КОНЪЮГАТЫ IL-2 Российский патент 2023 года по МПК A61K47/60 C07K14/55 A61K38/20 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к конъюгатам IL-2, их фармацевтически приемлемой соли, фармацевтическим композиция, содержащим такой конъюгат IL-или его фармацевтически приемлемую соль, и их применениям.

У здоровых людей иммунная система часто может различать здоровые клетки и раковые клетки. После идентификации данной клетки как раковой иммунная система обычно устраняет ее. Однако, когда иммунная система нарушена, например, при острых или хронических нарушениях или подавленном состоянии, рак может развиться в результате неспособности ослабленной иммунной системы дифференцировать, а затем устранять раковые клетки. У пациента, страдающего раком, введение пациенту иммуномодулирующего белка может помочь активировать иммунную систему этого пациента, так что способность иммунной системы устранять раковые клетки увеличивается. Таким образом, рак может быть замедлен от дальнейшего роста, подавлен от потенциального распространения или даже устранен.

Одним из таких иммуномодулирующих белков, используемых при лечении пациентов, страдающих некоторыми видами рака, является интерлейкин-2. Интерлейкин-2 (IL -2) представляет собой природный цитокин, который обладает активностью в качестве как стимулятора естественных клеток-киллеров (NK-клеток), так и пролиферации и функциональной активности Т-клеток. IL-2 играет центральную роль в образовании, дифференцировке, выживании и гомеостазе иммунных эффекторных клеток. IL-2 синтезируется активированными CD4+ хелперными Т-клетками, и посредством дифференциального взаимодействия рецепторов IL-2 может модулировать иммунный ответ в сторону иммунитета или толерантности.

IL-2 действует путем связывания с рецепторами IL-2 (IL-2R). Ассоциация субъединиц α-(CD25), β-(CD122) и в общем γ-(γc, CD132) приводит к образованию тримерного высокоаффинного IL-2R. Димерный промежуточный аффинный IL-2Rβγ состоит из β-и γ-субъединиц и связывает IL-2 с аффинностью в 50 раз ниже. CD25 не требуется для передачи сигналов IL-2, но обеспечивает высокую аффинность связывания тримерного рецептора, тогда как β-и γ-субъединицы опосредуют передачу сигнала. IL-2Rβγ экспрессируется на NK-клетках, моноцитах, макрофагах и покоящихся CD4 + и CD8 + T-клетках, в то время как IL-2Rαβγ транзиентно индуцируется на активированных T-и NK-клетках и конститутивно экспрессируется на T-регуляторных клетках. Способность IL-2 расширяться и активировать врожденные и адаптивные эффекторные клетки является основой его противоопухолевой активности.

У пациентов IL-2 может стимулировать противоопухолевую эффективность, характеризующуюся увеличением цитотоксических лимфоцитов, включая эффекторные Т-и NK-клетки, при введении в высоких дозах (например, 600 000-720 000 МЕ/кг массы тела три раза в день в течение до 14 доз за цикл для человека). Предположительно во время этой терапии все Т-клетки стимулируются IL-2 после введения высоких доз, и когда цикл терапии заканчивается и в какой-то момент падает уровень IL -2, IL -2 начинает ограничиваться, и Т-регуляторные (Treg) клетки экспрессируют IL-2Rαβγ будет превосходить эффекторные Т-клетки, экспрессирующие IL-2Rβγ для оставшегося IL-2 дикого типа.

Альдеслейкин, рекомбинантный человеческий IL -2, был первой иммунотерапией рака, одобренной FDA в 1992 году. При использовании соответствующей поддерживающей терапии альдеслейкин продемонстрировал полную регрессию рака примерно у 10% пациентов, лечившихся от метастатической меланома и рака почек. Приблизительно 70% пациентов с полным ответом были излечены, при этом полный регресс продолжался более 25 лет после первоначального лечения.

На основании его противоопухолевой эффективности высокие дозы IL -2 (альдеслейкин) были одобрены для лечения пациентов с метастатической почечно-клеточной карциномой и злокачественной меланомой. Однако его противоопухолевый иммунитет ограничен по дозе тяжелыми сердечно-сосудистыми, легочными, печеночными, желудочно-кишечными, неврологическими и гематологическими побочными эффектами, поэтому его назначают только пациентам в специализированных центрах. Кроме того, как только уровни введенного IL-2 падут ниже уровней, необходимых для активности IL-2Rβγ, активация Treg, экспрессирующих высокоаффинный IL-2Rαβγ, будет преобладать, что может ограничить противоопухолевый иммунитет.

Доклинические исследования показали, что индуцированный IL-2 отек легких (как модель синдрома пропотевания жидкости из сосудов) может быть вызван взаимодействием IL -2 с CD25 на эндотелиальных клетках легких и что он может быть отменен блокирующими CD25 антителами, генетическим нарушением или использованием комплексов IL-2-антитело. Другой предложенный механизм, с помощью которого IL-2 вызывает синдром пропотевания жидкости из сосудов, включает активацию эозинофилов, поскольку эти клетки могут экспрессировать IL-2Rαβγ, а терапия IL-2 у пациентов связана с повышенными системными уровнями эозинофилов и IL-5.

Регуляторные Т-клетки CD+ (Treg-клетки), которые отвечают за подавление иммунного ответа, ведущего к иммунной толерантности, предпочтительно экспрессируют IL-2Rαβγ форму IL-2R. Таким образом, можно ожидать, что введение соединений, которые связываются с IL-2Rαβγ и являются его агонистами, подавляет иммунный ответ и, таким образом, также препятствует противоопухолевым ответам у больных раком.

Эффекторные Т-клетки CD4+, Т-клетки CD8+ и NK-клетки, которые значительно усиливают противоопухолевые иммунные ответы, предпочтительно экспрессируют IL-2Rβγ форму IL-2R. Таким образом, можно ожидать, что введение соединений, которые связываются с IL-2Rβγ и являются агонистами для него, усилит иммунный ответ против опухолей (например, за счет увеличения пролиферации и активности эффекта Т-клеток CD4+, Т-клеток CD8+ и NK-клеток).

Таким образом, введение селективных агонистов IL-2Rβγ (имеющих пониженное связывание или не имеющих связывание с IL-2Rα или повышенное связывание с IL-2Rβγ) будет полезным для пациентов, страдающих определенными видами рака, поскольку ожидается, что это снизит системные побочные эффекты синдрома пропотевания жидкости из сосудов, такие как отек легких, обеспечивая улучшенное терапевтическое окно. Кроме того, селективные агонисты IL-2Rβγ будут иметь преимущество, заключающееся в предотвращении селективной активации иммуносупрессорных регуляторных Т-клеток при низких дозах, и будут одинаково эффективны против Treg и CD4+ эффекторных T-клеток, цитотоксических CD8+ эффекторных T-клеток и NK-клеток, тем самым предоставляя больше возможностей для усиления иммунной системы пациента для устранения раковых клеток.

Необязательно такой селективный агонист IL-2Rβγ также будет проявлять относительно длительную экспозицию после введения, тем самым дополнительно улучшая реакцию пациента на лечение. Усиление эффекторного действия иммунной системы у больного раком путем введения IL-2βγ-селективных агонистов может быть дополнительно усилено путем введения антагонистов иммуносупрессивных путей (например, антагонистов CTLA-4 и PD-1) или путем введения иммунных агонистов, таких как лиганды TLR, или агентов, которые агонизируют рецепторы, активирующие иммунную систему, таких как агонисты рецептора, активирующие 41BB (CD137), OX40, ICOS, CD40, CD28, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, LFA1, CD16, CD64, CD32A и CD3, или антитела, вызывающие антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC).

Адаптивный перенос опухолереактивных Т-клеток был разработан в клинически полезную терапию, способную вызывать у пациентов противоопухолевый иммунитет. Однако широкое применение методов адоптивного переноса Т-клеток (АСТ) для лечения рака имеет несколько ограничений, включая продукцию достаточных количеств клеток для инфузии и неспособность перенесенных Т-клеток сохраняться и оставаться функциональными in vivo. В клинике одновременное введение фактора роста Т-клеток интерлейкина-2 (IL -2) улучшает выживаемость, функцию и противоопухолевую активность трансплантированных Т-клеток. Однако использование IL -2 для усиления ACT осложняется плейотропной природой ACT -2, который вызывает как иммуностимулирующие, так и подавляющие Т-клеточные ответы, а также потенциально серьезные токсические эффекты.

Были предприняты попытки решить проблему токсичности IL-2. В одном случае были предприняты попытки составления составов, см., например, патент США № 6706289 и публикации международных патентных заявок WO 02/00243 и WO 99/60128. В других подходах были предложены определенные конъюгаты IL-2, см., например, патенты США № 4766106, 5206344, 5089261 и 4902502. Кроме того, были предложены некоторые обратимые конъюгаты IL-2, см., например, WO12065086A1.

Однако, несмотря на эти подходы, остается потребность в конъюгатах IL-2, которые обеспечивают более безопасное лечение больных раком.

Поэтому задача настоящего изобретения состоит в по меньшей мере частичном преодолении вышеуказанного недостатка.

Эта задача решается посредством конъюгата IL-2 или его фармацевтически приемлемой соли формулы (Ia) или (Ib)

(Ia)

(Ib),

где

- D представляет собой несимметричный фрагмент IL-2, где несимметричный фрагмент IL-2 содержит фрагмент IL-2, где для несимметричного IL-2 фрагмента соотношение K_D указанного несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ и K_D указанного несимметричного IL-2 к IL-2Rβ выше соотношения K_D альдеслейкина к IL-2Rαβ и K_D альдеслейкина к IL-2Rβ;

-L¹-представляет собой линкерный фрагмент, ковалентно и обратимо присоединенный к -D;

-L²-представляет собой химическую связь или представляет собой спейсерный фрагмент;

-Z представляет собой полимерный фрагмент или фрагмент замещенной жирной кислоты;

x представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или 16; и

y представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 2, 3, 4 и 5.

В контексте настоящего изобретения применяемые термины имеют следующие значения:

Термин «интерлейкин-2» или «IL-2», используемый в данном документе, относится ко всем белкам IL-2, предпочтительно белкам видов млекопитающих, более предпочтительно белкам видов приматов и наиболее предпочтительно белкам человека, а также к их вариантам, аналогам, ортологам, гомологи и их производным и фрагментам, которые характеризуются тем, что играют центральную роль в генерации, выживании и гомеостазе лимфоцитов. Термин «IL-2» также включает встречающиеся в природе варианты IL-2, например, варианты сплайсинга или аллельные варианты.

Человеческий IL-2 имеет последовательность SEQ ID NO:1:

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

Непроцессированный человеческий IL-2 дополнительно содержит N-концевой сигнальный пептид из 20 аминокислот, который отсутствует в молекуле зрелого IL-2.

Предпочтительно и если не указано иное, термин «IL-2» предпочтительно относится к альдеслейкину, т.е. к варианту человеческого IL-2, в котором аминокислота в положении 1 (аланин), присутствующая в человеческом IL-2 согласно SEQ ID NO: 1, была удалена (desA1), и цистеин, присутствующий в человеческом IL-2 согласно SEQ ID NO: 1 в положении 125, был заменен на серин (C125S). Последовательность альдеслейкина показана в SEQ ID NO: 2:

PTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFSQSIISTLT

В контексте настоящего изобретения термин “вариант белка IL-2” или “вариант IL-2”, относится к белку из того же вида, который отличается от ссылочного белка IL-2. Предпочтительно, последовательностью такого ссылочного белка IL-2 является последовательность SEQ ID NO:2. Как правило, различия ограничены, так что аминокислотная последовательность ссылочного белка и варианта в целом очень похожи и во многих областях идентичны. Предпочтительно, варианты белка IL-2 по меньшей мере на 70%, 80%, 90% или 95% идентичны ссылочному белку IL-2, предпочтительно белку IL-2 согласно SEQ ID NO: 2. Под белком, имеющим аминокислотную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% «идентичную» запрашиваемой аминокислотной последовательности, подразумевается, что аминокислотная последовательность рассматриваемого белка идентична запрашиваемой последовательности, за исключением того, что рассматриваемый белок может включать вплоть до пяти аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот рассматриваемой аминокислотной последовательности. Эти замены в ссылочной последовательности могут происходить при амино (N-концевое) или карбокси концевых (C-концевое) положениях ссылочной аминокислотной последовательности или в любом мести между этими концевыми положениями, распределяясь либо по отдельности среди остатков в ссылочной последовательности, либо в виде одной или более соприкасающихся групп в ссылочной последовательности. Рассматриваемая последовательность может быть либо полностью аминокислотной последовательностью ссылочной последовательности, либо любым фрагментом, уточненным как описано в настоящей заявке. Предпочтительно, рассматриваемой последовательностью является последовательность SEQ ID NO:2.

Такие варианты белка IL-2 могут быть вариантами, встречающимися в природе, как например встречающиеся в природе аллельные варианты, кодируемые одной из нескольких альтернативных форм IL-2, занимающих данный локус на хромосоме или организме, или изоформы, кодируемые встречающимися в природе вариантами сплайсинга, происходящими из одного первичного транскрипта. Альтернативно вариант белка IL-2 может быть вариантом, который, как известно, не происходит в природе, и который может быть получен методиками мутагенеза, известными в данной области техники.

В данной области известно, что одна или более аминокислот могут быть удалены с N-конца или C-конца биоактивного пептида или белка или из внутренних положений, то есть положения между N-и C-концевыми аминокислотами, без существенной потери биологической функции. Такие N-концевые, C-концевые и/или внутренние делеции также охватываются термином вариант белка IL-2.

Специалистам в данной области техники также известно, что некоторые аминокислотные последовательности белка IL-2 могут быть изменены без значительного влияния структуры или функции белка. Такие мутанты включают делеции, вставки, инверсии, повторы и замены, выбранные в соответствии с общими правилами, известными в данной области техники, чтобы иметь небольшой эффект на активность. Например, указания относительно того, как сделать фенотипически молчащие аминокислота замены, приведены в Bowie et al. (1990), Science 247:1306-1310, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки, где авторы указывают, что существуют два основных подхода к изучению толерантности аминокислотной последовательности к изменению.

Как применяется в настоящей заявке, термин “аналог IL-2” относится IL-2 различных и не связанных между собой организмов, которые выполняют одни и те же функции в каждом организме, но которые не происходят из родовой структуры, которую имели предки организмов. Вместо этого аналогичные IL-2 возникали отдельно, а затем эволюционировали для выполнения одних и тех же или подобных функций. Другими словами, аналогичные белки IL-2 представляют собой белки с совершенно различными аминокислотными последовательностями, но которые имеют одну и ту же биологическую активность.

В контексте настоящего изобретения термин «ортолог IL-2» относится к IL-2 в пределах двух разных видов, последовательности которых связаны друг с другом через общий гомологичный IL-2 у предкового вида, но которые в ходе эволюции стали отличаться друг от друга.

В контексте настоящего изобретения термин «гомолог IL-2» относится к IL-2 различных организмов, которые выполняют одни и те же функции в каждом организме и которые происходят от предковой структуры, которая была общей у предков этих организмов. Другими словами, гомологичные белки IL-2 представляют собой белки с очень похожими аминокислотными последовательностями, которые обладают одинаковой биологической активностью. Предпочтительно, гомологи белка IL-2 могут определяться как белки, проявляющие по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 95% идентичности со ссылочным белком IL-2, предпочтительно белком IL-2 согласно SEQ ID NO:2.

В контексте настоящего изобретения термин “фрагмент белка IL-2” относится к любому пептиду, содержащему непрерывный участок части аминокислотной последовательности белка IL-2, предпочтительно белка SEQ ID NO: 2. Более конкретно, фрагмент белка IL-2 включает по меньшей мере 50, например, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70 или по меньшей мере 80 последовательных аминокислот белка IL-2, более предпочтительно белка SEQ ID NO: 2.

Термин «IL-2» также включает поли (аминокислотные) конъюгаты, которые имеют последовательность, как описано выше, но имеют основную цепь, которая включает как амидные, так и неамидные связи, такие как сложноэфирные связи, такие как, например, депсипептиды. Депсипептиды представляют собой цепочки аминокислотных остатков, в которых основная цепь включает как амидные (пептидные), так и сложноэфирные связи. Соответственно, термин «боковая цепь», используемый в настоящем документе, относится либо к фрагменту, присоединенному к альфа-углероду аминокислотного фрагмента, если аминокислотный фрагмент связан посредством аминных связей, таких как в пептидах или белках, либо к любому фрагменту, содержащему атом углерода, присоединенному к основной цепи поли(аминокислотного) конъюгата, как например, в случае депсипептидов. Предпочтительно, термин «IL-2» относится к белкам, остов которых образован амидными (пептидными) связями.

Поскольку термин IL-2 включает в себя описанные выше варианты, аналоги, ортологи, гомологи, производные и фрагменты IL-2, все ссылки на конкретные положения в ссылочной последовательности также включают эквивалентные положения в этих вариантах, аналогах, ортологах, гомологах, производных и составляющих фрагмента IL-2, даже если не указано иное.

В контексте настоящего изобретения термин “несимметричный IL-2” относится к модифицированному IL-2, в котором соотношение KD указанного несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ и KD указанного несимметричного IL-2 к IL-2Rβ выше соотношения K_D альдеслейкина согласно SEQ ID NO:2 к IL-2Rαβ и K_D альдеслейкина к IL-2Rβ. Это описывается следующей формулой:

где

где

“K_D несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ” представляет собой K_D несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ,

“K_D несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ” представляет собой K_D несимметричного IL-2 к IL-2Rβ,

“K_D альдеслейкин к IL-2Rαβ” представляет собой K_D альдеслейкина к IL-2Rαβ, и

“K_D альдеслейкин к IL-2Rβ” представляет собой K_D альдеслейкина к IL-2Rβ.

Аффинность/кинетика связывания, необходимая для определения K_D несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ, K_D несимметричного IL-2 к IL-2Rβ, K_D альдеслейкина к IL-2Rαβ и K_D альдеслейкина к IL-2Rβ может быть оценена с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR), измеренного на приборе Biacore (GE Healthcare) следующим образом: поверхность для захвата Fc человека на чипе CM5 (или, альтернативно, C1 или CM4) получают ковалентным покрытием антителом против Fc человека, или альтернативно применяют чип с белком A. Затем на чипе иммобилизуют IL-2Rβ-Fc или подходящую смесь IL2-Rα-Fc и IL2-Rβ-Fc, такую как смесь 1:1. Для измерения аффинности/кинетических констант производят серийные разведения аналитов, начиная, например, от 1,5 до 2 мкМ или от 100 до 1 мкМ для соединений IL-2 (заканчивая, например, от 0,03 до 100 нМ или от 0.1 нМ до 1 нМ). Каждый аналит подвергается воздействию модифицированного рецептором чипа в течение подходящего периода времени, например, от 1 до 30 минут, который может составлять, например, 2 минуты или может составлять 3 минуты, а затем смывают в течение подходящего периода времени, например, от 2 до 60 минут, что может составлять, например, 10 минут. Полученные кривые связывания из серии разведений соответствуют кинетической модели 1:1 для корреляции наблюдаемых единиц ответа (R) с константами скорости ассоциации и диссоциации, k_a и k_d:

где

t означает время;

C означает концентрацию аналита; и

R_max означает максимальную связывающую способность поверхности.

При определении с помощью кинетической модели 1: 1 соотношение скоростей диссоциации и ассоциации дает равновесную константу диссоциации K_D.

В качестве альтернативы, полученные кривые связывания из серии разведений соответствуют модели взаимодействия в стационарном состоянии 1: 1, на основе которой вычисляют K_D для взаимодействия 1: 1 из графика уровней связывания в стационарном состоянии (R_eq) в зависимости от концентрации аналита (C):

где

R_eq означает уровень связывания в стационарном состоянии;

C означает концентрацию аналита; и

R_max означает максимальную связывающую способность поверхности.

Понятно, что не каждый метод расчета может быть возможным для каждой несимметричный молекулы IL-2. Если, например, реакции протекают слишком быстро, может оказаться невозможным использовать кинетическую модель 1: 1, а модель взаимодействия в стационарном состоянии 1: 1 может применяться. Если, например, не достигается равновесие, может оказаться невозможным использовать модель взаимодействия 1: 1, а кинетическая модель 1: 1 может применяться.

Понятно, что K_D несимметричного IL-2 к IL2Rαβ и IL2Rβ измеряют для несимметричного IL-2, а не для конъюгата IL-2 согласно настоящему изобретению. Таким образом, измерение K_D происходит в отсутствии фрагмента -L¹-, -L²-и -Z и предпочтительно перед синтезом конъюгата IL-2 согласно настоящему изобретению, за исключением случая, когда конъюгат IL-2 трансляционно слит с белком, в случае чего K_D измеряют после высвобождения несимметричного IL-2, как например после протеазного расщепления или химического расщепления.

Такой несимметричный IL-2 содержит белковую часть, которая представляет собой IL-2 фрагмент, предпочтительно IL-2 фрагмент, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2, которая содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию или по меньшей мере одну делецию или по меньшей мере один модифицирующий фрагмент M_mod, как например 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10 модифицирующих фрагментов M_mod, или любую их комбинацию. Фрагмент M_mod может представлять собой белковый фрагмент или небелковый фрагмент. Если несимметричный IL-2 содержит более чем один фрагмент M_mod, они могут быть одинаковыми или различными. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 имеет последовательность SEQ ID NO: 1.

В конъюгатах IL-2 согласно настоящему изобретению несимметричный IL-2 присутствует в форме соответствующего несимметричного IL-2 фрагмента, и конъюгаты IL-2 согласно настоящему изобретению высвобождают несимметричный IL-2 при высвобождении всех фрагментов -Z т.е. при расщеплении обратимой связи между несимметричным фрагментом IL-2, т.е. -D, и -L¹-.

В контексте настоящего изобретения термин «аффинность» относится к силе суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (таким как рецептор) и ее партнером по связыванию (таким как лиганд). Если не указано иное, в контексте настоящего изобретения «аффинность» относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1: 1 между членами пары связывания (например, между рецептором и лигандом). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y обычно можно представить с помощью равновесной константы диссоциации (K_D), которая представляет собой отношение констант скорости диссоциации и ассоциации (k_d и k_a, соответственно), измеренных в состоянии равновесия. Таким образом, эквивалентные аффинности могут включать разные константы скорости, пока соотношение констант скорости остается неизменным. Аффинность можно измерить хорошо зарекомендовавшими себя методами, известными в данной области техники, включая описанные в настоящем документе.

В контексте настоящего изобретения термины “α-субъединица рецептора IL-2” и “IL-2Rα” относятся к человеческому CD25.

В контексте настоящего изобретения термины “β-субъединица рецептора IL-2” и “IL-2Rβ” относятся к человеческому CD122.

В контексте настоящего изобретения термины “α-и β-субъединица рецептора IL-2”, “α-и β-субъединица IL-2R” и “IL-2Rαβ” относятся к смеси, такой как 1:1 смесь IL-2Rα и IL-2Rβ.

Конъюгаты IL-2 согласно настоящему изобретению высвобождают несимметричный IL-2, т.е. конъюгаты IL-2 согласно настоящему изобретению представляют собой пролекарства несимметричного IL-2. Используемый в настоящем документе термин «пролекарство» относится к биологически активному фрагменту, такому как несимметричный фрагмент IL-2, обратимо и ковалентно связанный со специализированной защитной группой через линкерный фрагмент (который также может называться «обратимый линкер пролекарства»). Этот линкерный фрагмент включает обратимую связь с биологически активным фрагментом, и где специализированная защитная группа изменяет или устраняет нежелательные свойства в исходной молекуле биологически активного фрагмента, то есть в соответствующем лекарственном средстве. Это также включает усиление желательных свойств лекарственного средства и подавление нежелательных свойств. Специализированная нетоксичная защитная группа называется «носителем». Пролекарство высвобождает обратимо и ковалентно связанный биологически активный фрагмент в форме его соответствующего лекарственного средства. Другими словами, пролекарство представляет собой конъюгат, содержащий биологически активный фрагмент, который ковалентно и обратимо конъюгирован с фрагментом носителя через обратимый линкерный фрагмент пролекарства, при этом ковалентное и обратимое конъюгирование носителя с обратимым линкерным фрагментом пролекарства осуществляется либо напрямую, либо через спейсерную группу. Другим термином для «биологически активного фрагмента» является «фрагмент лекарственного средства».

В контексте настоящего изобретения термин «обратимое», «обратимо», «разлагаемое» или «разлагаемо» в отношении присоединения первого фрагмента ко второму фрагменту означает, что связь, которая соединяет указанный первый и второй фрагменты, может расщепляться в физиологических условиях, которые представляют собой водный буфер при pH 7.4, 37°C, с периодом полужизни от одного часа до трех месяцев, предпочтительно от одного часа до двух месяцев, даже более предпочтительно от одного часа до одного месяца. Расщепление может происходить ферментативно или неферментативно и, в большинстве случаев, не ферментативно. Соответственно, термин «стабильное» или «постоянное» в отношении присоединения первого фрагмента ко второму фрагменту означает, что связь, которая соединяет указанные первый и второй фрагменты, может расщепляться с периодом полужизни более трех месяцев в физиологических условиях.

В контексте настоящего изобретения термин “модифицирующий фрагмент” предпочтительно относится к заместителю или полимерному фрагменту.

В контексте настоящего изобретения термин «дисульфидный мостик» относится к вставке фрагмента между двумя атомами серы дисульфидного мостика. Это достигается за счет использования реагента, который имеет указанный фрагмент между двумя функциональными группами, реагирующими с тиолами, и взаимодействия каждой функциональной группы, реагирующей с тиолом, с одним из атомов серы дисульфидного мостика, так что фрагмент вставляется между указанными атомами серы после предопределенного восстановления дисульфидная связь. Если более чем один дисульфидный мостик присутствует в пептиде или белке, дисульфидный мостик может быть либо вставлен между атомами серы одного дисульфидного мостика, либо может быть вставлен между атомами серы из разных дисульфидных мостиков. Такой дисульфидный мостик может входить в состав природного пептида или белка или может быть введен искусственно, например, путем замены существующих аминокислотных фрагментов на фрагмент цистеина или путем добавления фрагмента цистеина в пептид или белок.

Как применяется в настоящей заявке, термин “реагент” означает химическое соединение, которое содержит по меньшей мере одну функциональную группу для реакции с функциональной группой другого химического соединения или лекарственного средства. Понятно, что лекарственное средство, содержащее функциональную группу (как например первичный или вторичный амин или гидроксильная функциональная группа) также представляет собой реагент.

Как применяется в настоящей заявке, термин “фрагмент” означает часть молекулы, в которой отсутствует один или более атомов по сравнению с соответствующим реагентов. Если, например, реагент формулы “H-X-H” реагирует с другим реагентом и становится частью продукта реакции, соответствующий фрагмент продукта реакции имеет структуру “H-X-“ или “-X- “, где каждый “-“ обозначает присоединение к другому фрагменту. Соответственно, биологически активный фрагмент высвобождается из пролекарства в качестве лекарственного средства.

Понятно, что если обеспечивается последовательность или химическая структура группы атомов, где группа атомов присоединяется к двум фрагментам или прерывает фрагмент, указанная последовательность или структура может быть присоединен к двум фрагментам в любой ориентации, если иного не указано. Например, фрагмент “-C(O)N(R¹)-“ может быть присоединен к двум фрагментам или прерывать фрагмент либо как “-C(O)N(R¹)-“, либо как “-N(R¹)C(O)-“. Подобным образом, фрагмент

может быть присоединен к двум фрагментам или может прерывать фрагмент либо как

, либо как.

Термин “замещенный”, как применяется в настоящей заявке, означает, что один или более атомов водорода молекулы или фрагмента замещены другим атомом или группой атомов, которые обозначаются как “заместитель”.

В контексте настоящего изобретения термин “замещенный” предпочтительно относится к фрагменту, выбранному из группы, состоящей из галогена, -CN, -COOR^x1, -OR^x1, -C(O)R^x1, -C(O)N(R^x1R^x1a), -S(O)₂N(R^x1R^x1a), -S(O)N(R^x1R^x1a), -S(O)₂R^x1, -S(O)R^x1, -N(R^x1)S(O)₂N(R^x1aR^x1b), -SR^x1, -N(R^x1R^x1a), -NO₂, -OC(O)R^x1, -N(R^x1)C(O)R^x1a, -N(R^x1)S(O)₂R^x1a, -N(R^x1)S(O)R^x1a, -N(R^x1)C(O)OR^x1a, -N(R^x1)C(O)N(R^x1aR^x1b), -OC(O)N(R^x1R^x1a), -T⁰, C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила и C_2-50 алкинила; где -T⁰, C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно замещены одним или более -R^x2, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T⁰-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^x3)-, -S(O)₂N(R^x3)-, -S(O)N(R^x3)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^x3)S(O)₂N(R^x3a)-, -S-, -N(R^x3)-, -OC(OR^x3)(R^x3a)-, -N(R^x3)C(O)N(R^x3a)-, и -OC(O)N(R^x3)-;

-R^x1, -R^x1a, -R^x1b независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, -T⁰, C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила, и C_2-50 алкинила; где -T⁰, C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно замещены одним или более -R^x2, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T⁰-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^x3)-, -S(O)₂N(R^x3)-, -S(O)N(R^x3)-; -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^x3)S(O)₂N(R^x3a)-, -S-, -N(R^x3)-, -OC(OR^x3)(R^x3a)-, -N(R^x3)C(O)N(R^x3a)-и -OC(O)N(R^x3)-;

каждый T⁰ независимо выбран из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила и 8-11-ти членного гетеробициклила, где каждый T⁰ необязательно независимо замещен одним или более -R^x2, которые являются одинаковыми или различными;

каждый -R^x2 независимо выбран из группы, состоящей из галогена, -CN, оксо (=O), -COOR^x4, -OR^x4, -C(O)R^x4, -C(O)N(R^x4R^x4a), -S(O)₂N(R^x4R^x4a), -S(O)N(R^x4R^x4a), -S(O)₂R^x4, -S(O)R^x4, -N(R^x4)S(O)₂N(R^x4aR^x4b), -SR^x4, -N(R^x4R^x4a), -NO₂, -OC(O)R^x4, -N(R^x4)C(O)R^x4a, -N(R^x4)S(O)₂R^x4a, -N(R^x4)S(O)R^x4a, -N(R^x4)C(O)OR^x4a, -N(R^x4)C(O)N(R^x4aR^x4b), -OC(O)N(R^x4R^x4a) и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными;

каждый -R^x3, -R^x3a, -R^x4, -R^x4a, -R^x4b независимо выбран из группы, состоящей из -H и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными.

Предпочтительно, максимум 6 -H атомов необязательно замещенной молекулы независимо замещены заместителем, например, 5 -H атомов независимо замещены заместителем, 4 -H атома независимо замещены заместителем, 3 -H атома независимо замещены заместителем, 2 -H атома независимо замещены заместителем, или 1 -H атом замещен заместителем.

В контексте настоящего изобретения термин «жирная кислота» относится к насыщенной или ненасыщенной одноосновной карбоновой кислоте, имеющей алифатический хвост, который может включать от 4 до 28 атомов углерода. Жирная кислота может быть насыщенной или ненасыщенной, линейной или разветвленной. Термин «вариант жирной кислоты» относится к модифицированной жирной кислоте, в которой определенные атомы углерода могут быть заменены другими атомами или группами атомов и которая может быть замещена.

Используемый в контексте настоящего изобретения термин «пептид» относится к цепи, состоящей по меньшей мере из 2 и до 50 аминокислотных мономерных фрагментов, связанных пептидными (амидными) связями. Термин «пептид» также включает пептидомиметики, такие как D-пептиды, пептоиды или бета-пептиды, и охватывает такие пептидомиметические цепи, содержащие до и включая 50 мономерных фрагментов.

В контексте настоящего изобретения термин «белок» относится к цепи, состоящей из более чем 50 аминокислотных мономерных фрагментов, которые также могут называться «аминокислотными остатками», связанных пептидными связями, в которой предпочтительно не более 12000 аминокислотных мономеров связанны пептидными связями, как например не более чем 10000 аминокислотных мономерных фрагментов, не более чем 8000 аминокислотных мономерных фрагментов, не более чем 5000 аминокислотных мономерных фрагментов или не более чем 2000 аминокислотных мономерных фрагментов.

Как применяется в настоящей заявке термин “около” в комбинации с числовым значением применяется для указания на диапазон в интервале и включая числовое значение плюс и минус не более 25% от указанного числового значения, более предпочтительно не более 20% от указанного значения и наиболее предпочтительно не более 10% от указанного значения. Например, фраза “около 200” применяется для обозначения диапазона в интервале и включая 200 +/-25%, т.е. в интервале и включая 150 -250; предпочтительно 200 +/-20%, т.е. в интервале и включая 160 -240; даже более предпочтительно в интервале и включая 200 +/-10%, т.е. в интервале и включая 180-220. Понятно, что процент, приведенный как “около 50%” не означает “50% +/-25%”, т.е. в интервале и включая 25 -75%, но “около 50%” означает в интервале и включая 37,5 - 62,5%, т.е. плюс и минус 25% от числового значения, которое равно 50.

Как применяется в настоящей заявке, термин «полимер» означает молекулу, содержащую повторяющиеся структурные единицы, т.е. мономеры, связанные химическими связями линейным, кольцевым, разветвленным, сшитым или дендримерным образом или их комбинацией, которая может быть синтетического или биологического происхождения или комбинацией обоих. Понятно, что полимер может также содержать одну или более других химических групп и/или фрагментов, таких как, например, одна или более функциональные группы. Предпочтительно, растворимый полимер имеет молекулярную массу, равную по меньшей мере 0.5 кДа, например, молекулярную массу, равную по меньшей мере 1 кДа, молекулярную массу, равную по меньшей мере 2 кДа, молекулярную массу, равную по меньшей мере 3 кДа, или молекулярную массу, равную по меньшей мере 5 кДа. Если полимер является растворимым, он предпочтительно имеет молекулярную массу, равную самое большее 1000 кДа, как например самое большее 750 кДа, как например самое большее 500 кДа, как например самое большее 300 кДа, как например самое большее 200 кДа, как например самое большее 100 кДа. Понятно, что для нерастворимых полимеров, как например гидрогели, нет значимых диапазонов молекулярной массы. Понятно, что белок также представляет собой полимер, в котором аминокислоты являются повторяющимися структурными единицами, даже если боковые цепи каждой аминокислоты могут быть разными.

Как применяется в настоящей заявке, термин “полимерный” означает реагент или фрагмент, содержащий один или более полимеров или полимерных фрагментов. Полимерный реагент или фрагмент может необязательно также содержать один или более других фрагментов, которые предпочтительно выбирают из группы, состоящей из:

• C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила, C_2-50 алкинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила, 8-11-ти членного гетеробициклила, фенила, нафтила, инденила, инданила и тетралинила; и

• связей, выбранных из группы, содержащей

где

пунктирные линии обозначают присоединение к оставшейся части фрагмента или реагента, и

-R и R^a независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из -H, метила, этила, пропила, бутила, пентила и гексила.

Специалист в данной области понимает, что продукты полимеризации, полученные из реакции полимеризации, не все имеют одинаковую молекулярную массу, а скорее имеют молекулярно-массовое распределение. Следовательно, диапазоны молекулярных масс, молекулярные массы, диапазоны количества мономеров в полимере и количества мономеров в полимере, как применяется в настоящей заявке, относятся к среднечисловой молекулярной массе и среднему числу мономеров, т.е. к среднему арифметическому молекулярной массы полимера или полимерного фрагмента и среднему арифметическому числа мономеров полимера или полимерного фрагмента.

Соответственно, в полимерном фрагменте, содержащем “x” мономерных единиц, любое целое число, приведенное для “x”, поэтому соответствует арифметическому среднему числу мономеров. Любой диапазон целых чисел, приведенный для “x”, обеспечивает диапазон целых чисел, в котором лежит арифметическое среднее число мономеров. Целое число для “x”, приведенное как “около x”, означает, что арифметические средние числа мономеров лежат в диапазоне целых чисел x +/-25%, более предпочтительно x +/-20 и наиболее предпочтительно x +/-10%.

Как применяется в настоящей заявке, термин “среднечисловая молекулярная масса” означает обычное среднее арифметическое молекулярных масс отдельных полимеров.

Как применяется в настоящей заявке, термин “на основе ПЭГ” в отношении фрагмента или реагента означает, что указанный фрагмент или реагент содержит ПЭГ. Предпочтительно, фрагмент или реагент на основе ПЭГ содержит по меньшей мере 10% (мас./мас.) ПЭГ, как например по меньшей мере 20% (мас./мас.) ПЭГ, как например по меньшей мере 30% (мас./мас.) ПЭГ, как например по меньшей мере 40% (мас./мас.) ПЭГ, как например по меньшей мере 50% (мас./мас.), как например по меньшей мере 60 (мас./мас.) ПЭГ, как например по меньшей мере 70% (мас./мас.) ПЭГ, как например по меньшей мере 80% (мас./мас.) ПЭГ, как например по меньшей мере 90% (мас./мас.) ПЭГ, как например по меньшей мере 95%. Оставшиеся массовые проценты фрагмента или реагента на основе ПЭГ составляют другие фрагменты, предпочтительно выбранные из следующих фрагментов и связей:

• C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила, C_2-50 алкинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила, 8-11-ти членного гетеробициклила, фенила, нафтила, инденила, инданила и тетралинила; и

• связей, выбранных из группы, содержащей

где

пунктирные линии обозначают присоединение к оставшейся части фрагмента или реагента, и

-R и R^a независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из -H, метила, этила, пропила, бутила, пентила и гексила.

Термин “на основе гиалуроновой кислоты” применяется соответствующим образом.

Как применяется в настоящей заявке, термин “на основе ПЭГ, содержащий по меньшей мере X% ПЭГ” в отношении фрагмента или реагента означает, что указанный фрагмент или реагент содержит по меньшей мере X% (мас./мас.) единиц этиленгликоля (-CH₂CH₂O-), где единицы этиленгликоля могут быть расположены блочным, чередующимся образом или могут быть расположены случайным образом в фрагменте или реагенте, и предпочтительно все единицы этиленгликоля указанного фрагмента или реагента присутствуют в одном блоке; оставшиеся массовые проценты фрагмента или реагента на основе ПЭГ составляют другие фрагменты, предпочтительно выбранные из следующих фрагментов и связей:

• C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила, C_2-50 алкинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила, 8-11-ти членного гетеробициклила, фенила, нафтила, инденила, инданила и тетралинила; и

• связей, выбранных из группы, содержащей

где

пунктирные линии обозначают присоединение к оставшейся части фрагмента или реагента, и

-R и R^a независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из -H, метила, этила, пропила, бутила, пентила и гексила.

Термин “на основе гиалуроновой кислоты, содержащая по меньшей мере X% гиалуроновая кислота” применяется соответствующим образом.

В контексте настоящего изобретения термин «гидрогель» означает гидрофильную или амфифильную полимерную сеть, состоящую из гомополимеров или сополимеров, которая нерастворима из-за наличия гидрофобных взаимодействий, водородных связей, ионных взаимодействий и/или ковалентных химических поперечных связей. Сшивки обеспечивают структуру и физическую целостность сети.

Термин “прерванный” означает, что фрагмент вставлен между двумя атомами углерода или - если вставка находится на одном из концов фрагмента - между атомом углерода или гетероатомом и атомом водорода, предпочтительно между атомом углерода и атомом водорода.

Как применяется в настоящей заявке, термин “C_1-4 алкил” сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный алкильный фрагмент, имеющий от 1 до 4 атомов углерода. Если присутствует на конце молекулы, примерами неразветвленного или разветвленного C_1-4 алкила являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор.-бутил и трет.-бутил. Когда два фрагмента молекулы связаны C_1-4 алкилом, примерами таких C_1-4 алкильных групп являются -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -CH(CH₃)-, -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH(C₂H₅)-, -C(CH₃)₂-. Каждый водород C_1-4 алкильного углерода может необязательно быть замещен заместителем, как определено выше. Необязательно, C_1-4 алкил может быть прерван одной или более фрагментами, как определено далее.

Как применяется в настоящей заявке, термин “C_1-6 алкил” сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный алкильный фрагмент, имеющий от 1 до 6 атомов углерода. Если присутствует на конце молекулы, примерами неразветвленных или разветвленных C_1-6 алкильных групп являются метил, этил, н-пропил, изопропил, н-бутил, изобутил, втор.-бутил, трет-бутил, н-пентил, 2-метилбутил, 2,2-диметилпропил, н-гексил, 2-метилпентил, 3-метилпентил, 2,2-диметилбутил, 2,3-диметилбутил и 3,3-диметилпропил. Когда два фрагмента молекулы связаны C_1-6 алкильной группой, примерами таких C_1-6 алкильных групп являются -CH₂-, -CH₂-CH₂-, -CH(CH₃)-, -CH₂-CH₂-CH₂-, -CH(C₂H₅)-и C(CH₃)₂-. Каждый атом водорода при C_1-6 атоме углерода может необязательно быть замещен заместителем, как определено выше. Необязательно, C_1-6 алкил может быть прерван одним или более фрагментами, как определено далее.

Соответственно, “C_1-10 алкил”, “C_1-20 алкил” или “C_1-50 алкил” означает алкильную цепь, имеющую от 1 до 10, от 1 до 20 или от 1 до 50 атомов углерода, соответственно, где каждый атом водорода при C_1-10, C_1-20 или C_1-50 атоме углерода может необязательно быть замещен заместителем, как определено выше. Необязательно, C_1-10 или C_1-50 алкил может быть прерван одним или более фрагментами, как определено далее.

Как применяется в настоящей заявке, термин “C_2-6 алкенил” сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный фрагмент, содержащий по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод, имеющий от 2 до 6 атомов углерода. Если присутствует на конце молекулы, примерами являются CH=CH₂, -CH=CH-CH₃, -CH₂-CH=CH₂, -CH=CHCH₂-CH₃ и -CH=CH-CH=CH₂. Когда два фрагмента молекулы связаны C_2-6 алкенильной группой, тогда примером такого C_2-6 алкенила является -CH=CH-. Каждый атом водорода C_2-6 алкенильного фрагмента может необязательно быть замещен заместителем, как определено выше. Необязательно, C_2-6 алкенил может быть прерван одним или более фрагментами, как определено далее.

Соответственно, термин “C_2-10 алкенил”, “C_2-20 алкенил” или “C_2-50 алкенил” сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный фрагмент, содержащий по меньшей мере одну двойную связь углерод-углерод, имеющий от 2 до 10, от 2 до 20 или от 2 до 50 атомов углерода. Каждый атом водорода C_2-10 алкенильной, C_2-20 алкенильной или C_2-50 алкенильной группы может необязательно быть замещен заместителем, как определено выше. Необязательно, C_2-10 алкенил, C_2-20 алкенил или C_2-50 алкенил может быть прерван одним или более фрагментами, как определено далее.

Как применяется в настоящей заявке, термин “C_2-6 алкинил” сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный фрагмент, содержащий по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод, имеющий от 2 до 6 атомов углерода. Если присутствует на конце молекулы, примерами являются -C≡CH, -CH₂-C≡CH, CH₂-CH₂-C≡CH и CH₂-C≡C-CH₃. Когда два фрагмента молекулы связаны алкинильной группой, тогда примером является -C≡C-. Каждый атом водорода C_2-6 алкинильной группы может необязательно быть замещен заместителем, как определено выше. Необязательно, могут присутствовать одна или более двойных связей. Необязательно, C_2-6 алкинил может быть прерван одним или более фрагментами, как определено далее.

Соответственно, как применяется в настоящей заявке, термин “C_2-10 алкинил”, “C_2-20 алкинил” и “C_2-50 алкинил” сам по себе или в комбинации означает неразветвленный или разветвленный углеводородный фрагмент, содержащий по меньшей мере одну тройную связь углерод-углерод, имеющий от 2 до 10, от 2 до 20 или от 2 до 50 атомов углерода, соответственно. Каждый атом водорода C_2-10 алкинильной, C_2-20 алкинильной или C_2-50 алкинильной группы может необязательно быть замещен заместителем, как определено выше. Необязательно, могут присутствовать одна или более двойных связей. Необязательно, C_2-10 алкинил, C_2-20 алкинил или C_2-50 алкинил может быть прерван одним или более фрагментами, как определено далее.

Как упомянуто выше, C_1-4 алкил, C_1-6 алкил, C_1-10 алкил, C_1-20 алкил, C_1-50 алкил, C_2-6 алкенил, C_2-10 алкенил, C_2-20 алкенил, C_2-50 алкенил, C_2-6 алкинил, C_2-10 алкинил, C_2-20 алкенил или C_2-50 алкинил может необязательно быть прерван одним или более фрагментами, которые предпочтительно выбирают из группы, состоящей из

где

пунктирные линии обозначают присоединение к оставшейся части фрагмента или реагента; и

-R и R^a независимо друг от друга выбирают из группы, состоящей из -H, метила, этила, пропила, бутила, пентила и гексила.

Как применяется в настоящей заявке, термин "C_3-10 циклоалкил" означает циклическую алкильную цепь, имеющую от 3 до 10 атомов углерода, которая может быть насыщенной или ненасыщенной, например, циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогексенил, циклогептил, циклооктил, циклононил или циклодецил. Каждый атом водорода C_3-10 циклоалкильного углерода может быть замещен заместителем, как определено выше. Термин "C_3-10 циклоалкил" также включает мостиковые бициклы, такие как норборнан или норборнен.

Термин “8-30-членный карбополициклил” или “8-30-членный карбополицикл” означает циклический фрагмент из двух или более колец с 8 -30 кольцевыми атомами, где два соседних кольца разделяют по мере один кольцевой атом, и которая может содержать до максимального числа двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое является полностью насыщенным, частично ненасыщенным или ненасыщенным). Предпочтительно 8-30-членный карбополициклил означает циклический фрагмент из двух, трех, четырех или пяти колец, более предпочтительно двух, трех или четырех колец.

Как применяется в настоящей заявке, термин "3-10-членный гетероциклил" или "3-10-членный гетероцикл" означает кольцо с 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 кольцевыми атомами, которое может содержать до максимального числа двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое является полностью насыщенным, частично ненасыщенным или ненасыщенным), где по меньшей мере от одного кольцевого атома до четырех кольцевых атомов замещены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)₂-), кислорода и азота (включая =N(O)-), и где кольцо связано с остатком молекулы через атом углерода или азота. Примеры 3-10-членных гетероциклов включают, но без ограничения к этому, азиридин, оксиран, тиран, азирин, оксирен, тиирен, азетидин, оксетан, тиетан, фуран, тиофен, пиррол, пирролин, имидазол, имидазолин, пиразол, пиразолин, оксазол, оксазолин, изоксазол, изоксазолин, тиазол, тиазолин, изотиазол, изотиазолин, тиадиазол, тиадиазолин, тетрагидрофуран, тетрагидротиофен, пирролидин, имидазолидин, пиразолидин, оксазолидин, изоксазолидин, тиазолидин, изотиазолидин, тиадиазолидин, сульфолан, пиран, дигидропиран, тетрагидропиран, имидазолидин, пиридин, пиридазин, пиразин, пиримидин, пиперазин, пиперидин, морфолин, тетразол, триазол, триазолидин, тетразолидин, диазепан, азепин или гомопиперазин. Каждый атом водорода 3-10-членного гетероциклила или 3-10-членной гетероциклической группы может быть замещен заместителем, как определено далее.

Как применяется в настоящей заявке, термин "8-11-членный гетеробициклил" или "8-11-членный гетеробицикл" означает гетероциклический фрагмент из двух колец с 8 -11 кольцевыми атомами, где по меньшей мере один кольцевой атом разделен между двумя кольцами, и который содержит до максимального числа двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое является полностью насыщенным, частично ненасыщенным или ненасыщенным), где по меньшей мере от одного кольцевого атома до шести кольцевых атомов замещены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)₂-), кислорода и азота (включая =N(O)-), и где кольцо связано с остатком молекулы через атом углерода или азота. Примерами 8-11-членного гетеробицикла являются индол, индолин, бензофуран, бензотиофен, бензоксазол, бензизоксазол, бензотиазол, бензизотиазол, бензимидазол, бензимидазолин, хинолин, хиназолин, дигидрохиназолин, хинолин, дигидрохинолин, тетрагидрохинолин, декагидрохинолин, изохинолин, декагидроизохинолин, тетрагидроизохинолин, дигидроизохинолин, бензазепин, пурин или птеридин. Термин 8-11-членный гетеробицикл также включает спиро-структуры из двух циклов, такие как 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан или мостиковые гетероциклы, такие как 8-аза-бицикло[3.2.1]октан. Каждый атом водорода 8-11-членного гетеробициклила или 8-11-членного гетеробицикла может быть замещен заместителем, как определено далее.

Подобным образом, термин “8-30-членный гетерополициклил” или “8-30-членный гетерополицикл” означает гетероциклический фрагмент из более чем двух колец с 8 -30 кольцевыми атомами, предпочтительно тремя, четырьмя или пятью кольцами, где два соседних кольца разделяют по мере один кольцевой атом, и который может содержать до максимального числа двойных связей (ароматическое или неароматическое кольцо, которое является полностью насыщенным, частично ненасыщенным или ненасыщенным), где по меньшей мере от одного кольцевого атома до 10 кольцевых атомов замещены гетероатомом, выбранным из группы, состоящей из серы (включая -S(O)-, -S(O)₂-), кислорода и азота (включая =N(O)-), и где кольцо связано с остатком молекулы через атом углерода или азота.

Понятно, что фраза “пара R^x/R^y, соединяется вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием C_3-10 циклоалкила или 3-10-членного гетероциклила” в отношении фрагмента структуры

означает, что Rx и Ry образуют следующую структуру:

,

где R представляет собой C_3-10 циклоалкил или 3-10-членный гетероциклил.

Также понятно, что фраза “пара R^x/R^y, соединяется вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием кольца A” в отношении фрагмента структуры

означает, что R^x и R^y образуют следующую структуру:

.

Как применяется в настоящей заявке, "галоген" означает фтор, хлор, бром или иод. В общем предпочтительно, что галогеном является фтор или хлор.

Как применяется в настоящей заявке, термин “функциональная группа” означает группу атомов, которая может реагировать с другими группами атомов. Функциональные группы включают, но без ограничения к этому, следующие группы: карбоновая кислота (-(C=O)OH), первичный и вторичный амин (-NH₂, -NH-), малеимид, тиол (-SH), сульфоновая кислота (-(O=S=O)OH), карбонат, карбамат (-O(C=O)N<), гидроксил (-OH), альдегид (-(C=O)H), кетон (-(C=O)-), гидразин (>N-N<), изоцианат, изотиоцианат, фосфорная кислота (-O(P=O)OHOH), фосфоновая кислота (-O(P=O)OHH), галоацетил, алкилгалогенид, акрилоил, арилфторид, гидроксиламин, дисульфид, сульфонамиды, серная кислота, винилсульфон, винилкетон, диазоалкан, оксиран и азиридин.

В случае, если конъюгаты IL-2 согласно настоящему изобретению содержат одну или более кислотных или основных групп, изобретение также включает их соответствующие фармацевтически или токсикологически приемлемые соли, в частности их фармацевтически применимые соли. Таким образом, конъюгаты IL-2 согласно настоящему изобретению, содержащие кислотные группы, могут использоваться в соответствии с настоящим изобретением, например, в виде солей щелочных металлов, солей щелочноземельных металлов или солей аммония. Более точные примеры таких солей включают соли натрия, соли калия, соли кальция, соли магния или соли с аммиаком или органическими аминами, как например, этиламин, этаноламин, триэтаноламин или аминокислоты. Конъюгаты IL-2 согласно настоящему изобретению, содержащие одну или более основных групп, т.е. групп, которые могут быть протонированы, могут присутствовать и использоваться согласно настоящему изобретению в форме их аддитивных солей с неорганическими или органическими кислотами. Примеры подходящих кислот включают хлорид водорода, бромид водорода, фосфорную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, метансульфокислоту, п-толуолсульфокислоту, нафталинсульфокислоту, щавелевую кислоту, уксусную кислоту, винную кислоту, молочную кислоту, салициловую кислоту, бензойную кислоту, муравьиную кислоту, пропионовую кислоту, пивалоиловую кислоту, диэтилуксусную кислоту, малоновую кислоту, янтарную кислоту, пимелиновую кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, яблочную кислоту, сульфаминовую кислоту, фенилпропионовую кислоту, глюконовую кислоту, аскорбиновую кислоту, изоникотиновую кислоту, лимонную кислоту, адипиновую кислоту и другие кислоты, известные квалифицированным специалистам в данной области. Специалистам в данной области техники известно превращение основной группы в катион, такие как алкилирование аминной группы с получением положительно заряженной аммониевой группы и соответствующего противоиона соли. Если конъюгаты IL-2 согласно настоящему изобретению одновременно содержат кислотные и основные группы, настоящее изобретение также включает, помимо упомянутых солевых форм, внутренние соли или бетаины (цвиттерионы). Соответствующие соли могут быть получены обычными методами, которые известны специалисту в данной области, например, контактированием этих пролекарств с органической или неорганической кислотой или основанием в растворителе или диспергаторе, или путем анионного или катионного обмена с другими солями. Настоящее изобретение также включает все соли конъюгатов IL-2 согласно настоящему изобретению, которые из-за низкой физиологической совместимости не подходят напрямую для использования в фармацевтических препаратах, но которые могут использоваться, например, в качестве промежуточных продуктов для химических реакций или для приготовление фармацевтически приемлемых солей.

Термин "фармацевтически приемлемый" означает вещество, которое не наносит вред при введении пациенту и предпочтительно одобрено надзорным органом, таким как ЕМЕА (Европа) и/или FDA (США) и/или любым другим национальным надзорным органом для применения в отношении животных, предпочтительно человека.

Как применяется в настоящей заявке, термин "эксципиент" относится к разбавителю, вспомогательному средству или носителю, совместно с которым вводится терапевтическое средство, как например лекарственное средство или пролекарство. Такой фармацевтический эксципиент может представлять собой стерильную жидкость, такую как вода и масла, включая жидкости нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, включая, но без ограничения к этому, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло и тому подобное. Вода является предпочтительным эксципиентом, когда фармацевтическая композиция вводится перорально. Соляной раствор и водный раствор декстрозы являются предпочтительными наполнителями, когда фармацевтическая композиция вводится внутривенно. Соляные растворы и водные растворы декстрозы и глицерина предпочтительно применяются в качестве жидких эксципиентов для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, маннит, трегалозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, глицерин моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция при желании может содержать также небольшие количества увлажняющих или эмульгирующих средств, рН-буферных средств, таких как, например, ацетат, сукцинат, трис, карбонат, фосфат, HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфокислота, MES (2-(N-морфолин)этансульфокислота) или может содержать детергенты, такие как Tween, полоксамеры, полоксамины, CHAPS, Igepal, или аминокислоты, такие как, например, глицин, лизин или гистидин. Такие фармацевтические композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, препаратов с замедленным высвобождением и тому подобное. Фармацевтическая композиция может иметь вид суппозитория, с традиционными связующими средствами и эксципиентами, такими как триглицериды. Препарат для перорального введения может содержать стандартные эксципиенты, такие как фармацевтические марки маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество лекарственного средства или биологически активного фрагмента, вместе с подходящим количеством эксципиента, так чтобы получилась форма, подходящая для введения пациенту. Композиция должна соответствовать способу введения.

В общем термин “содержит” или “содержащий” также охватывает “состоит из” или “состоящий из”.

Соотношение Соотношение_{несимметричный IL-2} и Соотношение_{альдеслейкин} составляет более 1, предпочтительно более 2, предпочтительно более 3, предпочтительно более 4 и даже более предпочтительно более 5. Согласно определенным вариантам осуществления соотношение Соотношение_{несимметричный IL-2} и Соотношение_{альдеслейкин} составляет более 10, более 20, более 50, более 70, более 100 или более 150.

Несимметричный IL-2 фрагмент -D представляет собой IL-2 фрагмент, предпочтительно альдеслейкин, включающую

(a) по меньшей мере одно стабильное присоединение модифицирующего фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными; или

(b) по меньшей мере одну аминокислотную мутацию; или

(c) по меньшей мере одну делецию; или

любую комбинацию (a), (b) и (c).

По меньшей мере одна из модификаций, перечисленных в (a), (b) и (c) присутствует в -D и обеспечивает Соотношение_{несимметричный IL-2} больше Соотношение_{альдеслейкин} в несимметричном фрагменте IL-2. Однако, понятно, что фрагмент IL-2 может также включать одну или более модификаций, перечисленных в пунктах (a), (b) и (c), которые, если рассматривать их по отдельности, не обеспечивают Соотношение_{несимметричный IL-}2 более Соотношение_{альдеслейкин}. Такие дополнительные модификации могут, например, обеспечить улучшенные характеристики производства или хранения -D.

Согласно одному варианту осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит по меньшей мере одно стабильное присоединение модифицирующего фрагмента M_mod к фрагменту IL-2. Согласно другому варианту осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в фрагменте IL-2. Согласно другому варианту осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит по меньшей мере одну делецию в фрагменте IL-2. Согласно другому варианту осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит по меньшей мере одно стабильное присоединение модифицирующего фрагмента M_mod к фрагменту IL-2 и по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в фрагменте IL-2. Согласно другому варианту осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит по меньшей мере одно стабильное присоединение модифицирующего фрагмента M_mod к фрагменту IL-2 и по меньшей мере одну делецию в фрагменте IL-2. Согласно другому варианту осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию и по меньшей мере одну делецию в фрагменте IL-2. Согласно другому варианту осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит по меньшей мере одно стабильное присоединение модифицирующего фрагмента M_mod к фрагменту IL-2, по меньшей мере одну аминокислотную мутацию и по меньшей мере одну делецию в фрагменте IL-2.

Несимметричный фрагмент IL-2 может содержать по меньшей мере одно стабильное присоединение модифицирующего фрагмента M_mod к фрагменту IL-2. Присоединение M_mod может происходить на N-конце, C-конце, на боковой цепи аминокислоты или во внутреннем сайте фрагмента IL-2. Такой фрагмент M_mod может предпочтительно представлять собой заместитель или полимерный фрагмент. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит на N-конце фрагмента IL-2. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит на C-конце фрагмента IL-2. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит на боковой цепи аминокислоты фрагмента IL-2. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит во внутреннем сайте фрагмента IL-2. Если более чем один фрагмент M_mod присоединен к фрагменту IL-2, присоединение может происходить в любой комбинации сайтов присоединения, выбранных из группы, состоящей из N-конца, C-конца, боковой цепи аминокислотного остатка и внутреннего сайта.

Согласно одному варианту осуществления M_mod представляет собой заместитель. Предпочтительно, такой заместитель имеет молекулярную массу в интервале от 15 Да до 1 кДа.

Такой фрагмент M_mod может согласно одному варианту осуществления быть введен посредством дисульфидного мостика. Предпочтительно, такой дисульфидный мостик образуется между тиоловыми группами двух остатков цистеина. Такой дисульфидный мостик является одним примером присоединения модифицирующего фрагмента к внутреннему сайту. Согласно одному варианту осуществления эти остатки цистеина могут представлять собой встречающиеся в природе остатки цистеина. Согласно другому варианту осуществления, один или оба остатка цистеина не встречаются в природе, но были добавлены или вставлены в фрагмент IL-2, предпочтительно фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO: 2, или замещают встречающийся в природе аминокислотный остаток фрагмента IL-2, предпочтительно фрагмента IL-2 согласно SEQ ID NO:2.

Предпочтительные пути получения такого дисульфидного мостика описаны в Jones et al. (J. Am. Chem. Soc., 2012, 134 (3), pp 1847-1852), WO2011/018611, WO2011/018612 и WO2011/018613.

Предпочтительно такой дисульфидный мостик встречается в положении, которое участвует в связывании с IL-2Rα. Таким образом, предпочтительно, дисульфидный мостик приводит к пониженной аффинности несимметричного фрагмента IL-2 с IL-2Rαβ по сравнению с альдеслейкином.

Согласно одному варианту осуществления дисульфидный мостик образован между C57 и C104, если фрагмент IL-2 имеет последовательность SEQ ID NO:2.

Согласно другому варианту осуществления M_mod представляет собой полимерный фрагмент. Такой полимерный фрагмент может включать линейный, разветвленный или многоразветвленный полимер. Согласно одному варианту осуществления полимер представляет собой линейный полимер. Согласно другому варианту осуществления полимер представляет собой разветвленный полимер. Такой разветвленный полимер предпочтительно имеет одну, две, три, четыре или пять точек разветвления. Из каждой точки разветвления предпочтительно выходят две, три или четыре полимерные цепи. Согласно другому варианту осуществления полимер представляет собой многоразветвленный полимер. Такой многоразветвленный полимер предпочтительно имеет 3, 4, 5, 6, 7 или 8 полимерных цепей.

Если M_mod представляет собой полимерный фрагмент, такой полимерный фрагмент предпочтительно имеет молекулярную массу в интервале от 0.5 кДа до 1000 кДа, как например от 1 кДа до 1000 кДа, более предпочтительно от 2 кДа до 500 кДа, даже более предпочтительно от 3 кДа до 200 кДа, наиболее предпочтительно от 5 кДа до 120 кДа или имеет молекулярную массу в интервале от 7 до 40 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу около 0.5 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу около 1 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу около 2 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу около 3 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу около 4 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу около 5 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу около 7.5 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 10 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 15 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 20 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 30 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 40 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 50 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 70 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 80 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 90 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу около 100 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу 0.5 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу 1 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу 2 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу 3 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу 4 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу 5 кДа. Согласно одному варианту осуществления такой полимер имеет молекулярную массу 7.5 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 10 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 15 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 20 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 30 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 40 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 50 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 70 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 80 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 90 кДа. Согласно другому варианту осуществления такой полимерный фрагмент имеет молекулярную массу 100 кДа.

Если M_mod представляет собой полимерный фрагмент, такой полимерный фрагмент предпочтительно содержит полимер, выбранный из группы, состоящей из 2-метакрилоил-оксиэтила фосфоилхолинов, поли(акриловых кислот), поли(акрилатов), поли(акриламидов), поли(алкилокси) полимеров, поли(амидов), поли(амидоаминов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(аспартамидов), поли(масляных кислот), поли(гликолевых кислот), полибутилентерефталатов, поли(капролактонов), поли(карбонатов), поли(цианоакрилатов), поли(диметилакриламидов), поли(сложных эфиров), поли(этиленов), поли(этиленгликолей), поли(этиленоксидов), поли(этилфосфатов), поли(этилоксазолинов), поли(гликолевых кислот), поли(гидроксиэтилакрилатов), поли(гидроксиэтил-оксазолинов), поли(гидроксипропил метакрилатов), поли(гидроксипропилоксазолинов), поли(иминокарбонатов), поли(молочных кислот), поли(сополимеров молочных и гликолевых кислот), поли(метакриламидов), поли(метакрилатов), поли(метилоксазолинов), поли(органофосфазенов), поли(ортосложных эфиров), поли(оксазолинов), поли(пропиленгликолей), поли(силоксанов), поли(уретанов), поли(виниловых спиртов), поли(виниламинов), поли(винилметиловых простых эфиров), поли(винилпирролидонов), силиконов, целлюлоз, карбометилцеллюлоз, гидроксипропил метилцеллюлоз, хитинов, хитозанов, декстранов, декстринов, желатинов, гиалуроновых кислот и производных, функционализированных гиалуроновых кислот, маннанов, пектинов, рамногалактуронанов, крахмалов, гидроксиалкил крахмалов, гидроксиэтил крахмалов и других полимеров на основе углеводов, ксиланов и их сополимеров.

Согласно одному варианту осуществления M_mod представляет собой полимер на основе ПЭГ.

Согласно другому варианту осуществления M_mod представляет собой полимер на основе гиалуроновой кислоты.

Согласно другому варианту осуществления M_mod содержит пептидный или белковый фрагмент. Согласно одному варианту осуществления такой пептидный или белковый фрагмент M_mod может быть трансляционно слит с фрагментом IL-2, содержащимся в несимметричном IL-2. Согласно другому варианту осуществления такой пептидный или белковый фрагмент M_mod может быть химически конъюгирован с фрагментом IL-2, содержащимся в несимметричном IL-2. Предпочтительно, этот пептидный или белковый фрагмент M_mod не представляет собой составляющую IL-2 или фрагмент IL-2.

M_mod в форме пептидного или белкового фрагмента может представлять собой фрагмент синтетического или природного белка или его часть, или вариант. Примеры не-IL-2 фрагментов включают альбумин; домены антител, такие как домены Fc или антигенсвязывающие домены иммуноглобулинов; CTP и CD25; каждый либо в их природной форме, либо как вариант или составляющая.

Пептидный или белковый фрагмент M_mod, слитый с фрагментом IL-2, может быть присоединен к N-концу или C-концу или может быть вставлен во внутреннее положение фрагмента IL-2. Понятно, что более чем один пептидный или белковый фрагмент M_mod может быть трансляционно слит или химически конъюгирован и/или вставлен в фрагмент IL-2. Указанный более чем один пептидный или белковый фрагмент M_mod может иметь такую же или другую последовательность. Например, несимметричный фрагмент IL-2 может иметь первый пептидный или белковый фрагмент M_mod, трансляционно слитый или химически конъюгированный с N-концом фрагмента IL-2, и второй пептидный или белковый фрагмент M_mod, трансляционно слитый или химически конъюгированный с C-концом фрагмента IL-2. В другом примере, несимметричный фрагмент IL-2 может содержать первый пептидный или белковый фрагмент M_mod, трансляционно слитый или химически конъюгированный с N-концом фрагмента IL-2, и второй пептидный или белковый фрагмент M_mod, трансляционно слитый или химически конъюгированный во внутреннее положение фрагмента IL-2. В другом примере, несимметричный фрагмент IL-2 может содержать первый пептидный или белковый фрагмент M_mod, трансляционно слитый или химически конъюгированный с C-концом фрагмента IL-2, и второй пептидный или белковый фрагмент M_mod, трансляционно слитый или химически конъюгированный во внутреннее положение фрагмента IL-2. В другом примере несимметричный фрагмент IL-2 может содержать первый пептидный или белковый фрагмент M_mod, трансляционно слитый или химически конъюгированный с N-концом фрагмента IL-2, второй пептидный или белковый фрагмент M_mod, трансляционно слитый или химически конъюгированный с C-концом фрагмента IL-2, и третий пептидный или белковый фрагмент M_mod, трансляционно слитый или химически конъюгированный во внутреннее положение фрагмента IL-2.

Присоединение M_mod может быть в положении протеиногенного или непротеиногенного аминокислотного остатка фрагмента IL-2. Согласно определенному варианту осуществления присоединение M_mod происходит к протеиногенной аминокислоте. Такой протеиногенный аминокислотный остаток предпочтительно выбирается из группы, состоящей из цистеина, метионина, гистидина, лизина, триптофана, серина, треонина, тирозиана, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина и аргиниан. Согласно определенному варианту осуществления присоединение M_mod происходит к непротеиногенной аминокислоте. Если модифицирующий фрагмент присоединен к непротеиногенному аминокислотному остатку, понятно, что такой непротеиногенный аминокислотный остаток искусственно вводится в фрагмент IL-2. Такой непротеиногенный аминокислотный остаток может представлять собой любой непротеиногенный аминокислотный остаток, имеющий функциональную группу, доступную для конъюгирования M_mod с фрагментом IL-2. Согласно определенному варианту осуществления такие непротеиногенные аминокислоты содержат функциональную группу в своих боковых цепях, выбранные из группы, состоящей из карбонила; карбонильных производных, таких как карбонилподобные, меченые карбонильные и защищенные карбонильные группы; азида; оксима; и гидроксиламина.

Согласно определенным вариантам осуществления такая непротеиногенная аминокислота представляет собой непротеиногенную аминокислоту, как описано в WO2006/069246A2, эти непротеиногенные аминокислоты включены в настоящий документ посредством ссылки. Согласно определенному варианту осуществления непротеиногенная аминокислота имеет структуру, описанную формулой (I) в [00265] до [00283], формулой (XXX) в [00284], формулой (XXX-A) в [00285], формулой (XXX-B) в [00286], формулой (XXXI) в [00287], формулой (XXXI-A) в [00288], формулой (XXXI-B) в [00289], формулой (XXXII) в [00290], формулой (XXXII-A) в [00291], формулой (XXXII-B) в [00292], формулой (XXXX) в [00293], формулой (XXXXI) в [00294], формулой (XXXXII) в неправильно помеченном абзаце [0100], т.е. абзаце между [00294] м [00295], формулой (XXXXIII) в [00295] и [00296], формулой (XIV) в [00302] до [00305], формулой (XV) в [00306] и [00307], формулой (XI) в [00310] до [00312], формулой (XII) в [00313], формулой (XII) в [00314] и [00315], формулой (XIV) в [00316], формулой (XVI) в [00317], формулой (XVI) в [00318] и [00319], формулой (XVIII) в [00320] и [00321], или формулой (XXIX) в [00530] в WO2006/069246A2, эти непротеиногенные аминокислоты включены в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно одному варианту осуществления присоединение M_mod происходит в лизиновом остатке фрагмента IL-2, таком как лизиновый остаток, выбранный из группы, состоящей из K7, K8, K31, K34, K42, K47, K48, K53, K63, K75 и K96 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных лизиновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных лизиновых остатках. Понятно, что 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 11 лизиновых остатков согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше лизиновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 11 лизиновых остатков могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа лизиновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте последовательности SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному лизиновому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум лизиновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем лизиновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления четыре фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к четырем лизиновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления пять фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к пяти лизиновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления шесть фрагментов M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к шести лизиновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в треониновом остатке фрагмента IL-2, таком как треониновый остаток, выбранный из группы, состоящей из T2, T6, T9, T36, T40, T50, T100, T101, T110, T112, T122, T130 и T132 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных треониновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных треониновых остатках. Понятно, что 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 треониновых остатков согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше треониновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 13 треониновых остатков могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа треониновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному треониновому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум треониновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем треониновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления четыре фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к четырем треониновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления пять фрагментов M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к пяти треониновым остаткам согласно SEQ ID NO:1 или ее гомолога или варианта. Согласно другому варианту осуществления шесть фрагментов M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к шести треониновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в сериновом остатке фрагмента IL-2, таком как сериновый остаток, выбранный из группы, состоящей из S3, S4, S5, S74, S86, S98, S124, S126 и S129 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных сериновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных сериновых остатках. Понятно, что 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 сериновых остатков согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше сеиновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 9 сериновых остатков могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа сеиновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному сериновому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум сериновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем сериновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления четыре фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к четырем сериновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления пять фрагментов M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к пяти сериновым остаткам согласно SEQ ID NO:1 или ее гомолога или варианта. Согласно другому варианту осуществления шесть фрагментов M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к шести сериновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в тирозиновом остатке фрагмента IL-2, таком как тирозиновый остаток, выбранный из группы, состоящей из Y30, Y44 и Y106 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных тирозиновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных тирозиновых остатках. Понятно, что 1, 2 или 3 тирозиновых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше тирозиновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 3 тирозиновых остатка могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа тирозиновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному тирозиновому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум тирозиновым остатка согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем тирозиновым остатка согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в гистидиновом остатке фрагмента IL-2, таком как гистидиновый остаток, выбранный из группы, состоящей из H15, H54 и H78 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных гистидиновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных гистидиновых остатках. Понятно, что 1, 2 или 3 гистидиновых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше гистидиновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 3 гистидиновых остатка могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа гистидин остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному гистидиновому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум гистидиновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем гистидиновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в триптофановом остатке фрагмента IL-2, таком как триптофановый остаток в положении W120 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующем положении гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных триптофановых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных триптофановых остатках. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше триптофановых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем один триптофановый остаток может применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа триптофановых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному триптофановому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в остатке аспарагиновой кислоты IL-2, таком как остаток аспарагиновой кислоты, выбранный из группы, состоящей из D19, D83 и D108 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных остатков аспарагиновой кислоты по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных остатках аспарагиновой кислоты. Понятно, что 1, 2 или 3 остатка аспарагиновой кислоты согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше остатков аспарагиновой кислоты, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 3 остатка аспарагиновой кислоты могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа остатков аспарагиновой кислоты, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному остатку аспарагиновой кислоты согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум остаткам аспарагиновой кислоты согласно SEQ ID NO:2 или ее гомолога или варианта. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем остаткам аспарагиновой кислоты согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно одному варианту осуществления присоединение M_mod происходит в остатке глутаминовой кислоты фрагмента IL-2, таком как остаток глутаминовой кислоты, выбранный из группы, состоящей из E14, E51, E59, E60, E61, E66, E67, E94, E99, E105, E109 и E115 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных остатков глутаминовой кислоты по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных остатках глутаминовой кислоты. Понятно, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остатков глутаминовой кислоты согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше остатков глутаминовой кислоты, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 12 остатков глутаминовой кислоты могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа остатков глутаминовой кислоты, присутствующих в таком гомологе или варианте последовательности SEQ ID NO:2, могут применяться для присоединения одной или более модифицирующих фрагментов. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному остатку глутаминовой кислоты согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум остаткам глутаминовой кислоты согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем остаткам глутаминовой кислоты согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления четыре фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к четырем остаткам глутаминовой кислоты согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления пять фрагментов M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к пяти остаткам глутаминовой кислоты согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления шесть фрагментов M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к шести остаткам глутаминовой кислоты согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в аргининовом остатке фрагмента IL-2, таком как аргининовый остаток, выбранный из группы, состоящей из R37, R80, R82 и R119 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных аргининовых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных аргининовых остатках. Понятно, что 1, 2, 3 или 4 аргининовых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше аргининовых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 4 аргининовых остатка могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа аргининовых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному аргининовому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум аргининовым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем аргининовым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления четыре фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к четырем аргининовым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в цистеиновом остатке фрагмента IL-2, таком как цистеиновый остаток, выбранный из группы, состоящей из C57 и C104 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных цистеиновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных цистеиновых остатках. Понятно, что 1 или 2 цистеиновых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше цистеиновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 2 цистеиновых остатка могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа цистеиновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному цистеиновому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум цистеиновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в метиониновом остатке фрагмента IL-2, таком как метиониновый остаток, выбранный из группы, состоящей из M22, M38, M45 и M103 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных метиониновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных метиониновых остатках. Понятно, что 1, 2, 3 или 4 метиониновых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения одной или модифицирующих фрагментов. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше метиониновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 4 метиониновых остатка могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа метиониновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному метиониновому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум метиониновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем метиониновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления четыре фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к четырем метиониновым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Согласно другому варианту осуществления присоединение M_mod происходит в глутаминовом остатке фрагмента IL-2, таком как глутаминовый остаток, выбранный из группы, состоящей из Q10, Q12, Q21, Q56, Q73 и Q125 согласно SEQ ID NO: 2 или в соответствующих положениях гомологов или вариантов SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных глутаминовых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таких дополнительных глутаминовых остатках. Понятно, что 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 глутаминовых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения M_mod. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и содержит больше глутаминовых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 6 глутаминовых остатков могут применяться для присоединения M_mod, т.е. до максимального числа глутаминовых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения M_mod. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент M_mod присоединен к одному глутаминовому остатку согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления два фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к двум глутаминовым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления три фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к трем глутаминовым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления четыре фрагмента M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к четырем глутаминовым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления пять фрагментов M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к пяти глутаминовым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту. Согласно другому варианту осуществления шесть фрагментов M_mod, которые могут быть одинаковыми или различными, присоединены к шести глутаминовым остаткам согласно SEQ ID NO:2 или ее гомологу или варианту.

Понятно, что согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 может иметь фрагменты M_mod, присоединенные к более чем одному типу аминокислотного остатка, как например к цистеину и лизину.

Присоединение M_mod к фрагменту IL-2 происходит через стабильную ковалентную связь. Согласно определенным вариантам осуществления связь между фрагментом IL-2 и фрагментом M_mod происходит через амид. Согласно определенным вариантам осуществления связь между фрагментом IL-2 и фрагментом M_mod происходит через фрагмент .

Предпочтительно, присоединение по меньшей мере одного фрагмента M_mod происходит в аминокислотном положении фрагмента
IL-2, которое, как известно, участвует в связывании с IL-2Rα. Таким образом, предпочтительно, присоединение по меньшей мере одного фрагмента M_mod приводит к существенно пониженной аффинности фрагмента IL-2, в частности варианта фрагмента IL-2 согласно SEQ ID NO: 2, к IL-2Rαβ по сравнению с альдеслейкином, т.е. приводит к несимметричному фрагменту IL-2.

Предпочтительно присоединение M_mod происходит в положении аминокислоты, выбранном из группы, состоящей из K34, R37, M38, T40, F41, K42, F43, Y44, E61 и L71, согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Даже более предпочтительно присоединение M_mod происходит в положении аминокислоты, выбранном из группы, состоящей из F41, Y44, E61 и L71 согласно SEQ ID NO:2, или соответствующих положений е гомологов или вариантов. Понятно, что не все эти аминокислотные положения содержат функциональную группу, которая позволяет осуществлять прямую конъюгацию M_mod, и что определенные стадии могут быть необходимы до присоединения M_mod в этих аминокислотных положениях, такие как, например, замена встречающейся в природе аминокислоты на другую аминокислоту или выполнение определенных химических модификаций. Соответственно, присоединение M_mod может происходить в этих положениях либо у встречающейся в природе аминокислоты, либо у аминокислоты, которая заменяет встречающуюся в природе аминокислоту в этом конкретном положении, и сайт присоединения может составлять протеиногенную или непротеиногенную аминокислоту, причем варианты осуществления обоих описаны выше. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении K34 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении R37 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении M38 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении T40 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении F41 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении K42 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении F43 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении Y44 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении E61 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления присоединение M_mod происходит в аминокислотном положении L71 согласно SEQ ID NO:2 или соответствующем положении ее гомологов или вариантов.

Согласно определенным вариантам осуществления M_mod имеет формулу (A-1)

(A-1),

где

-FG-представляет собой связь;

-SP-представляет собой спейсерный фрагмент; и

-POL представляет собой полимер.

Согласно определенным вариантам осуществления -FG-формулы (A-1) представляет собой

; где пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому серы фрагмента IL -2, а непомеченная пунктирная линия указывает присоединение -SP-. Указанный атом серы может представлять собой атом серы, обеспеченный боковой цепью цистеина.

Согласно определенным вариантам осуществления -FG-формулы (A-1) представляет собой

; где пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому азота в фрагменте IL-2, и непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -SP-. Указанный атом азота может представлять собой атом азота N-концевого амина или азот боковой цепи лизина фрагмента IL-2. Согласно определенным вариантам осуществления указанный атом азота представляет собой атом азота N-концевого амина фрагмента IL-2. Согласно определенным вариантам осуществления такой атом азота представляет собой атом азота боковой цепи лизина фрагмента IL-2.

Согласно определенным вариантам осуществления -FG-формулы (A-1) представляет собой

; где пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому серы и азота фрагмента IL-2; непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -SP-, и a1 выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19 и 20. Указанный атом серы может представлять собой атом серы, обеспеченный боковой цепью цистеина, и указанный атом азота может представлять собой атом азота N--концевого амина или азот боковой цепи лизина фрагмента IL-2. Согласно определенным вариантам осуществления пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому серы, где атом серы обеспечен боковой цепью цистеина. Согласно определенным вариантам осуществления a1 представляет собой целое число в интервале от 1 до 8. Согласно определенным вариантам осуществления a1 представляет собой целое число в интервале от 1 до 6. Согласно определенным вариантам осуществления a1 представляет собой целое число в интервале от 1 до 4. Согласно определенным вариантам осуществления a1 представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления a1 представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления a1 представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления a1 представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления a1 представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления a1 представляет собой 6.

Согласно определенным вариантам осуществления -FG-формулы (A-1) представляет собой

; где пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому серы и азота фрагмента IL-2; непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -SP-, и a2 выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19 и 20. Согласно определенным вариантам осуществления a2 представляет собой целое число в интервале от 1 до 8. Согласно определенным вариантам осуществления a2 представляет собой целое число в интервале от 1 до 6. Согласно определенным вариантам осуществления a2 представляет собой целое число в интервале от 1 до 4. Согласно определенным вариантам осуществления a2 представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления a2 представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления a2 представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления a2 представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления a2 представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления a2 представляет собой 6. Указанный атом серы может представлять собой атом серы, обеспеченный боковой цепью цистеина, и указанный атом азота может представлять собой атом азота N--концевого амина или азот боковой цепи лизина фрагмента IL-2. Согласно определенным вариантам осуществления пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому серы, где атом серы обеспечен боковой цепью цистеина.

Согласно определенным вариантам осуществления -SP-формулы (A-1) выбран из группы, состоящей из C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила, и C_2-50 алкинила; где C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно замещены одним или более R⁹, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R¹⁰)-, -S(O)₂N(R¹⁰)-, -S(O)N(R¹⁰)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R¹⁰)S(O)₂N(R^10a)-, -S-, -N(R¹⁰)-, -OC(OR¹⁰)(R^10a)-, -N(R¹⁰)C(O)N(R^10a)-, и -OC(O)N(R¹⁰)-;

каждый T независимо выбран из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила, 8-11-ти членного гетеробициклила, 8-30-ти членного карбополициклила, и 8-30-ти членного гетерополициклила; где каждый T необязательно независимо замещен одним или более R⁹, которые являются одинаковыми или различными;

каждый -R⁹ независимо выбран из группы, состоящей из галогена, -CN, оксо (=O), -COOR¹¹, -OR¹¹, -C(O)R¹¹, -C(O)N(R¹¹R^11a), -S(O)₂N(R¹¹R^11a), -S(O)N(R¹¹R^11a), -S(O)₂R¹¹, -S(O)R¹¹, -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11aR^11b), -SR¹¹, -N(R¹¹R^11a), -NO₂, -OC(O)R¹¹, -N(R¹¹)C(O)R^11a, -N(R¹¹)S(O)₂R^11a, -N(R¹¹)S(O)R^11a, -N(R¹¹)C(O)OR^11a, -N(R¹¹)C(O)N(R^11aR^11b), -OC(O)N(R¹¹R^11a), и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными; и

каждый -R¹⁰, -R^10a, -R¹¹, -R^11a и -R^11b независимо выбран из группы, состоящей из -H и C_1-6 алкила, где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными.

Согласно определенным вариантам осуществления -SP-формулы (A-1) представляет собой C_1-20 алкил, где C_1-20 алкил необязательно замещенного одним или более -R⁹, и где C_1-20 алкил необязательно прерывается одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -O-, -C(O)N(R¹⁰)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -S-, -N(R¹⁰)-, -OC(OR¹⁰)(R^10a)-, -N(R¹⁰)C(O)N(R^10a)-, и -OC(O)N(R¹⁰)-; где каждый -R⁹ выбран из группы, состоящей из C_1-6 алкила; и каждый -R¹⁰ и -R^10a независимо выбран из группы, состоящей из -H и C_1-6 алкила.

Согласно определенным вариантам осуществления -SP-формулы (A-1) представляет собой C_1-10 алкил, где C_1-10 алкил необязательно замещен одним или более -R⁹, и где C_1-10 алкил необязательно прерывается одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -O-, -C(O)N(R¹⁰)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -S-, -N(R¹⁰)-, -OC(OR¹⁰)(R^10a)-, -N(R¹⁰)C(O)N(R^10a)-, и -OC(O)N(R¹⁰)-; где каждый -R⁹ выбран из группы, состоящей из C_1-6 алкила; и каждый -R¹⁰ и -R^10a независимо выбран из группы, состоящей из -H и C_1-6 алкила.

Согласно определенным вариантам осуществления -POL формулы (A-1) представляет собой полимер на основе ПЭГ. Согласно определенным вариантам осуществления -POL имеет формулу (A-1i)

(A-1i),

где

пунктирная линия показывает присоединение к -SP-;

m представляет собой 0 или 1;

p представляет собой целое число в интервале от 12 до 22700; и

q выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, и 6.

Согласно определенным вариантам осуществления m формулы (A-1i) представляет собой 0. Согласно определенным вариантам осуществления m формулы (A-1i) представляет собой 1.

Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) представляет собой целое число в интервале от 23 до 227000, как например от 45 до 11300, или от 69 до 4540, или от 114 до 2700. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 12. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 23. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 46. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 68. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 90. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 112. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 170. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 227. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 680. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 900. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 1130. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 1350. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 1590. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 1800. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 2045. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1i) составляет около 2275.

Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1i) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1i) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1i) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1i) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1i) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1i) представляет собой 6.

Согласно определенным вариантам осуществления -POL формулы (A-1) имеет формулу (A-1ii)

(A-1ii),

где

пунктирная линия показывает присоединение к -SP-;

FG представляет собой функциональную группу;

m представляет собой 0 или 1;

p представляет собой целое число в интервале от 12 до 22700; и

q выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, и 6.

Если фрагмент M_mod формулы (A-1) должен быть конъюгирован с дополнительными фрагментами, такими как один или более фрагментов -L¹-L²-Z, предпочтительно, если фрагмент POL заканчивается функциональной группой. Подразумевается, что если POL имеет формулу (A-1ii), такое соединение является реагентом, и что после конъюгирования такого одного или более фрагментов, таких как один или более фрагментов -L¹-L²-Z, с функциональной группой указанного реагента, FG более не присутствует, но образует связь с подходящей функциональной группой, присутствующей в форме реагента одного или более дополнительных фрагментов.

Также понятно, что также другие сайты присоединения для фрагментов, подлежащих конъюгированию с M_mod, таких как фрагменты -L¹-L²-Z, могут быть возможны.

Согласно определенным вариантам осуществления m формулы (A-1ii) представляет собой 0. Согласно определенным вариантам осуществления m формулы (A-1ii) представляет собой 1.

Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) представляет собой целое число в интервале от 23 до 227000, как например от 45 до 11300, или от 69 до 4540, или от 114 до 2700. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 12. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 23. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 46. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 68. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 90. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 112. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 170. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 227. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 680. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 900. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 1130. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 1350. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 1590. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 1800. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 2045. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-1ii) составляет около 2275.

Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1ii) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1ii) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1ii) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1ii) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1ii) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-1ii) представляет собой 6.

Если дополнительный фрагмент, такой как фрагмент -L¹-L²-Z, конъюгирован с M_mod через фрагмент -POL формулы (A-1), фрагмент -POL может иметь формулы (A-1iii), (A-1iv), (A-1v) или (A-1vi)

(A-1iii)

(A-1iv)

(A-1v)

(A-1vi),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к дополнительному фрагменту, как например к фрагменту -L¹-L²-Z;

непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -SP-; и

m, p и q имеют значения, как определено в формуле (A-1i).

Согласно определенным вариантам осуществления дополнительный фрагмент, такой как фрагмент -L¹-L²-Z, конъюгирован с M_mod через фрагмент -POL формулы (A-1), с получением фрагмента -POL формулы (A-1iii). Согласно определенным вариантам осуществления дополнительный фрагмент, такой как фрагмент -L¹-L²-Z, конъюгирован с M_mod через фрагмент -POL формулы (A-1), с получением фрагмента -POL формулы (A-1iv). Согласно определенным вариантам осуществления дополнительный фрагмент, такой как фрагмент -L¹-L²-Z, конъюгирован с M_mod через фрагмент -POL формулы (A-1), с получением фрагмента -POL формулы (A-1v). Согласно определенным вариантам осуществления дополнительный фрагмент, такой как фрагмент -L¹-L²-Z, конъюгирован с M_mod через фрагмент -POL формулы (A-1), с получением фрагмента -POL формулы (A-1vi).

Согласно определенным вариантам осуществления -POL формулы (A-1) представляет собой полимер на основе гиалуроновой кислоты.

Согласно определенным вариантам осуществления M_mod имеет формулу (A-1a)

(A-1a),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому серы боковой цепи аминокислотного остатка фрагмента IL-2;

b1 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19 и 20;

b2 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19 и 20; и

b3 представляет собой целое число в интервале от 12 до 22700.

Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой целое число в интервале от 1 до 8. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой целое число в интервале от 1 до 6. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой целое число в интервале от 1 до 4. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 6.

Согласно определенным вариантам осуществления b2 формулы (A-1a) представляет собой целое число в интервале от 1 до 8. Согласно определенным вариантам осуществления b2 формулы (A-1a) представляет собой целое число в интервале от 1 до 6. Согласно определенным вариантам осуществления b2 формулы (A-1a) представляет собой целое число в интервале от 1 до 4. Согласно определенным вариантам осуществления b2 формулы (A-1a) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления b2 формулы (A-1a) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления b2 формулы (A-1a) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления b2 формулы (A-1a) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления b2 формулы (A-1a) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления b2 формулы (A-1a) представляет собой 6.

Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) представляет собой целое число в интервале от 23 до 227000, как например от 45 до 11300, или от 69 до 4540, или от 114 до 2700. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 12. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 23. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 46. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 68. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 90. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 112. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 170. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 227. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 680. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 900. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 1130. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 1350. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 1590. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 1800. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 2045. Согласно определенным вариантам осуществления b3 формулы (A-1a) составляет около 2275.

Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 12. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 23. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 46. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 68. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 90. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 112. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 170. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 227. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления b1 формулы (A-1a) представляет собой 2, b2 формулы (A-1a) представляет собой 3, и b3 формулы (A-1a) составляет около 450.

Согласно определенным вариантам осуществления M_mod имеет формулу (A-1b)

(A-1b),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому серы боковой цепи аминокислотного остатка фрагмента IL-2;

c1 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19 и 20;

c2 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19 и 20; и

c3 представляет собой целое число в интервале от 12 до 22700.

Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой целое число в интервале от 1 до 8. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой целое число в интервале от 1 до 6. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой целое число в интервале от 1 до 4. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 6.

Согласно определенным вариантам осуществления c2 формулы (A-1b) представляет собой целое число в интервале от 1 до 8. Согласно определенным вариантам осуществления c2 формулы (A-1b) представляет собой целое число в интервале от 1 до 6. Согласно определенным вариантам осуществления c2 формулы (A-1b) представляет собой целое число в интервале от 1 до 4. Согласно определенным вариантам осуществления c2 формулы (A-1b) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления c2 формулы (A-1b) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления c2 формулы (A-1b) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления c2 формулы (A-1b) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления c2 формулы (A-1b) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления c2 формулы (A-1b) представляет собой 6.

Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) представляет собой целое число в интервале от 23 до 227000, как например от 45 до 11300, или от 69 до 4540, или от 114 до 2700. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 12. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 23. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 46. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 68. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 90. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 112. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 170. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 227. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 680. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 900. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 1130. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 1350. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 1590. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 1800. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 2045. Согласно определенным вариантам осуществления c3 формулы (A-1b) составляет около 2275.

Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 12. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 23. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 46. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 68. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 90. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 112. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 170. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 227. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления c1 формулы (A-1b) представляет собой 2, c2 формулы (A-1b) представляет собой 3, и c3 формулы (A-1b) составляет около 450.

Согласно определенным вариантам осуществления M_mod имеет формулу (A-1c)

(A-1c),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому серы боковой цепи аминокислотного остатка фрагмента IL-2;

d1 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19 и 20;

d2 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. 19 и 20; и

d3 представляет собой целое число в интервале от 12 до 22700.

Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой целое число в интервале от 1 до 8. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой целое число в интервале от 1 до 6. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой целое число в интервале от 1 до 4. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 6.

Согласно определенным вариантам осуществления d2 формулы (A-1c) представляет собой целое число в интервале от 1 до 8. Согласно определенным вариантам осуществления d2 формулы (A-1c) представляет собой целое число в интервале от 1 до 6. Согласно определенным вариантам осуществления d2 формулы (A-1c) представляет собой целое число в интервале от 1 до 4. Согласно определенным вариантам осуществления d2 формулы (A-1c) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления d2 формулы (A-1c) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления d2 формулы (A-1c) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления d2 формулы (A-1c) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления d2 формулы (A-1c) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления d2 формулы (A-1c) представляет собой 6.

Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) представляет собой целое число в интервале от 23 до 227000, как например от 45 до 11300, или от 69 до 4540, от 114 до 2700 или от 160 до 900. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 12. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 23. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 46. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 68. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 90. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 112. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 170. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 227. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 680. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 900. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 1130. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 1350. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 1590. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 1800. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 2045. Согласно определенным вариантам осуществления d3 формулы (A-1c) составляет около 2275.

Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1cd) составляет около 12. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1c) составляет около 23. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1c) составляет около 46. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1c) составляет около 68. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1c) составляет около 90. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1c) составляет около 112. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1c) составляет около 170. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1c) составляет около 227. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1c) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления d1 формулы (A-1c) представляет собой 2, d2 формулы (A-1c) представляет собой 3, и d3 формулы (A-1c) составляет около 450.

Несимметричный фрагмент IL-2 может содержать фрагмент IL-2, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию, как например одну аминокислотную мутацию, две аминокислотные мутации, три аминокислотные мутации, четыре аминокислотные мутации, пять аминокислотных мутаций, шесть аминокислотных мутаций, семь аминокислотных мутаций, восемь аминокислотных мутаций, девять аминокислотных мутаций или десять аминокислотных мутаций. Такая аминокислота мутацию предпочтительно происходит в положении, которое участвует в связывании с IL-2Rα. Таким образом, предпочтительно, по меньшей мере, аминокислотная мутация приводит к снижению аффинности несимметричного фрагмента IL-2 с IL-2Rαβ по сравнению с альдеслейкином.

Предпочтительно по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в положении аминокислоты, выбранном из группы, состоящей из K34, R37, M38, T40, F41, K42, F43, Y44, E61, и L71, согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Даже более предпочтительно по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в положении аминокислоты, выбранном из группы, состоящей из F41, Y44, E61 и L71 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении K34 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении R37 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении M38 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении T40 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении F41 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении K42 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении F43 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении Y44 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении E61 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация происходит в аминокислотном положении L71 согласно SEQ ID NO:2 или в соответствующих положениях ее гомологов или вариантов.

Согласно определенным вариантам осуществления такие мутации представляют собой замену встречающейся в природе аминокислоты на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аланина, аргинина, аспарагина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина, глутаминовой кислоты, глицина, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана и тирозина. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на аланин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на аргинин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на аспарагин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на аспарагиновую кислоту. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на цистеин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на глутамин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на глутаминовую кислоту. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на глицин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на гистидин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на лизин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на серин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на треонин. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на триптофан. Согласно определенным вариантам осуществления аминокислота природного происхождения заменена на тирозин. Согласно определенным вариантам осуществления такие мутации представляют собой замену встречающейся в природе аминокислоты на аминокислотный остаток, выбранный из группы, состоящей из аргинина, аспарагиновой кислоты, цистеина, глутамина, глутаминовой кислоты, гистидина, лизина, серина, треонина, триптофана и тирозина. Согласно определенному варианту осуществления такие мутации представляют собой замену встречающейся в природе аминокислоты аминокислотным остатком, выбранным из группы, состоящей из цистеина, глутаминовой кислоты, лизина, серина, треонина и тирозина. Согласно определенному варианту осуществления встречающаяся в природе аминокислота заменена непротеиногенной аминокислотой. Варианты осуществления таких непротеиногенных аминокислот описаны выше.

Согласно одному варианту осуществления IL-2 несимметричного фрагмента IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из K34A, K34C, K34G, K34S, K34T, K34Q, K34E, K34N, K34D, K34H, K34W, K34Y и K34R, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34A мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34G мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34S мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34T мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34Q мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34E мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34D мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34H мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34W мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34Y мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит K34R мутацию.

Согласно одному варианту осуществления IL-2 фрагмент несимметричного фрагмента IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из R37A, R37C, R37G, R37S, R37T, R37Q, R37E, R37N, R37D, R37H, R37W, R37Y и R37K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37A мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37G мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37S мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37T мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37Q мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37E мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37N мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37D мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37H мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37K мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37W мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37Y мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит R37K мутацию.

Согласно одному варианту осуществления по меньшей мере одна аминокислотная мутация выбран из группы, состоящей из F41A, F41C, F41G, F41S, F41T, F41Q, F41E, F41N, F41D, F41R, F41K, Y44A, Y44C, Y44G, Y44S, Y44T, Y44Q, Y44E, Y44N, Y44D, Y44R, Y44K, L71C, L71G, L71A, L71S, L71T, L71Q, L71E, L71N, L71D, L71R, и L71K, согласно SEQ ID NO: 2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов.

Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 несимметричного фрагмента IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из F41A, F41C, F41G, F41S, F41T, F41Q, F41E, F41N, F41D, F41R, F41H, F41W, F41Y и F41K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из F41A, F41C, F41G, F41S, F41T, F41Q, F41E, F41N, F41D, F41R и F41K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно одному варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41A мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41C мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41G мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41S мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41T мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41Q мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41E мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41N мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41D мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41R мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41H мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41W мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41Y мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41K мутацию.

Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из Y44A, Y44C, Y44G, Y44S, Y44T, Y44Q, Y44E, Y44N, Y44D, Y44R, Y44H, Y44W и Y44K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из Y44A, Y44C, Y44G, Y44S, Y44T, Y44Q, Y44E, Y44N, Y44D, Y44R и Y44K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно одному варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44A мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44C мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44G мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44S мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44T мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44Q мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44E мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44N мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44D мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44R мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44H мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44W мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y44K мутацию.

Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из L71G, L71C, L71A, L71S, L71T, L71Q, L71E, L71N, L71D, L71R, L71H, L71W, L71Y и L71K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из L71G, L71C, L71A, L71S, L71T, L71Q, L71E, L71N, L71D, L71R и L71K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно одному варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72G мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72C мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72A мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72S мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72T мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72Q мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72E мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72N мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72D мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72R мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72H мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72W мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72Y мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит L72K мутацию.

Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из F41A, F41C, F41G, F41S, F41T, F41Q, F41E, F41N, F41D, F41R и F41K и дополнительную аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из Y44A, Y44C, Y44G, Y44S, Y44T, Y44Q, Y44E, Y44N, Y44D, Y44R и Y44K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно одному варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41A и Y44A мутации. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41C мутацию и Y44A мутации. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41A и Y44C мутации.

Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из F41A, F41C, F41G, F41S, F41T, F41Q, F41E, F41N, F41D, F41R и F41K и дополнительную аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из L71G, L71C, L71A, L71S, L71T, L71Q, L71E, L71N, L71D, L71R и L71K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно одному варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F42A и L72G мутации. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F42C и L72G мутацию. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F42A и L72C мутацию.

Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из Y44A, Y44C, Y44G, Y44S, Y44T, Y44Q, Y44E, Y44N, Y44D, Y44R и Y44K и дополнительную аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из L71G, L71C, L71A, L71S, L71T, L71Q, L71E, L71N, L71D, L71R и L71K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно одному варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y45A и L72G мутации. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y45C и L72G мутации. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит Y45A и L72C мутации.

Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из F41A, F41C, F41G, F41S, F41T, F41Q, F41E, F41N, F41D, F41R и F41K; дополнительную аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из Y44A, Y41C, Y44G, Y44S, Y44T, Y44Q, Y44E, Y44N, Y44D, Y44R и Y44K и дополнительную аминокислотную мутацию, выбранную из группы, состоящей из L71G, L71C, L71A, L71S, L71T, L71Q, L71E, L71N, L71D, L71R и L71K, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов. Согласно одному варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41A, Y44A и L71G мутации. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41C, Y44A и L71G мутации. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41A, Y44C и L71G мутации. Согласно и варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит F41A, Y44C и L71C мутации.

Фрагмент IL-2 может дополнительно или альтернативно содержать аминокислотную мутацию, которая исключает сайт O-гликозилирования. Предпочтительно, такая аминокислотная мутация находится в положении, соответствующем аминокислотному остатку 2 альдеслейкина, даже более предпочтительно такая аминокислотная мутация выбрана из группы, состоящей из T2A, T2G, T2Q, T2E, T2N, T2D, T2R, T2K и T2P и наиболее предпочтительно представляет собой T2A, согласно SEQ ID NO:2 или соответствующим положениям ее гомологов или вариантов.

Фрагмент IL-2 может дополнительно или альтернативно содержать одну или более дополнительных аминокислотных мутаций, которые могут обеспечить дополнительные преимущества, такие как повышенная экспрессия или стабильность. Например, метионин в положении 103 альдеслейкина может быть замещен нейтральной аминокислотой, такой как аланин, как описано в US 5,206,344.

Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 представляет собой фрагмент IL-2, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию и по меньшей мере одно стабильное присоединение модифицирующего фрагмента M_mod, как например одну аминокислотную мутацию и один фрагмент M_mod, одну аминокислотную мутацию и два фрагмента M_mod, две аминокислотные мутации и один фрагмент M_mod, три аминокислотные мутации и один фрагмент M_mod, или одну аминокислотную мутацию и три фрагмента M_mod. Понятно, что число аминокислотных мутаций и фрагментов M_mod может быть выбрано независимо друг от друга и может быть выбрано из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций и фрагментов M_mod независимо друг от друга и выбрано из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 1. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 2. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 3. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 4. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 5. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 6. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 1. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 2. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 3. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 4. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 5. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 6. Варианты осуществления фрагментов M_mod и сайтов мутаций/мутаций описаны выше.

Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 представляет собой фрагмент IL-2, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию и по меньшей мере один фрагмент M_mod, присоединенный к такой мутированной аминокислоте. Понятно, что число аминокислотных мутаций и фрагментов M_mod может не быть идентичным, и что дополнительные фрагменты M_mod могут быть конъюгированы с фрагментом IL-2 в немутированных аминокислотных остатках, и что не все мутированные аминокислотные остатки могут быть конъюгированы с фрагментом M_mod, до тех пор, пока по меньшей мере один фрагмент M_mod конъюгирован с одним мутированным аминокислотным остатком. Таким образом, число аминокислотных мутаций и фрагментов M_mod может быть выбрано независимо друг от друга и может быть выбрано из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 и 15. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций и фрагментов M_mod независимо друг от друга и выбрано из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 1. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 2. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 3. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 4. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 5. Согласно определенным вариантам осуществления число аминокислотных мутаций составляет 6. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 1. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 2. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 3. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 4. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 5. Согласно определенным вариантам осуществления число фрагментов M_mod составляет 6. Варианты осуществления фрагментов M_mod и сайтов мутаций/мутаций описаны выше.

Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 представляет собой фрагмент IL-2, содержащий по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в положении, выбранном из группы, состоящей из K34, R37, M38, T40, F41, K42, F43, Y44, E61, и L71, где аминокислота природного происхождения замещена на цистеин в результате мутации K34C, R37C, M38C, T40C, F41C, K42C, F43C, Y44C, E61C и L71C, и где по меньшей мере один фрагмент M_mod конъюгирован с атомом серы такого цистеина. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит K34C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает лизин в положении 34. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит R37C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает аргинин в положении 37. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит M38C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает метионин в положении 38. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит T40C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает треонин в положении 40. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит F41C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает фенилаланин в положении 41. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит K42C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает лизин в положении 42. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит F43C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает фенилаланин в положении 43. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит Y44C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает тирозин в положении 44. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит E61C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает глутаминовую кислоту в положении 61. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит L71C мутацию и дополнительно фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, который замещает лизин в положении 71. Согласно определенным вариантам осуществления несимметричный фрагмент IL-2 содержит одну мутацию, выбранную из группы, состоящей из K34C, R37C, M38C, T40C, F41C, K42C, F43C, Y44C, E61C, и L71C, где один фрагмент M_mod конъюгирован с атомом серы цистеина, который замещает аминокислоту природного происхождения, т.е. аргинин в положении 37 в случае R37C мутации, например.

Фрагмент IL-2 может содержать по меньшей мере одну делецию (см. пункт (c)). Понятно, что такая делеция предпочтительно относится к последовательности SEQ ID NO:2. Такая делеция может быть делецией природного происхождения, как например в форме сплайсингового варианта, или может быть искусственно введенной делецией. Одним таким сплайсинговым вариантом природного происхождения является IL-2δ2 мутант (см. Tsytsikov et al., JBC 1996, 271(38): 23055-23060), в котором экзон 2 исключен, и что приводит к делеции аминокислотных остатков N30 -K49, на основе последовательности SEQ ID NO:1, что соответствует делеции аминокислотных остатков N29 -K48 на основе последовательности SEQ ID NO:2.

Предпочтительно такая делеция происходит в положении, которое участвует в связывании IL-2Rα. Таким образом, предпочтительно, по меньшей мере одна делеция приводит к пониженной аффинности несимметричного фрагмента IL-2 с IL-2Rαβ по сравнению с альдеслейкином.

Согласно одному варианту осуществления -D содержит фрагмент IL-2, предпочтительно фрагмент IL-2, имеющий последовательность SEQ ID NO:2, которая содержит по меньшей мере одну мутацию, которая вводит цистеиновый остаток, и дополнительно содержит модифицирующий фрагмент M_mod, присоединенный к указанной цистеиновой мутации. Предпочтительно, цистеиновая мутация выбрана из группы, состоящей из K34C, R37C, M38C, T40C, F41C, K42C, F43C, Y44C, E61C и L71C. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой K34C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой R37C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой M38C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой T40C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой F41C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой K42C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой F43C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой Y44C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой E61C мутацию. Согласно определенным вариантам осуществления цистеиновая мутация представляет собой L71C мутацию.

Согласно одному варианту осуществления фрагмент IL-2 представляет собой суперкин, как описано в Levin et al. (Nature, 2012, 484: 529-535). Предпочтительно, такой IL-2 фрагмент содержит дополнительно или альтернативно к модификациям, описанным выше, одну или более мутаций аминокислотных остатков Q73, L79, R80, L84, I85 и I91, и в частности содержит одну или более мутаций, выбранных из группы, состоящей из Q73H, L79F, R80D, L84V, I85V и I91F. Согласно одному варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит дополнительно или альтернативно к модификациям, описанным выше, Q73H, L79F, R80D, L84V, I85V и I91F мутации. Согласно другому варианту осуществления фрагмент IL-2 содержит дополнительно или альтернативно к модификациям, описанным выше, L79F, R80D, L84V, I85V и I91F мутации. Если фрагмент IL-2 основан на суперкине, соответствующий несимметричный IL-2 имеет более высокую аффинность к IL-2Rβ чем альдеслейкин.

Конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению содержит по меньшей мере один ковалентно и обратимо присоединенную полимерный фрагмент и/или фрагмент замещенной жирной кислоты -Z.

Неожиданно было обнаружено, что добавление такого по меньшей мере одного ковалентно и обратимо присоединенного полимерного фрагмента и/или фрагмента замещенной жирной кислоты способно дополнительно продлить период полужизни в циркуляции несимметричного фрагмента IL-2, в то время как его обратимое присоединение обеспечивает достаточную аффинность к IL-2Rβ после расщепления по меньшей мере одного ковалентно и обратимо присоединенного полимерного фрагмента или фрагмента замещенной жирной кислоты.

Согласно одному варианту осуществления конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению содержит один фрагмент -Z, который представляет собой либо замещенную жирную кислоту, либо полимерный фрагмент. Согласно одному варианту осуществления -Z представляет собой замещенную жирную кислоту. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент.

Согласно другому варианту осуществления конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению содержит два фрагмента -Z, которые могут быть одинаковыми или различными. Согласно одному варианту осуществления оба фрагмента -Z представляют собой замещенную жирную кислоту, которые могут быть одинаковыми или различными. Согласно другому варианту осуществления оба фрагмента -Z представляют собой полимерный фрагмент, которые могут быть одинаковыми или различными. Согласно другому варианту осуществления один фрагмент -Z представляет собой замещенную жирную кислоту, а другой фрагмент -Z представляет собой полимерный фрагмент.

Согласно другому варианту осуществления конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению содержит три фрагмента Z, которые могут быть одинаковыми или различными. Согласно одному варианту осуществления все три фрагмента Z представляют собой замещенную жирную кислоту, которые могут быть одинаковыми или различными. Согласно другому варианту осуществления все три фрагмента Z представляют собой полимерный фрагмент, которые могут быть одинаковыми или различными. Согласно другому варианту осуществления одна или два фрагмента Z представляют собой замещенную жирную кислоту, и оставшийся фрагмент/фрагменты Z представляет собой/представляют собой полимерный фрагмент.

Согласно другому варианту осуществления конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению содержит четыре фрагмента -Z, которые могут быть одинаковыми или различными. Согласно одному варианту осуществления все четыре фрагмента -Z представляют собой замещенную жирную кислоту, которые могут быть одинаковыми или различными. Согласно другому варианту осуществления все четыре фрагмента -Z представляют собой полимерный фрагмент, которые могут быть одинаковыми или различными. Согласно другому варианту осуществления одна, две или три фрагмента -Z представляют собой замещенную жирную кислоту, и оставшийся фрагмент/фрагменты -Z представляет собой/представляют собой полимерный фрагмент.

Если -Z представляет собой фрагмент замещенной жирной кислоты, он предпочтительно представляет собой фрагмент замещенной жирной кислоты, описанную в WO 2005/027978 A2 и WO 2014/060512 A1, которые включены в настоящий документ посредством ссылки.

Если -Z представляет собой полимерный фрагмент, такой полимерный фрагмент имеет предпочтительно молекулярную массу в интервале от 1 кДа до 1000 кДа, более предпочтительно от 2 кДа до 500 кДа, даже более предпочтительно от 3 кДа до 200 кДа, даже более предпочтительно от 5 кДа до 120 кДа, даже более предпочтительно от 10 кДа до 100 кДа и наиболее предпочтительно от 15 кДа до 80кДа. Согласно одному варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 2 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 5 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 10 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 15 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 20 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 30 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 40 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 50 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 60 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 70 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 80 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 90 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу около 100 кДа. Согласно одному варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 2 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 5 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 10 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 15 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 20 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 30 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 40 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 50 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 60 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 70 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 80 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 90 кДа. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимерный фрагмент, имеющий молекулярную массу 100 кДа.

Если -Z представляет собой полимерный фрагмент, такой полимерный фрагмент предпочтительно содержит полимер, выбранный из группы, состоящей из 2-метакрилоил-оксиэтила фосфоилхолинов, поли(акриловых кислот), поли(акрилатов), поли(акриламидов), поли(алкилокси) полимеров, поли(амидов), поли(амидоаминов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(аспартамидов), поли(масляных кислот), поли(гликолевых кислот), полибутилентерефталатов, поли(капролактонов), поли(карбонатов), поли(цианоакрилатов), поли(диметилакриламидов), поли(сложных эфиров), поли(этиленов), поли(этиленгликолей), поли(этиленоксидов), поли(этилфосфатов), поли(этилоксазолинов), поли(гликолевых кислот), поли(гидроксиэтилакрилатов), поли(гидроксиэтил-оксазолинов), поли(гидроксипропил метакрилатов), поли(гидроксипропилоксазолинов), поли(иминокарбонатов), поли(молочных кислот), поли(сополимеров молочных и гликолевых кислот), поли(метакриламидов), поли(метакрилатов), поли(метилоксазолинов), поли(органофосфазенов), поли(ортосложных эфиров), поли(оксазолинов), поли(пропиленгликолей), поли(силоксанов), поли(уретанов), поли(виниловых спиртов), поли(виниламинов), поли(винилметиловых простых эфиров), поли(винилпирролидонов), силиконов, целлюлоз, карбометилцеллюлоз, гидроксипропил метилцеллюлоз, хитинов, хитозанов, декстранов, декстринов, желатинов, гиалуроновых кислот и производных, функционализированных гиалуроновых кислот, маннанов, пектинов, рамногалактуронанов, крахмалов, гидроксиалкил крахмалов, гидроксиэтил крахмалов и других полимеров на основе углеводов, ксиланов и их сополимеров.

Согласно одному варианту осуществления -Z представляет собой пептидный или белковый фрагмент. Предпочтительно, такой пептидный или белковый фрагмент не представляет собой IL-2-фрагмент или его составляющую. Такой пептидный или белковый фрагмент -Z может быть химически конъюгирован с -D через -L¹-L²-или может быть трансляционно конъюгирован с -D через обратимый линкерный фрагмент -L¹-, в этом случае -L¹-представляет собой пептидный или белковый фрагмент, и -L²-предпочтительно представляет собой химическую связь. Согласно одному варианту осуществления такой пептидный или белковый фрагмент -Z химически конъюгирован с -D через -L¹-L²-. Согласно другому варианту осуществления такой пептидный или белковый фрагмент -Z трансляционно слита с -D через обратимый линкерный фрагмент -L¹-, в этом случае -L¹-представляет собой пептидный или белковый фрагмент, и -L²-предпочтительно представляет собой химическую связь. Понятно, что такой пептидный или белковый обратимый линкерный фрагмент -L¹-может быть ферментативно или ферментативно расщепляемым. Для усиления ферментативного расщепления -L¹-может содержать сайт распознавания протеазы.

Если -Z представляет собой пептидный или белковый фрагмент, он предпочтительно выбран из группы, состоящей из фрагментов, содержащих карбоксил-терминальный пептид хорионического гонадотропина, как описано в US 2012/0035101 A1, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки; альбуминовых фрагментов; фрагментов белка случайной спирали и фрагментов Fc-слитого белка.

Согласно одному варианту осуществления -Z содержит пептидный или белковый фрагмент случайной спирали.

Предпочтительно такой пептидный или белковый фрагмент случайной спирали содержит по меньшей мере 25 аминокислотных остатка и самое большее 2000 аминокислотных остатка. Даже более такой пептидный или белковый фрагмент случайной спирали содержит по меньшей мере 30 аминокислотных остатка и самое большее 1500 аминокислотных остатка. Даже более предпочтительно такой пептидный или белковый фрагмент случайной спирали содержит по меньшей мере 50 аминокислотных остатка и самое большее 500 аминокислотных остатка.

Согласно другому варианту осуществления, -Z содержит белковый фрагмент случайной спирали, в котором по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, даже более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95%, даже более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% от общего числа аминокислот, образующих указанный белковый фрагмент случайной спирали выбраны из аланина и пролина. Даже более предпочтительно, по меньшей мере 10%, но менее 75%, предпочтительно менее 65%, от общего числа аминокислотных остатков такого случайного белкового фрагмента являются остатками пролина. Предпочтительно, такой белковый фрагмент случайной спирали является таким, как описано в WO 2011/144756 A1, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Даже более предпочтительно -Z содержит по меньшей мере один фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:51 и SEQ ID NO:61, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. Фрагмент, содержащий такой белковый фрагмент случайной спирали, содержащий аланин, серин и пролин, обозначается как “PA” или “PA фрагмент”.

Соответственно, согласно одному варианту осуществления -Z содержит фрагмент PA.

Согласно другому варианту осуществления, -Z содержит белковый фрагмент случайной спирали, в котором по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, даже более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95%, даже более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% от общего числа аминокислот, образующих указанный белковый фрагмент случайной спирали, выбраны из аланина, серина и пролина. Даже более предпочтительно, по меньшей мере 4%, но менее 40% от общего числа аминокислотных остатков такого случайного белкового фрагмента являются остатками пролина. Предпочтительно, такой белковый фрагмент случайной спирали является таким, как описано в WO 2008/155134 A1, которая полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Даже более предпочтительно -Z содержит по меньшей мере один фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:34, SEQ ID NO:36, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:44, SEQ ID NO:46, SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:54 и SEQ ID NO:56, раскрытых в WO 2008/155134 A1, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. Фрагмент, содержащий такой белковый фрагмент случайной спирали, содержащий аланин, серин и пролин, обозначается как “PAS” или “PAS фрагмент”.

Соответственно, согласно одному варианту осуществления -Z содержит фрагмент PAS.

Согласно другому варианту осуществления, -Z содержит белковый фрагмент случайной спирали, в котором по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 85%, даже более предпочтительно по меньшей мере 90%, даже более предпочтительно по меньшей мере 95%, даже более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99% от общего числа аминокислот, образующих указанный белковый фрагмент случайной спирали выбраны из аланина, глицина, серина, треонина, глутамата и пролина. Предпочтительно, такой белковый фрагмент случайной спирали является таким, как описано в WO 2010/091122 A1, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. Даже более предпочтительно -Z содержит по меньшей мере один фрагмент, выбранный из группы, состоящей из SEQ ID NO:182, SEQ ID NO:183, SEQ ID NO:184; SEQ ID NO:185, SEQ ID NO:186, SEQ ID NO:187, SEQ ID NO:188, SEQ ID NO:189, SEQ ID NO:190, SEQ ID NO:191, SEQ ID NO:192, SEQ ID NO:193, SEQ ID NO:194, SEQ ID NO:195, SEQ ID NO:196, SEQ ID NO:197, SEQ ID NO:198, SEQ ID NO:199, SEQ ID NO:200, SEQ ID NO:201, SEQ ID NO:202, SEQ ID NO:203, SEQ ID NO:204, SEQ ID NO:205, SEQ ID NO:206, SEQ ID NO:207, SEQ ID NO:208, SEQ ID NO:209, SEQ ID NO:210, SEQ ID NO:211, SEQ ID NO:212, SEQ ID NO:213, SEQ ID NO:214, SEQ ID NO:215, SEQ ID NO:216, SEQ ID NO:217, SEQ ID NO:218, SEQ ID NO:219, SEQ ID NO:220, SEQ ID NO:221, SEQ ID NO:759, SEQ ID NO:760, SEQ ID NO:761, SEQ ID NO:762, SEQ ID NO:763, SEQ ID NO:764, SEQ ID NO:765, SEQ ID NO:766, SEQ ID NO:767, SEQ ID NO:768, SEQ ID NO:769, SEQ ID NO:770, SEQ ID NO:771, SEQ ID NO:772, SEQ ID NO:773, SEQ ID NO:774, SEQ ID NO:775, SEQ ID NO:776, SEQ ID NO:777, SEQ ID NO:778, SEQ ID NO:779, SEQ ID NO:1715, SEQ ID NO:1716, SEQ ID NO:1718, SEQ ID NO:1719, SEQ ID NO:1720, SEQ ID NO:1721 и SEQ ID NO:1722, как раскрыто в WO2010/091122A1, которая включена в настоящую заявку посредством ссылки. Фрагмент, содержащий такой белковый фрагмент случайной спирали, содержащий аланин, глицин, серин, треонин, глутамат и пролин, будет упоминаться как “XTEN” или “XTEN фрагмент” подобно тому, как обозначается в WO 2010/091122 A1.

Соответственно, согласно одному варианту осуществления -Z содержит фрагмент XTEN.

Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой полимер на основе гиалуроновой кислоты.

Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой фрагмент на основе ПЭГ, такую как линейный, разветвленный или многоцепочечный фрагмент на основе ПЭГ. Согласно одному варианту осуществления -Z представляет собой разветвленный фрагмент на основе ПЭГ. Предпочтительно, такой разветвленный фрагмент на основе ПЭГ -Z представляет собой разветвленный фрагмент на основе ПЭГ, имеющий одну, две, три, четыре, пять или шесть точек разветвления. Предпочтительно, -Z представляет собой разветвленный фрагмент на основе ПЭГ, имеющий одну, две или три точки разветвления. Согласно одному варианту осуществления -Z представляет собой разветвленный фрагмент на основе ПЭГ, имеющий одну точку разветвления. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой разветвленный фрагмент на основе ПЭГ, имеющий две точки разветвления. Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой разветвленный фрагмент на основе ПЭГ, имеющий три точки разветвления.

Каждая точка разветвления предпочтительно независимо выбрана из группы, состоящей из -N<, -CH< и >C<.

Согласно определенным вариантам осуществления -Z содержит фрагмент формулы (A)

(A),

где

-BP¹<, -BP²<, -BP³< независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -N< и -C(R⁸)<;

R⁸ выбран из группы, состоящей из H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила и C_2-6 алкинила;

-P¹, -P², -P³, -P⁴ независимо друг от друга представляют собой цепь на основе ПЭГ, содержащую по меньшей мере 40% ПЭГ и имеющую молекулярную массу в интервале от 3 до 40 кДа;

-C¹-, -C²-независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из C_1-50алкила, C_2-50 алкенила, и C_2-50 алкинила; где C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно замещены одним или более R⁹, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R¹⁰)-, -S(O)₂N(R¹⁰)-, -S(O)N(R¹⁰)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R¹⁰)S(O)₂N(R^10a)-, -S-, -N(R¹⁰)-, -OC(OR¹⁰)(R^10a)-, -N(R¹⁰)C(O)N(R^10a)-, и -OC(O)N(R¹⁰)-;

каждый T независимо выбран из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила, 8-11-ти членного гетеробициклила, 8-30-ти членного карбополициклила, и 8-30-ти членного гетерополициклила; где каждый T необязательно независимо замещен одним или более R⁹, которые являются одинаковыми или различными;

каждый R⁹ независимо выбран из группы, состоящей из галогена, -CN, оксо (=O), -COOR¹¹, -OR¹¹, -C(O)R¹¹, -C(O)N(R¹¹R^11a), -S(O)₂N(R¹¹R^11a), -S(O)N(R¹¹R^11a), -S(O)₂R¹¹, -S(O)R¹¹, -N(R¹¹)S(O)₂N(R^11aR^11b), -SR¹¹, -N(R¹¹R^11a), -NO₂, -OC(O)R¹¹, -N(R¹¹)C(O)R^11a, -N(R¹¹)S(O)₂R^11a, -N(R¹¹)S(O)R^11a, -N(R¹¹)C(O)OR^11a, -N(R¹¹)C(O)N(R^11aR^11b), -OC(O)N(R¹¹R^11a), и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными;

каждый R¹⁰, R^10a, R¹¹, R^11a и R^11b независимо выбран из группы, состоящей из -H, и C_1-6 алкила, где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными.

Согласно определенным вариантам осуществления -P¹, -P², -P³, -P⁴ независимо друг от друга представляют собой цепь на основе ПЭГ, содержащую по меньшей мере 50% ПЭГ и имеющую молекулярную массу в интервале от 3 до 40 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления -P¹, -P², -P³, -P⁴ независимо друг от друга представляют собой цепь на основе ПЭГ, содержащую по меньшей мере 60% ПЭГ и имеющую молекулярную массу в интервале от 3 до 40 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления -P¹, -P², -P³, -P⁴ независимо друг от друга представляют собой цепь на основе ПЭГ, содержащую по меньшей мере 70% ПЭГ и имеющую молекулярную массу в интервале от 3 до 40 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления -P¹, -P², -P³, -P⁴ независимо друг от друга представляют собой цепь на основе ПЭГ, содержащую по меньшей мере 80% ПЭГ и имеющую молекулярную массу в интервале от 3 до 40 кДа.

Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ и P⁴ формулы (A) независимо друг от друга находится в интервале от 5 до 30 кДа, как например от 5 до 25 кДа или от 8 до 20 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять около 5 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять около 7 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять около 10 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять около 12 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять около 15 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять около 20 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять около 25 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять около 30 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять 7 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять 10 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять 12 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять 15 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять 20 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять 25 кДа. Согласно определенным вариантам осуществления молекулярная масса фрагмента P¹, P², P³ или P⁴ может составлять 30 кДа.

Согласно определенным вариантам осуществления P¹, P², P³ и P⁴ формулы (A) имеют одну и ту же структуру.

Согласно определенным вариантам осуществления BP¹ формулы (A) представляет собой -N<.

Согласно определенным вариантам осуществления BP² и BP² формулы (A) имеют одну и ту же структуру. Согласно определенным вариантам осуществления BP² и BP² формулы (A) оба представляют собой -CH<.

Согласно определенным вариантам осуществления C¹ и C² формулы (A) имеют одну и ту же структуру. Согласно определенным вариантам осуществления C¹ и C² формулы (A) представляют собой C_1-50 алкил, прерывающийся одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -O-, -C(O)N(R¹⁰)-и 3-10-ти членного гетероциклила; где 3-10-ти членный гетероциклил имеет в качестве заместителя по меньшей мере один оксо (=O).

Согласно определенным вариантам осуществления C¹ и C² формулы (A) имеют формулу (A-a)

(A-a),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к BP¹;

непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к BP² или BP³, соответственно;

q1 выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8;

q2 выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, и 5;

q3 выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8; и

q4 выбран из группы, состоящей из 1, 2 и 3.

Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) выбран из группы, состоящей из 4, 5, 6, 7, и 8. Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) выбран из группы, состоящей из 5, 6 и 7. Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) представляет собой 6. Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) представляет собой 7. Согласно определенным вариантам осуществления q1 формулы (A-a) представляет собой 8.

Согласно определенным вариантам осуществления q2 формулы (A-a) выбран из группы, состоящей из 1, 2 и 3. Согласно определенным вариантам осуществления q2 формулы (A-a) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления q2 формулы (A-a) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления q2 формулы (A-a) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления q2 формулы (A-a) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления q2 формулы (A-a) представляет собой 5.

Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) выбран из группы, состоящей из 2, 3, 4, и 5. Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) выбран из группы, состоящей из 2, 3 и 4. Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) представляет собой 6. Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) представляет собой 7. Согласно определенным вариантам осуществления q3 формулы (A-a) представляет собой 8.

Согласно определенным вариантам осуществления q4 формулы (A-a) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления q4 формулы (A-a) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления q4 формулы (A-a) представляет собой 3.

Согласно определенным вариантам осуществления P¹, P², P³ и P⁴ формулы (A) независимо друг от друга представляют собой формулы (A-b)

(A-b),

где

пунктирная линия показывает присоединение к оставшейся части -Z;

m представляет собой 0 или 1;

p представляет собой целое число в интервале от 70 до 900; и

q выбран из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, и 6.

Согласно определенным вариантам осуществления m формулы (A-b) представляет собой 0. Согласно определенным вариантам осуществления m формулы (A-b) представляет собой 1.

Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) представляет собой целое число в интервале от 115 до 680. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) представляет собой целое число в интервале от 115 до 560. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) представляет собой целое число в интервале от 185 до 450. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) составляет около 115. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) составляет около 160. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) составляет около 225. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) составляет около 270. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления p формулы (A-b) составляет около 560.

Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-b) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-b) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-b) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-b) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы (A-b) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления q формулы
(A-b) представляет собой 6.

Согласно определенным вариантам осуществления -Z содержит фрагмент формулы (A-c):

(A-c),

где

p1, p2, p3, p4 независимо друг от друга представляют собой целое число в интервале от 70 до 900.

Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 115 до 680. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 115 до 560. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 185 до 450. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 220 до 240. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) составляет около 115. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) составляет около 160. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) составляет около 225. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) составляет около 270. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления p1 формулы (A-c) составляет около 560.

Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 115 до 680. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 115 до 560. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 185 до 450. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 220 до 240. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) составляет около 115. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) составляет около 160. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) составляет около 225. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) составляет около 270. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления p2 формулы (A-c) составляет около 560.

Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 115 до 680. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 115 до 560. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 185 до 450. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 220 до 240. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) составляет около 115. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) составляет около 160. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) составляет около 225. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) составляет около 270. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления p3 формулы (A-c) составляет около 560.

Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 115 до 680. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 115 до 560. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 185 до 450. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) представляет собой целое число в интервале от 220 до 240. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) составляет около 115. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) составляет около 160. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) составляет около 225. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) составляет около 270. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) составляет около 340. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) составляет около 450. Согласно определенным вариантам осуществления p4 формулы (A-c) составляет около 560.

Согласно определенным вариантам осуществления p1, p2, p3 формулы (A-c) и p4 являются идентичными. Согласно определенным вариантам осуществления p1, p2, p3 и p4 находятся в интервале от 220 до 240.

Согласно одному варианту осуществления -Z представляет собой фрагмент, как раскрыто в WO 2012/02047 A1, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно другому варианту осуществления -Z представляет собой фрагмент, как раскрыто в WO 2013/024048 A1, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно определенным вариантам осуществления -Z является нерастворимым в воде. Согласно определенным вариантам осуществления -Z представляет собой гидрогель.

Согласно определенным вариантам осуществления такой гидрогель содержит полимер, выбранный из группы, состоящей из 2-метакрилоил-оксиэтила фосфоилхолинов, поли(акриловых кислот), поли(акрилатов), поли(акриламидов), поли(алкилокси) полимеров, поли(амидов), поли(амидоаминов), поли(аминокислот), поли(ангидридов), поли(аспартамидов), поли(масляных кислот), поли(гликолевых кислот), полибутилентерефталатов, поли(капролактонов), поли(карбонатов), поли(цианоакрилатов), поли(диметилакриламидов), поли(сложных эфиров), поли(этиленов), поли(этиленгликолей), поли(этиленоксидов), поли(этилфосфатов), поли(этилоксазолинов), поли(гликолевых кислот), поли(гидроксиэтилакрилатов), поли(гидроксиэтил-оксазолинов), поли(гидроксиметакрилатов), поли(гидроксипропилметакриламидов), поли(гидроксипропил метакрилатов), поли(гидроксипропилоксазолинов), поли(иминокарбонатов), поли(молочных кислот), поли(сополимеров молочных и гликолевых кислот), поли(метакриламидов), поли(метакрилатов), поли(метилоксазолинов), поли(органофосфазенов), поли(ортосложных эфиров), поли(оксазолинов), поли(пропиленгликолей), поли(силоксанов), поли(уретанов), поли(виниловых спиртов), поли(виниламинов), поли(винилметиловых простых эфиров), поли(винилпирролидонов), силиконов, целлюлоз, карбометилцеллюлоз, гидроксипропил метилцеллюлоз, хитинов, хитозанов, декстранов, декстринов, желатинов, гиалуроновых кислот и производных, функционализированных гиалуроновых кислот, маннанов, пектинов, рамногалактуронанов, крахмалов, гидроксиалкил крахмалов, гидроксиэтил крахмалов и других полимеров на основе углеводов, ксиланов и их сополимеров.

Согласно определенным вариантам осуществления -Z представляет собой гидрогель на основе поли(алкиленгликоля) или на основе гиалуроновой кислоты.

Согласно определенным вариантам осуществления -Z представляет собой гидрогель на основе поли(алкиленгликоля).

Согласно определенным вариантам осуществления -Z представляет собой гидрогель на основе ПЭГ.

Согласно определенным вариантам осуществления -Z представляет собой гидрогель на основе ПЭГ, как описано в WO2011/012715A1 или WO2014/056926A1, которые включены в настоящий документ посредством ссылки.

Согласно определенным вариантам осуществления -Z представляет собой гидрогель на основе гиалуроновой кислоты.

Согласно определенным вариантам осуществления -Z представляет собой гидрогель на основе гиалуроновой кислоты, как описано в WO2018/175788A1, которая включена в настоящий документ посредством ссылки.

фрагмент -L¹-может быть присоединен к -D через фрагмент IL-2, в частности через аминокислотный остаток фрагмента IL-2, или через модифицирующий фрагмент M_mod, присутствующий в -D. Согласно одному варианту осуществления -L¹-присоединен к -D через фрагмент IL-2, в частности через аминокислотный остаток фрагмента IL-2. Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к -D через модифицирующий фрагмент M_mod, присутствующий в -D. Понятно, что один или более фрагментов -L¹-могут быть присоединены к фрагменту M_mod.

Согласно одному варианту осуществления все фрагменты -L¹-, присутствующие в конъюгатах IL-2 согласно настоящему изобретению, присоединены к аминокислотному остатку -D.

Если -L¹-присоединен к аминокислотному остатку фрагмента IL-2, такой аминокислотный остаток может представлять собой протеиногенный или непротеиногенный аминокислотный остаток -D. Согласно одному варианту осуществления -L¹-присоединен к непротеиногенному аминокислотному остатку, предпочтительно к непротеиногенному аминокислотному остатку, как описано выше. Согласно другому варианту осуществления присоединение -L¹-происходит через протеиногенный аминокислотный остаток. Если присоединение происходит при протеиногенном аминокислотном остатке, указанный протеиногенный аминокислотный остаток соответствует определенным вариантам осуществления, выбранным из группы, состоящей из цистеина, метионина, гистидина, лизина, триптофана, серина, треонина, тирозина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина и аргинина. Согласно определенным вариантам осуществления такой протеиногенный аминокислотный остаток выбран из группы, состоящей из цистеина, гистидина, лизина, триптофана, серина, треонина, тирозина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты и аргинина.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-присоединен к цистеиновому остатку -D, как например к цистеиновому остатку, выбранному из группы, состоящей из C57 и C104 согласно SEQ ID NO: 2 или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных цистеин остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таком цистеиновом остатке, который может быть природного происхождения или может быть получен в результате добавления, вставки или мутации. Понятно, что один или два цистеиновых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения одного или двух фрагментов -Z к -D, соответственно. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше цистеиновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем два цистеиновых остатка могут применяться для присоединения -Z, т.е. до максимального числа цистеиновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -Z. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -Z присоединен к одному цистеиновому остатку. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -Z присоединены к двум цистеиновым остаткам.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к гистидиновому остатку -D, как например к гистидиновому остатку, выбранному из группы, состоящей из H15, H54 и H78 согласно SEQ ID NO: 2 или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных гистидиновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таком гистидиновом остатке, который может быть природного происхождения или может быть получен в результате добавления, вставки или мутации. Понятно, что один, два или три гистидиновых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения одного, двух или трех фрагментов -L¹-, соответственно. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше гистидиновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем три гистидиновых остатка могут применяться для присоединения -L¹-к -D, т.е. до максимального числа гистидиновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -L¹-. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -L¹-присоединен к одному гистидиновому остатку. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к двум гистидиновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к трем гистидиновым остаткам.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к лизиновому остатку, такому как лизиновый остаток, выбранный из группы, состоящей из K7, K8, K31, K34, K42, K47, K48, K53, K63, K75 или K96 согласно SEQ ID NO: 2 или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных лизиновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таком лизиновом остатке, который может быть природного происхождения или может быть получен в результате добавления, вставки или мутации. Понятно, что 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 лизиновых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или 11 фрагментов -L¹-, соответственно. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше лизиновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 11 лизиновых остатков могут применяться для присоединения -L¹-, т.е. до максимального лизиновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -L¹-. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -L¹-присоединен к одному лизиновому остатку. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к двум лизиновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к трем лизиновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем четыре фрагмента -L¹-присоединены к четырем лизиновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем пять фрагментов -L¹-присоединены к пяти лизиновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем шесть фрагментов -L¹-присоединены к шести лизиновым остаткам.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к триптофановому остатку, как например к триптофановому остатку в положении W120 согласно SEQ ID NO: 2 или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных триптофановых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таком триптофановом остатке, который может быть природного происхождения или может быть получен в результате добавления, вставки или мутации. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше триптофановых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем один триптофановый остаток могут применяться для присоединения -L¹-, т.е. до максимального числа триптофановых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -L¹-. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент-L¹-присоединен к одному триптофановому остатку.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к сериновому остатку, как например к сериновому остатку, выбранному из группы, состоящей из S3, S4, S5, S74, S86, S98, S124, S126 и S129 согласно SEQ ID NO: 2, или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных сериновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таком сериновом остатке, который может быть природного происхождения или может быть получен в результате добавления, вставки или мутации. Понятно, что 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или 9 сериновых остатков согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения -L¹-. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше сериновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 9 сериновых остатков могут применяться для присоединения -L¹-к -D, т.е. до максимального числа сериновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -L¹-. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -L¹-присоединен к одному сериновому остатку. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к двум сериновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к трем сериновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем четыре фрагмента -L¹-присоединены к четырем сериновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем пять фрагментов -L¹-присоединены к пяти сериновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем шесть фрагментов -L¹-присоединены к шести сериновым остаткам.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к остатку треонина, как например остаток треонина, выбранный из группы, состоящей из T2, T6, T9, T36, T40, T50, T100, T102, T110, T112, T122, T130 и T132 согласно SEQ ID NO: 2 или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных треониновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таком треониновом остатке, который может быть природного происхождения или может быть получен в результате добавления, вставки или мутации. Понятно, что 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 треониновых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 или 13 фрагментов -L¹-, соответственно. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше треониновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 13 треониновых остатка могут применяться для присоединения -L¹-к-D, т.е. до максимального числа треониновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -L¹-. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -L¹-присоединен к одному треониновому остатку. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к двум треониновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к трем треониновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем четыре фрагмента -L¹-присоединены к четырем треониновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем пять фрагмента -L¹-присоединены к пяти треониновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем шесть фрагментов -L¹-присоединены к шести треониновым остаткам.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к тирозиновому остатку, такому как тирозиновый остаток, выбранный из группы, состоящей из Y30, Y44 и Y106 согласно SEQ ID NO: 2 или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных тирозиновых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение может происходить в таком тирозиновом остатке, который может быть природного происхождения или может быть получен в результате добавления, вставки или мутации. Понятно, что 1, 2 или 3 тирозиновых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения 1, 2 или 3 фрагментов -L¹-к -D. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше тирозиновых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 3 тирозиновых остатка могут применяться для присоединения -L¹-, т.е. до максимального числа тирозиновых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -L¹-к -D. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -L¹-присоединен к одному тирозиновому остатку. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к двум тирозиновым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к трем тирозиновым остаткам.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к остатку аспарагиновой кислоты, такому как остаток аспарагиновой кислоты, выбранный из группы, состоящей из D19, D83 и D108 согласно SEQ ID NO: 2 или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных остатков аспарагиновой кислоты по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить к таким остаткам аспарагиновой кислоты, которые могут быть природного происхождения или могут быть получены в результате добавления, вставки или мутации. Понятно, что 1, 2 или 3 остатка аспарагиновой кислоты согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения 1, 2 или 3 фрагмента -L¹-, соответственно. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше остатков аспарагиновой кислоты, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 3 остатка аспарагиновой кислоты могут применяться для присоединения -L¹-, т.е. до максимального числа остатков аспарагиновой кислоты, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -L¹-к -D. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -L¹-присоединен к одному остатку аспарагиновой кислоты. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к двум остаткам аспарагиновой кислоты. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к трем остаткам аспарагиновой кислоты.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к остатку глутаминовой кислоты, такому как остаток глутаминовой кислоты, выбранный из группы, состоящей из E14, E51, E59, E60, E61, E66, E67, E94, E99, E105, E109 и E115 согласно SEQ ID NO: 2 или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных остатков глутаминовой кислоты по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить в таком остатке глутаминовой кислоты, который может быть природного происхождения или может быть получен в результате добавления, вставки или мутации. Понятно, что 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 остатков глутаминовой кислоты согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 или 12 фрагментов -L¹-. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше остатков глутаминовой кислоты, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 12 остатков глутаминовой кислоты могут применяться для присоединения -L¹-, т.е. до максимального числа остатков глутаминовой кислоты, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -L¹-. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -L¹-присоединен к одному остатку глутаминовой кислоты. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к двум остаткам глутаминовой кислоты. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к трем остаткам глутаминовой кислоты. Согласно другому варианту осуществления в общем четыре фрагмента -L¹-присоединены к четырем остаткам глутаминовой кислоты. Согласно другому варианту осуществления в общем пять фрагментов -L¹-присоединены к пяти остаткам глутаминовой кислоты. Согласно другому варианту осуществления в общем шесть фрагментов -L¹-присоединены к шести остаткам глутаминовой кислоты.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-присоединен к аргининовому остатку, такому как аргининовый остаток, выбранный из группы, состоящей из R37, R80, R82 и R119 согласно SEQ ID NO: 2 или к соответствующим положениям гомологов или вариантов согласно SEQ ID NO:2. Если гомологи или варианты IL-2 содержат один или более дополнительных аргининовых остатков по сравнению с SEQ ID NO:2, присоединение также может происходить к такому аргининовому остатку, который может быть природного происхождения или может быть получен в результате добавления, вставки или мутации. Понятно, что 1, 2, 3 или 4 аргининовых остатка согласно SEQ ID NO:2 могут применяться для присоединения 1, 2, 3 или 4 фрагмента -L¹-. Если фрагмент IL-2 представляет собой гомолог или вариант последовательности SEQ ID NO:2 и имеет больше аргининовых остатков, чем фрагмент IL-2 согласно SEQ ID NO:2, более чем 4 аргининовых остатка могут применяться для присоединения -L¹-, т.е. до максимального числа аргининовых остатков, присутствующих в таком гомологе или варианте, могут применяться для присоединения -L¹-. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -L¹-присоединен к одному аргининовому остатку. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к двум аргининовым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к четырем аргининовым остаткам. Согласно другому варианту осуществления в общем четыре фрагмента -L¹-присоединены к четырем тирозиновым остаткам.

Согласно другому варианту осуществления по меньшей мере один фрагмент -L¹-присоединен к аминокислотному остатку -D, и оставшийся фрагмент/фрагменты -L¹-присоединены к модифицирующему фрагменту, присутствующему в -D.

Согласно другому варианту осуществления все фрагменты -L¹-, присутствующие в конъюгатах IL-2 согласно настоящему изобретению, присоединены к модифицирующему фрагменту, присутствующему в -D. Согласно одному варианту осуществления один фрагмент -L¹-присоединен к одному модифицирующему фрагменту -D. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к одному модифицирующему фрагменту, т.е. к одному и тому же модифицирующему фрагменту. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к одному модифицирующему фрагменту. Согласно другому варианту осуществления в общем четыре фрагмента -L¹-присоединены к одному модифицирующему фрагменту. Согласно другому варианту осуществления в общем пять фрагментов -L¹-присоединены к одному модифицирующему фрагменту. Согласно другому варианту осуществления в общем шесть фрагментов -L¹-присоединены к одному модифицирующему фрагменту. Согласно другому варианту осуществления в общем два фрагмента -L¹-присоединены к двум модифицирующим фрагментам, т.е. один фрагмент -L¹-на модифицирующий фрагмент. Согласно другому варианту осуществления в общем три фрагмента -L¹-присоединены к трем модифицирующим фрагментам, т.е. один фрагмент -L¹-на модифицирующий фрагмент. Согласно другому варианту осуществления в общем четыре фрагмента -L¹-присоединены к четырем модифицирующим фрагментам, т.е. один фрагмент -L¹-присоединен на модифицирующий фрагмент. Согласно другому варианту осуществления в общем пять фрагментов -L¹-присоединены к пяти модифицирующим фрагментам, т.е. один фрагмент на модифицирующий фрагмент. Согласно другому варианту осуществления в общем шесть фрагментов -L¹-присоединены к шести модифицирующим фрагментам, т.е. один фрагмент -L¹-присоединен на модифицирующий фрагмент.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-имеет структуру, как раскрыто в WO 2009/095479 A2. Соответственно, согласно одному варианту осуществления фрагмент -L¹-имеет формулу (II):

,

где пунктирная линия показывает присоединение к атому азота фрагмента -D посредством образования амидной связи;

-X- представляет собой -C(R⁴R^4a)-; -N(R⁴)-; -O-; -C(R⁴R^4a)-C(R⁵R^5a)-; -C(R⁵R^5a)-C(R⁴R^4a)-; -C(R⁴R^4a)-N(R⁶)-; -N(R⁶)-C(R⁴R^4a)-; -C(R⁴R^4a)-O-; -O-C(R⁴R^4a)-; или -C(R⁷R^7a)-;

X¹ представляет собой C или S(O);

-X²- представляет собой -C(R⁸R^8a)-или -C(R⁸R^8a)-C(R⁹R^9a)-;

=X³ представляет собой =O; =S или =N-CN;

-R¹, -R^1a, -R², -R^2a, -R⁴, -R^4a, -R⁵, -R^5a, -R⁶, -R⁸, -R^8a, -R⁹, -R^9a независимо выбраны из группы, состоящей из -H и C_1-6 алкила;

-R³, -R^3a независимо выбирают из группы, состоящей из -H; и C_1-6 алкила, при условии, что в случае, если один из -R³, -R^3a или оба отличны от водорода, они соединены с N, к которому они присоединены через SP³-гибридизованный атом углерода;

-R⁷ представляет собой -N(R¹⁰R^10a); или -NR¹⁰-(C=O)-R¹¹;

-R^7a, -R¹⁰, -R^10a, -R¹¹ независимо друг от друга представляют собой -H или C_1-6 алкил;

необязательно одна или более из пар -R^1a/-R^4a, -R^1a/-R^5a, -R^1a/-R^7a, -R^4a/-R^5a, -R^8a/-R^9a образуют химическую связь;

необязательно одна или более из пар -R¹/-R^1a, -R²/-R^2a, -R⁴/-R^4a, -R⁵/-R^5a, -R⁸/-R^8a,

-R⁹/-R^9a соединены вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием C_3-10 циклоалкила; или 3-10-ти членного гетероциклила;

необязательно одна или более из пар -R¹/-R⁴, -R¹/-R⁵, -R¹/-R⁶, -R¹/-R^7a, -R⁴/-R⁵, -R⁴/-R⁶, -R⁸/-R⁹, -R²/-R³ соединяются вместе с атомами, к которым они присоединены, с образованием кольца A;

необязательно, R³/R^3a соединяются вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 3-10-членного гетероцикла;

A выбран из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; C_3-10 циклоалкила; 3-10-ти членного гетероциклила и 8-11-ти членного гетеробициклила и

где -L¹-имеет в качестве заместителя по меньшей мере один -L²-Z и где -L¹-необязательно дополнительно замещен, при условии, что водород, помеченный звездочкой в формуле (II), не замещен -L²-Z или заместителем.

Предпочтительно -L¹-формулы (II) имеет в качестве заместителя один фрагмент -L²-Z.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-формулы (II) дополнительно не замещен.

Понятно, что если -R³/-R^3a формулы (II) соединяются вместе с атомом азота, к которому они присоединены, с образованием 3-10-членного гетероцикла, только такие 3-10-членные гетероциклы могут быть образованы, в которых атомы, непосредственно соединенные с атомом азота, представляют собой SP³-гибридизованные атомы углерода. Другими словами, такой 3-10-членный гетероцикл, образованный -R³/-R^3a вместе с атомом азота, с которыми они соединены, имеет следующую структуру:

где

пунктирная линия показывает присоединение к остальной части -L¹-;

кольцо содержит от 3 до 10 атомов, включая по меньшей мере один атом азота; и

R^# и R^## представляют собой SP³-гибридизованный атом углерода.

Также понятно, что 3-10-членный гетероцикл может быть дополнительно замещен.

Примерными вариантами выполнения подходящих 3-10-членных гетероциклов, образованных -R³/-R^3a формулы (II) вместе с атомом азота, к которому они присоединены, являются следующие:

где

пунктирная линия указывает присоединение к остальной части молекулы; и

-R выбран из группы, состоящей из -H и C_1-6 алкила.

-L¹-формулы (II) может необязательно быть дополнительно замещенной. В общем, любой заместитель может применяться, до тех пор, пока принцип расщепления не затронут, т.е. водород, помеченный звездочкой в формуле (II), не заменен, а азот фрагмента

формулы (II) остается частью первичного, вторичного или третичного амина, т.е. -R³ и R^3a независимо друг от друга представляют собой -H или соединены с -N< через SP³-гибридизованный атом углерода.

Согласно одному варианту осуществления -R¹ или -R^1a формулы (II) имеет в качестве заместителя -L²-Z или -L²-Z’. Согласно другому варианту осуществления -R² или -R^2a формулы (II) имеет в качестве заместителя -L²-Z или -L²-Z’. Согласно другому варианту осуществления -R³ или -R^3a формулы (II) имеет в качестве заместителя -L²-Z или -L²-Z’. Согласно другому варианту осуществления -R⁴ формулы (II) имеет в качестве заместителя -L²-Z или -L²-Z’. Согласно другому варианту осуществления -R⁵ или -R^5a формулы (II) имеет в качестве заместителя -L²-Z или -L²-Z’. Согласно другому варианту осуществления -R⁶ формулы (II) имеет в качестве заместителя -L²-Z или -L²-Z’. Согласно другому варианту осуществления -R⁷ или -R^7a формулы (II) имеет в качестве заместителя -L²-Z или -L²-Z’. Согласно другому варианту осуществления -R⁸ или -R^8a формулы (II) имеет в качестве заместителя -L²-Z или -L²-Z’. Согласно другому варианту осуществления -R⁹ или -R^9a формулы (II) имеет в качестве заместителя -L²-Z или -L²-Z’.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-имеет структуру, как раскрыто в WO2016/020373A1. Соответственно, согласно другому варианту осуществления фрагмент -L¹-имеет формулу (III):

(III),

где

пунктирная линия показывает присоединение к первичному или вторичному амину или гидроксилу фрагмента -D посредством образования амидной или сложноэфирной связи, соответственно;

-R¹, -R^1a, -R², -R^2a, -R³ и -R^3a независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, -C(R⁸R^8aR^8b), -C(=O)R⁸, -C≡N, -C(=NR⁸)R^8a, -CR⁸(=CR^8aR^8b), -C≡CR⁸ и -T;

-R⁴, -R⁵ и -R^5a независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, -C(R⁹R^9aR^9b) и -T;

a1 и a2 независимо друг от друга представляют собой 0 или 1;

каждый -R⁶, -R^6a, -R⁷, -R^7a, -R⁸, -R^8a, -R^8b, -R⁹, -R^9a, -R^9b независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, галогена, -CN, -COOR¹⁰, -OR¹⁰, -C(O)R¹⁰, -C(O)N(R¹⁰R^10a), -S(O)₂N(R¹⁰R^10a), -S(O)N(R¹⁰R^10a), -S(O)₂R¹⁰, -S(O)R¹⁰, -N(R¹⁰)S(O)₂N(R^10aR^10b), -SR¹⁰, -N(R¹⁰R^10a), -NO₂, -OC(O)R¹⁰, -N(R¹⁰)C(O)R^10a, -N(R¹⁰)S(O)₂R^10a, -N(R¹⁰)S(O)R^10a, -N(R¹⁰)C(O)OR^10a, -N(R¹⁰)C(O)N(R^10aR^10b), -OC(O)N(R¹⁰R^10a), -T, C_1-20 алкила, C_2-20 алкенила и C_2-20 алкинила; где -T, C_1-20 алкил, C_2-20 алкенил и C_2-20 алкинил необязательно замещены одним или более -R¹¹, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-20 алкил, C_2-20 алкенил и C_2-20 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R¹²)-, -S(O)₂N(R¹²)-, -S(O)N(R¹²)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R¹²)S(O)₂N(R^12a)-, -S-, -N(R¹²)-, -OC(OR¹²)(R^12a)-, -N(R¹²)C(O)N(R^12a)-, и -OC(O)N(R¹²)-;

каждый -R¹⁰, -R^10a, -R^10b независимо выбран из группы, состоящей из -H, -T, C_1-20 алкила, C_2-20 алкенила и C_2-20 алкинила; где -T, C_1-20 алкил, C_2-20 алкенил и C_2-20 алкинил необязательно замещены одним или более -R¹¹, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-20 алкил, C_2-20 алкенил и C_2-20 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R¹²)-, -S(O)₂N(R¹²)-, -S(O)N(R¹²)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R¹²)S(O)₂N(R^12a)-, -S-, -N(R¹²)-, -OC(OR¹²)(R^12a)-, -N(R¹²)C(O)N(R^12a)-, и -OC(O)N(R¹²)-;

каждый T независимо друг от друга выбран из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила и 8-11-ти членного гетеробициклила, где каждый T необязательно независимо замещен одним или более -R¹¹, которые являются одинаковыми или различными;

каждый -R¹¹ независимо друг от друга выбран из галогена, -CN, оксо (=O), -COOR¹³, -OR¹³, -C(O)R¹³, -C(O)N(R¹³R^13a), -S(O)₂N(R¹³R^13a), -S(O)N(R¹³R^13a), -S(O)₂R¹³, -S(O)R¹³, -N(R¹³)S(O)₂N(R^13aR^13b), -SR¹³, -N(R¹³R^13a), -NO₂, -OC(O)R¹³, -N(R¹³)C(O)R^13a, -N(R¹³)S(O)₂R^13a, -N(R¹³)S(O)R^13a, -N(R¹³)C(O)OR^13a, -N(R¹³)C(O)N(R^13aR^13b), -OC(O)N(R¹³R^13a), и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными;

каждый -R¹², -R^12a, -R¹³, -R^13a, -R^13b независимо выбран из группы, состоящей из -H и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными;

необязательно одна или более из пар -R¹/-R^1a, -R²/-R^2a, -R³/-R^3a, -R⁶/-R^6a, -R⁷/-R^7a соединены вместе с атомом, к которому они присоединены, с образованием C_3-10 циклоалкила или 3-10-ти членного гетероциклила;

необязательно одна или более из пар -R¹/-R², -R¹/-R³, -R¹/-R⁴, -R¹/-R⁵, -R¹/-R⁶, -R¹/-R⁷, -R²/-R³, -R²/-R⁴, -R²/-R⁵, -R²/-R⁶, -R²/-R⁷, -R³/-R⁴, -R³/-R⁵, -R³/-R⁶, -R³/-R⁷, -R⁴/-R⁵, -R⁴/-R⁶, -R⁴/-R⁷, -R⁵/-R⁶, -R⁵/-R⁷, -R⁶/-R⁷ соединены вместе с атомами, к которым они присоединены, с образованием кольца A;

A выбран из группы, состоящей из фенила; нафтила; инденила; инданила; тетралинила; C_3-10 циклоалкила; 3-10-ти членного гетероциклила и 8-11-ти членного гетеробициклила

где -L¹-имеет в качестве заместителя по меньшей мере один -L²-Z, и где -L¹-необязательно дополнительно замещен.

Необязательные дальнейшие заместители фрагмента -L¹-формулы (III) предпочтительно являются такими, как описано выше.

Предпочтительно -L¹-формулы (III) имеет в качестве заместителя один фрагмент -L²-Z.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-формулы (III) дополнительно не замещен.

В одном варианте выполнения настоящего изобретения -L¹-формулы (III) дополнительно не замещен.

Дополнительные предпочтительные варианты выполнения для -L¹-раскрываются в EP1536334B1, WO2009/009712A1, WO2008/034122A1, WO2009/143412A2, WO2011/082368A2 и US8618124B2, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме.

Дополнительные предпочтительные варианты выполнения для -L¹-раскрываются в US8946405B2 и US8754190B2, которые включены в настоящую заявку посредством ссылки в полном объеме. Соответственно, предпочтительная фрагмент -L¹-имеет формулу (IV):

(IV),

где

пунктирная линия показывает присоединение к -D через функциональную группу фрагмента -D, выбранную из группы, состоящей из -OH, -SH и NH₂;

m равно 0 или 1;

по меньшей мере один или оба из -R¹ и R² выбирается/выбираются независимо друг от друга из группы, состоящей из -CN, -NO₂, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного гетероарила, необязательно замещенного алкенила, необязательно замещенного алкинила, -C(O)R³, -S(O)R³, -S(O)₂R³ и -SR⁴,

один и только один из -R¹ и R² выбирают из группы, состоящей из -H, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного арилалкила и необязательно замещенного гетероарилалкила;

-R³ выбирают из группы, состоящей из -H, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного арилалкила, необязательно замещенного гетероарила, необязательно замещенного гетероарилалкила, -OR⁹ и N(R⁹)₂;

-R⁴ выбирают из группы, состоящей из необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного арилалкила, необязательно замещенного гетероарила и необязательно замещенного гетероарилалкила;

каждый -R⁵ независимо выбирают из группы, состоящей из -H, необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного алкенилалкила, необязательно замещенного алкинилалкила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного арилалкила, необязательно замещенного гетероарила и необязательно замещенного гетероарилалкила;

-R⁹ выбирают из группы, состоящей из -H и необязательно замещенного алкила;

-Y- отсутствует, и -X-представляет собой -O-или S-; или

-Y- представляет собой -N(Q)CH₂-, и X-представляет собой -O-;

Q выбирают из группы, состоящей из необязательно замещенного алкила, необязательно замещенного арила, необязательно замещенного арилалкила, необязательно замещенного гетероарила и необязательно замещенного гетероарилалкила;

необязательно, -R¹ и R² могут соединяться с образованием 3-8-членного кольца; и

необязательно, оба -R⁹ вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют гетероциклическое кольцо;

где -L¹-имеет в качестве заместителя -L²-Z, и где -L¹-необязательно дополнительно замещен.

Только в контексте формулы (IV) применяемые термины имеют следующие значения:

Термин “алкил”, как применяется в настоящей заявке, включает линейные, разветвленные или циклические насыщенные углеводородные группы, имеющие от 1 до 8 атомов углерода, или в некоторых вариантах выполнения настоящего изобретения от 1 до 6 или от 1 до 4 атомов углерода.

Термин “алкокси” включает алкильные группы, связанные с кислородом, включая метокси, этокси, изопропокси, циклопропокси, циклобутокси и подобное.

Термин “алкенил” включает неароматические ненасыщенные углеводороды с двойными связями углерод-углерод.

Термин “алкинил” включает неароматические ненасыщенные углеводороды с тройными связями углерод-углерод.

Термин “арил” включает ароматические углеводородные группы, имеющие от 6 до 18 атомов углерода, предпочтительно от 6 до 10 атомов углерода, включая группы, такие как фенил, нафтил и антраценил. Термин “гетероарил” включает ароматические кольца, содержащие от 3 до 15 атомов углерода, содержащие по меньшей мере один N, O или S атом, предпочтительно от 3 до 7 атомов углерода, содержащие по меньшей мере один N, O или S атом, включая группы, такие как пирролил, пиридил, пиримидинил, имидазолил, оксазолил, изооксазолил, тиазолил, изотиазолил, хинолил, индолил, инденил и подобное.

В некоторых случаях, алкенильные, алкинильные, арильные или гетероарильные фрагменты могут быть соединены с оставшейся частью молекулы через алкиленовую связь. При этих обстоятельствах заместитель будет называться алкенилалкил, алкинилалкил, арилалкил или гетероарилалкил, что указывает на то, что алкиленовый фрагмент находится между алкенилом, алкинилом, арилом или гетероарилом и молекулой, с которой связан алкенил, алкинил, арил или гетероарил.

Термин “галоген” включает бром, фтор, хлор и иод.

Термин “гетероциклическое кольцо” относится к 4 -8-членному ароматическому или неароматическому кольцу, содержащему от 3 до 7 атомов углерода и по меньшей мере один N, O, или S атом. Примерами являются пиперидинил, пиперазинил, тетрагидропиранил, пирролидин и тетрагидрофуранил, а также примерные группы, приведенные вые для термина “гетероарил”.

Когда кольцевая система необязательно замещена, подходящие заместители выбирают из группы, состоящей из алкила, алкенила, алкинила или дополнительного кольца, где каждый необязательно дополнительно замещен. Необязательные заместители в любой группе, включая вышеуказанные, включают гало, нитро, циано, OR, -SR, -NR₂, -OCOR, -NRCOR, -COOR, -CONR₂, -SOR, -SO₂R, -SONR₂, -SO₂NR₂, где каждый R независимо представляет собой алкил, алкенил, алкинил, арил или гетероарил, или две R группы, взятые вместе с атомами, к которым они присоединены, образуют кольцо.

Предпочтительно -L¹-формулы (IV) имеет в качестве заместителя один фрагмент -L²-Z.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-имеет структуру, раскрытую в WO2013/036857A1, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Соответственно, согласно другому варианту осуществления -L¹-имеет формулу (V):

(V),

где

пунктирная линия показывает присоединение к -D через аминную функциональную группу -D;

-R¹ выбран из группы, состоящей из необязательного замещенного C₁-C₆ линейного, разветвленного или циклического алкила; необязательно замещенного арила; необязательно замещенного гетероарила, алкокси и -NR⁵₂;

-R² выбран из группы, состоящей из -H; необязательно замещенного C₁-C₆ алкила; необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила;

-R³ выбран из группы, состоящей из -H; необязательно замещенного C₁-C₆ алкила; необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила;

-R⁴ выбран из группы, состоящей из -H; необязательно замещенного C₁-C₆ алкила; необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила;

каждый -R⁵ независимо друг от друга выбран из группы, состоящей из -H; необязательно замещенного C₁-C₆ алкила; необязательно замещенного арила и необязательно замещенного гетероарила; или взятые вместе два -R⁵ могут представлять собой циклоалкил или циклогетероалкил;

где -L¹-имеет в качестве заместителя -L²-Z, и где -L¹-необязательно дополнительно замещен.

Только в контексте формулы (V) применяемые термины имеют следующие значения:

“Алкил”, “алкенил” и “алкинил” включают линейные, разветвленные или циклические углеводородные группы, имеющие от 1 до 8 атомов углерода или 1-6 атомов углерода или 1-4 атомов углерода, где алкилом является насыщенный углеводород, алкенил включает одну или более двойных связей углерод-углерод, и алкинил включает одну или более тройных связей углерод-углерод. Если иного не указано, они содержат 1-6 атомов углерода.

“Арил” включает ароматические углеводородные группы, имеющие от 6 до 18 атомов углерода, предпочтительно 6-10 атомов углерода, включая группы, такие как фенил, нафтил и антрацен. “Гетероарил” включает ароматические кольца, содержащие 3-15 атомов углерода, содержащие по меньшей мере один N, O или S атом, предпочтительно 3-7 атомов углерода, содержащие по меньшей мере один N, O или S атом, включая группы, такие как пирролил, пиридил, пиримидинил, имидазолил, оксазолил, изооксазолил, тиазолил, изотиазолил, хинолил, индолил, инденил и подобное.

Термин “замещенный” означает алкильную, алкенильную, алкинильную, арильную или гетероарильную группу, включающую одну или более групп заместителей вместо одного или более атомов водорода. Заместители могут в общем быть выбраны из галогена, включая F, Cl, Br и I; низшего алкила, включая линейный, разветвленный и циклический; низшего галоалкила, включая фторалкил, хлоралкил, бромалкил и иодалкил; ОН; низшего алкокси, включая линейные, разветвленные и циклические; SH; низшего алкилтио, включая линейный, разветвленный и циклический; амино, алкиламино, диалкиламино, силила, включая алкилсилил, алкоксисилил и арилсилил; нитро; циано; карбонила; карбоновой кислоты, сложного эфира карбоновой кислоты, карбоксильного амида, аминокарбонила; аминоацила; карбамата; мочевины; тиокарбамата; тиомочевины; кетона; сульфона; сульфонамида; арила, включая фенил, нафтил и антраценил; гетероарила, включая 5-ти членные гетероарилы, включая пиррол, имидазол, фуран, тиофен, оксазол, тиазол, изоксазол, изотиазол, тиадиазол, триазол, оксадиазол и тетразол, 6-ти членные гетероарилы, включая пиридин, пиримидин, пиразин, и конденсированные гетероарилы, включая бензофуран, бензотиофен, бензоксазол, бензимидазол, индол, бензотиазол, бензизоксазол и бензизотиазол.

Предпочтительно -L¹-формулы (V) имеет в качестве заместителя один фрагмент -L²-Z.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-имеет структуру, как раскрыто в US7585837B2, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Соответственно, согласно другому варианту осуществления -L¹-имеет формулу (VI):

где

пунктирная линия показывает присоединение к -D через аминную функциональную группу -D;

R¹ и R² независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, алкила, алкокси, алкоксиалкила, арила, алкарила, аралкила, галогена, нитро, -SO₃H, -SO₂NHR⁵, амино, аммония, карбоксила, PO₃H₂ и OPO₃H₂;

R³, R⁴ и R⁵ независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, алкила и арила;

где -L¹-имеет в качестве заместителя -L²-Z, и где -L¹-необязательно дополнительно замещен.

Подходящими заместителями для формулы (VI) являются фрагменты алкил (как например C_1-6 алкил), алкенил (как например C_2-6 алкенил), алкинил (как например C_2-6 алкинил), арил (как например фенил), гетероалкил, гетероалкенил, гетероалкинил, гетероарил (как например ароматический 4 -7 членный гетероцикл) или галоген.

Только в контексте формулы (VI) применяемые термины имеют следующие значения:

Термины “алкил”, “алкокси”, “алкоксиалкил”, “арил”, “алкарил” и “аралкил” означают алкильные радикалы, содержащие 1-8, предпочтительно 1-4 атомов углерода, например, метил, этил, пропил, изопропил и бутил, и арильные радикалы, содержащие 6-10 атомов углерода, например, фенил и нафтил. Термин “галоген” включает бром, фтор, хлор и иод.

Предпочтительно -L¹-формулы (VI) имеет в качестве заместителя один фрагмент -L²-Z.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-имеет структуру, как раскрыто в WO2002/089789A1, которая включена в настоящий документ посредством ссылки. Соответственно, согласно другому варианту осуществления -L¹-имеет формулу (VII):

где

пунктирная линия показывает присоединение к -D через аминную функциональную группу -D;

L₁ представляет собой бифункциональную связывающую группу,

Y₁ и Y₂ независимо представляют собой O, S или NR⁷;

R², R³, R⁴, R⁵, R⁶ и R⁷ независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, C_1-6 алкилов, C_3-12 разветвленных алкилов, C_3-8 циклоалкилов, C_1-6 замещенных алкилов, C_3-8 замещенных циклоалкилов, арилов, замещенных арилов, аралкилов, C_1-6 гетероалкилов, замещенных C_1-6 гетероалкилов, C_1-6 алкокси, фенокси и C_1-6 гетероалкокси;

Ar представляет собой фрагмент, который при включении в формулу (VII), образует мультизамещенный ароматический углеводород или мульти-замещенную гетероциклическую группу;

X представляет собой химическую связь или фрагмент, который активно переносится в клетку-мишень, гидрофобный фрагмент или их комбинацию,

y представляет собой 0 или 1;

где -L¹-имеет в качестве заместителя -L²-Z, и где -L¹-необязательно дополнительно замещен.

Только в контексте формулы (VII) применяемые термины имеют следующие значения:

Термин “алкил”, как следует понимать, включает, например, неразветвленные, разветвленные, замещенные C_1-12 алкилы, включая алкокси, C_3-8 циклоалкилы или замещенные циклоалкилы, и т.д.

Термин “замещение”, как следует понимать, включает добавление или замещение одного или более атомов, содержащихся в функциональной группе, или соединения с одним или более отличными атомами.

Замещенные алкилы включают карбоксиалкилы, аминоалкилы, диалкиламины, гидроксиалкилы и меркаптоалкилы; замещенные циклоалкилы включают фрагменты, как например 4-хлорциклогексил; арилы включают фрагменты, как например нафтил; замещенные арилы включают фрагменты, как например 3-бром-фенил; аралкилы включают фрагменты, как например толуил; гетероалкилы включают фрагменты, как например этилтиофен; замещенный гетероалкилы включают фрагменты, как например 3-метокситиофен; алкокси включает фрагменты, как например метокси; и фенокси включает фрагменты, как например 3-нитрофенокси. Гало-, как необходимо понимать, включает фтор, хлор, иод и бром.

Предпочтительно -L¹-формулы (VII) имеет в качестве заместителя один фрагмент -L²-Z.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-содержит подструктуру формулы (VIII)

(VIII),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому азота в -D посредством образования амидной связи;

непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к оставшейся части -L¹-; и

где -L¹-имеет в качестве заместителя -L²-Z, и где -L¹-необязательно дополнительно замещен.

Предпочтительно -L¹-формулы (VIII) имеет в качестве заместителя один фрагмент -L²-Z.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-формулы (VIII) дополнительно не замещен.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-содержит подструктуру формулы (IX)

(IX),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому азота в -D посредством образования карбаматной связи;

непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к оставшейся части -L¹-; и

где -L¹-имеет в качестве заместителя -L²-Z, и где -L¹-необязательно дополнительно замещен.

Предпочтительно -L¹-формулы (IX) имеет в качестве заместителя один фрагмент -L²-Z.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-формулы (IX) дополнительно не замещен.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-имеет формулу (IX-a):

(IX-a),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому азота в -D, и непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -L²-Z;

n представляет собой 0, 1, 2, 3, или 4;

=Y₁, выбран из группы, состоящей из =O и =S;

-Y₂- выбран из группы, состоящей из -O-и -S-;

-Y₃- выбран из группы, состоящей из -O-и -S-;

-Y₄- выбран из группы, состоящей из -O-, -NR⁵-и -C(R⁶R^6a)-;

=Y₅ выбран из группы, состоящей из =O и =S;

-R³, -R⁵, -R⁶, -R^6a независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила, трет-бутила, н-пентила, 2-метилбутила, 2,2-диметилпропила, н-гексила, 2-метилпентила, 3-метилпентила, 2,2-диметилбутила, 2,3-диметилбутила и 3,3-диметилпропила;

-R⁴ выбран из группы, состоящей из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила, трет-бутила, н-пентила, 2-метилбутила, 2,2-диметилпропила, н-гексила, 2-метилпентила, 3-метилпентила, 2,2-диметилбутила, 2,3-диметилбутила и 3,3-диметилпропила;

-W- выбран из группы, состоящей из C_1-20 алкила, необязательно прерывающимися одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из C_3-10 циклоалкила, 8-30-ти членного карбополициклила, 3-10-ти членный гетероциклила, -C(O)-, -C(O)N(R⁷)-, -O-, -S-и -N(R⁷)-;

-Nu представляет собой нуклеофил, выбранный из группы, состоящей из -N(R⁷R^7a), -N(R⁷OH), -N(R⁷)-N(R^7aR^7b), -S(R⁷),-COOH,

-Ar- выбран из группы, состоящей из

где

пунктирная линия указывает присоединение к оставшейся части -L¹-,

-Z¹- выбран из группы, состоящей из -O-, -S-и -N(R⁷)-, и

-Z²- представляет собой -N(R⁷)-; и

-R⁷, -R^7a, -R^7b независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила и C_2-6 алкинила;

где -L¹-необязательно дополнительно замещен.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-формулы (IX-a) дополнительно не замещен.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-имеет формулу (IX-b):

(IX-b),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому азота в -D, и непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -L²-Z;

n представляет собой 0, 1, 2, 3 или 4;

=Y₁, выбран из группы, состоящей из =O и =S;

-Y₂- выбран из группы, состоящей из -O-и -S-;

-Y₃- выбран из группы, состоящей из -O-и -S-;

-Y₄- выбран из группы, состоящей из -O-, -NR⁵-и -C(R⁶R^6a)-;

=Y₅ выбран из группы, состоящей из =O и =S;

-R², -R³, -R⁵, -R⁶, -R^6a независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила, трет-бутила, н-пентила, 2-метилбутила, 2,2-диметилпропила, н-гексила, 2-метилпентила, 3-метилпентила, 2,2-диметилбутила, 2,3-диметилбутила и 3,3-диметилпропила;

-R⁴ выбран из группы, состоящей из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила, трет-бутила, н-пентила, 2-метилбутила, 2,2-диметилпропила, н-гексила, 2-метилпентила, 3-метилпентила, 2,2-диметилбутила, 2,3-диметилбутила и 3,3-диметилпропила;

-W- выбран из группы, состоящей из C_1-20 алкила, необязательно прерывающимися одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из C_3-10 циклоалкила, 8-30-ти членного карбополициклила, 3-10-ти членный гетероциклила, -C(O)-, -C(O)N(R⁷)-, -O-, -S-и -N(R⁷)-;

-Nu представляет собой нуклеофил, выбранный из группы, состоящей из -N(R⁷R^7a), -N(R⁷OH), -N(R⁷)-N(R^7aR^7b), -S(R⁷),-COOH,

-Ar- выбран из группы, состоящей из

где

пунктирная линия указывает присоединение к оставшейся части -L¹-,

-Z¹- выбран из группы, состоящей из -O-, -S-и -N(R⁷)-, и

-Z²- представляет собой -N(R⁷)-; и

-R⁷, -R^7a, -R^7b независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, C_1-6 алкила, C_2-6 алкенила и C_2-6 алкинила;

где -L¹-необязательно дополнительно замещен.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-формулы (IX-b) дополнительно не замещен.

Согласно определенным вариантам осуществления =Y¹ формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой =O.

Согласно определенным вариантам осуществления -Y²-формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой -O-.

Согласно определенным вариантам осуществления -Y³-формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой -O-.

Согласно определенным вариантам осуществления -Y⁴-формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой -NR⁵-.

Согласно определенным вариантам осуществления =Y⁵ формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой =O.

Согласно определенным вариантам осуществления n формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой 0 или 1. Согласно определенным вариантам осуществления n формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой 0. Согласно определенным вариантам осуществления n формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой 1.

Согласно определенным вариантам осуществления -R² формулы (IX-b) выбран из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Согласно определенным вариантам осуществления -R² формулы (IX-b) выбран из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила и изопропила. Согласно определенным вариантам осуществления -R² формулы (IX-b) выбран из -H, метила и этила. Согласно определенным вариантам осуществления -R² формулы (IX-b) представляет собой -H.

Согласно определенным вариантам осуществления -R³ формулы (IX-a) и (IX-b) выбран из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Согласно определенным вариантам осуществления -R³ формулы (IX-a) и (IX-b) выбран из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила и изопропила. Согласно определенным вариантам осуществления -R³ формулы (IX-a) и (IX-b) выбран из -H, метила и этила. Согласно определенным вариантам осуществления -R³ формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой -H.

Согласно предпочтительному варианту осуществления каждый -R⁴ формулы (IX-a) и (IX-b) независимо выбран из метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁴ формулы (IX-a) и (IX-b) выбран из группы, состоящей из метила, этила, н-пропила и изопропила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁴ формулы (IX-a) и (IX-b) выбран из метила и этила.

Согласно определенным вариантам осуществления -R⁵ формулы (IX-a) и (IX-b) выбран из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁵ формулы (IX-a) и (IX-b) выбран из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила и изопропила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁵ формулы (IX-a) и (IX-b) выбран из метила и этила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁵ формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой метил.

Согласно определенным вариантам осуществления -R⁶ и -R^6a формулы (IX-a) и (IX-b) независимо выбраны из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁶ и -R^6a формулы (IX-a) и (IX-b) независимо выбраны из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила и изопропила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁶ и -R^6a формулы (IX-a) и (IX-b) независимо выбраны из -H, метила и этила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁶ и -R^6a формулы (IX-a) и (IX-b) оба представляют собой -H.

Согласно определенным вариантам осуществления Ar формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой фенил. Согласно определенным вариантам осуществления Ar формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой

,

где пунктирная линия указывает присоединение к оставшейся части фрагмента формулы (IX-a) и (IX-b).

Согласно определенным вариантам осуществления W формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой C_1-20 алкил, необязательно прерванный C_3-10 циклоалкилом, -C(O)-, -C(O)N(R⁷)-, -O-, -S-и -N(R⁷)-. Согласно определенным вариантам осуществления W формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой C_1-10 алкил, необязательно прерванный C_3-10 циклоалкилом, -C(O)-, -C(O)N(R⁷)-, -O-, -S-и -N(R⁷)-. Согласно определенным вариантам осуществления W формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой C_1-6 алкил, необязательно прерванный C_3-10 циклоалкил, -C(O)-, -C(O)N(R⁷)-, -O-, -S-и -N(R⁷)-. Согласно определенным вариантам осуществления W формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой

,

где

пунктирная линия указывает присоединение к оставшейся части фрагмента формулы (IX-a) и (IX-b), соответственно.

Согласно определенным вариантам осуществления -Nu формулы (IX-a) и (IX-b) представляет собой -N(R⁷R^7a).

Согласно определенным вариантам осуществления -R⁷, -R^7a и -R^7b формулы (IX-a) и (IX-b) независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, метила, этила, н-пропила, изопропила, н-бутила, изобутила, втор-бутила и трет-бутила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁷, -R^7a и -R^7b формулы (IX-a) и (IX-b) каждый независимо выбран из -H, метила, этила, н-пропила и изопропила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁷, -R^7a и -R^7b формулы (IX-a) и (IX-b) каждый независимо выбран из метила или этила. Согласно определенным вариантам осуществления -R⁷, -R^7a и -R^7b формулы (IX-a) и (IX-b) оба представляют собой метил.

Согласно определенным вариантам осуществления -L¹-имеет формулу (IX-c)

(IX-c),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому азота в -D;

непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -L²-Z; и

s1 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10.

Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-c) представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4 и 5. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-c) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-c) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-c) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-c) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-c) представляет собой 5.

Согласно определенным вариантам осуществления -L¹-имеет формулу (IX-d)

(IX-d),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому азота в -D; и

непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -L²-Z.

Фрагмент -L¹-может быть соединен с -D через любой тип связи, при условии, что она является обратимой. Предпочтительно, -L¹-соединен с -D через связь, выбранную из группы, состоящей из амида, сложного эфира, карбамата, ацеталя, аминаля, имина, оксима, гидразона, дисульфида и ацилгуанидина. Даже более предпочтительно -L¹-соединен с -D через связь, выбранную из группы, состоящей из амида, сложного эфира, карбамата и ацилгуанидина. Понятно, что эти связи сами по себе не могут быть обратимыми, но что соседние группы атомов или фрагментов, содержащиеся в L¹, могут сделать связь обратимой.

Согласно одному варианту осуществления -L¹-соединена с -D через сложноэфирную связь.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-соединена с -D через карбаматную связь.

Согласно другому варианту осуществления -L¹-соединена с -D через ацилгуанидин.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения, фрагмент -L¹-соединен с -D через амидную связь.

Согласно определенным вариантам осуществления -L¹-соединен с -D через атом азота аминной функциональной группы боковой цепи лизинового остатка -D. Согласно определенным вариантам осуществления -L¹-соединен с -D через атом азота аминной функциональной группы боковой цепи лизинового остатка -D, и связь, образованная между -D и -L¹-, представляет собой карбамат. Варианты осуществления такого лизинового остатка описаны выше.

Согласно одному варианту осуществления -L²-представляет собой химическую связь.

Согласно другому варианту осуществления -L²-представляет собой спейсерный фрагмент.

Согласно определенным вариантам осуществления -L²-выбран из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y1)-, -S(O)₂N(R^y1)-, -S(O)N(R^y1)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^y1)S(O)₂N(R^y1a)-, -S-, -N(R^y1)-, -OC(OR^y1)(R^y1a)-, -N(R^y1)C(O)N(R^y1a)-, -OC(O)N(R^y1)-, C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила и C_2-50 алкинила; где -T-, C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно замещены одним или более -R^y2, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y3)-, -S(O)₂N(R^y3)-, -S(O)N(R^y3)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^y3)S(O)₂N(R^y3a)-, -S-, -N(R^y3)-, -OC(OR^y3)(R^y3a)-, -N(R^y3)C(O)N(R^y3a)-, и -OC(O)N(R^y3)-;

-R^y1 и -R^y1a независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, -T, C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила, и C_2-50 алкинила; где -T, C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил, и C_2-50 алкинил необязательно замещены одним или более -R^y2, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y4)-, -S(O)₂N(R^y4)-, -S(O)N(R^y4)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^y4)S(O)₂N(R^y4a)-, -S-, -N(R^y4)-, -OC(OR^y4)(R^y4a)-, -N(R^y4)C(O)N(R^y4a)-, и -OC(O)N(R^y4)-;

каждый T независимо выбран из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила, 8-11-ти членного гетеробициклила, 8-30-ти членного карбополициклила, и 8-30-ти членного гетерополициклила; где каждый T необязательно независимо замещен одним или более -R^y2, которые являются одинаковыми или различными;

каждый -R^y2 независимо выбран из группы, состоящей из галогена, -CN, оксо (=O), -COOR^y5, -OR^y5, -C(O)R^y5, -C(O)N(R^y5R^y5a), -S(O)₂N(R^y5R^y5a), -S(O)N(R^y5R^y5a), -S(O)₂R^y5, -S(O)R^y5, -N(R^y5)S(O)₂N(R^y5aR^y5b), -SR^y5, -N(R^y5R^y5a), -NO₂, -OC(O)R^y5, -N(R^y5)C(O)R^y5a, -N(R^y5)S(O)₂R^y5a, -N(R^y5)S(O)R^y5a, -N(R^y5)C(O)OR^y5a, -N(R^y5)C(O)N(R^y5aR^y5b), -OC(O)N(R^y5R^y5a), и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными; и

каждый -R^y3, -R^y3a, -R^y4, -R^y4a, -R^y5, -R^y5a и -R^y5b независимо выбран из группы, состоящей из -H и C_1-6 алкила, где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными.

Согласно определенным вариантам осуществления -L²-выбран из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y1)-, -S(O)₂N(R^y1)-, -S(O)N(R^y1)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^y1)S(O)₂N(R^y1a)-, -S-, -N(R^y1)-, -OC(OR^y1)(R^y1a)-, -N(R^y1)C(O)N(R^y1a)-, -OC(O)N(R^y1)-, C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила, и C_2-50 алкинила; где -T-, C_1-20 алкил, C_2-20 алкенил и C_2-20 алкинил необязательно замещены одним или более -R^y2, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-20 алкил, C_2-20 алкенил и C_2-20 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y3)-, -S(O)₂N(R^y3)-, -S(O)N(R^y3)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^y3)S(O)₂N(R^y3a)-, -S-, -N(R^y3)-, -OC(OR^y3)(R^y3a)-, -N(R^y3)C(O)N(R^y3a)-, и -OC(O)N(R^y3)-;

-R^y1 и -R^y1a независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, -T, C_1-10 алкила, C_2-10 алкенила, и C_2-10 алкинила; где -T, C_1-10 алкил, C_2-10 алкенил и C_2-10 алкинил необязательно замещены одним или более -R^y2, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-10 алкил, C_2-10 алкенил, и C_2-10 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y4)-, -S(O)₂N(R^y4)-, -S(O)N(R^y4)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^y4)S(O)₂N(R^y4a)-, -S-, -N(R^y4)-, -OC(OR^y4)(R^y4a)-, -N(R^y4)C(O)N(R^y4a)-, и -OC(O)N(R^y4)-;

каждый T независимо выбран из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила, 8-11-ти членного гетеробициклила, 8-30-ти членного карбополициклила, и 8-30-ти членного гетерополициклила; где каждый T необязательно независимо замещен одним или более -R^y2, которые являются одинаковыми или различными;

-R^y2 выбран из группы, состоящей из галогена, -CN, оксо (=O), -COOR^y5, -OR^y5, -C(O)R^y5, -C(O)N(R^y5R^y5a), -S(O)₂N(R^y5R^y5a), -S(O)N(R^y5R^y5a), -S(O)₂R^y5, -S(O)R^y5, -N(R^y5)S(O)₂N(R^y5aR^y5b), -SR^y5, -N(R^y5R^y5a), -NO₂, -OC(O)R^y5, -N(R^y5)C(O)R^y5a, -N(R^y5)S(O)₂R^y5a, -N(R^y5)S(O)R^y5a, -N(R^y5)C(O)OR^y5a, -N(R^y5)C(O)N(R^y5aR^y5b), -OC(O)N(R^y5R^y5a), и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными; и

каждый -R^y3, -R^y3a, -R^y4, -R^y4a, -R^y5, -R^y5a и -R^y5b независимо друг от друга выбран из группы, состоящей из -H, и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными.

Согласно определенным вариантам осуществления -L²-выбран из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y1)-, -S(O)₂N(R^y1)-, -S(O)N(R^y1)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^y1)S(O)₂N(R^y1a)-, -S-, -N(R^y1)-, -OC(OR^y1)(R^y1a)-, -N(R^y1)C(O)N(R^y1a)-, -OC(O)N(R^y1)-, C_1-50 алкила, C_2-50 алкенила и C_2-50 алкинила; где -T-, C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно замещены одним или более -R^y2, которые являются одинаковыми или различными, и где C_1-50 алкил, C_2-50 алкенил и C_2-50 алкинил необязательно прерываются одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из -T-, -C(O)O-, -O-, -C(O)-, -C(O)N(R^y3)-, -S(O)₂N(R^y3)-, -S(O)N(R^y3)-, -S(O)₂-, -S(O)-, -N(R^y3)S(O)₂N(R^y3a)-, -S-, -N(R^y3)-, -OC(OR^y3)(R^y3a)-, -N(R^y3)C(O)N(R^y3a)-, и -OC(O)N(R^y3)-;

-R^y1 и -R^y1a независимо выбраны из группы, состоящей из -H, -T, C_1-10 алкила, C_2-10 алкенила и C_2-10 алкинила;

каждый T независимо выбран из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила, 8-11-ти членного гетеробициклила, 8-30-ти членного карбополициклила, и 8-30-ти членного гетерополициклила;

каждый -R^y2 независимо выбран из группы, состоящей из галогена и C_1-6 алкила; и

каждый -R^y3, -R^y3a, -R^y4, -R^y4a, -R^y5, -R^y5a и -R^y5b независимо друг от друга выбран из группы, состоящей из -H, и C_1-6 алкила; где C_1-6 алкил необязательно замещен одним или более галогенами, которые являются одинаковыми или различными.

Согласно определенным вариантам осуществления -L²-представляет собой C_1-20 алкильную цепь, которая необязательно прерывается одной или более группами, независимо выбранными из -O-, -T-и -C(O)N(R^y1)-; и где C_1-20 алкильная цепь, необязательно замещена одной или более группами, независимо выбранными из -OH, -T и -C(O)N(R^y6R^y6a); где -R^y1, -R^y6, -R^y6a независимо выбраны из группы, состоящей из H и C_1-4 алкила, и где T выбран из группы, состоящей из фенила, нафтила, инденила, инданила, тетралинила, C_3-10 циклоалкила, 3-10-ти членного гетероциклила, 8-11-ти членного гетеробициклила, 8-30-ти членного карбополициклила, и 8-30-ти членного гетерополициклила.

Согласно определенным вариантам осуществления -L²-имеет молекулярную массу в интервале от 14 г/моль до 750 г/моль.

Согласно определенным вариантам осуществления -L²-содержит фрагмент, выбранный из группы, состоящей из

,, ,, ,, , , , , , , , ,, , , , , ,

, , и ;

где

пунктирная линия указывает присоединение к -L¹-, оставшуюся часть -L²-или к -Z, соответственно; и

-R и -R^a независимо друг от друга выбраны из группы, состоящей из -H, метила, этила, пропила, бутила, пентила и гексила.

Согласно определенным вариантам осуществления -L²-имеет формулу (IX-e)

(IX-e),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к -L¹-;

непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -Z; и

s2 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20.

Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 6. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 7. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 8.

Согласно определенным вариантам осуществления фрагмент -L¹-L²-имеет формулу (IX-f)

(IX-f),

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому азота в -D;

непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -Z;

s1 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 и 10; и

s2 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 и 20.

Соответственно, связь между фрагментом -L¹-и -D, образованная в соединении формулы (IX-f), представляет собой карбамат.

Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-f) представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4 и 5. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-f) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-f) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-f) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-f) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-f) представляет собой 5.

Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-f) представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 и 12. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-f) представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-f) представляет собой 1. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-f) представляет собой 2. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-f) представляет собой 3. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 4. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-f) представляет собой 5. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-e) представляет собой 6. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-f) представляет собой 7. Согласно определенным вариантам осуществления s2 формулы (IX-f) представляет собой 8.

Согласно определенным вариантам осуществления s1 формулы (IX-f) представляет собой 3, и s2 формулы (IX-f) представляет собой 3.

Согласно одному варианту осуществления конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению имеет формулу (Ia). Согласно одному варианту осуществления x представляет собой 1. Согласно другому варианту осуществления x представляет собой 2. Согласно другому варианту осуществления x представляет собой 3. Согласно другому варианту осуществления x представляет собой 4.

Согласно другому варианту осуществления конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению имеет формулу (Ib). Согласно одному варианту осуществления y представляет собой 2. Согласно другому варианту осуществления y представляет собой 3. Согласно другому варианту осуществления y представляет собой 4.

Другим аспектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению и по меньшей мере один эксципиент.

Предпочтительно, фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, имеет значение pH в интервале от pH 3 до pH 8 и включая указанные значения.

Согласно одному варианту осуществления фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению и по меньшей мере один эксципиент, представляет собой жидкий состав.

Согласно другому варианту осуществления фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению и по меньшей мере один эксципиент, представляет собой сухой состав.

Такая жидкая или сухая фармацевтическая композиция фармацевтическая композиция содержит по меньшей мере один эксципиент. Эксципиенты, применяемые в парентеральных композициях, могут быть разделены на категории следующим образом, например, буферные средства, модификаторы изотоничности, консерванты, стабилизаторы, антиадсорбционные средства, средства защиты от окисления, загустители/вещества, увеличивающие вязкость, или другие вспомогательные средства. Однако, в некоторых случаях, один эксципиент может иметь двойные или тройные функции. Предпочтительно, по меньшей мере один эксципиент, содержащийся в фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению выбирают из группы, состоящей из следующего:

(i) Буферные средства: физиологически допустимые буферы для поддержания значения pH в желаемом диапазоне, такие как фосфат натрия, бикарбонат, сукцинат, гистидин, цитрат и ацетат, сульфат, нитрат, хлорид, пируват; нейтролизаторы кислот, такие как Mg(OH)2 или ZnCO3 также могут применяться;

(ii) Модификаторы изотоничности: чтобы минимизировать боль, которая может стать результатом повреждения клеток в ходе разности осмотического давления при инъекции веществ замедленного всасывания; глицерин и хлорид натрия являются примерами; эффективные концентрации могут быть определены осмометрией, применяя допускаемую осмотическую концентрацию раствора, равную 285-315 мОсмоль/кг для сыворотки;

(iii) Консерванты и/или противомикробные средства: мультидозные парентеральные композиции требуют добавления консервантов при достаточной концентрации, чтобы минимизировать риск заражения пациента при инъекции, и соответствующие регулирующие требования должны быть установлены; типичные консерванты включают м-крезол, фенол, метилпарабен, этилпарабен, пропилпарабен, бутилпарабен, хлорбутанол, бензиловый спирт, фенилртути нитрат, тимерозол, сорбиновую кислоту, сорбат калия, бензойную кислоту, хлоркрезол, и бензалкония хлорид;

(iv) Стабилизаторы: Стабилизация достигается за счет усиления стабилизирующих белок сил, дестабилизации денатурированного состояния или прямого связывания эксципиентов с белком; стабилизаторами могут быть аминокислоты, такие как аланин, аргинин, аспарагиновая кислота, глицин, гистидин, лизин, пролин, сахара, такие как глюкоза, сахароза, трегалоза, полиолы, такие как глицерин, маннит, сорбит, соли, такие как фосфат калия, сульфат натрия, хелатирующие средства, такие как EDTA, гексафосфат, лиганды, такие как ионы двухвалентного металла (цинк, кальций и т.д.), другие соли или органические молекулы, такие как фенольные производные; кроме того, могут быть использованы олигомеры или полимеры, такие как циклодекстрины, декстран, дендримеры, ПЭГ или ПВП или протамин или HSA;

(v) Антиадсорбционные средства: В основном ионные или неионные поверхностно-активные вещества или другие белки или растворимые полимеры применяются для покрытия или конкурентным образом адсорбируются на внутренней поверхности контейнера композиции. Например, полоксамер (Pluronic F-68), ПЭГ додециловый простой эфир (Brij 35), полисорбат 20 и 80, декстран, полиэтиленгликоль, ПЭГ-полигистидин, BSA и HSA и желатины; выбранная концентрация и тип эксципиента зависит от эффекта, которого следует избегать, но обычно монослой поверхностно-активного вещества образуется на границе раздела фаз чуть выше значения CMC;

(vi) Средства защиты от окисления: антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, эктоин, метионин, глутатион, монотиоглицерин, морин, полиэтиленимин (PEI), пропилгаллат и витамин Е; хелатирующие агенты, такие как лимонная кислота, EDTA, гексафосфат и тиогликолевая кислота, также могут применяться;

(vii) Загустители или вещества, увеличивающие вязкость: замедляют осаждение частиц во флаконе и шприце и используются для облегчения смешивания и ресуспендирования частиц и для облегчения введения суспензии (т.е. с малой силой на шприцевом поршне); подходящими загустителями или усилителями вязкости являются, например, карбомерные загустители, такие как Carbopol 940, Carbopol Ultrez 10, производные целлюлозы, такие как гидроксипропилметилцеллюлоза (гипромеллоза, HPMC) или диэтиламиноэтилцеллюлоза (DEAE или DEAE-C), коллоидный силикат магния (Veegum) или силикат натрия, гидроксиапатитный гель, трикальцийфосфатный гель, ксантаны, каррагинаны, такие как камедь Satia UTC 30, алифатические поли(гидроксикислоты), как например поли(D, L-или L-молочная кислота) (PLA) и поли(гликолевая кислота) (PGA) и их сополимеры (PLGA), терполимеры D, L-лактида, гликолида и капролактона, полоксамеры, гидрофильные поли(оксиэтиленовые) блоки и гидрофобные поли(оксипропиленовые) блоки для создания триблока поли(оксиэтилен)-поли(оксипропилен)-поли(оксиэтилен) (например, Pluronic®), сополимер простого полиэфира и сложного полиэфира, как например сополимер терефталат полиэтиленгликоля/терефталат полибутилена, сахарозы ацетат изобутират (SAIB), декстран или его производные, комбинации декстранов и ПЭГ, полидиметилсилоксан, коллаген, хитозан, поливиниловый спирт (PVA) и производные, полиалкилимиды, поли(акриламид-со-диаллилдиметиламмоний (DADMA)), поливинилпирролидон (ПВП), глюкозаминогликаны (GAG), такие как дерматан сульфат, хондроитин сульфат, кератан сульфат, гепарин, гепаран сульфат, гиалуронан, ABA триблок-или AB блок-сополимеры, состоящие из гидрофобных А-блоков, как например, полилактид (PLA) или поли(лактид-со-гликолид) (PLGA) и гидрофильные B-блоки, как например полиэтилтенгликоль (ПЭГ) или поливинилпирролидон; такие блок-сополимеры, как и вышеупомянутые полоксамеры, могут проявлять обратимое термическое гелеобразование (состояние жидкости при комнатной температуре для облегчения введения и состояние геля выше температуры перехода золь-гель при температуре тела после инъекции);

(viii) Лиофилизирующий или диффундирующий агент: модифицирует проницаемость соединительной ткани посредством гидролиза компонентов внеклеточного матрикса во интерстициальном пространстве, таких как, но без ограничения к этому, гиалуроновая кислота, полисахарид, обнаруженные в межклеточном пространстве соединительной ткани; лиофилизирующий агент, такой как, но без ограничения к этому, гиалуронидаза, временно снижает вязкость внеклеточной матрицы и способствует диффузии инъецированных лекарственных средств; и

(ix) Другие вспомогательные средства: такие как смачивающие средства, модификаторы вязкости, антибиотики, гиалуронидаза; кислоты и основания, такие как соляная кислота и гидроксид натрия являются вспомогательными средствами, необходимыми для установления значения pH в ходе получения.

Другим аспектом настоящего изобретения является конъюгат IL-2 или его фармацевтиченски приемлемая соль или фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, для применения в качестве медикамента.

Другим аспектом настоящего изобретения является конъюгат IL-2 или его фармацевтиченски приемлемая соль или фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, для применения при лечении заболевания, которое можно лечить посредством IL-2.

Предпочтительно, указанным заболеванием является рак. Даже более предпочтительно указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из саркомы, хордомы, рака толстой кишки, ректального рака, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, плоскоклеточного рака, базально-клеточного рака, аденокарциномы, рака потовой железы, рака сальной железы, папиллярного рака, папиллярной аденокарциномы, цистаденокарциномы, медуллярного рака, рака бронхов, почечно-клеточного рака, гепатомы, рака желчных протоков, хориокарциномы, семиномы, эмбриональногой рака, опухоли Вильмса, рака шейки матки, тестикулярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака уротелия, эпителиального рака, глиомы, астроцитомы, медуллобластомы, краниофарингиомы, эпендимомы, пинеаломы, гемангиобластомы, нейромы слухового нерва, олигодендроглиомы, менингиомы, меланомы, нейробластомы, ретинобластомы, неходжкинской лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, острой миелоидной лейкемии и лейкоза. Даже более предпочтительно, заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы, почечно-клеточной карциномы, рака уротелия, рака молочной железы, колоректального ракы, ракы желудочно-кишечного тракта и саркомы.

Предпочтительные типы саркомы включают фибросаркому, миксосаркому, лейомиосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, гастроинтестинальную стромальную опухоль, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, саркому Юинга, лейомиосаркому и рабдомиосаркому.

Согласно одному варианту осуществления, конъюгат IL-2 или его фармацевтиченски приемлемая соль или фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению для применения при лечении заболевания, которое можно лечить посредством IL-2 вводится до, одновременно или после введения одного или более других лекарственных средств, где одно или более другие лекарственные средства предпочтительно выбраны из группы, состоящей из ингибиторов PD-1; ингибиторов PD-L1; ингибиторов CTLA-4; противораковых вакцин, таких как вакцины против опухолевых клеток, антигенные вакцины, дендритноклеточных вакцин, вакцин на основе вектора; агониста Toll-подобного рецептора (TLR), включая агонисты, нацеленные на TLR2, TLR3, TLR2/4, TLR4, TLR5, TLR7/8 и TLR9; и агентов, которые агонизируют рецепторы, активирующие иммунную систему, такие как 41BB (CD137), OX40, ICOS, CD40, CD28, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, LFA1, CD16, CD64, CD32A и CD3. Согласно одному варианту осуществления, конъюгат IL-2 или его фармацевтиченски приемлемая соль или фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, для применения при лечении заболевания, которое можно лечить посредством IL-2, вводится до, одновременно или после введения одного или более других лекарственных средств, где одно или более другие лекарственныесредства предпочтительно выбраны из группы, состоящей из ингибиторов PD-1; ингибиторов PD-L1; ингибиторов CTLA-4; противораковых вакцин, таких как вакцины против опухолевых клеток, антигенные вакцины, дендритноклеточных вакцин, вакцин на основе вектора; и агониста Toll-подобного рецептора (TLR), включая агонисты, нацеленные на TLR2, TLR3, TLR2/4, TLR4, TLR5, TLR7/8 и TLR9. Такое введение конъюгата IL-2 или его фармацевтиченски приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, с одним или более другими лекарственными средствами может быть либо единичным, либо может повторяться множество раз.

Согласно одному варианту осуществления ингибитор PD-1 представляет собой пембролизумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор PD-1 представляет собой ниволумаб.

Согласно одному варианту осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой атезолизумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой авелумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

Согласно одному варианту осуществления ингибитор CTLA-4 представляет собой ипилимумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор CTLA-4 представляет собой тремелимумаб.

Согласно другому варианту осуществления конъюгат IL-2 или его фармацевтиченски приемлемая соль или фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, вводится до, одновременно или после CAR-T терапии. Такое введение конъюгата IL-2 или его фармацевтиченски приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, в комбинации с CAR-T терапией, может быть либо единичным, либо может повторяться множество раз.

Предпочтительно, конъюгат IL-2, его фармацевтически приемлемая соль или фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, для применения при лечении, вводится пациенту-млекопитающему, предпочтительно пациенту-человеку.

Другим аспектом настоящего изобретения является применение конъюгата IL-2 или его фармацевтиченски приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, для получения медикамента для лечения заболевания, которое можно лечить посредством IL-2.

Предпочтительно, указанным заболеванием является рак. Даже более предпочтительно указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из саркомы, хордомы, рака толстой кишки, ректального рака, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, плоскоклеточного рака, базально-клеточного рака, аденокарциномы, рака потовой железы, рака сальной железы, папиллярного рака, папиллярной аденокарциномы, цистаденокарциномы, медуллярного рака, рака бронхов, почечно-клеточного рака, гепатомы, рака желчных протоков, хориокарциномы, семиномы, эмбриональногой рака, опухоли Вильмса, рака шейки матки, тестикулярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака уротелия, эпителиального рака, глиомы, астроцитомы, медуллобластомы, краниофарингиомы, эпендимомы, пинеаломы, гемангиобластомы, нейромы слухового нерва, олигодендроглиомы, менингиомы, меланомы, нейробластомы, ретинобластомы, неходжкинской лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, острой миелоидной лейкемии и лейкоза. Даже более предпочтительно, заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы, почечно-клеточной карциномы, рака уротелия, рака молочной железы, колоректального ракы, ракы желудочно-кишечного тракта и саркомы.

Предпочтительные типы саркомы включают фибросаркому, миксосаркому, лейомиосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, гастроинтестинальную стромальную опухоль, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, саркому Юинга, лейомиосаркому и рабдомиосаркому.

Согласно одному варианту осуществления, медикамент вводят пациенту до, одновременно или после введения одного или более других лекарственных средств, где одно или более другие лекарственные средства предпочтительно выбраны из группы, состоящей из ингибиторов PD-1; ингибиторов PD-L1; ингибиторов CTLA-4; противораковых вакцин, таких как вакцины против опухолевых клеток, антигенные вакцины, дендритноклеточных вакцин, вакцин на основе вектора; агониста Toll-подобного рецептора (TLR), включая агонисты, нацеленные на TLR2, TLR3, TLR2/4, TLR4, TLR5, TLR7/8 и TLR9; и агентов, которые агонизируют рецепторы, активирующие иммунную систему, такие как 41BB (CD137), OX40, ICOS, CD40, CD28, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, LFA1, CD16, CD64, CD32A и CD3. Такое введение медикамента с одним или более другими лекарственными средствами может быть либо единичным, либо может повторяться несколько раз. Согласно одному варианту осуществления, медикамент вводят пациенту до, одновременно или после введения одного или более других лекарственных средств, где одно или более другие лекарственныесредства предпочтительно выбраны из группы, состоящей из ингибиторов PD-1; ингибиторов PD-L1; ингибиторов CTLA-4; противораковых вакцин, таких как вакцины против опухолевых клеток, антигенные вакцины, дендритноклеточных вакцин, вакцин на основе вектора; и агониста Toll-подобного рецептора (TLR), включая агонисты, нацеленные на TLR2, TLR3, TLR2/4, TLR4, TLR5, TLR7/8 и TLR9. Такое введение медикамента с одним или более другими лекарственными средствами может быть либо единичным, либо может повторяться несколько раз.

Согласно одному варианту осуществления ингибитор PD-1 представляет собой пембролизумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор PD-1 представляет собой ниволумаб.

Согласно одному варианту осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой атезолизумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой авелумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

Согласно одному варианту осуществления ингибитор CTLA-4 представляет собой ипилимумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор CTLA-4 представляет собой тремелимумаб.

Согласно другому варианту осуществления медикамент вводится до, одновременно или после CAR-T терапии. Такое введение медикамента в комбинации с CAR-T терапией может быть либо единичным, либо может повторяться множество раз.

Предпочтительно, медикамент вводится пациенту-млекопитающему, предпочтительно пациенту-человеку.

Другим аспектом настоящего изобретения является способ лечения, контроля, задерживания или профилактики у пациента-млекопитающего, предпочтительно у пациента-человека, нуждающегося в лечении, одного или более заболеваний, которые можно лечить посредством IL-2, включающий стадию введения указанному пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества конъюгата IL-2 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению.

Предпочтительно, одним или более заболеваниями, которые можно лечить посредством IL-2, является рак. Даже более предпочтительно указанное заболевание выбрано из группы, состоящей из саркомы, хордомы, рака толстой кишки, ректального рака, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, плоскоклеточного рака, базально-клеточного рака, аденокарциномы, рака потовой железы, рака сальной железы, папиллярного рака, папиллярной аденокарциномы, цистаденокарциномы, медуллярного рака, рака бронхов, почечно-клеточного рака, гепатомы, рака желчных протоков, хориокарциномы, семиномы, эмбриональногой рака, опухоли Вильмса, рака шейки матки, тестикулярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака уротелия, эпителиального рака, глиомы, астроцитомы, медуллобластомы, краниофарингиомы, эпендимомы, пинеаломы, гемангиобластомы, нейромы слухового нерва, олигодендроглиомы, менингиомы, меланомы, нейробластомы, ретинобластомы, неходжкинской лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, острой миелоидной лейкемии и лейкоза. Даже более предпочтительно, заболевание выбрано из группы, состоящей из немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, меланомы, почечно-клеточной карциномы, рака уротелия, рака молочной железы, колоректального ракы, ракы желудочно-кишечного тракта и саркомы.

Предпочтительные типы саркомы включают фибросаркому, миксосаркому, лейомиосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеогенную саркому, ангиосаркому, эндотелиосаркому, гастроинтестинальную стромальную опухоль, лимфангиосаркому, лимфангиоэндотелиосаркому, синовиому, мезотелиому, саркому Юинга, лейомиосаркому и рабдомиосаркому.

Согласно одному варианту осуществления конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль или фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, вводится до, одновременно или после введения одного или более других лекарственных средств, где одно или более другие лекарственныесредства предпочтительно выбраны из группы, состоящей из ингибиторов PD-1; ингибиторов PD-L1; ингибиторов CTLA-4; противораковых вакцин, таких как вакцины против опухолевых клеток, антигенные вакцины, дендритноклеточных вакцин, вакцин на основе вектора; агониста Toll-подобного рецептора (TLR), включая агонисты, нацеленные на TLR2, TLR3, TLR2/4, TLR4, TLR5, TLR7/8 и TLR9; и агентов, которые агонизируют рецепторы, активирующие иммунную систему, такие как 41BB (CD137), OX40, ICOS, CD40, CD28, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, LFA1, CD16, CD64, CD32A и CD3. Такое введение конъюгата IL-2 или его фармацевтиченски приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, с одним или более другими лекарственными средствами может быть либо единичным, либо может повторяться множество раз. Согласно одному варианту осуществления конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль или фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, вводится до, одновременно или после введения одного или более других лекарственных средств, где одно или более другие лекарственныесредства предпочтительно выбраны из группы, состоящей из ингибиторов PD-1; ингибиторов PD-L1; ингибиторов CTLA-4; противораковых вакцин, таких как вакцины против опухолевых клеток, антигенные вакцины, дендритноклеточных вакцин, вакцин на основе вектора; и агониста Toll-подобного рецептора (TLR), включая агонисты, нацеленные на TLR2, TLR3, TLR2/4, TLR4, TLR5, TLR7/8 и TLR9. Такое введение конъюгата IL-2 или его фармацевтиченски приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, с одним или более другими лекарственными средствами может быть либо единичным, либо может повторяться множество раз.

Согласно одному варианту осуществления ингибитор PD-1 представляет собой пембролизумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор PD-1 представляет собой ниволумаб.

Согласно одному варианту осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой атезолизумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой авелумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор PD-L1 представляет собой дурвалумаб.

Согласно одному варианту осуществления ингибитор CTLA-4 представляет собой ипилимумаб. Согласно другому варианту осуществления ингибитор CTLA-4 представляет собой тремелимумаб.

Согласно другому варианту осуществления конъюгат IL-2 или его фармацевтиченски приемлемая соль или фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению вводится до, одновременно или после CAR-T терапии. Такое введение конъюгата IL-2 или его фармацевтиченски приемлемой соли или фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере один конъюгат IL-2 согласно настоящему изобретению, в комбинации с CAR-T терапией может быть либо единичным, либо может повторяться множество раз.

Дополнительным аспектом настоящего изобретения является способ введения конъюгата IL-2, его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, где способ включает стадию введения конъюгата IL-2, его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению посредством местного, энтерального или парентерального введения и методами наружного применения, инъекции или инфузии, включая внутрисуставное, околосуставное, внутрикожное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, внутрикостное, внутрибрюшинное, интратекальное, внутрикапсулярное, внутриглазнное, интравитреальное, интратимпанальное, внутрипузырное, внутристрахеальное, чрезскожное, субкутикулярное, субкапсулярное, субарахноидальное, интраспинальное, внутрижелудочковое введение, внутригрудинную инъекцию и инфузию, прямую доставку в мозг через имплантированное устройство, позволяющее доставить изобретение или тому подобное в ткань мозга или мозговые жидкости (например, резервуар Оммайя), прямую интрацеребровентрикулярную инъекцию или инфузию, инъекцию или инфузию в мозг или связанные с мозгом области, инъекцию в субхориоидальное пространство, ретроорбитальную инъекцию и окулярную инстилляцию, предпочтительно посредством подкожной инъекции.

Согласно одному варианту осуществления, настоящее изобретение относится к конъюгату IL-2 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, для применения для лечения одного или более заболеваний, которые можно лечить посредством IL-2 через подкожную инъекцию. Согласно другому варианту осуществления, настоящее изобретение относится к конъюгату IL-2 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции согласно настоящему изобретению, для применения для лечения одного или более заболеваний, которые можно лечить посредством IL-2 через подкожную инъекцию.

Материалы

0.7 кДа ПЭГ малеимид (MeO-dПЭГ(12)-mal, малеимидил-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаокса гептратриаконтан-37-ил)пропанамид, CAS 724722-89-8) приобретен у Iris Biotech GmbH, Marktredwitz, Germany. 2 кДа ПЭГ-малеимид (Sunbright ME-020-MA, CAS 883993-35-9), 5 кДа ПЭГ-малеимид (Sunbright ME-050MA, CAS 883993-35-9), 10 кДа ПЭГ-малеимид (Sunbright ME-100MA, CAS 883993-35-9) и 20 кДа ПЭГ-малеимид (Sunbright ME-200MA0B, CAS 883993-35-9) приобретены у NOF Europe N.V., Grobbendonk, Belgium.

10 кДа ПЭГ амин (Sunbright ME-100EA, CAS 80506-64-5) может быть приобретен у NOF Europe N.V., Grobbendonk, Belgium.

Рекомбинантный человеческий IL-2 (Альдеслейкин, № по каталогу AF-200-02) приобретали у Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA.

Микробную трансглутаминазу (№ по каталогу T001) и MTG ингибитор (№ по каталогу C102) приобретали у Zedira GmbH, Darmstadt, Germany.

10 кДа Mal-ПЭГ-NH₂ (№ по каталогу PHB-943) может быть приобретен, например, у Creative ПЭГWorks, Chapell Hill, NC, USA.

Способы

Пример 1. Получение вариантов IL-2

IL-2 варианты (мутеины) были изготовлены по индивидуальному заказу и получены от внешнего поставщика, где экспрессию белков проводили из E. coli с соблюдением стандартных стратегий очистки, известных специалисту в данной области техники. Были приготовлены следующие белки

1a -SEQ ID NO: 3: PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTCMLT FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT

1b -SEQ ID NO: 4: PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT CKFYMPKKAT ELKHLQCLEE ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT

1c -SEQ ID NO: 5: PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFCMPKKAT ELKHLQCLEE ELKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT

1d -SEQ ID NO: 6: PTSSSTKKTQ LQLEHLLLDL QMILNGINNY KNPKLTRMLT FKFYMPKKAT ELKHLQCLEE CLKPLEEVLN LAQSKNFHLR PRDLISNINV IVLELKGSET TFMCEYADET ATIVEFLNRW ITFSQSIIST LT

Пример 2. Получение конъюгата 0.7 кДа ПЭГ-IL-2 мутеина 2

Около 2 мл IL-2 мутеина 1a при 0.2 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, концентрировали посредством центрифужных фильтров до конечного объема 0.47 мл при концентрации 0.85 мг/мл, как определено посредством УФ (A280). Конъюгирование проводили при около pH 7.5 следующим образом. 0.385 мг 1a (0.455 мл при 0.85 мг/мл) в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, смешивали с 0.36 об. экв. (164 мкл) 0.5 M фосфата натрия, pH 8, 16 мкл 37 мМ уксусной кислоты, 132 мМ фосфата натрия, pH 7, и 3 мол. экв. (5 мкл) 15.1 мМ малеимидил-N-(2,5,8,11,14,17,20,23,26,29,32,35-додекаоксагептатриаконтан-37-ил)пропанамида в воде. Раствор бережно встряхивали и оставляли отстаиваться на 15 мин при температуре окружающей среды. Количественное превращение 1a в соответствующий моноконъюгат было подтверждено посредством MS. Конъюгат выделяли из реакционной смеси посредством эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) с применением GE Healthcare Superdex 200 Increase 10/300 GL (24 мл по объему) колонки, соединенной с системой Äkta с 10 мМ HEPES, 150 мМ хлорида натрия, 0.05 % Tween 20, pH 7.4, в качестве подвижной фазы и скоростью потока 0.75 мл/мин. Одну фракцию, преимущественно содержащую конъюгат, концентрировали с применением центрифужного фильтра с получением 2 в виде 0.45 мл раствора белка с содержанием белка 0.22 мг/мл и приблизительной чистоте 79 %, как определено посредством SEC.

Пример 3. Получение конъюгата 2 кДа ПЭГ-IL-2 мутеина 3

Около 2 мл мутеина IL-2 1a при 0.2 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, концентрировали посредством центрифужных фильтров до конечного объема 0.34 мл при концентрации 1.16 мг/мл, как определено посредством A280. Конъюгирование проводили при около pH 7 следующим образом. 0.38 мг 1a (0.33 мл при 1.16 мг/мл) в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, смешивали с 0.36 об. экв. (118 мкл) 0.5 M фосфата натрия, pH 8, и 20 мол. экв. (20 мкл) 24.8 мМ 2 кДа ПЭГ-Mal в воде. Раствор аккуратно встряхивали и инкубировали в течение 15 мин при температуре окружающей среды. 0.82 мл суспензии функционализированного тиолом гидрогеля, как описано в WO2014056923, пример 29, стр 159, с содержанием гидрогегля 21.8 мг/мл и содержанием тиола 3 мкмол/мл (соответствует 5 мол. экв. Тиола относительно 2 кДа ПЭГ малеимида) переносили в 2 мл PP реактор, оборудованный PE фритой. Реакционную смесь переносили в реакционный сосуд и инкубировали в течение 30 мин при температуре окружающей среды при бережном встряхивании с обеспечением связывания избытка ПЭГ-малеимида с гидрогелем. Раствор, содержащий белок, удаляли, и белковый конъюгат выделяли с помощью эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) из смеси для конъюгирования с применением GE Healthcare Superdex 75 Increase 10/300 GL (24 мл по объему) колонки, соединенной с системой Äkta, с 10 мМ HEPES, 150 мМ хлорида натрия, 0.05 % Tween 20, pH 7.4, в качестве подвижной фазы при скорости потока 0.75 мл/мин. Фракцию, содержащую конъюгат, собирали с применением центрифужных фильтров с получением 0.37 мл 2 кДа ПЭГ IL-2 мутеин конъюгата 3 при концентрации белка 0.27 мг/мл с чистотой 78% согласно SEC.

Пример 4. Получение конъюгата 5 кДа ПЭГ-IL-2 мутеина 4

Около 2 мл IL-2 мутеина 1a при 0.2 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, концентрировали посредством центрифужных фильтров с получением конечного объема 0.36 мл при концентрации 1.01 мг/мл, как определено посредством A280. Конъюгирование проводили при около pH 7.5 следующим образом. 0.35 мг белка (0.35 мл при 1.01 мг/мл) в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, смешивали с 0.36 об. экв. (125 мкл) 0.5 M фосфата натрия, pH 8, и 3 мол. экв. (9.8 мкл, скорректировано по активности) 7.49 мМ 5 кДа ПЭГ-малеимида в воде. Раствор аккуратно встряхивали и инкубировали в течение 15 мин при температуре окружающей среды. Для гашения избытка ПЭГ-малеимида, 6 мол. экв. относительно 1a (10 мкл) 13.8 мМ L-цистеина в воде добавляли к смеси для конъюгирования. Раствор аккуратно встряхивали и инкубировали в течение 2.5 ч при температуре окружающей среды. Конъюгат выделяли посредством эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) из смеси для конъюгирования с применением GE Healthcare Superdex 75 Increase 10/300 GL (24 мл по объему) колонки, соединенной с системой Äkta, с 10 мМ HEPES, 150 мм хлорида натрия, 0.05 % Tween 20, pH 7.4, в качестве подвижной фазы и скоростью потока 0.75 мл/мин. Фракции, преимущественно содержащие конъюгат, объединяли и концентрировали с применением центрифужных фильтров с получением 0.42 мл 5 кДа ПЭГ IL-2 мутеин конъюгата 4 с концентрацией белка 0.30 мг/мл. Анализ выделенного конъюгата проводили посредством SEC и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Количественное удаление примесей не может быть достигнуто на стадии очистки, как показано посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ. Приблизительная чистота конъюгата 4 была определена как 68 % согласно анализу SEC при 215 нм.

Пример 5. Получение конъюгата 10 кДа ПЭГ-IL-2 мутеина 5

Около 2 мл IL-2 мутеина 1a при 0.2 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, концентрировали посредством центрифужных фильтров с получением конечного объема 0.35 мл при концентрации 1.03 мг/мл, как определено посредством A280. Конъюгирование проводили при около pH 7.5 следующим образом. 0.34 мг белка (0.33 мл при 1.03 мг/мл) в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, смешивали с 0.36 об. экв. (120 мкл) 0.5 M фосфата натрия, pH 8, и 3 мол. экв. (5 мкл) 13.54 мМ 10 кДа ПЭГ-малеимида в воде. Раствор аккуратно встряхивали и инкубировали в течение 15 мин при температуре окружающей среды. Конъюгат выделяли посредством эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) из смеси для конъюгирования с применением GE Healthcare Superdex 200 Increase 10/300 GL (24 мл по объему) колонки, соединенной с системой Äkta с 10 мМ HEPES, 150 мМ хлорида натрия, 0.05 % Tween 20, pH 7.4, в качестве подвижной фазы и скоростью потока 0.75 мл/мин. Фракции, преимущественно содержащие конъюгат, объединяли и концентрировали с применением центрифужных фильтров с получением 0.55 мл 10 кДа ПЭГ IL-2 мутеин конъюгата 5 с концентрацией белка 0.22 мг/мл. Анализ выделенного конъюгата проводили посредством SEC и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Количественное удаление примесей не может быть достигнуто на стадии очистки. Приблизительная чистота конъюгата 5 была определена как 57 % согласно SEC анализу при 215 нм с избытком ПЭГ-Mal в качестве основной примеси.

Пример 6. Получение конъюгата 20 кДа ПЭГ-IL-2 мутеина 6

Около 2 мл IL-2 мутеина 1a при 0.2 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, концентрировали посредством центрифужных фильтров с получением конечного объема 0.33 мл при концентрации 1.11 мг/мл, как определено посредством A280. Конъюгирование проводили при около pH 7.5 следующим образом. 0.35 мг белка (0.32 мл при 1.11 мг/мл) в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, смешивали с 0.36 об. экв. (115 мкл) 0.5 M фосфата натрия, pH 8, 6 мкл 37 мМ уксусной кислоты, 132 мМ фосфата натрия, pH 7, и 3 мол. экв. (10 мкл) 6.96 мМ 20 кДа ПЭГ-малеимида в воде. Раствор аккуратно встряхивали и инкубировали в течение 15 мин при температуре окружающей среды. Конъюгат выделяли посредством эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) из смеси для конъюгирования с применением GE Healthcare Superdex 200 Increase 10/300 GL (24 мл по объему) колонки, соединенной с системой Äkta с 10 мМ HEPES, 150 мМ хлорида натрия, 0.05 % Tween 20, pH 7.4, в качестве подвижной фазы и скоростью потока 0.75 мл/мин. Фракции, преимущественно содержащие конъюгат, объединяли и концентрировали с применением центрифужных фильтров с получением 0.67 мл 20 кДа ПЭГ IL-2 мутеин конъюгата 6 с концентрацией белка 0.18 мг/мл. Анализ выделенного конъюгата проводили посредством SEC и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Количественное удаление примесей не может быть достигнуто на стадии очистки. Приблизительная чистота конъюгата 6 была определена как 44 % согласно анализу обращенно-фазовой ВЭЖХ при 215 нм с избытком ПЭГ-Mal в качестве основной примеси.

Пример 7. Получение конъюгата 5 кДа ПЭГ-IL-2 мутеина 7

1.1 мл мутеина IL-2 1c при 0.66 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3 смешивали с 0.15 об. экв. (165 мкл) 0.5 M фосфата натрия, pH 8, и 141 мкл 0.6 M гидроксиламингидрохлорида, 0.5 M фосфата натрия, pH 6.4. Полученную реакционную смесь инкубировали при 25°C всю ночь. Раствор концентрировали с применением центрифужных фильтров с получением конечного объема 0.67 мл при концентрации 0.99 мг/мл, как определено посредством A280. Конъюгирование проводили следующим образом. 0.65 мг белка (0.66 мл при 0.99 мг/мл) в 58 мМ фосфате натрия, около 57 мМ гидроксиламингидрохлориде, 39 мМ уксусной кислоте, pH 6.5, смешивали с 6 мол. экв. (320 мкл) 81 mM 5 кДа ПЭГ-малеимида в воде. Полученную реакционную смесь инкубировали при температуре окружающей среды в течение 2.25 часов. Затем буфер обменивали с применением центрифужного фильтра на 37 мМ уксусной кислоте, 132 мМ фосфата, pH 7, с получением конечного объема 0.75 мл. 1.5 мол. экв. (80 мкл) 81 мМ 5 кДа ПЭГ-малеимида в воде добавляли в реакционный раствор после добавления 3 мол. экв. (160 мкл) 81 mM 5 кДа ПЭГ-малеимида в воде через 3.5 часа. Полученную реакционную смесь инкубировали при температуре окружающей среды всю ночь. Конъюгат выделяли посредством эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) из смеси для конъюгирования с применением GE Healthcare Superdex 75 Increase 10/300 GL (24 мл по объему) колонки, соединенной с системой Äkta с 10 мМ HEPES, 150 мМ хлорида натрия, 0.05 % Tween 20, pH 7.4, в качестве подвижной фазы при скорости потока 0.75 мл/мин. Собранные фракции, содержащие конъюгат, концентрировали с применением центрифужных фильтров с получением 0.45 мл 5 кДа ПЭГ IL-2 мутеина 7 при 0.25 мг/мл. Анализ выделенного конъюгата проводили посредством SEC и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Удаление примесей не может быть достигнуто количественно на стадии очистки, что приводит к их присутствию в образце конъюгата, с получением приблизительной чистоты конъюгата 7 60% согласно SEC.

Пример 8. Получение конъюгата 10 кДа ПЭГ-IL-2 мутеина 8

1.1 мл мутеина IL-2 1c при 0.66 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3, смешивали с 0.15 об. экв. (165 мкл) 0.5 M фосфата натрия, pH 8 и 141 мкл 0.5 M гидроксиламингидрохлорида, 0.05 M фосфата натрия, pH 7. Полученную реакционную смесь инкубировали при 25°C всю ночь. Раствор концентрировали с применением центрифужных фильтров с получением конечного объема 0.48 мл при концентрации 1.42 мг/мл, как определено посредством A280. Конъюгирование проводили следующим образом. 0.678 мг белка (0.48 мл при 1.42 мг/мл) в 64 мМ фосфате натрия, 50 мМ гидроксиламингидрохлориде, 39 мМ уксусной кислоте, pH 6.5-7.0, смешивали с 3 мол. экв. (18 мкл) 7.42 мМ 10 кДа ПЭГ10-малеимида в воде. Полученную реакционную смесь аккуратно встряхивали и инкубировали в течение 15 мин при температуре окружающей среды. Еще 3 мол. экв. (17.9 мкл) 7.42 мМ ПЭГ-малеимида в воде добавляли к смеси для конъюгирования после инкубации в течение 15 мин при температуре окружающей среды. Конъюгат выделяли посредством эксклюзионной хроматографии по размеру (SEC) из смеси для конъюгирования с применением GE Healthcare Superdex 200 Increase 10/300 GL (24 мл по объему) колонки, соединенной с системой Äkta с 10 мМ HEPES, 150 мМ хлоридом натрия, 0.05 % Tween 20, pH 7.4, в качестве подвижной фазы и скоростью потока 0.75 мл/мин. Собранные фракции анализировали посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ, и фракции, содержащие конъюгат, объединяли и концентрировали с применением центрифужных фильтров с получением 0.57 мл 10 кДа ПЭГ IL-2 мутеина 8 при 0.50 мг/мл. Анализ выделенного конъюгата проводили посредством SEC и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Удаление примесей из исходного материала не может быть достигнуто количественно на стадии очистки, что приводит к их присутствию в образце конъюгата, как показано посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ. Приблизительная чистота конъюгата 8 была определена как 25 % посредством обращенно-фазовой ВЭЖХ при 280 нм, с избытком ПЭГ-Mal в качестве основной примеси.

Пример 9. SPR анализ конъюгатов ПЭГ IL-2 мутеинов

Кинетику связывания альдеслейкина и несимметричных соединений IL-2 оценивали с помощью спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе Biacore (T200, GE Healthcare) с иммобилизованными внеклеточными доменами субъединиц рецептора IL-2. Вкратце, биосенсорные чипы карбоксиметилированного декстрана (CM5, GE Healthcare) активировали N-(3-диметиламинопропил)-N'-этилкарбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Иммобилизацию моноклонального мышиного антитела против человеческого IgG (Fc) также проводили в соответствии с инструкциями поставщика (GE Healthcare, номер заказа BR-1008-39).

Для определения кинетики связывания с IL-2Rα применяли следующее получение чипа: альфа-субъединицу рецептора человеческого IL-2, Fc-Tag (Symansis, New Zealand) разводили в HBS-EP подвижном буфере (GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0.05% Поверхностно-активное вещество P20, pH 7.4) до около 0.67 мкг/мл и иммобилизировали при скорости потока 10 мкл/мин в течение 60 секунд с достижением 80 - 100 единиц ответа (RU).

Для определения кинетики связывания с IL-2Rβ применяли следующее получение чипа: бета-субъединицу рецептора человеческого, Fc-Tag (Symansis, New Zealand) разводили в HBS-EP подвижном буфере (GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0.05% Поверхностно-активное вещество P20, pH 7.4) до около 0.80 мкг/мл и иммобилизировали при скорости потока 10 мкл/мин в течение 60 секунд с получением 140 - 180 единиц ответа (RU).

Для определения кинетики связывания с комплексом IL-2Rαβ применяли следующее получение чипа: альфа-субъединицу рецептора человеческого, Fc-Tag (Symansis, New Zealand) и бета-субъединицу рецептора человеческого, Fc-Tag (Symansis, New Zealand) смешивали и разводили в HBS-EP подвижном буфере (GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0.05% Поверхностно-активное вещество P20, pH 7.4) до около 1.33 мкг/мл каждый и иммобилизировали при скорости потока 10 мкл/мин в течение 60 секунд с достижением 360 - 440 единиц ответа (RU).

Для кинетических измерений на всех трех наборах субъединиц рецептора альдеслейкин или несимметричные соединения IL-2 были проанализированы в многоцикловой кинетике и, следовательно, вводились по меньшей мере в пяти различных концентрациях в HBS-EP подвижном буфере при 25°C (скорость потока 30 мкл/мин, время контакта 120 с, время диссоциации 600 с). Данные с двойными ссылками (вычтенные данные из эталонной проточной кюветы и образцов, содержащих только буфер), по возможности анализировали либо кинетически с помощью модели связывания 1: 1, либо с помощью анализа в стационарном состоянии (Biacore T200 Evaluation Software, версия 3.1) для определения K_D и по возможности ka и kd. Регенерацию после каждого цикла проводили 3 M MgCl₂ в течение 30 с при скорости потока 30 мкл/мин.

Полученные данные приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Обобщение данных по связыванию SPR с субъединицами рецептора IL-2. Соединение K_D к IL-2Rα [нМ] K_D к IL-2Rβ [нМ] K_D к IL-2Rαβ [нМ] K_D-Соотношение (αβ/β) Альдеслейкин 5.65 287 0.141 4.91E-4 6 > 1500 1950 > 100 > 0.05 5 > 1000 1640 > 100 > 0.06 4 > 1500 1410 > 100 > 0.07 3 614 589 > 100 > 0.17 8 > 2000 > 2000 > 100 - 7 1580 1550 > 100 > 0.07

Пример 10. Вычисление соотношения смещения

В контексте настоящего изобретения термин “несимметричный IL-2” относится к модифицированному IL-2, в котором соотношение K_D указанного несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ и K_D указанного несимметричного IL-2 к IL-2Rβ выше соотношения K_D альдеслейкина к IL-2Rαβ и K_D альдеслейкина к IL-2Rβ. Это описывается следующими формулами:

где

где

“K_D несимметричного IL_2 к IL-2Rαβ” представляет собой K_D несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ,

“K_D несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ” представляет собой K_D несимметричного IL-2 к IL-2Rβ,

“K_D альдеслейкина к IL-2Rαβ” представляет собой K_D альдеслейкина к IL-2Rαβ, и

“K_D альдеслейкина к IL-2Rβ” представляет собой K_D альдеслейкина к IL-2Rβ.

Применяя вышеуказанные формулы следующие соотношения были вычислены и приведены в Таблице 2.

Таблица 2: Соотношение несимметричного IL-2 к Соотношение альдеслейкин для различных конъюгатов мутеина IL-2. Соединение Соотношение_{несимметричный IL-2} / Соотношение_{альдеслейкин} 6 >100 5 >120 4 >140 3 >340 8 n.d. 7 >140

Пример 11. Получение 10 кДа ПЭГ-Конъюгат IL-2 9

Рекомбинантный человеческий IL-2 подвергали замене буфера на 0,2 М Трис/HCl, pH 7,5, с использованием колонок HiTrap Desalting, соединенных с системой Äkta. После этого IL-2 ферментативно ПЭГилировали с использованием микробной трансглутаминазы (MTG) на основе методики, описанной в Sato et al., Bioconjugate Chem 2001, 12 (5), 701-710. IL-2 при концентрации 5 мкМ инкубировали в присутствии 10 кДа ПЭГ амина (10 кДа метокси-ПЭГ-(CH2)2-NH2) при концентрации 1,25 мМ и MTG при концентрации 0,2 единиц/мл. в 0,2 М Трис/HCl, pH 7,5, при 25°C в течение 12 часов. 10 кДа ПЭГ конъюгат IL-2 (9) очищали из реакционной смеси методом эксклюзионной хроматографии по размеру с использованием колонки GE Healthcare Superdex 200 Increase 10/300 GL, соединенной с системой Äkta с 10 мМ HEPES, 150 мМ хлорида натрия, 0,05% Твин 20, pH 7,4, в качестве подвижной фазы и скоростью потока 0,75 мл/мин.

Пример 12. Получение 10 кДа ПЭГ-IL-2 конъюгата 10

Рекомбинантный человеческий IL-2 (2.7 мг/мл в 50 мМ уксусной кислоте, pH 3.0) смешивали с одним объемным эквивалентом 140 мМ HEPES, 300 мМ NaCl, 6 мМ натрия EDTA, 0.1 % Tween 20, pH 8.2, с получением 1.35 мг/мл IL-2 в 70 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ натрия EDTA, 0.05 % Tween 20, 25 мМ AcOH, pH 7.4. IL-2 ферментативно ПЭГилировали с использованием микробной трансглутаминазы (MTG). Для этого IL-2 при концентрации 0.1 мг/мл инкубировали в 70 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ натрия EDTA, 0.05% Tween 20, 25 мМ AcOH, pH 7.4 в присутствии 1 мМ 10 кДа ПЭГ амина (10 кДа метокси-ПЭГ-(CH₂)₂-NH₂) и 1 ед./мл MTG при 37°C в течение 4 h. После этого добавляли ингибитор MTG до конечной концентрации 0.5 мМ, и реакционную смесь инкубировали в течение еще 30 мин. 10 кДа ПЭГ Конъюгат IL-2 (10) очищали из реакционной смеси методом эксклюзионной хроматографии по размеру с использованием колонки GE Healthcare Superdex 200 Increase 10/300 GL, соединенной с системой Äkta с 10 мМ HEPES, 150 мМ хлорида натрия, 0,05% Твин 20, pH 7,4, в качестве подвижной фазы и скоростью потока 0,75 мл/мин.

Пример 13. Получение несимметричный полимерного пролекарства IL-2 мутеина 11

ПЭГ IL-2 мутеин подвергали обмену буфера на 100 мМ борат натрия, pH 9, и концентрировали до концентрации около 2.5 мг/мл IL-2 экв. Пятикратный молярный избыток 40 кДа mПЭГ-линкер реагента (как описано в WO 2016079114, пример 2) относительно количества IL-2 мутеина растворяли в равном объеме воды по сравнению с раствором белка, применяемым для реакции конъюгирования. Раствор белка (2.5 мг/мл IL-2 экв.) и раствор 40 кДа mПЭГ-линкер (32 г/л) смешивали и инкубировали в течение 2 часов при 14-16°C. Полимерное пролекарство на основе несимметричного IL-2 мутеина11 выделяли посредством CIEX и анализировали посредством SEC.

Пример 14. Получение нового конъюгата 12

40 кДа mПЭГлинкер реагент (как описано в WO 2016079114, пример 2) растворяли в воде с получением 32 г/л раствора. 10 кДа Mal-ПЭГ-NH₂ растворяли в 0.1 M фосфате натрия, 6 мМ натрия EDTA, pH 7.4, до конечной концентрации 1 мМ. Оба раствора смешивали при соотношении объемов 1 к 1 и инкубировали в течение 2 ч при температуре окружающей среды. Затем 0.5 об. эквивалентов (по отношению к объему реакционной смеси40 кДа mПЭГ-линкер реагента и 10 кДа Mal-ПЭГ-NH₂) раствора IL-2 мутеин 1a при концентрации 2 мг/мл в 50 мМ фосфате натрия, 3 мМ натрия EDTA, pH 7.4, добавляли к реакционной смеси и инкубировали в течение 1 часа при температуре окружающей среды. 40+10 кДа ПЭГ IL-2 мутеин конъюгат 12 выделяли из реакционной смеси посредством катион-обменной хроматографии и анализировали посредством экслюзионной хроматографии по размеру.

Аббревиатуры

A280 Поглощение при длине волны 280 нм AcOH Уксусная кислота CIEX Катионный обмен E.coli Escherichia coli EDC N-(3-диметиламинопропил)-N′-этилкарбодиимид гидрохлорид EDTA этилендиаминтетрауксусная кислота экв. эквиваленты HBS-EP 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0.05% Поверхностно-активное вещество P20, pH 7.4 HEPES 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота IL-2 Интерлейкин-2 IL-2R Рецептор интерлейкина-2 Mal малеимид мол.экв. Молекулярные эквиваленты mПЭГ метокси ПЭГ MS Масс-спектрометрия MTG Микробная трансглутаминаза NaCl Хлорид натрия NHS N-гидроксисукцинимид ПЭГ поли(этиленгликоль) PTFE Политетрафторэтилен PyBOP Бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфония гексафторфосфат Обращенно-фазовая ВЭЖХ Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография SEC Эксклюзионная хроматография по размеру SPR Поверхностный плазмонный резонанс Tween 20 Полиэтиленгликоль сорбитан монолаурат

--->

Перечень последовательностей

<110> Ascendis Pharma A/S

<120> Конъюгаты IL-2

<130> CPX71637PC

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 133

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 2

<211> 132

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> альдеслейкин

<400> 2

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu

1 5 10 15

Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn

20 25 30

Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro

50 55 60

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg

65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

100 105 110

Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Thr

130

<210> 3

<211> 132

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> альдеслейкин мутеин

<400> 3

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu

1 5 10 15

Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn

20 25 30

Pro Lys Leu Thr Cys Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro

50 55 60

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg

65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

100 105 110

Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Thr

130

<210> 4

<211> 132

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> альдеслейкин мутеин

<400> 4

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu

1 5 10 15

Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn

20 25 30

Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Cys Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro

50 55 60

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg

65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

100 105 110

Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Thr

130

<210> 5

<211> 132

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> альдеслейкин мутеин

<400> 5

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu

1 5 10 15

Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn

20 25 30

Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Cys Met Pro Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys Pro

50 55 60

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg

65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

100 105 110

Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Thr

130

<210> 6

<211> 132

<212> PRT

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> альдеслейкин мутеин

<400> 6

Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His Leu

1 5 10 15

Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys Asn

20 25 30

Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys

35 40 45

Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Cys Leu Lys Pro

50 55 60

Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu Arg

65 70 75 80

Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu Lys

85 90 95

Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala Thr

100 105 110

Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ser Gln Ser Ile Ile

115 120 125

Ser Thr Leu Thr

130

<---

Изобретение относится к конъюгатам IL-2 или их фармацевтически приемлемым солям, фармацевтическим композициям, содержащим такой конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемую соль, и их применениям. 4 н. и 12 з.п. ф-лы, 2 табл., 14 пр.

1. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль формулы (Ia)

где

-D представляет собой несимметричный фрагмент IL-2, где несимметричный фрагмент IL-2 содержит фрагмент IL-2, и где для несимметричного фрагмента IL-2 соотношение равновесной константы диссоциации (K_D) указанного несимметричного IL-2 к IL-2Rαβ и K_D указанного несимметричного IL-2 к IL-2Rβ больше соотношения K_D альдеслейкина к IL-2Rαβ и K_D альдеслейкина к IL-2Rβ; где фрагмент IL-2 представляет собой последовательность SEQ ID NO: 2, которая содержит одну или две аминокислотные мутации в последовательности, одна из которых представляет собой R37C мутацию, и дополнительно -D содержит фрагмент M_mod, конъюгированный с атомом серы цистеина, замещающим аргинин в положении R37C;

где M_mod имеет формулу (А-1а)

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому серы цистеина;

b1 представляет собой целое число в интервале от 1 до 4;

b2 представляет собой целое число в интервале от 1 до 4; и

b3 представляет собой целое число, такое что молекулярная масса M_mod составляет 5 кДа ± 25%;

-L¹-имеет формулу (IX-c)

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к атому азота в -D; непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -L²-Z; и

s1 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4 и 5;

-L²-имеет формулу (IX-e)

где

пунктирная линия, помеченная звездочкой, указывает присоединение к -L¹-;

непомеченная пунктирная линия указывает присоединение к -Z; и

s2 представляет собой целое число, выбранное из группы, состоящей из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 и 8;

-Z содержит фрагмент формулы (А-с):

где

р1, р2, р3, р4 независимо друг от друга представляют собой целое число в интервале от 185 до 450; и

х представляет собой 1.

2. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где b1 формулы (А-1а) представляет собой 2.

3. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где b2 формулы (А-1а) представляет собой 2.

4. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где b2 формулы (А-1а) представляет собой 3.

5. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где b3 формулы (А-1а) представляет собой около 112.

6. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где s1 формулы (IX-C) представляет собой 3.

7. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где s2 формулы (IX-C) представляет собой 3.

8. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где р1, р2, р3 и р4 находятся в интервале от 220 до 240.

9. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где -L¹-присоединен к аминокислотному остатку фрагмента IL-2.

10. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где -L1-присоединен к аминокислотному остатку фрагмента IL-2, выбранному из группы, состоящей из цистеина, метионина, гистидина, лизина, триптофана, серина, треонина, тирозина, аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутамина и аргинина.

11. Конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемая соль по п. 1, где -L1 -присоединен к лизиновому остатку, выбранному из группы, состоящей из K7, K8, K31, K34, K42, K47, K48, K53, K63, K75 и K96, согласно SEQ ID NO: 2.

12. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания, которое можно лечить посредством IL-2, содержащая по меньшей мере один конъюгат IL-2 или его фармацевтически приемлемую соль по п. 1 в эффективном количестве и по меньшей мере один эксципиент.

13. Применение конъюгата IL-2 или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 12 для лечения заболевания, которое можно лечить посредством IL-2.

14. Применение по п. 13, где заболевание, которое можно лечить посредством IL-2, выбрано из группы, состоящей из саркомы, хордомы, рака толстой кишки, ректального рака, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, плоскоклеточного рака, базально-клеточного рака, аденокарциномы, рака потовой железы, рака сальной железы, папиллярного рака, папиллярной аденокарциномы, цистаденокарциномы, медуллярного рака, рака бронхов, почечно-клеточного рака, гепатомы, рака желчных протоков, хориокарциномы, семиномы, эмбрионального рака, опухоли Вильмса, рака шейки матки, тестикулярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака уротелия, эпителиального рака, глиомы, астроцитомы, медуллобластомы, краниофарингиомы, эпендимомы, пинеаломы, гемангиобластомы, нейромы слухового нерва, олигодендроглиомы, менингиомы, меланомы, нейробластомы, ретинобластомы, неходжкинской лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, острой миелоидной лейкемии и лейкоза.

15. Применение конъюгата IL-2 или его фармацевтически приемлемой соли по п. 1 или фармацевтической композиции по п. 12 в способе лечения, контроля, задерживания или профилактики у пациента-млекопитающего, предпочтительно у пациента-человека, нуждающегося в лечении, одного или более заболеваний, которые можно лечить посредством IL-2, включающего стадию введения указанному пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества конъюгата IL-2 или его фармацевтически приемлемой соли или фармацевтической композиции.

16. Применение по п. 15, где заболевание выбрано из группы, состоящей из саркомы, хордомы, рака толстой кишки, ректального рака, колоректального рака, рака поджелудочной железы, рака молочной железы, рака яичников, рака предстательной железы, плоскоклеточного рака, базально-клеточного рака, аденокарциномы, рака потовой железы, рака сальной железы, папиллярного рака, папиллярной аденокарциномы, цистаденокарциномы, медуллярного рака, рака бронхов, почечно-клеточного рака, гепатомы, рака желчных протоков, хориокарциномы, семиномы, эмбрионального рака, опухоли Вильмса, рака шейки матки, тестикулярного рака, рака желудочно-кишечного тракта, немелкоклеточного рака легкого, мелкоклеточного рака легкого, рака мочевого пузыря, почечно-клеточной карциномы, рака уротелия, эпителиального рака, глиомы, астроцитомы, медуллобластомы, краниофарингиомы, эпендимомы, пинеаломы, гемангиобластомы, нейромы слухового нерва, олигодендроглиомы, менингиомы, меланомы, нейробластомы, ретинобластомы, неходжкинской лимфомы, кожной Т-клеточной лимфомы, острой миелоидной лейкемии и лейкоза.