Способ генотипирования полиморфного локуса rs2277947 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме "реального времени" с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Область техники, к которой относится изобретение. Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, в частности к оценке однонуклеотидного полиморфизма rs2277947 (G>A) гена C19orf53 молекулярно-генетическим методом исследования.

Уровень техники. Ген C19orf53 (Gene ID: 28974; расположен на хромосоме 19p13.13) подлежит активному изучению в аспекте его связи с мультифакторными заболеваниями человека. Фактором повышенного внимания исследователей к данному гену являются его шапероноподобные свойства, открытые в 2020 г. японскими учеными [Tsuboyama K. et al. A widespread family of heat-resistant obscure (Hero) proteins protect against protein instability and aggregation //PLoS Biology. – 2020. – Vol. 18. – №. 3. – P. e3000632]. Для анализа ассоциаций функционально значимых полиморфных вариантов гена C19orf53 с заболеваниями человека требуется разработка эффективных и недорогих методов генотипирования. Однонуклеотидный полиморфизм rs2277947, позиция chr19:13778554 (GRCh38.p14) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/rs2277947) локализован в 3′-нетранслируемой области гена и характеризуется заменой G>A,С. Однако, аллель C встречается с частотой <0.0000001 в европейских популяциях и также характеризуется низкой частотой в других популяциях мира, в связи с чем именно замена G>A является актуальной для исследований многофакторных болезней человека. SNP rs2277947 (G>A) Данный генетический вариант характеризуется высоким регуляторным потенциалом. Согласно биоинформатическому ресурсу GTEx Portal, rs2277947 влияет на экспрессию гена C19orf53 и MRI1 в артериях, сердце, тканях головного мозга, жировой ткани, поджелудочной железе, что побуждает к исследованиям данного генетического варианта в аспекте неврологических, сердечно-сосудистых заболеваний, сахарного диабета 2 типа (https://gtexportal.org/home/snp/rs2277947). С применением биоинформатического ресурса eQTLGen [https://www.eqtlgen.org/] установлено влияние данного SNP на уровень экспрессии генов MRI1, ZSWIM4 и CCDC130 в крови. Кроме того, обнаружена значительная связь rs2277947 с модификациями гистонов, маркирующими промоторы и энхансеры в различных тканях [https://pubs.broadinstitute.org/mammals/haploreg/detail_v4.2.php?query=&id=rs2277947]; влияние данного генетического варианта на связывание с транскрипционными факторами [http://atsnp.biostat.wisc.edu/search]. Это создает потребность в создании простого в исполнении, недорого и доступного исследователям, работающим в области генетической эпидемиологии, метода идентификации однонуклеотидного полиморфизма rs2277947 гена C19orf53.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом секвенирования амплифицированных участков ДНК [Mardis E. R. DNA sequencing technologies: 2006–2016 //Nature protocols. – 2017. – Vol. 12. – №. 2. – P. 213-218]. Недостатками метода являются высокая стоимость оборудования и реагентов, что исключает широкое внедрение метода в экспериментальные исследования, особенно изучение многофакторных заболеваний, которые требуют большого размера выборок для обеспечения высокой мощности исследований.

Известен способ анализа генетических вариаций в геноме человека методом матричноактивированной лазерной десорбционно-ионизационной масс-спектрометрии (MALDI). Метод заключается в том, анализируемая ДНК переносится на подложку, где она кристаллизуется с матрицей. Затем кристаллизованные аналиты переносят, облучают лазером, вызывая десорбцию и ионизацию молекул в вакуумной камере. Положительно заряженные ионы ДНК ускоряются и мигрируют через вакуумную трубку к высокочувствительному детектору с разной скоростью в зависимости от массы ионов, что приводит к различному времени пролета. Используя время пролета отдельных ионизированных ДНК-аналитов, система определяет массу и отображает масс-спектр, идентифицирующий различные генетические мишени [Li D. et al. MALDI-TOF mass spectrometry in clinical analysis and research //ACS Measurement Science Au. – 2022. – Vol. 2. – №. 5. – P. 385-404]. Недостатками метода являются трудоемкость, высокая стоимость оборудования, высокая стоимость эксперимента, наличие высококвалифицированного персонала.

За прототип выбран  коммерческий набор по генотипированию rs2277947 (G/A) C19orf53 (Assay ID C__15964193_20) компании ThermoFisher. Однако, генотипирование с использованием коммерческих наборов характеризуется высокой стоимостью, а информация о структуре необходимых для проведения ПЦР праймеров и аллель-специфических зондов является закрытой для исследователей, в связи с чем он не может быть воспроизведен при наличии стандартного набора оборудования и реактивов.

Таким образом, существует реальная потребность в создании быстрого, недорогого и легко воспроизводимого способа идентификации полиморфизма rs2277947 (G>A) гена C19orf53, с доступной всем исследователям структурой праймеров и аллель-специфических зондов, который мог бы использоваться в качестве «рутинного» метода генотипирования в любой ПЦР-лаборатории.

Раскрытие сущности изобретения. Техническим результатом данного изобретения является разработка простого в исполнении и экономически целесообразного способа генотипирования однонуклеотидного полиморфизма rs2277947 (G>A), локализованного в позиции chr19:13778554 (GRCh38.p14) гена C19orf53 (Gene ID: 28974) методом полимеразной цепной реакции в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических сигнальных зондов, содержащие флуорофоры FAM и ROX.

Технический результат достигается тем, что идентификацию аллельных вариантов rs2277947 (G>A) гена C19orf53 осуществляют с использованием прямого праймера rs2277947 5′-ATCCCTCTTGCAGTCCTGTG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs2277947 5′-AAGACTCTTTCCCGGCTCTC -3′ (SEQ ID NO 2), rs2277947-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM) CACCCCACCGCCTTTAGCA (RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3),

rs2277947-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX) CACCCCACCACCTTTAGCA (BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

Изобретение поясняется следующей фигурой: дискриминация аллелей по локусу rs2277947 гена C19orf53 при генотипировании методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) на амплификаторе CFX96: генотипы rs2277947-G/G показаны оранжевыми кругами, генотипы rs2277947-G/A показаны зелеными треугольниками, генотипы rs2277947-A/A показаны голубыми квадратами; черным ромбом отмечен отрицательный контроль.

Работа над дизайном олигонуклеотидов включала несколько этапов:

1) С применением открытой базы данных Ensembl genome browser 109 [https://www.ensembl.org/index.html] выбран синвенс, фланкирующий искомую однонуклеотидную замену [G/A] rs2277947 C19orf53, и затем с помощью доступного онлайн программного обеспечения Primer3web version 4.1.0 [https://primer3.ut.ee/] подобрана последовательность олигонуклеотидов, используемых для проведения ПЦР-реакции:

прямой общий праймер rs2277947 5′-ATCCCTCTTGCAGTCCTGTG-3′ (SEQ ID NO 1),

обратный общий праймер rs2277947 5′-AAGACTCTTTCCCGGCTCTC-3′ (SEQ ID NO 2).

Размер амплифицируемого в ходе ПЦР фрагмента гена C19orf53 составляет 175 пар нуклеотидов:

(ATCCCTCTTGCAGTCCTGTGTTCGGGTGAGCAGGCCAGGTGAGCCCACAAGTCTCCATGAGTGACGTGGCCTGGCGTGCTCCACCCCACCCCACC[G/A]CCTTTAGCAACCATGTGCCCAGGGGACAGCTGGGCTTCTACACCTCTGGCCCTGAGCCTGAGAGCCGGGAAAGAGTCTT).

2). Для дизайна зондов пользовались практическими рекомендациями [Basu C. (ed.). PCR primer design. – New york : Humana Press, 2015]. В реакции использовались гидролизные зонды. Последовательность зонда подбирали таким образом, чтобы он отжигался на матрицу между прямым и обратным праймерами. Каждый зонд снабжали флуорофором и гасителем флуоресценции, спектр поглощения которого соответствует длинам волн спектра флуорофора. Для гашения флуоресценции FAM пользовались гасителем RTQ1; для гашения флуоресценции ROX - гасителем BHQ2.

На основании изложенных критериев и практических рекомендаций были подобраны зонды со следующей структурой:

rs2277947-G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(FAM) CACCCCACCGCCTTTAGCA (RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3),

rs2277947-A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд 5′-(ROX) CACCCCACCACCTTTAGCA (BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).

3) Изготовление праймеров и зондов осуществлялось в сервисном центре НПК «Синтол», Москва.

4) С помощью практических экспериментов подобраны оптимальные условия для проведения генотипирования, которые включают следующие этапы: 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 65°C в течение 30 секунд].

5) Разработанный способ был апробирован в лаборатории геномных исследований на 200 образцах ДНК здоровых индивидуумов биобанка НИИ генетической и молекулярной эпидемиологии КГМУ. Генотипирование осуществляли по данным величин RFU (относительные единицы флуоресценции) зондов с флуоресцентными красителями. По результатам генотипирования rs2277947 118 человек (59%) оказались гомозиготами по аллелю G (генотип G/G); 72 человека (36%) являлись гетерозиготами (генотип G/A), 10 человек (5%) индивидуумов оказались гомозиготами A/A.

6) Валидацию способа проводили методом масс-спектрометрического анализа на геномном времяпролетном масс-спектрометре MassArray analyzer 4 (Agena Bioscience). Результаты обоих способов генотипирования полностью (100% генотипов) совпали. Однако патентуемый способ генотипирования полиморфного локуса rs2277947 (G>A) гена C19orf53 методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических зондов позволяет значительно (на 6 часов) сократить время проведения анализа, а также снижает себестоимость анализа (в 4-5 раз).

Осуществление изобретения.

Способ осуществляют следующим образом:

1. Выделение ДНК из периферической венозной крови. На первом этапе к 0,5 мл крови добавляли 0,5 мл PBS и центрифугировали 10 мин при 12 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 1 мл PBS и вновь центрифугировали при тех же условиях. Надосадочную жидкость сливали, добавляли 200 мкл ТЕ-буфера, пипетировали до растворения осадка и затем последовательно добавляли 10 мкл 1% раствора додецилсульфата натрия SDS и 5 мкл протеиназы К. Пробирки инкубировали в термостате при t=37˚C 12 ч. В ходе второго этапа проводили четыре последовательных центрифугирования с фенолом и хлороформом согласно протоколу методики (10 мин, 8 тыс. об/мин), после чего ДНК осаждали ледяным раствором 95% этилового спирта и центрифугировали 10 мин при 14,3 тыс. об/мин. По испарении спирта ДНК растворяли в 100 мкл деионизированной дистиллированной воды. Получаемый раствор ДНК в воде имел чистоту в диапазоне А260/280=1,5-2,0 и среднюю концентрацию около 180-200 нг/мкл.

2. Подготовка образцов ДНК к генотипированию. Качество выделенной ДНК оценивали по степени чистоты и концентрации раствора на спектрофотометре NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, США). Все анализируемые образцы ДНК были разведены деионизированной водой до концентрации 15-20 нг/мкл при А260/280=1,5-2,0.

3. Анализ полиморфизма rs2277947 (G>A) гена C19orf53 с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени с использованием аллель-специфических зондов. Для генотипирования использовали два фланкирующих праймера, прямой (SEQ ID NO 1) и обратный (SEQ ID NO 2), а также аллель-специфические зонды: G-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 3), A-аллель-специфичный флуоресцентно-меченый зонд (SEQ ID NO 4).

ПЦР в «реальном времени» проводили в 25 мл реакционной смеси, содержащей 1,25 ЕД ДНК-полимеразы Hot Start Taq («Биолабмикс», Новосибирск, Россия), 20 нг ДНК, по 10 мкM каждого праймера, по 5 мкM каждого зонда, 0.03 мM каждого dNTP, 2,5 мМ MgCl2; 1xПЦР-буфер [67 мМ Tris-HCl, pH 8,8, 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% Tween-20]. Реакция амплификации состояла из стадии нагревания до 50°C в течение 2 минут, 95°C в течение 10 минут, затем 39 циклов [95°C в течение 10 секунд и 65°C в течение 1 минуты].

4. Генотипирование. При проведении ПЦР в амплификаторе с флуоресцентной детекцией (Bio-Rad CFX96 или аналогичном амплификаторе) генотипирование осуществляют по данным величин RFU (относительных единиц флуоресценции). Для rs2277947 (G>A) гена C19orf53 зонд с флуоресцентным красителем FAM соответствует аллелю G, зонд с красителем ROX - аллелю A (фиг. 1). На фигуре видно четкое разделение образцов на кластеры, где черный ромб соответствуют отрицательному контролю, кластер оранжевых кругов – соответствует зонду с флуоресцентным красителем FAM и позволяет идентифицировать гомозигот G/G. Кластер синих квадратов соответствует зонду с красителем ROX и позволяет идентифицировать гомозигот A/A. Кластер зеленых треугольников соответствует накоплению уровня флуоресценции по обоим зондам и позволяет идентифицировать гетерозигот G/A.

Резюме.

Таким образом, разработан эффективный и недорогой способ для экспресс-идентификации полиморфного варианта rs2277947 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, который может быть использован в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфизмов гена C19orf53, а также в научных целях.

Изобретение относится к области биотехнологии, молекулярно-генетической диагностики, и может быть использовано в медицине при определении наследственной предрасположенности к развитию заболеваний, ассоциированных с носительством полиморфного варианта rs2277947 (G>A) гена C19orf53. Предложен способ генотипирования полиморфного локуса rs2277947 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, предусматривающий проведение ПЦР с использованием специально подобранных праймеров (прямого 5′-ATCCCTCTTGCAGTCCTGTG-3′ и обратного 5′-AAGACTCTTTCCCGGCTCTC-3′) и зондов c флуорофорами (G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM) CACCCCACCGCCTTTAGCA (RTQ1)-3′ и A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX) CACCCCACCACCTTTAGCA (BHQ2)-3′) в амплификаторе с детекцией флуоресценции. Изобретение позволяет расширить арсенал способов генотипирования полиморфных вариантов гена C19orf53, отличается простотой, точностью и низкой себестоимостью. 1 ил.

Способ генотипирования полиморфного локуса rs2277947 (G>A) гена C19orf53 у человека методом ПЦР в режиме «реального времени» с применением аллель-специфических флуоресцентных зондов, отличающийся тем, что идентификацию аллельных вариантов rs2277947 (G>A) гена C19orf53 осуществляют с использованием прямого праймера rs2277947 5′-ATCCCTCTTGCAGTCCTGTG-3′ (SEQ ID NO 1), обратного праймера rs2277947 5′-AAGACTCTTTCCCGGCTCTC -3′ (SEQ ID NO 2), rs2277947-G-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(FAM) CACCCCACCGCCTTTAGCA (RTQ1)-3′ (SEQ ID NO 3), rs2277947-A-аллель-специфичного флуоресцентно-меченого зонда 5′-(ROX) CACCCCACCACCTTTAGCA (BHQ2)-3′ (SEQ ID NO 4).