КОНЪЮГАТЫ МОНОМЕТИЛ АУРИСТАТИНА Е С ЛИГАНДАМИ АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВОГО РЕЦЕПТОРА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ ПЕЧЕНИ Российский патент 2023 года по МПК A61K47/55 A61K47/62 A61P35/00 

Описание патента на изобретение RU2809635C1

Область техники

Настоящее изобретение относится к области медицинской химии, а именно к конъюгатам противоопухолевого препарата монометил ауристатина Е с низкомолекулярными органическими соединениями - лигандами асиалогликопротеинового рецептора для повышения селективности действия и эффективности препаратов путем создания систем для их направленного транспорта в целевые клетки. Предложенные соединения могут быть применены в медицине для лечения гепатоцеллюлярной карциномы.

Уровень техники

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является шестым по распространенности типом рака [Cancer today: [Электронный ресурс] // International Agency for Research on Cancer URL: https://gco.iarc.fr/today/online-analysis-map?v=2020&mode=population&mode_population=continents&population=900&populations=900&key=asr&sex=0&cancer=11&type=0&statistic=5&prevalence=0&population_group=0&ages_group%5B%5D=0&ages_group%5B%5D=17&nb_items=10&group_cancer=1&include_nmsc=0&include_nmsc_other=0&projection=natural-earth&color_palette=default&map_scale=quantile&map_nb_colors=5&continent=0&show_ranking=0&rotate=%255B10%252C0%255D (дата обращения: 7.07.2022)]. В основном болезнь протекает практически бессимптомно, в результате, постановка диагноза осуществляется на последней стадии, когда лечение уже малоэффективно. Одним из способов борьбы с ГЦК является курс химиотерапии. В клинической практике применяют такие препараты как доксорубицин, паклитаксел, капецитабин, гемцитабин и другие. Однако в 90% случаев данные препараты не проявляют желаемого терапевтического эффекта. Использование сорафениба бывает более успешным, однако гепатоцеллюлярная карцинома занимает четвертое место среди опухолевых заболеваний по частоте летальных исходов. Именно поэтому остро стоит задача разработки новых, более действенных средств для лечения пациентов, страдающих от ГЦК.

Монометил ауристатин Е (ММАЕ) - синтетический противоопухолевый препарат, который гораздо более активен (IC50 < 1 нмоль на клеточной линии HepG2), чем препараты аналогичного действия, применяемые в клинической практике (винкристин, калхецин и т.д.). Механизм действия ММАЕ заключается в ингибировании полимеризации тубулина и дестабилизировании структуры микротрубочек, что в конечном итоге приводит к остановке клеточного цикла и, как следствие, к апоптозу [Bai R., Pettit G.R., Hamel E. Structure-activity studies with chiral isomers and with segments of the antimitotic marine peptide dolastatin 10 // Biochem. Pharmacol. 1990. V. 40. P. 1859-1864.]. Однако, неизбирательность действия ММАЕ и, как следствие, высокая общая токсичность препарата [Doronina S.O., Toki B.E., Torgov M.Y., Mendelsohn B.A., Cerveny C.G., Chace D.F., DeBlanc R.L., Gearing R.P., Bovee T.D., Siegall C.B., Francisco J.A., Wahl A.F., Meyer D.L., Senter P.D. Development of potent monoclonal antibody auristatin conjugates for cancer therapy // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 778-784.], делает его самостоятельное использование невозможным.

На сегодняшний день известно ограниченное число примеров использования пролекарств монометил ауристатина Е в клинической практике. Так, успешно применяются 4 конъюгата монометил ауристатина Е с антителами: Адцетрис (Adcetris®, Брентуксимаб ведотин), Падцев (Padcev®, Энфортумаб ведотин), Полайви (Polivy®, Полатузумаб ведотин) и Тивдак (Tivdak®, Тисотумаб ведотин) (общая структура конъюгатов (1)). Адцетрис - конъюгат, разработанный компанией Seattle Genetics, противоопухолевого препарата ММАЕ с моноклональным антителом сАС10, который нацелен на опухолевые клетки, экспрессирующие СD30, который является маркером лимфомы Ходжкина и анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) [Senter P.D., Sievers E.L. The discovery and development of brentuximab vedotin for use in relapsed Hodgkin lymphoma and systemic anaplastic large cell lymphoma // Nat. Biotechnol. 2012. V. 30. P. 631-637.]. Падцев - конъюгат ММАЕ с моноклональным антителом AGS-22C3, данный препарат применяется для лечения опухолевых заболеваний мочевого пузыря [Challita-Eid P.M., Satpayev D., Yang P., An Z., Morrison K., Shostak Y., Raitano A., Nadell R., Liu W., Lortie D.R., Capo L., Verlinsky A., Leavitt M., Malik F., Aviña H., Guevara C.I., Dinh N., Karki S., Anand B.S., Pereira D.S., Joseph I.B.J., Doñate F., Morrison K., Stover D.R. Enfortumab Vedotin Antibody-Drug Conjugate Targeting Nectin-4 Is a Highly Potent Therapeutic Agent in Multiple Preclinical Cancer Models // Cancer Res. 2016. V. 76. P. 3003-3013.]. Полайви - конъюгат противоопухолевого препарата монометил ауристатина Е с анти-CD79b антителом, применяется для лечения рецидивирующей или рефрактерной диффузной B-крупноклеточной лимфомы, агрессивного типа неходжкинской лимфомы. Тивдак - конъюгат антитело-препарат, который используют для лечения пациентов, страдающих от рака шейки матки [Markham A. Tisotumab Vedotin: First Approval //Drugs. 2021. V. 81. P. 2141-2147.].

Примеров использования препаратов ММАЕ с моноклональными антителами для терапии гепатоцеллюлярной карциномы в литературе не обнаружено, помимо этого, стоит отметить, что конъюгаты на основе моноклональных антител не лишены недостатков [Murali M., Kumar A.R., Nair B., Pavithran K., Devan A.R., Pradeep G.K., Nath L.R. Antibody-drug conjugate as targeted therapeutics against hepatocellular carcinoma: preclinical studies and clinical relevance // Clin. Transl. Oncol. 2022. V. 24. P. 407-431.]:

1) высокая стоимость конечного лекарственного средства;

2) не для каждой опухоли известно подходящее антитело, что сильно ограничивает сферу применения данного подхода;

3) при длительной циркуляции конъюгата в кровотоке в целевые клетки попадает лишь небольшое количество действующего вещества. Для преодоления данной проблемы, к одному антителу “пришивают” несколько молекул препарата. Однако, данный способ не всегда отличается высокой воспроизводимостью;

4) существует риск возникновения у пациента резистентности.

Из уровня техники известны препараты, которые используют в клинической практике для лечения гепатоцеллюлярной карциномы - сорафениб, доксорубицин и паклитаксел. Однако, активность данных соединений не превышает 12 мкмоль/л. IC50 на клеточной линии HepG2 для сорафениба составил 12.0 ± 3.1 мкмоль/л [Cervello M., Bachvarov, D., Lampiasi, N., Cusimano, A., Azzolina, A., McCubrey, J. A., Montalto, G. Molecular mechanisms of sorafenib action in liver cancer cells //Cell cycle. 2012. V. 15. P. 2843-2855.], для паклитаксела = 0.12 ± 0.01 мкмоль/л [Petrov R.A., Maklakova S.Y., Ivanenkov Y.A., Petrov S.A., Sergeeva O. v., Yamansarov E.Y., Saltykova I. v., Kireev I.I., Alieva I.B., Deyneka E. v., Sofronova A.A., Aladinskaia A. v., Trofimenko A. v., Yamidanov R.S., Kovalev S. v., Kotelianski V.E., Zatsepin T.S., Beloglazkina E.K., Majouga A.G. Synthesis and biological evaluation of novel mono- and bivalent ASGP-R-targeted drug-conjugates // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2018. V. 28. P. 382- 387], для доксорубицина = 5 мкмоль/л [Chan J. Y. W., Chu A. C. Y., Fung K. P. Inhibition of P-glycoprotein expression and reversal of drug resistance of human hepatoma HepG2 cells by multidrug resistance gene (mdr1) antisense RNA // Life Sci. 2000. V. 67. №. 17. P. 2117-2124.].

Альтернативным подходом к адресной доставке ММАЕ в клетки печени является разработка систем направленного транспорта на основе низкомолекулярных лигандов трансмембранных белков. В данном случае отличной мишенью для создания системы направленной доставки в опухолевые клетки печени является асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR). Асиалогликопротеиновый рецептор минимально представлен на внепеченочных типах клеток. В литературе хорошо описаны вещества, способные эффективно связываться с рецептором - это молекулы, содержащие в своем составе один или несколько терминальных остатков галактозы и N-ацетилгалактозамина [Lee Y.C., Townsend R.R., Hardy M.R., Lönngren J., Arnarp J., Haraldsson M., Lönn H. Binding of synthetic oligosaccharides to the hepatic Gal/GalNAc lectin. Dependence on fine structural features. // J. Bio. Chem. 1983. V. 258. P. 199-202.].

Наиболее близким аналогом данного изобретения является конъюгаты лигандов асиалогликопротеинового рецептора с иными противоопухолевыми препаратами, такими как доксорубицин [Ivanenkov Y.A., Majouga A.G., Petrov R.A., Petrov S.A., Kovalev S. v., Maklakova S.Y., Yamansarov E.Y., Saltykova I. V., Deyneka E. V., Filkov G.I., Kotelianski V.E., Zatsepin T.S., Beloglazkina E.K. Synthesis and biological evaluation of novel doxorubicin-containing ASGP- R-targeted drug-conjugates // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2018. V. 28. P. 503-508.], паклитаксел [Petrov R.A., Maklakova S.Y., Ivanenkov Y.A., Petrov S.A., Sergeeva O. v., Yamansarov E.Y., Saltykova I. v., Kireev I.I., Alieva I.B., Deyneka E. v., Sofronova A.A., Aladinskaia A. v., Trofimenko A. v., Yamidanov R.S., Kovalev S. v., Kotelianski V.E., Zatsepin T.S., Beloglazkina E.K., Majouga A.G. Synthesis and biological evaluation of novel mono- and bivalent ASGP-R-targeted drug-conjugates // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2018. V. 28. P. 382- 387.], бетулин [Yamansarov E.Yu., Lopatukhina E. v., Evteev S.A., Skvortsov D.A., Lopukhov A. v., Kovalev S. v., Vaneev A.N., Shkil’ D.O., Akasov R.A., Lobov A.N., Naumenko V.A., Pavlova E.N., Ryabaya O.O., Burenina O.Yu., Ivanenkov Y.A., Klyachko N.L., Erofeev A.S., Gorelkin P. v., Beloglazkina E.K., Majouga A.G. Discovery of Bivalent GalNAc-Conjugated Betulin as a Potent ASGPR-Directed Agent against Hepatocellular Carcinoma // Bioconjug. Chem. 2021. V. 32. P. 763-781]. Однако, эффективность данных соединений невысока. Например, в случае конъюгатов с доксорубицином, все соединения показали низкие значения CC50 (в максимальной концентрации 100 мкМ достигается гибель лишь 30% клеток) [Ivanenkov Y.A., Majouga A.G., Petrov R.A., Petrov S.A., Kovalev S. V., Maklakova S.Y., Yamansarov E.Y., Saltykova I. V., Deyneka E. V., Filkov G.I., Kotelianski V.E., Zatsepin T.S., Beloglazkina E.K. Synthesis and biological evaluation of novel doxorubicin-containing ASGP- R-targeted drug-conjugates // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2018. V. 28. P. 503-508].

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка конъюгатов монометил ауристатина Е с лигандами асиалогликопротеинового рецептора, эффективность которых сравнима или превосходит существующие противоопухолевые препараты. Так, цитотоксичность конъюгатов находится на уровне с используемым в клинической практике препаратом аналогичного действия колхицином. Например, IC50 конъюгата из примера 1 на клеточной линии HepG2 составил 0.11 ± 0.04 мкмоль/л, для колхицина = 4.6 ± 0.4 мкмоль/л [Fu D.J., Li P., Wu B.W., Cui X.X., Zhao C. bin, Zhang S.Y. Molecular diversity of trimethoxyphenyl-1,2,3-triazole hybrids as novel colchicine site tubulin polymerization inhibitors // Eur. J. Med. Chem. 2019. V. 165. P. 309-322]. Разработанные конъюгаты также обладают большей селективностью по отношению к ASGPR-экспрессирующей клеточной линии, чем немодифицированный монометил ауристатин Е.

Раскрытие изобретения

Заявляемое изобретение представляет собой низкомолекулярные конъюгаты монометил ауристатина Е общей формулы (I), в которых препарат соединен с остатком N-ацетилгалактозамина с помощью линкера. Линкер представляет собой дипептидный фрагмент или углеводородную цепь из нескольких метиленовых остатков (длина углеводородной цепи от 1 до 6 метиленовых звеньев). Молярная масса заявляемых конъюгатов составляет от 1080.6 до 1346.7 г/моль.

Техническим результатом заявляемого изобретения являются конъюгаты противоопухолевого препарата монометил ауристатина Е с лигандами асиалогликопротеинового рецептора, эффективность которых сравнима или превосходит существующие аналоги. Конъюгаты обладают цитотоксичностью, находящейся на уровне с используемыми в клинической практике препаратами. Также заявляемый конъюгат является стабильными в условиях, имитирующих физиологические (pH 5.0 и 7.4), но подвергается гидролизу под действием смеси ферментов Проназы.

Технический результат достигается конъюгатом общей формулы (I):

(I)

где

Лиганд это ,

,

где Х = NHAc или OH, l = от 0 до 2, m = от 1 до 10, o = от 1 до 3

Линкер это ,

где Y = Val, Phe, Ala, Z = Cit, Arg, n = от 1 до 6, p = от 0 до 1.

Технический результат также достигается способом получения заявляемого конъюгата, который получают с помощью Cu(I)-катализируемой реакции азидо-алкинового циклоприсоединения. В качестве исходных соединений используют производное монометил ауристатина Е, содержащее терминальную тройную связь и лиганд асиалогликопротеинового рецептора (производное галактозы или N-ацетилгалактозамина) содержащий азидо-группу. Растворы веществ смешивают в таких количествах, чтобы на 1.0 мольный эквивалент производного ММАЕ приходилось не менее 1.0 мольного эквивалента лиганда. В качестве растворителя используют любой органический растворитель, обеспечивающий растворение исходных соединений и инертный к компонентам смеси, например ДМФА, ДМСО или любой другой растворитель. Реакцию проводят в присутствии катализатора - соединения одновалентной меди, взятого в количестве не менее 0.5 мольных эквивалентов на 1.0 мольный эквивалент производного ММАЕ. В качестве катализатора используют любую соль одновалентой меди, обеспечивающую прохождение реакции - CuCl, CuI, CuBr и т.д. В качестве основания используют любой третичный амин, например, триэтиламин, диизопропиламин и т.д. Основание берут в количестве не менее 8.8 мольных эквивалентов на 1.0 мольный эквивалент производного ММАЕ. После проведения реакции в смесь добавляют ЭДТА или динатриевую соль ЭДТА в мольном соотношении 1:1 к добавленному катализатору для удаления Cu (I) из реакционной смеси. Полученный продукт выделяют с помощью обращенно-фазовой колоночной хроматографии (подвижная фаза А - вода, B - ацетонитрил, градиент 95:5 → 40:60, А:B, по объему)

Технический результат также достигается применением конъюгата общей формулы (I) по п.1 для приготовления фармацевтической композиции для лечения гепатоцеллюлярной карциномы.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 приведены результаты исследований наномеханических свойств клеток HepG2 и PC3. Слева представлены снимки топографии клеток, и карта отступов, полученная с помощью SICM. Справа представлены полученные данные измерения модуля Юнга [Па] для конъюгата, немодифицированного ММАЕ и необработанных клеток в качестве контроля (на рисунке данные, полученные для соединения из Примера 1).

На фиг. 2 представлены результаты измерения уровня активных форм кислорода для структуры из примера 1.

На фиг. 3 и 4 приведены результаты исследований кинетики гидролиза конъюгатов при выдерживании в модельных растворах.

Осуществление изобретения

Ниже приведены определения терминов, которые используются в описании настоящего изобретения.

«Линкер» - структурное звено, соединяющее действующее вещество и направляющий лиганд.

«Асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR)» - трансмембранный белок, преимущественно экспрессируемый гепатоцитами, распознающий производные D-галактозы и N-ацетилгалактозамина и участвующий в их транспорте в клетку.

«Конъюгат» - комплекс, формирующийся при помощи ковалентных связей между лекарственным соединением и лигандом-носителем.

«Лиганд» - химическое соединение, которое образует нековалентный комплекс с той или иной биомолекулой (чаще всего белком, например, клеточным рецептором, но иногда, например, с ДНК) и производит, вследствие такого связывания, те или иные биохимические, физиологические или фармакологические эффекты.

Конъюгаты получают с помощью Cu(I)-катализируемой реакции азидо-алкинового циклоприсоединения. В качестве исходных соединений используют производное монометил ауристатина Е, содержащее терминальную тройную связь и лиганд асиалогликопротеинового рецептора (производное галактозы или N-ацетилгалактозамина) содержащий азидо-группу. Растворы веществ смешивают в таких количествах, чтобы на 1.0 мольный эквивалент производного ММАЕ приходилось не менее 1.0 мольного эквивалента лиганда. В качестве растворителя используют ДМФА, ДМСО или любой другой растворитель, который будет обеспечивать растворение и инертным к компонентам смеси. Реакцию проводят в присутствии катализатора - соединения одновалентной меди, взятого в количестве не менее 0.5 мольных эквивалентов на 1.0 мольный эквивалент производного ММАЕ. В качестве катализатора используют любую соль одновалентой меди, обеспечивающую прохождение реакции - CuCl, CuI, CuBr и т.д. В качестве основания используют любой третичный амин, например, триэтиламин, диизопропиламин и т.д. Основание берут в количестве не менее 8.8 мольных эквивалентов на 1.0 мольный эквивалент производного ММАЕ. После проведения реакции в смесь добавляют ЭДТА или динатриевую соль ЭДТА в мольном соотношении 1:1 к добавленному катализатору для удаления Cu (I) из реакционной смеси. Полученный продукт выделяют с помощью обращенно-фазовой колоночной хроматографии (подвижная фаза А - вода, B - ацетонитрил, градиент 95:5 → 40:60, А:B, по объему).

Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1. Получение 4-((S)-2-((R)-2-(4-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)бутанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил ((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)(метил)карбамата

Реакцию проводили в инертной атмосфере. К раствору 4-((S)-2-((R)-2-(гекс-5-инамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил ((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2- ил)амино)-3- метил-1-оксобутан-2-ил)(метил)карбамата (50 мг, 0.04 ммоль) в 1 мл ДМФА добавляли раствор 1-Азидо-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозы (25 мг, 0,08 ммоль) в 1 мл ДМФА. В полученную смесь добавляли иодид меди (I) (4 мг, 0.02 ммоль) и триэтиламин (49 мкл, 0.35 ммоль), перемешивали в течение ночи. После чего к раствору добавляли ЭДТА (7 мг, 0.02 ммоль), концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Продукт очищали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на препаративном хроматографе (подвижная фаза А - вода, B - ацетонитрил, градиент 95:5 → 40:60, А:B, по объему).

Получили 21 мг (36%) желтого порошка.

1Н ЯМР (DMSO-d6, δ, м.д.): 10.02-9.97 (м, 1Н, NH), 8.36-8.32 и 8.23-8.06 (2м, всего 2H, 2хNH), 7.96-7.76 (м, 3H, 2хNH, CHtrz), 7.71-7.52 (м, 2H, ArH), 7.38- 7.22 (м, 6H, ArH), 7.17 (т, J=7.4 Гц, 1Н, ArH), 5.99 (с, 1H, NH), 5.54 (д, J=9.9 Гц, 1Н, H-1), 5.46-5.33 (м, 2Н, NH2), 5.14-4.93 (м, 2H, CH2), 4.84-4.69 (м, 2H, 2xCH), 4.53-4.33 (м, 3H, Н-3, 2xCH), 4.31-4.17 (м, 2H, 2xCH), 4.06-3.89 (м, 2H, Н- 2, CH), 3.82-3.72 (м, 1H, Н-4), 3.66 (т, J = 6.2 Гц, 1Н, СHAHB), 3.61-3.43 (м, 4H, СHAHB, CHAHB, СН), 3.35-3.28 (м, 1Н, Н-5), 3.28-3.09 (м, 8H, 2xCH3, CH2), 3.08-2.80 (м, 7H, 2xCH3, CHAHB), 2.69-2.52 (м, 2H, CH2), 2.45-2.37 (м, 1Н, CHAHB), 2.32-2.21 (м, 1H, CHAHB), 2.19-1.90 (м, 6H, 4xCH, CH2), 1.87-1.22 (м, 15H, CH, CHAHB, 5хCH2, NHC(O)CH3), 1.07-0.70 (м, 31H, CHAHB, 10xCH3).

ВЭЖХ-МС: чистота 100%, tR=12.19 мин

Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для С72H114N14O18Na [M+Na]+ m/z 1485.8328, найдено - 1485.8329.

Пример 2. Получение 4-((S)-2-((S)-2-(4-(1-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)бутанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил ((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил) амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)(метил)карбамата

Реакцию проводили в инертной атмосфере. К раствору 4-((S)-2-((R)-2-(гекс-5-инамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил ((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1- гидрокси-1-фенилпропан- 2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин1-ил)-3-метокси-5- метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2- ил)амино)-3- метил-1-оксобутан-2-ил)(метил)карбамата (40 мг, 0.03 ммоль) в 1 мл ДМФА добавляли раствор 1-O-(2’-Азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозы (19 мг, 0,06 ммоль) в 1 мл ДМФА . В полученную смесь добавляли иодид меди (I) (3 мг, 0.015 ммоль) и триэтиламин (37 мкл, 0.26 ммоль), перемешивали в течение ночи. После чего к раствору добавляли ЭДТА (5 мг, 0.015 ммоль), концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Продукт очищали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на препаративном хроматографе (подвижная фаза А - вода, B - ацетонитрил, градиент 95:5 → 40:60, А:B, по объему).

Получили 37 мг (75%) желтого порошка.

1Н ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 7.78 (с, 1H, СНtrz), 7.59 (д, J=7.8 Гц, 2H, ArH), 7.44-7.27 (м, 6H, ArH), 7.23-7.18 (м, 1H, ArH), 5.23-5.04 (м, 2H, СН2), 4.80-4.71 (м, 1H, СН), 4.68-4.59 (м, 2H, СН), 4.58-4.48 (м, 4H, 2xCH, CH2), 4.37 (д, J=8.3 Гц, 1H, Н-1), 4.25-4.15 (м, 4H, 3xCH, CHAHB), 3.98-3.65 (м, 7H, Н-2, CHAHB, CH, Н-4, 2хН-6, CHAHB), 3.59-3.48 (м, 2H, Н-3, Н-5), 3.45-3.34 (м, 8H, СН2, 2xCH3), 3.21-3.04 (м, 4H, CH3, CHAHB), 3.01-2.84 (м, 4H, CH3, CH), 2.76-2.69 (м, 2H, CH2), 2.56-2.44 (м, 2H, CH2), 2.37-2.31 (м, 2H, СН2), 2.25-2.16 (м, 1H, СН), 2.14-1.70 (м, 13H, СН, NHC(O)CH3, 2хCHAHB, 2хCH2), 1.64-1.50 (м, 2H, 2xCHAHB), 1.46-1.36 (м, 3H, CH2, CHAHB), 1.22-1.09 (м, 6H, 2хСН3), 1.04-0.73 (м, 25H, 8хСН3, СНАНВ).

ВЭЖХ-МС: чистота 95%, tR=12.18 мин.

Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для С74H119N14O19 [M+H]+ m/z 1507.8770, найдено - 1507.8762.

Пример 3. Получение 4-((S)-2-((R)-2-(4-(1-(11-((1,25-бис(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ацетамидо- 4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-13-((3-((6-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)гексил)амино)-3-оксопропокси)метил)-8,18-диоксо-11,15-диокса-7,19-диазапентакозан-13-ил)амино)-11-оксоундецил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)бутанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)(метил)карбамат

Реакцию проводили в инертной атмосфере. К раствору 4-((S)-2-((R)-2-(гекс-5-инамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил ((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2- ил)амино)-3- метил-1-оксобутан-2-ил)(метил)карбамата (15 мг, 0.012 ммоль) в 1 мл ДМФА добавляли раствор N-(11-Азидоундеканоил)амино-трис-[(1-(6-амидогексил)-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-галактопиранозил)-карбоксиэтоксиметил]метана (20 мг, 0,013 ммоль) в 1 мл ДМФА . В полученную смесь добавляли иодид меди (I) (1 мг, 0.006 ммоль) и триэтиламин (15 мкл, 0.11 ммоль), перемешивали в течение ночи. После чего к раствору добавляли ЭДТА (2 мг, 0.006 ммоль), концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Продукт очищали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на препаративном хроматографе (подвижная фаза А - вода, B - ацетонитрил, градиент 95:5 → 40:60, А:B, по объему).

Получили 16 мг (50%) желтого порошка.

1Н ЯМР (DMSO-d6, δ, м.д.): 10.04-9.82 (м, 1H, NH), 8.36-8.27 и 8.17-8.00 (2м, всего 2H, 2хNH), 7.93-7.79 (м, 4H, NH, СНtrz), 7.68-7.53 (м, 4H, 2хNH, 2хArH), 7.36-7.22 (м, 4H, АrH), 7.20-7.11 (м, 1H, ArH), 7.00 (c, 1H, NH), 5.98 (с, 1H, NH), 5.42 (c, 2H, NH2), 5.19-4.89 (м, 2H, СН2), 4.80-4.33 (м, 13H, 4хСН, 9xOH), 4.31-4.16 (м, 6H, 3хН-1, СН2, 2хСН), 4.04-3.92 (м, 3H, 3хСН), 3.80-3.38 (м, 36H, 3xH-2, 3xH-3, 3xH-4, 6xH-6, 3xOСН2, 3xCH2OCH2, CHAHB, СН), 3.29-3.10 (м, 11H, 2хСН3, СН2), 3.08-2.90 (м, 10H, СН3, 3xO(CH2)5СH2NH, СНАНВ), 2.89-2.80 (м, 3H, Н-5), 2.58 (т, J=7.7 Гц, 2H, СН2), 2.47-2.36 (м, 1H, СНАНВ), 2.33-2.18 (м, 9H, 3хС(О)СН2СН2О, СН2, СНАНВ), 2.18-1.91 (м, 6H, 4хСН, СН2), 1.87-1.54 (м, 16Н, 3хNHC(O)CH3, 3xCH2, CH), 1.51-1.30 и 1.30-1.12 (2м, всего 45H, 3xOCH2(CH2)4CH2NH, N3CH2(CH2)8CH2C(O), 2хCH2, CHAHB), 1.05-0.95 (м, 6H, 2хСН3), 0.95-0.89 (м, 25H, 8хСН3, СНАНВ).

ВЭЖХ-МС: чистота 90%, tR=12.30 мин.

Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для С130H220N20O38Na [M+H+Na]2+ m/z 1346.7931, найдено - 1346.7896.

Пример 4. Получение 4-((S)-2-((R)-2-(4-(1-(2-((1,17-бис(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)-9-((3-((2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3- ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)амино)-3-оксопропокси)метил)-4,14-диоксо-7,11-диокса-3 ,15-диазагептадекан-9-ил)амино)-2-оксоэтил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)бутанамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил((S)-1 -(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)(метил)карбамат

Реакцию проводили в инертной атмосфере. К раствору 4-((S)-2-((R)-2-(гекс-5-инамидо)-3-метилбутанамидо)-5-уреидопентанамидо)бензил ((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1- гидрокси-1-фенилпропан- 2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин1-ил)-3-метокси-5- метил-1-оксогептан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2- ил)амино)-3- метил-1-оксобутан-2-ил)(метил)карбамата (15 мг, 0.012 ммоль) в 1 мл ДМФА добавляли раствор N-(2-Азидоэтаноил)амино-трис-[(1-(2-амидоэтил)-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-галактопиранозил)-карбоксиэтоксиметил]метана (16 мг, 0,014 ммоль) в 1 мл ДМФА. В полученную смесь добавляли иодид меди (I) (1 мг, 0.006 ммоль) и триэтиламин (15 мкл, 0.11 ммоль), перемешивали в течение ночи. После чего к раствору добавляли ЭДТА (2 мг, 0.006 ммоль), концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Продукт очищали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на препаративном хроматографе (подвижная фаза А - вода, B - ацетонитрил, градиент 95:5 → 40:60, А:B, по объему).

Получили 22 мг (71%) желтого порошка.

1Н ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 7.83 (c, 1H, СНtrz), 7.60 (д, J=7.9 Гц, 2H, ArH), 7.41-7.27 (м, 6H, ArH), 7.24-7.18 (м, 1H, СН), 5.25-5.11 (м, 4H, 2хСН2), 4.69-4.47 (м, 4H, 4хСН), 4.40 (д, J=8.4 Гц, 3H, 3хН-1), 4.26-4.14 (м, 4H, 4хСН), 3.96 (дд, J=10.7, 8.4 Гц, 3H, 3хН-2), 3.90-3.66 (м, 30H, 3хН-4, 6хН-6, 3хН-5, СНAHB, 3xССН2OCH2, 3xOCHAHB,, 2хСН), 3.60 (дд, J=10.8, 3.2 Гц, 3H, Н-3), 3.52 (т, J=6.2 Гц, 3H, 3xOCH2СHAHBNH), 3.48-3.33 (м, 14H, 3xOCHAHB, СН2, 3xOCH2СHAHBNH, 2хСН3), 3.23-3.04 (м, 4H, СН3, СНАНВ), 3.01-2.91 (м, 3H, СН3), 2.75 (т, J=7.5 Гц, 2H, CH2), 2.53-2.42 (м, 8H, 3хС(O)СH2CH2O, СН2), 2.33 (т, J=7.8 Гц, 2H, СН2), 2.28-1.70 (м, 20H, 4хСН, 3xNHC(O)CH3, 3хCH2, CHAHB), 1.66-1.51 (м, 2H, СН2), 1.47-1.35 (м, 1H, CHAHB), 1.21-1.09 (м, 6H, 2хСН3), 1.06-0.73 (м, 26H, 8хСН3, CH2).

ВЭЖХ-МС: чистота 100%, tR=11.98 мин.

Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для С109H179N20O38Na [M+H+Na]2+ m/z 1199.6288, найдено - 1199.6311.

Пример 5. Получение (S)-2-((S)-2-(4-(1-((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро- 2H-пиран-2-ил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)-N-метилбутанамидо)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид

Реакцию проводили в инертной атмосфере. К раствору N-((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксопентан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)-N-метилгекс-5-инамида (20 мг, 0.025 ммоль) в 1 мл ДМФА добавляли раствор 1-Азидо-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозы (12 мг, 0,049 ммоль) в 1 мл ДМФА . В полученную смесь добавляли иодид меди (I) (3 мг, 0.013 ммоль) и триэтиламин (31 мкл, 0.22 ммоль), перемешивали в течение ночи. После чего к раствору добавляли ЭДТА (4 мг, 0.013 ммоль), концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Продукт очищали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на препаративном хроматографе (подвижная фаза А - вода, B - ацетонитрил, градиент 95:5 → 40:60, А:B, по объему).

Получили 23 мг (87%) желтого порошка.

1Н ЯМР (DMSO-d6, δ, м.д.): 7.91-7.81 (м, 2H, NH, CHtrz), 7.81-7.71 (м, 1H, NH), 7.66-7.60 (м, 1Н, NH), 7.33-7.13 (м, 5H, ArH), 5.58-5.50 (м, 1H, H-1), 5.42 (д, J=8.3 Гц, 1H, ОН), 5.35 (д, J = 4.9 Гц, 1Н, ОН), 4.96-4.85 (м, 1H, CH), 4.78-4.69 (м, 2H, 2хCH), 4.68-4.59 (м, 1H, CH), 4.57-4.33 (м, 3H, 3хCH), 4.08-3.89 (м, 3H, Н-2, CH, CHAHB), 3.82-3.73 (м, 1H, H-4), 3.71-3.62 (м, 2H, Н-3, CHAHB), 3.60-3.44 (м, 3H, 2хH-6, H-5), 3.29-3.08 (м, 6H, 2хCH3), 3.01-2.81 (м, 6H, 2хCH3), 2.70-2.56 (м, 4H, 2хCH2), 2.43-2.23 (м, 3H, CH2, CH), 2.18-2.09 (м, 2H, 2хCH), 1.86-1.66 (м, 5H, CH-20, 2хCHAHB, CH2), 1.65-1.42 (м, 5H, 2хСНАНВ, 3xNHC(O)CH3), 1.36-1.18 (м, 1Н, СНАНВ), 1.07-0.94 (м, 6H, 2хCH3), 0.92-0.70 (м, 19H, 8xCH3, СНАНВ).

ВЭЖХ-МС: чистота 100%, tR=11.89 мин

Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для С53H87N9O13Na [M+Na]+ m/z 1080.6314, найдено - 1080.6316.

Пример 6. Получение (S)-2-((S)-2-(4-(1-(2-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)этил)-1H-1,2,3-триазол-4-ил)-N-метилбутанамидо)-3-метилбутанамидо)-N-((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил)-N,3-диметилбутанамид

Реакцию проводили в инертной атмосфере. К раствору N-((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксопентан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)-N-метилгекс-5-инамида (37 мг, 0.046 ммоль) в 1 мл ДМФА добавляли раствор 1-O-(2’-Азидоэтил)-2-ацетамидо-2-дезокси-β-D-галактопиранозы (26 мг, 0,091 ммоль) в 1 мл ДМФА . В полученную смесь добавляли иодид меди (I) (4 мг, 0.023 ммоль) и триэтиламин (56 мкл, 0.40 ммоль), перемешивали в течение ночи. После чего к раствору добавляли ЭДТА (8 мг, 0.023 ммоль), концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Продукт очищали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на препаративном хроматографе (подвижная фаза А - вода, B - ацетонитрил, градиент 95:5 → 40:60, А:B, по объему).

Получили 30 мг (59%) желтого порошка.

1Н ЯМР (CD3OD, δ, м.д.): 7.79 (д, J =2.6 Гц, 1Н, СHtrz), 7.41-7.35 (м, 2H, ArH), 7.34-7.27 (м, 2H, ArH), 7.25-7.18 (м, 1H, ArH), 4.68-4.51 (м, 6H, 4xCH, CH2), 4.37 (д, J=8.4 Гц, 1Н, H-1), 4.28-4.17 (м, 3H, СНАНВ, 2хCH), 4.10-4.02 (м, 1H, CHAHB), 3.99-3.85 (м, 2H, CH, H-2), 3.82 (д, J = 3.3 Гц, 1Н, Н-4), 3.80-3.64 (м, 4H, 2xH-6, СН, СНАНВ), 3.56 (дд, J=10.8, 3.4 Гц, 1Н, Н-3), 3.51-3.47 (м, 1H, Н-5), 3.45-3.38 (м, 1H, СНАНВ), 3.37-3.33 (м, 6H, 2хСН3), 3.28 (с, 3H, СН3), 3.14-2.96 (м, 3H, СН3), 2.81-2.72 (м, 2H, СН2), 2.63-2.45 (м, 4H, 2хСН2), 2.32-2.18 (м, 1H, СН), 2.15-1.78 (м, 10H, 3хСН, СН2, NHC(O)CH3, 2хСНАНВ), 1.74-1.52 (м, 2H, 2хСНАНВ), 1.47-1.36 (м, 1Н, СНАНВ), 1.21-1.09 (м, 6H, 2хСН3), 1.03-0.81 (м, 19Н, 6хСН3, СНАНВ).

ВЭЖХ-МС: чистота 100%, tR=11.76 мин

Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для С55H92N9O14 [M+H]+ m/z 1102.6758, найдено - 1102.6739

Пример 7. Получение конъюгата 3,3'-((2-((3-((6-(((2R,3R,6R)-3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)-3,6-дигидро-2H-пиран-2-ил)окси)гексил)амино)-3-оксопропокси) метил)-2-(11-(4-((3R,4S,7S,10S)-4-((S)-втор-бутил))-3-(2-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-2-оксоэтил)-7,10-диизопропил-5,11-диметил-6,9,12-триоксо-2-окса-5,8,11-триазапентадекан-15-ил)-1H-1,2,3-триазол-1-ил)ундеканамидо)пропан-1,3-диил)бис(окси))бис(N-(6-(((2R,3R,4R,5R,6R)-3-ацетамидо-4,5-дигидрокси-6-(гидроксиметил)тетрагидро-2H-пиран-2-ил)окси)гексил)пропанамид)

Реакцию проводили в инертной атмосфере. К раствору N-((S)-1-(((S)-1-(((3R,4S,5S)-1-((S)-2-((1R,2R)-3-(((1S,2R)-1-гидрокси-1-фенилпропан-2-ил)амино)-1-метокси-2-метил-3-оксопропил)пирролидин-1-ил)-3-метокси-5-метил-1-оксопентан-4-ил)(метил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)амино)-3-метил-1-оксобутан-2-ил)-N-метилгекс-5-инамида (30 мг, 0.037 ммоль) в 1 мл ДМФА добавляли раствор N-(11-Азидоундеканоил)амино-трис-[(1-(6-амидогексил)-2-ацетамидо-2-деокси-β-D-галактопиранозил)-карбоксиэтоксиметил]метана (54 мг, 0,037 ммоль) в 1 мл ДМФА . В полученную смесь добавляли иодид меди (I) (4 мг, 0.019 ммоль) и триэтиламин (45 мкл, 0.326 ммоль), перемешивали в течение ночи. После чего к раствору добавляли ЭДТА (7 мг, 0.019 ммоль), концентрировали реакционную смесь при пониженном давлении. Продукт очищали с помощью обращенно-фазовой хроматографии на препаративном хроматографе (подвижная фаза А - вода, B - ацетонитрил, градиент 95:5 → 40:60, А:B, по объему).

Получили 15 мг (18 %) желтого порошка.

1Н ЯМР (СD3OD, δ, м.д.): 7.79 (д, J=2.6 Гц, 1H, СHtrz), 7.42-7.36 (м, 2H, ArH), 7.35 - 7.27 (м, 2H, ArH), 7.26-7.18 (м, 1H, ArH), 4.71-4.51 (м, 3H, 3хСН), 4.36 (д, J=8.4 Гц, 3H, 3хН-1), 4.28-4.13 (м, 2H, 2хСН), 3.97-3.86 (м, 6H, 3хСН2), 3.84 (д, J=3.2 Гц, 3H, 3хН-4), 3.80-3.71 (м, 6H, 3хH-6), 3.70-3.64 (м, 13H, 3хССН2ОСН2, СНАНВ), 3.60 (дд, J=10.7, 3.2 Гц, 3H, Н-3), 3.54-3.37 (м, 7H, 3хН-5, 3хН-2, СН), 3.37-3.33 (м, 6H, 2хСН3), 3.31-3.26 (м, 4H, СН3, СНАНВ), 3.23-3.09 (м, 8H, 4хСН2), 3.08-2.96 (м, 3H, СН3), 2.80-2.73 (м, 2H, СН2), 2.64-2.45 (м, 4H, 2хСН2), 2.41 (т, J=6.0 Гц, 6H, 3хС(О)СН2СН2О), 2.32-2.20 (м, 1H, СН), 2.17 (т, J=7.5 Гц, 2H, СН2), 2.14-2.06 (м, 1H, СН), 1.98 (с, 9H, NHC(O)CH3), 1.93-1.84 (м, 3H, СН2, СНАНВ), 1.84-1.75 (м, 1H, СНАНВ), 1.62-1.46 (м, 16H, N3CH2(CH2)8CH2C(O)), 1.43-1.27 (м, 26H, 3xOCH2(CH2)4CH2NH, 2хСНАНВ, СНАНВ), 1.23-1.10 (м, 6H, 2хСН3), 1.04-0.82 (м, 19H, 6хСН3, СНАНВ).

ВЭЖХ-МС: чистота 100%, tR=10.00 мин.

Масс-спектр высокого разрешения: вычислено для С111H194N15O33Na [M+H+Na]2+ m/z 1144.1925, найдено - 1144.1908.

Пример 8. Методика эксперимента гидролиза

Образец (C =10 мг/мл, V = 50 мкл) разбавляли в 950 мкл буферного раствора состава 0.2 М Трис-HCl (pH 7.4) или 0.2 М AcONa-AcOH (pH 5.0). В случае ферментативного гидролиза дополнительно вводили препарат Проназы (10 мг/мл в dH2O, 50 мкл). Проназа содержит нейтральную протеазу, химотрипсин, трипсин, карбоксипептидазу, аминопептидазу, нейральную и щелочную фосфатазу. Смеси инкубировали при 37°C. Отбирали аликвоты с временными интервалами 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 и 24 часов. Отобрав 100 мкл смеси, немеделенно добавляли 400 мкл холодного метанола (для подавления гидролиза). Далее хранили аликвоту при -20°C. Непосредственно перед анализом, образцы размораживали, центрифугировали при 13000 G и исследовали отобранный супернатант методом ВЭЖХ-МС.

В результате проведенных экспериментов, было показано, что конъюгаты из примеров 1 и 4 остаются стабильными при pH = 4.9 и 7.4 (фиг. 3 и 4), однако подвергаются гидролизу под действием смеси ферментов. Было также показано (на примере 4), что основным продуктом гидролиза является действующее вещество - монометил ауристатин Е (ММАЕ).

Пример 9. Электрохимическое измерение уровня активных форм кислорода

Измерение уровня АФК в клетках HepG2 и PC-3 проводили с помощью платинового наноэлектрода согласно методике [Erofeev A., Gorelkin P., Garanina A., Alova A., Efremova M., Vorobyeva N., Edwards C., Korchev Y., Majouga A. Novel method for rapid toxicity screening of magnetic nanoparticles // Sci. Rep. 2018. V. 8. P. 1-11.]. Для его изготовления были использованы коммерчески доступные дискообразные угольные наноэлектроды, изолированные в кварце (ICAPPIC Limited, Великобритания) диаметром 60-100 нм. Наноразмерные полости создавались электрохимическим травлением угольных электродов в растворе, содержащем 0.1М NaOH и 10мМ KCl. Затем наносили платину на наноэлектроды из 2мМ раствора H2PtCl6. Разность потенциалов между платиновым наноэлектродом и эталонным электродом регистрировали с помощью патч-клеммы усилителя модели 2400 (AM Systems). Измерения передавались на компьютер и записывались с помощью преобразователя USB-6211 (National Instruments) и программы WinWCP (John Dempster, University of Strathclyde, UK). Все манипуляции производили на столе оптического инвертированного микроскопа (Nikon, Япония).

Концентрацию АФК (пероксида водорода) оценивали при потенциале +800 мВ относительно Ag/AgCl. Перед измерениями каждый платиновый электрод калибровали с помощью стандартных растворов H2O2. При проникновении в клетку наблюдали резкое увеличение тока с последующим относительно медленным снижением до стационарного значения, превышающего измеренное в клеточной среде. Ток быстро возвращался к исходному уровню, если электрод удаляли из клетки. Измерения в 7-10 разных клетках с одним и тем же электродом показывали примерно одинаковые величины изменения сигнала. В качестве анализируемого значения тока использовали разность между токами внутри и снаружи клетки.

В результате эксперимента было выявлено что конъюгат из примера 1 вызывает продукцию большего количества активных форм кислорода в клетках HepG2, по сравнению с немодифицированным ММАЕ (фиг. 2).

Пример 10. Топография поверхности клеток и измерение модуля Юнга

Измерение проводили согласно методике [Kolmogorov, V. S., Erofeev, A. S., Woodcock, E., Efremov, Y. M., Iakovlev, A. P., Savin, N. A., Alova, A. V., Lavrushkina, S. V., Kireev, I. I., Prelovskaya, A. O., Sviderskaya, E. V., Scaini, D., Klyachko, N. L., Timashev, P. S., Takahashi, Y., Salikhov, S. V., Parkhomenko, Y. N., Majouga, A. G., Edwards, C. R. W., Novak, P., Korchev, Y. E., Gorelkin, P. V. Mapping Mechanical Properties of Living Cells at Nanoscale Using Intrinsic Nanopipette- Sample Force Interactions // Nanoscale. 2021.V. 13. P. 6558-6568.]. Сканирование проведено на сканирующем ион-проводящем микроскопе (ICAPPIC Limited, United Kingdom). Использовали нанокапилляры, изготовленные на лазерном пуллере P-2000 (Sutter Instruments), радиусом 40 - 50 нм. Скорость нагружения составляла 100 мкм/с. Топография поверхности соответствует падению ионного тока на 0.5 % от исходного значения, а деформация поверхности для последующего расчета модуля Юнга 1 и 2 % [Kolmogorov, V. S., Erofeev, A. S., Woodcock, E., Efremov, Y. M., Iakovlev, A. P., Savin, N. A., Alova, A. V., Lavrushkina, S. V., Kireev, I. I., Prelovskaya, A. O., Sviderskaya, E. V., Scaini, D., Klyachko, N. L., Timashev, P. S., Takahashi, Y., Salikhov, S. V., Parkhomenko, Y. N., Majouga, A. G., Edwards, C. R. W., Novak, P., Korchev, Y. E., Gorelkin, P. V. Mapping Mechanical Properties of Living Cells at Nanoscale Using Intrinsic Nanopipette- Sample Force Interactions // Nanoscale. 2021.V. 13. P. 6558-6568.]. Чашки с клетками омывали раствором Хенкса (Gibco), и в нем же проводили сканирование образцов. ММАЕ и конъюгат были добавлены в чашки Петри с клетками HepG2 и PC3, в концентрациях, соответствующих IC50. Клетки инкубировали в течение часа, затем проводили измерение.

Механизм ММАЕ заключается в ингибировании полимеризации тубулина. Поэтому, в ходе эксперимента под действием ММАЕ и конъюгата из примера 1 на обеих клеточных линиях наблюдали снижение жесткости клеточной мембраны. При этом, на клетках HepG2, наблюдали снижение модуля Юнга после инкубирования с конъюгатом в 1.6 раз более интенсивное, чем после обработки немодифицированным монометил ауристатином Е. В случае эксперимента на клетках PC3, такую значительную разницу в снижении жесткости клеточной мембраны для двух веществ не фиксировали (фиг. 1).

Пример 11. Измерение цитотоксичности

В данной работе использовали клеточную линию HepG2. Клетки культивировали в матрасиках T25 в CO2 инкубаторе при 5% СО2 и температуре 37°С. Клетки высаживали в 96-луночные планшеты. Для подсчета клеток использовали автоматический счетчик клеток EVE. Через 24 часа после посадки в среду к клеткам добавляли тестируемые конъюгаты в различных концентрациях и инкубировали их в течение 72 часов. После этого из лунок удаляли культуральную среду и добавляли к клеткам смесь среды с МТС реагентом (CellTiter 96 AQueous Non- Radioactive Cell Proliferation Assay, Promega) из расчета 20 мкл МТС на 100 мкл ростовой среды. Клетки инкубировали в течение 4 часов в темноте в СО2-инкубаторе. Оптическую плотность полученных растворов измеряли при длине волны 490 нм с помощью спектрофотометра Thermo Scientific Multiskan GO. В качестве отрицательного контроля использовали клетки, инкубировавшиеся в культуральной среде, в качестве положительного контроля - клетки, инкубировавшиеся в среде с добавлением 20% ДМСО. Выживаемость клеток, инкубировавшихся с конъюгатами, рассчитывали как процент относительно клеток, культивировавшихся в ростовой среде. Значение поглощения MTС реагента в культуральной среде без клеток принимали равным нулю.

По полученным данным (табл. 1) можно сделать вывод о том, что конъюгаты хоть и немного уступают по цитотоксичности немодифицированному ММАЕ, но находятся на уровне с используемым в клинической практике препаратом аналогичного действия Колхицином (IC50(HepG2)= 4.6 ± 0.4 [Fu D.J., Li P., Wu B.W., Cui X.X., Zhao C. bin, Zhang S.Y. Molecular diversity of trimethoxyphenyl-1,2,3-triazole hybrids as novel colchicine site tubulin polymerization inhibitors // Eur. J. Med. Chem. 2019. V. 165. P. 309-322.]).

Таблица 1. Результаты измерения цитотоксичности соединений из примера 1 и 2 и ММАЕ на клеточной линии HepG2. Соединение IC50, мкмоль/л HepG2 MMAE <1 нмоль/л Пример 1 0.11 ± 0.04 Пример 2 0.5 ± 0.2

Конъюгат монометил ауристатина Е с лигандами асиалогликопротеинового рецептора могут быть использованы для приготовления фармацевтических композиций, включающих заявляемый конъюгат и фармацевтически приемлемые носителя для направленного транспорта в опухолевые клетки печени. Для лечения гепатоцеллюлярной карциномы фармацевтическую композицию, включающую конъюгат монометил ауристатина Е с лигандами асиалогликопротеинового рецептора, вводят в терапевтически эффективном количестве. Частоту и длительность введения выбирают в зависимости от характера и степени выраженности заболевания.

«Фармацевтическая композиция» обозначает композицию, включающую в себя соединение формулы 1 и, по крайней мере, один из компонентов, выбранных из группы, состоящей из фармацевтически приемлемых и фармакологически совместимых наполнителей, растворителей, разбавителей, носителей, вспомогательных средств, средств доставки, консерванты, стабилизаторы, наполнители, измельчители, увлажнители, эмульгаторы, суспендирующие агенты, загустители, подсластители, отдушки, ароматизаторы. Примерами подходящих носителей, растворителей, разбавителей и средств доставки являются вода, этанол, полиспирты, а также их смеси, инъекционные органические сложные эфиры (такие, как этилолеат). Фармацевтическая композиция может быть использована для внутримышечного, внутривенного, подкожного, одного или в комбинации с другим активным началом, может быть введена животным и людям в стандартной форме введения, в виде смеси с традиционными фармацевтическими носителями. Пригодные стандартные формы введения включают порошки, гранулы, растворы или суспензии, имплантаты, подкожные, внутримышечные, внутривенные, интраназальные формы введения.

Термин «терапевтически эффективное количество» означает количество действующего вещества, которое (1) лечит или предупреждает конкретное заболевание, состояние или расстройство, (2) ослабляет, улучшает или устраняет один или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, или (3) предупреждает или задерживает наступление одного или более симптомов конкретного заболевания, состояния или расстройства, изложенного в данном описании. Термин «терапевтически эффективное количество» означает такое количество соединения формулы (I), которое достаточно для того, чтобы обеспечить желаемый терапевтический эффект. При этом суточная доза у взрослых обычно составляет 1,0 ~ 500 мг, предпочтительно - 10 ~ 300 мг. Поэтому во время приготовления из фармацевтической композиции лекарственного средства по настоящему изобретению в виде единиц дозировки необходимо учитывать вышеназванную эффективную дозировку, при этом каждая единичная дозировка препарата должна содержать 10 ~ 500 мг соединения общей формулы I предпочтительно - 50 ~ 300 мг. В предпочтительном варианте, терапевтически эффективное количество составляет от 0,01 до 1 мг/кг веса тела субъекта. В соответствии с указаниями врача или фармацевта данные препараты могут приниматься несколько раз в течение определенных промежутков времени (предпочтительно - от одного до шести раз). При этом, дозировка средства, содержащего соединение общей формулы (I), у пациентов может корректироваться в зависимости от терапевтической эффективности и биодоступности заявляемого конъюгата в организме, скорости их обмена и выведения из организма, а также в зависимости от возраста, пола и стадии заболевания пациента.

Похожие патенты RU2809635C1

название год авторы номер документа
ЦИТОТОКСИЧЕСКИЕ ПЕПТИДЫ И ИХ КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО 2012
  • Дороски Мэттью Дэвид
  • Мадерна Андреас
  • О'Доннелл Кристофер Джон
  • Субраманьям Чакрапани
  • Ветелино Бет Купер
  • Душин Рассел Джордж
  • Строп Павел
  • Грациани Эдмунд Идрис
RU2586885C2
НОВЫЕ ДИСПИРО-ИНДОЛИНОНЫ, ИНГИБИТОРЫ MDM2/p53 ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ 2015
  • Иваненков Ян Андреевич
  • Мажуга Александр Георгиевич
  • Белоглазкина Елена Кимовна
  • Белоглазкина Анастасия Александровна
  • Веселов Марк Сергеевич
  • Кукушкин Максим Евгеньевич
RU2629750C2
МОДУЛЯТОРЫ РЕЦЕПТОРА НМДА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ 2012
  • Кхан Амин М.
  • Москал Джозеф
RU2621049C2
ТЕТРАГИДРОФУРО(3,2-b)ПИРРОЛ-3-ОНЫ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ КАТЕПСИНА К 2007
  • Квибелл Мартин
  • Уоттс Джон Пол
RU2456290C2
КОНЪЮГАТ МОНОМЕТИЛ АУРИСТАТИНА Е ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ 2019
  • Мачулкин Алексей Эдуардович
  • Успенская Анастасия Алексеевна
  • Хазанова Елена Сергеевна
  • Рыбалов Алексей Алексеевич
  • Пчелинцев Светозар Олегович
  • Петров Станислав Александрович
  • Бер Антон Петрович
  • Зык Николай Юрьевич
  • Иваненков Ян Андреевич
  • Скворцов Дмитрий Александрович
  • Ерофеев Александр Сергеевич
  • Горелкин Петр Владимирович
  • Белоглазкина Елена Кимовна
  • Мажуга Александр Георгиевич
RU2729192C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ДИСПИРОИНДОЛИНОНОВ 2018
  • Мажуга Александр Георгиевич
  • Белоглазкина Елена Кимовна
  • Иваненков Ян Андреевич
  • Белоглазкина Анастасия Александровна
  • Кукушкин Максим Евгеньевич
  • Барашкин Александр Анатольевич
RU2682678C1
ПРОТИВОВИРУСНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ 2010
  • Дегой Дэвид А.
  • Хатчинс Чарльз В.
  • Кати Уоррен М.
  • Доннер Памела Л.
  • Нельсон Лисса Т.
  • Джинкерсон Тамми К.
  • Кедди Райан Дж.
  • Моттер Кристофер Э.
  • Матуленко Марк А.
  • Крюгер Аллан К.
  • Пател Сачин В.
  • Рандолф Джон Т.
  • Солтведел Тодд Н.
RU2541571C2
ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМБИНАЦИЯ АТИПИЧНОГО АНТИПСИХОТИКА И МОДУЛЯТОРА NMDA ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ШИЗОФРЕНИИ, БИПОЛЯРНОГО РАССТРОЙСТВА, КОГНИТИВНОГО НАРУШЕНИЯ И КЛИНИЧЕСКОЙ ДЕПРЕССИИ 2016
  • Москал Джозеф Р.
  • Мельцер Хеберт
RU2802972C2
АЛКИЛ 2-{ [(2R,3S,5R)-5-(4-АМИНО-2-ОКСО-2Н-ПИРИМИДИН-1-ИЛ)- -ГИДРОКСИ-ТЕТРАГИДРО-ФУРАН-2-ИЛМЕТОКСИ]-ФЕНОКСИ-ФОСФОРИЛАМИНО} -ПРОПИОНАТЫ, НУКЛЕОЗИДНЫЕ ИНГИБИТОРЫ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ HCV NS5B, СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЯ 2013
  • Иващенко Александр Васильевич
RU2534613C2
ПРОЛЕКАРСТВО ПРОИЗВОДНОГО АМИНОКИСЛОТЫ 2017
  • Отаке, Норикадзу
  • Хасихаята, Такаси
  • Мацуда, Йохей
  • Масуда, Сейдзи
  • Ямаути, Юко
RU2739318C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 809 635 C1

Реферат патента 2023 года КОНЪЮГАТЫ МОНОМЕТИЛ АУРИСТАТИНА Е С ЛИГАНДАМИ АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВОГО РЕЦЕПТОРА ДЛЯ НАПРАВЛЕННОГО ТРАНСПОРТА В ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ ПЕЧЕНИ

Изобретение относится к области медицинской химии, а именно к низкомолекулярным конъюгатам противоопухолевого препарата монометил ауристатин Е, в которых действующее вещество соединено с остатком N-ацетилгалактозамина с расщепляемым катепсином В дипептидным линкером валин-цитруллин или нерасщепляемым линкером на основе гекс-5-иновой кислоты. Также предложен способ получения конъюгата и его применение для приготовления фармацевтической композиции для лечения гепатоцеллюлярной карциномы. Конъюгаты характеризуются большей эффективностью по отношению к ASGPR-экспрессирующей клеточной линии (HepG2), а также обладают цитотоксичностью, находящейся на уровне с применяемыми в клинической практике препаратами аналогичного действия, и являются стабильными в условиях, имитирующих физиологические (pH 5.0 и 7.4), но подвергаются гидролизу под действием смеси ферментов Проназы. 3 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 11 пр.

Формула изобретения RU 2 809 635 C1

1. Конъюгат противоопухолевого препарата монометил ауристатина Е с низкомолекулярными органическими соединениями – лигандами асиалогликопротеинового рецептора, представленный общей формулой (I)

(I),

где Лиганд - это соединение формулы или

,

где l = от 0 до 2, m = от 1 до 10, o = от 1 до 3,

Линкер - это соединение формулы ,

где Y = Val, Phe, Ala, Z = Cit, Arg, n = от 1 до 6, p = от 0 до 1.

2. Способ получение конъюгата по п. 1, характеризующийся тем, что проводят Cu(I)-катализируемую реакцию азидо-алкинового циклоприсоединения, где в качестве исходных соединений используют производное монометил ауристатина Е, содержащее терминальную тройную связь и лиганд асиалогликопротеинового рецептора, содержащий азидо-группу, при этом растворы веществ смешивают в таких количествах, чтобы на 1.0 мольный эквивалент производного ММАЕ приходилось не менее 1.0 мольного эквивалента лиганда, после проведения реакции удаляют Cu (I) из реакционной смеси, полученный продукт выделяют с помощью обращенно-фазовой колоночной хроматографии.

3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве лиганда асиалогликопротеинового рецептора используют производное N-ацетилгалактозамина.

4. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что для растворения исходных веществ используют растворители, обеспечивающие их растворение, и инертные к компонентам смеси.

5. Способ по п. 4, характеризующийся тем, что для растворения используют ДМФА, ДМСО.

6. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве катализатора для проведения реакции используют соединения одновалентной меди, взятые в количестве не менее 0.5 мольных эквивалентов на 1.0 мольный эквивалент производного ММАЕ.

7. Способ по п. 6, характеризующийся тем, что в качестве соли одновалентой меди используют CuCl, CuI, CuBr.

8. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве основания используют третичный амин, выбранный из группы, включающей триэтиламин, диизопропиламин.

9. Способ по п. 8, характеризующийся тем, что основание берут в количестве не менее 8.8 мольных эквивалентов на 1.0 мольный эквивалент производного ММАЕ.

10. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что для удаления Cu (I) в реакционную смесь добавляют ЭДТА или динатриевую соль ЭДТА.

11. Способ по п. 10, характеризующийся тем, что ЭДТА или динатриевую соль ЭДТА добавляют в мольном соотношении 1:1 к добавленному катализатору.

12. Применение конъюгата общей формулы (I) по п.1 для приготовления фармацевтической композиции для лечения гепатоцеллюлярной карциномы.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2809635C1

Подъемное устройство для ремонта дверец коксовых печей 1933
  • Городинский О.Л.
SU35987A1
US 20210220477 A1, 22.07.2021
Композиция системы доставки на основе конъюгата для доставки полинуклеотида РНК-интерференции в клетку печени и способ ее получения 2011
  • Розема Дэвид Б.
  • Льюис Дэвид Л.
  • Вэйкфилд Даррен Х.
  • Китас Эрик А.
  • Хадвигер Филипп
  • Волф Джон А.
  • Роэль Инго
  • Мор Питер
  • Хофманн Торстен
  • Жан-Хоффман Керстин
  • Мюллер Ханс Мартин
  • Отт Гюнтер
  • Блохин Андрей В.
  • Бенсон Джонатан Д.
  • Карлсон Джеффри С.
RU2623160C9
НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЛИГАНДЫ АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВОГО РЕЦЕПТОРА НА ОСНОВЕ ХИНОЛИН-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ 2020
  • Маклакова Светлана Юрьевна
  • Лопухов Антон Владимирович
  • Петров Ростислав Александрович
  • Ямансаров Эмиль Юлаевич
  • Клячко Наталья Львовна
  • Белоглазкина Елена Кимовна
  • Мажуга Александр Георгиевич
RU2769859C1
Reshitko, G
S
et al "Synthesis and Evaluation of New Trivalent Ligands for Hepatocyte Targeting via the Asialoglycoprotein Receptor", 2020, Bioconjugate Chemistry, 31(5), 1313-1319
Petrov, R
A
et al "Synthesisand biological

RU 2 809 635 C1

Авторы

Маклакова Светлана Юрьевна

Мажуга Мария Павловна

Ванеев Александр Николаевич

Колмогоров Василий Сергеевич

Ямансаров Эмиль Юлаевич

Горелкин Петр Владимирович

Ерофеев Александр Сергеевич

Мажуга Александр Георгиевич

Белоглазкина Елена Кимовна

Даты

2023-12-14Публикация

2022-10-10Подача