НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ЛИГАНДЫ АСИАЛОГЛИКОПРОТЕИНОВОГО РЕЦЕПТОРА НА ОСНОВЕ ХИНОЛИН-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ Российский патент 2022 года по МПК C07D215/14 C07D215/18 A61K31/47 A61K47/22 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области органической и медицинской химии и касается синтеза соединений, предназначенных для направленного транспорта лекарственных препаратов в клетки печении с помощью молекул, способных связываться с трансмембранным белком асиалогликопротеином. Предложенные вещества могут быть применены для увеличения селективности известных препаратов, например, путем создания их пролекарств или путем модификации их носителей (мицелл, липосом, наночастиц и т.д.).

Уровень техники

Разработка систем для направленного транспорта действующего вещества в очаг заболевания - один из способов совершенствования существующих препаратов, позволяющий скорректировать их фармакологический профиль, улучшить биодоступность, и, как следствие, увеличить эффективность и безопасность лечения в целом. Развитие молекулярной биологии и открытие ряда специфических поверхностных рецепторов позволило предложить системы направленного транспорта лекарственных средств, нацеленные на конкретную молекулярную мишень. В данном случае тропность системы доставки достигается за счет введения в нее адресных фрагментов, способных селективно взаимодействовать с рецептором. В качестве таких адресных (векторных) фрагментов находят применение низкомолекулярные соединения, пептиды, аптомеры, антитела, которые либо используют для модификации поверхности наноносителя, либо получают на их основе ковалентные конъюгаты с действующим веществом.

Существует ряд рецепторов, располагающихся на поверхности гепатоцитов и клеток гепатоцеллюлярной карциномы, которые используют как мишени для направленного транспорта препаратов, например, рецепторы глицирретиновой кислоты, фолатный рецептор и др. [Wang Y., Du H., Zhai G. Recent advances in active hepatic targeting drug delivery system // Curr. Cancer Drug Targets. - 2014. - V. 15. - №6. - P. 573-599; Ivanenkov Y.A. et al. Development of liver cell-targeted drug delivery systems: experimental approaches // Russ. Chem. Rev. - 2017. - V. 86. - №8. - P. 750-776]. Наиболее часто для этих целей находит применение асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR). Его биологическая роль заключается в поддержании баланса десиалированных гликопротеинов в сыворотке крови, обеспечивая их распознавание, захват и эндоцитоз. ASGPR в больших количествах представлен на поверхности паренхимных клеток печени и клеток гепатоцеллюлярной карциномы и минимально на поверхности других типов клеток, в связи с чем является прекрасной мишенью для направленного транспорта. Так, в 2019 году FDA (Food and Drug Administration - управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных препаратов США) был одобрен GIVLAARI™ (givosiran, Alnylam Pharmaceuticals) - препарат для генной терапии острой печеночной порфирии и яркий пример терапевтического средства, для которого избирательное проникновение в целевые клетки достигается благодаря связыванию с ASGPR. Идея была подхвачена конкурирующими фирмами, и на сегодня на поздних стадиях клинических испытаний находятся более 5 подобных препаратов для лечения иных заболеваний печени.

Природными лигандами асиалогликопротеинового рецептора являются асиалооросомукоид и асиалофетуин. Оба гликопротеина - высокомолекулярные разветвленные соединения с несколькими терминальными остатками D-галактозы (Gal) и N-ацетил-D-галактозамина (GalNAc), которые и обеспечивают взаимодействие с сайтом связывания ASGPR. Синтетические лиганды ASGPR, подобные асиалооросомукоиду и асиалофетуину, с двумя и более концевыми фрагментами Gal или GalNAc, называют многовалентными (multivalent ligands) [Huang X., Leroux J. C., Castagner B. Well-defined multivalent ligands for hepatocytes targeting via asialoglycoprotein receptor // Bioconjugate Сhem. - 2017. - V. 28. - №2. - P. 283-295]. Известно, что аффинность по отношению к рецептору возрастает в ряду моно-<би-<три- (тетра-валентные лиганды [Lee R. T., Lee Y. C. Affinity enhancement by multivalent lectin-carbohydrate interaction // Glycoconjugate J. - 2000. - V. 17. - P. 543-551]. При этом, константы диссоциации комплекса соединение-рецептор (K_D) три- и тетра-гликозилированных соединений как правило лежат в наномолярномом диапазоне, тогда как K_D моновалентных лигандов редко бывают ниже 1 мкМ [Stokmaier D. et al. Design, synthesis and evaluation of monovalent ligands for the asialoglycoprotein receptor (ASGP-R) // Bioorg. Med. Chem. - 2009. - V. 17. - №20. - P. 7254-7264]. Поскольку синтез многовалентных лигандов ASGPR разветвленного строения весьма трудоемкий, актуальной задачей является поиск альтернативных низкомолекулярных соединений, способных также эффективно связываться с рецептором. Тем не менее, публикации, посвященные разработке более простых селективных и аффинных моновалентных лигандов ASGPR, крайне немногочисленны [Iobst S. T., Drickamer K. Selective sugar binding to the carbohydrate recognition domains of the rat hepatic and macrophage asialoglycoprotein receptors // J. Biol. Chem. - 1996. - V. 271. - №12. - P. 6686-6693; Wong T. C., Townsend R. R., Lee Y. C. Synthesis of D-galactosamine derivatives and binding studies using isolated rat hepatocytes // Carbohydrate res. - 1987. - V. 170. - №1. - P. 27-46; Stokmaier D. et al. Design, synthesis and evaluation of monovalent ligands for the asialoglycoprotein receptor (ASGP-R) // Bioorg. Med. Chem. - 2009. - V. 17. - №20. - P. 7254-7264; Mamidyala S. K. et al. Glycomimetic ligands for the human asialoglycoprotein receptor // J. Am. Chem. Soc. - 2012. - V. 134. - №4. - P. 1978-1981; Sanhueza C. A. et al. Efficient liver targeting by polyvalent display of a compact ligand for the asialoglycoprotein receptor // J. Am. Chem. Soc. - 2017. - V. 139. - №9. - P. 3528-3536]. Все перечисленные работы направлены на синтез производных D-галактозы и N-ацетил-D-галактозамина. Так, например, в статье 2012 года [Mamidyala S. K. et al. Glycomimetic ligands for the human asialoglycoprotein receptor // J. Am. Chem. Soc. - 2012. - V. 134. - №4. - P. 1978-1981] авторы исследовали 82 соединения, варьируя заместители в первом, втором и пятом положениях пиранозного цикла GalNAc (Схема 1). Они установили, что замена ацетамидной группы во втором положении на трифторацетамидную увеличивает сродство к рецептору, такой же эффект оказывает замена гидроксильной группы в первом положении на аллильный фрагмент.Объемные заместители в шестом положении не сильно ухудшают связывание, а иногда даже улучшают его. В итоге авторам удалось получить ряд высоко аффинных лигандов ASGPR с субмикромолярными значениями констант диссоциации комплекса рецептор-лиганд. Некоторые из соединений, синтезированных в статье, представлены на схеме 1 [Mamidyala S. K. et al. Glycomimetic ligands for the human asialoglycoprotein receptor // J. Am. Chem. Soc. - 2012. - V. 134. - №4. - P. 1978-1981], под каждым соединением показана константа диссоциации комплекса рецептор-лиганд, измеренная методом поверхностного плазмонного резонанса (K_D, мкМ).

Схема 1

Этот же коллектив авторов в 2017 году предложил новый «компактный» лиганд ASGPR, представляющий собой бициклический ацеталь (Схема 2) [Sanhueza C. A. et al. Efficient liver targeting by polyvalent display of a compact ligand for the asialoglycoprotein receptor // J. Am. Chem. Soc. - 2017. - V. 139. - №9. - P. 3528-3536]. На схеме представлены A - лиганды ASGPR, предложенные в статье [Sanhueza C. A. et al. Efficient liver targeting by polyvalent display of a compact ligand for the asialoglycoprotein receptor // J. Am. Chem. Soc. - 2017. - V. 139. - №9. - P. 3528-3536], и указана константа диссоциации комплекса рецептор-лиганд (K_D, мкМ), измеренная методом поверхностного плазмонного резонанса. B - суперпозиция двух структур: предложенного лиганда и GalNAc.

Схема 2

Из лигандов асиалогликопротеинового рецептора, которые не являются производными углеводов, известны 3-гидроксихинолин-4-карбоновые кислоты, описанные в работе [Маклакова С.Ю., Лиганды асиалогликопротеинового рецептора и конъюгаты на их основе с терапевтическими и диагностическими агентами: дис.на соискание ученой степени канд. хим. наук: 02.00.03. - МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 2018 - 116 с.], например, соединение (1).

(1)

Структура соединения (1) была разработана исходя из схожести с лигандами Р-селектина - белка, изоструктурного асиалогликопротеиновому рецептору. Так, по аналогии с лигандами P-селектина, описанными в работе [Kaila N., et al. 2-(4-Chlorobenzyl)-3-hydroxy-7, 8, 9, 10-tetrahydrobenzo [H] quinoline-4-carboxylic acid (PSI-697): identification of a clinical candidate from the quinoline salicylic acid series of P-selectin antagonists // J. Med. Chem. - 2007. - V. 50. - №1. - P. 40-64], в третье положение хинолин-4-карбоновой кислоты была введена гидроксильная группа, во второе - п-хлорбензильная, а в четвертое - карбоксильная. Это позволило достичь неплохого связывания с рецептором (K_D 2-(4-хлорбензил)-8-бром-3-гидроксихинолин-4-карбоновой кислоты (1) равна 327 нМ, в то время как K_D N-ацетил-D-галактозамина – 448⋅10³ нМ). Синтез 3-гидроксихинолин-4-карбоновых кислот проводят по методу Пфитцингера. В качестве исходных соединений используют подходящие изатины и подходящие α-замещенные карбонильные соединение. В работе [Маклакова С.Ю., Лиганды асиалогликопротеинового рецептора и конъюгаты на их основе с терапевтическими и диагностическими агентами: дис.на соискание ученой степени канд. хим. наук: 02.00.03. - МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, 2018 - 116 с.] для получения соединения (1) в качестве карбонильной компоненты использовали 3-(4-хлорфенил)-2-оксопропил ацетат.Его синтезировали из коммерчески доступной п-хлорфенилуксусной кислоты в три стадии. Таким образом, получение хинолин-4-кароновых кислот с гидроксильной группой в третьем положении требует проведения дополнительных стадий (синтез α-замещенных карбонильных соединений), что осложняет их синтез.

Ранее в работе [Majouga A.G., et al. Identification of novel Small-molecule ASGP-R ligands // Curr. Drug Deliv. - 2016. - V. 13. - №8. - P. 1303-1312] в число наиболее аффинных по отношению к ASGPR соединений вошла 2-(4-хлорфенил)хинолин-4-карбоновая кислота (2), которая продемонстрировала лучшее связывание с асиалогликопротеиновым рецептором, чем природный лиганд - D-галактоза (константы диссоциации комплекса рецептор-лиганд, определенные методом ППР, для данных соединений составили 761 и 8820 мкM, соответственно). 2-(4-Хлорфенил)хинолин-4-карбоновая кислота - прототип настоящего изобретения.

(2)

Данное соединение получают по методу Пфитцингера из п-хлорацетофенона и изатина [Nicolai E. et al. Synthesis and aldose reductase inhibitory activity of N-(quinolinyl thiocarbonyl) glycine derivatives // Europ.J. Med. Chem. - 1992. - V. 27. - №9. - P. 977-984; Kaoud T. S. et al. NO-releasing STAT3 inhibitors suppress BRAF-mutant melanoma growth // Europ.J. Med. Chem. - 2020. - V. 186. - P. 111885; More P. A., Shankarling G. S. Energy efficient Pfitzinger reaction: a novel strategy using a surfactant catalyst // New J. Chem. - 2017. - V. 41. - №21. - P. 12380-12383] или по методу Дебнера из п-хлорбензальдегида, пировиноградной кислоты и анилина, но выход продукта в данном случае ниже [Wang L. M. et al. One-pot synthesis of quinoline-4-carboxylic acid derivatives in water: Ytterbium perfluorooctanoate catalyzed Doebner reaction // J. Fluorine Chem. - 2009. - V. 130. - №4. - P. 406-409; Muscia G. C. et al. Microwave‐assisted Döbner synthesis of 2‐phenylquinoline‐4‐carboxylic acids and their antiparasitic activities // J. Heterocyclic Chem. -2008. - V. 45. - №2. - P. 611-614].

К преимуществам соединения (2) стоит отнести доступность и дешевизну исходных соединений, однако, в его структуре отсутствует функциональная группа, по которой данную молекулу можно было бы соединять с лекарственным препаратом, соответственно, его использование в качестве молекулы-вектора невозможно. Кроме того, 2-(4-хлорфенил)хинолин-4-карбоновая кислота (2) связывается с рецептором хуже, чем наиболее часто используемый для этих целей N-ацетил-D-галактозамин.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является синтез соединений неуглеводной природы, способных эффективно связываться с асиалогликопротеиновым рецептором. Кроме того, данные соединения должны быть пригодны для использования в качестве векторных фрагментов в системах направленного транспорта, то есть они должны содержать функциональную группу, по которой можно проводить их модификацию.

Раскрытие изобретения

Заявляемое изобретение представляет собой модификацию хинолин-4-карбоновой кислоты общей формулы (I), которая проявляет более высокую аффинность по отношению к асиалогликопротеиновому рецептору (константы диссоциации комплекса соединение-рецептор менее 20 нМ) для связывания с терапевтическими и диагностическими агентами.

Проставленная цель достигается с помощью лигандов общей формулы (I):

(I)

где R=8-Br, 8-I, 8-C≡CH, 6-I, 6-C≡CH

которые могут быть получены из коммерчески доступных галоген замещенных изатинов и 4-метоксиацетофенона.

Способ получения галоген замещенных хинолин-4-карбоновых кислот, заключается в проведении реакции Пфитцингера путем добавления к подходящему изатину, нагретому до температуры не менее 80°С в водном растворе щелочи с концентрацией не менее 6 М, раствора 4-метоксиацетофенона в органическом растворителе, взятого из расчета, что на 1.0 мольный эквивалент изатина берут не менее 1.0 эквивалента 4-метоксиацетофенона. Предпочтительно в качестве изатинов использовать 7-бром-, 7-йод- или 5-йодизатин. В качестве щелочи для создания среды для протекания реакции предпочтительно использовать KOH или NaOH. В качестве органического растворителя предпочтительно использовать 1,3-диоксан или этанол. Реакцию предпочтительно проводить при температуре 80°С-100°С в течение не менее 3 часов. Выделение продукта предпочтительно проводить путем разбавления реакционной смеси водой и отделением образовавшегося осадка, последующего подкисления фильтрата с помощью 1 М раствора HCl, отфильтровывания продукта и его высушивания на воздухе. Далее, предпочтительно проведение дополнительной очистки продукта колоночной хроматографией в системе EtOAc:MeOH:MeCN, 7:0.25:0.5 (по объему) с добавлением 0.5об% Et₃N.

Способ получения 6- и 8-этинил-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновых кислот заключается в проведении для синтезированных по вышеописанному способу йод замещенных хинолин-4-карбоновых кислот реакции Соногаширы путем перемешивания в ДМФА при температуре не менее 60°С в течение не менее 6 часов соответствующей хинолин-4-карбоновой кислоты и алкина, взятых из расчета, что на 1.0 мольный эквивалент хинолин-4-карбоновой кислоты берут не менее 1.0 эквивалента алкина, в присутствии основания, йодида одновалентной меди и каталитической системы на основе палладия. При этом в качестве хинолин-4-карбоновой кислоты предпочтительно использовать 6-йод-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновую кислоту или 8-йод-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновую кислоту. В качестве алкина предпочтительно использовать этинилтриметилсилан, этинилтриизопропилсилан, этинилтриэтилсилан. В качестве основания предпочтительно использовать триэтиламин или диизопропилэтиламин. В качестве каталитической системы на основе палладия предпочтительно использовать Pd(Ph₃P)₄ или Pd(Ph₃P)₂Cl₂ в присутствии Ph₃P. Для выделения промежуточного продукта предпочтительно использовать колоночную хроматографию в системе EtOAc:MeOH:MeCN, 7:0.25:0.5 (по объему) с добавлением 0.5об% Et₃N. Для удаления защитной группы предпочтительно использовать раствор TBAF (фторид тетрабутиламмония) в тетрагидрофуране.

Осуществление изобретения

Ниже приведены определения терминов, которые используются в описании настоящего изобретения.

«Асиалогликопротеиновый рецептор (ASGPR)» - трансмембранный белок, преимущественно экспрессируемый гепатоцитами, распознающий производные D-галактозы и N-ацетил-D-галактозамина и участвующий в их транспорте в клетку.

«Конъюгат» - комплекс, формирующийся при помощи ковалентных связей между лекарственным соединением и лигандом-носителем.

«Лиганд» - химическое соединение, которое образует нековалентный комплекс с той или иной биомолекулой (чаще всего белком, например, клеточным рецептором, но иногда, например, с ДНК) и производит, вследствие такого связывания, те или иные биохимические, физиологические или фармакологические эффекты.

Все используемые реагенты являются коммерчески доступными, выпаривание растворителя осуществляли с использованием роторного испарителя, при пониженном давлении при температуре бани примерно 40 °С; контроль за ходом реакции и хроматографическим разделением осуществляли при помощи тонкослойной хроматографии (ТСХ), и время реакции указано только для иллюстрации; структуру и чистоту всех выделенных соединений подтверждали, по меньшей мере, одним из следующих методов: ТСХ (пластины для ТСХ с предварительно нанесенным силикагелем 60 F₂₅₄ Merck), масс-спектрометрия или ядерный магнитный резонанс (ЯМР). Выход продукта приведен только для иллюстрации. Колоночную флэш-хроматографию осуществляли, используя Merck силикагель 60 (230-400 меш ASTM). Спектры ЯМР регистрировали на приборах Bruker Avance-400 (рабочая частота 400.1 и 100.6 МГц для ¹H и ¹³C, соответственно), используя дейтерированный хлороформ (99.8% D) или метанол (99.9%) или ДМСО (99.9% D) в качестве растворителя, если не указано иное, относительно тетраметилсилана в качестве внутреннего стандарта, миллионных долях (м.д.); обычные используемые сокращения следующие: с - синглет, д - дублет, т - триплет, кв - квартет, м - мультиплет, шир. - широкий и так далее.

Синтез галоген замещенных хинолин-4-карбоновых кислот осуществляют, основываясь на методе Пфитцингера. Реакцию проводят путем добавления к подходящему изатину, предварительно нагретому в щелочной среде, раствора 4-метоксиацетофенона в органическом растворителе и последующим перемешиванием и нагреванием реакционной смеси. По прошествии 3 и более часов в реакцию добавляют воду и удаляют нерастворимые в водном щелочном растворе побочные продукты фильтрованием. Продукт выделяют путем его осаждения из фильтрата действием 1 М раствора соляной кислоты. При необходимости проводят дополнительную очистку продукта с помощью колоночной хроматографии с использованием в качестве элюента системы EtOAc:MeOH:MeCN, 7:0.25:0.5 (по объему) с добавлением 0.5об% Et₃N.

В качестве изатинов используют 7-бром-, 7-йод- или 5-йодизатин.

В качестве щелочной среды для протекания реакции используют водные растворы KOH или NaOH предпочтительно с концентрацией 6-12 М.

В качестве органического растворителя используют 1,3-диоксан или этанол.

Синтез 6- и 8-этинил-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновых кислот осуществляют по реакции Соногаширы с использованием в качестве исходного реагента синтезированных по вышеописанному способу йод замещенных хинолин-4-карбоновых кислот.В качестве алкиновой компоненты используют триалкилсилилацетилены. После проведения кросс-сочетания защитную группу удаляют действием TBAF. Реакцию Соногаширы осуществляют путем перемешивания при температуре не менее 60 °С в течение не менее 6 часов соответствующей хинолин-4-карбоновой кислоты и алкина в ДМФА в присутствии основания, йодида меди (I) и каталитической системы на основе палладия. Для выделения промежуточного продукта с защитной силильной группой используют колоночную хроматографию в системе EtOAc:MeOH:MeCN, 7:0.25:0.5 (по объему) с добавлением 0.5об% Et₃N. Конечный продукт после элиминирования защитной группы действием TBAF в ТГФ выделяют осаждением из водного раствора. ТГФ предварительно удаляют при пониженном давлении.

При этом в качестве алкина используют этинилтриметилсилан, этинилтриизопропилсилан, этинилтриэтилсилан. Допустимо использование других триалкилсилилацетиленов, которые являются защищенной формой терминальных алкинов.

В качестве основания используют триэтиламин или диизопропилэтиламин.

В качестве каталитической системы на основе палладия используют Pd(Ph₃P)₄ или Pd(Ph₃P)₂Cl₂ в присутствии Ph₃P.

Синтез конъюгатов терапевтических и диагностических препаратов с разработанными лигандами осуществляют по реакции Cu(I)-катализируемого азидо-алкинового циклоприсоединения с использованием в качестве исходных соединений 6- и 8-этинил-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновых кислот.Реакцию проводят путем смешения лиганда, содержащего терминальный алкильный фрагмент, и предварительно синтезированного производного препарата, содержащего азидогруппу. Реагенты берут в таких количествах, чтобы на 1.0 мольный эквивалент лиганда приходился по меньшей мере 1.0 эквивалент соединения с азидогруппой. Реакцию проводят в присутствии катализатора - соединения одновалентной меди, взятого в количестве по меньшей мере 0.25 эквивалента катализатора на 1.0 мольный эквивалент лиганда. Реакцию проводят в среде, обеспечивающей растворение компонентов. После прохождения реакции продукт выделяют при помощи колоночной хроматографии.

При этом в качестве среды, обеспечивающей растворение соединений, используют ДМФА, ДМСО, смесь ацетонитрил-триэтиламин или любой другой растворитель, обеспечивающий растворение и инертный к компонентам смеси.

В качестве соединения, содержащего терминальный алкильный фрагмент, используют 6- или 8-этинил-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновые кислоты.

В качестве соединений, содержащих азидогруппу, используют производные терапевтических и диагностических препаратов, которые получают модификацией молекулы препарата по доступной функциональной группе (карбоксильной, гидроксильной, аминогруппе) спиртами, аминами, карбоновыми кислотами с азидогруппой. Длина углеродного фрагмента спирта, амина, кислоты не имеет принципиального значения, в качестве перечисленных соединений могут выступать: 2-азидоэтанол-1, 3-азидопропанол-1, 3-азидо-1-аминопропан, 3-азидо-1-аминопропан, 6-азидогексановая кислота, 11-азидоундекановая кислота и т.д.

В качестве катализатора - соединения одновалентной меди используют любую растворимую в среде, обеспечивающей прохождение реакции, соль одновалентной меди. Например, CuI, CuBr, CuCl и т.д.

Для выделения полученного продукта используют две последовательные колоночные хроматографии: колоночную хроматографию в системе EtOAc:MeOH:MeCN, 7:0.25:0.5 (по объему) с добавлением 0.5об% Et₃N и обращено-фазовую колоночную хроматографию в системе H₂O-MeCN.

В качестве терапевтических препаратов могут быть использованы препараты, которые могут быть модифицированы азидоаминами и азидоспиртами по карбоксильной группе (ибупрофен, флурбирофен, метотрексат), которые могут быть модифицированы по гидроксильной группе азидокислотами (паклитаксел, доцетаксел, гемцитабин, рибавирин, цитарабин, азацитидин), которые могут быть модифицированы по аминогруппе азидокислотами (доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, даунорубицин).

В качестве диагностических препаратов могут быть использованы азиды флуоресцентных красителей (борфторидных комплексов дипирролилметена (BODIPY), флуоресцеинов, цианиновых красителей) такие как: Cyanine5 азид, FAM (флуоресцеин) азид, Sulfo-Cyanine5 азид, Sulfo-Cyanine7 азид.

Верхняя граница содержания используемых реагентов не ограничивается, т.к. избыток какого-либо реагента не уменьшает выходов реакций, однако при большом избытке может понадобиться дополнительная очистка продуктов реакций.

Представленные ниже примеры иллюстрируют, но не ограничивают настоящее изобретение.

Пример 1. Получение 8-бром-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновой кислоты

В круглодонную колбу на 10 мл, снабженную обратным холодильником, помещали 500 мг 7-броминдолин-2,3-диона (2.2 ммоль) в 2 мл 10 М водного раствора KOH и нагревали до 80°С. В 0.5 мл диоксана растворяли 430 мг (2.9 ммоль) 1-(4-метоксифени)этан-1-она и добавляли в реакционную смесь небольшими порциями в течение 15 минут.После этого реакционную смесь нагревали с обратным холодильником в течение 4 ч. Затем охлаждали до комнатной температуры, верхний органический слой отделяли, добавляли 10 мл воды и отфильтровывали выпавший осадок через пористый стеклянный фильтр. Фильтрат подкисляли до рН 1 с помощью 1 М водного раствора HCl. Осадок собирали фильтрованием, промывали водой и высушивали до сыпучего состояния. Дополнительную очистку не проводили. Получали 569 мг (72%) целевого соединения в виде светло-желтого кристаллического вещества.

¹H ЯМР (δ, м.д., ДМСО-d₆): δ 8.59 (дд, J=8.5, 1.1 Гц, 1H), 8.50 (с, 1H), 8.37 (д, J=8.9 Гц, 2H), 8.21 (дд, J=7.5, 1.1 Гц, 1H), 7.55 (дд, J=8.5, 7.5 Гц, 1H), 7.14 (д, J=8.9 Гц, 2H), аром.; 3.86 (с, 3H, OCH₃).

¹³C ЯМР (δ, м.д., ДМСО-d₆): δ 167.4, 161.3, 156.0, 144.8, 138.5, 133.8, 129.8, 129.0, 127.8, 125.5, 124.8, 124.5, 119.2, 114.5, 55.4.

Масс-спектр высокого разрешения: рассчитано для C₁₇H₁₃BrNO₃ [M+Н]⁺, m/z - 358.0073; найдено - 358.0065.

Пример 2. Получение 6-йод-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновой кислоты

В круглодонную колбу на 25 мл, снабженную обратным холодильником, помещали 1.13 г 5-йодиндолин-2,3-диона (4.1 ммоль) в 5 мл 6 М водного раствора KOH и нагревали до 80 °С. В 10 мл этанола растворяли 0.61 г (4.1 ммоль) 1-(4-метоксифени)этан-1-она и добавляли в реакционную смесь четырьмя порциями в течение 30 минут.После этого реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 3 ч. Затем охлаждали до комнатной температуры, этанол удаляли при пониженном давлении. Добавляли 10 мл воды и отфильтровывали выпавший осадок через пористый стеклянный фильтр. Фильтрат подкисляли до рН 1 с помощью 1 М водного раствора HCl. Осадок собирали фильтрованием, промывали водой и высушивали до сыпучего состояния. Дополнительную очистку не проводили. Получали 1.14 г (68%) целевого соединения в виде светло-желтого кристаллического вещества.

¹Н ЯМР (δ, м.д., ДМСО-d₆): 9.08 (д, J=1.8 Гц, 1H), 8.45 (с, 1H), 8.26 (д, J=8.8 Гц, 2H), 8.07 (дд, J=8.8, 1.9 Гц, 1H), 7.88 (д, J=8.8 Гц, 1H), 7.11 (д, J=8.9 Гц, 2H), аром.; 3.85 (с, 3H, OCH₃).

Масс-спектр высокого разрешения: рассчитано для C₁₇H₁₃INO₃ [M+Н]⁺, m/z - 405.9935; найдено - 405.9928.

Пример 3. Получение 8-йод-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновой кислоты

В круглодонную колбу на 10 мл, снабженную обратным холодильником, помещали 151 мг (0.56 ммоль) 7-йодиндолин-2,3-диона в 2 мл 6 М водного раствора KOH и нагревали до 100 °С. В 1 мл этанола растворяли 106 мг (0.7 ммоль) 1-(4-метоксифени)этан-1-она и добавляли в реакционную смесь порциями. После этого реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 4 ч. Затем охлаждали до комнатной температуры, и удаляли растворители при пониженном давлении. Остаток растворяли в воде и отфильтровали образовавшийся осадок через пористый стеклянный фильтр. Фильтрат подкисляли до рН 1 с помощью 1 М водного раствора HCl. Осадок собирали фильтрованием, промывали водой и высушивали. Дополнительную очистку проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. В качестве элюента брали смесь EtOAc:MeOH:MeCN, 7:0.25:0.5 (по объему) с добавлением 0.5об% Et₃N. Выделенную фракцию упаривали и получали триэтиламмонийную соль целевого вещества. Последнюю растворяли в смеси ацетонитрил-вода (1:4 по объему), добавляли 1 М водный раствор HCl до установления pH 1 и собирали продукт фильтрованием, промывали водой, высушивали осадок на воздухе до сыпучего состояния. Получали 85 мг (38%) 8-йод-2-(4-метоксифенил)-хинолин-4-карбоновой кислоты в виде желтого кристаллического вещества.

¹Н ЯМР (δ, м.д., ДМСО-d₆): 8.59 (д, J=8.2 Гц, 1H), 8.49 - 8.31 (м, 4H), 7.39 (т, J=7.7 Гц, 1H), 7.14 (д, J=8.1 Гц, 2H) аром.; 3.86 (с., 3H, OCH₃).

Масс-спектр высокого разрешения: рассчитано для C₁₇H₁₃INO₃ [M+Н]⁺, m/z - 405.9935; найдено - 405.9933.

Пример 4. Получение 6-этинил-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновой кислоты

6-Йод-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбновую кислоту (100 мг, 0.25 ммоль), Pd(Ph₃P)₄ (14 мг, 0.01 ммоль), CuI (5 мг, 0.025 ммоль), растворяли в ДМФА, добавляли триэтиламин (172 мкл, 1.20 ммоль) и перемешивали в течение 1 ч. После добавляли триметилсилилацетилен (50 мкл, 0.37 ммоль) и реакционную смесь перемешивали при 80 °С в течение 8 часов. После этого реакционную смесь охлаждали и фильтровали через слой целита, концентрировали при пониженном давлении. Растворяли остаток в этилацетате и промывали водой и насыщенным раствором NaCl. Сушили над безводным Na₂SO₄, растворитель удаляли при пониженном давлении. Дополнительную очистку проводили с помощью колоночной хроматографии на силикагеле. В качестве элюента брали смесь EtOAc:MeOH:MeCN, 7:0.25:0.5 (по объему) с добавлением 0.5об% Et₃N. Выделенную фракцию упаривали, растворяли в 3 мл ТГФ и добавляли 300 мкл 1 М раствора TBAF в ТГФ. Перемешивали реакционную смесь в течение 4 часов. Удаляли растворитель при пониженном давлении. Остаток растворяли в смеси ацетонитрил-вода (1:4 по объему) и добавляли 1 М раствор HCl до установления pH 1. Собирали продукт фильтрованием, промывали водой, высушивали осадок на воздухе до сыпучего состояния.

¹H ЯМР (δ, м.д., ДМСО-d₆): 8.80 (с, 1H), 8.45 (с, 1H), 8.27 (д, J=8.5 Гц, 2H), 8.08 (д, J=8.6 Гц, 1H), 7.81 (д, J=8.7 Гц, 1H), 7.11 (д, J=8.5 Гц, 3H), аром., 4.43 (с, 1H, С≡СН), 3.85 (с, 3H, OCH₃).

Масс-спектр высокого разрешения: рассчитано для C₁₉H₁₄NO₃, [M+Н]⁺, m/z - 304.0968; найдено - 304.0964.

Пример 5. Применение разработанных лигандов для получения конъюгатов лекарственных препаратов на примере синтеза конъюгата противовоспалительного препарата ибупрофена

В ДМФА растворяли 10 мг (0.03 ммоль) этинилхинолин-4-карбоновой кислоты (конц. р-ра 0.08М). К раствору добавляли 15 мг (0.05 ммоль) азидопроизводного ибупрофена*. Реакционную смесь дегазировали после чего добавляли 20 мкл (0.13 ммоль) триэтиламина, 5 мг (0.03 ммоль) йодида меди и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи в инертной атмосфере. В реакционную смесь добавляли 0.03 ммоль ЭДТА, перемешивали 30 минут и удаляли растворитель при пониженном давлении. Остаток разделяли с помощью колоночной хроматографии в системе EtOAc:MeCN:MeOH:H₂O, 70:10:5:5 (по объему) с добавлением 0.5об% Et₃N. Выделенное вещество растворяли в 1 мл ацетонитрила, добавляли 4 мл воды и 1 М раствор HCl до рН 2. Выпавший осадок отфильтровали и дополнительно очищали с помощью обращено-фазовой ВЭЖХ в системе (H₂O - CH₃CN).

¹H ЯМР (δ, м.д., ДМСО-d₆): 9.12 (д, J=1.9 Гц, 1H), 8.68 (с, 1H), 8.44 (с, 1H), 8.28 (д, J=8.9 Гц, 1H), 8.23 (дд, J=8.8, 1.9 Гц, 1H), 8.18 (д, J=8.8 Гц, 1H), 7.22 (д, J=8.1 Гц, 2H), 7.14 - 7.11 (м, 2H), 7.06 (д, J=8.0 Гц, 2H), аром.; 4.37 (т, J=7.0 Гц, 2H, -NHCH₂CH₂CH₂-триазол), 3.85 (с, 3H, -ОСН₃), 3.55 (к, J=7.1 Гц, 1H, сигнал ибупрофена), 3.08 (дт, J=11.9, 5.9 Гц, 2H, -NHCH₂CH₂CH₂-триазол), 2.36 (д, J=7.1 Гц, 2H, сигнал ибупрофена), 2.04-1.96 (м, 2H, -NHCH₂CH₂CH₂-триазол); 1.75 (дт, J=13.3, 6.7 Гц, 1H), 1.22 (с, 9H), 0.80 (д, J=6.6 Гц, 6H), сигналы ибупрофена.

Масс-спектр высокого разрешения: рассчитано для C₃₅H₃₈N₅O₄, [M+Н]⁺, m/z - 592.2918; найдено - 592.2928.

*Исходный препарат предварительно модифицировали аминопропилазидом с использованием в качестве промежуточного продукта NHS-эфира ибупрофена:

Пример 6. Измерение констант диссоциации комплекса лиганд-ASGPR

Эксперимент проводился на приборе Biacore X100 (Biacore AB, Уппсала, Швеция) с использованием чипа-носителя CM5, состоящего из золотой пластины, покрытой слоем карбоксиметилированного декстрана. Поверхность чипа включает в себя две проточных ячейки: на одной иммобилизуется анализируемый белок, вторая ячейка - ячейка сравнения.

Использовалась буферная смесь, содержащая 150 mM NaCl, 50 mM CaCl₂, 50 mM Tris, pH 7.4. Обе ячейки были активированы смесью, содержащей 0.05 М N-гидроксисукцинимид (NHS) и 0,2 М N-этил-N’-диметиламинопропил карбодиимид (EDC) в течение 7 минут, скорость потока смеси 10 мкл/мин. Поверхность ячейки 1 не модифицировалась. На поверхности ячейки 2 был иммобилизован фермент ASGRP печени кролика, растворенный в буфере: 10 mM Tris-HCl, pH 7.0. Раствор фермента подавался в течение 15 минут со скоростью 10 мкл/мин. Обе ячейки были обработаны 0.1 М раствором этаноламина (pH 8.5) для деактивации. Количество иммобилизированного белка ASGPR - 2000 RU.

Отбор и подготовка проб

Лиганды формул, исследуемые на аффинность к белку ASGPR, были растворены в рабочей буферной смеси (150 mM NaCl, 50 mM CaCl₂, 50 mM Tris, pH 7.4). К образцам с низкой растворимостью был добавлен диметилсульфоксид (ДМСО), вплоть до объема, равного половине объема использованной буферной смеси. Более высокие концентрации ДМСО не были использованы ввиду непереносимости белковой структуры экстремальных условий и опасности необратимой денатурации.

Каждый лиганд был представлен в широком диапазоне концентраций, от 10^-2 М до 5*10^-11 М. Скорость потока 20 мкл/мин, лиганд подавался в течение 180 с (время связывания), и далее в течение 60 с изучалась диссоциация комплекса. Для восстановления чип-носитель обрабатывался 20 мкл 20 мМ раствором ЭДТА. Эксперименты проводились при 25 °С. Все буферные растворы были дегазированы и профильтрованы.

Результаты приведены в таблице 1.

Таблица 1. Термодинамические константы диссоциации протеин-лигандного комплекса, определенные методом ППР-спектроскопии

Соединение K_D, моль N-ацетил-D-галактозамин 448*10^-6 D-галактоза 8820*10^-6 8-бром-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновая кислота 1.43(±0.93)*10^-9 6-йод-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновая кислота 18.7(±6.7)*10^-9 8-йод-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновая кислот 0.45(±0.36)*10^-9 6-этинил-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновая кислота 0.72(±0.13)*10^-9 конъюгат 6-этинил-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновой кислоты и азидопроизводного ибупрофена 4.7(±0.6)*10^-9

Полученные данные свидетельствуют о высокой аффинности 2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновых кислот к ASGPR. А также о том, что полученные лиганды можно модифицировать по 6ому и 8ому положениям без негативного влияния на их связывание с рецептором, в том числе, вещества не теряют сродства к ASGPR при их соединении с препаратами.

Изобретение относится к области медицинской химии и касается направленного транспорта лекарственных препаратов в клетки печени с помощью молекул, способных связываться с трансмембранным белком асиалогликопротеином. Предложены новые низкомолекулярные органические соединения - производные хинолин-4-карбоновой кислоты общей формулы (I), где R = 8-Br, 8-I, 6-I, 6-C≡CH. Также описан способ их получения. Технический результат: получены новые гетероциклические соединения, полезные в качестве направленного транспорта лекарственных веществ в очаг заболевания. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

(I)

1. Производные хинолин-4-карбоновой кислоты общей формулы (I):

(I),

где R = 8-Br, 8-I, 6-I, 6-C≡CH.

2. Способ получения производного по п. 1 с R = 8-Br, 8-I, 6-I, характеризующийся тем, что к соответствующему изатину, предварительно нагретому до температуры 80°С - 100°С в водном растворе щелочи с концентрацией 6 М - 12 М, приливают раствор 4-метоксиацетофенона в 1,3-диоксане или этаноле, взятого из расчета, что на 1.0 мольный эквивалент изатина берут не менее 1.0 эквивалента 4-метоксиацетофенона, с последующим перемешиванием и нагреванием реакционной смеси до температуры 80°С - 100°С в течение не менее 3 часов, для отделения побочных продуктов в реакционную смесь приливают воду, с отфильтровыванием образовавшегося осадка, фильтрат подкисляют 1 М водным раствором HCl до выпадения осадка, полученный продукт выделяют фильтрованием и высушивают на воздухе.

3. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что полученный продукт очищают путем колоночной хроматографии с использованием в качестве элюента системы EtOAc/MeCN/MeOH, 70/5/2.5 + 0,5% Et₃N, v/v.

4. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве изатинов используют 7-бром-, 7-йод- или 5-йодизатин.

5. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что в качестве водного раствора щелочи используют растворы KOH или NaOH.

6. Способ по п. 2, характеризующийся тем, что фильтрование проводят через пористый стеклянный фильтр.

7. Способ получения производного по п. 1 с R = 6-C≡CH, характеризующийся тем, что к 5-йодизатину, предварительно нагретому до температуры 80°С - 100°С в водном растворе щелочи с концентрацией 6 М - 12 М, приливают раствор 4-метоксиацетофенона в 1,3-диоксане или этаноле, взятого из расчета, что на 1.0 мольный эквивалент изатина берут не менее 1.0 эквивалента 4-метоксиацетофенона, с последующим перемешиванием и нагреванием реакционной смеси до температуры 80°С - 100°С в течение не менее 3 часов, для отделения побочных продуктов в реакционную смесь приливают воду, с отделением образовавшегося осадка, фильтрат подкисляют 1 М водным раствором HCl, промежуточный продукт – 6-йодхинолин-4-карбоновую кислоту – выделяют фильтрованием, высушивают на воздухе и очищают дополнительно колоночной хроматографией, получая промежуточный продукт, который смешивают с (триалкилсилил)ацетиленом, взятым из расчета, что на 1.0 мольный эквивалент хинолин-4-карбоновой кислоты берут 1.0-1.48 эквивалента (триалкилсилил)ацетилена, в присутствии основания, выбранного из триэтиламина или диизопропилэтиламина, йодида одновалентной меди и каталитической системы на основе палладия в ДМФА, полученную смесь перемешивают при температуре 60°С - 80°С в течение 6-8 часов, с последующим выделением промежуточного продукта – 6-((триалкилсилил)этинил)-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновой кислоты – с помощью колоночной хроматографии, удалением защитных групп и выделением целевого продукта высаживанием из смеси 1 М водный раствор HCl – ацетонитрил, при этом в качестве каталитической системы на основе палладия предпочтительно использовать Pd(Ph₃P)4 или Pd(Ph₃P)₂Cl₂ в присутствии Ph₃P.

8. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что в качестве водного раствора щелочи используют растворы KOH или NaOH.

9. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что в качестве (триалкилсилил)ацетилена предпочтительно использовать этинилтриметилсилан, этинилтриизопропилсилан, этинилтриэтилсилан.

10. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что для очистки йодхинолин-4-карбоновой кислоты и выделения 6-((триалкилсилил)этинил)-2-(4-метоксифенил)хинолин-4-карбоновой кислоты предпочтительно использовать колоночную хроматографию в системе EtOAc/MeCN/MeOH, 70/5/2.5 + 0,5% Et₃N, v/v.

11. Способ по п. 7, характеризующийся тем, что для удаления триалкилсилильной защитной группы предпочтительно использовать раствор TBAF в тетрагидрофуране с концентрацией TBAF в реакционной смеси 0.1±0.09 М.