Аллостерический фармакологический шаперон, восстанавливающий функцию глюкоцереброзидазы Российский патент 2023 года по МПК C07C235/64 A61K31/175 A61P25/16 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, фармакотерапии, а именно, к веществам для лечения болезни Гоше (БГ) и Паркинсона (БП), ассоциированной с мутациями в гене глюкоцереброзидазы (GBA). Изобретение направлено на оценку эффективности новых аллостерических фармакологических шаперонов (ФШ) глюкоцереброзидазы (GCase), способных восстанавливать функцию фермента GCase и способствовать транспорту GCase в лизосому.

Мутации в гене GBA в гомозиготном/компаунд-гетерозиготном состоянии приводят к развитию БГ - наследственного заболевания, относящегося к классу лизосомных болезней накопления. В настоящее время считается, что мутации в гене GBA являются наиболее распространенным фактором повышенного риска развития БП.

В норме фермент GCase участвует в катаболизме лизосфинголипидов, а именно расщепляет свои субстраты: глюкозилцерамид и глюкозилсфингозин до глюкозы и церамида и сфингозина, соответственно. Дисфункция GCase ведет к нарушению метаболизма лизосфинголипидов с их последующим накоплением в лизосомах клеток, в первую очередь в макрофагах: Ferreira C.R., Gahl W.A. Lysosomal storage diseases: Transl. Sci. Rare Dis. 2017. Vol. 2, №1-2. P. 1 [1].

У пациентов с БГ и, в меньшей степени у пациентов с GBA-ассоциированной БП (GBA-БП), как в клетках мозга, так и периферической крови, наблюдается снижение ферментативной активности GCase, повышение уровня лизосфинголипида гексозилсфингозина (HexSph), а также дисфункция лизосом: Sidransky Е., Lopez G. The link between the GBA gene and parkinsonism: Lancet. Neurol. 2012. Vol. 11, №11. P. 986 [2]; Do J. et al. Glucocerebrosidase and its relevance to Parkinson disease: Mol. Neurodegener. 2019. Vol. 14, №1 [3].

Так как большинство мутаций в гене GBA находятся вне активного центра фермента, а приводят к нарушению пространственной структуры белка GCase, обсуждается использование ФШ для терапии как GBA-БП, так и БГ. ФШ - это химические соединения, которые способны связываться с мутантной формой GCase, стабилизировать ее пространственную структуру и способствовать транспорту GCase в лизосому, что в свою очередь приводит к повышению активности фермента, снижению концентрации субстрата в клетках, а также повышает функциональность лизосом. Это описано работах: [2]; Aflaki Е. et al. A characterization of Gaucher iPS-derived astrocytes: Potential implications for Parkinson's disease //Neurobiol. Dis. 2020. Vol. 134, №October 2019. P. 104647 [4]; Tran M.L. et al. Second-Generation Pharmacological Chaperones: Beyond Inhibitors // Mol. 2020, Vol. 25, Page 3145. Multidisciplinary Digital. 2020. Vol. 25, №14. P. 3145 [5].

ФШ, связывающиеся с активным центром белка (ингибирующего типа), обладают недостатками, которые препятствуют их использованию в клинической практике, а именно: низкая селективность и вероятность взаимодействия с другими ферментами лизосом; высокая константа связывания шаперона с активным центром, что в дальнейшем затрудняет протекание каталитической реакции расщепления глюкозилцерамида и глюкозилсфингозина [5].

Существуют ФШ GCase, способные связываться с аллостерическими сайтами на поверхности GCase; такие ФШ получили название аллостерические активаторы (т.е. ФШ неингибирующего типа).

Преимущества аллостерических активаторов GCase заключаются в том, что они обладают большей селективностью в отношении фермента GCase (по сравнению с ФШ ингибирующего типа), т.е. обладают таргетным воздействием только на фермент GCase. Это значит, что ФШ аллостерического типа могут использоваться для лечения БГ и БП, ассоциированной с мутациями в гене GBA для восстановления функции глюкоцереброзидазы, исключая побочное взаимодействие с другими ферментами лизосом, что свойственно ФШ ингибирующего типа. Это будет являться их преимуществом при внедрении их в клиническую практику.

На данный момент описано несколько ФШ аллостерического типа [3, 5].

Известен фармакологический шаперон неингибирующего типа, восстанавливающий функцию глюкоцереброзидазы: патент WO2012078855 [6]: Patnaik S. et al. Discovery, SAR, and Biological evaluation of Non-Inhibitory Small Molecule Chaperones of Glucocerebrosidase // J. Med. Chem. 2012. Vol. 55, №12. P. 5734 [7].

В данных работах выявлены соединения, выступающие в качестве потенциальных ФШ GCase неингибирующего типа из класса пиразолопиримидинов и дигидропиразолопиримидинов, обладающие активностью в отношении фермента GCase, а также представлены варианты замещения радикальных групп выявленных соединений и способы их получения. Соединение NGC00188758 - работа [7] - повышает активность GCase и степень транслокации GCase в лизосомы в клетках фибробластов пациентов с БГ. Он обладает селективностью действию по отношению к GCase и не воздействует на другие лизосомные ферменты, что является важным параметром и отражает его специфичность. В этих работах механизм действия данного соединения и его производных не описан, также как и не описаны сайты связывания соединений с GCase. Поэтому нельзя с уверенностью отнести соединение NGC00188758 к ФШ аллостерического типа.

Известны шапероны неингибирующего типа из класса пиримидинов, восстанавливающие функцию глюкоцереброзидазы, описанные в патентах: US10751341 [8], US9802942 [9]. Здесь представлены варианты замещения радикальных групп пиролопиримидиновых соединений и способы их получения.

Известен фармакологический шаперон неингибирующего типа, восстанавливающий функцию глюкоцереброзидазы, описанный в патенте US9464035 [10]. В отличие от аналогов, указанных выше, являющихся производными пиримидинов, в данном патенте представлены потенциальные ФШ неингибирующего типа, восстанавливающие активность GCase, которые относятся к производным салициловой кислоты.

В патенте охарактеризованы варианты замещения радикальных групп салициловой кислоты и способы их получения. Однако количество исследований по подтверждению влияния ФШ на активность GCase выполнены в недостаточном объеме для того, чтобы можно было с уверенностью сказать о повышение активности фермента GCase.

В качестве прототипа рассмотрена статья: Aflaki Е. et al. A New Glucocerebrosidase Chaperone Reduces α-Synuclein and Glycolipid Levels in iPSC-Derived Dopaminergic Neurons from Patients with Gaucher Disease and Parkinsonism // J. Neurosci. 2016. Vol. 36, №28. P. 7441-7452 [11].

Здесь описан ФШ GCase неингибирующего типа NCGC607, способный восстанавливать функцию GCase, из класса производных салициловой кислоты, структурной формулы:

Химическая формула соединения NCGC607 (2-(2-(4-иодофениламино)-2-оксоэтокси)-N-(2-(метил(фенил)амино)-2-оксоэтил)бензамид) [11]

Показана эффективность соединения NCGC607 (2-(2-(4-иодофениламино)-2-оксоэтокси)-N-(2-(метил(фенил)амино)-2-оксоэтил)бензамид) в повышении активности фермента GCase, снижении концентрации субстрата и повышении транспорта этого фермента в лизосому на пациент-специфичных клетках (макрофаги и дофаминергические (ДА) - нейроны, дифференцированные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)), полученных от пациентов с БГ, а также БГ с проявлениями паркинсонизма. Соединение не оказывает ингибирующего действия на фермент GCase и при этом способно восстанавливать функцию GCase. По этим исследованиям нельзя однозначный сделать вывод об эффективности действия данного вещества на пациентов только с БП.

В прототипе не раскрыт механизм взаимодействия ФШ с GCase и не известны сайты связывания данного ФШ с GCase. Что не позволяет с уверенностью отнести соединение NCGC607 к аллостерическим ФШ GCase.

Это значит, что данный ФШ достоверно не обладает преимуществами, характерными для ФШ аллостерического типа.

Технический результат - расширение арсенала средств для лечения болезни Паркинсона и болезни Гоше.

Задачей данного изобретения является создание новых аллостерических шаперонов, способных восстанавливать функцию GCase, обладающих большей селективностью в отношении фермента GCase.

Технический результат достигается тем, что создан аллостерический ФШ (далее соединение N2), восстанавливающий функцию глюкоцереброзидазы, из класса N,O-дизамещенных производных салицилоил гидразина, общей формулы:

Соединение N2-(2-(2-(4-иодофениламино)-2-оксоэтокси)бензоил)-N-енилгидразинкарбоксамид).

Настоящее изобретение посвящено поиску ФШ GCase, восстанавливающих функцию данного фермента, способных связываться с аллостерическими сайтами на поверхности GCase.

С помощью методов молекулярного моделирования получено заявляемое вещество - N2, производное салицилоил гидразина, проведена оценка влияния заявляемого соединения на ферментативную активность GCase, относительный уровень белка GCase, количество субстрата и транспорт фермента в лизосому в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ, а также GBA-БП. Заявляемое соединение обладает более высоким показателем растворимости в полярных растворителях, таких как водные растворы в сравнении с прототипом, относящемуся также к классу производных салициловой кислоты.

На фиг. 1 представлены результаты по оценке эффективности заявляемого вещества в клетках первичной культуры макрофагов как пациентов с БГ, так и GBA-БП., где:

Фиг. 1, А - Результаты измерения активности GCase (в виде графиков бокс-плот) в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ, GBA-БП и лиц контрольной группы с добавлением соединения N2 и без него.

Фиг. 1, Б - Результаты измерения концентрации субстрата HexSph (в виде графиков бокс-плот) в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ, GBA-БП и лиц контрольной группы с добавлением соединения N2 и без него.

Фиг. 1, В - Результаты измерения активности GCase (в виде графиков бокс-плот) в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ, GBA-БП в зависимости от тяжести мутаций в гене GBA и лиц контрольной группы с добавлением соединения N2 и без него.

Фиг. 1, Г - Результаты измерения относительного уровня белка GCase (в виде графиков бокс-плот) в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ и лиц контрольной группы с добавлением соединения N2 и без него.

Фиг. 1, Д - Оценка степени колокализации белков GCase (красный) и лизосомного маркера LAMP2 (зеленый) в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ с добавлением соединения N2 и без него. Визуализация проводилась с помощью конфокальной микроскопии (х63). Для оценки степени колокализации GCase и LAMP2 рассчитывался коэффициент Пирсона (не менее 10 клеток в каждом состоянии). На бокс-плот графиках представлены результаты расчета коэффициента Пирсона в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ с добавлением соединения N2 и без него.

* р<0.05 относительно необработанных клеток.

Для получения заявляемого вещества с помощью методов молекулярного моделирования была построена атомарная модель мутантной формы GCase N370S, на поверхности которой описаны сайты связывания малых химических соединений. Методами молекулярного докинга и молекулярной динамики обнаружены возможные варианты связывания соединения NCGC607 - прототипа, в выявленных сайтах. В трех из шести сайтов GCase наблюдается стабильное связывание NCGC607, следовательно, соединение может действовать как аллостерический ФШ GCase. В заявляемом изобретении предложено провести модификации соединения NCGC607, введя две полярные аминогруппы в линкер между фенильными химическими группами. Было установлено, что соединение NCGC607 и заявляемое соединение обладают схожими свободными энергиями связывания в аллостерическом сайте GCase, расположенном вблизи активного центра фермента под петлей, состоящей из аминокислотных остатков 311-319. Свободную энергию связывания вычисляли методом MMGBSA на основе расчетов траектории молекулярной динамики комплекса GCase с соединениями NCGC607 и заявляемого вещества; она составила -49,94±6,21 и -44,15±5,02 ккал/моль соответственно). Величина LogBB, рассчитанная на онлайн сервере ADMET: Dyabina A.S. et al. Prediction of blood-brain barrier permeability of organic compounds // Dokl. Biochem. Biophys. 2016. Vol. 470, №1. P. 371-374 [12] составила -0.48 для NCGC607 и -0.62 для заявляемого соединения. Это указывает на снижение гидрофобности заявляемого соединения в сравнении с исходным, т.е. на увеличение его растворимости в полярных растворителях, таких как водные растворы. Растворимость соединений, предполагаемых к использованию в качестве лекарственных средств, в значительной степени влияет на их биодоступность и возможность применения в клинической практике.

Получение заявляемого соединения.

Заявляемое соединение было получено с помощью химического синтеза. 2-(2-гидроксибензоил)-N-фенилгидразинкарбоксамид

К раствору салицилоилгидразида (15.22 г, 100 ммоль) в диметилформамиде (50 мл) при перемешивании и охлаждении (0°С) по каплям за 15-20 минут прибавили фенилизоцианат (10.9 мл, 100 ммоль). Реакционную смесь выдерживали 2 часа при комнатной температуре, выпавший осадок отфильтровали, промыли изопропиловым спиртом и высушили на воздухе. Получили 15.2 г (56%) в виде бесцветных кристаллов. Дополнительное количество продукта может быть получено путем добавления 17-20 мл воды к нагретому (80°С) маточному раствору с последующим фильтрованием и промывкой изопропиловым спиртом. Общий выход 2-(2-гидроксибензоил)-N-фенилгидразинкарбоксамида в виде бесцветных кристаллов 22.5 г (83%).

2-(2-(2-(4-иодофениламино)-2-оксоэтокси)бензоил)-N-фенилгидразинкарбоксамид

К раствору 2-(2-гидроксибензоил)-N-фенилгидразинкарбоксамида (2.71 г, 10 ммоль), 2-хлоро-N-(4-иодофенил)ацетамида (2.96 г, 10 ммоль) и KI (83 мг, 0.5 ммоль) в диметилформамиде (20 мл) прибавили измельченный прокаленный карбонат калия (1.38 г, 10 ммоль) и полученную суспензию перемешивали 15 часов при комнатной температуре, после чего к реакционной смеси добавили равный объем воды, выпавший осадок отфильтровали, промыли водой и изопропиловым спиртом. Сырой продукт перекристаллизовали из смеси диметилформамид-этилацетат. Выход бесцветного кристаллического продукта 3.98 г (75%).

Заявляемое соединение было охарактеризовано с использованием ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и масс-спектрометрии.

Масс-спектры высокого разрешения (HRMS) снимали на спектрометре Bruker micrOTOF 10223 (ESI). Масс-спектр: m/z вычислено для C₂₂H₁₉IN₄O₄ [М-Н+]: 529.0367; найдено: 529.0362.

Спектры ЯМР регистрировали с помощью спектрометра Bruker Avance 400 (400,13 МГц для 14 и 100,61 МГц для 13С). Результаты ЯМР анализа для соединения N2: ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ, 4.95 (с, 2Н, СН₂), 7.00 (т, 1Н,7 Гц, С_аром), 7.18 (т, 1H, 7 Гц, С_аром), 7.24 (т, 3Н, 8 Гц, С_аром), 7.42 (д, 2Н, 8 Гц, С_аром), 7.49 (д, 2Н, 8 Гц, С_аром), 7.54-7.62 (м, 3Н, С_аром), 7.90-7.95 (м 1H, С_аром), 8.88 (с, 1H, NH), 10.26 (с, 1Н, NH), 10.43 (с, 1H, NH), 10.70 (с, 1Н, NH).

В данном изобретении - разработано и синтезировано химическое соединение N2 (2-(2-(4-иодофениламино)-2-оксоэтокси)бензоил)-N-фенилгидразинкарбоксамид), относящееся к производным салициловой кислоты, в качестве нового аллостерического ФШ GCase и показана его эффективность в восстановление функции GCase в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ, а также GBA-БП.

Оценка эффективности заявленного соединения по восстановлению функции GCase проводилась в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ (N=9, средний возраст 37.3±4.0 лет, 44% мужчин) и GBA-БП (N=5, средний возраст 55.5±3.5 лет, 17% мужчин) и лиц контрольной группы (N=7, средний возраст 41.3±4.2 лет, 42% мужчин) с последующей оценкой в них ферментативной активности GCase, концентрации ее субстрата - гексозилсфингозин (HexSph, который представляет собой смесь двух стереоизомеров глюкозилсфингозин (GlcSph) и галактозилсфингозин (GalSph)), относительного уровня белка GCase и степени транслокации GCase в лизосомы.

Клетки первичной культуры макрофагов являются оптимальной моделью для изучения молекулярных механизмов при дисфункции GCase. Ранее было показано, что клетки первичной культуры макрофагов отражают изменение ферментативной активности GCase и накопление ее субстрата и могут быть использованы как in vitro модель не только при БГ, но и GBA-БП: Николаев М.А. и соавт. Макрофаги периферической крови человека как модель изучения дисфункции глюкоцереброзидазы // Цитология. 2018. Vol. 12, №60. Р. 1022-1028 [13].

Используя методы компьютерного моделирования - молекулярная динамика и молекулярный докинг, выявлены сайты связывания заявляемого соединения на поверхности GCase, что позволяет отнести заявляемое соединение к аллостерическим ФШ GCase. В клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ заявляемое соединение не оказывало положительного эффекта на активность GCase, в то время как у пациентов с GBA-БП (в общей группе) заявляемое соединение N2 повышает активность GCase в 1,5-раза (р=0.012), а в группе пациентов с GBA-БП, носителей легкой мутации в гене GBA (N370S), использование заявляемого соединения приводило к увеличению ферментативной активность GCase в 2,8-раза (р=0.050) по сравнению с клетками без добавления заявляемого соединения (фиг. 1, А, В). Одним из важных параметров оценки эффективности ФШ, направленных на повышение функции GCase, является их способность снижать концентрацию субстрата. Заявляемое соединение в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ и GBA-БП приводило к снижению концентрации субстрата в 4,3- и 14,5-раза по сравнению с клетками без добавления заявляемого соединения (р=0.005 и р=0.012, соответственно) (фиг. 1, Б). Кроме того заявляемое соединение повышает относительный уровень белка GCase в 1,2-раза в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ по сравнению с клетками без добавления заявляемого соединения (р<0.05) (фиг. 1, Г). Заявляемое соединение повышает степень транслокации GCase в лизосому в клетках первичной культуры макрофагов пациентов с БГ по сравнению с клетками без добавления заявляемого соединения (р<0.0001) (фиг. 1, Д).

Проверка работоспособности заявляемого соединения

Забор крови у пациентов проводят из вены в 3 пробирки объемом 9 мл с ЭДТА. Получение мононуклеарной фракции производят из 24 мл методом градиентного центрифугирования в растворе фиколла (р=1.077, ПанЭко, Россия) при 1600 об/мин в течение 40 минут, с последующем промыванием полученной клеточной суспензии в растворе натрий-фосфатного буфера (PBS) и центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 минут. Полученные мононуклеарные клетки ресуспензируют в культуральной среде (RPMI-1640, ПанЭко, Россия) с добавлением 10% эмбриональной сыворотки крови крупного рогатого скота (БиолоТ, Россия) и 1% гентамицина (БиолоТ, Россия) с добавлением колоние-стимулирующего фактора макрофагов М-КСФ (Biolegend, США) в конечной концентрации 10 нг/мл. Клетки культивируют течение 8 дней в 5% СО²-инкубаторе при +37°С: [13]. На 4ый день к клеткам добавляют соединение N2 в конечной концентрации 4 мкМ и культивируют еще 4 дня без ежедневной замены среды в 5% CO²-инкубаторе при +37°С. После культивирования клетки дважды отмывают в PBS и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 минут. Созревание макрофагов периферической крови подтверждают с помощью световой микроскопии, а также проточной цитометрии с использованием специфических антител CD14+ и CD68+. Для оценки активности фермента GCase и концентрации HexSph суспензию полученных макрофагов наносят на специальные круги на фильтровальных карточках (Whatman 903 Sample Collection Cards, Germany) в концентрации 2*10⁶ кл/мл. Далее фильтровальные карточки, с нанесенными на них исследуемыми образцами, высушивают в течение 2 часов при комнатной температуре и хранят при +4°С до дальнейшего использования не более одного месяца. Оценка ферментативной активности GCase и концентрации HexSph проводится методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС/МС) по протоколу, описанному ранее: [13] с модификациями, в частности измеряя ее в сухом пятне биоматериала.

Для дальнейших экспериментов часть клеток после культивирования дважды отмывают в PBS и центрифугируют при 1500 об/мин в течение 5 минут, затем отбирают супернатант полностью и клетки замораживают при -80°С.

Для определения относительного уровня GCase методом вестерн в первичной культуре макрофагов клетки лизируют с помощью Total Protein Extraction Kit (Chemicon (Millipore), США). Определение общего белка в лизатах проводят методом с использованием набора Pierce ВСА Protein Assay kit (Thermo Scientific, США) на спекртофотометре SmartSpecTMPlus (BioRad, США). Затем лизаты в количестве 20 мкг белка наносят на 7,5% ПААГ гель и подвергают электрофоретическому разделению в 1X трис-глициновом буфере с добавлением SDS. Перенос белков с геля проводится на PVDF мембрану (Bio-Rad, USA). Мембрану инкубируют с первичными антителами (кроличье моноклональные антитела anti-GBA (1:1000, ab125065, Abcam, UK) и (поликлональные кроличьи антитела anti-GAPDH (1:10000, SAB2108266, Sigma, USA) при +4°С в течение ночи, с последующим инкубированием с вторичными антителами, коньюгированными с пероксидазой (козьи антитела anti-rabbit) (1:5000, ab6721, Abeam, UK) в течение 60 минут. Цифровые изображения получают с помощью хемилюминесцентной системы ChemiDoc (Bio-Rad, USA). Данные вестерн-блоттинга анализируют с помощью программы ImageJ (Версия 1.38а для Windows, http://rsb.info.nih.gov/ij/). Содержание белка GCase нормировали к содержанию GAPDH.

Оценка транслокации GCase в лизосомы (фиг. 1, Е) была проведена с помощью оценки степени колокализации белков GCase и маркера лизосом (LAMP2) методом иммунофлуоресцентного окрашивания и последующей визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Для проведения данного эксперимента клетки культивировали согласно условиям, описанным выше. На 8ой день культивирования клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре. После фиксации клетки трижды промывали в PBS в течение 5 минут. Пермеабилизацию клеток проводили с помощью 0,1% Тритон Х-100, растворенном в PBS, затем клетки были трижды промыты в PBS в течение 5 минут. Для блокировки неспецифического связывания клетки инкубировали в 1% БСА, растворенном в PBS, в течение 30 минут, затем инкубировали с первичными антителами против-GBA мыши (Sigma-Aldrich, США) и кроличьи против-LAMP2 (Sigma-Aldrich, США) в течение 60 минут при комнатной температуре, в конечной концентрации 7 мкг/мл и 1:500, соответственно. После промывки в PBS клетки инкубировали с вторичными антителами Alexa Fluore 488 против-мыши (Jackson ImmunoResearch Laboratories, США) и Су3 против-кролика (Jackson ImmunoResearch Laboratories, США), используемое разведение 1:400, в течение 60 минут в темноте при комнатной температуре. Затем клетки помещали в монтирующую среду с DAPI (Abcam, Великобритания). Изображения были получены с помощью лазерного конфокального микроскопа Leica TCS-SP5 (объектив х63) (Leica, Германия). Использовались следующие линии лазеров: аргоновый - 488 нм, HeNe - 543 нм и UV -405 нм). Толщина оптического среза 500 нм. Для определения уровня относительной флуоресценции изображений, полученных при помощи конфокального микроскопа, использовали программу LAS AF Lite. Оценка колокализации проводилась в программе Image J с использованием плагина, опубликованного ранее EzColocalization: Stauffer W., Sheng H, Lim H.N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms // Sci. Reports 2018. Vol. 8, №1. P. 1-13 [14]. Расчет коэффициента Пирсона производился для каждого образца в отдельности (не менее 3х полей зрения, не менее 10 клеток в одном поле зрения).

Полученные результаты подтверждают возможность использования заявленного соединения в качестве аллостерического ФШ, восстанавливающего функцию GCase. По этим исследованиям можно сделать вывод об эффективности действия данного соединения у пациентов с БГ, а также у пациентов с БП, ассоциированной с мутациями в гене глюкоцереброзидазы (GBA) для восстановления функции глюкоцереброзидазы, исключая побочного взаимодействия с другими ферментами лизосом

Работа частично выполнена в рамках Программы стратегического академического лидерства «Приоритет 2030».

Список используемой литературы

1. Ferreira C.R., Gahl W.A. Lysosomal storage diseases // Transl. Sci. Rare Dis. 2017. Vol. 2, №1-2. P. 1.

2. Sidransky E., Lopez G. The link between the GBA gene and parkinsonism // Lancet. Neurol. 2012. Vol. 11, №11. P. 986.

3. Do J. et al. Glucocerebrosidase and its relevance to Parkinson disease // Mol. Neurodegener. 2019. Vol. 14, №1.

4. Aflaki E. et al. A characterization of Gaucher iPS-derived astrocytes: Potential implications for Parkinson's disease //Neurobiol. Dis. 2020. Vol. 134, №October 2019. P. 104647.

5. Tran M.L. et al. Second-Generation Pharmacological Chaperones: Beyond Inhibitors // Mol. 2020, Vol.25, Page 3145. Multidisciplinary Digital. 2020. Vol. 25, №14. P. 3145.

6. Патент WO2012078855. Substituted pyrazolopyrimidines as glucocerebrosidase activators.

7. Patnaik S. et al. Discovery, SAR, and Biological evaluation of Non-Inhibitory Small Molecule Chaperones of Glucocerebrosidase // J. Med. Chem. 2012. Vol. 55, №12. P. 5734.

8. Патент US10751341. Substituted pyrrolo[1,2-a]pyrimidines and their use in the treatment of medical disorders.

9. Патент US9802942. Substituted 4-methyl-pyrrolo[1,2-a]pyrimidine-8-carboxamide compounds and uses thereof for modulating glucocerebrosidase activity.

10. Патент US9464035. Salicylic acid derivatives useful as glucocerebrosidase activators.

11. Aflaki E. et al. A New Glucocerebrosidase Chaperone Reduces a-Synuclein and Glycolipid Levels in iPSC-Derived Dopaminergic Neurons from Patients with Gaucher Disease and Parkinsonism // J. Neurosci. 2016. Vol. 36, №28. P. 7441-7452.

12. Dyabina A.S. et al. Prediction of blood-brain barrier permeability of organic compounds // Dokl. Biochem. Biophys. 2016. Vol. 470, №1. P. 371-374.

13. Николаев M.A. и соавт. Макрофаги периферической крови человека как модель изучения дисфункции глюкоцереброзидазы // Цитология. 2018. Vol. 12, №60. Р. 1022-1028.

14. Stauffer W., Sheng Н., Lim H.N. EzColocalization: An ImageJ plugin for visualizing and measuring colocalization in cells and organisms // Sci. Reports 2018. Vol. 8, №1. P. 1-13.

Изобретение относится к аллостерическому фармакологическому шаперону, восстанавливающему функцию глюкоцереброзидазы, из класса N,O-дизамещённых производных сацилилоил гидразина, общей формулы. Технический результат: создание нового соединения, восстанавливающего функцию глюкоцереброзидазы за счёт аллостерической регуляции, которое могут найти применение в медицине для лечения болезни Гоше и болезни Паркинсона. 5 ил.

Аллостерический фармакологический шаперон, восстанавливающий функцию глюкоцереброзидазы, из класса N,O-дизамещённых производных сацилилоил гидразина, общей формулы: