Молекулярно-генетический маркер цветовой вариации "черный хрусталь" у американской норки и способ выявления особи норки, являющейся носителем аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 A01K67/02 

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генетическим исследованиям в селекции и пушном звероводстве.

Уровень техники

Американская норка является основным объектом клеточного пушного звероводства. Более 50 млн шкур производится ежегодно, что составляет более 80% всей международной торговли необработанным мехом [Andersson, Nyman, Wallgren, 2017; Hansen, 2014]. Одной из причин подобной популярности является чрезвычайно высокое разнообразие окрасочных форм. За более чем вековую историю размножения, темно-коричневой в природных условиях американский норки, в пушных звероводческих хозяйствах возникли и были зафиксированы 35 мутаций доминантной, полудоминантной и рецессивной природы, затрагивающих окраску волосяного покрова, на основе которых селекционерами сформировано более 100 комбинативных окрасочных форм [Трапезов, Трапезова, 2009].

Окраска мехового покрова - один из важнейших признаков для промышленного разведения американской норки. В связи с этим целесообразным является отбор тех особей и популяций норки, которые будут размножаться и давать наибольшее число потомков с желаемой окраской мехового покрова. На практике, с использованием традиционных методов промышленного разведения (т.е. постановки случайных скрещиваний, анализа полученного потомства и составления родословных животных), получение потомков с желаемой окраской мехового покрова является трудоемким и дорогостоящим. Поэтому существует потребность в быстрых и менее трудоемких способах определения окраски меха норки на основании генотипа отдельных животных.

Одной из групп окрасок мехового покрова у американской норки являются белые окраски, которые востребованы на рынке, так как такой мех может быть покрашен [Anistoroaei и др., 2008]. На сегодняшний день описано по меньшей мере три типа белой окраски меха у американской норки:

- Классическая альбино-окраска, также известная как королевская белая окраска. Данная окраска наследуется как моногенный аутосомно-рецессивный признак (обозначается как с/с) и, как было показано ранее, обуславливается мутацией в гене, кодирующем фермент тирозиназу (TTR) [Anistoroaei и др., 2008].

- Окраска белый Хедлюнд (h/h), которая отличается от альбино-формы окраской глаз, у белых Хедлюнд норок глаза темные, в то время как у альбиносов - красные. Данная окраска наследуется как моногенный кодоминантный признак - гомозиготы h/h имеют белую окраску и часто являются глухими, а гетерозиготы H/h - имеют пятнистую, пегую окраску и нормальный слух. Ранее было показано, что развитие этой окраски мехового покрова, обуславливается мутацией в гене, кодирующем ассоциированный с микрофтальмией транскрипционный фактор (MITF), а именно в его меланоцит-специфичной изоформе (MITF-M) [Manakhov и др., 2019].

- Окраска черный хрусталь, одна из недавно возникших форм, которая впервые выделена в ИЦиГ СО РАН в ходе проведения экспериментальной доместикации американской норки. Данная мутация наследуется как моногенный полудоминантный признак: гетерозиготные (С'/+) особи характеризуются наличием белых остевых волос, которые образуют «вуаль», покрывающую все тело, гомозиготные по мутации особи (С'/С') имеют единичные черные волоски на теле, которые могут полностью отсутствовать, в результате чего животные могут иметь абсолютно белую окраску, схожую с окраской белая Хедлюнд (h/h). Но в отличие от последней, животные с окраской хрусталь имеют нормальный слух [Trapezov, 1997].

До настоящего времени из 35 мутаций, обуславливающих формирование цветных форм американкой норки, с молекулярно-генетической точки зрения было описано всего лишь 9. Это мутации, обуславливающие алеутскую (а/а), королевскую белую (с/с), гималайскую (c^h/c^h), белую Хедлюнд (h/h), паломино (k/k), мойл (m/m), камео (m^c/m^c), серебристо-голубую (р/р), и Шедоу (S^h+) окраски меха [Anistoroaei и др., 2008; Anistoroaei, Krogh, Christensen, 2013; Benkel и др., 2009; Cirera и др., 2016; Manakhov и др., 2019; Manakhov и др., 2020; Manakhov и др., 2022а].

В случае если генетические маркеры животных-носителей данных мутаций неизвестны, носительство определяют, используя генеалогический метод - это метод изучения родословных, с помощью которого прослеживается наследование признака в группе с указанием типа родственных связей между членами родословной [Инге-Вечтомов, 2010]. Молекулярно-генетический маркеры для животных, являющихся носителями признака черный хрусталь до настоящего времени не были известны и впервые предложены в заявленном изобретении.

Ранее в патенте РФ №2722564 нами был предложен способ выявления особи американской норки, являющейся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, включающий генотипирование животного по гену MLPH и MITF-M. Были раскрыты новые генетические маркеры, а именно специфические мутации: MLPH c.901+1G>A (р) в гене меланофилина (белок MLPH) и MITF-M с.33+1G>А (И) в гене транскрипционного фактора, ассоциированного с микрофтальмией/меланогенезом (белок MITF), а также способ идентификации генов, вовлеченных в регуляцию формирования окраски меха у американской норки. Авторы изобретения обнаружили, что их функционирование связано с развитием серебристо-голубой (р/р) и белой Хедлюнд (h/h) окрасок меха американской норки соответственно. Предложен также способ отбора животных, являющихся носителем какого-либо из указанных маркеров, и применение данного способа в звероводстве для отбора производителей, обладающих генетическими характеристиками, необходимыми для получения потомства желаемой цветовой окраски. Возможность определения наличия или отсутствия данных маркеров в образце ДНК животного методами молекулярной биологии показана на примере их выявления путем проведения ПЦР-анализа и последующего секвенирования биологических образцов американской норки. Раскрыта тест-система, включающая генотипирование животного для выявления у него маркерной полиморфной нуклеотидной вариации, ассоциированной с наличием у животного аллеля, проявляющегося в развитии определенной цветовой вариации. Предложенные в качестве маркеров нуклеотидные вариации в геноме ассоциированы с изменением физиологической активности белков MLPH и MITF-M. Для выявления данных вариаций проводят генотипирование полиморфных локусов в генах MLPH и MITF. В частности, в качестве маркера наличия в генотипе животного аллеля р используют однонуклеотидную замену MLRH c.901+1G>A, и в качестве маркера наличия аллеля h используют однонуклеотидную замену MITF-M с.33+1G>А.

Технической задачей, на решение которой направлено настоящее изобретение, является решение как минимум одной из вышеуказанных в уровне техники проблем.

Сущность изобретения

Техническим решением является использование описанного признаками в пунктах формулы изобретения.

Одной из возможных технических задач, на решение которой может быть направлено настоящее изобретение, являлось создание способа отбора особей американской норки для получения желаемой окраски меха на основе определения генотипа отдельных особей норки.

Задача решена тем, что впервые выявлен новый генетический маркер, определяющий окраску меха норок. Было обнаружено, что однонуклеотидная замена в гене СОРА (СОРА с.478 ОТ), определяет окраску меха черный хрусталь: особи, гетерозиготные по данной замене (аллели С'/+) характеризуются наличием белых остевых волос, которые образуют «вуаль», покрывающую все тело, в то время как особи гомозиготные по данной замене (аллели С'/С') имеют единичные черные волоски на теле, которые могут полностью отсутствовать, в результате чего животные могут иметь абсолютно белую окраску.

Кроме того, было показано наличие взаимодействия между мутациями, обуславливающими формирование окрасок черный хрусталь и белый Хедлюнд (мутация MITF-M с.33+1G>A). Особи, гетерозиготные по обеим мутациям (C'/+, H/h) характеризуются преимущественно белой окраской мехового покрова и нормальным слухом. Фенотипически такие особи не отличаются от особей, гомозиготных по мутации, обуславливающей формирование окраски меха черный хрусталь (С'/С') [Manakhov и др., 2022b].

В одном из вариантов осуществления изобретения предложен способ выявления особи американской норки, являющейся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, включающий генотипирование животного для выявления у него маркерных полиморфных нуклеотидных вариаций, ассоциированных с наличием у животного аллелей, проявляющихся в развитии определенной цветовой вариации, отличающийся тем, что в качестве маркеров используют однонуклеотидные замены СОРА с.478 ОТ и MITF-Mc.33+1 G>A.

В одном из вариантов осуществления изобретения предложенный способ выявления особи американской норки, являющейся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, включает в себя:

а) определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК исследуемой особи американской норки, содержащих позиции генов СОРА с.478 и MITF-M с.33+1;

б) сравнение последовательности упомянутых фрагментов ДНК с референсными последовательностями генов СОРА (ENSNVIT00000001038.1, Ensembl v107) и MITF-M (ENSNVIT00000002796.1, Ensembl v107);

в) выявление наличия и количества или отсутствия однонуклеотидной замены СОРА с.478 С>Т и MITF-M с.33+1 G>A в нуклеотидной последовательности упомянутых фрагментов ДНК;

г) определение генотипа исследуемой особи американской норки по мутациям, обуславливающим развитие окрасок меха черных хрусталь и белый Хедлюнд.

В одном из вариантов осуществления изобретения фрагмент ДНК исследуемой особи американской норки, содержащий позицию гена СОРА с.478 получают путем амплификации ДНК с использованием праймеров SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.

В одном из вариантов осуществления изобретения желаемая цветовая вариация отличается от темно-коричневой.

В одном из вариантов осуществления изобретения однонуклеотидная замена СОРА с.478 С>Т является маркером проявления окраски черной хрусталь у животного, гетерозиготного по аллелю С' и гомозиготного по аллелю Н (С' Н/Н) и преимущественно белой окраски меха у животного, гомозиготного по обоим аллелям (С'/С' Н/Н) и дигетерозиготного по обоим аллелям (С'/+Н/И).

В одном из вариантов осуществления изобретения определение нуклеотидной последовательности ДНК проводят секвенированием по методу Сенгера.

В одном из вариантов осуществления изобретения определение нуклеотидной последовательности ДНК проводят секвенированием NGS.

В других вариантах осуществления изобретения выявление наличия или отсутствия однонуклеотидной замены в последовательности ДНК проводят методом ПЦР-ПДРФ, ПНР в реальном времени с использованием флуоресцентных зондов типа TaqMan, аллель-специфической ПНР, гибридизации на чипах.

В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается применение упомянутого способа выявления особи американской норки, являющейся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, для отбора особей американской норки среди имеющегося поголовья фермерских норок.

В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается упомянутое применение для отбора особей, где отобранных животных используют для получения от них потомства с желаемой окраской меха.

Детальное описание изобретения

Если не указано иначе, предполагается, что все термины, обозначения и другие научные термины, используемые в данной заявке, имеют значения, которые обычно понимают специалисты в области, к которой относится настоящее изобретение. В некоторых случаях определения терминов с общепринятыми значениями приведены в данной заявке для ясности и/или для быстрой справки и понимания, и включение таких определений в настоящее описание не должно истолковываться как наличие существенного отличия значения термина от обычно подразумеваемого в данной области.

Кроме того, если по контексту не требуется иное, термины в единственном числе включают в себя термины во множественном числе, и термины во множественном числе включают в себя термины в единственном числе. Как правило, используемая классификация и методы молекулярной биологии, генетики, аналитической химии, а также гибридизации и химии белка и нуклеиновых кислот, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Ферментативные реакции и способы очистки осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как описано в настоящем документе.

Изобретение раскрывает новый генетический маркер, а именно специфическую мутацию в гене, кодирующем α-субъединицу гептамерного белкового комплекса COPI - белок СОРА, - а также способ идентификации генов, вовлеченных в регуляцию формирования окраски меха у американской норки (Neogale vison, ранее известная как Neovison vison [Patterson и др., 2021]). Авторы изобретения обнаружили, что выявленный генетический маркер связан с развитием окраски меха черный хрусталь (С'/+ и С'/С') у американской норки. Предложен способ отбора животных, являющихся носителем указанного маркера, и применение данного способа в пушном звероводстве для отбора производителей, обладающих генетическими характеристиками, необходимыми для получения потомства желаемой цветовой окраски. Возможность определения наличия или отсутствия данных маркеров в образце ДНК животного методами молекулярной биологии показана на примере их выявления путем проведения ПЦР-анализа и последующего секвенирования биологических образцов американской норки. Раскрыт способ выявления особи американской норки, являющейся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, включающий генотипирование животного для выявления у него маркерной полиморфной нуклеотидной вариации, ассоциированной с наличием у животного аллеля, проявляющегося в развитии определенной цветовой вариации. Предложена в качестве маркера нуклеотидная вариация в геноме, ассоциированная с изменением физиологической активности белка СОРА. Для выявления данной вариации проводят генотипирование полиморфного локуса в гене СОРА. В качестве маркера наличия в генотипе животного аллеля С используют вариант однонуклеотидной замены с.478 С>Т в гене СОРА.

Изобретение относится также к мутации СОРА с.478 С>Т в гене СОРА, которая приводит к несинонимичной замене 160 аргинина на цистеин в конце четвертого WD40 повтора в белке СОРА. Данный WD40 повтор является эволюционно консервативным и функционально значимым для связывания COPI комплекса с дилизиновыми мотивами (KKxx, KxKx) транспортируемых белков [Vece и др., 2016; Jackson и др., 2012]. Авторы изобретения показали, что ген СОРА у норки вовлечен в процессы определения окраски мехового покрова. В частности, авторы изобретения обнаружили, что однонуклеотидная замена в гене СОРА (СОРА с.478 С>Т), определяет окраску меха черный хрусталь: особи, гетерозиготные по данной замене (аллели С'/+) характеризуются наличием белых остевых волос, которые образуют «вуаль», покрывающую все тело, в то время как особи гомозиготные по данной замене (аллели С'/С') имеют единичные черные волоски на теле, которые могут полностью отсутствовать, в результате чего животные могут иметь абсолютно белую окраску. Авторы изобретения впервые показали ассоциацию физиологической активности белка СОРА с окраской мехового покрова американской норки, что и послужило основой создания нового способа отбора животных, являющих носителями аллелей, обеспечивающих определенную окраску, а также их число. Раскрыт новый генетический маркер СОРА с.478 С>Т, который может быть использован для генотипирования животных с целью выявления животных - носителей аллелей определенной цветовой вариации.

Кроме того, нами было показано наличие взаимодействия между мутациями, обуславливающими формирование окрасок черный хрусталь и белый Хедлюнд (мутация MITF-M с.33+1 G>A). Особи, гетерозиготные по обеим мутациям (С'/+H/h) характеризуются преимущественно белой окраской мехового покрова и нормальным слухом. Фенотипически такие особи не отличаются от особей, гомозиготных по мутации, обуславливающей формирование окраски меха черный хрусталь (С'/С') [Manakhov и др., 2022b]. Различение таких особей является актуальной задачей для промышленного разведения американской норки, так как знание о генотипе особей позволяет подбирать их в скрещивание таким образом, чтобы в потомстве получалась максимальная доля животных с окраской меха, необходимой звероводу.

Открытие однонуклеотидной замены в кодирующей области гена СОРА, а также наличия факта взаимодействия между генами СОРА и MITF в процессе формирования окраски мехового покрова, позволило авторам изобретения разработать способ, позволяющий предсказывать цвет норки и ее потомства на основе различения аллелей С' и + и определения генотипа отдельных особей американской норки по однонуклеотидной замене, обуславливающей развитие окраски меха черный хрусталь. В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ отбора особей для получения желаемой окраски меха на основе определения генотипа отдельных особей норки.

Эффективность производства меха заданной окраски и разведения соответствующих линий животных может быть повышена, при возможности определения до скрещивания, является ли животное носителем мутации, влияющей на окраску мехового покрова. Используя данную информацию, селекционер может планировать скрещивания животных, увеличивая, таким образом, долю потомства с интересующей его окраской мехового покрова, что в конечном итоге приведет к уменьшению расходов звероводческой организации. В качестве инструмента для отбора животных предложено использовать мутации в генах СОРА (СОРА с.478 ОТ) и MITF (MITF-M с.33+1 G>A), которые обуславливают развитие окраски меха черный хрусталь и Хедлюнд:

- особи, гетерозиготные по замене С' и гомозиготные по аллелю Н (С/+Н/Н), характеризуются наличием белых остевых волос, которые образуют «вуаль», покрывающую все тело;

- особи, гомозиготные по замене С' и гомозиготные или гетерозиготные по аллелю Н (С'/С' Н/Н; С'/С' H/h), характеризуются наличием единичных черных волосков на теле, которые могут полностью отсутствовать, в результате чего животные могут иметь абсолютно белую окраску;

- особи, дигетерозиготные по аллелям C' и h (С'/+H/h) характеризуются наличием единичных черных волосков на теле, которые могут полностью отсутствовать, в результате чего животные могут иметь абсолютно белую окраску;

Изобретение раскрывает также применение заявленного способа для селекции и разведения фермерской американской норки по желательному признаку (для получения особей с заданной окраской мехового покрова). Применение включает в себя отбор особей, генетически соответствующих желательному признаку (заданной окраске меха) среди имеющегося поголовья фермерских норок для использования в направленных селекционных программах (получение потомства с заданной окраской меха). Применение заявленного способа для отбора норок для селекции также может быть использован для защиты от генетической кражи селекционных линий американских норок определенной окраски.

Авторы изобретения провели полногеномное секвенирование и последующее сравнение геномов американских норок, характеризующихся различными типами окраски мехового покрова: стандартной темно-коричневой (дикий тип, +/+), серебристо-голубой (аллели р/р), белой Хедлюнд (аллели h/h), мойл (аллели m/m), виолет (аллели а/а m/m р/р), а также особи из линии, характеризующейся окраской меха черный хрусталь: абсолютно белого животного с темными глазами и нормальным слухом (аллели С'/С').

У белого животного из линии черный хрусталь была обнаружена несинонимичная замена (СОРА p.Argl60Cys) в эволюционно консервативном и функционально значимом домене белок-кодирующего транскрипта гена СОРА (СОРА с.478 С>Т). Было показано, что выявленная мутация в гене СОРА (СОРА с.478 С>Т), в гетерозиготном состоянии обуславливает развитие окраски меха черный хрусталь (С/+), характеризующейся наличием белых остевых волос, которые образуют «вуаль», а в гомозиготном состоянии обуславливает развитие белой окраски мехового покрова. Кроме того, было показано, что особи, являющиеся двойными гетерозиготами по выявленной мутации в гене СОРА (СОРА с.478 С>Т) и описанной ранее для норок белой Хедлюнд окраски мутацией в гене MITF (MITF-M с.33+1 G>A), также характеризуются полностью белой окраской меха.

Таким образом, настоящее изобретение относится, прежде всего, к использованию обнаруженной мутации в генах СОРА в качестве маркера, позволяющего определить наличие или отсутствие у животного аллелей С, а также их числа. Изобретение относится к способу выявления особи американской норки, являющейся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, включающий генотипирование животного по генам СОРА и MITF-M. Генотипирование по настоящему изобретению содержит следующие стадии:

а) определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК исследуемой особи американской норки, содержащих позиции генов СОРА с.478 и MITF-M с.33+1;

б) сравнение последовательности упомянутых фрагментов ДНК с референсными последовательностями генов СОРА (ENSNVIT00000001038.1, Ensembl v107) и MITF-M (ENSNVIT00000002796.1, Ensembl v107);

в) выявление наличия и количества или отсутствия однонуклеотидной замены СОРА с.478 С>Т и MITF-M с.33+1 G>A в нуклеотидной последовательности упомянутых фрагментов ДНК;

г) определение генотипа исследуемой особи американской норки по мутациям, обуславливающим развитие окрасок меха черных хрусталь и белый Хедлюнд.

Фрагмент ДНК исследуемой особи получается любым известным из уровня техники способом взятия биологического материала, содержащего ДНК, в том числе, но не ограничиваясь, такими способами как взятие крови, мазка, биопсии и пр. способами. Такие способы известны специалисту в данной области.

Специалисту в данной области понятно, что для осуществления генотипирования по мутациям СОРА с.478 С>Т и MITF-M с.33+1 G>A может быть использован любой известный в настоящее время способ определения нуклеотидной последовательности ДНК и/или наличия определенной мутации (секвенирование по Сэнгеру, NGS, аллель-специфичная ПНР, ПЦР-ПДРФ, ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентных зондов типа TaqMan и др.).

В одном из вариантов осуществления изобретения генотипирование проводится с использованием фрагмента ДНК исследуемой особи американской норки, содержащего позицию гена СОРА с.478, полученного путем амплификации ДНК исследуемой особи американской норки с использованием праймеров SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4. В результате такой амплификации образуется фрагмент ДНК с последовательностью SEQ ID NO: 1 (аллель дикого типа) либо SEQ ID NO: 2 (аллель с однонуклеотидной заменой).

Изобретение также относится к применению упомянутого способа выявления особи американской норки, являющейся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование желаемой цветовой вариации, для отбора особей американской норки, пригодных в племенной работе для получения желаемой окраски меха, среди имеющегося поголовья фермерских норок.

В одном из вариантов осуществления изобретения предлагается упомянутое применение для отбора особей, где отобранных животных используют для получения от них потомства с желаемой окраской меха.

В настоящее время аналогов представляемым маркерам и способу их использования для определения окраски меха черный хрусталь у американской норки не существует.

Ниже представлены примеры проведения генотипирования животных по мутацям СОРА с.478 С>Т (С) и MITF-Mc.33+1 G>A (/г), а также применение заявленного способа в селекции.

Пример 1. Генотипирование биологического образца

Пример 1.1. Получение ДНК

ДНК может быть получена из любой ткани животного, содержащей клеточные ядра, например, из лейкоцитов, волосяных фолликулов, ткани уха и мышечной ткани, клеток буккального эпителия и др. Пригодная для проведения ПЦР ДНК может быть выделена из образца при помощи наборов QIAamp DNA Mini Kit компании Qiagen (http://www.qiagen.com/). Однако любой метод выделения ДНК должен быть в равной степени эффективным.

Пример 1.2. Амплификация участков генома американской норки, содержащих исследуемые однонуклеотидные замены

Амплификацию полученного в Примере 1.1. образца ДНК проводили с помощью наборов GenPack PCR Core компании «Лаборатория Изоген» (Россия), на приборах GeneAmp PCR System 9700 Thermal Cycler компании «Applied Biosystems» (США) no следующей программе: 94°C - 5 мин; (94°C - 30 сек; 58°C - 30 сек; 72°C - 30 сек) * 35 циклов; 72°C - 10 мин. Реакционная смесь объемом 20 мкл содержала: 10 мкл PCR Diluent, по 0,5 пмоль прямого и обратного праймеров (Таблица 1), 10 нг геномной ДНК.

Пример 1.3. Секвенирование полученных ПЦР продуктов

Полученные в результате ПЦР фрагменты очищали с использованием наборов Cleanup компании «Евроген» (Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

Пробоподготовку для секвенирования проводили с помощью набора реагентов BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit компании «Applied Biosystems» (США), реакционная смесь объемом 10 мкл содержала: 2 мкл BigDye™ Terminator v3.1 Ready Reaction Mix, 1 мкл BigDye™ Terminator v3.1 5X Sequencing Buffer, 0,1 пмоль прямого или обратного праймера (Таблица 1), и очищенный продукт ПЦР.

Полученные продукты реакции очищали на колонках DyeEx 2.0 Spin Kit («Qiagen», Германия) и секвенировали на приборе ABI PSISN 3730x1 компании «Applied Biosystems» (США).

Пример 1.4. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей

Анализ проводили с использованием программ Chromas, GeneDoc и веб-сервиса Clustal Omega.

Проводили выравнивание и сравнение полученных нуклеотидных последовательностей исследуемых особей с референсными нуклеотидными последовательностями генов СОРА (ENSNVIT00000001038.1, Ensembl v107) и MITF-M (ENSNVIT00000002796.1, Ensembl v107) американской норки.

Пример 2. Применение способа для отбора особей норки в селекционной работе

Условные обозначения:

- Аллель «+» - СОРА с.478 С

- Аллель С - СОРА с.478 Т

- Аллель Н - MITF-Mc.33+1 G

- Аллель h - MITF-Mc.33+1 А.

Предположим, имеется популяция норок с белой окраской мехового покрова и нормальным слухом. В результате проведенного генотипирования по мутации СОРА с.478 С>Т было выяснено, что 75% популяции гомозиготы по аллелю СОРА с.478 Т (С'/С'), а 25% популяции гетерозиготы по аллелю СОРА с.478 Т (С'/+). Предположительно, особи с нормальным слухом и белой окраской мехового покрова, оказавшиеся гетерозиготами по аллелю СОРА с.478 Т (С'/+) также являются гетерозиготами по аллелю MITF-M с.33+1 А (H/h) [Manakhov et al., 2022b] и целесообразным является проведение дополнительного генотипирования этих особей по мутации MITF-M с.33+1 G>A, обуславливающей развитие белой Хедлюнд окраски меха (патент РФ №2722564).

Предположим, что в результате проведенного дополнительно генотипирования всей популяции норок с белой окраской мехового покрова и нормальным слухом было показано, что 75% популяции гомозиготы по аллелям СОРА с.478 Т и MITF-M с.33+1 G (С'/С' Н/Н), а 25% популяции гетерозиготы по аллелям СОРА с.478 Т и MITF-Mc.33+1 А (Cr'/⁺ H/h).

В случае случайного скрещивания в потомстве ожидается следующее распределение по окраскам и генотипам:

- 87,11% белых животных с нормальным слухом (66,02% С'/С' Н/Н; 10,16% С'/С' H/h; 10,94% С'/+ Н/И)

- 10,16% с окраской меха черный хрусталь, с характерной «вуалью» белых остевых волос (С'/+ Н/Н)

- 1,56% белых глухих животных (0,39% С'/С' h/h; 0,78% С/+h/h; 0,39%+/+h/h)

- 0,78% пегих животных со стандартной окраской меха (+/+H/h)

- 0,38% животных со стандартной окраской мехового покрова (+/+Н/Н).

В случае целенаправленного скрещивания животных с генотипом С/С Н/Н в потомстве от таких скрещиваний ожидается следующее распределение по окраскам и генотипам:

- 100% белых животных с нормальным слухом (С/С Н/Н).

В случае целенаправленного скрещивания животных с генотипом С'/+ H/h в потомстве от таких скрещиваний ожидается следующее распределение по окраскам и генотипам:

- 43,75% белых животных с нормальным слухом (6,25% С'/С' Н/Н; 12,50% С/С H/h; 25,00% С'/+ H/h)

- 12,50% с окраской меха черный хрусталь, с характерной "вуалью" белых остевых волос (С'/+ Н/Н)

- 25,00% белых глухих животных (6,25% С/С h/h; 12,50% С/+h/h; 6,25%+/+h/h)

- 12,50% пегих животных со стандартной окраской меха (+/+H/h)

- 6,25% животных со стандартной окраской мехового покрова (+/+Н/Н).

Таким образом, применение предложенного способа определения окраски меха американской норки, с использованием молекулярных маркеров ДНК, может существенно увеличить долю животных с заданной окраской в потомстве. Способ позволяет определить генотип норок, который позволяет проводить скрещивание таким образом, чтобы получить максимальное количество животных заданной окраски, например, вплоть до 100% белых животных с нормальным слухом. В случае случайного скрещивания, их доля составит 66,02+10,16+10,94=87,11% (расчеты проводились на основании частот генотипов и в соответствии с законами расщепления Менделя).

Все публикации, патенты и заявки на патенты включены в настоящий документ посредством ссылки. Хотя в вышеприведенном описании это изобретение было описано в отношении некоторых предпочтительных вариантов его осуществления, и многие детали были изложены в целях иллюстрации, для специалистов в данной области техники будет очевидно, что изобретение допускает дополнительные варианты осуществления и что некоторые детали, описанные в данном документе, могут значительно изменяться без отклонения от сущности изобретения.

Использование терминов в единственном числе в контексте описания изобретения должно толковаться как охватывающее как единственное, так и множественное число, если иное не указано в данном документе или явно не противоречит контексту. Термины «состоящий из», «имеющий», «включающий» и «содержащий» следует толковать как неограничивающие термины, т.е. означающие «включая, но не ограничиваясь», если не указано иное. Перечисление диапазонов значений в данном документе просто предназначено для использования в качестве сокращенного способа индивидуальной ссылки на каждое отдельное значение, попадающее в этот диапазон, если здесь не указано иное, и каждое отдельное значение включено в спецификацию, как если бы оно было отдельно изложено в данном документе. Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту. Использование любых и всех примеров или иллюстративного языка (например, «такой как»), представленных в данном документе, предназначено просто для лучшего описания изобретения и не налагает ограничения на объем изобретения, если иное не заявлено. Никакие формулировки в описании не следует истолковывать как указывающие на какой-либо не заявленный элемент как существенный для практического применения изобретения.

Здесь описаны варианты осуществления этого изобретения, включая лучший из известных изобретателям способа осуществления изобретения. Разновидности этих вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после прочтения предшествующего описания. Авторы ожидают, что квалифицированные специалисты будут использовать такие варианты в зависимости от обстоятельств, и авторы предполагают, что изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, это изобретение включает в себя все модификации и эквиваленты признаков, изложенных в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных признаков во всех их возможных вариациях охватывается изобретением, если иное не указано в данном документе или иным образом явно не противоречит контексту.

Список литературы

1. Инге-Вечтомов С.Г. Генетика с основами селекции: учебник для студентов высших учебных заведений. 2-е издание, перераб. и доп. // СПб.: Изд-во Н.-Л., 2010. 720 с.

2. Трапезов О.В., Трапезова Л.И. Воспроизводящаяся коллекция окрасочных генотипов американской норки (Mustela vison Schreber, 1777) на экспериментальной звероферме Института цитологии и генетики СО РАН // Вестник ВОГиС.2009. Т. 13. №3. С. 554-570.

3. Andersson А.-М., Nyman А.-K., Wallgren P. A retrospective cohort study estimating the individual Aleutian disease progress in female mink using a VP2 ELISA and its association to reproductive performance//Preventive Veterinary Medicine. 2017. T. 140. C. 60-66.

4. Anistoroaei R. и др. Albinism in the American mink (Neovison vison) is associated with a tyrosinase nonsense mutation // Animal Genetics. 2008. T. 39. №6. C. 645-648.

5. Anistoroaei R., Krogh A.K., Christensen K. A frameshift mutation in the LYST gene is responsible for the Aleutian color and the associated Chediak-Higashi syndrome in American mink // Animal Genetics. 2013. T. 44. №2. C. 178-183.

6. Benkel B.F. и др. Molecular characterization of the Himalayan mink // Mammalian Genome. 2009. T. 20. №4. C. 256-259.

7. Cirera S. и др. A large insertion in intron 2 of the TYRP1 gene associated with American Palomino phenotype in American mink. // Mammalian genome: official journal of the International Mammalian Genome Society. 2016. T. 27. №3-4. C. 135-43.

8. Hansen H.O. The Global Fur Industry: Trends, Globalization and Specialization // Journal of Agricultural Science and Technology. 2014. T. 4. C. 543-551.

9. Jackson L.P. и др. Molecular basis for recognition of dilysine trafficking motifs by COPI. // Developmental cell. 2012. T. 23. №6. C. 1255-62.

10. Manakhov A. D. и др. Genome analysis identifies the mutant genes for common industrial Silverblue and Hedlund white coat colours in American mink. // Scientific reports. 2019. T. 9. №1. C. 4581.

11. Manakhov A.D. и др. Genome analysis of American minks reveals link of mutations in Ras-related protein-38 gene to Moyle brown coat phenotype. // Scientific reports. 2020. T. 10. №1. C. 15876.

12. Manakhov A.D. и др. Shadow coat colour in American mink associated with a missense mutation in the KIT gene. // Animal genetics. 2022b. T. 53. №4. C. 522-525.

13. Manakhov A.D. и др. Identification of mutant gene for Black crystal coat and nonallelic gene interactions in Neogale vison // Scientific Reports. 2022a. T. 12. №1. C. 10483.

14. Patterson B.D. и др. On the nomenclature of the American clade of weasels (Carnivora: Mustelidae) // Journal of Animal Diversity. 2021. T. 3. №2. C. 1-8.

15. Trapezov О.V. Black crystal: a novel color mutant in the American mink (Mustek vision Schreber). // The Journal of heredity. 1997. T. 88. №2. C. 164-6.

16. Vece T.J. и др. Сора Syndrome: a Novel Autosomal Dominant Immune Dysregulatory Disease // Journal of Clinical Immunology. 2016. T. 36. №4. C. 377-387.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ выявления особи американской норки, являющейся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование окраски меха черный хрусталь или белый Хедлюнд, включающий генотипирование животного по генам COPA и MITF-M. Определяют нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК исследуемой особи американской норки, содержащих позиции генов COPA c.478 и MITF-M c.33+1. Сравнивают последовательности упомянутых фрагментов ДНК с референсными последовательностями генов COPA (ENSNVIT00000001038.1, Ensembl v107) и MITF-M (ENSNVIT00000002796.1, Ensembl v107). Выявляют наличие и количество или отсутствие однонуклеотидной замены COPA c.478 C>T и MITF-M c.33+1 G>A в нуклеотидной последовательности упомянутых фрагментов ДНК. Определяют генотип исследуемой особи американской норки по мутациям, обуславливающим развитие окрасок меха черных хрусталь и белый Хедлюнд. Также представлено применение указанного способа для отбора особей американской норки, являющихся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование окраски меха черный хрусталь или белый Хедлюнд, среди имеющегося поголовья фермерских норок. Изобретение расширяет арсенал средств определения окрасов норок. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Способ выявления особи американской норки, являющейся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование окраски меха черный хрусталь или белый Хедлюнд, включающий генотипирование животного по генам COPA и MITF-M, а именно:

а) определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК исследуемой особи американской норки, содержащих позиции генов COPA c.478 и MITF-M c.33+1;

б) сравнение последовательности упомянутых фрагментов ДНК с референсными последовательностями генов COPA (ENSNVIT00000001038.1, Ensembl v107) и MITF-M (ENSNVIT00000002796.1, Ensembl v107);

в) выявление наличия и количества или отсутствия однонуклеотидной замены COPA c.478 C>T и MITF-M c.33+1 G>A в нуклеотидной последовательности упомянутых фрагментов ДНК;

г) определение генотипа исследуемой особи американской норки по мутациям, обуславливающим развитие окрасок меха черных хрусталь и белый Хедлюнд.

2. Способ по п. 1, где фрагмент ДНК исследуемой особи американской норки, содержащий позицию гена COPA c.478, получают путём амплификации ДНК исследуемой особи американской норки с использованием праймеров SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 4.

3. Способ по п. 1, где желаемая цветовая вариация отличается от темно-коричневой.

4. Способ по п. 1, где однонуклеотидная замена является маркером проявления окраски черный хрусталь у животного, гетерозиготного по аллелю C^r (C^r/+) и гомозиготного по аллелю H (C^r/+ H/H).

5. Способ по п. 1, где однонуклеотидная замена является маркером проявления преимущественно белой окраски меха у животного, гомозиготного по аллелю C^r (C^r/C^r) и гомозиготного или гетерозиготного по аллелю H (C^r/C^r H/H; C^r/C^r H/h).

6. Способ по п. 1, где однонуклеотидная замена является маркером проявления преимущественно белой окраски меха у животного, дигетерозиготного по аллелям C^r и h (C^r/+ H/h).

7. Способ по п. 1, где определение нуклеотидной последовательности фрагментов ДНК проводят секвенированием по методу Сенгера.

8. Способ по п. 1, где определение нуклеотидной последовательности ДНК проводят секвенированием NGS.

9. Способ по п. 1, где выявление наличия или отсутствия однонуклеотидной замены проводят методом ПЦР-ПДРФ.

10. Способ по п. 1, где выявление наличия или отсутствия однонуклеотидной замены проводят методом ПЦР в реальном времени с использованием флуоресцентных зондов типа TaqMan.

11. Способ по п. 1, где выявление наличия или отсутствия однонуклеотидной замены проводят методом аллель-специфичной ПЦР.

12. Способ по п. 8, где выявление наличия или отсутствия однонуклеотидной замены проводят методом гибридизации на чипах.

13. Применение способа по п. 1 для отбора особей американской норки, являющихся носителем по меньшей мере одного аллеля, обуславливающего формирование окраски меха черный хрусталь или белый Хедлюнд, среди имеющегося поголовья фермерских норок.

14. Применение по п. 13, где отобранных животных используют для получения от них потомства с заданной окраской меха.