Способ прогнозирования исхода распространённой меланомы кожи при проведении терапии ингибиторами контрольных точек Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 A61B5/00 A61P35/00 

Изобретение относится к области медицины, к химиотерапии и может быть использовано для прогнозирования ответа на лечение ингибиторами контрольных точек генерализованной меланомы кожи.

Меланома кожи представляет собой опасное заболевание с агрессивным клиническим течением и склонностью к раннему прогрессированию. Основными критериями прогнозирования течения меланомы кожи являются морфологические характеристики, такие как толщина опухоли по Бреслоу и глубина инвазии по Кларку.

Также согласно литературным источникам меланома обладает иммуногенными свойствами и способна хорошо отвечать на иммунотерапию (см. Carr S., Smith C., Wernberg J. Epidemiology and risk factors of melanoma. The Surgical Clinics of North America. 2020; 100(1):1-12. doi: 10.1016/j.suc.2019.09.005.; см. O'Neill C. H., Scoggins C. R. Melanoma. Journal of Surgical Oncology. 2019;120(5):873-881. doi: 10.1002/jso.25604.; Iglesias-Pena N., Paradela S., Tejera-Vaquerizo A., Boada A., Fonseca E. Cutaneous melanoma in the elderly: review of a growing problem. Actas 2019;110(6):434-447. doi: 10.1016/j.ad.2018.11.009).

Из патентных источников известны следующие способы.

Известен «Способ определения ответа пациента с диагнозом меланома кожи на анти-PD1-терапию» (см. патент RU 0002771080 C, опубл. 29.03.2022 г.). Способ заключается в выделении ДНК из образца кала пациента с диагнозом меланома кожи, полногеномное метагеномное секвенирование, анализ полученных данных; определение представленности микробной ДНК. Недостатками метода являются трудоемкость, дорогостоящее специальное оборудование и длительность процесса.

Также известен «Способ прогноза эффективности терапии меланомы» (см. патент RU 0002766739С1, опубл. 15.03.2022 г.), заключающийся в количественном определении опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ) с субпопуляцией лимфоцитов в опухолевой ткани пациента, полученной методом кор-биопсии и прогнозируют эффективность иммунотерапии меланомы ниволумабом. Недостатком данного способа является отсутствие возможности его использования, при невозможности получения биоптата, и не подходит при использовании пембролизумаба.

Известен также метод оценки инфильтрации опухолевой ткани лимфоцитами, предложенный в 2018 году международной рабочей группой по иммуноонкологическим биомаркерам «Оценка опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов в солидных опухолях: обзор практических подходов для патологов и предложение стандартизированной методики от Международной Рабочей Группы по Иммуноонкологическим биомаркерам» (см. Assessing tumor infiltrating lymphocytes in solid tumors: a practical review for pathologists and proposal for a standardized method from the International Immuno-Oncology Biomarkers Working Group, 2018, https://doi.org/10.1097/PAP.0000000000000162). Данный метод заключается в использовании алгоритма, который основывается на оценке гистологических срезов, окрашенных гематоксилином и эозином. Процедура включает выполнение ряда последовательных шагов: 1) определение опухолевой области; 2) определение стромальной и внутриопухолевой областей, в пределах которых необходимо определить «инвазивный край», представляющий собой область в 1мм, отделяющую массу злокачественных клеток от непораженных клеток; 3) сканирование обозначенных областей при помощи камеры светового микроскопа на малом увеличении; 4) определение типа опухолевого инфильтрата; 5) подсчет процента ОИЛ отдельно для стромальной и внутриопухолевой областей.

При необходимости отдельно указывается процент околоопухолевых лимфоцитов (ОИЛ, прилегающих к инвазивному краю). Данный метод может выступать в качестве референтного для других диагностических систем, таких как цифровая численная оценка ОИЛ на иммуногистохимическом срезе или мРНК профилирование. Данный метод имеет ряд недостатков, прежде всего связанных с его субъективностью. Помимо субъективной оценки гистологического среза, результаты которой зависят, в том числе от опытности специалиста, другим недостатком метода является необходимость проведения инвазивной процедуры биопсии.

Известен метод определения популяционного состава опухолевой ткани «Определение и измерение опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов» (см. Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes, SG11201403212R, 12.12.2012 г.). Данный метод основан на определении количества, концентрации и/или соотношения клеток (в частности, лимфоцитов, инфильтрирующих опухолевую или поврежденную аутоиммунным процессом ткань) и методы прогноза терапии, основанные на данных измерениях. Недостатком данного метода является необходимость одновременного забора двух видов биологического материала - периферической венозной крови и биоптата пораженной ткани - и проведение сортировки лимфоцитов на субпопуляции с последующим получением определенного пула клеток и определением клонотипа, что является сложным, длительным, дорогостоящим процессом.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка способа прогнозирования ответа на терапию ингибиторами контрольных точек при распространённой меланоме кожи, позволяющего на амбулаторном этапе прогнозировать возможный исход заболевания.

Технический результат достигается тем, что у пациентов перед назначением анти- PD-1 терапии, методом проточной цитофлуометрии определяют относительное (процентное) содержание DN, T-reg, CD8+HLADR, CD4+HLADR, CD8+CD95+ и NK, проводят клиническую оценку распространенности заболевания, затем рассчитывают индивидуальный риск прогрессирования меланомы кожи по формуле

Y=expz/(1+expz),

где Y - вероятность прогрессирования онкологического заболевания (от 0 до 1), z - коэффициент регрессии:

z= -25,5+0,29*Х1+0,64*Х2+0,18*Х3-0,013*Х4+0,25*Х5+0,13*Х6,

Х1-Х6 - относительное (процентное) количество лимфоцитов:

Х1 - DN; Х2 - T-reg; Х3 - CD8+HLADR; Х4 - CD4+HLADR; Х5 - CD8+CD95+; Х6 - NK; -25,5, 0,29, 0,64, 0,18, -0,013, 0,25, 0,13 -коэффициенты.

При значении Y равном или более 0,25 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания.

Для лучшего понимания способа приводим фигуры.

На фигуре 1 представлено соотношение чувствительности и специфичности при оценке риска прогрессирования меланомы по комплексу иммунологических показателей.

На фигуре 2 изображено окно программы MS Office Excel 2016 для автоматического расчета вероятности прогрессирования меланомы кожи опухоли у пациента С.

На фигуре 3 изображено окно программы MS Office Excel 2016 для автоматического расчета вероятности прогрессирования меланомы кожи у пациента Р.

Способ осуществляется следующим способом.

На амбулаторном этапе, при обследовании, перед назначением ингибиторов PD-1 определяют некоторые показатели иммунного статуса в периферической крови больного следующим способом: у больного производят забор крови из периферической вены стандартным способом, определяют относительное (процентное) количество лимфоцитов DN, T-reg, CD8+HLADR, CD4+HLADR, CD8+CD95+ и NK методом проточной цитофлуометрии, затем рассчитывают индивидуальный риск прогрессирования меланомы кожи по формуле: Y=expz/(1+expz), где Y - вероятность прогрессирования онкологического заболевания (от 0 до 1), z - коэффициент регрессии:

z= -25,5+0,29*Х1+0,64*Х2+0,18*Х3-0,013*Х4+0,25*Х5+0,13*Х6, Х1-Х6 - относительное (процентное) количество лимфоцитов:

Х1 - DN; Х2 - T-reg; Х3 - CD8+HLADR; Х4 - CD4+HLADR; Х5 - CD8+CD95+; Х6 - NK; -25,5, 0,29, 0,64, 0,18, -0,013, 0,25, 0,13 -коэффициенты.

При значении Y равном или более 0,25 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания.

В исследование были включены данные о 30 пациентах с верифицированным диагнозом генерализованная меланома кожи, получивших лечение в ФГБУ «НМИЦ онкологии» МЗ РФ с 2019 по 2021 гг. Средний возраст больных составил 60 лет. Лечение пациентов проводили с применением анти - PD-1 терапии (пембролизумаб 200 мг в/в, цикл 21 день или ниволумаб 480 мг в/в, цикл 28 дней), до появления достоверных признаков прогрессирования процесса или непереносимой токсичности лечения. Больные были разделены на две группы: 1-я - пациенты с общим ответом (n=21), 2-я - пациенты с прогрессированием заболевания (n=9).

Методом логит-регрессии был проведен статистический анализ иммунологических показателей, позволивший выявить ряд факторов, позволяющих оценить риск прогрессирования меланомы кожи.

Проведенный анализ установил наличие нелинейной связи между риском прогрессирования меланомы при лечении ИТ и целым комплексом иммунологических показателей. В данный комплекс пошагово были включены значения относительного (процентного) количества лимфоцитов DN, T-reg, CD8+HLADR, CD4+HLADR, CD8+CD95+ и NK. Относительный риск, включенных в модель предикторов, отражающий влияние на прогрессирование меланомы, представлен в таблице 1.

Таблица 1
Относительный риск влияния параметров модели на развитие прогрессирования меланомы при лечении ИИКТ Показатель Относительный риск (ОР) ДИ ОР р DN 1,932 1,463-2,781 0,012 T-reg 2,890 2,016-4,392 0,0001 CD8+HLADR 1,802 1,172-2,576 0,017 CD4+HLADR 1,587 1,118-2,894 0,021 CD8+CD95+ 1,887 1,342-2,863 0,011 NK 1,740 1,217-2,978 0,027

Примечание: ОР - относительный риск, ДИ - доверительный интервал

Обращает на себя внимание выраженная зависимость прогрессирования меланомы при ЦМ лечении в большей мере от T-reg (OР = 2,89, р = 0,0001) и DN (OР = 1,932, р = 0,012) на этапе первой точки наблюдения.

Коэффициенты перед параметрами модели и постоянная математического выражения определены в результате регрессионного анализа по первичным статистическим данным.

Статистическая значимость модели определения вероятности прогрессирования меланомы при терапии ИИКТ по комплексу иммунологических параметров была высокой - χ²=19,93, р=0,0029.

Далее методом ROC анализа была найдена дифференциальная точка разделения для Y, при достижении и превышении которой риск прогрессирования меланомы повышался. Точка cut-off составила 0,24. При превышении разделительной точки 0,24 с диагностической чувствительностью 88,89% и специфичностью 80,95% риск прогрессирования меланомы повышался (см. Фиг. 1).

Площадь по ROC кривой составила 0,921±0,0496 (доверительная вероятность от 0,762 до 0,987), что свидетельствовало об отличном качестве прогностической модели. Доверительная вероятность отклонения ROC кривой от диагональной линии была высокой и составила р<0,0001(z=8,48) (см. Таблица 2).

Таблица 2
Диагностическая чувствительность и специфичность при различных уровнях прогностического коэффициента Y Критерий ДЧ ДИ ДЧ ДС ДИ ДС ОШ ≥0,002 100,00 66,4 - 100,0 0,00 0,0 - 16,1 1,00 >0,044 100,00 66,4 - 100,0 66,67 43,0 - 85,4 3,00 >0,110 88,89 51,8 - 99,7 66,67 43,0 - 85,4 2,67 >0,236* 88,89 51,8 - 99,7 80,95 58,1 - 94,6 4,67 >0,253 77,78 40,0 - 97,2 80,95 58,1 - 94,6 4,08 >0,354 77,78 40,0 - 97,2 90,48 69,6 - 98,8 8,17 >0,609 55,56 21,2 - 86,3 90,48 69,6 - 98,8 5,83 >0,661 55,56 21,2 - 86,3 100,00 83,9 - 100,0 >0,992 0,00 0,0 - 33,6 100,00 83,9 - 100,0

Примечание: ДЧ - диагностическая чувствительность, ДИ - доверительный интервал, ДС - диагностическая специфичность, ОШ - отношение шансов, * - точка cut-off.

В табличном процессоре Excel произведена автоматизация расчетов. Данные пациентов необходимо внести в маркированную желтым цветом область и после нажатия кнопки Enter автоматически рассчитывается как значение прогностического коэффициента, так и производится его качественная оценка.

Индивидуальные значения больного подставляются в математическую модель и рассчитывается вероятность прогрессирования меланомы кожи при терапии ИИКТ.

Для удобства расчетов в табличном процессоре Ms Excel создан файл для расчета вероятности прогрессирорования меланомы кожи на фоне ИИКТ, окна которого представлены на фигурах 2,3.

Приводим клинические примеры применения способа.

Клинический пример №1.

Пациент С., 1959 г.р., поступил в отделение противоопухолевой лекарственной терапии 17.12.2018г.

14.05.2018 выполнено удаление образования на коже поясничной области слева. Гистологически - меланома, преимущественно из эпителиоподобных клеток с изъязвлением, лимфолейкоцитарной инфильтрацией и небольшим количеством пигмента, обширными очагами некроза с инвазией сосудистых пространств, инвазия 3 степени по Кларку, толщина 12 мм по Бреслоу, удалена в пределах здоровых тканей. При анализе соматических мутаций в гене BRAF обнаружена мутация V600E в 15 экзоне. В результате проведенного обследования и хирургического лечения установлен диагноз: (С43.7) Меланома кожи поясничной области слева BRAFmut рT4bN0M0, St IIc, клиническая группа 2. В июне-июле 2018 проведена дистанционная гамматерапия на пахово-бедренные лимфоузлы слева до СОД 48 изоГр. Рекомендованную адъювантную терапию интерфероном 2-альфа пациент не получал. В декабре 2018 пациент обратился повторно с жалобами на кашель и боли в грудной клетке, а также отметил появление подкожных образований правой верхней конечности. При контрольной СРКТ органов грудной клетки, брюшной полости и малого таза выявлены множественные метастатические очаги в легких с обеих сторон (справа до 0.7 см, слева до 0.6 см), в обеих долях печени до 1.8 см, в селезенке - 1.7 см, остеолитические очаги в грудине до 1.5 см, ребрах до 1.1 см, лопатке до 1.1 см, в телах позвонков до 1.2 см. При осмотре отмечены внутрикожные образования верхних конечностей. При МРТ головы выявлены метастазы в правой теменной доле головного мозга 6х7 мм и тела С2 позвонка.

При остеосцинтиграфии - признаки множественных остеодеструктивных измений костей скелета в проекции костей черепа, грудины, ребер, Th1-L5, левой ключицы, правой лопатки, плечевых и бедренных костей, правого плечевого сустава, костей таза, коленных суставов.

С декабря 2018 была начата иммунотерапия ниволумабом в режиме 240 мг каждые 14дней, на фоне остеомодифицирующей терапии (золедроновая кислота 4 мг каждые 28 дней). При контрольном СРКТ органов грудной клетки, брюшной полости и малого таза в феврале 2019 отмечена стабилизация со стороны метастазов в легких, печени, селезенки и костные структуры. Также отмечен регресс подкожных образований правой верхней конечности.

Результаты иммунологического обследования были следующими: DN-7,4; Treg- 6,5; CD8+HLADR- 4,5; CD4+HLADR-5,1; CD8+CD95+-53,7, NK-12,7

Данные показатели внесены в формулу (см. Фиг. 2):

z= -25,5+0,29*7,4+0,64*6,5+0,18*4,5-0,013*5,1+0,25*53,7+0,13*12,7= -3,4

Y= = 0,033

У пациента C. риск метастазирования опухоли низкий, поскольку величина Y менее 0,25.

На этапах лечения выполнялось СРКТ и МРТ обследование, где определялись только метастатические очаги в костях (ребра, грудина, тела позвонков), продолжает лечение золедроновой кислотой

В настоящее время пациент находится под динамическим наблюдением.

Клинический пример №2.

Больной Р., 1961 г.р, наблюдается и лечится в нашем учреждении с января 2020. Считает себя больным с апреля 2019, когда по месту жительства было удалено образование кожи волосистой части головы без морфологического исследования.

В августе 2019 заметил опухолевидное образование в околоушной области справа, обратился к врачу по месту жительства, где выполнена пункционная биопсия опухоли. Цитологически - метастаз аденокарциномы. околоушной области справа. При УЗИ - правая околоушная слюнная железа 5,3х2,4х4,8 см, в среднем сегменте анэхогенное образование с гиперэхогенным неоднородным компонентом, размерами 2,0х2,6 см, при допплерографии - единичные интранодулярные сосуды, в нижнем полюсе кистозное образование размерами 1,6х1,4 см, шейные лимфатические узлы справа 0,7-0,8-1,4 см, слева 1,0-1,4 см. Заключение - образование и киста правой околоушной слюнной железы, гиперплазия шейных лимфатических узлов. Выполнена трепан-биопсия опухоли. Гистологически в трепан-биоптате слюнной железы опухоль солидного и альвеолярного строения, представленная гиперхромными клетками с полиморфным ядром, обильной цитоплазмой, наличием пигмента, очагами некроза,морфологическая картина характерна для меланомы. Цитологически - метастаз пигментной меланомы. При ИГХ исследовании - морфологическая картина и иммунофенотип клеток опухоли в объеме исследованного материала характерны для метастаза эпителиоидноклеточной меланомы с небольшим количеством пигмента с позитивным PDL-1 статусом. При молекулярно-генетическом исследовании ДНК мутации BRAF V600E не обнаружено. При СРКТ головного мозга, грудной клетки, брюшной полости и малого таза справа в области слюнной железы выявлены плотные образования, по структуре - лимфатические узлы до 2,8 см. Диагноз: (С43.4) Меланома кожи волосистой части головы, состояние после хирургического лечения первичного очага в 2019, прогрессирование процесса с метастазами в околоушные и подчелюстные лимфоузлы справа, 08.2019., BRAFwt, TxN2bM1a (LYM), St IV, кл. гр. 2. Пациенту начата иммунотерапия по схеме ниволумаб 240 мг каждые 14дней.

Результаты иммунологического обследования были следующими:

DN-1,9; Treg- 8,1; CD8+HLADR- 9,1; CD4+HLADR-3,6; CD8+CD95+-69,7, NK-5,6

Данные показатели внесены в формулу (см. Фиг. 3):

z= -25,5+0,29*1,9+0,64*8,1+0,18*9,1-0,013*3,6+0,25*69,7+0,13*5,6 = 0

Y= = 0,495

У пациента Р. риск метастазирования опухоли высокий, поскольку величина Y более 0,25.

При СРКТ головного мозга, грудной клетки, брюшной полости и малого таза после 8 курсов иммунотерапии справа в области слюнной железы выявлены плотные образования, по структуре - лимфатические узлы до 4 см, паховые лимфатические узлы до 2.8 см. выполнена пункционная биопсия паховых лимфатических узлов.

Цитологически в паховом лимфатическом узле справа метастаз пигментной меланомы, слева - подозрение на метастаз пигментной меланомы (в материале разрушенные элементы лимфатического узла, пигмент). Диагностирована прогрессия заболевания.

Данным способом был рассчитан прогноз 30 пациентам.

Технико-экономическая эффективность способа расчета прогноза ответа на терапию ингибиторами контрольных точек при распрострасненной меланоме кожи заключается в том, что его применение позволяет оценить прогноз течения заболевания уже на амбулаторном этапе, за счёт определения показателей иммунного статуса в дополнение к стандартным критериям, таким как распространенность опухолевого процесса и толщина опухоли.

Изобретение относится к области медицины, к химиотерапии и может быть использовано для прогнозирования исхода распространённой меланомы кожи при проведении терапии ингибиторами контрольных точек. Способ включает: исследование крови, определение риска прогрессирования меланомы кожи, где на амбулаторном этапе, перед назначением анти- PD-1 терапии, методом проточной цитофлуометрии определяют относительное, процентное количество лимфоцитов DN, T-reg, CD8+HLADR, CD4+HLADR, CD8+CD95+ и NK. Затем проводят клиническую оценку распространенности заболевания, рассчитывают индивидуальный риск прогрессирования меланомы кожи (Y) по формуле. При значении Y равном или более 0,25 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания. Изобретение позволяет оценить прогноз течения заболевания уже на амбулаторном этапе за счёт определения показателей иммунного статуса в дополнение к стандартным критериям, таким как распространенность опухолевого процесса и толщина опухоли. 3 ил., 2 табл., 2 пр.

Способ прогнозирования исхода распространённой меланомы кожи при проведении терапии ингибиторами контрольных точек, включающий исследование крови, определение риска прогрессирования меланомы кожи, отличающийся тем, что на амбулаторном этапе, перед назначением анти- PD-1 терапии, методом проточной цитофлуометрии определяют относительное, процентное количество лимфоцитов DN, T-reg, CD8+HLADR, CD4+HLADR, CD8+CD95+ и NK, проводят клиническую оценку распространенности заболевания, затем рассчитывают индивидуальный риск прогрессирования меланомы кожи по формуле: Y=expz/(1+expz), где Y - вероятность прогрессирования онкологического заболевания (от 0 до 1), z - коэффициент регрессии: z= -25,5+0,29*Х1+0,64*Х2+0,18*Х3-0,013*Х4+0,25*Х5+0,13*Х6, где Х1-Х6 - относительное процентное количество лимфоцитов: Х1 - DN, Х2 - T-reg, Х3 - CD8+HLADR, Х4 - CD4+HLADR, Х5 - CD8+CD95+, Х6 - NK, при значении Y равном или более 0,25 прогнозируют неблагоприятное течение заболевания.