СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ COVID-19 И ВАКЦИНА, ПОЛУЧЕННАЯ СПОСОБОМ Российский патент 2023 года по МПК C12N7/04 A61K35/76 A61P31/14 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и иммунологии, конкретно к инактивированной цельновирионной вакцине против COVID-19 и способу ее получения путем культивирования вирусного штамма-возбудителя с последующей инактивацией и очисткой вирусного антигена. Полученная предложенным способом вакцина может быть использована для профилактики инфекции COVID-19.

Предшествующий уровень техники

Коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), который стал причиной глобальной пандемии COVID-19, был впервые обнаружен в Китае в конце 2019 года. Вирус SARS-CoV-2, также называемый как 2019-nCoV (далее - вирус) относится к семейству Coronaviridae, роду Betacoronavirus (betaCoV), его природным резервуаром являются летучие мыши. Геном вируса представлен одноцепочечной РНК, состоящей из 29903 п.н. (эталонная полноразмерная последовательность генома вируса штамма Wuhan-Hu-1 размещена в Базе данных Genbank под номером NC_045512.2), который кодирует полипептид из 9860 аминокислот, включающий 25 неструктурных белков и 4 структурных белка, таких как белки шипа (S), оболочки (E), мембраны (M) и нуклеокапсида (N). Нуклеотидная последовательность вирусного генома на 89% идентична SARS-подобному CoVZXC21 вирусу летучей мыши и на 82% идентична SARS-CoV вирусу человека (Chan J.F.-W. et al., Genomic characterization of the 2019 novel human-pathogenic coronavirus isolated from a patient with atypical pneumonia after visiting Wuhan, 2020, Emerg Microbes Infect,., 2020 Jan 28;9(1):221-236). Вирус чувствителен к ультрафиолетовому излучению, теплу и липидным растворителям.

Передача инфекции SARS-CoV-2 осуществляется воздушно-капельным, воздушно-пылевым и контактным путями. Ведущим путем передачи SARS-CoV-2 является воздушно-капельный, который реализуется при кашле, чихании и разговоре на близком расстоянии. Возможен контактный путь передачи, который реализуется во время рукопожатий и других видах непосредственного контакта с инфицированным человеком, а также через поверхности и предметы, контаминированные вирусом. Кроме того, вирус может передаваться при переливании крови, трансплацентарно и половым путем. Хотя инфекция SARS-CoV-2 может проявляться только легкими симптомами, такими как, как правило, лихорадка и кашель, или даже протекать бессимптомно; в другой крайности это может быть фатальным. Основными симптомами обычно являются высокая температура, кашель и затрудненное дыхание.

В настоящее время SARS-CoV-2 представляет значительную угрозу для здоровья населения. Начиная с 2019 года, вирус быстро распространился по миру и по данным ВОЗ на конец февраля 2023 года привел уже к более чем 757 млн. подтвержденных случаев COVID-19, включая почти 7 млн. смертельных случаев (https://covid19.who.int/). В связи с этим продолжаются поиски терапевтических средств, которые могли бы окончательно остановить переход от инфицирования к развитию тяжелой формы COVID-19.

Внимание исследователей направлено на разработку различных терапевтических стратегий, среди которых предотвращение связывания SARS-CoV-2 с рецепторами на клетках человека, блокировка синтеза и репликации вирусной рибонуклеиновой кислоты (РНК), восстановление врожденного иммунитета хозяина и регуляция специфических рецепторов или ферментов хозяина. Однако, наиболее многообещающим подходом для сдерживания пандемии считаются вакцины, предотвращающие инфицирование SARS-CoV-2 (Вакцины против SARS-CoV-2: светлые и темные стороны, перевод Савицкая Р., размещено 09.08.2021 по адресу https://medach.pro/post/2680).

На сегодняшний день разработаны различные типы вакцин против COVID-19, включая цельновирионные аттенуированные и инактивированные вакцины, пептидные и векторные вакцины, ДНК- и РНК-вакцины, которые направлены на стимуляцию нейтрализующего вирус иммунного ответа организма. По данным ВОЗ на конец февраля 2023 г. известно о разработке 199 вакцин-кандидатов против COVID-19, находящихся на стадии доклинических испытаний, и о 180 вакцинах на стадии клинических испытаний, из них только 22 относятся к инактивированных вакцинам (https://www.who.int/publications/m/item/draft-landscape-of-covid-19-candidate-vaccines).

Доступны к применению для профилактики COVID-19, как минимум, шесть цельновирионных инактивированных вакцин, пять из которых применяются для человека и одна для плотоядных животных, такие как: российские вакцины для человека - КовиВак («Институт полиомиелита им. Чумакова») и для животных - Карнивак-Ков (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), китайские вакцины - CoronaVac и PiCoVacc (Sinovac), а также BBIBP-CorV/COVILO (Sinopharm) и индийская вакцина Covaxin/BBV152 (Bharat Biotech).

В качестве аналогов предлагаемого изобретения могут быть рассмотрены следующие документы, относящиеся к цельновирионным вакцинным препаратам против COVID-19 и способам их получения на основе инактивированных вирусных штаммов.

Международная патентная заявка WO 2022038642 A1, опубл. 24.02.2022, в которой раскрыт способ получения цельновирионной инактивированной вакцины на основе вирусного антигена из штамма NIV-2020-770 вируса SARS-CoV-2 и вакцинный препарат, полученный предложенным способом.

Известный способ включает культивирование штамма SARS-CoV-2 (NIV-2020-770) в клетках Vero, Vero E6 или Vero-TMPRSS2 с последующей инактивацией вируса, очисткой с помощью эксклюзионной или аффинной хроматографии (с использованием Capto core 700, Sepharose CL-4B и др.), проведением диафильтрации и ультрацентрифугирования, концентрированием вирусного антигена с помощью тангенциальной проточной фильтрации (TFF) и разбавления фосфатным буфером с добавлением адъюванта.

Международная патентная заявка WO 2021209060 A1, опубл. 21.10.2021, относящаяся к инактивированной вакцине PiCoVacc против SARS-Cov-2 на основе вирусного антигена из штамма CN3 вируса SARS-CoV-2 и способу ее получения. Для производства PiCoVacc штамм вируса CN3 культивируют в клетках Vero и инактивируют с помощью β-пропиолактона, вирусный антиген очищают с использованием глубинной фильтрации или центрифугирования и двух оптимизированных стадий ионообменной хроматографии (IEC) и/или эксклюзионной хроматографии (SEC), перед эксклюзионной хроматографией инактивированный вирус SARS-Cov-2 обрабатывают нерестрикционной эндонуклеазой, перед смешиванием с адъювантами используют фильтрацию через мембрану с диаметром пор 0,2-0,25 мкм.

Международная патентная заявка WO 2021176434 A1, опубл. 10.09.2021, раскрывает способ получения вакцины против SARS-CoV-2 и вакцину, полученную данным способом. Цельновирионную инактивированную вакцину против COVID-19 получают путем культивирования вируса в клетках Vero/E6 с последующей инактивацией, например, β-пропиолактоном, очисткой периодической адсорбцией с использованием хроматографической среды Capto™ Core 700 (CC700) или CC400 и ультра/диафильтрацией (TFF), после чего добавляют адъюванты. Известная вакцина содержит:

(i) инактивированную частицу SARS-CoV-2, где количество инактивированного вируса SARS-CoV-2 на дозу в вакцине составляет примерно от 0,01 до 25 мАЕ (миллиабсорбционных единиц x минуты), предпочтительно от примерно 0,25 до 2,5 мАЕ по оценке SEC-HPLC;

(ii) CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG-ODN) от 0,25 до 6 мг/мл, предпочтительно примерно 2 мг/мл, т.е. 1 мг/доза; и

(iii) гидроксид алюминия от 0,1 до 2 мг/мл, предпочтительно 1 мг/мл, т.е. 0,5 мг/доза, при этом вакцина доставляется в объеме 0,5 мл.

Эффективное количество вакцины против SARS-CoV-2 на дозу составляет от 0,05 до 50 мг общего белка, предпочтительно около 5 мкг общего белка/доза, т.е. как измерено (p)BCA. Вакцина обеспечивает профилактику инфекции SARS-CoV-2 без индукции антителозависимого усиления (ADE) SARS-CoV-2-ассоциированного заболевания (COVID-19) или иммунопатология у субъекта.

Следует отметить преимущества инактивированных вакцин перед живыми, которые заключаются в отсутствии риска инфицирования, поскольку убитые вирусы не могут мутировать, соответственно, в них нет потенциальной опасности как у живых вакцин, в ходе репликации которых в организме хозяина возможен возврат к дикому типу или рекомбинация с вирусом дикого типа. По сравнению с векторными и мРНК-вакцинами преимущества инактивированных вакцин состоят в том, что пациенту вводится цельный вирусный капсид, что приводит к формированию иммунитета против всего комплекса вирусных белков, а не только фрагмента S-белка, ранее считавшегося консервативным у мутировавших штаммов, но реальные условия пандемии показали иное, что привело к снижению эффективности как векторных, так и мРНК-вакцин, нацеленных исключительно на S-белок.

У известных инактивированных вакцин есть и недостатки, связанные с недостаточной иммуногенной активностью, а именно, недостаточным формированием Т-клеточного противовирусного иммунитета, что требует использования адъювантов для повышения их эффективности, сложностями их производства и нежелательными побочными явлениями.

В связи с этим существует потребность в разработке технологии получения новых вакцинных препаратов, эффективных против COVID-19. Идеальная вакцина-кандидат против COVID-19 должна обладать высокой иммуногенностью, надежной способностью вызывать эффективный иммунный ответ с помощью нейтрализующих антител, обеспечивать практически полную защиту от тяжелых форм COVID-19 и быть безопасной, то есть не нести значительных побочных эффектов.

В качестве ближайшего аналога (прототипа) предлагаемого изобретения может быть выбран способ получения цельновирионной инактивированной вакцины против SARS-CoV-2, раскрытый в WO 2021176434 A1, 10.09.2021.

В качестве недостатков прототипа можно отметить следующие:

- использование исходного уханьского штамм коронавируса, который уже не актуален с эпидемической точки зрения;

- недостаточная очистка вирусного антигена, что может привести к возникновению нежелательных побочных эффектов при использовании содержащего его вакцинного препарата;

- количество действующего вещества - инактивированного вирусного антигена в составе вакцинного препарата выражено в условных единицах, которые не отражают абсолютное количество антигена и препятствуют обеспечению воспроизводимости и масштабированию процесса в условиях GMP.

Таким образом, в данной области техники существует проблема в недостатке на фармрынке высокочистых эффективных вакцинных препаратов против COVID-19, полученных путем инактивации вирусного штамма-возбудителя COVID-19.

Задача предлагаемого изобретения состоит в разработке способа получения вакцины, эффективной против коронавирусной инфекции, вызванной возбудителем COVID-19.

Раскрытие сущности изобретения

Если не определено иное, все термины и понятия, применяемые в раскрытии настоящего изобретения, включая технические и научные термины, имеют значение, которое обычно понятно среднему специалисту в технической области, к которой принадлежит настоящее изобретение. Как правило, используемая классификация и методы клеточной и молекулярной биологии, иммунологии, микробиологии, вирусологии, аналитической, препаративной, медицинской и фармацевтической химии, описанные в настоящем документе, хорошо известны специалистам и широко применяются в данной области. Методики получения вирусов и культивирования клеток-продуцентов, выделения целевого белка, очистки и проверки активности целевого белка осуществляют в соответствии с инструкциями производителя, как это обычно осуществляется в данной области, или как это подробно описано в настоящем документе.

Все документы, цитируемые или приводимые в качестве ссылок в настоящем описании изобретения, и все документы, цитируемые или приводимые в качестве ссылок в документах, цитируемых в настоящем описании изобретения, вместе с любыми инструкциями производителя, описаниями и режимами использования способа или продуктов, упомянутых в настоящем документе или в любом документе, включенном в настоящий документ посредством ссылки, включены в предложенный документ посредством ссылки и могут быть использованы при осуществлении предложенного изобретения на практике.

Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении степени очистки вирусного антигена цельновирионной инактивированной вакцины и предлагаемом составе вакцины на основе очищенного вирусного антигена из уникального штамма nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2, депонированного в специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным № 1339.

Также следует отметить дополнительные преимущества предложенного изобретения перед ближайщим аналогом, которые заключаются в:

- использовании высоковирулентного штамма, который сохраняется таковым среди известных вариантов вируса и является высоко патогенным для человека, что обеспечивает высокую иммуногенность и эффективность вакцины, в том числе перекрестную;

- снижении рисков возникновения нежелательных побочных эффектов при использовании вакцинного препарата на основе инактивированного вирусного антигена за счет повышения степени его очистки;

- однозначном определении дозы инактивированного вируса, что позволяет проводить исследования и разработку (GLP), а также масштабировать производство (GMP);

- использовании оптимально низких концентраций адъювантов в комбинации, прежде всего CpG-ODN, что значительно снижает риски по безопасности препарата при массовом применении.

Указанный технический результат достигается за счет предложенного способа получения вакцины против COVID-19, который включает культивирования штамма возбудителя указанной инфекции, а именно, nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2 в монослое клеток Vero с последующей инактивацией вируса, очисткой вирусного антигена и дополнением состава вакцины фармацевтически приемлемыми эксципиентами, с получением, таким образом, вакцины против указанной инфекции.

Для получения вакцины согласно настоящему документу используют уникальный штамм nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021, который выделен из биопробы от больного в ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России и депонирован в специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным № 1339.

В соответствии с настоящим изобретением, термин «очистка вирусного антигена» означает основные способы очистки или основные стадии очистки, такие способы очистки как хроматография или ультрафильтрация/диафильтрация, при необходимости, могут быть использованы различные методы концентрирования и доочистки, например, центрифугирование в градиенте плотности сахарозы (периодическое центрифугирование). Используемой хроматографией может быть ионообменная хроматография, например, анионобменная или катионобменная хроматография, мультимодальная хроматография (хроматография на мультимодальных матрицах), хроматография гидрофобного взаимодействия, комбинированная хроматография, псевдоаффинная хроматография, аффинная хроматография, жидкостно-жидкостная хроматография и тому подобное.

В использованном в настоящем документе значении термин «ультрафильтрация» или «UF» означает метод, в соответствии с которым раствор или суспензию фильтруют через полупроницаемую мембрану, которая задерживает макромолекулы, пропуская растворитель и мелкие молекулы растворенного вещества. Ультрафильтрация может быть использована для увеличения концентрации макромолекул в растворе или суспензии.

В использованном в настоящем документе термин «диафильтрация» или «DF» означает специальный класс фильтрации, в соответствии с которым задержанное вещество разбавляется растворителем и повторно фильтруется, в результате чего уменьшается концентрация растворимых компонентов проникающего вещества. Диафильтрация может вызывать или не вызывать увеличения концентрации задержанных компонентов, включая, например, белки. Например, в случае диафильтрации в непрерывном режиме растворитель постоянно добавляется к задержанному веществу со скоростью образования фильтрата. В таком случае объем задержанного вещества и концентрация удерживаемых компонентов не изменяется во время данного процесса. С другой стороны, в случае диафильтрации в периодическом режиме или диафильтрации с последующим разбавлением за стадией ультрафильтрации следует добавление растворителя со стороны задержанного вещества; если объем растворителя, добавляемого со стороны задержанного вещества, не равен или превышает объем образованного фильтрата, то концентрация удерживаемых компонентов увеличивается. Диафильтрация может быть использована для изменения значения рН, ионной силы, состава соли, состава буфера или других свойств раствора или суспензии макромолекул.

Термин «ультрафильтрация/диафильтрация» или «UF/DF» означает любой процесс, метод или комбинацию методов последовательного или одновременного выполнения ультрафильтрации и/или диафильтрации.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения способ предусматривает проведение очистки вирусного антигена с использованием анионообменной и мультимодальной хроматографии с дополнительной ультрафильтрацией/диафильтрацией. Наиболее предпочтительно очистку вирусного антигена осуществляют путем последовательного проведения начального этапа ультрафильтрации/диафильтрации, анионообменной и мультимодальной хроматографии и заключительного этапа ультрафильтрации/диафильтрации.

Также указанный технический результат достигается за счет полученной предложенным способом вакцины против инфекции COVID-19, вызываемой вирусом тяжелого острого респираторного синдрома SARS-Cov-2, на основе очищенного инактивированного вирусного антигена возбудителя указанной инфекции в эффективном количестве с фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

В качестве очищенного инактивированного вирусного антигена возбудителя COVID-19 используют вакцинный антиген из уникального штамма nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2, депонированного в специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным № 1339.

Вирусный антиген используют в эффективном количестве в составе фармацевтической композиции, в частности, вакцины, которая представляет собой средство, вызывающее специфический иммунный ответ против вируса SARS-Cov-2.

Термин «фармацевтическая композиция», «вакцинная композиция», «вакцина» и подобные им используют в настоящем документе взаимозаменяемо и они относятся к составу, содержащему терапевтически эффективный агент, предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемыми эксципиентами. Указанная фармацевтическая композиция полезна для лечения, предотвращения или снижения тяжести заболевания или расстройства путем введения указанной фармацевтической композиции субъекту, предпочтительно для профилактики, предотвращения или предупреждения возникновения коронавирусного заболевания, вызванного коронавирусом 2 острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), путем индукции специфического иммунитета.

Термин «субъект», «пациент», «индивидуум» и подобные им используют в настоящем документе взаимозаменяемо и они относятся к любому животному, поддающемуся воздействию предложенными средствами и способами. Предпочтительно субъект, пациент или индивидуум является человеком любого пола и любого возраста.

Термин «профилактика», «предотвращение» или «предупреждение» и подобные им означает замедление или предотвращение появления симптомов заболевания или инфекции, предпочтительно симптомов заболевания COVID-19 или инфекции, вызванной вирусом SARS-Cov-2.

Термин «индукция иммунитета» или «индукция иммунного ответа», как используют в настоящем изобретении, относится к специфическому контролю или к влиянию на активность иммунного ответа и включает активацию иммунного ответа, стимуляцию иммунного ответа, усиление иммунного ответа.

Термин «специфический иммунитет», согласно настоящему документу, относится к состоянию невосприимчивости к заболеванию вследствие индукции иммунного ответа, предпочтительно, к невосприимчивости к COVID-19 вследствие индукции иммунного ответа против вируса SARS-Cov-2.

Термин «заболевание» относится к состоянию здоровья субъекта, при котором нарушаются функции поддержания гомеостаза, и в том случае, если заболевание не облегчают, то здоровье субъекта продолжает ухудшаться или не улучшается.

Термин «инфекция», как указано в настоящем документе, относится к заражению живого организма инфекционным агентом, процессу его размножения или развития в организме, а также реакции организма на присутствие в нем инфекционного агента и на выделяемые им токсины, предпочтительно инфекция вызывается вирусом SARS-Cov-2 и представляет собой инфекцию COVID-19.

Под термином «инфекционное заболевание» в настоящем документе понимается развитие заболевания в результате инфекции, предпочтительно инфекционное заболевание представляет собой коронавирусное заболевание, а именно COVID-19, вызванное таким инфекционным агентом как вирус SARS-Cov-2.

Термин «эффективное количество», в том числе «фармакологически эффективное количество», «профилактически эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое обеспечивает желательную реакцию или желательный эффект отдельно или вместе с дополнительными дозами, в частности, которое избавит в определенной степени от одного или нескольких симптомов заболевания, по поводу которого проводится лечение.

Желательная реакция предпочтительно связана с профилактикой коронавирусного заболевания, вызванного вирусом SARS-Cov-2, а именно с ингибированием или предупреждением возникновения коронавирусного заболевания, вызванного вирусом SARS-Cov-2. Желательным эффектом может быть отсрочка начала или предотвращение наступления COVID-19.

Также желательная реакция связана с лечением коронавирусного заболевания, вызванного вирусом SARS-Cov-2, а именно с ингибированием течения заболевания, облегчении тяжести инфекции, уменьшения одного или нескольких симптомов заболевания, ускорении процесса выздоровления, снижении осложнений основного заболевания и уменьшении выраженности сопутствующих патологических состояний. Желательный эффект включает замедление прогрессирования заболевания, в частности, прекращение заболевания или бессимптомное течение COVID-19.

Эффективное количество описанных в данном документе вакцинных композиций может зависеть от состояния, подлежащего лечению, тяжести заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, размер и массу, продолжительность лечения, тип сопутствующей терапии в случае ее наличия, конкретного способа введения и других факторов. Соответственно, вводимые дозы вакцинных композиций, описанных в данном документе, могут зависеть от множества таких параметров. В том случае, когда реакция пациента или достигаемый эффект недостаточны при исходной дозе, могут использоваться более высокие дозы или эффективно более высокие дозы, достигнутые с помощью другого более точно локализованного пути введения.

Предпочтительно эффективное количество, согласно настоящему документу, представляет собой количество, достаточное для образования у субъекта вируснейтрализующих антиген-специфических антител, а именно, антител против SARS-CoV-2.

Указанное количество рассчитывается на одну дозу вакцины, которая предпочтительно составляет от 0,5 до 10 мл, наиболее предпочтительно 0,5 мл на одно введение субъекту.

Количество указанного вирусного антигена в составе вакцины составляет от 3 до 60 мкг на одну дозу, предпочтительно 7,5-30 мкг на одну дозу, наиболее предпочтительно 15 мкг на одну дозу.

Концентрация указанного вирусного антигена в составе вакцины составляет от 6 до 120 мкг/мл, предпочтительно 15-60 мкг/мл, наиболее предпочтительно 30 мкг/мл.

Используемые в составе фармацевтической композиции по настоящему изобретению фармацевтически приемлемые эксципиенты представляют собой один или несколько адъювантов и фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель. Примеры эксципиентов включают, без ограничения указанными, носители, связующие, разбавители, смазывающие вещества, загустители, поверхностно-активные агенты, консерванты, стабилизаторы, эмульгаторы, буферы.

Фармацевтические композиции могут содержать один или несколько адъювантов или могут вводиться с одним или несколькими адъювантами.

Термин «адъювант» относится к соединению, которое продлевает, усиливает или ускоряет иммунный ответ. Адъюванты включают гетерогенную группу соединений, таких как масляные эмульсии, например, адъюванты Фрейнда, минеральные соединения, такие как квасцы, например, гидроксид алюминия (например, не ограничиваясь указанными, коммерчески доступные гели гидроксида алюминия - Alhydrogel™ (Brenntag Biosector), Rehydragel™ (Reheis), Rehsorptar™ (Armour Pharmaceutical) и др.), бактериальные продукты, такие как токсин Bordetella pertussis или иммуностимулирующие комплексы. Примеры адъювантов включают, без ограничения указанными: LPS, GP96, CpG-содержащие олигодезоксинуклеотиды (CpG-ODN, например, не ограничиваясь указанными, такие как CPG-ODN 1018 (Dynavax Technologies), CpG-ODN 1826 (Синтол), CpG-ODN 2006 (Invivogen), CpG-ODN 2216 (Invivogen) и др.), липопептиды, такие как Pam3Cys, факторы роста и цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины, хемокины, например, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-γ, GM-CSF и другие.

Термин «наполнитель» означает агент, который может быть добавлен к композиции для обеспечения требуемой консистенции, например, изменения объемных свойств, улучшения стабильности и/или регулирования осмоляльности. Примеры обычно используемых наполнителей включают, не ограничиваясь ими, хлорид натрия; сахара, например, сахарозу; полиолы, например, маннит; аминокислоты, например, гистидин, аргинин; поверхностно-активные вещества, например, полисорбат 80 и полимеры.

Термин «носитель» относится к компоненту, который может быть натуральным, синтетическим, органическим, неорганическим, в котором активный компонент объединен для облегчения, усиления или обеспечения возможности введения фармацевтической композиции. Используемый в настоящем документе носитель может быть представлен одним или несколькими совместимыми твердыми или жидкими наполнителями, разбавителями или инкапсулирующими веществами, которые подходят для введения субъекту. Подходящий носитель включает, без ограничения указанными, стерильную воду, раствор Рингера, лактат Рингера, стерильный раствор хлорида натрия, изотонический солевой раствор, полиалкиленгликоли, гидрогенизированные нафталины и, в частности, биосовместимые полимеры лактида, сополимеры лактида/гликолида или сополимеры полиоксиэтилена/полиоксипропилена.

Термин «разбавитель» относится к разбавляющему и/или разжижающему агенту. Более того, термин «разбавитель» включает любую одну или несколько из жидкости, жидкой или твердой суспензии и/или смешивающей среды. Примеры подходящих разбавителей включают буферный раствор, например, фосфатно-солевой буфер (PBS), раствор NaCl (0,9%), этанол, глицерин или воду.

Фармацевтические композиции, согласно настоящему изобретению, могут содержать подходящие добавки, соли, буферы, антиоксиданты, консерванты, агенты, регулирующие осмоляльность, и агенты, регулирующие рН, и, возможно, другие терапевтические агенты, например, другие иммунорегуляторные средства.

Подходящие добавки включают хелатирующие агенты, например, диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA), DTPA-бисамид и другие или кальциевые хелатные комплексы, например, кальция DTPA, CaNaDTPA-бисамид и другие, или, возможно, добавки кальциевой или натриевой солей, например, хлорида кальция, аскорбата кальция, глюконата кальция, лактата кальция и другие.

Подходящие буферы для применения в фармацевтических композициях по настоящему изобретению включают физиологически биосовместимые буферные растворы, например, PBS и другие.

Фосфатно-солевой буфер (PBS) представляет собой физиологически приемлемый буферный солевой раствор на водной основе (pH ~ 7,4), содержащий динатриевый гидрофосфат, хлорид натрия и, в некоторых составах, хлорид калия и дигидрофосфат калия, который помогает поддерживать постоянный рН. Типичный химический состав 1X PBS имеет конечную концентрацию NaCl - 137 мМ/л, KCl - 2.7 мМ/л, Na₂HPO₄ - 10 мМ/л, KH₂PO₄ - 1.8 мМ/л.

При необходимости, состав фармацевтических композиций по настоящему изобретению может быть дополнен подходящими консервантами, например, без ограничения указанными, хлоридом бензалкония, хлорбутанолом, парабеном и тимеросалом и другими.

Фармацевтически приемлемые эксципиенты могут быть выбраны с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики.

Описанные в данном документе фармацевтические композиции можно вводить подкожно, внутрикожно или внутримышечно. В предпочтительном варианте фармацевтические композиции составлены для системного введения путем внутримышечной инъекции.

Предпочтительно в состав вакцины входят такие адъюванты как гидроксид алюминия и/или CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG-ODN) в фармацевтически приемлемом разбавителе, предпочтительно комплексный адъювант - гидроксид алюминия и CpG-ODN в фосфатно-солевом буфере (PBS). При этом гидроксид алюминия используют предпочтительно в количестве 100 - 1000 мкг на одну дозу (в концентрации 200 - 2000 мкг/мл), а CpG-ODN в количестве 1 - 100 мкг на одну дозу (в концентрации 2-200 мкг/мл), наиболее предпочтительно гидроксид алюминия в количестве 500 мкг на одну дозу (в концентрации 1000 мкг/мл) и CpG-ODN в количестве 10 мкг на одну дозу (в концентрации 20 мкг/мл).

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения предложенная композиция вакцины содержит вирусный антиген в концентрации 30 мкг/мл в сочетании с гидроксидом алюминия в концентрации 1000 мкг/мл и CpG-ODN в концентрации 20 мкг/мл с доведением объема раствора фосфатно-солевым буфером (PBS) до 1 мл, и используется в дозе 0,5 мл на одно введение субъекту.

В расчете на одну дозу для введения субъекту, например, в дозе 0,5 мл на одно внутримышечное введение субъекту предложенная композиция вакцины содержит 15 мкг вирусного антигена; 500 мкг гидроксида алюминия; 10 мкг CpG-ODN и PBS до 0,5 мл.

Полученную вакцину расфасовывают во флаконы для сублимационного высушивания или реализации в жидком виде. В жидком виде препарат вакцины предпочтительно представляет собой суспензию для внутримышечного введения и имеет следующее соотношение компонентов:

- инактивированный очищенный вирусный антиген штамма «nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021» в количестве 3 - 60 мкг на одну дозу (в концентрации 6-120 мкг/мл), наиболее предпочтительно в количестве 15 мкг на одну дозу (в концентрации 30 мкг/мл);

- гидроксид алюминия в количестве 100 - 1000 мкг на одну дозу (в концентрации 200 - 2000 мкг/мл), предпочтительно в количестве 500 мкг на одну дозу (в концентрации 1000 мкг/мл);

- CpG-ODN в количестве 1 - 100 мкг на одну дозу (в концентрации 2-200 мкг/мл), наиболее предпочтительно в количестве 10 мкг на одну дозу (в концентрации 20 мкг/мл);

- PBS (натрия гидрофосфат, натрия дигидрофосфат, натрия хлорид, вода для инъекций) - остальное.

Инактивированный очищенный вирусный антиген штамма «nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021» представляет собой суспензию, содержащую очищенные цельновирионные капсиды возбудителя COVID-19, которые полностью сохранили свою белковую и антигенную структуру, но в результате разрушения генетического аппарата потерявшие вирулентность и способность к размножению.

Для приготовления сухого препарата жидкую вакцину высушивают путем вакуумной лиофилизации. Готовую вакцину контролируют на физические свойства, стерильность, иммуногенность, безвредность, авирулентность и т.п.

Вакцину, содержащую инактивированный вирусный материал возбудителя COVID-19, хранят при температуре 2-8°С.

Предложенное применение вакцины обеспечивает индукцию устойчивого иммунного ответа против COVID-19, который позволяет предупредить развитие инфекции, вызываемой вирусом SARS-Cov-2, или ослабить по меньшей мере один из ее симптомов.

Способ применения предложенной вакцины для индукции специфического иммунного ответа против инфекции включает однократное или многократное введение нуждающемуся в этом субъекту вакцинной композиции в дозе, эффективной для лечения COVID-19.

Несмотря на то, что предпочтительным является стимуляция устойчивого иммунитета путем однократного или двукратного введения, для достижения требуемого эффекта возможно вводить дополнительные дозы с помощью такого же или отличающегося пути введения. Например, у детей для достижения достаточных уровней иммунитета могут потребоваться многократные введения дозы вакцины с определенными интервалами на протяжении всего детского возраста, при необходимости, поддержания достаточных уровней защиты против инфекции. Аналогично для взрослых, которые особенно восприимчивы к повторному возникновению или тяжелому протеканию коронавирусной инфекции, например, медицинские или социальные работники, пожилые и субъекты с хроническими заболеваниями, могут потребоваться множественные иммунизации для установления и/или поддержания защитных иммунных ответов. Уровни индуцированного иммунитета возможно отслеживать, например, путем измерения количеств нейтрализующих секреторных и сывороточных антител, и, при необходимости, производят коррекцию дозировок или повторяют вакцинации для вызова или поддержания требуемых уровней защиты от COVID-19.

Предложенное применение вакцины заключается в однократном или многократном введении, предпочтительно двух- или трехкратном введении дозы вакцины для индукции устойчивого иммунитета, достаточного для предупреждения развития указанной инфекции или ослабления по меньшей мере одного из ее симптомов.

Вакцинные составы можно вводить на основе схемы многократного введения, например, осуществляя первичное введение вакцинной композиции с последующими бустерными введениями. Повторную дозу композиции вводят в пределах от двух недель до одного года, предпочтительно от двух недель до шести месяцев, наиболее предпочтительно от двух до трех недель после первичного введения. При необходимости, после второй дозы можно вводить третью и последующие дозы с интервалом от трех недель до трех лет, наиболее предпочтительно от трех недель до одного года после первичного введения.

Способ профилактики или лечения COVID-19 может предусматривать проведение комбинированной терапии, например, использование предложенной вакцинной композиции совместно с другими активными агентами, например, иммуногенными композициями и/или противовирусными препаратами.

Осуществление изобретения

Перед тем как описать конкретные примеры осуществления изобретения, следует отметить, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными способами, используемыми средствами и методами, продуктами или комбинациями, поскольку такие способы, средства и методы, продукты или комбинации, без сомнения, могут варьироваться. Также следует отметить, что терминология, используемая в настоящей заявке, не подразумевается как ограничивающая, поскольку объем настоящего изобретения будет ограничиваться только предлагаемой формулой изобретения.

Пример 1. Получение инактивированного вирусного антигена, входящего в состав предложенной композиции вакцины против COVID-19

1.1. Получение культуры клеток

В данном примере показано использование клеток линии Vero (В) и специально подобранные для этого условия, но могут быть использованы другие клетки млекопитающих, подходящие для культивирования коронавирусов, например, линии клеток Vero, Vero С1008, Vero E6, Vero-TMPRSS2, GMK, СПЭВ, MDCK, COS, ВНК-21 и другие подходящие условия (см. Руководство по вирусологии: вирусы и вирусные инфекции человека и животных / ред. Д. К. Львов, Москва: Медицинское информационное агентство, 2013. - 1197 с.;. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник в 2-х т. / ред. В. В. Зверев, М.Н. Бойченко, Москва, ГЭОТАР-Медиа, 2014. - Т. 1 - 447 с.; Т. 2 - 477 с.; Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник / под ред. А. А. Воробьева, 2-е изд., испр. и доп. - Москва: МИА, 2006. - 702 с.).

Получение монослойной культуры клеток линии Vero (В) включает в себя следующие стадии: расконсервация культуры клеток, получение посевной культуры, пересев культуры клеток в пластиковый роллерный флакон.

В качестве исходного объекта используют культуру клеток Vero (В), хранящуюся в ампулах при температуре минус 196°С (жидкий азот), в виде взвеси замороженных клеток в фетальной телячьей сыворотке (ФТС) с добавлением консерванта - ДМСО.

1.1.1. Для разведения оттаянной суспензии клеток применяют питательную среду 199 с солями Эрла, дополненную ФТС (Gibco), 200 мМ раствором глутамина и раствором гентамицина сульфата. Ампулу с замороженным посевным материалом клеток Vero (В) оттаивают на водяной бане при температуре от 35 до 37°С пока вся суспензия клеток не перейдет в жидкую фазу. После этого ампулу вскрывают в асептических условиях в ламинарном шкафу и переносят ее содержимое в пластиковую пробирку объемом 50 см³ с постепенным добавлением питательной среды. Не позднее 20 минут после разведения из пробирки с расконсервированной суспензией клеток отбирают пробу, в которой определяют долю жизнеспособных клеток и микробиологическую чистоту методом микроскопии. Расконсервированная культура должна быть микробиологически чистой и содержать не менее 85% жизнеспособных клеток.

1.1.2. Получение посевной культуры

Для выращивания клеток в пластиковых флаконах и роллерах также применяют среду 199 с солями Эрла, дополненную фетальной телячьей сывороткой (ФТС) (Gibco), 200 мМ раствором глутамина и раствором гентамицина сульфата. Расконсервированную суспензию клеток переносят в пластиковый флакон с площадью рабочей поверхности 75 см² в посевной концентрации 4,0*10⁴ кл*см². Флаконы в горизонтальном положении помещают в СО² - инкубатор и культивируют 4 суток при температуре около 37°C с заменой питательной среды на свежую через 24 часа после внесения суспензии клеток в пластиковый флакон. Состояние формирующегося монослоя контролируют путем его просмотра под микроскопом. В течение пассажа должен сформироваться ровный, сплошной монослой без признаков дегенерации клеток.

По окончании пассажа сформировавшийся монослой клеток переводят в суспендированное состояние с использованием стерильного раствора Версена и раствора химопсина. В суспензии определяют количество клеток и долю жизнеспособных. Конечная концентрация клеток должна быть не менее 0,9*10⁶ кл*см³. Суспензию в посевной концентрации не менее 4*10⁴ кл*см² переносят в пластиковый матрас (175 см2) и доводят объем среды до 75 см³. После этого начинают второй пассаж выращивания монослойной культуры с длительностью культивирования 3 суток.

1.1.3. Пересев культуры клеток в пластиковый роллерный флакон

Выращивание монослойной культуры клеток проводят в пластиковых роллерных флаконах с площадью рабочей поверхности 800 см² и 4250 см², соответственно, в которые путем последовательного пересева переносят клетки с предыдущей стадии в посевной концентрации не менее 4*10⁴ кл*см². Сначала проводят культивирование в течение 3 суток в роллерных флаконах с площадью рабочей поверхности 800 см², которые в горизонтальном положении помещают на роллерную установку в СО₂ - инкубатор при температуре около 37°C со скоростью вращения 0,4 оборота в минуту.

Состояние формирующегося монослоя контролируют путем его просмотра под микроскопом. В течение пассажа должен сформироваться ровный, сплошной монослой без признаков дегенерации клеток. Микробиологическую чистоту контролируют методом микроскопии.

Затем осуществляют пересев клеток в посевной концентрации 1,4*10⁴кл.*см² - 1,6*10⁴ кл.*см² на ребристые роллеры с площадью поверхности 4250 см² и инкубируют 1 сутки.

1.2. Получение биомассы вируса

Получение биомассы вируса включает в себя следующие стадии: получение биомассы вируса, оценка качества полученной биомассы и инактивация биомассы вируса.

1.2.1. Для получения биомассы используют штамм nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-CoV-2 относящийся к генетической линии В.1.617.3 (Депонирован в Специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России, инвентарный номер штамма 1339).

Рабочую (посевную) культуру вируса получают культивированием на суточном монослое клеток Vero (В) в пластиковых флаконах с площадью поверхности 25 см². При инфицирующей дозе 0,1 БОЕ*кл^-1, время культивирования составляет 24 часа (контролируется по наступлению цитопатического эффекта). Биологическая активность вируса SARS-CoV-2 в полученной биомассе составляет не менее 6,0 lg БОЕ*мл^-1, при отсутствии посторонней микрофлоры.

Затем для получения биомассы вируса используют ребристые роллеры с площадью поверхности 4250 см² с монослоем клеток Vero (В) возрастом 1 сутки. Для инфицирования монослоя применяют поддерживающую среду 199 с солями Хенкса, дополненную ФТС (Gibco), 200 мМ раствором глутамина и раствором Antibiotic-antimecotic (100х) (Gibco). Объем заполнения роллера составляет 600 мл, непосредственно в среду добавляют культуру вируса с инфицирующей дозой 0,1 БОЕ*кл^-1. С роллеров с суточным монослоем сливают ростовую среду и заливают поддерживающую с культурой вируса, культивируют при температуре около 37°C и скорости вращения 0,4 оборота в минуту в течение приблизительно 50 часов (контролируется по наступлению цитопатического эффекта путем микроскопии). По достижении активности вируса не менее 6,0 lg БОЕ*мл^-1 извлекают культуральную жидкость, содержащую биомассу вируса SARS-CoV-2 в концентрации не менее 10⁸ вирусных частиц/мл.

Далее полученную биомассу вируса с роллеров сливают в отдельную ёмкость, отбирают пробы для контроля качества и передают на стадию инактивации.

1.2.2. Оценка качества полученной биомассы

Определение биологической активности проводят по образованию негативных колоний под агаровым покрытием на культуре клеток Vero С1008. Из отобранной после завершения культивирования пробы готовят последовательные десятикратные разведения на стерильном солевом растворе Хенкса с 2% ФТС и антибиотиками. Три наивысших разведения используют для инфицирования монослоя культуры клеток Vero С1008.

Флаконы с односуточным монослоем культуры клеток Vero С1008, отобранные для опыта, извлекают из термостата и удаляют из них ростовую среду. В каждый флакон вносят по 0,5 мл соответствующего разведения, расчетная концентрация вируса в которых составляет 1,0; 10,0; 100,0 БОЕ*мл^-1, и оставляют в термостате при температуре около 37° С для адсорбции вируса. Через один час в каждый флакон вносят 10 мл первичного агарового покрытия и продолжают инкубирование. На 3 сутки инкубирования с целью окрашивания во флаконы добавляют вторичное агаровое покрытие, содержащее нейтральный красный. Учет результатов проводят через 1 сутки инкубирования при той же температуре.

Определение микробиологической чистоты проводят путём посева на тиогликолевую среду, для этого в 3 стеклянные пробирки с жидкой тиогликолевой средой вносят пробу биомассы вируса, отобранную после завершения культивирования, после инкубируют при температуре около 37° С. Заключение о микробиологической чистоте делают при отсутствии роста в пробирках с тиогликолевой средой спустя 7 суток.

1.2.3. Инактивация биомассы вируса

Разводят бета-пропиолактон физиологическим раствором в соотношении 1:10. К биомассе вируса SARS-CoV-2 прибавляют пипеткой разведенный бета-пропиолактон до конечной инактивирующей концентрации 0,0167 % (разведение 1:6000). Процесс инактивации проводят при перемешивании биомассы вируса SARS-CoV-2 в ёмкости при температуре от 20 до 25°C в течение 4 часов и далее 2 часа при температуре 37°C. Инактивированную биомассу вируса SARS-CoV-2 для передачи на стадию очистки хранят при температуре от 2 до 6°C в условиях, исключающих случайное вскрытие емкости.

Пример 2 Очистка инактивированного вирусного антигена, входящего в состав предложенной композиции вакцины против COVID-19

В данном примере показано использование для очистки вирусного антигена последовательного проведения начального этапа ультрафильтрации/диафильтрации, анионообменной и мультимодальной хроматографии и заключительного этапа ультрафильтрации/диафильтрации, однако очистка может быть также проведена с использованием иной последовательности стадий, иных режимов, реагентов, материалов и оборудования (см. Комиссаров А.В., Алешина Ю.А. и другие, Применение ультрафильтрации для концентрирования и очистки антигенов, Проблемы особо опасных инфекций, вып. 1, 2015, с.79-84; международная заявка WO 2013/010797, опубл. 24.01.2013; патент ЕАПВ EA001414B1, опубл. 26.02.2001).

2.1. Стадия ультрафильтрации/диафильтрации 1 (UF/DF 1)

Материал исходной инактивированной вирусосодержащей жидкости (ВСЖ) перед проведением процесса фильтруют при помощи системы последовательно установленных фильтра Opticap и стерилизующего фильтра. Полученный материал ВСЖ концентрируют на кассете SARTOCON Slice Cassette (Sartorius) с отсечением 300 кДа суммарно в 25 раз. После завершения концентрирования концентрат диализуют против раствора A (15 мМ Na-P, 600 мМ натрия хлорида, 0,05% полисорбата 80, pH 7,5±0,1, с удельной электропроводностью (УЭП) 55,5±3,5 мСм/см) в объёме 10 диафильтрационных объемов (DV). Следующим шагом является диализ концентрата против раствора B (15 мМ Na-P, 600 мМ натрия хлорида, pH 7,5±0,1, УЭП 55,5±3,5 мСм/см) в объёме 10 DV. Финальным этапом UF/DF стадии является переконцентрирование до 70% от объёма ретентата и вытеснением из кассеты раствором B до 100% объёма ретентата. Таким образом исключаются потери полупродукта в кассете для тангенциальной фильтрации. По завершению стадии полупродукт фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранят при температуре 2-8°С. Выход составляет 80%. На данной стадии происходит концентрирование материала, удаляются все низкомолекулярные примеси (менее 300 кДа), из ВСЖ удаляется краситель (за счет диализа буфером, содержащим полисорбат) и материал подготавливается к последующим стадиям хроматографической очистки.

2.2. Анионообменная хроматография

Стерильный полупродукт после стадии UF/DF 1 проверяют на значение pH и УЭП, которое должно находиться в диапазоне 7,5±0,1 и 53-57 мСм/см соответственно. УЭП титруют 1 М раствором хлорида натрия. Колонку XK 26 (GE Healthcare) с сорбентом Q Sepharose FF (GE Healthcare) санитизируют 1 М раствором гидроксида натрия и перезаряжают сорбент 1 М натрия хлоридом. Далее через колонку с сорбентом пропускают уравновешивающий буфер С (15 мМ Na-P, 600 мМ натрия хлорида, pH 7,5±0,1, УЭП 55,5±3,5 мСм/см) не менее 5-ти колоночных объёмов со скоростью 170 см/ч. Следующем шагом после предварительно уравновешенного сорбента является нанесение подготовленного материала со скоростью 170 см/ч, при этом время контакта с сорбентом составляет около 10 минут. Сбор фракции начинают сразу же после увеличения оптической плотности более 2 мОЕ (единиц оптической плотности). По окончании нанесения сорбент промывают уравновешивающим буферным раствором С со скоростью 170 см/ч до снижения оптической плотности менее 2 мОЕ, на этом этап сбора целевой фракции завершен. Полупродукт с анионообменной стадии хроматографии стерильно фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранят при температуре 2-8°С. Данная стадия проводится в режиме фильтрации, что позволяет провести очистку материала от свободной ДНК, которая задерживается на сорбенте.

2.3. Мультимодальная хроматография

Стерильный полупродукт после стадии анионообменной хроматографии проверяют на значение pH и УЭП, которое должно находиться в диапазоне 7,5±0,1 и 54-57 мСм/см соответственно. При необходимости, УЭП титруют при помощи раствора 1 М хлорида натрия. Колонку ECO PLUSE TAC 35*500 (YMC) с сорбентом Capto Core 700 (Cytiva) санитизируют 0,5 М гидроксидом натрия с последующим пропусканием через сорбент 30% изопропилового спирта. Далее через колонку с сорбентом пропускают уравновешивающий буфер D (15 мМ натрия фосфата, 600 мМ натрия хлорида, pH 7,50±0,1, УЭП 55,5±3,5 мСм/см) не менее 5-ти колоночных объёмов со скоростью 124 см/ч. Следующим шагом, после уравновешивания сорбента, является нанесение подготовленного материала со скоростью 124 см/ч, при этом время контакта с сорбентом должно составлять не менее 10 минут. Сбор фракции начинают сразу же после увеличения оптической плотности более 2 мОЕ. По окончании нанесения сорбент промывают уравновешивающим буферным раствором D со скоростью 124 см/ч до снижения оптической плотности менее 2 мОЕ, на этом этап сбора целевой фракции завершен. Полупродукт с мультимодальной стадии хроматографии стерильно фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и хранят при температуре 2-8°С. На данной стадии происходит удаление обрывков S- и N-белков вирусной оболочки, что позволяет получить цельнокапсидный вирусный материал.

2.4. Стадия ультрафильтрации/диафильтрации 2 (UF/DF 2)

Фильтрат с предыдущей стадии, предварительно согретый до 18-25°С, концентрируют в 2 раза. Затем материал диализуют против раствора E (15 мМ Na-P, 140 мМ натрия хлорида, pH 7,2±0,1 УЭП 15,0±2,0 мСм/см) в объёме 10 DV. Далее материал, при необходимости, концентрируют до объема равного 1/50 от начального объема входящей в процесс ВСЖ. Для вытеснения материала с кассеты Pellicon 2 MAXI (MERCK) активную фармацевтическую субстанцию (АФС) переконцентрируют до 70% от объёма ретентата и вытесняют из кассеты раствором Е до 100% объёма ретентата. Таким образом исключаются потери полупродукта в кассете для тангенциальной фильтрации. По завершению стадии полупродукт фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм с получением очищенного вирусного антигена в концентрации не менее 30 мкг/мл и хранят при температуре 2-8^°С. На данной стадии корректируется концентрация антигена в АФС, а также проводится формуляция продукта в итоговый буфер хранения, который используют для получения готовых форм вакцинной композиции в Примере 3.

Пример 3 Анализ полученного продукта и формулирование готовой вакцинной композиции

3.1. Проводят аналитическую оценку полученного согласно Примеру 2 продукта

3.1.1. Методика «Количественное определение белка», основанная на методике ELISA с использованием моноклональных антител к шиповидному белку SARS-CoV-2 (CR3022, GTX01555, GeneTex). По данным SDS-PAGE АФС характеризовалась высокой чистотой продукта - более чем 96% и по данным SE-HPLC незначительным количеством агрегатов - менее 4%.

3.1.2. Методика «Определение подлинности», основанная на методе ИФА. Продукт индуцировал образование специфических антител к коронавирусу SARS-CoV-2 при иммунизации мышей линии Balb/c. Выраженный иммунный ответ регистрировали при однократном и двукратном внутримышечном введении композиций в дозе 0,5 мл/животное с пиком титра специфических антител на 18-й день эксперимента и с сохранением до 40-го дня. Появление специфических антител регистрировали через 14 дней после первой вакцинации животных.

3.1.3. Методика «Определение остаточных белков культуры клеток» с использованием наборов F975 (Cygnus Technologies). На данный момент очисткой достигается остаточное содержание примесных белков менее 200 нг/мл (100 нг/доза).

3.1.4. Методика «Определение остаточной ДНК культуры клеток» с использованием наборов Vero Host Cell DNA Residue Detection Kit (Yeasen Biotechnology). На данный момент очисткой достигается остаточное содержание примесной ДНК в количестве менее 20 нг/мл (10 нг/доза).

3.1.5. Методика «Специфическая безопасность (полнота инактивации) in vitro». Производят засев клеток Vero в 6 луночые планшеты/культуральные чашки. При достижении монослоя меняют питательную среду и в лунки с клетками вносят различные концентрации инактивированной вирусной суспензии. Далее каждую лунку покрывают карбоксиметилцеллюлозой и инкубируют в течение 3 дней. По окончании инкубации из всех лунок удаляют покрывающую смесь, клетки фиксируют 4% параформальдегидом и окрашивают с помощью раствора красителя кристаллического фиолетового. После окрашивания клетки промывают водой очищенной и производят подсчет БОЕ для каждой концентрации инактивированной вирусной суспензии. По результатам проверки БОЕ отсутствуют для каждой концентрации.

3.1.6. Методика «Определение токсичности in vivo».

По результатам проведения двух доклинических исследований (ДКИ) «Доклиническое исследование токсичности, безопасности и иммуногенности вакцинного препарата при двукратном внутримышечном введении макакам резус (GLP)» и «Исследование токсичности инактивированной сорбированной вакцины против новой коронавирусной инфекции COVID-19 при повторном введении кроликам» были получены результаты, подтверждающие безопасность вакцины, поскольку не было выявлено иммунотоксичности и аллергенности вакцины.

3.2. Получение готовых форм вакцинной композиции

Перед розливом готового продукта в флаконы, в асептических условиях АФС смешивают с комплексным адъювантом и разбавляют формулирующим буферным раствором до получения целевой концентрации (см. Таблицы 1-3). При необходимости, препарат лиофильно высушивают, концентрация компонентов в Таблицах 1-3 указана до начала сушки.

Пример 4 Оценка иммуногенных и протективных свойств образцов инактивированной очищенной сорбированной ковидной вакцины, содержащих различные дозы антигенов вируса SARS-CoV-2 и различные адъюванты.

I. Используемые материалы:

1. Образцы вакцины: 30/0/0; 30/500/0; 30/500/10; 15/0/0; 15/500/0; 15/500/10; 7,5/500/10, где первая цифра - концентрация вирусного антигена (мкг на дозу), вторая - концентрация гидроксида алюминия (мкг на дозу) и третья - концентрация CpG-ODN в составе образцов вакцины (мкг на дозу).

2. Образцы для контроля адъювантов: 0/0/0; 0/500/0; 0/500/10, где первая цифра - концентрация вирусного антигена (мкг на дозу), вторая - концентрация гидроксида алюминия (мкг на дозу) и третья - концентрация CpG-ODN в составе образцов вакцины (мкг на дозу).

3. Сирийские хомячки массой 40-60 г - 200 голов;

4. Инфицирующий материал: вирус SARS-CoV-2, вариант А, штамм nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021, культура штамма прошла 3 пассажа на культуре клеток Vero В, субстрат накопления - культура клеток Vero В, хранится в криопробирках при температуре от минус 18°C до минус 22°C, биологическая активность - 6,8 1g БОЕ/мл.

II. Методика проведения опыта

1. Иммунизация

Образцы вакцины приготовлены на основе разных доз антигена вируса SARS-CoV-2: 30, 15 и 7,5 мкг белка в одной дозе. Кроме того, образцы с дозами 30 и 15 мкг белка представлены в трех вариантах: без адъювантов, с гидроксидом алюминия (500 мкг), с гидроксидом алюминия (500 мкг) в сочетании с CpG (10 мкг).

Сирийских хомячков разделили на 10 групп по 20 голов в каждой. Животным каждой группы вводили один из образцов вакцины внутримышечно по 0,5 мл двукратно с интервалом 21 сутки. Через 21 сутки после второй иммунизации по 5 животных из каждой группы иммунизировали теми же образцами в тех же дозах и тем же путем третий раз.

2 Оценка протективных свойств антигенов

Через 21 сутки после второй иммунизации по 10 особей из каждой группы инфицировали вирулентным штаммом интаназальным путем в дозе 1 ⋅ 10⁵ БОЕ/особь. На 2 сутки (по 3 головы), 4 сутки (по 4 головы) и 6 сутки (по 3 головы) животных в каждой группе умерщвляли и брали пробы легких с соблюдением правил асептики. Пробы легких в каждой группе на каждый срок объединяли, ткани затем подвергали гомогенизации в стерилизованных охлаждённых фарфоровых ступках с добавлением стерилизованного речного песка. Из полученного гомогената готовили 10 % суспензию на растворе Хенкса с добавлением 2 % ФТС и антибиотиков (стрептомицина сульфата и бензилпенициллина натриевой соли по 200 ЕД/мл). Для титрования использовали суточный монослой клеток Vero В, который, после удаления ростовой среды инфицировали последовательными 10-кратными разведениями вируссодержащего материала, внося по 0,5 мл соответствующего разведения на 2 флакона с культурой клеток. Покачивая флакон, равномерно распределяли инокулят по всему монослою. Флаконы укладывали горизонтально, при этом поверхность с инфицированным клеточным монослоем находилась внизу. Флаконы инкубировали в термостате при температуре 37,0±0,5°C в течение 60 минут. После инкубирования инокулят удаляли пипеткой и в каждый флакон вносили по 10 мл первичного агарового покрытия. Далее флаконы снова укладывали горизонтально (поверхность с инфицированным монослоем находилась внизу). После затвердевания покрытия флаконы переворачивали монослоем вверх и помещали в термостат при температуре 37,0±0,5° С на 48 часов. По истечении срока инкубации с целью окрашивания монослоя культуры клеток во флаконы вносили по 10 мл вторичного агарового покрытия, содержащего нейтральный красный, и продолжали инкубировать при температуре 37,0±0,5°C в течение 24 часов, после чего подсчитывали количество негативных колоний.

Протективные свойства к коронавирусу оценивали по концентрации вируса в легких вакцинированных сирийских хомячков на 2, 4 и 6 сутки после интраназального заражения вирулентным штаммом в дозе 10⁵ БОЕ/особь. Защищенность животных оценивали с помощью вирусологического индекса защиты легких на 2, 4 и 6 сутки после инфицирования по снижению концентрации коронавируса в легких иммунизированных сирийских хомячков по сравнению с концентрацией в легких не иммунизированных животных.

3 Оценка иммуногенности антигенов

Через 21 сутки после второй иммунизации и через 21 сутки после третьей иммунизации у 5 животных из каждой группы тотально брали кровь, из которой получали сыворотки крови для определения титра специфических вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации с вирулентным вирусом SARS-CoV-2, по снижению бляшкообразующей активности вируса на монослойной культуре клеток Vero под агаровым покрытием (вариант постановки реакции - постоянная доза вируса и разведения сыворотки).

Исследовали сыворотки крови опытных животных, а также положительный контрольный образец (сыворотку крови переболевшего человека, заведомо содержащую специфические антитела к вирусу SARS- CoV-2 в титре 1:40).

Разведения сывороток готовили на растворе Хенкса с 2% ФТС и антибиотиками (стрептомицина сульфат и бензилпенициллина натриевая соль) по 200 ЕД/мл двукратным шагом, начиная с разведения 1:10. Рабочее разведение вируса готовили на той же разводящей жидкости. В приготовленном разведении концентрация вируса SARS-CoV-2 составила 200 БОЕ/мл.

Смесь равных объемов сыворотки и рабочего разведения культуры вируса SARS-CoV-2 инкубировали в пробирках в течение 60 минут при температуре от 36,5 до 37,5°C, затем вносили по 0,5 мл во флаконы с монослоем клеток Vero В, предварительно удалив из них ростовую среду. После адсорбции комплекса АГ+АТ на клетках в течение 60 минут при температуре от 36,5 до 37,5°C инокулят декантировали, затем наносили первичное агаровое покрытие, разработанное для вируса SARS-CoV-2, и проводили дальнейшее инкубирование монослоя при температуре от 36,5 до 37,5°C в течение двух суток.

Через трое суток на инфицированный монослой клеток с целью окрашивания 0,1% раствором нейтрального красного наносили вторичное агаровое покрытие и инкубировали в течение 24 часов при температуре от 36,5 до 37,5°C, затем проводили визуальный учет негативных колоний во флаконах.

За титр антител исследуемой сыворотки принимали высшее разведение сыворотки крови, в котором выявляли подавление негативных колоний, образованных вирусом SARS-CoV-2, на 50% и более по сравнению с отрицательным контролем (вирус + разводящая жидкость).

III. Результаты эксперимента

Результаты оценки протективных и иммуногенных свойств антигенов представлены в Таблицах 4 и 5.

Наиболее выраженной протективной активностью обладали образцы вакцины 30/500/10 и 15/500/10. После заражения двукратно иммунизированных данными образцами хомячков вирулентным штаммом вируса SARS-CoV-2 в дозе 10⁵ БОЕ/особь в легких животных вирус не выделяли на протяжении всего периода наблюдения: 2, 4 и 6 сутки после заражения. Титры антител у большинства животных составляли величину >1:40 при уровне сероконверсии от 80 до 100 %.

Образцы вакцины без адъювантов обладали наименьшей протективной активностью. Добавление гидроксида алюминия усиливало протективные свойства антигенов в дозах 15 и 30 мкг на дозу. Титры антител не превышали значений 1:20, сероконверсия составляла от 60 до 100 %. Оба адъюванта не влияли на уровень накопления вируса в легких, то есть не утяжеляли процесса.

По результатам данного эксперимента доза вирусного антигена 15 мкг на дозу является оптимальной по протективным и иммуногенным свойствам.

Также были изучены иммуногенные свойства исследуемой вакцины против разных штаммов вируса SARS-CoV-2, известных как «Дельта» и «Омикрон», у обезьян по уровню вируснейтрализующих антител. Согласно полученным данным по результатам ДКИ «Исследование иммуногенности и безопасности, инактивированной сорбированной вакцины от новой коронавирусной инфекции COVID-19 при моделировании заболевания SARS-CoV-2 на макаках-резус» предложенная вакцина обладает высокой иммуногенностью и эффективностью, в том числе перекрестной.

Таблицы

Таблица 1 - Состав вакцинной композиции из расчета на 1 мл, доза составляет 0,5 мл (вариант 1) Компоненты вакцины Концентрация, мкг/мл Очищенный инактивированный вирусный антиген из штамма nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2 6 гидроксид алюминия 200 CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG-ODN) 2 Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) остальное

Таблица 2 - Состав вакцинной композиции из расчета на 1 мл, доза составляет 0,5 мл (вариант 2) Компоненты вакцины Концентрация, мкг/мл Очищенный инактивированный вирусный антиген из штамма nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2 30 гидроксид алюминия 1000 CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG-ODN) 20 Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) остальное

Таблица 3 - Состав вакцинной композиции из расчета на 1 мл, доза составляет 0,5 мл (вариант 3) Компоненты вакцины Концентрация, мкг/мл Очищенный инактивированный вирусный антиген из штамма nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2 120 гидроксид алюминия 2000 CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG-ODN) 200 Фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) остальное

Таблица 4 - Результаты оценки протективных свойств образцов вакцины от коронавирусной инфекции при двукратной иммунизации по схеме (0+21) Шифр образца вакцины Кол-во антигена в дозе, мкг Наличие адъювантов, доза, мкг Кол-во животных Уровень накопления вируса в легких, 1g БОЕ/мл Индекс защиты легких на ... сутки после инфицирования 2 4 6 2 4 6 0/0/0¹ 0 нет 20 5,3 4,7 3,6 - - - 0/500/0 А1(ОН)₃,500 20 5,1 5,1 3,7 - - - 0/500/10 А1(ОН)₃, 500 + CpG, 10 20 3,7 5,0 3,1 - - - 30/0/0 30 нет 20 4,3 4,8 2,3 1,0 0 1,3 30/500/0 А1(ОН)з, 500 20 3,4 1,8 1,2 1,9 2,9 2,4 30/500/10 А1(ОН)з, 500 + CpG, 10 20 0 0 0 >5,3 >4,7 >3,6 15/0/0 15 нет 20 5,3 4,2 1,4 0 0,5 2,2 15/500/0 А1(ОН)₃,500 20 2,9 2,0 0 2,4 2,7 >3,6 15/500/10 А1(ОН)з,500 + CpG, 10 20 0 0 0 >5,3 >4,7 >3,6 7,5/500/10 7,5 А1(ОН)з,500 +CpG, 10 20 3,3 1,0 0 2,0 3,7 >3,6 Контроль стада
(не иммунизированные, без заражения) 6 0 0 0 - - -

¹Примечание. За контрольную группу принимали 0/0/0 - животных, которым вводили двукратно разводящую жидкость без адъювантов.

Таблица 5 - Результаты оценки титров вируснейтрализующих антител в сыворотках крови иммунизированных хомячков Шифр антигена № сыворотки крови хомячка Разведение сыворотки Кол-во флаконов Кол-во БОЕ/
флакон Титр антител Сероконверсия, % 1 2 3 4 5 6 7 8 0/0/0 1 1:10 2 116 120 <1:10 0% 2 1:10 2 118 124 <1:10 3 1:10 2 127 120 <1:10 4 1:10 2 116 119 <1:10 5 1:10 2 121 117 <1:10 0/500/0 6 1:10 2 123 126 <1:10 0% 7 1:10 2 114 127 <1:10 8 1:10 2 124 122 <1:10 9 1:10 2 125 128 <1:10 10 1:10 2 116 120 <1:10 0/500/10 11 1:10 2 112 125 <1:10 0% 12 1:10 2 116 127 <1:10 13 1:10 2 111 123 <1:10 14 1:10 2 119 130 <1:10 15 1:10 2 121 128 <1:10 30/0/0 16 1:10 2 114 119 <1:10 0% 1:20 2 118 113 1:40 2 112 115 17 1:10 2 123 115 <1:10 1:20 2 116 111 1:40 2 114 108 30/0/0 18 1:10 2 116 122 <1:10 1:20 2 104 109 1:40 2 118 113 19 1:10 2 109 117 <1:10 1:20 2 118 115 1:40 2 120 115 20 1:10 2 117 105 <1:10 1:20 2 111 108 1:40 2 114 112 30/500/0 21 1:10 2 0 0 >1:40 100% 1:20 2 3 3 1:40 2 17 15 22 1:10 2 54 56 1:10 1:20 2 77 79 1:40 2 126 120 23 1:10 2 52 56 1:10 1:20 2 80 75 1:40 2 119 114 24 1:10 2 60 53 1:10 1:20 2 115 117 1:40 2 118 120 25 1:10 2 55 52 1:10 1:20 2 90 82 1:40 2 116 123 30/500/10 26 1:10 2 0 0 >1:40 80% 1:20 2 0 0 1:40 2 0 0 30/500/10 27 1:10 2 0 0 >1:40 1:20 2 0 0 1:40 2 0 0 28 1:10 2 71 69 <1:10 1:20 2 118 116 1:40 2 121 126 29 1:10 2 0 0 >1:40 1:20 2 0 0 1:40 2 0 0 30 1:10 2 0 0 >1:40 1:20 2 0 0 1:40 2 5 2 15/0/0 31 1:10 2 94 79 <1:10 0% 1:20 2 101 102 1:40 2 >100 >100 32 1:10 2 81 92 <1:10 1:20 2 >100 >100 1:40 2 >100 >100 33 1:10 2 >100 >100 <1:10 1:20 2 >100 >100 1:40 2 >100 >100 34 1:10 2 >100 >100 <1:10 1:20 2 >100 >100 1:40 2 >100 >100 35 1:10 2 >100 >100 <1:10< 1:20 2 >100 >100 1:40 2 >100 >100 15/500/0 36 1:10 2 4 3 1:20(1:30) 60% 1:20 2 17 28 1:40 2 58 59 37 1:10 2 89 78 <1:10 1:20 2 >100 >100 1:40 2 >100 >100 38 1:10 2 8 10 1:20 1:20 2 29 31 1:40 2 80 62 39 1:10 2 >100 >100 <1:10 1:20 2 >100 >100 1:40 2 >100 >100 40 1:10 2 11 11 1:20 1:20 2 38 35 1:40 2 75 85 15/500/10 41 1:10 2 0 0 >1:40 100% 1:20 2 0 0 1:40 2 3 5 42 1:10 2 0 1 >1:40 1:20 2 2 2 1:40 2 13 15 43 1:10 2 0 0 >1:40 1:20 2 0 0 1:40 2 1 1 44 1:10 2 23 24 1:10 1:20 2 57 58 1:40 2 92 95 15/500/10 45 1:10 2 0 0 >1:40 1:20 2 0 0 1:40 2 0 0 7,5/500/10 46 1:10 2 29 14 1:20 20% 1:20 2 40 30 47 1:10 2 >100 >100 <1:10 1:20 2 >100 >100 48 1:10 2 76 76 <1:10 1:20 2 98 95 49 1:10 2 >100 >100 <1:10 1:20 2 >100 >100 50 1:10 2 75 74 <1:10 1:20 2 94 >100 Контроль положительной сыворотки с титром антител 1:40 1:20 2 30 22 1:40 - 1:40 2 40 35 Контроль (рабочее разведение вируса+ разводящая жидкость 1:1) 3 108 115 74 Среднее кол-во БОЕ-132 Контроль сыворотки (чистая), разведение 1:2 0,5мл разв. аликвоты сыворотки + 0,5 мл среды без сыворотки (выдерживают при 37С, 60 мин.) 0
Бляшки отсутствуют Примечание. Расчетная доза вируса: 100 БОЕ (200 БОЕ 1мл + 1мл разводящей жидкости) выдерживают при 37° С в течение 60 минут.

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и иммунологии. Описана вакцина против COVID-19 и способ ее получения путем культивирования вирусного штамма-возбудителя nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2, депонированного в специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным № 1339, с последующей инактивацией и очисткой вакцинного антигена. Технический результат предлагаемого изобретения заключается в повышении степени очистки вирусного антигена вируса SARS-Cov-2. При этом использование высоковирулентного штамма, высокопатогенного для человека, обеспечивает высокую иммуногенность и эффективность вакцины, а использование высокоочищенного вакцинного препарата на основе вирусного антигена снижает риски возникновения нежелательных побочных эффектов за счет повышения степени его очистки. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 табл., 4 пр.

1. Способ получения вакцины против COVID-19, включающий культивирование штамма-возбудителя в монослое клеток Vero с последующей инактивацией вируса, очисткой вирусного антигена и дополнением состава вакцины фармацевтически приемлемыми эксципиентами с получением, таким образом, вакцины против COVID-19, отличающийся тем, что предусматривает использование штамма nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2, депонированного в специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным № 1339, и проведение очистки вирусного антигена с использованием анионообменной и мультимодальной хроматографии с дополнительной ультрафильтрацией/диафильтрацией.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку вирусного антигена осуществляют путем последовательного проведения начального этапа ультрафильтрации/диафильтрации, анионообменной и мультимодальной хроматографии и заключительного этапа ультрафильтрации/диафильтрации.

3. Вакцина против COVID-19 на основе инактивированного вирусного антигена из штамма nCoV-19/Russia/SP48-1339/2021 вируса SARS-Cov-2, депонированного в специализированной коллекции эталонных культур штаммов II-IV групп патогенности (арбовирусы и другие) ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России под регистрационным № 1339, в эффективном количестве с фармацевтически приемлемыми эксципиентами.

4. Вакцина по п.3, отличающаяся тем, что фармацевтически приемлемые эксципиенты представляют собой адъюванты и фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.

5. Вакцина по п.3, отличающаяся тем, что в качестве адъюванта используется гидроксид алюминия и CpG-содержащий олигодезоксинуклеотид (CpG-ODN).

6. Вакцина по любому из пп.3-5, отличающаяся тем, что вакцина содержит вирусный антиген и комплексный адъювант - гидроксид алюминия и CpG-ODN в фармацевтически приемлемом разбавителе - фосфатно-солевом буфере (PBS).

7. Вакцина по п.6, отличающаяся тем, что вакцина содержит вирусный антиген в концентрации 30 мкг/мл в сочетании с гидроксидом алюминия в концентрации 1000 мкг/мл и CpG-ODN в концентрации 20 мкг/мл в PBS.