Способ моделирования хронической тромбоэмболической легочной гипертензии у крупных животных Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 G09B23/28 A61M25/01 A61L31/12 A61B6/02 

Изобретение относится к биологии, а именно к созданию модели хронической тромбоэмболической легочной гипертензии (ХТЛГ) у крупных животных с целью дальнейшего использования при проведении фармакологических исследований лекарственных средств, в качестве экспериментальной модели для разработки и оптимизации способов лечения ХТЛГ, для прогнозирования исходов ХТЛГ при применении того или иного способа лечения, для исследования патогенеза различных стадий развития ХТЛГ, для обучения врачей-хирургов существующим методикам хирургического лечения ХТЛГ.

Хроническая тромбоэмболическая легочная гипертензия - это тяжелая форма легочной гипертензии, развивающаяся вследствие сужения просвета или обструкции легочных артерий, является поздним осложнением острой тромбоэмболии легочной артерии. По распространенности среди всех сердечно-сосудистых заболеваний занимает третье место. Возможности лечения ХТЛГ ограничены, и даже при лечении болезнь часто прогрессирует до развития правосторонней сердечной недостаточности и даже смерти.

Животные модели ХТЛГ являются важным инструментом для изучения патофизиологии заболевания, выявления потенциальных терапевтических мишеней и тестирования эффективности и безопасности новых методов лечения до их испытания на людях. Животные модели ХТЛГ были разработаны на нескольких видах животных, включая крыс, мышей, собак, свиней и овец, с использованием различных методов, чтобы вызвать тромбоз и легочную гипертензию. Эти модели могут быть использованы для изучения клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе ХТЛГ, а также гемодинамических и структурных изменений, происходящих в легочном сосудистом русле. Кроме того, животные модели могут дать ценные сведения о естественной истории развития ХТЛГ и помочь в выявлении биомаркеров, которые можно использовать для мониторинга прогрессирования заболевания и ответа на лечение. Кроме того, животные модели могут быть использованы для проверки безопасности и эффективности новых терапевтических вмешательств, таких как фармакологические агенты, генная терапия или хирургические процедуры, потенциально способные принести пользу пациентам с ХТЛГ. В целом, животные модели ХТЛГ являются важными инструментами для понимания патофизиологии заболевания и разработки новых методов терапии для улучшения результатов лечения пациентов. Однако важно понимать, что животные модели имеют ограничения, и результаты исследований на животных следует интерпретировать с осторожностью и подтверждать в исследованиях на людях.

Уровень техники.

Рекомендациями Европейского общества кардиологов (2022) определены следующие критерии формирования ХТЛГ, определяемые по результатам инвазивного диагностического зондирования сердца: увеличение среднего давления в легочной артерии (сДЛА) ≥ 25 мм рт.ст.; снижение давления заклинивания в легочной артерии (ДЗЛА) ≤ 15 мм.рт.ст.; увеличение величины легочного сосудистого сопротивления (ЛСС) > 240 дин*с/см⁵ (или > 3 Ед по Вуду) [Eur Respir J. 2022. doi: 10.1183/13993003.00879-2022].

Известен моделирования хронической тромбоэмболической легочной гипертензии (патент РФ 2675353), в котором крысам внутривенно вводят эмболизирующие частицы в виде аутологичных тромбов, инкапсулированные в альгинатные микрокапсулы не менее 4 раз с интервалом не менее 2 дней. Недостатком данного способа является использование мелких животных, техническая невозможность получения полной патофизиологической картины нарушений легочной гемодинамики вследствие небольшого размера модельного объекта, наличие у крыс отличающихся от человека механизмов регуляции тромбообразования. Данный способ не позволяет использовать методики зондирования сердца, которые применяются в клинической практике, и в длительном периоде времени получать данные, релевантные таковым у человека.

Раскрытие сущности изобретения.

Проблема, на решение которой направлено изобретение, является разработка способа моделирования хронической тромбоэмболической легочной гипертензии (ХТЛГ) у лабораторных животных крупного размера с последующей селективной ангиографией для контроля эффективности процедуры эмболизации и возможностью дальнейшего динамического контроля формирования клинических признаков ХТЛГ по результатам повторного диагностического зондирования сердца.

Технический результат - разработан способ моделирования хронической тромбоэмболической легочной гипертензии у крупных лабораторных животных (свиней весом 40-100 кг), имеющей все функциональные и гистологические признаки, характерные для ХТЛГ у человека.

Задача решается способом моделирования хронической тромбоэмболической легочной гипертензии у лабораторных животных крупного размера путем введения неадгезионной рентгенконтрастной полимерной композиции (НК) в нижнедолевые и среднедолевые легочные артерии, кровоснабжающие ткани правого и левого легких, под контролем рентгеноскопии, с последующей селективной ангиографией для контроля эффективности процедуры эмболизации и возможностью дальнейшего динамического контроля формирования клинических признаков ХТЛГ по результатам повторного диагностического зондирования сердца.

Предварительно перед выполнением операции проводят контроль электрокардиографии, инвазивный контроль артериального давления, контроль насыщения периферической крови кислородом, инфузионную поддержку кровообращения, выделение яремной вены, установку интродьюсера и диагностического катетера, выполнение контрольного зондирования сердца. Для точной локализации правых и левых легочных средне- и нижнедолевых артерий с помощью рентгеноскопии выполняют селективную артериографию путем введения через диагностический катетер рентгенконтрастного препарата в целевые легочные артерии (в правое и левое средне- и нижнедолевых легочные артерии). Затем в данные целевые артерии, через установленный ранее диагностический катетер, устанавливают микрокатетер через который вводится НК до получения рентгеновской картины прекращения кровообращения. Общий объем введенного НК зависит от объема кровеносного русла. Затем, каждые 2 недели после выполнения эмболизации, животным выполняют диагностическое зондирование и определяют среднее давление в легочной артерии (сДЛА), давление заклинивания в легочной артерии (ДЗЛА) и легочно-сосудистое сопротивление (ЛСС). Через 3 месяца достигаются функциональные и гистологические признаки ХТЛГ.

Формирование клинических признаков ХТЛГ проиллюстрированы на фигурах 1-7.

Фиг.1 А, Б - Рентгеноскопическая картина формирования острого тромбоза левых нижнедолевых легочных артерий (А - до эмболизации, Б - после эмболизации)

Фиг.2 А, Б- Рентгеноскопическая картина формирования острого тромбоза правых нижнедолевых легочных артерий (А - до эмболизации, Б - после эмболизации)

Фиг.3 - Нижняя доля правого легкого, общий вид. Обширные поля ателектазной легочной паренхимы с выраженной лимфоцитарной инфильтрацией. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х50.

Фиг. 4 - Патологическое расширение альвеол с их укрупнением на фоне диффузного сегментарного компенсаторного повышения давления в малых ветвях легочной артерии. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х50

Фиг.5 - Пристеночные тромбы в артериоле, выраженной утолщение стенки сосуда, дезинтеграция слоев артериолы с замещением среднего слоя коллагеновыми волокнами. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х400

Фиг.6 - Миокард правого предсердия. Дезинтеграция миофибриллярных комплексов. Окраска гематоксилином и эозином. Увеличение х100

Фиг.7 - Миокард правого предсердия. Дезинтеграция миофибриллярных комплексов, расширение перинуклеарных пространств, апоптозные изменения в ядрах кардиомиоцитов (появление пустот). Окраска гематоксилином и эозином, увеличение х400

Осуществление изобретения.

Изобретение подтверждается следующими примерами.

Пример 1. Способ моделирования хронической тромбоэмболической легочной гипертензии у животных

Экспериментальная работа одобрена Локальной биоэтической комиссией и осуществлялась согласно этическим нормам, регламентирующим эксперименты на животных в соответствии с международными и российскими нормативно-правовыми документами («Европейская конвенция о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях: EST № 123» от 18 марта 1986 г. Страсбург, 1986; Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации» № 199н «Об утверждении правил надлежащей лабораторной практики» от 01.04.2016 г.; Межгосударственный стандарт ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики»; Euroguide on the accommodation and care of animals used for experimental and other scientific purposes. 2007. FELASA: Federation of European Laboratory Animal Science Associations).

Исследование проводилось на группе из 6 минисвиней «Минисибс» селекции ИЦиГ СО РАН. Подготовка к операции и все дальнейшие манипуляции производились с соблюдением правил асептики и антисептики. За сутки до операции животное лишалось корма, но не воды, перед операцией врачом-ветеринаром выполнялась премедикация комбинацией препаратов атропин, золетил-100 и кетамин в дозе, рассчитанной исходя из веса животного. После наступления сна животное мылось, брилось, переносилось на операционный стол и закреплялось в положении «на спине». В краевую вену уха устанавливают периферический катетер для инъекций подходящего размера, к грудной клетке прикреплялись датчики для электрокардиографии. Датчик контроля насыщения периферической крови кислородом крепят на язык. Для инвазивного контроля артериального давления в бедренную артерию пункционным способом устанавливают артериальный катетер, через который присоединяют 2-канальную систему инвазивного контроля давления типа Combitrans (один канал для оценки системного артериального давления, второй канал для гемодинамических измерений). Все критически важные витальные параметры - пульс, артериальное давление, температура в носоглотке, ЭКГ, насыщение крови кислородом - фиксируют в режиме «реального времени» системой мониторинга V26E (Philips, Германия). Интубацию трахеи трубкой диаметром 8-9 мм проводят на фоне миорелаксации (рокуроний, 8 мг в/в). После раздутия обтурационной манжеты подсоединяют наркозно-дыхательный аппарат Julian Plus (Draeger, Германия), начинают принудительную вентиляцию легких воздушной смесью, содержащей 60% кислорода и 3 - 4% севофлюрана (по объему) с частотой 12-14 циклов в минуту. Дыхательный объем подбирался индивидуально в зависимости от веса животного. Через установленный ранее периферический катетер проводят инфузионную поддержку кровообращения кристаллоидными (раствор Рингера, изотонический раствор) и/или коллоидными (гелафузин, полиглюкин) растворами. Объем инфузии определялся врачом-ветеринаром согласно весо-ростовым показателям и данным объективного мониторинга витальных функций экспериментального животного.

Для точной локализации правых и левых легочных средне- и нижнедолевых артерий с помощью рентгеноскопии выполняют селективную артериографию путем введения через диагностический катетер в целевые легочные артерии (в правые и левые средне- и нижнедолевые легочные артерии) рентгенконтрастного препарата типа Ультравист (Байер, Германия). Затем в данные артерии через диагностический катетер устанавливаютя микрокатетер, через который вводять НК до получения рентгеновской картины прекращения кровообращения. Общий объем введенного НК определяется объемом кровеносного русла животного.

Зондирование сердца и легочной артерии до выполнения эмболизации и в последующем периоде выполняют каждые 2 недели наблюдения (сроком до 3 месяцев) следующим способом. В условиях операционной под наркозом иглой пунктируют яремную вену, заводят проволочный проводник и устанавливают интродьюсер размером 8Fr. В интродьюсер вводят баллонный катетер типа Corodyn. Под контролем ренгеноскопии с помощью С-дуги OEC9900 (GE Healthcare, США) катетер продвигают до правого желудочка и устья легочной артерии. Показатели сДЛА, ДЗЛА и ЛСС регистрировались системой мониторинга V26E в автоматическом режиме.

Через 3 месяца животным выполнялась контрольная артериография правых и левых легочных артерий, диагностическое зондирование, затем животное выводилось из эксперимента и забирались образцы для гистологических исследований.

В результате исследования было показано, что среднее давление в легочной артерии увеличивалось с 13,4 ± 2,2 мм.рт.ст до 27,8 ± 4,4 мм.рт.ст. (p < 0,0001), давление заклинивания легочной артерии увеличивалось с 9,1 ± 3,4 мм.рт.ст. до 10,7 ± 2,5 мм.рт.ст. (р = 0,1347), легочное сосудистое сопротивление увеличивалось с 78,5 ± 18,6 дин*с/см5 до 397,7 ± 50,8 дин*с/см5 (p < 0,0001). В результате гистологических исследований обнаружено, что во всех долях легких фиксируются патологические изменения, связанные с хроническим нарушением кровотока в ветвях легочной артерии. Изменения более выражены в паренхиме долей легких, подвергшихся эмболизации. Обнаружены зоны патологического утолщения альвеолярных септ за счет расширения просвета кровеносных капилляров в них, закрытие просветов альвеол, формирование ателектазов паренхимы легких и запуск патологической перестройки стенок микрососудов (гипертрофия стенки с утратой слоистости за счет коллагенизации всех ее слоев), облитерация просвета кровеносных сосудов малого и среднего диаметра с формированием внутрипросветных тромбов. В неэмболизированных долях легких выявлены патологические перестройки в капиллярном русле, проявившиеся в расширении внутрисептальных кровеносных капилляров. После спадения части альвеол, за счет утолщения септ произошло компенсаторное эмфизематозное расширение альвеол соседних регионов с их локальным разрывом. Другим проявлением патологического процесса стала миграция в легочную ткань лейкоцитарных клеток (преимущественно лимфоцитов). В миокарде правого предсердия и правого желудочка выявлены признаки дистрофических изменений, вызванных перегрузкой давлением. В предсердии выраженность этих проявлений больше, чем в желудочке. Выявленные изменения отражают начало патологического ремоделирования миокарда правых отделов сердца, с последующим замещением кардиомиоцитов соединительной тканью. В условиях увеличенной нагрузки происходит разволокнение миокарда и дезинтеграция миофибриллярных комплексов, увеличение перинуклеарных пространств.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно кардиологии, пульмонологии. С помощью диагностического катетера выполняют селективную артериографию с введением рентгеноконтрастного препарата в целевые - нижнедолевые и среднедолевые - легочные артерии, кровоснабжающие ткани правого и левого легких. Затем через ранее установленный диагностический катетер вводят микрокатетер и выполняют эмболизацию целевых артерий путем введения неадгезионной рентгеноконтрастной полимерной композиции под контролем рентгеноскопии. Выполняют диагностическое зондировании через каждые две недели в течение трех месяцев. Способ позволяет создать модель хронической тромбоэмболической легочной гипертензии (ХТЛГ), имеющей все функциональные и гистологические признаки, характерные для ХТЛГ у человека. 7 ил., 1 пр.

Способ моделирования хронической тромбоэмболической легочной гипертензии у лабораторных животных крупного размера, характеризующийся тем, что с помощью диагностического катетера выполняют селективную артериографию с введением рентгеноконтрастного препарата в целевые - нижнедолевые и среднедолевые - легочные артерии, кровоснабжающие ткани правого и левого легких, затем через диагностический катетер вводят микрокатетер и выполняют эмболизацию целевых артерий путем введения неадгезионной рентгеноконтрастной полимерной композиции под контролем рентгеноскопии с последующим выполнением диагностического зондирования через каждые две недели в течение трех месяцев.