СПЕЦИФИЧЕСКИЙ В ОТНОШЕНИИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО АРБОВИРУС С ДЕФЕКТОМ РОСТА Российский патент 2024 года по МПК C12N7/04 A61K35/76 C07K14/175 C07K14/18 

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

[0001] Настоящее изобретение в целом относится к арбовирусам, небольшой группе из нескольких вирусов с уникальным и необычным свойством репликации в клетках насекомого и в клетках человека. Настоящее изобретение относится к мутантным арбовирусам и к их применению в качестве иммуногенов. Согласно аспектам настоящее изобретение относится к измененному арбовирусу, который больше не репродуцируется в клетках млекопитающего-хозяина, но продолжает реплицироваться в клетках насекомого и может быть собран из них, но продолжает экспрессировать и представлять антигены арбовируса иммунной системе млекопитающих и в таковой.

[0002] Настоящее изобретение относится к группе арбовирусов. Основным свойством арбовируса является репликация в клетках млекопитающих и насекомых. Многие арбовирусы передаются млекопитающим клещами или комарами. Согласно одной схеме классификации арбовирусы включают в себя роды Flavivirus, Alphavirus и Orthobunyavirus. Согласно другой схеме классификации арбовирусы включают в себя семейства Bunyaviridae, Flaviviridae, Reoviridae и Togaviridae. Примеры арбовирусов включают в себя вирус африканской чумы свиней, вирус клещевого энцефалита, вирус лихорадки долины Рифт, вирус колорадской клещевой лихорадки, вирус энцефалоза лошадей, вирус чикунгуньи, вирус денге (DV), вирус Зика (ZV) и вирус Западного Нила.

[0003] Флавивирусы были частично изучены из-за патологии человека, см., например, Gubler & Kuno, eds.: Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. Wallingford, CAB International, 1997; и Porterfield; Exotic Viral Infections. Chapman and Hall Medical, London, 1995.

[0004] Геномы флавивируса состоят из одной линейной одноцепочечной + смысловой РНК. + цепь РНК инфицирует соответствующие клетки-хозяева. Общий геном может варьировать от 10 до 11 т. п. н. 3'-Полиаденилирование отсутствует. 5'-конец имеет метилированный кэп.

[0005] Геномы флавивируса не содержат внутренних сайтов связывания рибосомы (IRES), которые обеспечивают сайт инициации трансляции для рибосом хозяина. Вместо этого флавивирус использует рибосомное сканирование, чтобы начать синтез белка.

[0006] Вирионы флавивируса могут представлять собой сферы диаметром от 40 до 65 нм. Под липидной оболочкой находится икосаэдрическая капсидная оболочка диаметром приблизительно 25-30 нм.

[0009] DV (типы 1-5), вирус желтой лихорадки, вирус японского энцефалита, вирус клещевого энцефалита и вирус Западного Нила являются причиной значительной заболеваемости и смертности у людей.

[0008] Например, вирус желтой лихорадки способен вызывать эпидемии. В первом цикле вирус передается комарами Aedes africanus и другими Aedes (в Африке) или комарами Hemogogus (в Северной Америке и Южной Америке); обезьяны служат резервентами, и, как правило, зараженные люди - это те, кто попадает в дремучие леса и джунгли и подвергается воздействию этих переносчиков. Во втором цикле домашний комар Aedes aegypti, живущий в тесной связи с людьми, может передавать вирус непосредственно человеку, единственному хозяину в цикле.

[0009] Флавивирусы вызывают другие заболевания, такие как энцефалит долины Мюррея, энцефалит Росио и Повассан и, как это недавно наблюдали, в Северной Америке и Южной Америке, лихорадку Западного Нила и лихорадку Зика.

[0010] Некоторые флавивирусы, в том числе вирус энцефаломиелита овец, вызывающий неврологическое заболевание у овец, вирус Западного Нила, вызывающий энцефалит у лошадей, и вирус японского энцефалита, который также вызывает энцефалит у лошадей и мертворождение у свиней, являются ветеринарными патогенами, имеющими коммерческое значение.

[0011] Учитывая острую необходимость в лечении вызываемых арбовирусами заболеваний, необходим надежный способ изготовления безопасных и эффективных композиций для лечения вызываемых арбовирусами заболеваний. Теоретически, живые аттенуированные вакцины вызывают наиболее эффективный, долгосрочный специфический иммунитет, тогда как инактивированные вирусные вакцины, в том числе рекомбинантные субъединичные вакцины, обеспечивают более высокий уровень безопасности. Идеальной вакциной будет та, которая может обеспечить эффективность живой вакцины и безопасность субъединичной вакцины.

[0012] Эти цели были достигнуты при разработке масштабируемого способа изготовления специфических в отношении млекопитающего арбовирусов с ограниченным ростом. Представляющий интерес вирус с дефектом роста располагается в млекопитающем, экспрессирует арбовирусные антигены и вызывает иммунный ответ у инфицированных млекопитающих на арбовирусный(ые) антиген(ы), но не продуцирует потомство вируса в клетках млекопитающего, поэтому инфицированная клетка не способствует распространению клеточной инфекции и патологии у млекопитающего-хозяина. Размножение представляющего интерес вируса с ограниченным ростом не нарушается в клетках насекомого. Таким образом, представляющий интерес дисфункциональный вирус может быть экономично получен в линиях клеток насекомого.

Краткое раскрытие настоящего изобретения

[0013] Настоящие изобретения относятся к материалам и способам получения арбовирусных частиц с ограниченным ростом, которые продолжают реплицироваться в клетках насекомого, но больше на реплицируются (или делают это на низких уровнях) в клетках млекопитающего (таких как клетки человека), так что инфицированные клетки млекопитающего не продуцируют потомство вируса. Представляющий интерес арбовирус инфицирует клетку млекопитающего-хозяина и может реплицироваться в этой клетке млекопитающего-хозяина с образованием белков арбовируса, которые распознаются иммунной системой млекопитающего-хозяина, например, с клеточными и/или гуморальными ответами, но не продуцирует и не выделяет частицы потомства арбовируса. Представляющий интерес дефектный вирус включает в себя все необходимые гены для обеспечения репликации вирусного генома и продуцирования арбовирусных белков, которые могут высвобождаться из инфицированной клетки или могут экспрессироваться на поверхности клетки-хозяина, но не продуцируют потомство вируса из инфицированной клетка млекопитающего-хозяина. Таким образом, представляющие интерес частицы арбовируса могут быть такими же иммуногенными, как и вирус дикого типа, но частицы не должны слишком способствовать или совсем не способствовать, заболеванию или патологии у инфицированного хозяина, поскольку представляющий интерес измененный арбовирус характеризуется уменьшенной, если вообще характеризуется таковой, репликацией в клетках млекопитающего.

[0014] Представляющий интерес арбовирус с ограниченным ростом легко не размножается в клетках млекопитающего или человека, что сокращает продуцирование и высвобождение вирусных частиц на 4 порядка или меньше, 5 порядков или меньше, 6 порядков или меньше, 7 порядков или меньше, 8 порядков или меньше, 9 порядков или меньше, или потомство арбовируса отсутствует по сравнению с уровнем или количеством потомства вируса, продуцируемого в клетке того же типа, инфицированной арбовирусом дикого типа того же вида или образца до обработки, что ограничивает рост.

[0015] С другой стороны, представляющий интерес арбовирус с ограниченным ростом или с дефектом роста легко размножается в клетках насекомого, таких как клетки членистоногих, с продуцированием аналогичного потомства арбовируса. Уровень потомства арбовируса, продуцируемого клеткой насекомого, может быть примерно равным или может превышать уровни или количества потомства вируса, продуцируемого подходящим контрольным арбовирусом дикого типа того же вида или образца, используемого для лечения, что ограничивает рост, в такой же клетке насекомого.

[0016] Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дефектный арбовирус характеризуется усиленной (то есть может расщеплять при более высокой скорости, может расщеплять более эффективно, или и то, и другое, по сравнению с арбовирусом дикого типа того же вида или образца, используемого для лечения, что ограничивает рост) активностью фурина. Расщепление фурином предшественника полипротеина может быть важным для созревания частиц потомства арбовируса. В некоторых арбовирусах расщепление фурином происходит в месте соединения pr и М. Следовательно, представляющий интерес дефектный арбовирус характеризуется усиленной активностью фурина в отношении белка или полипептида prM, в нем или около него. У некоторых арбовирусов расщепление фурином происходит в месте соединения E3 и E2. Следовательно, представляющий интерес дефектный арбовирус характеризуется повышенной активностью фурина в отношении белка-предшественника или полипептида Е2, в нем или около него.

[0017] Представляющий интерес арбовирус с ограниченным ростом включает в себя изменение в консенсусном тетрапептиде фурина, что может происходить в месте соединения, например, pr и M; изменение в 3'-5'-направлении консенсусного тетрапептида (в аминоконцевом направлении, например, в полипептиде pr); изменение в 5'-3'-направлении консенсусного тетрапептида (в карбоксиконцевом направлении, например, в белке М) или их комбинации.

[0018] Согласно вариантам осуществления арбовирус представляет собой вирус денге (DV), который содержит полипротеин prM.

[0019] Согласно вариантам осуществления одна или несколько аминокислотных замен в сайте расщепления фурином и/или около такового между pr и M дает в результате вирус с усиленным расщеплением фурином prM; который размножается в клетках насекомого и не размножается в клетках млекопитающего или человека.

[0020] Согласно вариантам осуществления усиленная активность фурина в DV получается с помощью одного или нескольких из: 1) изменения в удлинении из восьми аминокислот в 3'-5'-направлении (в направлении аминоконца) сайта распознавания фурином и расщепления фурином, начинающегося на аминокислоте 80 полипептида prM в DV, то есть аминокислоты 80-87 prM; 2) изменения в тетрапептидном сайте распознавания фурином; 3) изменения в удлинении из тридцати девяти аминокислот в 5'-3'-направлении (в направлении карбоксиконца) сайта распознавания фурином и расщепления фурином, то есть аминокислоты 92-130 prM; 4) изменения в 3'-5'-направлении аминокислоты 80; и 5) изменения в 5'-3'-направлении аминокислоты 130. Может присутствовать любая комбинация вышеперечисленного, например, 1), 2) и 3). Могут присутствовать изменения 1), 2) и 3).

[0021] Согласно вариантам осуществления сайт расщепления фурином DV в белке prM NH2-(88)Arg-Glu-Lys-Arg-COOH/ (SEQ ID NO: 1), при этом расщепление происходит после остатков Lys-Arg (и указывается с помощью «/» в сайте распознавания расщепления, обозначенном выше), изменяется по сайту Glu с усилениям расщепления фурином.

[0022] Согласно вариантам осуществления Glu замещается любой аминокислотой.

[0023] Согласно вариантам осуществления аминокислота, которая замещает Glu, представляет собой не кислотную, не нейтральную аминокислоту, такую как Gln, Asn, Gly, Lys, Arg, His, Thr, Ser, Tyr, Met или Cys. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не содержит серу. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не содержит гидроксильную группу в боковой цепи группы R. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой основную аминокислоту. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой Lys, Arg или His. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой Arg.

[0024] Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дефективный DV содержит одно или несколько изменений полипептидной последовательности в 3'-5'-направлении SEQ ID NO: 1, например, в восьми аминокислотах в 3'-5'-направлении остатков Arg-Glu. Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дефективный DV содержит одно или несколько изменений полипептидной последовательности в 5'-3'-направлении SEQ ID NO: 1, например, в тридцати девяти аминокислотах в 5'-3'-направлении остатков Lys-Arg. Изменение может происходить либо в сайте распознавания фурином, либо в сайте расщепления. Изменение может происходить в белке М. Изменение может быть расположено в первых 39 аминоконцевых аминокислотах мембранного белка. Изменение может происходить в полипептиде pr. Изменение может быть расположено в последних восьми карбоксиконцевых аминокислотах полипептида pr.

[0025] Такое изменение или комбинация изменений снижают или сводят на нет репликацию, созревание и высвобождение DV из инфицированных клеток млекопитающего. Следовательно, инфицированные клетки млекопитающего содержат и представляют антигены DV иммунной системе млекопитающего-хозяина, но инфицированные клетки млекопитающего не высвобождают инфекционные частицы потомства DV.

[0026] Однако такие изменения по сайту расщепления фурином или около такового не сводят на нет репликацию представляющего интерес DV в клетках насекомого, что тем самым обеспечивает способ и средства продуцирования частиц DV, содержащих измененный фуриновый сайт, раскрываемый в настоящем документе, для применения с целью инфицирования, но не репликации в клетках млекопитающего. Размножение в клетках насекомого является устойчивым, что обеспечивает высокие выходы вируса, а рост или продуцирование DV в клетках насекомого масштабируется для получения вирусных частиц в более крупных объемах, количествах и реакция.

[0027] Согласно вариантам осуществления арбовирус представляет собой вирус Зика (ZV), который содержит полипротеин prM.

[0028] Сайт расщепления фурином в ZV располагается после аминокислоты 93 prM. Согласно вариантам осуществления последовательность prM в 3'-5'-направлении сайта распознавания фурином ZV включительно, His-His-Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Arg-Arg/ (SEQ ID NO: 2), модифицируется по сериновому остатку тетрапептидного сайта распознавания фурином (расщепление происходит после четвертого Arg в приведенной выше последовательности) с обеспечением последовательности из пяти остатков аргинина для усиления расщепления фурином. Согласно вариантам осуществления остаток глутаминовой кислоты в этой области может быть изменен на гистидин для усиления расщепления фурином. Другие изменения могут быть выполнены в приведенной выше последовательности остатков. Изменение может быть выполнено в 3'-5'-направлении аминокислоты 82 и/или в 5'-3'-направлении аминокислоты 93.

[0029] Усиленная активность фурина в ZV может быть достигнута с помощью одного или нескольких из: (1) изменения одной или нескольких аминокислот в 3'-5'-направлении сайта расщепления фурином ZV, например, в последовательности из восьми остатков, начинающейся с аминокислотного остатка 82 от N-конца prM (т. e. аминокислотные остатки 82-89 prM), но может быть в 3'-5'-направлении аминокислоты 82; (2) изменения в тетрапептидном сайте расщепления фурином ZV и (3) изменения одного или нескольких аминокислотных остатков в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином, то есть от аминокислоты 94 и далее, например, в удлинении из 26 остатков аминокислот в 5'-3'-направлении тетрапептида. Может присутствовать любая комбинация из (1), (2) и (3).

[0030] Рост представляющего интерес ZV в клетках млекопитающего сводится к минимуму или практически отсутствует, в то время как рост такого дисфункционального ZV в клетках насекомого существенно не нарушается.

[0031] Дополнительные признаки и преимущества настоящего изобретения описываются и станут очевидными из следующего подробного описания настоящего изобретения и графических материалов.

Краткое описание графических материалов

[0032] На фиг. 1 изображен график выживания, включающий в себя данные, полученные от мышей, которые получали до заражения DV дикого типа забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) в качестве контроля или представляющий интерес мутант DV (D2-89R).

[0033] На фиг. 2 изображен график выживания, включающий в себя данные, полученные от мышей, которые получали до заражения SV дикого типа забуференный фосфатом солевой раствор (PBS) в качестве контроля или представляющий интерес мутант SV (M2).

[0034] На фиг. 3 изображен график безопасности, включающий в себя данные, полученные от мышей, которые получали либо SV дикого типа, либо мутант SV M2.

Подробное раскрытие настоящего изобретения

[0035] Применяемый в настоящем документе термин «дисфункция» или его грамматические формы указывают на усиление свойства или функции, возникающее в результате перемены или изменения, по сравнению с уровнем функции или наличием этого свойства, наблюдаемым до перемены или изменения или без перемены или изменения. Например, сайт фермента, который является измененным и дисфункциональным, может быть тем сайтом, который всегда распознается ферментом или расщепляется родственным ферментом с большей скоростью, более эффективно и т. д., в результате чего повышаются уровни или количество продукта ферментативной реакции. Например, согласно вариантам осуществления дисфункциональный сайт расщепления фурином расщепляется со скоростью или величиной, которая выше или больше, чем наблюдаемая для недисфункционального сайта расщепления фурином. Следовательно, результатом является снижение количества или уровня prM в инфицированной клетке. Синонимом дисфункции является термин «дефектный» или его грамматические формы.

[0036] Термин «усиленный» или его грамматические версии означает показатель или уровень, превышающий исходный или эталонный уровень или показатель. Исходный уровень может быть определен путем выборки ряда единиц и получения среднего значения или путем получения производного среднего значения популяции из литературы. Согласно вариантам осуществления усиленный уровень представляет собой любой уровень выше уровня, обнаруженного в контрольном образце. Следовательно, в биоанализе, химическом анализе и т. п., например, два образца могут быть проанализированы одновременно, экспериментальный образец с предположением усиленного показателя и контроль, который может представлять собой образец из известного дикого типа, нормального, неизмененного, немутантного и подобного представителя популяции, при этом более высокий показатель выявляют в экспериментальном образце, например, большее количество продукта, более быстрые кинетические показатели, более крупный продукт и т. д. Согласно вариантам осуществления исходный уровень представляет собой уровень, который находится в единице дикого типа. Согласно вариантам осуществления «усиленный» включает в себя повышенный уровень ферментативной активности. Согласно вариантам осуществления «усиленный» включает в себя повышенный уровень каталитической активности. Согласно вариантам осуществления «усиленный» включает в себя повышенный уровень литической активности. Согласно вариантам осуществления «усиленный» включает в себя повышенный уровень расщепления полипептида фурином. Согласно вариантам осуществления усиленная активность фурина может быть выявлена путем сравнения количеств prM в образцах из клеток, инфицированных представляющим интерес мутантом и из клеток, инфицированных вирусом дикого типа. Согласно вариантам осуществления усиленная активность фурина может быть выявлена с помощью пониженных уровней prM или повышенных уровней pr или M при сравнении с мутантом и диким типом.

[0037] Термин «изменение» или его грамматические формы представляют собой видоизменение или модификацию аминокислотной последовательности дикого типа в одном или нескольких остатках. Таким образом, измененный полипептид может включать в себя аллель. Видоизменение может представлять собой аминокислотную замену, делецию или вставку, которые могут предусматривать две или более аминокислот в сайте последовательности дикого типа. Изменение дает представляющий интерес дисфункциональный вирус.

[0038] Термин «удлинение» или его грамматические формы означают последовательные нуклеотиды нуклеиновой кислоты или последовательные аминокислоты белка. Последовательные нуклеотиды нуклеиновой кислоты (удлинение нуклеотидов) полимеризуются в виде линейного олигонуклеотида. Последовательные аминокислоты белка (удлинение аминокислот) полимеризуются в виде линейного олигопептида.

[0039] Термин «размножение» или его грамматические формы включают в себя процессы, при которых вирус инфицирует совместимую клетку-хозяина; реплицируется в этой инфицированной клетке с продуцированием потомства вируса, и инфицированная клетка высвобождает потомство вируса в межклеточное пространство. Синонимы включают в себя «репродуцироваться», «реплицироваться», «расти» и т. д.

[0040] Термин «иммуногенный» или его грамматические формы включают в себя создание или индуцирование иммунного ответа у хозяина. Таким образом, термин «иммуногенный» предусматривает согласно вариантам осуществления наличие эпитопа или детерминанты. Согласно вариантам осуществления, например, иммуногенная композиция представляет собой композицию, несущую эпитоп или детерминанту, которая при введении в хозяина вызывает иммунный ответ иммунной системы хозяина на этот эпитоп или эту детерминанту. Иммунный ответ представляет собой ответ, который может в некоторой степени «удалить» иммуногенную композицию из хозяина, при этом термин «удаление» может включать в себя фактическое разрушение композиции, то есть денатурацию или расщепление композиции; секвестирование композиции так, что композиция содержится в структуре, делающей композицию инертной; детоксикацию композиции; нейтрализацию композиции; придание композиции биологической инертности; обеспечение безопасности композиции для хозяина и внутри хозяина и т. д. Термин «иммуногенный» не означает и не гарантирует иммунологическую защиту ни одному подвергшемуся воздействию хозяину. Иммунный ответ может быть гуморальным, клеточным и т. п. или может представлять собой их комбинации.

[0041] Фразы «не реплицируется в клетках человека или млекопитающего», «не размножается в клетках человека или млекопитающего», «не растет в клетках человека или млекопитающего», «не репродуцируется в клетках человека или млекопитающего», «ограниченно растет в клетках человека или млекопитающего», «характеризуется ограниченным ростом», «характеризуется дефектом роста», эквиваленты этих фраз, грамматические формы этих фраз и т. п. являются синонимами или синонимичными терминами или фразами, описываемыми в настоящем документе, и означают клетку человека или млекопитающего, инфицированную представляющим интерес мутантным вирусом, который продуцирует потомство арбовируса на 4 порядка или меньше, 5 порядков или меньше, 6 порядков или меньше, 7 порядков или меньше, 8 порядков или меньше, 9 порядков или меньше, или не продуцирует его по сравнению с уровнем или количеством потомства вируса, продуцируемого тем же типом клетки, инфицированной арбовирусом дикого типа того же вида, штамма, линии и т. д.; подобной клеткой инфицированной недисфункциональным вирусом, описываемым в настоящем документе; или соответствующим и приемлемым отрицательным контролем.

[0042] Фразы «реплицируются в клетках насекомого», «размножаются в клетках насекомого», «растут в клетках насекомого», «репродуцируются в клетках насекомого», «не характеризуются ограниченным ростом в клетках насекомого», «не характеризуются дефектом роста», «не характеризуются ограниченным ростом», эквиваленты этих фраз, грамматические формы этих фраз и т. п. являются синонимами или синонимичными терминами или фразами, описываемыми в настоящем документе, и означают клетку насекомого, инфицированную представляющим интерес мутантным вирусом, который продуцирует примерно столько же или больше потомства арбовируса по сравнению с уровнем или количеством потомства вируса, продуцируемого клеткой насекомого того же типа, инфицированной арбовирусом дикого типа того же вида, штамма, линии и т. д.; подобной клеткой, инфицированной недисфункциональным вирусом, описываемыми в настоящем документе; или соответствующим и приемлемым отрицательным контролем.

[0043] Термин «приблизительно» представляет собой аппроксимацию относительно определенного значения, так что существует величина изменчивости, которая отражается, например, в ошибке или отклонении, что обеспечивает диапазон относительно этого определенного значения, при этом границы диапазона представляют собой значение, на 10% меньшее определенного значения, включая определенное значение и значение, на 10% превышающее определенное значение. Следовательно, при использовании в настоящем документе упоминание приблизительно 50, подразумевает, что значение может варьировать от 45 до 55. Синонимичные термины включают в себя выражения «по сути» и «практически».

[0044] Термин «масштабируемый» или его грамматические формы означают способ, применяемый при испытании или в лабораторном масштабе, который можно перевести в более крупные масштаб или презентацию, например, способ, применяемый для коммерческого производства продуктов питания, напитков, потребительских товаров, промышленных химикатов и т. д., при этом реакционные сосуды могут иметь объем в сотни или тысячи литров. Следовательно, в контексте настоящего изобретения культуры клеток насекомых могут осуществляться в 10-кратных, 100-кратных или 1000-кратных и т. д. объемах в литрах, количествах, реакциях и т. д. или больше.

[0045] Термин «дикий тип» или его грамматические формы относятся к встречающемуся в природе арбовирусу, который обычно является наиболее распространенной или преобладающей формой, признаком, геном, белком, фенотипом и т. д. в популяции. Согласно вариантам осуществления синонимом является термин «тип» или «эталон» арбовируса. Популяционный признак может быть определен более чем одним аллелем одного локуса или полигенами. Следовательно, поскольку аллели или полигены дают один и тот же признак или практически один и тот же признак, то аллели или набор полигенов рассматривают в настоящем документе как эквивалентные. Арбовирус дикого типа не содержит дисфункционального сайта фурина, что приводит к усиленному расщеплению фурином, поскольку он присутствует в представляющем интерес измененном арбовирусе. Согласно вариантам осуществления в настоящем документе проводят сравнение, чтобы продемонстрировать свойства представляющего интерес модифицированного арбовируса относительно нормального арбовируса или арбовируса дикого типа, который не содержит представляющего интерес дисфункционального сайта расщепления фурином. Согласно вариантам осуществления представляющий интерес арбовирус характеризуется свойством, которое является нормальным или приблизительно таким же, как свойство эталонного арбовируса, например, рост в клетках насекомого. Например, согласно вариантам осуществления эталонным DV является серотип 2, штамм из Новой Гвинеи, доступный в ATCC (номер доступа VR-1584). Следовательно, ссылка в настоящем документе на prM DV и нумерацию его аминокислот может относиться к prM VR-1584 или к prM и к нумерации его аминокислот формы дикого типа мутанта DV. Согласно вариантам осуществления эталонный ZV доступен из ATCC под номером доступа VR-1838. Следовательно, ссылка в настоящем документе на prM ZV и нумерацию его аминокислот может относиться к prM VR-1838 или к форме дикого типа мутанта ZV. Представляющий интерес арбовирус, как и арбовирус дикого типа, размножается в клетках насекомого. Тем не менее, что касается нумерации аминокислот в настоящем документе, из-за врожденной изменчивости популяции, полиморфизма или изменчивости в популяции нумерация для одних штамма, линии, вида и т. д. может не соответствовать непосредственно нумерации для других штамма, вида, линии и т. д. Следовательно, нумерация в настоящем документе не является абсолютной в отношении положения какого-либо полипептида, сайта расщепления и т. д., поскольку нумерация может варьировать даже в пределах линии, штамма, вида и т. д. из-за встречающейся в природе вариации. Поэтому, нумерация, используемая в настоящем документе, относится к конкретной клетке, вирусу и т. д., и ее не следует истолковывать как абсолютно типичную для всех арбовирусов с такой же нумерацией во всех арбовирусах, что и в настоящем документе. Вместо этого различные признаки предоставляют ориентиры для идентификации сайтов и позволяют специалисту применять на практике заявленный объект с любым арбовирусом в качестве разрабатываемого решения. Например, консенсусный тетрапептид фурина в месте соединения pr и M, в 5'-3'-направлении или на карбокси-конце pr, в 3'-5'-направлении или на амино-конце M являются ориентирами, которые можно использовать для ориентации манипуляции и изменения белков. Следовательно, согласно варианту осуществления в нумерации учитывается количество аминокислот тетрапептида, чтобы определить, существует ли изменчивость в размере pr и M, и если да, то для обеспечения надлежащей системы отсчета производится регулировка или коррекция между тем, что представляют в настоящем документе, и тем, что применяет специалист в другом арбовирусе.

[0046] Термин «prM» представляет собой белок или полипептид DV длиной 166 аминокислот в серотипах 1-4 DV, расщепляющийся после аминокислоты 91 фурином с получением полипептида pr и белка М. Аминокислотная последовательность prM дикого типа prM штамма NGC DV2 представляет собой FHLTTRNGEP HMIVSRQEKG KSLLFKTEDG VNMCTLMAMD LGELCEDTIT YNCPLLRQNE PEDIDCWCNS TSTWVTYGTC TTTGEHRREK RSVALVPHVG MGLETRTETW MSSEGAWKHA QRIETWILRH PGFTIMAAIL AYTIGTTYFQ RVLIFILLTA VAPSMT (SEQ ID NO: 8). Как известно, природная вариация может давать штамм дикого типа с наличием изменений одной или нескольких аминокислот из последовательности, представленной под SEQ ID NO: 8, без нарушения или усиления расщепления prM фурином и без снижения размножения в клетках млекопитающего. Измененная представляющая интерес SEQ ID NO: 8 характеризуется усиленным расщеплением фурином и не значительным размножением вируса в клетках насекомого или отсутствием размножения этого вируса в клетках млекопитающего.

[0047] Термин «prM» представляет собой белок или полипептид ZV длиной 168 аминокислот, расщепляющийся после аминокислоты 93 фурином с получением полипептида pr и белка М. Аминокислотная последовательность prM дикого типа представляет собой AEITRRGSAY YMYLDRSDAG KAISFATTLG VNKCHVQIMD LGHMCDATMS YECPMLDEGV EPDDVDCWCN TTSTWVVYGT CHHKKGEARR SRRAVTLPSH STRKLQTRSQ TWLESREYTK HLIKVENWIF RNPGFALVAV AIAWLLGSST SQKVIYLVMI LLIAPAYS (SEQ ID NO: 9). Как известно, природная вариация может давать штамм дикого типа с наличием изменений одной или нескольких аминокислот из последовательности, представленной под SEQ ID NO: 9, без нарушения или усиления расщепления prM фурином и без снижения размножения в клетках млекопитающего. Измененная представляющая интерес SEQ ID NO: 9 характеризуется усиленным расщеплением фурином и размножением вируса в клетках насекомого, но отсутствием размножения этого вируса в клетках млекопитающего.

[0048] Применяемые в настоящем документе термины «сайт расщепления фурином», «сайт распознавания фурином» и «сайт распознавания фурином и расщепления фурином» являются взаимозаменяемыми и эквивалентными, поскольку известно, что, как правило, фурин распознает консенсусный тетрапептид Arg-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 16), при этом X представляет собой любую аминокислоту (также последовательности в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении этого тетрапептида могут включать в себя сайт расщепления фурином), и расщепляет пептидную связь после карбокси-конца или на стороне карбокси-конца тетрапептида. Как правило, в арбовирусах сайт расщепления фурином находится в месте соединения двух полипептидов в полипротеине-предшественнике, таком как предшественник prM и E2 (prE2). У некоторых арбовирусов сайт расщепления фурином находится в месте соединения pr и M. У других арбовирусов, с другой геномной организацией и не содержащих prM, например, у некоторых альфавирусов, сайт расщепления фурином находится в месте соединения E3 и E2.

[0049] Применяемые в настоящем документе термины «X порядков или ниже», «X порядков или меньше» или «X порядков или менее», при этом X представляет собой рациональное число, относится к логарифмической шкале для описания количества вирусных частиц. Как известно, шкала является нелинейной и основана на порядке величины с основанием 10. Логарифмическая шкала находит применение при наличии большого диапазона значений параметра. Следовательно, фраза «4 порядка» отражает разность между двумя значениями 104, то есть одно значение на 10000 единиц меньше или больше другого значения, «5 порядков» отражает разность между двумя значениями 105, то есть одно значение на 100000 единиц меньше или больше другого значения и т. д. Фраза, включающая выражения «ниже», «меньше» или «менее», относится к количеству, которое ниже значения, меньше числа и т. д., или в контексте настоящего документа к меньшему числу вирусных частиц. Следовательно, фраза «на 4 порядка или меньше» означает, что разность между двумя значениями составляет 104, 104,5, 105 и т. д., что означает, что число вирусных частиц, полученных в одном образце, в 10000 меньше, в приблизительно 31600 меньше или в приблизительно 100000 меньше, чем в другом образце, и в контексте настоящего документа означает, что один образец содержит вирусных частиц в 10000 меньше, чем другой образец.

[0050] Задача настоящего изобретения заключается в манипулировании геномом арбовируса для получения специфического для клеток млекопитающего арбовируса с дефектом роста, при этом клетки млекопитающего, инфицированные таким арбовирусом, не высвобождают зрелое потомство вируса, но продолжают экспрессировать эпитопы и детерминанты арбовируса, которые могут распознаваться млекопитающим-хозяином, например, детерминанты, экспрессируемые, например, белками М и Е. Клеточные и/или гуморальные ответы на арбовирус могут генерироваться у млекопитающего-хозяина. Представляющий интерес арбовирус, по сути, напоминает вирус дикого типа и, таким образом, представляет иммунной системе млекопитающего-хозяина разнообразие арбовирусных эпитопов, которые можно найти в арбовирусе, в арбовирусе дикого типа. Представляющий интерес арбовирус просто не может реплицироваться в клетке млекопитающего-хозяина и, следовательно, не может способствовать инфекции других клеток млекопитающего-хозяина и патологии или заболеванию у хозяина.

[0051] Следовательно, настоящее изобретение относится к дефективному или дисфункциональному арбовирусу, который содержит и экспрессирует большинство структурных белков, если не все, или по меньшей мере большинство полипептидов, которые включают в себя детерминанты или эпитопы антител, или к иммунным клеткам, вырабатываемым инфицированным хозяином на арбовирус. Таким образом, например, для флавивируса, предпочтительно, чтобы большинство белков pr, M и/или E экспрессировалось таким образом, поскольку они содержат иммуногенные сайты вируса дикого типа. Белок С может быть меньше целевого для иммунной системы хозяина, но может присутствовать.

[0052] Все известные арбовирусы требуют расщепления фурином полипротеина-предшественника для правильного созревания вируса и высвобождения из клетки-хозяина, такого как расщепление prE2 на E3 и E2 в некоторых альфавирусах и расщепление prM на pr и M в некоторых флавивирусах, для правильного созревания вируса и последующего высвобождения потомства вируса из инфицированной клетки.

[0053] Представляющий интерес мутантный арбовирус содержит измененный или дисфункциональный сайт расщепления фурином, например, в prE2 или в prM, и необязательно изменения в вышележащем и/или нижележащем направлении консенсусного сайта расщепления фурином, что приводит в результате к усиленному расщеплению фурином, например, prE2 или prM, с продуцированием вируса, который продолжает реплицироваться в клетках насекомого, но больше не реплицируется или реплицируется очень плохо в клетках млекопитающего (которое, конечно, включает в себя человека). Следовательно, изменение в сайте расщепления фурином и/или около такового, например, prE2 или prM, в арбовирусе дает вирус с ограниченным ростом, который продолжает расти в клетках насекомого, но больше не растет или плохо растет в клетках человека или млекопитающего, при этом рост указывает на то, что потомство вируса высвобождается инфицированной клеткой.

[0054] В целом, во время созревания начальной частицы флавивируса в аппарате Гольджи незрелые частицы представляют собой шипы, содержащие тримеры белков prM и E, которые во время прохождения через аппарат Гольджи, возможно, вследствие изменения рН, перестраиваются с образованием гладкой поверхности частицы. Эта перестройка или трансформация шипов экспонирует сайт расщепления фурином в prM. prM расщепляется фурином, и некоторые из фрагментов pr, возможно, на основании pH в аппарате Гольджи, остаются связанными с частицей. Предполагают, что фрагмент pr предотвращает слияние мембран. Когда начальная частица высвобождается из аппарата Гольджи во внеклеточную среду, pr высвобождается из начальной частицы с образованием зрелой частицы, которая может сливаться с клеточной мембраной для высвобождения из клетки. Некоторые развивающиеся частицы могут не созреть. Тем не менее, вирусный белок связан с внутриклеточными мембранами и может быть предназначен для включения в клеточную мембрану, где вирусные белки экспрессируются на клеточной поверхности. Вирусные частицы и компоненты могут высвобождаться в среду после гибели и лизиса клеток.

[0055] Без привлечения теории следует отметить, что представляющий интерес мутантный вирусный геном, содержащий измененный сайт расщепления фурином в prM, обеспечивающий усиленное расщепление prM, может обеспечивать расщепление prM до того, как развивающаяся вирусная частица попадет в аппарат Гольджи, вероятно, при других условиях pH, в результате чего pr не связывается с поверхностью частицы, когда частица входит и находится в аппарате Гольджи. Следовательно, без pr для предотвращения слияния с мембраной вирусная частица не может должным образом созревать при прохождении через аппарат Гольджи и улавливаться в аппарате Гольджи. Из-за преждевременного расщепления prM перед входом в аппарат Гольджи представляющая интерес частица арбовируса не содержит pr и, следовательно, не может быть должным образом обработана в аппарате Гольджи, в результате чего вирусная частица связывается, сливается с мембранами аппарата Гольджи и не высвобождается из мембран аппарата Гольджи, а, следовательно, не может быть высвобождена из клетки.

[0056] Однако этот процесс не изменяется в клетках насекомого, где время и/или эффективность расщепления фурином, например, prE2 или prM, не способствует или не препятствует надлежащему созреванию частиц арбовируса и высвобождению их из клетки насекомого-хозяина. Таким образом, инфицированные клетки насекомого продуцируют потомство арбовируса на уровнях, сравнимых с уровнями насекомого, инфицированного вирусом дикого типа, таких же или превышающих таковые.

[0057] Консенсусный тетрапептид фурина (R-X-K/R-R (SEQ ID NO: 16)) представляющего интерес арбовируса располагается, например, в месте соединения E3 и E2, и в месте соединения полипептида pr и белка M. Аминокислоты тетрапептида изменяют с помощью замены аминокислот, сайт-направленного мутагенеза нуклеиновой кислоты, кодирующей эту аминокислоту, и т. д., применяя известные способы, такие как конструирование тетрапептида с содержанием, например, Arg в качестве второго или X сайта. Измененный сайт фурина помещают, например, в нуклеиновую кислоту полной длины, например, с помощью гомологичной рекомбинации, применяя известные способы. Манипулирование нуклеиновой кислотой может быть осуществлено для кДНК, которая затем транскрибируется с образованием вирусной РНК, содержащей измененную последовательность, кодирующую сайт расщепления фурином, как описывается в настоящем документе, и с применением способов, известных в уровне техники. Вирусные нуклеиновые кислоты могут быть упакованы в частицы, например, путем электропорации вирусной РНК в соответствующие клетки-хозяева. Трансфицированные клетки культивируют, контролируют на предмет продуцирования вирусных частиц и получают вирусные частицы, несущие РНК, содержащую измененную область, кодирующую сайт расщепления фурином. Известны ДНК, РНК, векторы, клетки-хозяева и т. п., и некоторые реагенты коммерчески доступны, также, см., например, Polo et al., Zeng et al., Khromykh et al. J Virol 75(10)4633-4640, 2001; Gehrke et al., J Virol 77(6)8924-8933, 2003; и Shustov et al., J Virol 81(21)11737-11748, 2007. Затем вирусные частицы используют для инфицирования соответствующих клеток и культивируют, как известно в уровне техники. Продуцирование вируса потомства контролируют с использованием описанных в настоящем документе способов, чтобы определить, влияет ли изменение на репликацию вируса в клетках млекопитающего, но не в клетках насекомого, и в какой степени изменяется размножение в этих двух типах клеток.

[0058] Настоящее изобретение отчасти относится к флавивирусам, некоторые из которых содержат полипротеин prM.

[0059] Согласно вариантам осуществления настоящее изобретение относится к DV (такому как любой из серотипов 1-5).

[0060] Геном DV состоит из одной линейной однонитевой + смысловой РНК. Весь геном может варьировать от 10 до 11 т. п. н. 3'-Полиаденилирование отсутствует. 5'-Конец имеет метилированный кэп. Геном DV не содержит внутренние сайты связывания рибосомы (IRES), которые обеспечивают сайт инициация трансляции для рибосом хозяина. Вместо этого DV использует рибосомное сканирование, чтобы начать синтез белка.

[0061] Вирионы денге представляют собой сферы диаметром от 40 до 65 нм. Под липидной оболочкой находится икосаэдрическая капсидная оболочка диаметром приблизительно 25-30 нм.

[0062] Лихорадка денге является острым инфекционным заболеванием, характеризующимся двухфазной лихорадкой, головной болью, болью в различных частях тела, прострацией, сыпью, лимфаденопатией и лейкопенией (Holstead, 1980, Immunological parameters of togavirus disease syndromes, p. 107-173, in Schlesinger (ed.), “The Togaviruses,” Academic Press, Inc., NY; и Sabin, 1959, Dengue, p. 361-373, in Rivers & Horsfall (eds.), “Viral and Rickettsial Infections of Man,” JB Lippincott Co., Philadelphia). DV переносят комары. Заражение одним серотипом вируса денге может обеспечить пожизненный иммунитет к этому подтипу, но не перекрестно-защитный иммунитет к другим серотипам.

[0063] Геморрагическая лихорадка денге (DHF) представляет собой тяжелое лихорадочное заболевание, характеризующееся аномалиями гемостаза и повышенной проницаемостью сосудов, что в некоторых случаях приводит к синдрому гиповолемического шока, синдрому шока денге (DSS) (WHO: 1975. Technical Guides for Diagnosis, Treatment, Surveillance, Prevention and Control of Dengue Hemorrhagic Fever, Geneva, CH). Механизм DHF/DSS может варьировать в разных случаях. Основные факторы, способствующие DHF/DSS, могут включать в себя вирусную вирулентность, состояние здоровья больного и вторичную инфекцию различных серотипов DV.

[0064] В настоящее время существует пять серотипов DV - 1, 2, 3, 4 и 5. Иммунитет к одному серотипу обычно не обеспечивает иммунитет к другому серотипу.

[0065] Усугубляющим является то, что люди не всегда одинаково реагируют на отдельные серотипы. Таким образом, человек, инфицированный одновременно по меньшей мере двумя серотипами DV, вероятно, выработает иммунный ответ только против одного серотипа. Более того, последующие инфекции, как правило, серотипа, отличного от такового при первичной или предыдущей инфекции, но также и в тех случаях, когда первая или предшествующая инфекция являются доброкачественными, легкими или бессимптомными, могут привести к более тяжелому заболеванию и патологии.

[0066] Причины доминирования, селективности или интерференции серотипов неизвестны. Может случиться так, что in situ репликация, рост, созревание и высвобождение вируса из клетки-хозяина или представление антигена могут направлять иммунный ответ хозяина на конкретный серотип.

[0067] В любом случае, менее чем предсказуемый ответ хозяина, интерференция серотипов и бессимптомные инфекции создают многочисленные препятствия при разработке эффективной поливалентной вакцины.

[0068] Имеющиеся поливалентные живые вакцины не способны генерировать эквивалентный иммунитет ко всем серотипам, даже когда относительные количества каждого серотипа в вакцине варьируют в попытке компенсировать искаженные иммунные ответы.

[0069] В практике осуществления представляющего интерес объекта настоящего изобретения конструировали различные геномы DV с различными аминокислотными заменами в остатке Glu сайта расщепления фурином prM; в 3'-5'-направлении консенсусного тетрапептида, например, в удлинении из 8 аминокислот в 3'-5'-направлении рядом с консенсусом, то есть аминокислоты 88-91; в 5'-3'-направлении консенсусного тетрапептида, например, в удлинении из 39 аминокислотах в 5'-3'-направлении рядом с консенсусом из аминокислот 88-91, то есть аминокислоты 92-130 (то есть в пределах аминокислот 80-130 включительно prM), или их комбинация. Аминокислотное(ые) изменение(ия) усиливает(ют) расщепление prM фурином. При введении в клетки-хозяева млекопитающего происходила репликация и происходила экспрессия с образованием вирусных частиц. Однако зрелые частицы, предназначенные для перемещения из клетки-хозяина, не были получены. Таким образом, представляющая интерес частица инфицирует клетку млекопитающего один раз, мутантный вирусный геном реплицируется и экспрессируется в клетке-хозяине млекопитающего, но частицы зрелого потомства вируса не высвобождаются инфицированными клетками-хозяевами млекопитающего или человека.

[0070] Согласно вариантам осуществления тетрапептидный сайт расщепления фурином DV в белке prM NH2-(88)Arg-Glu-Lys-Arg-COOH (SEQ ID NO: 1), при этом расщепление происходит в 5'-3'-направлении остатков Lys-Arg, изменяется в сайте Glu для усиления расщепления фурином.

[0071] Согласно вариантам осуществления Glu замещается любой аминокислотой. Замещающая аминокислота может представлять собой не кислотную, не нейтральную аминокислоту, такую как Gln, Asn, Gly, Lys, Arg, His, Thr, Ser, Tyr, Met или Cys. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не содержит серу. Следовательно, замещающая аминокислота представляет собой не кислотную, не нейтральную аминокислоту, отличную от Met или Cys. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не содержит гидроксильную группу R. Следовательно, согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота не является Tyr, Ser или Thr. Согласно вариантам осуществления замещающая мутантная аминокислота является основной аминокислотой. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой Lys, Arg или His. Согласно вариантам осуществления замещающая аминокислота представляет собой Arg.

[0072] Согласно вариантам осуществления изменяют аминокислоту в 3'-5'-направлении консенсусного тетрапептида. Например, изменяют аминокислоту в удлинении из восьми аминокислот непосредственно в 3'-5'-направлении консенсусом (или на аминоконцевой стороне) сайта расщепления фурином для усиления расщепления фурином prM («измененный сайт в 3'-5'-направлении»). Таким образом, изменение может происходить в аминокислотах 80-87 полипептида prM.

[0073] Согласно вариантам осуществления изменяют аминокислоту в 5'-3'-направлении консенсусного тетрапептида. Например, изменяют аминокислоту в удлинении из тридцати девяти аминокислот непосредственно в 5'-3'-направлении консенсуса (или на карбоксиконцевой стороне) сайта расщепления фурином для усиления расщепления фурином prM («измененный сайт в 5'-3'-направлении»). Изменение может происходить в аминокислотах 92-130 полипептида M.

[0074] Представляющий интерес DV содержит по меньшей мере один из: (1) измененного тетрапептидного сайта расщепления фурином; (2) измененного сайта в 3'-5'-направлении и (3) измененного в 5'-3'-направлении сайта. Представляющий интерес DV может включать в себя комбинацию любых двух из (1), (2) и (3). Представляющий интерес DV может включать в себя все три изменения.

[0075] Согласно вариантам осуществления арбовирус представляет собой ZV, который включает в себя полипротеин prM.

[0076] Геном ZV состоит из одной однонитевой положительной смысловой РНК из 10794 оснований (хотя некоторые изоляты имеют другой размер [например, Baronti et al., Genome Announc 2(3)1-2, 2014]). Помимо структурных и неструктурных генов имеются 3' и 5' некодирующие концы.

[0077] ZV характеризуется незначительными уровнями полиморфизма. Например, распознают по меньшей мере два подтипа - африканскую линию вируса и азиатскую/южно-американскую линию вируса. Эти две линии можно различать серологически, то есть существует вероятность вариации белков оболочки.

[0078] Симптомы лихорадки Зика могут включать в себя лихорадку, покраснение глаз, боль в суставах, головную боль и макулопапулезную сыпь и обычно длятся менее семи суток. Хотя первоначальная инфекция не считается фатальной для нормальных взрослых, инфекция во время беременности может вызвать пороки развития и аномалии у развивающегося эмбриона и/или плода, такие как микроцефалия. Инфекции у взрослых были связаны с синдромом Гийена-Барре.

[0079] ZV преимущественно переносится комарами. После крупной вспышки лихорадки Зика в Бразилии в 2015 году ZV распространился через Латинскую Америку и Карибский бассейн, а теперь и в Соединенные Штаты Америки.

[0080] Жизненный цикл ZV начинается с прикрепления вириона к поверхности клетки-хозяина и последующего попадания в клетку путем опосредованного рецептором эндоцитоза. Как понимают в настоящее время, подкисление эндосомального везикула запускает конформационные изменения в вирионе, слияние вирусной и клеточной мембран и разборку частиц. Как только геном высвобождается в цитоплазму, положительная смысловая РНК транслируется в один полипротеин, который процессируется протеазами вируса и хозяина в 10 генных продуктов: три структурных белка, коровый белок (С), премембранный белок (prM), белок оболочки (E) и семь неструктурных (NS) белков - NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5.

[0081] Сайт расщепления фурином ZV расположен после аминокислоты 93 в prM. Согласно вариантам осуществления последовательность белка prM в 3'-5'-направлении тетрапептидного сайта расщепления фурином включительно, His-His-Lys-Lys-Gly-Glu-Ala-Arg-Arg-Ser-Arg-Arg/ (SEQ ID NO: 2), при этом расщепление происходит после концевого Arg и обозначается косой чертой, при этом сериновый остаток заменяется Arg (тетрапептидного сайта, Arg-Ser-Arg-Arg (SEQ ID NO: 10)), с обеспечением последовательности из пяти аргининовых остатков для усиления расщепления фурином. Кроме того, остаток глутаминовой кислоты в 3'-5'-направлении удлинения может быть изменен, например, на гистидин, для усиления расщепления фурином. Другие изменения остатков в 3'-5'-направлении удлинения усиливают расщепление фурином. Изменения в 5'-3'-направлении тетрапептидного удлинения усиливают расщепление фурином. Например, изменения могут касаться любой или всех из 26 аминокислот удлинения в 5'-3'-направлении тетрапептида, что усиливает расщепление фурином.

[0082] Усиленной активности фурина достигают с помощью одного или нескольких из: (1) изменения одной или нескольких аминокислот в 3'-5'-направлении сайта расщепления фурином, например, в последовательности из восьми остатков, начинающейся с аминокислотного остатка 82 от N-конца prM ZV (т. e. аминокислотные остатки 82-89 prM); (2) изменения в сайте расщепления фурином и (3) изменения одного или нескольких аминокислотных остатков в 5'-3'-направлении (от аминокислоты 94 и далее) сайта расщепления фурином, например, в последовательности из 26 остатков в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином. Может присутствовать любая комбинация из (1), (2) и (3).

[0083] У вируса желтой лихорадки, вируса калифорнийского энцефалита, вируса лихорадки долины Рифт, вируса клещевого энцефалита, вируса Западного Нила, вируса энцефалоза лошадей, вируса колорадской клещевой лихорадки, вируса чикунгуньи, вируса африканской чумы свиней и других арбовирусов консенсусный тетрапептидный сайт распознавания фурином располагают на основе известной консенсусной последовательности распознавания фурином и в ней осуществляют аминокислотные замены для идентификации мутантов, которые больше не размножаются или плохо размножаются в клетках млекопитающего. Аминокислотные изменения, такие как, замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., также могут быть выполнены в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении консенсусного сайта расщепления фурином.

[0084] Известны получение, выращивание и поддержание вируса в клеточных линия и в животных. Известно получение мутантов арбовируса путем изменения кодирующих последовательностей с использованием молекулярных методик. Известны различные тесты для определения роста вируса в клетках, продуцирования потомства вируса из клеток и другие анализы, применимые в осуществлении настоящего изобретения, и их выбор является конструктивным выбором.

[0085] Еще одна цель настоящего изобретения заключается в разработке масштабируемой системы для получения композиции представляющего интерес иммуногенного арбовируса. Эту цель достигали путем получения представляющего интерес арбовируса, который экспрессирует дисфункциональный сайт расщепления фурином, который расщепляется на повышенных уровнях фурином, в линиях клеток насекомого, таких как линии клеток членистоногих, например, линии клеток клещей или комаров, при этом материалы и способы для крупномасштабного получения вируса клетками насекомого известны и доступны. Линии клеток членистоногих коммерчески доступны, например, линии клеток шелкопряда и линии клеток комара.

[0086] Представляющий интерес арбовирус растет беспрепятственно в клетках насекомого. Таким образом, представляющий интерес арбовирус, несущий дисфункциональный сайт расщепления фурином, растет, реплицируется, созревает и может быть высвобожден клеткой насекомого-хозяина в окружающую среду в приблизительно той же степени или при том же уровне, что и арбовирус дикого типа. Таким образом, представляющий интерес арбовирус может продуцировать потомство вируса до той же степени или при более высоких уровнях, чем арбовирус, который не содержит представляющий интерес дисфункциональный сайт расщепления фурином в клетках насекомого.

[0087] Степень продуцирования потомства вируса (или размножения) может быть оценена, например, в анализе бляшкообразования или анализе гемагглютининов, известном в уровне техники и изложенном в настоящем документе. Легким и чувствительным способом оценки продуцирования вируса является подсчет флуоресцентно меченных клеток в проточном цитометре, как описано в Drayman & Oppenheim, “Rapid Titration of Viruses by Flow Cytometry,” Curr Prot Cell Biol 26.11.1-26.11.7, 2011. Следовательно, серийно разведенные инфицированные клетки получают с отделением, если необходимо, клетки собирают, фиксируют и подвергают воздействию одного или нескольких реагентов на основе антител по меньшей мере с одним Ab, направленным на вирусный белок, и по меньшей мере с одним флуоресцентно меченным Ab, а затем, например, с помощью проточного цитометра, считывают по меньшей мере приблизительно 10000 клеток, чтобы определить количество флуоресцентно меченных клеток, экспрессирующих этот вирусный белок. Таким образом, представляющий интерес арбовирус может продуцировать приблизительно те же или большие уровень или количество потомства вируса по сравнению с количеством потомства вируса, продуцируемого клетками, инфицированными эталонным арбовирусом (таким как для DV серотип 2, новогвинейский штамм, № в ATCC VR-1584), в клетках C6/36 (№ доступа в ATCC CRL-1660), или вирусом дикого типа тех же штамма или линии, не включающим в себя представляющий интерес мутантный вирус, обладающий усиленной активностью фурина или демонстрирующий усиленное расщепление фурином, или prM.

[0088] Представляющий интерес арбовирус не созревает надлежащим образом в клетках млекопитающего, и частицы не высвобождаются клеткой млекопитающего-хозяина (или не размножаются), но вместо этого незрелые частицы улавливаются и накапливаются в клетке млекопитающего-хозяина. Таким образом, представляющий интерес арбовирус практически не продуцирует потомство вируса в клетках человека или млекопитающего. Представляющий интерес арбовирус продуцирует меньше потомства вируса по сравнению с арбовирусом дикого типа, например, на 4 порядка или меньше, 5 порядков или меньше, 6 порядков или меньше, 7 порядков или меньше, 8 порядков или меньше, 9 порядков или меньше, или не продуцирует потомство по сравнению с количеством потомства, производимого, например, при использовании клеток HT1080 (№ доступа в ATCC CCL-121).

[0089] Представляющий интерес мутантный вирус, который не размножается в клетках млекопитающего, является желательным, поскольку заболевание или патология сводятся к минимуму или предотвращаются. Однако очень низкое высвобождение или отсутствие высвобождения потомства вируса не является важным или необходимым. Дисфункциональный вирус, который при инфицировании в клетке млекопитающего, продуцирующий, например, на 4 порядка или меньше, 5 порядков или меньше, 6 порядков или меньше потомства вируса по сравнению с подобной клеткой, инфицированной вирусом дикого типа, может быть применен в качестве иммуногена несмотря на высвобождение низких или небольших количеств потомства вируса, потому что иммунная система хозяина в конечном итоге выведет вирус и клетки, экспрессирующие вирусный антиген.

[0090] Вирус, содержащий представляющий интерес измененный и дисфункциональный сайт фурина, является инфекционным, но не может продуцировать или не продуцирует инфекционные вирионы потомства при заражении клеток млекопитающего. Таким образом, нереплицирующаяся частица представляет собой частицу, которая инфицирует клетку млекопитающего-хозяина, такую как клетка человека, но эта клетка-хозяин не дает или не высвобождает частицы потомства вируса, образующиеся в результате этой инфекции. Но эта инфицированная клетка-хозяин млекопитающего экспрессирует эпитопы арбовируса в инфицированной клетке и на таковой.

[0091] Уникальный характер представляющего интерес дефектного вируса обеспечивает источник эффективных и безопасных арбовирусных иммуногенных композиций, и большое количество вируса может быть эффективно получено путем выращивания представляющего интерес вируса в клетках насекомого. Представляющий интерес дисфункциональный вирус может продуцировать приблизительно такое же количество потомства вируса, что и эталонный вирус, при инфицировании в том же типе клетки насекомого. Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дисфункциональный вирус продуцирует больше вируса из клетки насекомого, чем эталонный вирус, инфицирующий этот тип клетки насекомого. Согласно вариантам осуществления представляющий интерес дисфункциональный вирус продуцирует меньше вируса, чем эталонный вирус. Высокоиммуногенный дисфункциональный вирусный штамм имитирует процесс естественной инфекции арбовируса и позволяет млекопитающему-хозяину генерировать и вырабатывать длительный и широкий иммунитет против арбовируса без патологии или с минимальной патологией Таким образом, представляющий интерес измененный арбовирус представляет собой вирус, который содержит генетический материал для экспрессии как можно большего количества или всех эпитопов, экспрессируемых белками prM, M и E дикого типа и, возможно, также C арбовируса дикого типа.

[0092] Представляющий интерес арбовирус может инфицировать многие, если не все восприимчивые клетки после соответствующего титрования. Степень инфекционности может быть оценена с использованием стандартного и известного анализа. Например, клетки Vero в шести-луночном планшете инфицируют арбовирусом при серийном разведении и клетки перемешивают на шейкерной платформе при 37°C. Жидкость клеточной культуры собирают через 48 часов. Количество вируса, высвобождаемого в культуральную среду, может быть определено с использованием известных способов, таких как те, что описаны в настоящем документе.

[0093] Например, чтобы приготовить частично очищенные частицы арбовируса, культуральную жидкость очищают, например, центрифугированием при 16000 × g в микроцентрифуге в течение 15 минут при 4°C, и частицы осаждают из надосадочной жидкости ультрацентрифугированием при 40000 оборотах в минуту в течение 2 часов при 4°C в роторе AH650 центрифуги Sorvall OTD55B. Гранулы повторно суспендируют в 50 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS) и оставляют растворяться на протяжении ночи при 4°C.

[0094] Для определения титра арбовируса, например, клетки почки детеныша хомяка (ВНК)-21 на предметных стеклах с восьмью луночными камерами инфицируют 50 мкл серийных 10-кратных разведений жидкости клеточной культуры или повторно суспендированного осажденного центрифугированием материала в течение 2 часов при 37°С. Затем жидкость заменяют 1 мл минимальной питательной среды Дульбекко, дополненной 2% фетальной бычьей сыворотки. Клетки инкубируют в течение 24 часов при 37°С в инкубаторе с CO2, а затем подвергают иммунофлуоресцентному (IF) анализу с использованием специфического в отношении арбовируса Ab или mAb (коммерчески доступного или полученного, как известно в уровне техники), HMAF, как описано ниже, или поликлональной антисыворотки с требуемой специфичностью, реагента, который образует сэндвич со специфическим в отношении вируса реагентом, который несет выявляемый репортер, и с использованием соответствующих контролей.

[0095] Титры вируса (в инфекционных единицах (IU) на миллилитр), присутствующего в собранных культуральных жидкостях (CF), также определяли путем инфицирования, например, эпителиальных клеток почки резуса (например, клеток LLC-MK2 (ATCC)), с последующим непрямым иммунофлуоресцентным анализом (IF) со специфическими в отношении арбовируса реагентами и мечеными реагентами, например, гипериммунной асцитической жидкостью мыши (HMAF), содержащей mAb.

[0096] Как гуморальные на основе антител, так и клеточные иммунные ответы участвуют в защите инфекции DV и восстановлении после нее. Представляющий интерес арбовирус индуцирует обе группы иммунного ответа. Частицы состоят из белков prM, M и/или E, и, таким образом, представляющие интерес частицы представляют собой иммуногены широкого спектра действия и имитируют заражение вирусом дикого типа. Но представляющие интерес частицы инфицируют клетки-хозяева млекопитающего, и в этих клетках дополнительный белок prM, M и/или E экспрессируется в клетке-хозяине или клеткой-хозяином. Белки prM, M и/или E либо могут высвобождаться из этих клеток, обеспечивая дополнительные антигенные стимулы для хозяина, либо могут экспрессироваться на поверхности инфицированных клеток-хозяев с обеспечением еще одного пути антигенного стимула для хозяина. Представляющий интерес арбовирус необязательно может экспрессировать неструктурные белки, такие как NS1. Предыдущие сообщения показали, что эти вирусные белки NS могут индуцировать защитный иммунный ответ (Heinz & Roehrig, 1990, in, “Immunochemistry of Viruses, Vol II,” Amsterdam-NY-Oxford, Elsevier, p. 289-305; Heinz, 1986, Adv Virus Res 31:103-168; Bray & Lai, 1991, Virol, 185:505-508; Henchal et al., 1988, J Gen Virol 69:2101-2107; и Schlesinger et al., 1986, J Virol 60:1153-1155).

[0097] Соответствующие модели для тестирования эффективности представляющей интерес фармацевтической композиции включают в себя животные модели, которые моделируют арбовирусную инфекцию. Например, был описан протокол, используемый для иммунизации мышей и последующего заражения арбовирусом (Bray et al., 1989, J Virol 63:2853-2856). Вкратце, по 10 самок мышей BALB/c в каждой группе иммунизируют в возрасте 3 недель (день 1) и снова в день 14 путем внутрибрюшинной (ip) инокуляции вируса, такого как DV. Контрольные животные получают забуференный фосфатом солевой раствор (PBS). У всех животных берут кровь в день 0 и в день 21. В случае DV мышей заражают в день 22 путем внутрицеребральной инъекции дозы, в 100 раз превышающей 50% смертельную дозу (LD50), вируса. После заражения мышей наблюдают в течение 21 суток на наличие признаков патологии, а мышей с симптомами (энцефалит, паралич или смерть) регистрируют ежедневно. Сыворотку крови также собирают у выживших для сравнения с сыворотками крови перед заражением.

[0098] Определяют дозу каждого вируса. Серореактивность иммунизированных мышей к отдельным белкам арбовируса анализируют, например, с помощью ELISA или радиоиммунопреципитации меченых антигенов арбовируса с использованием коммерчески доступных наборов для мечения и антител. Анализ уменьшения образования бляшек может быть использован для измерения титров специфических в отношении арбовирусов нейтрализующих антител в сыворотке крови мыши. Например, приблизительно 0,5 мл образца сыворотки крови, который будет использоваться в анализе, сначала инактивируют нагреванием путем инкубации в течение 30 минут при 56°С. Готовят четырехкратные разведения сыворотки крови в конечном объеме 0,3 мл, начиная с разведения 1:10, с использованием среды М199 с 2% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) в качестве разбавителя. К каждой аликвоте 0,3 мл разбавленной сыворотки крови добавляют равный объем среды, содержащий 150-180 образующих бляшки единиц (PFU) вируса. Вирус и сыворотку крови смешивают и инкубируют в течение 30 минут при 37°С. В каждом анализе также предусматривают контроль без сыворотки крови и контроль, состоящий из специфического в отношении каждого арбовируса Ab, например, в двух разведениях. Смеси вируса/сыворотки крови и контроля высевают на слившиеся монослои, например, клеток LLC-MK2, в шестилуночные планшеты Costar (Corning Inc., Corning, NY) по 0,2 мл/лунка. Для каждого образца инфицируют дублирующие лунки. Адсорбцию вируса осуществляют в течение 1 часа при комнатной температуре с покачиванием вручную каждые 15 минут. Затем лунки покрывают средой, содержащей 1% агарозы (SeaKem LE; BioWhittaker, Rockland, ME) в сбалансированном солевом растворе Эрла плюс 10% FBS с добавлением незаменимых витаминов и аминокислот (Invitrogen) при 6 мл/лунка. Планшеты инкубируют в течение 7 суток при 37°С в 5% CO2. Затем лунки покрывают 4% раствором нейтрального красного (4 мл раствора нейтрального красного, добавленного к 96 мл PBS), содержащим 1% агарозы. Планшеты инкубируют в течение 24 часов при 37°С. Среднее число бляшек используют для расчета 50% снижения уровня количества бляшек.

[0099] Согласно вариантам осуществления представляющая интерес композиция вируса представляет собой композицию, которая является поливалентной, то есть двухвалентной, трехвалентной, четырехвалентной и т. д., и представляет собой композицию, которая иммунизирует хозяина к множеству серотипов арбовируса, как правило, одного вируса, но может включать в себя антигены от множества видов вирусов, например, включающих в себя множество представляющих интерес мутантных вирусов. Интерференция или доминирование одного серотипа над одним или несколькими другими серотипами не наблюдается. Это может быть потому, что иммуногенность не зависит от продуцирования вируса и от постоянной репликации нового вируса.

[00100] Представляющий интерес арбовирус включают в фармацевтические композиции, подходящие для введения в качестве иммуногена, как известно в уровни техники области иммунологии. Такие композиции обычно содержат активный ингредиент и фармацевтически приемлемый носитель. Применяемый в настоящем документе термин «фармацевтически приемлемый носитель» подразумевает включение любых растворителей, дисперсионных сред, покрытий, противобактериальных и противогрибковых средств, изотонических и задерживающих абсорбцию средств и т п., совместимых с фармацевтическим введением. Применение таких сред и средств для фармацевтически активных веществ известно в уровне техники и является разрабатываемым решением. Их применение в композициях предполагается за исключением случаев, когда какие-либо обычные среда или средство несовместимы с активным соединением. Дополнительные фармакологически активные соединения, такие как адъювант, также могут быть включены в композиции.

[00101] Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением для применения, раскрываемого в настоящем документе, составляют совместимой с предполагаемым путем введения. Примеры путей введения включают в себя парентеральное, например, внутривенное, внутрикожное, подкожное, чрескожное (в том числе, например, местное), трансмукозальное и ректальное введение.

[00102] Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного или подкожного применения, могут включать в себя следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, солевой раствор, нелетучие масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; противобактериальные средства, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатообразующие средства, такие как EDTA; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты; и средства для регулирования тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. рН можно регулировать кислотами или основаниями, такими как HCl или NaOH. Парентеральный препарат может быть заключен в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы с множественными дозами, сделанные из стекла или пластика.

[00103] Фармацевтические композиции, подходящие для инъекционного применения, включают в себя стерильные водные растворы (при этом растворимые в воде) или дисперсии и стерильные порошки для немедленного приготовления стерильных инъекционных растворов или дисперсий. Для внутривенного введения подходящие носители включают в себя физиологический раствор, бактериостатическую воду, Cremophor EL® (BASF; Parsippany, NJ) или забуференный фосфатом солевой раствор (PBS). Во всех случаях композиция должна быть стерильной и должна быть жидкой до такой степени, чтобы ее можно было вводить через шприц. Композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения и должна быть защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Носителем может быть растворитель или дисперсионная среда, содержащая, например, воду, этанол, многоатомный спирт (например, глицерин, пропиленгликоль, жидкий полиэтиленгликоль и т. п.) и их подходящие смеси. Надлежащая текучесть может поддерживаться, например, путем использования покрытия, такого как лецитин, путем поддержания требуемого размера частиц в случае дисперсии и путем использования поверхностно-активных веществ. Предотвращение действия микроорганизмов может быть достигнуто с помощью различных противобактериальных и противогрибковых средств, например, парабенов, хлорбутанола, фенола, аскорбиновой кислоты и т. п. Может быть предпочтительным включение в композицию изотонических средств, например сахаров, многоатомных спиртов, таких как маннит и сорбит, или хлорида натрия. Пролонгированная абсорбция инъецируемых композиций может быть достигнута включением в композицию средства, которое задерживает абсорбцию, например, моностеарата алюминия или желатина.

[00104] Стерильные инъекционные растворы могут быть приготовлены путем включения активного соединения в необходимом количестве в подходящем растворителе с одним или комбинацией ингредиентов, перечисленных выше, при необходимости, с последующей фильтрационной стерилизацией. Как правило, дисперсии готовят путем включения активного соединения в стерильную среду-носитель, которая содержит основную дисперсионную среду и другие требуемые ингредиенты из перечисленных выше. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных инъекционных растворов способы приготовления включают в себя вакуумную сушку и сушку вымораживанием, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из его предварительно стерильно отфильтрованного раствора.

[00105] Пероральные композиции, как правило, включают в себя инертный разбавитель или пищевой носитель. Композиция может быть заключена в желатиновые капсулы или спрессована в таблетки, которые могут быть покрыты оболочкой или обработаны, например, для обеспечения энтеросолюбильной композиции, состава с отсроченным высвобождением и т. д. С целью перорального терапевтического введения активное соединение может быть включено со вспомогательными средствами и может использоваться в форме таблеток, пастилок или капсул. Пероральные композиции также могут быть приготовлены с использованием жидкого носителя для получения сиропа, эликсира или жидкого состава или для применения в качестве жидкости для полоскания рта, при этом соединение в жидком носителе применяют перорально, полощут им рот и выплевывают или проглатывают.

[00106] Фармацевтически совместимые связующие средства и/или адъювантные материалы могут быть включены как часть композиции. Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и т.п. могут содержать любой из следующих ингредиентов или соединений аналогичной природы: связующее, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; вспомогательное средство, такое как крахмал или лактоза; разрыхлитель, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или Sterotes; усилитель скольжения, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как мята перечная, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Представляющие интерес частицы могут быть инкапсулированы в формы, которые выживут при прохождении через желудочную среду. Такие формы обычно известны как составы с энтеросолюбильным покрытием.

[00107] Для введения путем ингаляции соединение может быть доставлено в форме, например, аэрозольного спрея из находящегося под давлением контейнера или дозатора, который содержит подходящий пропеллент, например, газ, такой как диоксид углерода, или небулайзера, или распылителя. Состав может быть жидким, сухим, таким как тонкоизмельченный порошок, и т.д.

[00108] Системное введение также может осуществляться трансмукозальным или чрескожным способом. Для трансмукозального или чрескожного введения в составе используют усилители проницаемости, подходящие для проникновения через барьер. Такие усилители проницаемости, как правило, известны в области техники и включают в себя, например, средства для трансмукозального введения, поверхностно-активные вещества, соли желчных кислот и производные фузидиевой кислоты. Трансмукозальное введение может быть достигнуто путем использования назальных спреев или клизм. Для чрескожного введения активные соединения могут быть составлены в виде мазей, бальзамов, пен, гелей или кремов, как правило, известных в уровне техники. Композиция может быть доставлена с использованием пластыря, наносимого на кожу.

[00109] В форме суппозитория представляющая интерес композиция может включать в себя традиционную основу для суппозитория, такую как масло какао и другие глицериды.

[00110] Согласно вариантам осуществления активное соединение готовят с носителями, которые защищают соединение от быстрого выведения из организма, например, в составе с контролируемым высвобождением, включая имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Могут быть использованы биоразлагаемые биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, сложные полиортоэфиры и полимолочная кислота.

[00111] Способы приготовления таких составов будут очевидны специалистам в данной области. Материалы могут быть получены из коммерческих источников, таких как Johnson & Johnson и Encapsula Nano Sciences (Brentwood, TN).

[00112] Липосомные суспензии (включающие в себя липосомы, на которые нацелены моноклональные антитела и другие такие нацеливающиеся молекулы) также можно использовать в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Они могут быть получены в соответствии со способами, известными специалистам в данной области, например, как описано в патенте США № 4522811.

[00113] Может быть выгодно составлять пероральные или парентеральные композиции в стандартной лекарственной форме для простоты введения и однородности дозировки. Используемый в настоящем документе термин «стандартная лекарственная форма» относится к физически дискретным единицам, подходящим в качестве единичных доз для субъекта, подлежащего лечению; при этом каждая единица содержит заданное количество активного соединения, рассчитанное для получения желаемого терапевтического эффекта, в сочетании с необходимым фармацевтическим носителем.

[00114] Фармацевтические композиции могут быть включены в контейнер, упаковку, набор или дозатор вместе с инструкциями по введению.

[00115] Другой способ введения предусматривает добавление представляющего интерес соединения в пищевой продукт или напиток или вместе с ним, в качестве пищевой добавки или добавки, или в виде лекарственной формы, принимаемой на профилактической основе, подобной витамину.

[00116] Дозировки, например, предпочтительный путь введения и количества, определяют на основании эмпирических данных, полученных из доклинических и клинических исследований, с применением способом, известных в уровне техники. Для повторных введений в течение нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение продолжают до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов заболевания. Однако могут быть применимы другие режимы дозировки. Ход терапии контролируют с помощью традиционных методов и анализов. Типичный режим введения дозы раскрыт в WO 94/04188. Описание единичных лекарственных форм в соответствии с настоящим изобретением продиктовано уникальными характеристиками и может напрямую зависеть от таковых активного соединения и конкретного терапевтического эффекта, который должен быть достигнут, а также ограничений, присущих области приготовления такого активного соединения для лечения индивидуумов. Следовательно, количество вирусных частиц, вводимых взрослому человеку, можно экстраполировать из терапевтических количеств, доставляемых модельным животным, таким как мыши, крысы, обезьяны и т. д. Например, основываясь на исследованиях на мышах, можно вводить приблизительно 106 частиц (или IU), приблизительно 107 частиц, приблизительно 108 частиц, приблизительно 109 частиц или больше на дозу или разделенными дозами. Количество или дозы могут быть скорректированы по мере появления эмпирических данных, как известно в уровне техники.

[00117] Представляющий интерес вирус может быть применен для выработки эффективного иммунного ответа у индивидуума, при этом термин «эффективный» включает в себя минимизацию, уменьшение или предотвращение симптомов или патологии у индивидуума. Поскольку иммунный ответ хозяина является определяющим при получении терапевтического ответа, который может быть классифицирован у любого индивидуума, как и для любого лекарственного средства, вирус или представляющий интерес объект могут быть или могут не быть терапевтическими и могут давать или могут не давать желаемый ответ у реципиента вируса. Введение дозы, путь и способ представления вируса, применение адъюванта и других иммунологических факторов могут решить проблему отсутствия иммунного ответа или умеренного иммунного ответа у индивидуума.

[00118] Это явление проявляется на уровне популяции, и не каждый реципиент в популяции представляющего интерес вируса будет вызывать терапевтический иммунный ответ, и число респондеров в любой популяции может отличаться от такового в другой популяции.

[00119] Применимость представляющего интерес дисфункционального вируса не обусловлена более высоким процентом респондеров в популяции, более высоким уровнем иммунологической защиты в популяции, коммерческой жизнеспособностью, коммерческим успехом и т. д., но только в том случае, если у одного индивидуума представляющий интерес дисфункциональный вирус генерирует терапевтический иммунный ответ, который уменьшает или предотвращает симптомы или заболевание.

[00120] Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано в следующих неограничивающих примерах.

Пример 1

[00121] Вирион DV состоит из 6% РНК, 66% белка, 9% углевода и 17% липида (Russell et al., Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses, in, Schlesinger eds., “The Togaviruses: Biology, Structure, Replication,” New York, Academic, 1980, p. 503-529; и Trent & Naeve, Biochemistry and Replication, in Monath, ed., “St. Louis Encephalitis,” Washington, DC, American Public Health Association, 1980, p. 159-199). Электронно-плотный нуклеокапсид состоит из белка С (капсида) и геномной РНК. Белок оболочки Е и белок мембраны (М) внедряются в липидный бислой с помощью C-концевых гидрофобных якорей. Однако незрелые частицы, обнаруженные во внутриклеточных везикулах, содержат исключительно непроцессированный пре-М (prM) и являются менее инфекционными, чем высвобожденные вирионы (Morens, Clin Infect Dis, 1994, 19:500-512).

[00122] Геном DV является однородным и представляет собой одноцепочечную положительную смысловую молекулу РНК размером приблизительно 10-11 т. п. н., содержащую одну ORF, составляющую приблизительно 95% генома (Chambers et al., Ann Rev Microbiol, 1990, 44:649-688). Геномные РНК полной длины, по-видимому, являются единственными специфическими для вируса молекулами РНК (мРНК) в инфицированных DV клетках. При заражении вирусная РНК транслируется в полипротеин из приблизительно 3400 аминокислот, который процессируется в 10 генных продуктов: три структурных белка, C, prM и E; и семь неструктурных (NS) белков - 1, 2А, 2В, 3, 4А, 4В и 5 (Bhamarapravati & Yokan, Live attenuated tetravalent vaccine, in Gubler & Kuno, eds., “Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever,” Wallingford, CAB International, 1997, pp 367-377; и Falgout & Markoff, 1995, The family flaviviridae and its diseases, p. 47-66, in, Porterfield, ed., “Exotic Viral Infections,” Chapman and Hall Medical, London, United Kingdom).

Пример 2

[00123] Мутантные DV создавали из инфекционного клона кДНК полной длины штамма DV2 New Guinea C (№ в ATCC VR-1584). Фрагменты мутантной ДНК создавали с помощью ПЦР и вводили в клон полной длины с помощью гомологичной рекомбинации, как описано (Zeng et al., J Virol. 1998 Sep;72(9):7510-22). Мутации подтверждали путем секвенирования ДНК. Мутантные РНК DV синтезировали с помощью in vitro транскрипции, как описано в Polo et al., J Virol. 1997;71(7):5366-74.

[00124] Кинетические показатели роста мутантных DV показывали различие роста вируса между инфицированными клетками Vero (№ в ATCC CCL-81) (человека) и инфицированными клетками C6/36 (CRL-1660) (комара). prM DV2 дикого типа (DENV2) (SEQ ID NO: 3) и четыре мутанта, в которых Glu (E из DENV2) сайта распознавания фурином меняли на Arg (R) (D2-89R, SEQ ID NO: 4), Val (V) (D2-89V, SEQ ID NO: 5), Ser (S) (D2-89S, SEQ ID NO: 6) или Gly (G) (D2-89G, SEQ ID NO: 7), тестировали на предмет роста в клетках Vero человека и в клетках C6/36 комара.

[00125] Мутант D2-89R, в котором Glu меняли на R, размножался в клетках насекомого и не демонстрировал репликации в клетках человека.

Пример 3

[00126] Мутантов создавали со вторым серотипом DV из инфекционного клона кДНК полной длины штамма DV1 Western Pacific 74 (№ в Genbank U88536). Фрагменты мутантной ДНК создавали с помощью ПЦР и вводили в клон полной длины с помощью гомологичной рекомбинации, как описано (Markoff et al., J Virol. 2002;76(7):3318-28). Мутации подтверждали путем секвенирования ДНК. Мутантные РНК DV синтезировали с помощью in vitro транскрипции, как описано у Polo et al.

[00127] Кинетические показатели роста мутантных DV показывали различие роста вируса между инфицированными клетками Vero (№ в ATCC CCL-81) (человека) и инфицированными клетками C6/36 (CRL-1660) (комара).

Пример 4

[00128] Получали мутанта DV1, как описано в примерах 2 и 3, содержащего следующую последовательность:

CSQTGEHRRRKRSVALAPHVGLGLETRTETWMSSEGAWKHAQRIETWILRH (SEQ ID NO: 17).

[00129] Эта последовательность начинается с аминокислоты 80 полипептида prM DV1, и в консенсусном тетрапептиде фурина D меняли на R. Расщепление происходит между R и S в указанной выше последовательности.

[00130] Кинетические показатели роста мутантного DV1 показывали различие роста вируса между инфицированными клетками Vero (№ в ATCC CCL-81) (человека) и инфицированными клетками C6/36 (CRL-1660) (комара)

Пример 5

[00131] Анализ вестерн-блоттинга с применением известного способа с коммерчески доступным mAb DV prM и сравнением интенсивности полос и размера полос для вывода молекулярной массы показывал, что эффективность расщепления фурином мутантных DV усиливалась как в клетках Vero (CCL-81), так и в клетках C6/36 (CRL-1660).

Пример 6

[00132] Рост мутантных DV в клетках млекопитающих исследовали путем непрямого иммунофлуоресцентного окрашивания. В способе Polo et al. использовали mAb 4G2 из ATCC (HB-112).

[00133] Положительную флуоресценцию наблюдали от 1 суток до 3 суток после заражения с увеличением яркости и увеличением количества положительных клеток для положительных контролей с использованием родительского вируса DV2. С другой стороны, при инфицировании мутантом D2-89R интенсивность и количество флуоресцирующих клеток постепенно уменьшались в течение этого периода времени. Никаких новых колоний не формировалось от 1 до 3 суток после заражения.

[00134] Таким образом, мутант D2-89R инициировал только один цикл инфицирования в клетках человека и не продуцировал инфекционные частицы потомства вируса.

Пример 7

[00135] Для подтверждения того, что рост мутанта D2-89R ограничен в клетках человека, клетки фибробласты кожи (CRL-2522, ATCC) инфицировали in vitro с помощью DV2 или D2-89R и оценивали наличие антигенов вирусной оболочки по иммунофлуоресценции в различные моменты времени (часы) после инфицирования (hpi), как описывается в настоящем документе. DV2 размножался и продуцировал потомство вируса в клетках CRL-2522, тогда как мутант D2-89R нет.

[00136] Постепенное усиление продуцирования вирусных частиц с течением времени, указывающее на активную репликацию вируса в инфицированных клетках, наблюдали для клеток, инфицированных вирусом DV2 дикого типа.

[00137] С другой стороны, клетки, инфицированные мутантным D2-89R, не продуцировали никакого вирусного потомства.

Пример 8

[00138] Для оценки защитной эффективности специфического в отношении клеток млекопитающего ограничения роста представляющего интерес мутанта DV против заражения DV группы 6-недельных мышей AG129 (N = 6/группа) получали однократную внутрибрюшинную иммунизацию 105 инфекционными единицами (IU) мутанта D2-89R. Мышам контрольной группы вводили внутрибрюшинной инъекцией 50 мкл забуференного фосфатом солевого раствора (PBS).

[00139] Две группы мышей не демонстрировали какой-либо видимой разницы в подвижности и поведения после иммунизации.

[00140] Через десять суток после иммунизации мышам, которым вводили инъекцией D2-89R, и контрольным мышам AG129, которым вводили PBS, вводили внутрибрюшинной инъекцией 105 образующих бляшки единиц (PFU) (что составляет стократную инокуляцию LD50) DV2.

[00141] У контрольных мышей, которым вводили инъекцией PBS, инокулированных DV2, развивалась виремия. Напротив, однократная иммунизация мутантом D2-89R обеспечивала полную защиту от заражения DV2 без обнаруживаемой виремии (< 100 копий/мл) в любой момент времени (N = 10).

[00142] Более того, все мыши, подвергшиеся воздействию D2-89R, были здоровы на протяжении всего эксперимента, тогда как все мыши, подвергшиеся воздействию только PBS, умерли после заражения DV2, см. фиг. 1.

Пример 9

[00143] Для оценки безопасности мутантов DV использовали мышей AG129, поскольку мыши AG129 могут быть смертельно инфицированы DV2 с помощью всего лишь 1 PFU вируса.

[00144] Группа из 6 взрослых мышей AG129 получала 106 IU мутанта D2-89R внутрибрюшинно. Для контрольных групп равным количествам мышей на группу вводили внутрибрюшинной инъекцией 101, 102 и 103 PFU DV2. Вирусную нагрузку после инъекции DV2 и D2-89R количественно определяли с помощью ОТ-ПЦР.

[00145] У инфицированных DV2 групп мышей развивалась выявляемая виремия, и все погибали после инфицирования.

[00146] С другой стороны, мыши, подвергшиеся воздействию мутанта D2-89R, не имели выявляемой виремии, и все оставались живыми на протяжении эксперимента (15 суток) без каких-либо признаков болезни и изменения массы.

Пример 10

[00147] Электронно-плотный нуклеокапсид ZV состоит из белка С (капсида) и геномной РНК. Белок оболочки Е и белок мембраны (М) внедряются в липидный бислой (Russell et al., Chemical and Antigenic Structure of Flaviviruses, in Schlesinger, ed., The Togaviruses: Biology, Structure, Replication. New York: Academic; 1980:503-529; и Trent & Naeve, Biochemistry and Replication, in Monath, ed. St. Louis Encephalitis. Washington, DC: American Public Health Association; 1980 p. 159-199).

[00148] Геном ZV представляет собой однонитевую положительную смысловую молекулу РНК приблизительно 10-11 т. п. н., содержащую одну ORF, составляющую примерно 95% генома (Chambers et al., Ann Rev Microbiol 1990, 44:649-688). При инфицировании инфекционная вирусная РНК транслируется и процессируется в структурные белки и неструктурные белки (Bhamarapravati & Yokan: Live attenuated tetravalent vaccine, in Gubler & Kuno, eds., Dengue and Dengue Hemorrhagic Fever. Wallingford, CAB International, 1997, pp 367-377; и Falgout & Markoff, 1995, The family flaviviridae and its diseases, p. 47-66. in: JS Porterfield (ed.), Exotic Viral Infections. Chapman and Hall Medical, London, United Kingdom).

Пример 11

[00149] Инфекционный клон кДНК полного размера ZV MR766 из ATCC подвергали точечным мутациям, чтобы вызвать ограничение роста в клетках млекопитающего. Мутации подтверждали секвенированием ДНК. Мутантные геномные РНК ZV синтезировали путем транскрипции in vitro и клетки комара С6/36 трансфицировали мутантными вирусными РНК с помощью TransIT®-mRNA (Mirus Bio, Madison, WI), следуя инструкциям производителя. Мутантные ZV собирали через 7 суток после трансфекции. Кинетические показатели роста вируса определяли как в клетках млекопитающего (Vero), так и в клетках C6/36.

[00150] В геноме ZV индуцировали точечную мутацию, чтобы изменить последовательность вблизи сайта расщепления фурином следующим образом:

дикий тип: HHKKGEARRSRRAVTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHIKVENWIFRN (SEQ ID NO: 11);

мутант: HHKKGEARRRRRAVTLPSHSTRKLQTRSQTWLESREYTKHIKVENWIFRN (SEQ ID NO: 12).

[00151] Единственное изменение серина на аргинин привело к снижению размножения в клетках Vero, тогда как размножение в клетках комара оставалось относительно неизменным по сравнению с контролем.

Пример 12

[00152] Следовали процедуре примера 11. Применяли ту же замену Ser на Arg, а также замену Glu (E) (между G и A) на His (H) для получения мутанта с двумя точечными мутациями.

[00153] Размножение в клетках человека было снижено до уровня, меньшего, чем наблюдалось у мутанта из примера 11, без влияния на репликацию в клетках насекомого.

Пример 13

[00154] Следовали процедуре примера 11. Первые 12 аминокислот последовательности, представленной в примере 11, заменяли на TTTGEHRRRKRS (SEQ ID NO: 13).

[00155] Размножение в клетках человека было снижено до уровня, меньшего, чем наблюдалось у мутанта из примера 11, без влияния на репликацию в клетках насекомого.

Пример 14

[00156] Следовали процедуре примера 11. Первые 22 аминокислоты последовательности, представленной в примере 11, заменяли на TTTGEHRRRKRSVALVPHVGMG (SEQ ID NO: 14).

[00157] Размножение в клетках человека было снижено до уровня, меньшего, чем наблюдалось у мутанта из примера 11, без влияния на репликацию в клетках насекомого.

Пример 15

[00158] Следовали процедуре примера 11. Первые 37 аминокислот последовательности, представленной в примере 11, заменяли на TTTGEHRRRKRSVALVPHVGMGLETRTETWMSSEGAW (SEQ ID NO: 15) для формирования мутанта ZV M2.

[00159] Размножение в клетках человека было снижено до уровня, меньшего, чем наблюдалось у мутанта из примера 11, без влияния на репликацию в клетках насекомого.

Пример 16

[00160] Для оценки защитной эффективности специфического для клеток млекопитающего ограничения роста представляющего интерес мутанта SV против заражения SV группы 6-недельных мышей AG129 (N = 6/группа) получали однократную внутрибрюшинную иммунизацию 105 инфекционными единицами (IU) мутанта M2 из примера 15. Контрольным мышам вводили внутрибрюшинной инъекцией 50 мкл PBS.

[00161] Две группы мышей не демонстрировали какой-либо видимой разницы в подвижности и поведения после иммунизации.

[00162] Через четырнадцать суток после иммунизации мышам, которым вводили инъекцией M2, и контрольным мышам AG129, которым вводили PBS, вводили внутрибрюшинной инъекцией 105 образующих бляшки единиц (PFU) (что составляет стократную инокуляцию LD50) SV дикого типа.

[00163] У контрольных мышей, которым вводили инъекцией PBS, инокулированных SV, развивалась виремия. Напротив, однократная иммунизация мутантом M2 обеспечивала полную защиту от заражения SV без обнаруживаемой виремии (< 100 копий/мл) в любой момент времени (N = 10).

[00164] Более того, все мыши, подвергшиеся воздействию M2, были здоровы на протяжении всего эксперимента, тогда как все мыши, подвергшиеся воздействию только PBS, умерли после заражения SV, см. фиг. 2.

Пример 17

[00165] Для оценки безопасности специфического для клеток млекопитающего ограничения роста у представляющего интерес мутанта SV группы 6-недельных мышей AG129 (N = 6/группа) получали однократную внутрибрюшинную иммунизацию 105 инфекционными единицами (IU) мутанта M2 или ZV дикого типа.

[00166] Мыши, подвергшиеся воздействию M2, были здоровы на протяжении всего эксперимента, тогда как все мыши, подвергшиеся воздействию только PBS, умерли после заражения SV, см. фиг. 3.

Пример 18

[00167] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса желтой лихорадки.

[00168] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.

[00169] Идентифицировали мутанта вируса желтой лихорадки, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.

Пример 19

[00170] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса калифорнийского энцефалита.

[00171] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.

[00172] Идентифицировали мутанта вируса калифорнийского энцефалита, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.

Пример 20

[00173] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса лихорадки долины Рифт.

[00174] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.

[00175] Идентифицировали мутанта вируса лихорадки долины Рифт, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.

Пример 21

[00176] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса клещевого энцефалита.

[00177] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.

[00178] Идентифицировали мутанта вируса клещевого энцефалита, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.

Пример 22

[00179] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса Западного Нила.

[00180] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.

[00181] Идентифицировали мутанта вируса Западного Нила, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.

Пример 23

[00182] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса энцефалоза лошадей.

[00183] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.

[00184] Идентифицировали мутанта вируса энцефалоза лошадей, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.

Пример 24

[00185] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса колорадской клещевой лихорадки.

[00186] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.

[00187] Идентифицировали мутанта вируса колорадской клещевой лихорадки, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.

Пример 25

[00188] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса чикунгуньи.

[00189] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.

[00190] Идентифицировали мутанта вируса чикунгуньи, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.

Пример 26

[00191] Материалы и способы примеров 2-9 применяли с типовым штаммом вируса африканской чумы свиней.

[00192] Расположение сайта распознавания фурином в prM и выполнение в нем аминокислотных замен представлено выше и известно из уровня техники. Представляющих интерес мутантов идентифицировали как такие, которые больше не размножаются или размножаются на более низких уровнях в клетках человека, как указано выше. Аминокислотные изменения, такие как замена, вставка, делеция, химическая модификация и т. д., выполняли также в 3'-5'-направлении и/или в 5'-3'-направлении сайта расщепления фурином.

[00193] Идентифицировали мутанта вируса африканской чумы свиней, который реплицируется в клетках насекомого, но характеризуется менее успешной репликацией в клетках человека.

Пример 27

[00194] Взрослых макаков резусов распределяли на экспериментальную и контрольную группы по 4-6 животных на группу. Животные экспериментальной группы получали различные дозы (105-1010 IU) мутанта D2-89R из примера 2. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем PBS.

[00195] Животных содержали в течение 4 недель, на протяжении которых животных тестировали на предмет циркулирующего антитела против вируса денге, вирусной нагрузки и клеточной иммунофлуоресценции для выявления наличия, степени и количества вируса и ответа на него хозяина, а также для мониторинга любых симптомов инфекции вируса денге, таких как лихорадка и потеря массы.

[00196] Затем животных заражали DV2 дикого типа и проводили мониторинг на наличие симптомов, таких как лихорадка и потеря массы, а также серологических параметров, таких как вирусная нагрузка и антитело против денге.

[00197] У контрольных животных проявляются симптомы инфекции вируса денге, тогда как у обезьян, которые получали представляющий интерес мутант, симптомы отсутствуют.

Пример 28

[00198] Взрослых макаков резусов распределяли на экспериментальную и контрольную группы по 4-6 животных на группу. Животные экспериментальной группы получали различные дозы (105-1010 IU) мутанта DV1 из примера 4. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем PBS.

[00199] Животных содержали в течение 4 недель, на протяжении которых животных тестировали на предмет циркулирующего антитела против вируса денге, вирусной нагрузки и клеточной иммунофлуоресценции для выявления наличия, степени и количества вируса и ответа на него хозяина, а также для мониторинга любых симптомов инфекции вируса денге, таких как лихорадка и потеря массы.

[00200] Затем животных заражали DV1 дикого типа и проводили мониторинг на наличие симптомов, таких как лихорадка и потеря массы, а также серологических параметров, таких как вирусная нагрузка и антитело против денге.

[00201] У контрольных животных проявляются симптомы инфекции вируса денге, тогда как у обезьян, которые получали представляющий интерес мутант, симптомы отсутствуют.

Пример 29

[00202] Взрослых макаков резусов распределяли на две экспериментальные и две контрольные группы по 4-6 животных на группу. Животные экспериментальной группы получали различные дозы (105-1010 IU) мутанта вируса Зика из примера 14. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем PBS.

[00203] Животных содержали в течение 4 недель, на протяжении которых животных тестировали на предмет циркулирующего антитела против вируса Зика, вирусной нагрузки и клеточной иммунофлуоресценции для выявления наличия, степени, количества вируса и ответа на него хозяина, а также для мониторинга любых симптомов инфекции вируса Зика, таких как лихорадка, виремия, сыпь и потеря массы.

[00204] Затем животных заражали ZV дикого типа. Пару экспериментальной группы и контрольной группы заражали африканским штаммом ZV дикого типа, а другую пару экспериментальной группы и контрольной группы заражали азиатским штаммом ZV дикого типа. Проводили мониторинг животных на предмет симптомов, таких как, лихорадка, сыпь и потеря массы, а также серологических параметров, таких как вирусная нагрузка и антитело против вируса Зика.

[00205] У контрольных животных проявляются симптомы инфекции вируса Зика, тогда как у обезьян, которые получали представляющий интерес мутант, симптомы отсутствуют.

Пример 30

[00206] Взрослых макаков резусов распределяли на две экспериментальные и две контрольные группы по 4-6 животных на группу. Животные экспериментальной группы получали различные дозы (105-1010 IU) мутанта вируса Зика из примера 15. Животные контрольной группы получали эквивалентный объем PBS.

[00207] Животных содержали в течение 4 недель, на протяжении которых животных тестировали на предмет циркулирующего антитела против вируса Зика, вирусной нагрузки и клеточной иммунофлуоресценции для выявления наличия, степени, количества вируса и ответа на него хозяина, а также для мониторинга любых симптомов инфекции вируса Зика, таких как лихорадка, виремия, сыпь и потеря массы.

[00208] Затем животных заражали ZV дикого типа. Пару экспериментальной группы и контрольной группы заражали африканским штаммом ZV дикого типа, а другую пару экспериментальной группы и контрольной группы заражали азиатским штаммом ZV дикого типа. Проводили мониторинг животных на предмет симптомов, таких как, лихорадка, сыпь и потеря массы, а также серологических параметров, таких как вирусная нагрузка и антитело против вируса Зика.

[00209] У контрольных животных проявляются симптомы инфекции вируса Зика, тогда как у обезьян, которые получали представляющий интерес мутант, симптомы отсутствуют.

[00210] Все ссылочные материалы, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки в полном своем объеме.

[00211] Следует учитывать, что различные изменения и модификации описанных в настоящем документе предпочтительных вариантов осуществления будут очевидны для специалистов в данной области. Такие изменения и модификации могут быть сделаны без отклонения от сути и объема настоящего изобретения и без уменьшения его предполагаемых преимуществ. Поэтому предполагается, что такие изменения и модификации будут охватываться прилагаемой формулой изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ТЕНДЖЕН БИОМЕДИКАЛ КОМПАНИ

<120> СПЕЦИФИЧЕСКИЙ В ОТНОШЕНИИ МЛЕКОПИТАЮЩЕГО АРБОВИРУС С ДЕФЕКТОМ

РОСТА

<130> 14520201

<150> US 62/556,892

<151> 2017-11-09

<160> 17

<170> Патентная версия 3.5

<210> 1

<211> 4

<212> PRT

<213> вирус денге

<220>

<221> иной признак

<223> Сайт расщепления фурином DV в белке prM

<400> 1

Arg Glu Lys Arg

1

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> вирус Зика

<220>

<221> иной признак

<223> последовательность prM перед сайтом распознавания фурина ZV

включительно

<400> 2

His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 166

<212> PRT

<213> вирус денге

<220>

<221> иной признак

<223> prM DV2 (DENV2) дикого типа

<400> 3

Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn

20 25 30

Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr

35 40 45

Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile

50 55 60

Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val

85 90 95

Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser

100 105 110

Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu

115 120 125

Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile

130 135 140

Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala

145 150 155 160

Val Ala Pro Ser Met Thr

165

<210> 4

<211> 166

<212> PRT

<213> вирус денге

<220>

<221> иной признак

<223> Мутантный DENV2 (D2-89R)

<400> 4

Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn

20 25 30

Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr

35 40 45

Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile

50 55 60

Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu Val

85 90 95

Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser

100 105 110

Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu

115 120 125

Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile

130 135 140

Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala

145 150 155 160

Val Ala Pro Ser Met Thr

165

<210> 5

<211> 166

<212> PRT

<213> вирус денге

<220>

<221> иной признак

<223> Мутантный DENV2 (D2-89V)

<400> 5

Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn

20 25 30

Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr

35 40 45

Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile

50 55 60

Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Val Lys Arg Ser Val Ala Leu Val

85 90 95

Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser

100 105 110

Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu

115 120 125

Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile

130 135 140

Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala

145 150 155 160

Val Ala Pro Ser Met Thr

165

<210> 6

<211> 166

<212> PRT

<213> вирус денге

<220>

<221> иной признак

<223> Мутантный DENV2 (D2-89S)

<400> 6

Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn

20 25 30

Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr

35 40 45

Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile

50 55 60

Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Ser Lys Arg Ser Val Ala Leu Val

85 90 95

Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser

100 105 110

Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu

115 120 125

Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile

130 135 140

Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala

145 150 155 160

Val Ala Pro Ser Met Thr

165

<210> 7

<211> 166

<212> PRT

<213> вирус денге

<220>

<221> иной признак

<223> Мутантный DENV2 (D2-89G)

<400> 7

Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn

20 25 30

Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr

35 40 45

Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile

50 55 60

Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Gly Lys Arg Ser Val Ala Leu Val

85 90 95

Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser

100 105 110

Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu

115 120 125

Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile

130 135 140

Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala

145 150 155 160

Val Ala Pro Ser Met Thr

165

<210> 8

<211> 166

<212> PRT

<213> вирус денге

<220>

<221> иной признак

<223> аминокислотная последовательность prM дикого типа штамма NGC

DV2

<400> 8

Phe His Leu Thr Thr Arg Asn Gly Glu Pro His Met Ile Val Ser Arg

1 5 10 15

Gln Glu Lys Gly Lys Ser Leu Leu Phe Lys Thr Glu Asp Gly Val Asn

20 25 30

Met Cys Thr Leu Met Ala Met Asp Leu Gly Glu Leu Cys Glu Asp Thr

35 40 45

Ile Thr Tyr Asn Cys Pro Leu Leu Arg Gln Asn Glu Pro Glu Asp Ile

50 55 60

Asp Cys Trp Cys Asn Ser Thr Ser Thr Trp Val Thr Tyr Gly Thr Cys

65 70 75 80

Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Glu Lys Arg Ser Val Ala Leu Val

85 90 95

Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser

100 105 110

Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile Leu

115 120 125

Arg His Pro Gly Phe Thr Ile Met Ala Ala Ile Leu Ala Tyr Thr Ile

130 135 140

Gly Thr Thr Tyr Phe Gln Arg Val Leu Ile Phe Ile Leu Leu Thr Ala

145 150 155 160

Val Ala Pro Ser Met Thr

165

<210> 9

<211> 168

<212> PRT

<213> вирус Зика

<220>

<221> иной признак

<223> аминокислотная последовательность prM дикого типа

<400> 9

Ala Glu Ile Thr Arg Arg Gly Ser Ala Tyr Tyr Met Tyr Leu Asp Arg

1 5 10 15

Ser Asp Ala Gly Lys Ala Ile Ser Phe Ala Thr Thr Leu Gly Val Asn

20 25 30

Lys Cys His Val Gln Ile Met Asp Leu Gly His Met Cys Asp Ala Thr

35 40 45

Met Ser Tyr Glu Cys Pro Met Leu Asp Glu Gly Val Glu Pro Asp Asp

50 55 60

Val Asp Cys Trp Cys Asn Thr Thr Ser Thr Trp Val Val Tyr Gly Thr

65 70 75 80

Cys His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr

85 90 95

Leu Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp

100 105 110

Leu Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Leu Ile Lys Val Glu Asn Trp

115 120 125

Ile Phe Arg Asn Pro Gly Phe Ala Leu Val Ala Val Ala Ile Ala Trp

130 135 140

Leu Leu Gly Ser Ser Thr Ser Gln Lys Val Ile Tyr Leu Val Met Ile

145 150 155 160

Leu Leu Ile Ala Pro Ala Tyr Ser

165

<210> 10

<211> 4

<212> PRT

<213> вирус Зика

<220>

<221> иной признак

<223> сайт тетрапептида

<400> 10

Arg Ser Arg Arg

1

<210> 11

<211> 50

<212> PRT

<213> вирус Зика

<220>

<221> иной признак

<223> Дикий тип

<400> 11

His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Ser Arg Arg Ala Val Thr Leu

1 5 10 15

Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu

20 25 30

Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Ile Lys Val Glu Asn Trp Ile Phe

35 40 45

Arg Asn

50

<210> 12

<211> 50

<212> PRT

<213> вирус Зика

<220>

<221> иной признак

<223> Мутант

<400> 12

His His Lys Lys Gly Glu Ala Arg Arg Arg Arg Arg Ala Val Thr Leu

1 5 10 15

Pro Ser His Ser Thr Arg Lys Leu Gln Thr Arg Ser Gln Thr Trp Leu

20 25 30

Glu Ser Arg Glu Tyr Thr Lys His Ile Lys Val Glu Asn Trp Ile Phe

35 40 45

Arg Asn

50

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> вирус Зика

<220>

<221> иной признак

<223> Мутант

<400> 13

Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 22

<212> PRT

<213> вирус Зика

<220>

<221> иной признак

<223> Мутант

<400> 14

Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu Val

1 5 10 15

Pro His Val Gly Met Gly

20

<210> 15

<211> 37

<212> PRT

<213> вирус Зика

<220>

<221> иной признак

<223> ZV M2 Мутант

<400> 15

Thr Thr Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu Val

1 5 10 15

Pro His Val Gly Met Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met Ser

20 25 30

Ser Glu Gly Ala Trp

35

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая: консенсусный тетрапептид

<220>

<221> иной признак

<222> (2)..(2)

<223> Xaa может представлять собой любую встречающуюся в природе

аминокислоту

<220>

<221> иной признак

<222> (3)..(3)

<223> X представляет собой K или R

<400> 16

Arg Xaa Xaa Arg

1

<210> 17

<211> 51

<212> PRT

<213> вирус денге

<220>

<221> иной признак

<223> Мутант DV1

<400> 17

Cys Ser Gln Thr Gly Glu His Arg Arg Arg Lys Arg Ser Val Ala Leu

1 5 10 15

Ala Pro His Val Gly Leu Gly Leu Glu Thr Arg Thr Glu Thr Trp Met

20 25 30

Ser Ser Glu Gly Ala Trp Lys His Ala Gln Arg Ile Glu Thr Trp Ile

35 40 45

Leu Arg His

50

<---

Изобретение относится к биотехологии, вируологии и медицине. Предложена частица арбовируса для выработки иммунного ответа к указанному арбовирусу, включающая в себя мутантный арбовирус, который реплицируется в клетках насекомого и не реплицируется в клетках млекопитающего, содержащий молекулярно измененный тетрапептидный сайт расщепления фурином в полипротеине-предшественнике и необязательно изменение в первом удлинении из аминокислот, вышележащих по отношению к указанному сайту, и/или изменение во втором удлинении из аминокислот, нижележащих по отношению к указанному сайту. Предложены: композиция для выработки иммунного ответа к указанному арбовирусу, содержащая частицу арбовируса и фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель или вспомогательное средство; клетка насекомого, включающая частицу арбовируса, для продуцирования указанной частицы; клетка млекопитающего для вызывания иммунного ответа, включающая в себя частицу указанного арбовируса. Арбовирус несет измененный сайт расщепления фурином, который приводит к усиленному расщеплению полипротеина-предшественника, такого как prE2 или prM. Вирус может продуцироваться в клетках насекомого. Вирус не образует потомство вируса в клетках млекопитающего. 4 н. и 17 з.п. ф-лы, 3 ил., 29 пр.

1. Частица арбовируса для выработки иммунного ответа к указанному арбовирусу, включающая в себя мутантный арбовирус, который реплицируется в клетках насекомого и не реплицируется в клетках млекопитающего, содержащий молекулярно измененный тетрапептидный сайт расщепления фурином в полипротеине-предшественнике и необязательно изменение в первом удлинении из аминокислот, вышележащих по отношению к указанному сайту, и/или изменение во втором удлинении из аминокислот, нижележащих по отношению к указанному сайту.

2. Частица по п. 1, в которой указанный сайт включает в себя консенсусную последовательность Arg-X-Lys/Arg-Arg (SEQ ID NO: 16).

3. Частица по п. 2, в которой X включает в себя Arg.

4. Частица по п. 2, в которой указанное первое удлинение содержит восемь аминокислот рядом с указанным сайтом.

5. Частица по п. 2, включающая в себя указанное изменение в указанном первом удлинении.

6. Частица по п. 2, включающая в себя указанное изменение в указанном втором удлинении.

7. Частица по п. 1, в которой указанный полипротеин включает в себя prM.

8. Частица по п. 1, в которой указанный полипротеин включает в себя prE2.

9. Частица по п. 1, включающая в себя вирус денге (DV).

10. Частица по п. 1, включающая в себя вирус Зика (ZV).

11. Частица по п. 1, включающая в себя указанное изменение в указанном первом удлинении из аминокислот, вышележащих по отношению к указанному сайту, и/или указанное изменение в указанном втором удлинении из аминокислот, нижележащих по отношению к указанному сайту.

12. Композиция для выработки иммунного ответа к указанному арбовирусу, содержащая частицу по п. 1 и фармацевтически приемлемые носитель, разбавитель или вспомогательное средство.

13. Клетка насекомого, включающая частицу по п. 1, для продуцирования указанной частицы.

14. Клетка по п. 13, при этом указанное насекомое включает в себя членистоногое.

15. Клетка по п. 13, при этом указанное насекомое включает в себя клеща или комара.

16. Клетка млекопитающего для вызывания иммунного ответа, включающая в себя частицу по п. 1.

17. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка экспрессирует антиген DV.

18. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка экспрессирует антиген DV на поверхности указанной клетки.

19. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка экспрессирует антиген ZV.

20. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка экспрессирует антиген ZV на поверхности указанной клетки.

21. Клетка по п. 16, при этом указанная клетка млекопитающего включает клетку человека.