Способ получения вакцинного адъюванта в виде эмульсии Российский патент 2024 года по МПК A61K39/39 A61K9/107 A61K47/06 A61K47/24 A61K47/26 A61P31/00 

Изобретение относится к способам получения вакцинных адъювантов в виде эмульсии и может быть использовано в медицине и фармацевтической промышленности.

Согласно данным ВОЗ на 2018 г., распространение вируса гриппа в мире ежегодно приводит к 3-5 млн. случаев тяжелых заболеваний со смертностью 290-650 тыс. человек [1]. Кроме того, по данным на 2015 г., вирусом гепатита В было заражено 257 млн. человек со смертностью 887 тыс. [2]. В то же время, в Российской Федерации острыми респираторными вирусными инфекциями ежегодно заболевают более 37 млн. человек, из них до 2-х млн. подвергается заражению гриппом; около 30 млн. человек переносят различные формы герпесвирусных инфекций. Экономический ущерб от данных заболеваний, по итогам 2015 г., составляет более 450 млрд рублей в год [3]. Для профилактики этих и других заболеваний, в частности, используется вакцинация с целью формирования длительного специфического иммунитета.

Большое количество эффективных и безопасных вакцин использующихся в практике были разработаны на основе живых, ослабленных возбудителей инфекции. При их применении в организме развивается легкий инфекционный процесс с образованием длительного иммунитета, сходного с таковым после перенесенной инфекции. Вакцины же, созданные на основе инактивированных возбудителей, очищенных и рекомбинантных антигенов, в ряде случаев обладают недостаточной иммуногенностью, что приводит к необходимости применения адъювантов с целью улучшения стимуляции иммунного ответа. Адъюванты, компоненты вакцин, функция которых - повышение их иммуногенности. Однако в настоящее время количество разработанных и применяемых адъювантов по-прежнему крайне ограничено.

Как и любой антиген, вакцины действуют сначала на систему врожденного иммунитета, а уже через нее способствуют развитию антиген-специфического адаптивного иммунного ответа. Адъюванты способствуют формированию более выраженного адаптивного иммунитета путем активации разных звеньев системы врожденного иммунитета и/или стимуляции процессов транспорта, процессинга и презентации антигенов, прямо или косвенно воздействуя на антиген-презентирующие клетки (АПК). В настоящее время одобрены такие адъюванты, как соединения алюминия (на примере гидроксида или фосфата), масляные эмульсии (MF59, AS03), адъювантные системы (AS04, AS01), виросомы, GC-содержащие синтетические олигодезоксинуклеотиды, полиоксидоний.

Каждый возбудитель имеет свои особенности, играющие большую роль в развитии иммунного ответа, что необходимо учитывать при подборе адъювантов для оптимальной стратегии [4]. Различают несколько механизмов действия адъювантов:

1. Длительное высвобождение антигена в месте инъекции, называемое эффектом депо и способствующее увеличению времени контакта с антигеном.

2. Действие в качестве системы доставки антигена, стимулируя процессы поглощения антигена АПК.

3. Активация системы врожденного иммунитета путем передачи сигналов через мембранные и внутриклеточные паттерн-распознающие рецепторы, что приводит к активации факторов транскрипции и адаптерных белков.

4. Индукция секреции цитокинов и хемокинов, участвующих в активации и миграции иммунокомпетентных клеток.

5. Активация инфламмасомы NLRP3 с формированием воспалительной реакции и индукцией провоспалительных цитокинов.

6. Стимуляция активации и созревания АПК, стимуляция презентации антигена.

7. Индукция развития клеточного и/или гуморального иммунного ответа.

8. Участие в реакции зародышевых центров, стимуляция продукции высокоаффинных антител, стимуляция образования В-клеток памяти при развитии гуморального иммунного ответа [5].

9. Стимуляция образования центральных и эффекторных Т-клеток памяти [4].

Самыми распространенными адъювантами являются соединения алюминия, применяемые в вакцинах уже около 100 лет [6]. Адъюванты на основе алюминия состоят из наноразмерных частиц, при этом частицы гидроксида алюминия имеют удлиненную форму размерами примерно 4×2×10 нм, а частицы фосфата алюминия имеют форму пластинки с диаметром около 50 нм. Частицы образуют слабосвязанные пористые агрегаты размером от 1 до 20 мкм. При этом они отличаются по поверхностному заряду: гидроксид алюминия при физиологическом рН несет положительный заряд и связывает кислые белки, тогда как фосфат алюминия заряжен отрицательно и, соответственно, связывает основные белки. Предполагается, что адъювантные свойства соединений алюминия на примере гидроксида обусловлены эффектом депо, доставкой сорбированного антигена, активацией комплемента и инфламмасомы NLRP3, стимуляцией и дифференцировкой CD4+ Т-клеток. Однако вопрос о механизмах и значимости каждого из эффектов до конца не изучен. К тому же алюминий и его соединения могут быть токсичны для людей с нарушениями выделительной системы.

Известен способ получения вакцинного адъюванта MF59 на основе эмульсии сквалена, и относящейся к типу «масло-в-воде» (патент США №8778275 В2, МПК А61К 39/39, опубл. 15.07.2014 г.). Все компоненты MF59 являются безопасными биодеградируемыми природными производными. Сквален является метаболитом изопренового ряда, является интермедиатом биосинтеза холестерина и его производных - стероидных гормонов и витамина D [7]. Считается, что эффект MF59 обусловлен усилением миграции и активацией АПК, активацией антиген-специфических CD4+ Т-клеток и стимуляцией продукции специфических гемагглютинирующих антител. MF59 активирует продукцию более широкого спектра цито- и хемокинов, усиливая привлечение иммунокомпетентных клеток к месту инъекции. Также, MF59 значительно повышает экспрессию факторов хемотаксиса моноцитов, эозинофилов, базофилов и других клеток [8]. Адъювант косвенно усиливает фаго- и пиноцитоз антигенов, причем вместо прямого воздействия на процессы поглощения антигена дендритными клетками он стимулирует привлечение к месту инъекции их клеток-предшественников и их дифференцировку [9], а также усиливает их миграцию в лимфатические узлы. Подчеркивается, что это коррелирует с усилением запуска в лимфоузлах специфического ответа CD4+ Т-лимфоцитов, индуцированного АПК [10].

Однако описанный способ получения включающий использование сложного оборудования достаточно сложен и трудоемок. Кроме того, представленная композиция не содержит дополнительных компонентов (например, фосфолипидов) способных облегчить образование гомогенной (образование частиц близкого размера) стабильной эмульсии.

Известен способ получения катионных липосомных частиц в качестве адъюванта. [Патент Китая CN 111388422 А, МПК А61К 39/39, опубл. 10.07.2020 г.]. Предложено приготовление адъюванта в виде катионной скваленовой липосомы следующего состава: фосфолипиды, стерины, сквален, стеариламин, дистиллированная вода и глицерин с нестрогим массовым соотношением (300-350):(30-60):(150-250):(1-5):(≈30000-40000): (≈380-1260), оно же приблизительно (10-12):(1-2):(5-8):(0,03-0,17):(1000-1300):(13-42), или примерно (300-350) мг : (30-60) мг : (150-250) мг : (1-5) мг : (30-40) мл : (0,3-1) мл. Средний поверхностный потенциал катионной скваленовой липосомы составляет 20-45 мВ, а средний размер частиц 150-220 нм. Способ получения катионных скваленовых липосом включает следующие этапы:

1. Растворяют фосфолипиды, стерины, сквален и стеариламин в этаноле для получения масляной фазы.

2. Добавляют глицерин в дистиллированную воду, чтобы сделать водную фазу.

3. Под действием магнитного перемешивания 400-800 об/мин вводят водную фазу в масляную фазу с целью получения однородной и прозрачной эмульсии.

4. Удаление этанола в эмульсии с получением промежуточного продукта при 20-40°С ротационным испарением.

5. Добавление дистиллированной воды к промежуточному продукту, встряхивание и перемешивание для получения сырой скваленовой липосомной суспензии.

6. Сырую суспензию гомогенизируют для получения скваленовой липосомы путем ультразвуковой обработки в течение 10-20 минут при условии ультразвуковой мощности 80-120 Вт.

Предложенный способ, несмотря на возможность получения композиции в виде стабильных липосом отличается высокой сложностью и трудоемкостью. Кроме того, используется ряд токсичных веществ.

Наиболее близким аналогом (прототипом) к заявляемому является способ получения и состав адъюванта на основе сквалена и фосфолипида [Европейский патент ЕР 0745388, МПК А61К 39/39, опубл. 04.12.1996]. Описан адъюванта состава: сквален или его восстановленная форма сквалан, или их смесь, фосфолипид, поверхностно-активное вещество, с возможным добавлением солей или гидроксида алюминия. Количественное содержание компонентов по объему имеет, соответственно, следующие варианты:

1. Сквален от 1% до 40%, фосфолипид от 0,5% до 4%, ПАВ от 0,1% до 4,0%.

2. Сквален от 5% до 20%, фосфолипид от 0,7% до 2%, ПАВ от 0,15% до 1,6%.

3. Сквален от 8% до 12%, фосфолипид от 0,8% до 1,2%, ПАВ от 0,18% до 0,22%.

Приготовление адъюванта производят примерно при 37°С. Смешивают буфер, если используют, сквален и фосфолипид, выдерживают при комнатной температуре 15 минут, после чего добавляют эмульгатор и размешивают. Полученную смесь автоклавируют и обрабатывают ультразвуком (общее время озвучивания не менее 5 минут: по 30 секунд на повтор с последующим выдерживанием во льду в течение 15 секунд). В качестве альтернативы озвучиванию могут применяться микроожижение смеси или ее пропускание через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. К полученной эмульсии могут добавлять соединение алюминия с последующим размешиванием. В конце, к полученной адъювантной системе добавляют вакцинный агент. Полученные композиции могут объединять между собой с аккуратным размешиванием.

Однако в патенте-прототипе не описано исследование стабильности получаемой эмульсии и время ее хранения, в то время как известно, что стабильность эмульсии является важной характеристикой вакцинных композиций включающих подобного рода адъюванты (липидные эмульсии). Быстрое расслаивание эмульсии может приводить к сложностям при введении вакцины и влиять на иммуногенность.

Для решения этой проблемы предложена композиция и способ получения, обеспечивающие получение стабильной эмульсии, относящейся к типу «масло-в-воде не обнаруживающую признаков разделения фаз при температуре 2-8°С в течение до 12 месяцев после получения.

Техническим результатом является обеспечение возможности сохранения эмульсии адъюванта свыше 6 месяцев.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения вакцинного адъюванта в виде эмульсии, включающем приготовление гидрофобной фазы, содержащей сквален растительного происхождения и фосфатидилхолины, растворенные в сквалене, и приготовление гидрофильной фазы, содержащей буферный раствор и растворенный в нем эмульгатор Твин 80, смешивание гидрофобной и гидрофильных фаз и измельчение частиц гидрофобной фазы в гидрофильной фазе путем обработки смеси ультразвуком с получением эмульсии, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют 50 мМ буферный раствор с рН 7,6, конечное содержание компонентов смеси перед обработкой ультразвуком составляет, масс. %:

Сквален 3,0-10,0 Фосфатидилхолины 0,5-1,0 Эмульгатор Твин 80 0,5-1,0 50 мМ буферный раствор с рН 7,6 остальное до 100%,

причем содержание фосфатидилхолинов и эмульгатора в смеси находится в соотношении 1:1, а обработку смеси компонентов адъюванта проводят ультразвуком с частотой волны от 20 до 60 кГц и длительностью обработки 3 раза по 40 сек с интервалом между обработками 2-3 минуты; первую и вторую обработку ультразвуком проводят при температуре смеси компонентов плюс 58-62°С, а финальную обработку ультразвуком проводят при температуре смеси компонентов плюс 8-12°С с получением эмульсии с размером частиц в диапазоне от 30 до 90 нМ.

Изобретение поясняется графическими материалами, представленными на фиг. 1 и 2. На фиг. 1. Приведены результаты иммуноферментного анализа взаимодействия антител сывороток крови иммунизированных животных с RBD (штамм В. 1.617.2 (Delta)) SARS-CoV-2. На фиг. 2 представлена гистограмма распределения частиц и их размер в эмульсии. Сущность изобретения поясняется, но не ограничивается, следующими примерами 1-11.

Примеры 1-11 способа получения адъюванта в виде эмульсии

Для получения эмульсии I рода, или тип «масло в воде» использовали сквален (растительного происхождения) и фосфатидилхолины. В качестве эмульгатора применяли Твин 80. Эмульсию в примерах 1-11 в объеме 10 мл получали путем приготовления и последующего объединения гидрофобной и гидрофильной фаз. Для приготовления гидрофобной фазы сквален брали из расчета от 3% до 10% (3, 4, 3, 5, 6, 7, 8, 6, 9, 10) от конечного состава. В нем растворяли фосфолипиды от 0,5 до 10% (0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10). Для приготовления гидрофильной фазы в 50 мМ буфера натрия гидрокарбоната, рН 7,6, растворяли от 50 до 100 мкл Твин 80. После объединения гидрофильной и гидрофобной фаз проводили измельчение частиц гидрофобной фазы.

Для измельчения частиц систему обрабатывали ультразвуком с частой волны от 20 до 60 кГц и длительностью обработки по 40 сек три раза с интервалом между обработками не более 2-3 минут. При этом для первой и второй обработок ультразвуком систему нагревали до температуры плюс 58-62°С, а финальную третью обработку проводили при температуре плюс 8-12°С.

Из полученных продуктов было выбрано 3 оптимальных состава (составы по примерам 1, 2 и 4) по стабильности эмульсии в процессе хранения. Содержание фосфолипидов (фосфатидилхолин) и эмульгатора (Твин 80) в смеси по примерам 1, 2 и 4 находится в соотношении 1:1. Указанные составы получены при ультразвуковой обработке с частотой 22 кГц, длительностью обработки 40 сек. Обработку ультразвуком проводили три раза с интервалом между обработками не более 2-3 минут. При этом перед первой и второй обработок ультразвуком смесь нагревают до температуры плюс 60°С, а финальную обработку проводили при температуре плюс 9°С.

Составы адъюванта, полученные по примерам 1, 2 и 4 имеют стабильность при хранении эмульсии более 6 месяцев. Остальные составы в примерах 3, 5-11 имеют незначительное расслоение эмульсии после 5-6 месяцев хранения. Полученные эмульсии с размером частиц в диапазоне от 30 до 90 нМ, полученные по примерам 1, 2 и 4, использовались для приготовления вакцинной композиции.

Пример 2. Иммунизация мышей линии BALB/c вакцинной композицией с заявляемым адъювантом в виде эмульсии.

В работе использовали мышей линии BALB/c в количестве 50 штук, пол мужской, массой 16-18 г. Условия содержания животных и проведения экспериментов соответствовали Федеральный закон "Об ответственном обращении с животными и о внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации" от 27.12.2018 Ν 498-ФЗ.

Мышей линии BALB/c иммунизировали двукратно с интервалом 14 суток, внутримышечно дозой RBD и разным количеством адъюванта на животное. В качестве отрицательного контроля использовали мышей линии BALB/c, которым внутримышечно вводили двукратно с интервалом 14 суток 100 мкл физиологического раствора. В качестве положительного контроля использовали мышей линии BALB/c, которым внутримышечно вводили двукратно с интервалом 14 суток RBD+Al(OH)₃. Через 10 суток после 2-ой иммунизации брали образец крови из ретроорбитального синуса для определения гуморального иммунных ответов. Сыворотку получали путем инкубирования крови при 37°С в течение 1 часа, далее кровь инкубировали при +4°С в течение 20 часов с последующим обведением сгустка крови в пробирке стерильным инструментом и ц/ф данного образца в течение 10 мин при 5000g. Препараты сывороток хранили при температуре - 20°С.

Пример 3. Иммуноферментный анализ взаимодействия антител сывороток крови иммунизированных животных с рецептор-связывающим доменом поверхностного белка SARS-CoV-2. Для анализа специфичности взаимодействия антител сывороток крови иммунизированных животных с рецептор-связывающим доменом поверхностного белка SARS-CoV-2 использовали метод ИФА. В качестве антигена использовали рекомбинантный RBD поверхностного белка SARS-CoV-2 (штамм В. 1.617.2 (Delta)). Сорбцию антигена проводили в буфере 0,1 Μ NaHCO₃ по 200 нг очищенного белка в лунке. После 16 часовой инкубации при +4°С и удаления растворов в лунки добавляли по 150 мкл блокирующего буфера (PBS+1% BSA) и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После удаления блокировочного раствора и трехкратной промывки с PBS+0,5% Tween-20, инкубировали антиген с сыворотками крови иммунизированных животных, в объеме 50 мкл/лунка в блокировочном буфере и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. После трехкратной отмывки лунок промывочным буфером в них добавляли по 100 мкл конъюгатов в рабочем разведении 1/2000 и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. После трехкратной отмывки лунок добавляли 50 мкл жидкого субстрата на основе ТМБ и буфера, содержащего Н₂О₂ и инкубировали в течение 15 минут при комнатной температуре в защищенном от света месте. Реакцию блокировали добавлением 50 мкл 1М HCl в каждую лунку. Оптическую плотность измеряли на мультимодальном ридере Thermo Scientific Varioskan LUX при длине волны 450 нм. Результаты ИФА представлены на фиг. 1. Примечания: 1 - положительный контроль RBD (доза 50 мкг)+Al(ОН)₃; 2 - RBD (доза 50 мкг)+адъювант по примеру 1 (доза 4,3 мг); 3 - RBD (доза 50 мкг)+адъювант по примеру 2 (доза 8,6 мг); 4 - RBD (доза 25 мкг)+адъювант по примеру 4 (доза 4,3 мг); 5 - отрицательный контроль физиологический раствор.

Пример 4. Определение размера частиц эмульсии и оценка стабильности эмульсии адъюванта Для оценки размера частиц эмульсии ее наносили на медные сетки для электронной микроскопии, покрытые пленкой стабилизированного углеродом формвара. Препараты окрашивали 2% водным раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты и исследовали с помощью электронного микроскопа JEM-1400 (JEOL, Akishima, Tokyo, Japan). Для получения изображений использовалась цифровая камера Veleta (SIS, Schwentinental, Германия), а для анализа и обработки изображений использовался программный пакет iTEM (SIS, Schwentinental, Германия).

Оценку стабильности эмульсии проводили визуально а так же при помощи электронной микроскопии. Спустя 6 месяц визуальная оценка эмульсии по примерам 1, 2 и 4 не выявила признаков образования отдельных фаз. Сравнения количества и размера частиц проведенное при помощи электронной микроскопии образцов полученной эмульсии и спустя 6 месяцев ее хранения при температуре плюс 10±2°С показало отсутствие изменений. Гистограмма распределения частиц и их размер в эмульсии представлены на фиг.2, которая не изменилась после хранения эмульсии в течении 6 месяцев.

Источники научно-технической и патентной информации

1. Influenza (Seasonal). WHO. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/influenza-(seasonal)

2. Hepatitis В. WHO. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b

3. Попова А.Ю. Об эпидемиологической ситуации по гриппу и ОРВИ и мероприятиях по обеспечению готовности субъектов Российской Федерации к предстоящему эпидсезону. http://www.iia-rf.ru/upload/iblock/eaf/eaf4ca4d 11 3а2228а91 еа87е7629ес63.pdf

4. Sarkar I., Garg R., van Drunen Littel-van den Hurk S. Selection of adjuvants for vaccines targeting specific pathogens. Expert Rev Vaccines. 2019; 18(5):505-21.

5. Reed S.G., Orr M.T., Fox C.B. Key roles of adjuvants in modern vaccines. Nat Med. 2013; 19(12): 1597-608.

6. Landsteiner K. The Specificity of Serological Reactions, revised ed. Dover; New York: 1945.

7. Хора Мэниндер (US). Улучшенные способы получения сквалена. Патент ЕА 027142 В1, Int.Cl.C07C 11/21, дата публикации 30.06.2017.

8. Seubert A., Monaci E., Pizza M., O’Hagan D.T., Wack A. The adjuvants aluminum hydroxide and MF59 induce monocyte and granulocyte chemoattractants and enhance monocyte differentiation toward dendritic cells. J Immunol. 2008;180(8):5402-12.

9. De Gregorio E., Caproni E., Ulmer J.B. Vaccine adjuvants: mode of action. Front Immunol. 2013; 4:214.

10. Cioncada R., Maddaluno M., Vo H.T.M., Woodruff M., Tavarini S., Sammicheli C. et al. Vaccine adjuvant MF59 promotes the intranodal differentiation of antigen-loaded and activated monocyte-derived dendritic cells. PLoS One. 2017; 12(10): e0185843.

11. Morel S., Didierlaurent A., Bourguignon P., Delhaye S., Baras B., Jacob V. et al. Adjuvant system AS03 containing α-tocopherol modulates innate immune response and leads to improved adaptive immunity. Vaccine. 2011; 29(13):2461-73.

12. Petrovsky N., Aguilar J.C. Vaccine adjuvants: current state and future trends. Immunol Cell Biol. 2004;82(5):488-96.

13. Mastelic B., Ahmed S., Egan W.M., Del Giudice G., Golding H., Gust I. et al. Mode of action of adjuvants: implications for vaccine safety and design. Biologicals. 2010;38(5):594-601.

14. Marty-Roix R., Vladimer G.I., Pouliot K., Weng D., Buglione-Corbett R., West K. et al. Identification of QS-21 as an inflammasome-activating molecular component of saponin adjuvants. J Biol Chem. 2016;291 (3): 1123-36.

15. Didierlaurent A.M., Morel S., Lockman L., Giannini S.L., Bisteau M., Carlsen H. et al. AS04, an aluminum salt- and TLR4 agonist-based adjuvant system, induces a transient localized innate immune response leading to enhanced adaptive immunity. J Immunol. 2009; 183(10):6186-97.

16. Патент США №8778275 В2, МПК А61К 39/39, опубл. 15.07.2014 г.

17. Патент Китая CN 111388422 А, МПК А61К 39/39, опубл. 10.07.2020 г.

18. Европейский патент ЕР 0745388, МПК А61К 39/39, опубл. 04.12.1996. (прототип).

Изобретение относится к области химии и фармацевтики, а именно к способу получения вакцинного адъюванта в виде эмульсии, включающему приготовление гидрофобной фазы, содержащей сквален растительного происхождения и фосфатидилхолины, растворенные в сквалене, и приготовление гидрофильной фазы, содержащей буферный раствор и растворенный в нем эмульгатор Твин 80, смешивание гидрофобной и гидрофильных фаз и измельчение частиц гидрофобной фазы в гидрофильной фазе путем обработки смеси ультразвуком с получением эмульсии, отличающемуся тем, что конечное содержание компонентов смеси перед обработкой ультразвуком составляет, масс. %: сквален - 3,0-10,0; фосфатидилхолины - 0,5-1,0; эмульгатор Твин 80 - 0,5-1,0; 50 мМ буферный раствор с рН 7,6 - остальное до 100%, причем содержание фосфатидилхолинов и эмульгатора в смеси находится в соотношении 1:1, а обработку смеси компонентов адъюванта проводят ультразвуком с частотой волны 20-60 кГц и длительностью обработки 3 раза по 40 сек с интервалом между обработками 2-3 минуты; первую и вторую обработку ультразвуком проводят при температуре смеси компонентов 58-62°С, а финальную обработку ультразвуком проводят при температуре смеси компонентов 8-12°С с получением эмульсии с размером частиц в диапазоне 30-90 нМ. Технический результат заключается в обеспечении возможности сохранения эмульсии адъюванта свыше 6 месяцев. 2 ил., 1 табл., 4 пр.

Способ получения вакцинного адъюванта в виде эмульсии, включающий приготовление гидрофобной фазы, содержащей сквален растительного происхождения и фосфатидилхолины, растворенные в сквалене, и приготовление гидрофильной фазы, содержащей буферный раствор и растворенный в нем эмульгатор Твин 80, смешивание гидрофобной и гидрофильных фаз и измельчение частиц гидрофобной фазы в гидрофильной фазе путем обработки смеси ультразвуком с получением эмульсии, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют 50 мМ буферный раствор с рН 7,6, конечное содержание компонентов смеси перед обработкой ультразвуком составляет, масс. %:

Сквален 3,0-10,0 Фосфатидилхолины 0,5-1,0 Эмульгатор Твин 80 0,5-1,0 50 мМ буферный раствор с рН 7,6 остальное до 100%,

причем содержание фосфатидилхолинов и эмульгатора в смеси находится в соотношении 1:1, а обработку смеси компонентов адъюванта проводят ультразвуком с частотой волны от 20 до 60 кГц и длительностью обработки 3 раза по 40 сек с интервалом между обработками 2-3 минуты; первую и вторую обработку ультразвуком проводят при температуре смеси компонентов плюс 58-62°С, а финальную обработку ультразвуком проводят при температуре смеси компонентов плюс 8-12°С с получением эмульсии с размером частиц в диапазоне от 30 до 90 нМ.