АДЬЮВАНТ ДЛЯ БИОПРЕПАРАТОВ Российский патент 2003 года по МПК A61K39/39 

Изобретение относится к биотехнологии и иммунологии, а именно к препаратам, стимулирующим антителообразование, и может быть использовано в области медицины и ветеринарии для конструирования и производства высокоэффективных вакцин.

Адъюванты - вещества или смеси веществ, в т.ч. в виде суспензий и эмульсий, вызывающие усиление образования антител к сложным антигенам (АГ), таким как бактерии и вирусы. К адъювантам относятся препараты, усиливающие выработку специфических антител к антигену за счет стимуляции иммунной системы организма.

Мицеллярные растворы поверхностно-активных веществ (ПАВ) представляют собой лиофильные дисперсные системы, в которых наряду с отдельными молекулами присутствуют коллоидные частицы (мицеллы) - ассоциаты молекул ПАВ с достаточно большой степенью ассоциации (числом молекул в мицелле). При образовании таких мицелл в полярном растворителе углеводородные цепи молекул ПАВ объединяются в компактное углеводородное ядро, а гидратированные полярные группы, обращенные в сторону водной фазы, образуют гидрофильную оболочку. Частным случаем мицелл являются образования, представляющие собой замкнутые псевдоклеточные структуры из производных фосфатидилхолина, лецитина или холестерина. Такие разновидности мицелл называются липосомами.

Наиболее распространенными в настоящее время адъювантами для вакцин (бактериальных и вирусных) являются эмульсии типа "вода-масло" в присутствии эмульгирующих веществ или суспензии неорганических веществ (см. патент РФ 2058154, МПК А 61 К 39/135, патент РФ 1743027, МПК А 61 К 39/135, МПК А 61 К 39/39, заявка WО09701133, МПК А 61К 9/14, патент США 5312620, МПК А61К31/765).

Например, традиционный адъювант типа "вода-масло" для биопрепаратов (патент РФ 1730763 от 10.12.95), содержащий полиэтилсилоксановую жидкость марки ПЭС-3 в качестве эмульгатора в следующих соотношениях, мас.%:
ПЭС - 91-94
Этерифицированный полиглецирин - 6-9
Известен адъювант, в состав которого в качестве основы входит 83% легкого минерального масла для эмульгированных вакцин и антигенов (ТУ-38101307) и в качестве эмульгатора 17% безводного ланолина. Вакцина на основе этого адъюванта представляет собой эмульсию типа "вода в масле".

Известны липосомальные адъюванты для биопрепаратов (патент США 485388 от 26.02.90, патент США 108509 от 1.07.98), представляющие собой дисперсию липосом в воде. Липосомы готовили из димиристоилфосфатидилхолина и холестерина в следующих соотношениях, мол.%:
Димиристоилфосфатидилхолин - 70-40
Холестерин - 60-30
Однако препараты на основе масляных эмульсий и суспензий неорганических веществ, как правило, склонны к расслоению фаз и реактогенны. Большинство таких адъювантов вызывает локальные и системные токсические явления. Кроме того, препараты, приготовленные на их основе, обладают повышенной вязкостью, что затрудняет их введение.

Липосомальные адъюванты не стабильны при хранении, а производство липосом требует больших материальных затрат.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является патент 6086901 США от 11.07.2000 "Использование микрочастиц, скомбинированных с субмикронными эмульсиями типа "вода-масло"". Данный препарат содержит иммунологический адъювант в виде эмульсии и целевой антиген, заключенный в биодеградируемые микрочастицы. Иммунологический адъювант содержит масляную основу, воду, поверхностно-активные вещества (ПАВ) в качестве эмульгатора - 4-5% сквалена, 0,25-0,5% полиоксиэтиленсорбитанмоноолеата и 0,5% сорбитантриолеата, активно действующее вещество с иммуномодулирующими свойствами - производное мурамилдипептида.

Однако данный препарат обладает высокой токсичностью и недостаточной иммуногенной активностью, включение в него мурамилдипептида и заключение антигена в биодеградируемые микрочастицы требует больших материальных затрат.

Задачей настоящего изобретения является разработка адьюванта, позволяющего создавать вакцины с низкой токсичностью, повышенной иммуногенной активностью, стабильностью имунногенных свойств при хранении и низкой себестоимостью производства.

Поставленная задача решается тем, что адьювант для биопрепаратов, содержащий основу, дистиллированную воду, консервант, согласно предлагаемому решению в качестве основы содержит неионогенные ПАВ при следующем соотношении компонентов (мас.%.):
Неионогенные ПАВ - 5-30
Консервант - 0,05-5
Дистиллированная вода - До 100
Адьювант для биопрепаратов дополнительно содержит иммуномодулятор в виде жиро- и/или водорастворимых витаминов в количестве от 3 до 18 мас.%.

Адьювант для биопрепаратов содержит в качестве жиро- и/или водорастворимых витаминов витамины А, Е, С при следующем соотношении, мас.%:
А - 3
Е - 5
С - 10
Адьювант для биопрепаратов дополнительно содержит сорастворитель в количестве (мас.%) 1-25%.

В прототипе присутствуют неиногенные ПАВ, однако в другом процентном содержании и выполняют функцию эмульгатора.

Сущность изобретения заключается в том, что в качестве адъюванта используется водно-органическая дисперсия неионогенных ПАВ. Данный состав позволяет добавлять в вакцины различные липофильные биологически активные вещества (витамины, иммуномодуляторы и др.), способные влиять на имунногенную активность вакцины.

Препарат представляет собой водно-органическую дисперсионную систему вода -ПАВ, в качестве ПАВ используется полиоксиэтилированное касторовое масло, или полисорбаты, или полиоксиэтилгидроксистеарат, или эфиры сорбита жирных кислот в качестве сорастворителя: диметилсульфоксид, 2-пироллидон или диметилацетамид или низкомолекулярные гликоли, в качестве растворителя используется вода или водный раствор биологически активных веществ (витаминов), в качестве консерванта используют, например, бензиловый спирт, или парабены, или хлорэтон при следующем содержании компонентов (мас.%):
Неиногенные ПАВ - 5-30
Консервант - 0,05-5
Сорастворитель - 1-25
Вода дистиллированная - До 100
Исследование влияния витаминов на антителообразующие клетки показали их роль в стимулировании лимфоцитов Т-хелперного звена и формировании Т-зависимого иммунного ответа. Кроме того, витамин Е, инактивируя свободные радикалы клеток, подавляет экспрессию противовоспалительных генов цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, рецепторов к цитокинам и др. При исследовании действия на организм витамина А отмечалась его благоприятная роль на стимуляцию антителообразующих клеток фагоцитов селезенки и подавление процессов атрофии тимуса. Витамин С (аскорбиновая кислота) способствует стимуляции общих факторов резистентности организма за счет повышения неспецифических механизмов иммунитета (Иммунофармакология микроэлементов. Кудрин А.В., Скальный А.В. и др. 2000).

Способ приготовления препарата (лекарственной формы)
1. Перемешивали ПАВ, сорастворитель и консервант при температуре 30-40^oС. В раствор вносили навеску антигена при постоянном помешивании. К полученной смеси добавляли рассчитанное количество дистиллированной воды. После солюбилизации антигена проводили контроль рН и расфасовывали препарат в подходящую тару в асептических условиях.

2. Перемешивали ПАВ, сорастворитель и консервант при температуре 30-40^oС. К полученному раствору добавляли рассчитанное количество дистиллированной воды. После полного смешивания компонентов проводили контроль рН, добавляли навеску антигена и перемешивали раствор до полной солюбилизации антигена. Полученный препарат расфасовывали в подходящую тару в асептических условиях.

3. Так же, как в п.1, с добавлением в смесь ПАВ/сорастворитель/антиген липофильных витаминов.

4. Так же, как в п.2, с добавлением в смесь ПАВ/сорастворитель липофильных витаминов.

5. Так же, как в п.1, с добавлением в дистиллированную воду аскорбиновой кислоты и/или других водорастворимых биологически активных веществ.

6. Так же, как в п.2, с добавлением в дистиллированную воду аскорбиновой кислоты и/или других водорастворимых биологически активных веществ.

В данной лекарственной форме могут использоваться следующие поверхностно-активные вещества: полиоксиэтилированное касторовое масло; полиоксиэтилгидроксистеарат; полисорбат 80; пропиленгликольмонопальмитостеарат и органические растворители: диметилсульфоксид; диметилацетамид; 2-пирролидон; пропиленгликоль; глицероформаль; транскутол; ПЭГ 400.

Ниже приведены примеры соотношений компонентов в мицеллярной лекарственной форме адъюванта. Антиген добавляют в соотношении от 1:1 до 1:100000 в зависимости от требуемых иммунных свойств вакцины.

Пример 1
Приведены оптимальные соотношения и наиболее предпочтительные виды компонентов. Количества ПАВ, приведенные в таблице, имеют оптимальную концентрацию и стабильность.

Наименование компонента - Количество, мас.%
Полисорбат 80 или полиоксиэтилгидроксистеарат - 20-22
Диметилацетамид или 2-пирролидон - 15
Консервант - 1
Вода дистиллированная - До 100
Пример 2
Приведены минимальные соотношения компонентов. Количества ПАВ и сорастворителя, приведенные в таблице, имеют минимальную концентрацию.

Наименование компонента - Количество, мас.%
Полисорбат 80 или полиоксиэтилгидроксистеарат - 5,0
Диметилацетамид или 2-пирролидон - 1,0
Консервант - 0,05
Вода дистиллированная - До 100
Пример 3
Приведены максимальные соотношения компонентов. Количества ПАВ и сорастворителя, приведенные в таблице, имеют максимальную концентрацию.

Наименование компонента - Количество, мас.%
Полисорбат 80 или полиоксиэтилгидроксистеарат - 30,0
Диметилацетамид или 2-пирролидон - 25,0
Консервант - 5,0
Вода дистиллированная - До 100
Пример 4
Приведены оптимальные соотношения компонентов и липофильных биологически активных веществ. Количества ПАВ и витаминов, приведенные в таблице, имеют оптимальную концентрацию и стабильность.

Наименование компонента - Количество, мас.%
Витамин А - 3
Витамин Е - 5
Витамин С - 10
Полисорбат 80 или полиоксиэтилгидроксистеарат - 23
Диметилацетамид или 2-пирролидон - 16
Консервант - 1
Вода дистиллированная - Остальное
Пример 5
Приведена рецептура препарата без добавления витамина С с оптимальными концентрациями витаминов А и Е.

Наименование компонента - Количество, мас.%
Витамин Е - 5
Витамин А - 3
Полисорбат 80 или полиоксиэтилгидроксистеарат - 23,0
Диметилацетамид или 2-пирролидон - 16,0
Кремофор - 20
Сорастворитель - 15
Консервант - 1
Вода дистиллированная - До 100
Пример 6
Приведена рецептура препарата, содержащая оптимальную концентрацию витамина А и не содержащая витамины Е и С.

Наименование компонента - Количество, мас.%
Витамин А - 3
Полисорбат 80 - 22
Диметилацетамид или 2-пирролидон - 15
Консервант - 1
Вода дистиллированная - До 100
Пример 7
Приведена рецептура препарата, содержащая оптимальную концентрацию витамина Е и не содержащая витамины А и С.

Наименование компонента - Количество, мас.%
Витамин Е - 5
Полиоксиэтилированное касторовое масло - 24
Диметилацетамид или 2-пирролидон - 15
Консервант - 1
Вода дистиллированная - До 100
Пример 8
Приведены максимальные соотношения компонентов и БАВ. Количества ПАВ сорастворителя и консервантов, приведенные в таблице, имеют максимально возможную концентрацию.

Наименование компонента - Количество, мас.%
Витамин А - 4,5
Витамин Е - 7,0
Витамин С - 10
Полиоксиэтилгидроксистеарат или полисорбат 80 - 30
Диметилацетамид, или 2-пирролидон, или транскутол - 20
Консервант - 2
Вода дистиллированная - До 100
Пример 9
Приведены минимальные соотношения компонентов и БАВ. Количества ПАВ сорастворителя и консервантов, приведенные в таблице, имеют минимально возможную концентрацию.

Наименование компонента - Количество, мас.%
Витамин А - 0,5
Витамин Е - 1,0
Витамин С - 0,5
Полиоксиэтилгидроксистеарат или полисорбат 80 - 5,0
Диметилацетамид, или 2-пирролидон, или транскутол - 1,0
Консервант - 4,0
Вода дистиллированная - До 100
Проведенные испытания показали, что уменьшение или увеличение компонентов в рецептуре приводит к качественному изменению свойств лекарственной формы, то есть увеличение количества ПАВ и/или сорастворителя приводит к недопустимому увеличению вязкости раствора, уменьшение количества ПАВ и/или сорастворителя приводило к расслоению жидкости.

Использование других ПАВ и сорастворителей в приведенных рецептурах не приводило к резкому изменению физико-химических и фармакологических свойств полученного адъюванта.

Изучение биологических свойств препаратов
Испытание лекарственной формы на основе заявленного адьюванта проводили на белых мышах (самках), кроликах (породы шиншилла), белых крысах. LD50 препаратов в примерах 1- 8 составила 9,0±3,0 мл/кг ж.м.т. (внутрибрюшинно, мыши). В качестве модельных антигенов использовали раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) и вытяжку из бактерии Y. Pseudotuberculosis (AGY). В качестве положительного контроля использовали смеси антигенов с полным адъювантом Фрейнда (ПАФ). (Полный адъювант Фрейнда является одним из самых сильных адъювантов используемых в иммунологии. Однако вследствие частых осложнений этот адъювант применяют только в лабораторной практике.) В качестве отрицательного контроля использовали растворы антигенов в физиологическом растворе (ФС).

Эксперимент 1
Исследование проводили на половозрелых крысах-самках в количестве 60 штук. Объекты делили на десять групп по 6 животных в каждой группе и иммунизировали, как описано в таблице 1. В качестве модельного антигена брали БСА.

Иммунизацию проводили четырехкратно с интервалом в 2 недели. Препараты вводились внутримышечно в объеме 0,1 мл в область конечности.

Забор крови проводили методом декапитации по следующей схеме:
1) через неделю после второго введения;
2) через неделю после третьего введения;
3) через 15 дней после четвертого введения.

Титр антител определяли в реакции гемаглютинации (РГА) по общепринятой методике.

Диагностикум для РГА готовили следующим методом. К 3,2 мл дистиллированной воды добавляли 0,32 мл БСА концентрацией 1 мг/мл, 0,1 мл 0,25% раствора глютарового альдегида и 0,1 мл 4% раствора эритроцитов, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 1 час (Фримель Г., 1987).

Данные по проведенным исследованиям приведены в таблице 2.

Эксперимент 2
Исследование проводили на половозрелых кроликах в количестве 6 штук породы шиншилла. Объекты делили на три группы по 2 животных в каждой группе и иммунизировали по следующей схеме (таблица 3).

Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в 2 недели. После второй иммунизации проводилась бустировка. Препараты вводились внутримышечно в объеме 0,1 мл в область конечности.

Полный адъювант Фрейнда вводили подкожно в четыре точки вдоль позвоночного столба.

Забор крови проводили методом из ушной вены по следующей схеме:
1) через неделю после первого введения;
2) через неделю после второго введения;
3) через 7 дней после бустировки.

Титр антител определяли в реакции гемаглютинации (РГА) по общепринятой методике.

Диагностикум для РГА готовили следующим методом. К 3,2 мл дистиллированной воды добавляли 0,32 мл БСА концентрацией 1 мг/мл, 0,1 мл 0,25% раствора глютарового альдегида и 0,1 мл 4% раствора эритроцитов, перемешивали и оставляли при комнатной температуре на 1 час.

Данные по проведенным исследованиям приведены в таблице 4.

Эксперимент 3
Витамины А и Е перемешивались с ПАВ при температуре 30-50^oС. К полученному раствору приливали аскарбат натрия, имеющий рН 6,7-7,2, с рассчитанным количеством воды. После полного смешивания проводят контроль рН. И смешивают полученный препарат с антигеном. Стерилизуют лекарственную форму мембранной фильтрацией. Исследование проводили на половозрелых кроликах в количестве 6 штук породы шиншилла. Объекты делили на три группы по 2 животных в каждой группе и иммунизировали по следующей схеме (таблица 5).

Иммунизацию проводили двукратно с интервалом в 2 недели. После второй иммунизации проводилась реиммунизация. Препараты вводились внутримышечно.

Забор крови проводили из ушной вены по следующей схеме:
через неделю после первой иммунизации;
через неделю после второй иммунизации;
через неделю после реимунизации.

Антиген Y. Pseudotuberculosis получали по общепринятой методике (обработкой ультразвуком с последующим осаждением компонентов клеточной стенки).

Иммунологическая активность полученного антигена определялась методом иммунодиффузии с поливалентой йерсениозной сывороткой. Концентрацию полученного АГ приводили к значению 100 мкг/мл по белку.

Раствор коллоидного золота готовили по стандартной методике.

Концентрация частиц золота 10¹² на 1 мл раствора. Препарат АГ смешивался с раствором коллоидного золота, как указано в Таблице 3. Количество (титр) антител определяли в реакции гемаглютинации (РГА) по общепринятой методике.

Результаты титра образования антител к АГ приведены в Таблице 6.

Таким образом, приведеные данные показывают эффективность мицеллярной формы ПАВ в качестве адьюванта.

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии и иммунологии, а именно к препаратам, стимулирующим антителообразование, и может быть использовано в области медицины и ветеринарии для конструирования и производства высокоэффективных вакцин. Сущность способа состоит в том, что адъювант для биопрепаратов содержит дистиллированную воду, консервант, а в качестве основы - неионогенные ПАВ. Адъювант дополнительно содержит иммуномодулятор в виде жиро- и/или водорастворимых витаминов, а также сорастворитель. Техническим результатом является разработка адъюванта, позволяющего создавать вакцины с низкой токсичностью, повышенной иммуногенной активностью, стабильностью имунногенных свойств при хранении и низкой себестоимостью производства. 3 з.п.ф-лы, 6 табл.

1. Адъювант для биопрепаратов, содержащий основу, дистиллированную воду, консервант, отличающийся тем, что в качестве основы адъювант содержит неоиногенные ПАВ при следующем соотношении компонентов, мас.%:
Неионогенные ПАВ - 5-30
Консервант - 0,05-5
Дистиллированная вода - До 100
2. Адъювант для биопрепаратов по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит иммуномодулятор в виде жиро- и/или водорастворимых витаминов, выбранных из группы, состоящей из витаминов А, E, С или их комбинации, в количестве от 3 до 18 мас.%. 3. Адъювант для биопрепаратов по п.2, отличающийся тем, что он содержит в качестве жиро- и/или водорастворимых витаминов витамин А, Е, С при следующем соотношении, мас.%:
А - 3
Е - 5
С - 10
4. Адъювант для биопрепаратов по п.1, отличающийся тем, что он дополнительно содержит сорастворитель в количестве 1-25 мас.%.