Противоопухолевая комбинация хидамида и целекоксиба Российский патент 2024 года по МПК A61K31/4406 A61K31/415 A61K31/635 A61P35/00 

Настоящее изобретение относится к области терапии рака. В частности, в настоящем изобретении предложена комбинация, содержащая хидамид и целекоксиб в солевых формах, и ее применение для регуляции микроокружения опухоли и иммунотерапии рака.

Уровень техники

Иммунная терапия рака является быстро развивающейся областью, в которой были сделаны впечатляющие и многообещающие открытия. Открытие существования опухоль-ассоциированных антигенов в настоящее время предоставляет возможность использования иммунной системы организма-хозяина для вмешательства в процесс роста опухоли. В настоящее время ведутся исследования различных механизмов использования как гуморального, так и клеточного звена иммунной системы для иммунотерапии рака.

Было предложено несколько стратегий разрушения иммунной толерантности, включая адаптивный перенос иммунных эффекторов, иммуномодулирующую терапию и вакцинацию. Однако данные стратегии по-прежнему не позволяют предотвратить ускользание от иммунного ответа. Основным путями ускользания от иммунного ответа, используемыми раковыми клетками, являются механизмы, связанные с активацией антиапоптических сигнальных путей, митоген-активируемой протеинкиназой (МАПК) и циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ). Микроокружение опухоли представляет собой важное поле для исследований, поскольку оно динамично и взаимосвязано с процессом прогрессирования опухоли. Опухоли развивают механизмы, позволяющие избежать иммунного ответа, за счет процесса, называемого «иммунным редактированием», обеспечивающим селективное давление в микроокружении опухоли, способное привести к злокачественному прогрессированию. В фазе стимулирования опухоли, называемой «ускользанием от иммунного ответа», иммунная система может способствовать дальнейшему прогрессированию опухоли путем отбора раковых клеток, которые в большей степени способны к выживанию в условиях иммунологической активности организма-хозяина, или путем изменения микроокружения опухоли таким образом, чтобы оно способствовало росту опухоли. Отличительные свойства микроокружения опухоли связаны с влиянием различных факторов, таких как гипоксия, кислотный рН, структура сосудов, состояние обмена веществ, иммуносупрессия иммунных клеток, а также цитокины или хемокины. Эти факторы контролируют процесс ускользания от иммунного ответа, а также способствуют снижению скорости формирования иммунного ответа. Таким образом, контроль микроокружения опухоли является одной из важнейших стратегий противоопухолевого лечения, особенно иммунотерапии.

Гомеостаз иммунной системы включает присутствие как стимулирующих, так и ингибирующих механизмов, предназначенных для контроля баланса процесса формирвоания иммунного ответа. Ингибирующие механизмы включают цитотоксический Т-лимфоцит-ассоциированный антиген-4 (CTLA-4, гомолог CD28) и белок программируемой клеточной смерти-1 (PD-1) или его лиганд (PD-L1), TIM-3 (Т-клеточный иммуноглобулин-3), BTLA (аттенюатор В- и Т-лимфоцитов), VISTA (V-доменный Ig-супрессор активации Т-клеток) и LAG-3 (ген активации лимфоцитов-3). Стимулирующие механизмы включают дифференцировочный кластер 28 (CD28), суперсемейство рецепторов фактора некроза опухоли, член 4 (TNFRSF4), также известный как CD134 или OX40, индуцированный глюкокортикоидами TNFR-родственный белок (GITR), член семейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNF) (CD137; 4-1BB), член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (CD27), медиатор проникновения вируса герпесвируса (HVEM). В настоящее время многие моноклональные антитела, являющиеся ингибиторами иммунных контрольных точек, в том числе антитела к CTLA-4, антитела к PD-1 и антитела к PD-L1, были зарегистрированы Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), Европейским агентством по лекарственным средствам (EMA), Агентством по фармацевтике и медицинскому оборудованию (PMDA) и Национальным управлением по изделиям медицинского назначения (NMPA) для терапевтического применения по нескольким онкологическим показаниям. Однако при использовании указанных ингибиторов иммунных контрольных точек ответ опухоли на монотерапию наблюдается у около 20% – 30% больных раком пациентов. Эффективность по-прежнему остается неудовлетворительной. Стратегии применения новой комбинации лекарственных средств с ингибиторами иммунных контрольных точек представляют собой наиболее современные подходы к повышению скорости формирования ответа на воздействие соответствующих ингибиторов иммунных контрольных точек. Они дадут возможность оценить преимущества иммунотерапии для пациентов с разными типами распространенных злокачественных опухолей. С другой стороны, резистентность в отношении ингибиторов иммунных контрольных точек привела к тому, что польза от лечения оказалась меньше, чем ожидалось. Большое число многообещающих комбинированных подходов находятся в стадии доклинических исследований и клинических испытаний. Достижения, связанные с данными многообещающими комбинированными схемами, дают надежду на решение проблемы резистентности в отношении лекарственных препаратов за счет повышения скорости формирования иммунного ответа и активности.

Патентные заявки US 20180355042 и US 20190211103 предлагают комбинации, которые содержат HDACi и ингибитор PD-1, применимые для лечения рака, включая сокращение и/или предотвращение появления раковых метастазов. Тем не менее, по-прежнему сохраняется необходимость в разработке терапевтического решения, позволяющего контролировать микроокружение опухоли и достигнуть более выраженной противоопухолевой активности.

Раскрытие изобретения

В настоящем изобретении предложена комбинация, содержащая соль хидамида и соль целекоксиба, а также способы регуляции микроокружения опухоли, значительно повышающие скорость формирования иммунного ответа и противоопухолевую активность под воздействием комбинации соли хидамида и соли целекоксиба.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предлагается комбинация, содержащая кислую соль хидамида и основную соль целекоксиба.

В одном из вариантов осуществления изобретения количества кислой соли хидамида и основной соли целекоксиба находятся в интервале от около 5% по весу до около 80% по весу и от около 95% по весу до около 20% по весу, соответственно. В одном из вариантов осуществления изобретения количества кислой соли хидамида и основной соли целекоксиба находятся в массовом соотношении около 8:1, около 4:1, около 3:1, около 2:1, около 1:1, около 1:2, около 1:3, около 1:4 или около 1:8.

В одном из вариантов осуществления изобретения кислая соль хидамида и основная соль целекоксиба содержатся в одинаковой лекарственной форме или независимо распределены по разным лекарственным формам. В другом варианте осуществления изобретения лекарственная форма представляет собой таблетку или капсулу.

В одном из вариантов осуществления изобретения кислая соль хидамида представляет собой хлористоводородную или сульфатную соль. В одном из вариантов осуществления изобретения кислая соль хидамида находится в кристаллической или аморфной форме.

В одном из вариантов осуществления изобретения хлористоводородная соль хидамида находится в кристаллической форме (форма A), при этом на рентгенограмме, полученной методом порошкового рентгеноструктурного анализа (XRPD), наблюдаются пики со значениями 2θ на уровне около 16,12°, около 19,02°, около 21,62°, около 23,38° и около 30,16°. В другом варианте осуществления изобретения на рентгенограмме формы A наблюдаются дополнительные пики со значениями 2θ на уровне около 21,08°, около 23,76°, около 25,58°, около 27,82° и около 28,18°.

В еще одном из вариантов осуществления изобретения хлористоводородная соль хидамида находится в кристаллической форме (форма А), при этом на спектре, полученном методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), наблюдаются пики на уровне около 3162 см^-1, около 3059 см^-1, около 3036 см^-1, около 2751 см^-1, около 2588 см^-1, около 2359 см^-1, около 2341 см^-1, около 1667 см^-1, около 1658 см^-1, около 1639 см^-1, около 1620 см^-1, около 1610 см^-1, около 1562 см^-1, около 1517 см^-1, около 1508 см^-1, около 1485 см^-1, около 1468 см^-1, около 1444 см^-1, около 1431 см^-1, около 1307 см^-1, около 1282 см^-1, около 1265 см^-1, около 1243 см^-1, около 1220 см^-1, около 1182 см^-1, около 1145 см^-1, около 1074 см^-1, около 1046 см^-1.

В еще одном из вариантов осуществления изобретения дополнительно показано, что рентгенограмма формы A в значительной степени повторяет рентгенограмму, представленную на Фиг. 3, фрагмент B, или ИК-спектр, полученный методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), в значительной степени повторяет спектр, представленный на Фиг. 4, фрагмент B.

В одном из вариантов осуществления изобретения сульфатная соль хидамида находится в кристаллической форме (форма В), при этом на рентгенограмме, полученной методом порошкового рентгеноструктурного анализа (XRPD), наблюдаются пики со значениями 2θ на уровне около 21,15°, около 24,65°, около 17,00°, около 18,49° и около 26,69°. В другом варианте осуществления изобретения на рентгенограмме формы В наблюдаются дополнительные пики со значениями 2θ на уровне около 14,74°, около 19,45°, около 22,00°, около 23,55° и около 27,94°.

В одном из вариантов осуществления изобретения сульфатная соль хидамида находится в кристаллической форме (форма В), при этом на спектре, полученном методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), , наблюдаются пики на уровне около 3249 см^-1, около 3067 см^-1, около 2578 см^-1, около 2360 см^-1, около 1689 см^-1, около 1664 см^-1, около 1647 см^-1, около 1614 см^-1, около 1568 см^-1, около 1521 см^-1, около 1510 см^-1, около 1486 см^-1, около 1467 см^-1, около 1434 см^-1, около 1412 см^-1, около 1388 см^-1, около 1354 см^-1, около 1328 см^-1, около 1283 см^-1, около 1266 см^-1, около 1252 см^-1, около 1226 см^-1, около 1184 см^-1, около 1099 см^-1, около 1059 см^-1, около 1034 см^-1 и около 1022 см^-1.

В еще одном из вариантов осуществления изобретения дополнительно показано, что рентгенограмма формы B в значительной степени повторяет рентгенограмму, представленную на Фиг. 3, фрагмент С, или ИК-спектр, полученный методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), в значительной степени повторяет спектр, представленный на Фиг. 4, фрагмент С.

В одном из вариантов осуществления изобретения основная соль целекоксиба представляет собой натриевую соль. В другом варианте осуществления изобретения натриевая соль целекоксиба находится в аморфной или кристаллической форме. В другом варианте осуществления изобретения дополнительно показано, что рентгенограмма аморфной формы натриевой соли целекоксиба в значительной степени повторяет рентгенограмму, представленную на Фиг. 7, фрагмент B.

В одном из вариантов осуществления изобретения натриевая соль целекоксиба находится в кристаллической форме (форма I), при этом на рентгенограмме, полученной методом порошкового рентгеноструктурного анализа (XRPD), наблюдаются пики со значениями 2θ на уровне около 19,85°, около 20,51°, около 21,51°, около 22,55° и около 18,25°. В другом варианте осуществления изобретения на рентгенограмме формы I наблюдаются дополнительные пики со значениями 2θ на уровне около 10,95°, около 14,05°, около 14,60°, около 17,2°, около 25,80° и около 27,30°. В еще одном из вариантов осуществления изобретения дополнительно показано, что рентгенограмма формы I в значительной степени повторяет рентгенограмму, представленную на Фиг. 7, фрагмент С.

В одном из вариантов осуществления изобретения комбинация дополнительно содержит ингибитор иммунных контрольных точек и/или химиотерапевтическое средство. В некоторых из вариантов осуществления изобретения ингибиторы иммунных контрольных точек представляют собой антитела к CTLA-4, антитела к PD-1 или антитела к PD-L1. В некоторых из вариантов осуществления изобретения среди ингибиторов иммунных контрольных точек отмечают пембролизумаб, пидилизумаб, ниволумаб, дурвалумаб, авелумаб, атезолизумаб, торипалимаб, синтилимаб, камрелизумаб и MIH1.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения рака посредством регуляции микроокружения опухоли и повышения скорости формирования иммунного ответа, включающий введение комбинации эффективных количеств хидамида и целекоксиба. В еще одном из вариантов осуществления изобретения хидамид и целекоксиб вводят одновременно, раздельно или последовательно.

В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения предлагается способ регуляции микроокружения опухоли при иммунотерапии рака, включающий введение субъекту эффективного количества комбинации, описанной в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления изобретения кислую соль хидамида и основную соль целекоксиба вводят одновременно, раздельно или последовательно.

В соответствии со вторым аспектом настоящего изобретения предлагается способ лечения рака, включающий введение субъекту эффективного количества комбинации, описанной в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления изобретения рак лечат посредством регуляции микроокружения опухоли и повышения скорости формирования иммунного ответа. В одном из вариантов осуществления изобретения способ дополнительно включает введение ингибитора иммунных контрольных точек. В другом варианте осуществления изобретения комбинацию, содержащую изобретение и ингибитор иммунных контрольных точек, вводят одновременно, раздельно или последовательно. Примеры ингибиторов иммунных контрольных точек описаны в настоящем документе.

В одном из вариантов осуществления изобретения введение кислой соли хидамида и основной соли целекоксиба, в отличие от способа с использованием хидамида в виде свободного основания и целекоксиба в виде свободной кислоты, улучшается фармакокинетический профиль.

В некоторых из вариантов осуществления изобретения виды рака включают глиобластому, рак печени, колоректальную карциному, глиобластому, рак желудка, колоректальный рак, рак пищевода, рак легкого, рак поджелудочной железы, почечно-клеточную карциному, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, рак предстательной железы, рак яичников, меланому, рак молочной железы, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), карциному из клеток Меркеля, неходжкинскую лимфому, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), рак желчного пузыря, холангиокарциному, рак мочевого пузыря и рак матки.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1, фрагменты A – G представлены ¹H-ЯМР- и ¹³C-ЯМР-спектры вещества хидамид-АФИ, соли хидамид-HCl и соли хидамид-H₂SO₄. Показаны ¹H-ЯМР-спектр вещества хидамид-АФИ (активный фармацевтический ингредиент) (A), ¹H-ЯМР-спектр соли хидамид-HCl (B) и ¹H-ЯМР-спектр соли хидамид-H₂SO₄ (C). Показаны ¹³C-ЯМР-спектр вещества хидамид-АФИ (D), ¹³C-ЯМР-спектр соли хидамид-HCl (E) и ¹³C-ЯМР-спектр соли хидамид-H₂SO₄ (F). Представлено сравнение данных ¹³C-ЯМР-спектров разных форм хидамида (G).

На Фигуре 2, фрагменты A – D представлены полученные методом масс-спектрометрии (МС) с ионизацией электрораспылением (ESI) в режиме регистрации положительных и отрицательных ионов спектры соли хидамид-HCl и соли хидамид-H₂SO₄. Показаны МС-спектры (ESI) соли хидамид-HCl, полученные в режиме регистрации положительных ионов (A) и режиме регистрации отрицательных ионов (B). Показаны МС-спектры (ESI) соли хидамид-H₂SO₄, полученные в режиме регистрации положительных ионов (C) и режиме регистрации отрицательных ионов (D).

На Фигуре 3, фрагменты A – D представлены полученные методом порошкового рентгеноструктурного анализа (XRD) рентгенограммы вещества хидамид-АФИ, соли хидамид-HCl и соли хидамид-H₂SO₄. Согласно результатам сравнения рентгенограмм вещества хидамид-АФИ (A), соли хидамид-HCl (B) и соли хидамид-H₂SO₄ (C) показано, что значения 2θ вещества хидамид-АФИ, соли хидамид-HCl и соли хидамид-H₂SO₄ отличаются (D).

На Фигуре 4, фрагменты A – D представлены полученные методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR) спектры вещества хидамид-АФИ, соли хидамид-HCl и соли хидамид-H₂SO₄. Для оценки характеристик вещества хидамид-АФИ, соли хидамид-HCl и соли хидамид-H₂SO₄ (D) проводили анализ ИК-спектров вещества хидамид-АФИ (А), соли хидамид-HCl (В) и соли хидамид-H₂SO₄ (C), полученных методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR).

На Фигуре 5, фрагменты A – E представлены ¹H-ЯМР- и ¹³C-ЯМР-спектры вещества целекоксиб-АФИ и целекоксиб-Na соли. ¹H-ЯМР-спектры (400 МГц, CDCl₃) вещества целекоксиб-АФИ (активный фармацевтический ингредиент) и целекоксиб-Na соли представлены на Фигуре 5, фрагменты A и B, соответственно. ¹³C-ЯМР-спектры вещества целекоксиб-АФИ и целекоксиб-Na соли представлены на Фигуре 5, фрагменты C и D, соответственно. Сравнение данных ¹³C-ЯМР-спектров (100 МГц, ДМСО-d₆) вещества целекоксиб-АФИ и целекоксиб-Na соли представлено на Фигуре 5, фрагмент E. Соль целекоксиба-Na может быть получена в аморфной или кристаллической форме в ходе различных процессов. Характеристики ¹H-ЯМР- и ¹³C-ЯМР-спектров аморфной целекоксиб-Na соли и спектров кристаллической формы соли аналогичны.

На Фигуре 6 показан полученный методом масс-спектрометрии (МС) с бомбардировкой быстрыми атомами (FAB) спектр целекоксиб-Na соли. Параметры МС-спектра (FAB)аморфной целекоксиб-Na соли аналогичны параметрам спектра кристаллической формы соли.

На Фигуре 7, фрагменты A – D представлены полученные методом порошкового рентгеноструктурного анализа (XRD) рентгенограммы вещества целекоксиб-АФИ, а также аморфной и кристаллической форм целекоксиб-Na соли. Рентгенограммы вещества целекоксиб-АФИ, а также аморфной и кристаллической форм целекоксиб-Na соли представлены на Фигуре 7, фрагменты A, B и C, соответственно. Между аморфной и кристаллической формами наблюдаются существенные различия в отношении дифракционных максимумов.

На Фигуре 8, фрагменты A – D представлены полученные методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR) спектры вещества целекоксиб-АФИ, а также аморфной и кристаллической форм целекоксиб-Na соли. ИК-спектры вещества целекоксиб-АФИ, а также аморфной и кристаллической форм целекоксиб-Na соли, полученные методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), представлены на Фигуре 8, фрагменты A, B и C, соответственно. Проведено сравнение данных ИК-спектров вещества целекоксиб-АФИ и целекоксиб-Na солей, полученных методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR) (Фигура 8, фрагмент D).

На Фигуре 9, фрагменты A – D показан терапевтический ответ на комбинацию соли хидамид-HCl и капсул целекоксиба в сочетании с антителами к PD-1, возникающий у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); CD-HCl, хидамид-HCl соль (12,5, 25, 50 мг/кг); CD-K30, хидамид-K30 (хидамид, нанесенный на поливинилпирролидон K30, 50 мг/кг); C-cap 50, целекоксиб в капсулах (50 мг/кг, Целебрекс®). Регистрировали общие значения и кратность изменения объема опухоли (А), индивидуальные значения объема опухоли (В), массу тела мышей, несущих опухоль СТ26 (С) и выживаемость животных (D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и СО. Также указано количество животных, использованных в каждой экспериментальной группе, и значения P. *P < 0,05 (по сравнению с IgG); ^#P < 0,05 (по сравнению с PD-1). Значения P были рассчитаны с использованием t-критерия Стьюдента, который применялся для сравнения размеров опухоли в группе показаний с группой IgG. Различия в показателях выживаемости между разными группами лечения были проанализированы в рамках однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

На Фигуре 10, фрагменты A – D показан терапевтический ответ на комбинацию соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1, возникающий у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); CD-HCl, хидамид-HCl соль (50 мг/кг); C-Na, аморфная целекоксиб-Na соль (12,5, 25 и 50 мг/кг); CD-K30, хидамид-K30 (хидамид, нанесенный на поливинилпирролидон K30, 50 мг/кг); C-cap 50, целекоксиб в капсулах (50 мг/кг, Целебрекс®). Регистрировали общие значения и кратность изменения объема опухоли (А), индивидуальные значения объема опухоли (В), долю мышей без опухоли (С), массу тела мышей, несущих опухоль СТ26 (D) и выживаемость животных (Е). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и СО. Также указано количество животных, использованных в каждой экспериментальной группе, и значения P. *P < 0,05 (по сравнению с IgG); ^#P < 0,05 (по сравнению с PD-1). Значения P были рассчитаны с использованием t-критерия Стьюдента, который применялся для сравнения размеров опухоли в группе показаний с группой IgG. Различия в показателях выживаемости между разными группами лечения были проанализированы в рамках однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

Данные, представленные на Фигуре 11, фрагменты A – D, подтверждают оптимальные дозировки, соответствующие терапевтическому ответу на комбинацию соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1, и позволяют оценить терапевтический ответ на комбинацию соли хидамид-H₂SO₄ и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1, возникающий у мышей, несущих опухоль СТ26. Мыши BALB/c, несущие опухоль толстого кишечника СТ26 объемом около 300 мм³, получали различные терапевтические воздействия, указанные ниже. IgG, контрольные антитела IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); CD-HCl, хидамид-HCl соль (12,5, 25 и 50 мг/кг); C-Na, аморфная целекоксиб-Na соль (12,5, 25 и 50 мг/кг); C-Na cry, кристаллическая целекоксиб-Na соль (50 мг/кг); CD-H₂SO₄, хидамид-H₂SO₄ соль (50 мг/кг); CD-K30, хидамид-K30 (хидамид, нанесенный на поливинилпирролидон K30, 50 мг/кг); C-cap, целекоксиб в капсулах (50 мг/кг, Целебрекс®). Регистрировали общие значения и кратность изменения объема опухоли (А), индивидуальные значения объема опухоли (В), массу тела мышей, несущих опухоль СТ26 (С) и выживаемость животных (D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и СО. Также указано количество животных, использованных в каждой экспериментальной группе, и значения P. *P < 0,05 (по сравнению с IgG); ^#P < 0,05 (по сравнению с PD-1). Значения P были рассчитаны с использованием t-критерия Стьюдента, который применялся для сравнения размеров опухоли в группе показаний с группой IgG. Различия в показателях выживаемости между разными группами лечения были проанализированы в рамках однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

На Фигуре 12, фрагменты A – D показано, что у мышей, несущих опухоль СТ26, резистентность в отношении терапии путем блокады иммунных контрольных точек PD-1 преодолевается с помощью антител к PD-1 или антител к CTLA-4 в сочетании с комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли. Мыши, несущие опухоль СТ26 (средний объем опухоли – около 120 мм³) проходили терапию первой линии с применением антител к PD-1 (2,5 мг/кг), которые вводили дважды (дважды в неделю). Когда опухоли соответствовали критериям неудачи терапии первой линии, что означало трехкратное увеличение размера опухоли (до среднего значения около 360 мм³), а объем опухоли составлял < 600 мм³, мышей повторно включали в исследование терапии второй линии. Лечение мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-1, проводили по семи различным схемам (n=9 – 11 мышей/группа): IgG, контрольные антитела IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); CTLA-4, моноклональные антитела к CTLA-4 (2,5 мг/кг); CD-HCl, хидамид-HCl соль (50 мг/кг); C-Na, аморфная целекоксиб-Na соль (50 мг/кг); MS275, энтиностат (20 мг/кг). Регистрировали общие значения и кратность изменения объема опухоли (А), индивидуальные значения объема опухоли (В), массу тела мышей, несущих опухоль СТ26 (С) и выживаемость животных (D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и СО. Также указано количество животных, использованных в каждой экспериментальной группе, и значения P. *P < 0,05 (по сравнению с IgG); ^#P < 0,05 (по сравнению с PD-1). Значения P были рассчитаны с использованием t-критерия Стьюдента, который применялся для сравнения размеров опухоли в группе показаний с группой IgG. Различия в показателях выживаемости между разными группами лечения были проанализированы в рамках однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

На Фигуре 13, фрагменты A – D показано, что у мышей, несущих опухоль СТ26, резистентность в отношении терапии путем блокады иммунных контрольных точек PD-L1 преодолевается с помощью антител к PD-1 или антител к CTLA-4 в сочетании с комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли. Мыши, несущие опухоль СТ26 (средний объем опухоли – около 160 мм³) проходили терапию первой линии с применением антител к PD-L1 (2,5 мг/кг), которые вводили дважды (дважды в неделю). Когда опухоли соответствовали критериям неудачи терапии первой линии, что означало трехкратное увеличение размера опухоли (до среднего значения около 320 мм³), а объем опухоли составлял < 600 мм³, мышей повторно включали в исследование терапии второй линии. Лечение мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-L1, проводили по семи различным схемам (n=9 – 11 мышей/группа). IgG, контрольные антитела IgG (основа-носитель, 2,5 мг/кг); PD-1, моноклональные антитела к PD-1 (2,5 мг/кг); CTLA-4, моноклональные антитела к CTLA-4 (2,5 мг/кг); CD-HCl, хидамид-HCl соль (50 мг/кг); C-Na, аморфная целекоксиб-Na соль (50 мг/кг); MS275, энтиностат (20 мг/кг). Регистрировали общие значения и кратность изменения объема опухоли (А), индивидуальные значения объема опухоли (В), массу тела мышей, несущих опухоль СТ26 (С), и выживаемость животных (D). Мышей, несущих опухоль СТ26, подвергали указанной терапии и умерщвляли при достижении опухолью объема 3000 мм³ после имплантации опухоли. Указаны средние значения и СО. Также указано количество животных, использованных в каждой экспериментальной группе, и значения P. *P < 0,05 (по сравнению с IgG); ^#P < 0,05 (по сравнению с PD-1). Значения P были рассчитаны с использованием t-критерия Стьюдента, который применялся для сравнения размеров опухоли в группе показаний с группой IgG. Различия в показателях выживаемости между разными группами лечения были проанализированы в рамках однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

На Фигуре 14, фрагменты A – F представлены ФК профили соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли, применяемых по отдельности или в комбинации на самцах крыс линии Вистар. Крысам перорально вводили хидамид-K30, соль хидамид-HCl, целекоксиб в капсулах (Целебрекс®, целекоксиб/капс.) или аморфную целекоксиб-Na соль в дозировке 50 мг/кг. Были проанализированы различия между ФК профилями вещества хидамид-K30 и соли хидамид-HCl (A). Были проанализированы различия между ФК профилями целекоксиба в капсулах и аморфной целекоксиб-Na соли (B). Различия между ФК профилями хидамида на примере комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах и комбинации соли хидамид-HCl и аморфной целекоксиб-Na соли показаны на Фигуре 14, фрагмент C. Различия между ФК профилями целекоксиба на примере комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах и комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли показаны на Фигуре 14, фрагмент D. Различия между ФК профилями хидамида на примере вещества хидамид-K30 и соли хидамид-HCl, а также комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах и комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли показаны на Фигуре 14, фрагмент Е. Различия между ФК профилями целекоксиба на примере целекоксиба в капсулах и целекоксиб-Na соли, а также комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах и комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли показаны на Фигуре14, фрагмент F.

Осуществление изобретения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют общепринятые значения, понятные обычному специалисту в области техники, к которой относится изобретение. Несмотря на то, что при практическом применении или испытании изобретения могут быть использованы любые способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, предпочтительные способы и материалы описаны далее. Все публикации, упомянутые в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылок.

Использование «около» при указании значения или параметра в настоящем документе включает (и описывает) варианты, которые направлены непосредственно на это значение или параметр. Например, описание, относящееся к «около X», включает в себя описание «X». Например, значение 2θ на уровне «около X°» на рентгенограмме соответствует +/-0,2 градуса значения 2θ.

Применение термина в единственном числе означает один или более одного (т.е., по меньшей мере один) грамматического объекта, о котором идет речь. Например, «элемент» означает один элемент или более одного элемента. Использование «или» означает «и/или», если специально не указано иное.

Термин «полиморф» относится к кристаллической форме соединения (например, соединения 1) или его гидрату или сольвату с определенным типом кристаллической решетки. Все полиморфы определенного соединения имеют одинаковый элементный состав. Термин «кристаллический», в контексте настоящего документа, обозначает твердофазную форму с упорядоченным расположением структурных единиц. Различные кристаллические формы одного и того же соединения, его гидрата или сольвата возникают из-за разной упаковки молекул в твердом состоянии, что приводит к различиям в симметрии кристаллов и/или параметров элементарной ячейки. Различные кристаллические формы обычно демонстрируют разные рентгенограммы, инфракрасные спектры, температуры плавления, плотность, твердость, формы кристаллов, оптические и электрические свойства, стабильность и/или растворимость.

Термин «в значительной степени повторяет» при обозначении, например, на рентгенограммы, относится к графику, который не обязательно идентичен показанному в настоящем документе, но находится в пределах экспериментальной ошибки или отклонения при рассмотрении одним из обычных специалистов в соответствующей области.

В контексте настоящего документа термины «субъект», «индивидуум» и «пациент» используются взаимозаменяемо и обозначают позвоночный организм, предпочтительно, млекопитающее, и более предпочтительно, человека. К млекопитающим относятся, помимо прочего, мышиные, обезьяны, человек, сельскохозяйственные животные, спортивные животные и домашние питомцы. Также включаются ткани, клетки биологического организма и их потомство, полученные in vitro или культивируемые in vitro.

В контексте настоящего документа термин «терапевтически эффективное количество» обозначает количество, достаточное для лечения субъекта, пораженного заболеванием (например, нейродегенеративным заболеванием), или для уменьшения симптомов или осложнений, связанных с заболеванием.

В контексте настоящего документа термины «лечить», «лечение», «терапия» и им подобные обозначают уменьшение или устранение нарушения и/или симптомов, связанных с заболеванием. Следует иметь в виду, что, хотя это и не исключается, лечение нарушения или состояния не требует полного устранения нарушения, состояния или симптомов, связанных с ним.

В контексте настоящего документа термин «иммунотерапия» обозначает терапию субъекта, пораженного или имеющего риск поражения или рецидива заболевания, с использованием способа, включающего усиление, подавление или другую модификацию иммунного ответа.

В контексте настоящего документа термин «белок программируемой клеточной смерти-1 (PD-1)» обозначает иммуноингибирующий рецептор, принадлежащий к семейству CD28. PD-1 экспрессируется преимущественно в ранее активированных Т-клетках in vivo и связывается с двумя лигандами, PD-L1 и PD-L2. Термин «PD-1», в контексте настоящего документа, включает человеческий PD-1 (hPD-1), варианты, изоформы и гомологи hPD-1, принадлежащие определенным биологическим видам, а также аналоги, имеющие, по меньшей мере, один общий эпитоп с hPD-1. Полная последовательность hPD-1 находится в базе данных GenBank, учетный номер U64863.

В контексте настоящего документа термин «лиганд белка программируемой клеточной смерти 1 (PD-L1)» обозначает один из двух располагающихся на поверхности клеток гликопротеиновых лигандов белка PD-1 (второй представляет собой PD-L2), который оказывает понижающее воздействие на активацию Т-клеток и секрецию цитокинов после связывания с PD-1. Термин «PD-L1», в контексте настоящего документа, включает человеческий PD-L1 (hPD-L1), варианты, изоформы и гомологи hPD-L1, принадлежащие определенным биологическим видам, а также аналоги, имеющие, по меньшей мере, один общий эпитоп с hPD-L1. Полная последовательность hPD-L1 находится в базе данных GenBank, учетный номер Q9NZQ7.

В контексте настоящего документа термин «антитела» и «антигенсвязывающий фрагмент последних» включает иммуноглобулины естественного происхождения (например, IgM, IgG, IgD, IgA, IgE и т.д.), а также иммуноглобулины, не встречающиеся в природе, включая, например, одноцепочечные антитела, химерные антитела (например, гуманизированные мышиные антитела), гетероконъюгатные антитела (например, биспецифические антитела), Fab', F(ab').sub.2, Fab, Fv и rIgG. В контексте настоящего документа термин «антигенсвязывающий фрагмент» обозначает часть молекулы антител полной длины, которая сохраняет способность к специфическому распознаванию антигена, а также различные комбинации таких частей.

В контексте настоящего документа термин «рак» обозначает широкую группу различных заболеваний, характеризующихся неконтролируемым ростом имеющих отклонения от нормы клеток в организме. Неконтролируемое деление и рост клеток приводят к образованию злокачественных опухолей, которые вторгаются в соседние ткани, а также могут метастазировать в удаленные части организма через лимфатическую или кровеносную систему. Термин «рак», в контексте настоящего документа, обозначает первичный, метастатический и рецидивирующий рак.

Микроокружение опухоли является важным аспектом биологии рака и вносит вклад в возникновение опухоли, прогрессирование опухоли и развитие ответа на терапию. Микроокружение опухоли состоит из гетерогенной клеточной популяции, которая включает злокачественные клетки и клетки, поддерживающие пролиферацию, инвазию и метастатический потенциал опухоли за счет разнообразных взаимодействий. Опухолевые клетки часто индуцируют формирование иммуносупрессивного микроокружения, которое способствует развитию иммуносупрессивных популяций иммунных клеток, таких как супрессорные клетки миелоидного происхождения (MDSC), опухоль-ассоциированные макрофаги (TAM) и регуляторные Т-клетки (Tregs). Поэтому в микроокружении опухоли были открыты мишени, которые могут помочь направлять и улучшать действие различных средств противораковой терапии, в частности, иммунотерапии, которая работает за счет потенцирования противоопухолевых иммунных ответов организма-хозяина.

В рамках настоящего изобретения было неожиданно обнаружено, что комбинация, содержащая ингибитор гистондеацетилазы (HDAC) (например, хидамид или его кислая соль) и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) (например, целекоксиб или его основная соль), может существенно повышать скорость формирования иммунного ответа, воздействовать на регуляцию микроокружения опухоли и, таким образом, значительно повышать противоопухолевую активность. Указанные два активных фармацевтических ингредиента предпочтительно находятся в форме соли (кристаллической или аморфной).

Хидамид (Эпидаза®) известен как ингибитор гистондеацетилазы (HDAC), который оказывает соответствующее воздействие на HDAC1, HDAC2, HDAC3 класса I, а также HDAC10 класса IIb. Химическое наименование хидамида: 4-(((Е)-3-(пиридин-3-ил)акриламидо)метил)-N-(2-амино-4-фторфенил)бензамид; структура показана далее

Целекоксиб, продаваемый, в частности, под торговой маркой Целебрекс®, представляет собой нестероидный противовоспалительный препарат (НПВП) – селективный ингибитор ЦОГ-2. Химическое наименование целекоксиба: 4-[5-(4-метилфенил)-3-(трифторметил)пиразол-1-ил]бензолсульфонамид; структура показана далее

В настоящем изобретении используются кислая соль хидамида (соли хидамид-HCl или хидамид-H₂SO₄) и основная форма целекоксиба (такая как целекоксиб-Na соль). Предпочтительно, солевая форма хидамида находится в кристаллической форме, а солевая форма целекоксиба – в аморфной форме.

В частности, кристаллическая форма соли хидамид-HCl (кристаллическая форма A) и кристаллическая форма соли хидамид-H2SO4 (форма B).

Рентгенограммы и ИК-спектры, полученные методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), показаны и описаны в настоящем документе для формы A и формы B. В контексте настоящего документа термин «наибольший пик» относится к пику с самой высокой интенсивностью на рентгенограмме. В контексте настоящего документа термин «пик с большой интенсивностью» включает любой пик, интенсивность которого соответствует верхним 20% пиков на определенной полученной методом порошкового рентгеноструктурного анализа рентгенограмме.

На рентгенограмме кристаллической формы А наблюдаются пики со значениями 2θ, которые приводятся в настоящем документе. При этом на полученном методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR) спектре кристаллической формы хлористоводородная соли хидамида наблюдаются пики, данные по которым приводятся далее. Кроме того, дополнительно показано, что рентгенограмма формы А в значительной степени повторяет рентгенограмму, представленную на Фиг. 3, фрагмент В, или ИК-спектр, полученный методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), в значительной степени повторяет спектр, представленный на Фиг. 4, фрагмент В.

На рентгенограмме кристаллической формы В наблюдаются пики со значениями 2θ, которые приводятся в настоящем документе. При этом на ИК-спектре кристаллической формы сульфатной соли хидамида (форма В) наблюдаются пики, данные по которым приводятся далее. Кроме того, дополнительно показано, что рентгенограмма формы B в значительной степени повторяет рентгенограмму, представленную на Фиг. 3, фрагмент С, или ИК-спектр, полученный методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), в значительной степени повторяет спектр, представленный на Фиг. 4, фрагмент С.

Основная соль целекоксиба представляет собой натриевую соль, которая находится в аморфной или кристаллической форме. В одном из вариантов осуществления изобретения дополнительно показано, что рентгенограмма аморфной формы натриевой соли целекоксиба в значительной степени повторяет рентгенограмму, представленную на Фиг. 7, фрагмент B.

На полученной методом порошкового рентгеноструктурного анализа (XRPD) рентгенограмме кристаллической формы (форма I) натриевой соли целекоксиба наблюдаются пики, данные по которым приводятся далее. В еще одном из вариантов осуществления изобретения дополнительно показано, что рентгенограмма формы I в значительной степени повторяет рентгенограмму, представленную на Фиг. 7, фрагмент С.

Кислую соль хидамида получают в сильнокислых условиях (кислота Аррениуса, pKa < 3) в рамках производственного процесса, а также в ходе специфического процесса синтеза новых кристаллических форм солей хидамид-HCl и хидамид-H₂SO₄. Эти соли существенно улучшают растворимость в воде и фармакокинетический профиль, значительно повышая эффективность иммунотерапии в сочетании с целекоксиб-Na солью и ингибитором иммунных контрольных точек. Процессы получения кристаллических форм солей хидамид-HCl и хидамид-H₂SO₄ проиллюстрированы на приведенных в настоящем документе примерах.

Основную соль целекоксиба получают из гидрида металла, например, NaH, в рамках производственного процесса, а также в ходе специфических процессов синтеза «безводных» аморфных и кристаллических форм целекоксиб-Na солей. Аморфная целекоксиб-Na соль характеризуется хорошей растворимостью в воде и новым фармакокинетическим профилем, а также оказывает влияние на повышение эффективности иммунотерапии при использовании в сочетании с кислой солью хидамида и ингибиторами иммунных контрольных точек. Подобные результаты также наблюдали при использовании кристаллической формы целекоксиб-Na соли. Процессы получения аморфной и кристаллической форм целекоксиба-Na соли проиллюстрированы на приведенных в настоящем документе примерах.

В некоторых из вариантов осуществления изобретения количество солей хидамид-HCl или хидамид-H₂SO₄ в комбинации находится в диапазоне от около 5% по весу до около 80% по весу, около от 30% до около 80% по весу, от около 40% до около 80% по весу, от около 20% до около 60% по весу, от около 30% до около 60% по весу, от около 40% до около 60% по весу или от около 35% до около 60% по весу.

В некоторых из вариантов осуществления изобретения количество целекоксиб-Na соли в комбинации находится в диапазоне от около 5% по весу до около 80% по весу, около от 30% до около 80% по весу, от около 40% до около 80% по весу, от около 20% до около 60% по весу, от около 30% до около 60% по весу, от около 40% до около 60% по весу или от около 35% до около 60% по весу.

В одном из вариантов осуществления изобретения комбинацию, предлагаемую в настоящем изобретении, производят при использовании разных соотношений солей хидамид-HCl или хидамид-H₂SO₄ (также используют название соль хидамида) и целекоксиб-Na соли (используют название соль целекоксиба). Фармакокинетические свойства солей хидамида и целекоксиба были улучшены по сравнению с веществом хидамид-K30 (оригинальный состав препарата Эпидаза®, изготавливаемого на основе хидамида) и целекоксибом в капсулах (оригинальный состав препарата Целебрекс®, изготавливаемого на основе целекоксиба).

Кроме того, в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек комбинация (соль хидамида и соль целекоксиба) значительно повышала противоопухолевую активность по сравнению с комбинацией вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах. Лечение с применением комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, в сочетании с ингибиторами иммунных контрольных точек существенно повышает эффективность ингибирования роста опухоли по сравнению с отдельным применением ингибиторов иммунных контрольных точек, комбинации вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах и даже с их совместного применения. Кроме того, комбинация комбо и ингибиторов иммунных контрольных точек оказывает существенное воздействие на процесс уничтожения опухоли и увеличивает показатели выживаемости до около 80 – 100%.

В одном варианте осуществления изобретения ингибитор иммунных контрольных точек может быть использован в сочетании с фармацевтической комбинацией, описанной в настоящем документе, с целью стимуляции активности иммунной системы против раковых клеток и лечения рака. Ингибиторы иммунных контрольных точек, подходящие для использования при осуществлении настоящего изобретения, включают антагонисты ингибирующих рецепторов, которые ингибируют PD-1, PD-L1, CTLA-4, Т-клеточный иммуноглобулин-3 (TIM-3), аттенюатор В- и Т-лимфоцитов (BTLA), V-доменный Ig-супрессор активации Т-клеток (VISTA) или путь гена активации лимфоцитов-3 (LAG-3), такие как антитела к PD-1, антитела к PD-L1, антитела к CTLA-4, антитела к TIM-3, антитела к BTLA, антитела к VISTA и антитела к LAG-3. Примеры ингибиторов PD-1 или PD-L1 включают, помимо прочего, гуманизированные антитела, блокирующие PD-1 человека, такие как пембролизумаб (антитела к PD-1, торговое название Кейтруда®), ниволумаб (антитела к PD-1, торговое название Опдиво®) или пидилизумаб (антитела к PD-1, CT-011), торипалимаб (антитела к PD-1, торговое название То И®), синтилимаб (антитела к PD-1, торговое название Тивит®), камрелизумаб (антитела к PD-1), Бавенсио® (антитела к PD-L1, авелумаб), Имфинзи® (антитела к PD-L1, дурвалумаб) и Тецентрик® (антитела к PD-L1, атезолизумаб), а также полностью человеческие антитела, такие как ниволумаб (антитела к PD-1, торговое название Опдиво®) и цемиплимаб (антитела к PD-1, торговое название Либтайо®). Прочие ингибиторы PD-1 могут включать препараты растворимого лиганда PD-1, включая, помимо прочего, гибридный белок PD-L2 Fc, также известный как B7-DC-Ig и АМР-244, и другие ингибиторы PD-1, в настоящее время находящиеся в стадии исследований и/или разработки в качестве средств, предназначенных для использования в терапии. Кроме того, ингибиторы иммунных контрольных точек могут включать, помимо прочего, гуманизированные или полностью человеческие антитела, блокирующие PD-L1, такие как дурвалумаб и MIH1 и другие ингибиторы PD-L1, в настоящее время находящиеся в стадии исследований. В некоторых из вариантов осуществления изобретения количество ингибитора иммунных контрольных точек находится в интервале значений от около 0,5% по весу до около 15% по весу, от 0,5% по весу до около 10% по весу, от 0,5% по весу до около 5% по весу, от 1,0% по весу до около 20% по весу, от 1,0% по весу до около 15% по весу, от 1,0% по весу до около 10% по весу или от 1,0% по весу до около 5% по весу.

В некоторых из вариантов осуществления настоящего изобретения соли хидамид-HCl или хидамид-H₂SO₄, целекоксиб-Na соль и ингибитор иммунных контрольных точек вводят одновременно. В некоторых из вариантов осуществления изобретения соли хидамид-HCl или хидамид-H₂SO₄, целекоксиб-Na соль и ингибитор иммунных контрольных точек вводят последовательно в любом порядке или чередуют.

В состав фармацевтической комбинации, предлагаемой в настоящем изобретении, может входить «носитель». В контексте настоящего документа термин «носитель» включает любой растворитель, дисперсионную среду, основу-носитель, покрытие, разбавитель, антибактериальный и/или противогрибковый агент, изотонический агент, агент, замедляющий абсорбцию, буфер, раствор носителя, суспензию, коллоид и тому подобное. Применение подобных сред и/или агентов для фармацевтических активных субстанций известно специалистам в соответствующей области. Например, фармацевтическая комбинация может быть приготовлена в форме, специально предназначенной для введения в твердой или жидкой форме, включая формы, адаптированные для следующих способов введения: (1) пероральное введение, например, в виде жидких лекарственных форм (водные или неводные растворы или суспензии), таблеток для рассасывания, драже, капсул, пилюль, таблеток (например, таблеток, предназначенных для трансбуккального, сублингвального или системного применения), болюсов, порошков, гранул, паст для нанесения на язык; (2) парентеральное введение, например, путем подкожной, внутримышечной, внутривенной или эпидуральной инъекции, например, в виде стерильного раствора или суспензии, либо препарата с замедленным высвобождением; (3) местное применение, например, в виде крема, лосьона, геля, мази или пластыря с контролируемым высвобождением, либо спрея, наносимого на кожу; (4) вагинальное или ректальное введение, например, в виде пессария, крема, суппозитория или пены; (5) сублингвальное введение; (6) введение через глаза; (7) трансдермальное введение; (8) чресслизистое введение; или (9) интраназальное введение.

Комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть использована для регуляции микроокружения опухоли и иммунотерапии рака. Виды рака включают, помимо прочего, глиобластому, рак печени (например, гепатоклеточная карцинома), колоректальную карциному, глиобластому, рак желудка, колоректальный рак, рак пищевода, рак легкого (например, немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и мелкоклеточный рак легкого), рак поджелудочной железы, почечноклеточную карциному, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, рак предстательной железы, рак яичников, меланому, рак молочной железы, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), карциному из клеток Меркеля, неходжкинскую лимфому, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), рак желчного пузыря, холангиокарциному, рак мочевого пузыря и рак матки.

Фармацевтическая комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть выпущена в виде единого препарата. В других вариантах осуществления изобретения фармацевтическая комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть выпущена в виде раздельных препаратов. Фармацевтическая комбинация может быть составлена в различных и/или множественных формах, предназначенных для одного или нескольких предпочтительных путей введения. Так, фармацевтическая комбинация может вводиться с использованием одного или более известных путей, включая, например, пероральное введение, парентеральное введение (например, интрадермальное, чрескожное, подкожное, внутримышечное, внутривенное, интраперитонеальное и т.д.) или местное применение (например, интраназальное, внутрилегочное, интрамаммарное, вагинальное, внутриматочное, интрадермальное, чрескожное, ректальное и.т.д.). Фармацевтическая комбинация, или ее часть, может вводиться через поверхность слизистой оболочки, путем нанесения, например, на слизистую оболочку носа или дыхательных путей (например, в виде спрея или аэрозоля). Фармацевтическая комбинация, или ее часть, также может вводиться в виде формы с замедленным или отсроченным высвобождением.

Фармацевтическая комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть для удобства выпущена в виде лекарственной формы с единичными дозами или может быть приготовлена с использованием способов, известных специалистам в области фармацевтики. Способы приготовления комбинации с использованием фармацевтически приемлемого носителя включают этап объединения фармацевтической комбинации, предлагаемая в настоящем изобретении, с носителем, который состоит из одного или более вспомогательных ингредиентов. В целом, фармацевтическая комбинация, предлагаемая в настоящем изобретении, может быть приготовлена путем однородного и/или равномерного объединения активного компонента с жидким носителем, мелкораздробленным твердым носителем, или обоими, и затем, при необходимости, придания препарату требуемой формы.

В некоторых из вариантов осуществления изобретения способ может включать введение достаточного количества фармацевтической комбинации для обеспечения получения субъектом дозы, например, от около 10 мг/кг до около 1000 мг/кг.

Настоящее изобретение иллюстрируется приведенными ниже примерами. Следует понимать, что конкретные примеры, материалы, количества и процедуры должны интерпретироваться в широком смысле в соответствии с объемом и сущностью изобретения, изложенными в настоящем документе.

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

Материалы и оборудование. Хидамид-АФИ, хидамид-K30, соль хидамид-HCl, соль хидамид-H₂SO₄ и целекоксиб-Na соль были предоставлены компанией GNT Biotech & Medicals Co. Ltd (Тайвань). Целекоксиб-АФИ был приобретен в компании Aarti Drugs Ltd (Индия). Целекоксиб в капсулах (Целебрекс®, 200 мг) был приобретен в компании (Pfizer, Тайвань). В экспериментах на животных использовали следующие антитела и реактивы: мышиные моноклональные антитела к PD-L1 (B7-H1) (10F.9G2; Bio X Cell), мышиные моноклональные антитела к PD-1 (CD279) (RMP1-14); Bio X Cell), мышиные моноклональные антитела к CTLA-4 (CD152) (BE0164; Bio X Cell) и изотипические контрольные крысиные моноклональные антитела IgG2a (2A3; Bio X Cell). Метанол «для ЖХ/МС», ацетонитрил «для ВЭЖХ», натриевая соль 1-гептансульфоновой кислоты, тальк и этилендиаминтетрауксусная кислота были приобретены в компании J.T.Baker® (США). Муравьиная кислота, хлорид натрия, лактоза, стеарат магния, поливинилпирролидон и трехосновный додекагидрат фосфата натрия были приобретены в компании Sigma-Aldrich (США). Лаурилсульфат натрия был приобретен в компании Showa Chemical Co., Ltd (Япония). Дистиллированную воду очищали с применением дистилляционной системы Milli-Q (Merck Millipore®, Франция). Соляная кислота S.G. (HCl) была приобретена в компании Fisher Chemical, США. Гидрид натрия (NaH), ТГФ 99,5% (молекулярные сита) были приобретены в компании Acros, Бельгия. Безводный этиловый эфир был приобретен в компании ECHO Chemical Co., LTD, Тайвань. Фильтровальная бумага была приобретена в компании Toyo Roshi Kaisha, LTD, Япония. ¹Н-ЯМР- и ¹³С-ЯМР-спектры регистрировали на приборе Bruker AVANCE 400MHz PLUS. ИК-спектры (FTIR) регистрировали на приборе Perkin Elmer Spotlight 200i Sp2 с системой AutoATR System (ИК-спектрометр Perkin Elmer). Измерения методом порошкового рентгеноструктурного анализа проводили на рентгеновском дифрактометре PANalytical EMPYREAN. Массы, полученные путем ионизации электрораспылением, регистрировали на приборе Bruker microTOF. Массы, полученные путем бомбардировки быстрыми атомами, регистрировали на приборе JEOL JMS-700. Культуральные среды Gibco RPMI 1640 и DMEM с L-глутамином были приобретены в компании Invitrogen Life Technologies. Фетальная бычья сыворотка (ФБС) HyClone была приобретена в компании Thermo Scientific.

Приготовление соли хидамид-HCl. 1 грамм вещества хидамид-АФИ (активный фармацевтический ингредиент) помещали в колбу и добавляли 3~5 мл 6~8 Н HCl (водн.), после перемешивали до полного растворения; процесс контролировали визуально. При отсутствии перемешивания образовывался твердый осадок. Твердый осадок отделяли от раствора путем фильтрования с отсасыванием и дополнительно очищали при четырехкратном образовании суспензии для удаления примесей с помощью диэтилового эфира. Конденсировали и концентрировали (досуха) чистое твердое вещество. Затем твердый продукт сушили при температуре 50 – 60°С в течение 16 часов в печи и измельчали в порошок (100 меш). После приготовления определяли характеристики соли хидамид-HCl методами ВЭЖХ, ¹H-ЯМР, ¹³C-ЯМР, XRD, МС, FTIR, оценивали растворимость при насыщении и т. д. Другие способы приготовления соли хидамид-HCl представлены далее.

65 мг вещества хидамид-АФИ суспендировали в 50~150 мл EtOH, MeOH, ДХМ, ТГФ или H₂O, затем добавляли 2~6 капель 37% HCl и перемешивали до полного растворения. Смесь концентрировали для удаления растворителя до тех пор, пока не оставался 1 мл жидкости, которую затем добавляли по каплям к 50 мл эфира и осаждали твердую соль.

500 мг вещества хидамид-АФИ добавляли к 4~10 мл 4~8 Н HCl (водн.) и перемешивали до полного растворения. Добавляли 10~20 мл EtOH, а затем 10~20 мл эфира до образования тумана. Процесс кристаллизации продолжали при температуре 4°С в течение 12 часов. Соль собирали в процессе фильтрации и промывали эфиром, а затем сушили в печи при температуре 60°С в течение 5 часов.

Приготовление соли хидамид-H₂SO₄. 1 грамм вещества хидамид-АФИ помещали в колбу и добавляли 3~5 мл 3~5 M H₂SO₄ (водн.), после перемешивали до полного растворения; процесс контролировали визуально. Раствор медленно по каплям добавляли к 150 – 200 мл этанола и осаждали твердое вещество. Твердое вещество отделяли от раствора путем фильтрования с отсасыванием и трижды промывали этанолом. Твердое вещество очищали при трехкратном образовании суспензии с этанолом, а затем дополнительно удаляли избыток влаги с помощью диэтилового эфира. Конденсировали и концентрировали (досуха) чистое твердое вещество. Затем твердый продукт сушили при температуре 50 – 60°С в течение 16 часов в печи и измельчали в порошок (100 меш). После приготовления определяли характеристики соли хидамид-H₂SO₄ методами ВЭЖХ, ¹H-ЯМР, ¹³C-ЯМР, XRD, МС, FTIR, оценивали растворимость при насыщении и т. д.

Приготовление целекоксиб-Na соли. 5 грамм вещества целекоксиб-АФИ помещали в круглодонную колбу и добавляли 150 – 200 мл ТГФ при отсутствии воздуха в среде газообразного азота. Соединение полностью растворялось; процесс контролировали визуально. В раствор добавляли 450 – 500 мг NaH (гидрид натрия) и интенсивно перемешивали. Твердый осадок образовывался примерно через 70 – 90 мин. ТГФ удаляли путем фильтрования с отсасыванием, твердое вещество трижды промывали 20 мл ТГФ. Затем твердое вещество растворяли в 300 мл дихлорметана (ДХМ), а все не растворившиеся компоненты удаляли путем фильтрования с отсасыванием. Собирали фильтрат, затем для конденсировали и концентрировали (досуха) на ротационном испарителе при давлении 30 – 50 мбар и скорости вращения 140 об/мин твердое вещество. Чистый твердый продукт сушили при температуре 60°С в течение 16 часов и измельчали в порошок (100 меш). После приготовления определяли характеристики безводной аморфной целекоксиб-Na соли согласно данным спектров, полученных методами ¹H-ЯМР, ¹³C-ЯМР, XRD, МС, FTIR и т.д.

Другой способ приготовления безводной аморфной целекоксиб-Na соли представлен далее. 1 грамм вещества целекоксиб-АФИ помещали в круглодонную колбу и добавляли 6 мл ТГФ при отсутствии воздуха в среде газообразного азота. Соединение полностью растворялось; процесс контролировали визуально. В раствор добавляли 75~100 мг NaH (гидрид натрия) и интенсивно перемешивали. Твердый осадок образовывался примерно через 40~80 мин. ТГФ удаляли путем фильтрования с отсасыванием, твердое вещество трижды промывали диэтиловым эфиром. Твердое вещество очищали при трехкратном образовании суспензии с диэтиловым эфиром. Затем твердое вещество растворяли в 150~200 мл дихлорметана (ДХМ), а все не растворившиеся компоненты удаляли путем фильтрования с отсасыванием. Собирали фильтрат, затем конденсировали и концентрировали (досуха). В процессе конденсации начальное давление устанавливали на уровне 400~430 мбар до полного отсутствия дистиллята. Затем давление устанавливали на уровне 10~30 мбар до завершения процесса осаждения твердой соли. Чистый твердый продукт сушили при температуре 60°С в течение 16 часов и измельчали в порошок (100 меш). После приготовления определяли характеристики аморфной целекоксиб-Na соли методами ВЭЖХ, ¹H-ЯМР, ¹³C-ЯМР, XRD, МС, FTIR, оценивали растворимость при насыщении и т. д.

Безводную кристаллическую целекоксиб-Na соль также получали способом, описанным выше, за исключением того, что в ходе конденсации давление устанавливали на уровне 10~30 мбар до завершения процесса осаждения твердой соли.

Определение растворимости солей хидамид-HCl, хидамид-H₂SO₄ и целекоксид-Na соли при насыщении. Образец 5 мг солей хидамид-HCl, хидамид-H₂SO₄ или целекоксиб-Na соли помещали в мерные колбы емкостью 5 мл, содержащие дистиллированную деминерализованную воду, и взбалтывали при 100 об/мин в инкубаторе при температуре 25°C в течение 90 минут. Полученную суспензию пропускали через 0,22 мкм фильтр. Концентрации солей хидамид-HCl, хидамид- хидамид-H₂SO₄ и целекоксиб-Na соли определяли спектрофотометрическим методом при 256 нм, 256 нм и 253 нм, соответственно. Растворимость каждого образца при насыщении определяли в трех повторностях, регистрировали среднее значение и стандартное отклонение. Данные о построении калибровочных кривых представлены далее. Маточные растворы хидамида и целекоксиба готовили в 99,99% MeOH. Значения λ_max составляли 256 нм и 253 нм, соответственно. Калибровочная кривая демонстрировала надлежащий уровень линейности с коэффициентом корреляции (R²), равным 0,9998, в диапазоне концентраций Бера 0 – 20 мкг/мл.

Клеточные линии. СТ26 (CRL-2638; клетки мышиной колоректальной аденокарциномы) были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС). Клетки опухолевых клеточных линий CT26 выращивали на среде МакКоя 5А с добавлением 10% (v/v) ФБС при температуре 37°С, 5% CO₂.

Противоопухолевая активность на экспериментальных моделях на животных. Исследование на животных было одобрено и прошло контроль Комиссии по контролю содержания и использования лабораторных животных Тайбэйского медицинского университета (TMU IACUC, №: LAC-2018-0340). Для всех экспериментов на животных использовали самцов мышей BALB/C в возрасте от шести до восьми недель (BioLASCO, Тайвань). Инокуляцию раковых клеток СТ26 (5 × 10⁶) проводили путем подкожного введения в правый бок каждой мыши. Опухоли росли в течение 10 – 11 дней (размер опухоли около 200 – 300 мм³) перед началом рандомизации и терапии. Мыши, несущие опухоль СТ26, получали 2,5 мг/кг антител IgG (партия № 65481701), антител к PD-1 (партия № 640517M1 и 717918D1), антител к PD-L1 (партия № 720619F1) или антител к CTLA-4 (партия № 702418A2B) интраперитонеально на 11, 14, 17, 20, 23 и 26 день после имплантации опухоли, все антитела разводили до соответствующих значений концентрации в 100 мкл стерильного фосфатного буферного раствора (ФБР) (рН 7,4) (Invitrogen Life Technologies). Хидамид-K30, соль хидамид-HCl, соль хидамид-H₂SO₄, целекоксиб в капсулах (Целебрекс®, 200 мг) и целекоксиб-Na соль (аморфная или кристаллическая форма) вводили перорально на 11 день после имплантации опухоли. Хидамид-K30, соль хидамид-HCl и соль хидамид-H₂SO₄ вводили перорально для лечения мышей, несущих опухоль, в дозировке 12,5, 25 и 50 мг/кг ежедневно с 11 по 26 день. Ежедневное лечение с применением целекоксиба (капсула/Целебрекс®, 200 мг) или целекоксиб-Na соли в дозировке 12,5, 25,0 и 50 мг/кг проводили с 11 по 26 день. Противоопухолевую активность измеряли с начала терапии, направленной на уменьшение роста опухоли, до момента достижения опухолью объема 3000 мм³. Объем опухоли рассчитывали по формуле: длина × ширина² × 0,5.

Выживаемость среди экспериментальных моделей на животных. Введение антител или лекарственных средств проводили с 11 по 25 или 26 день. Опухоль продолжала расти в организме мышей, несущих опухоль. Объем опухоли у мышей измеряли каждые три или четыре дня (дважды в неделю). Мышей, несущих опухоль, считали мертвыми после того, как опухоль достигала объема 3000 мм³. Данные для всех групп лечения регистрировали и подвергали анализу.

Преодоление резистентности в отношении терапии первой линии путем блокады иммунных контрольных точек PD-1. Исследование на животных было одобрено и прошло контроль Комиссии по контролю содержания и использования лабораторных животных Тайбэйского медицинского университета (TMU IACUC, №: LAC-2018-0340). Для всех экспериментов на животных использовали самцов мышей BALB/C в возрасте от шести до восьми недель (BioLASCO, Тайвань). Инокуляцию раковых клеток СТ26 (5 × 10⁶) проводили путем подкожного введения в правый бок каждой мыши. Опухоли росли в течение 8 дней (средний размер опухоли около 120 мм³) перед началом терапии первой линии с применением антител к PD-1 (2,5 мг/кг), которые вводили дважды (интервал между двумя введениями – 3 дня). Когда опухоли соответствовали критериям неудачи, что означало постепенное трехкратное увеличение размера в течение 3 дней (средний размер опухоли – 360 мм³) после второй дозы антител к PD-1 в рамках терапии первой линии, а объемы опухоли составляли < 600 мм³, мышей повторно включали в исследование. Мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-1, дополнительно рандомизировали. Мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-1, лечили по семи различным схемам, включая антитела IgG (2,5 мг/кг; партия № 65481701), антитела к PD-1 (2,5 мг/кг; партия № 640517M1), антитела к PD-1 (2,5 мг/кг) в сочетании с энтиностатом (20 мг/кг), антитела к PD-1 (2,5 мг/кг) в сочетании с комбинацией соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг), комбинацию соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг), антитела к CTLA-4 (2,5 мг/кг; партия № 702418A2B) по отдельности или в сочетании с комбинацией соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг). Антитела вводили интраперитонеально на 14, 17, 20, 23, 26 и 29 день (шесть процедур, интервал между двумя введениями – 3 дня), все антитела разводили до соответствующих значений концентрации в 100 мкл стерильного ФБР (рН 7,4) (Invitrogen Life Technologies). Целекоксиб-Na соль, соль хидамид-HCl и энтиностат вводили перорально с 14 по 29 день. Целекоксиб-Na соль (50 мг/кг), соль хидамид-HCl (50 мг/кг) давали ежедневно, а энтиностат (20 мг/кг) – каждые два дня. Противоопухолевую активность измеряли с начала терапии, направленной на уменьшение роста опухоли, до момента достижения опухолью объема 3000 мм³. Объем опухоли рассчитывали по формуле: длина × ширина² × 0,5. Исследование на животных было проработано и позволило продемонстрировать потенциальный вариант лечения при неэффективности терапии первой линии с применением антител к PD-1 у больных раком людей, у которых развилась первичная/вторичная резистентность в отношении терапии с применением антител к PD-1.

Преодоление резистентности в отношении терапии первой линии путем блокады иммунных контрольных точек PD-L1. Исследование на животных было одобрено и прошло контроль Комиссии по контролю содержания и использования лабораторных животных Тайбэйского медицинского университета (TMU IACUC, №: LAC-2018-0340). Для всех экспериментов на животных использовали самцов мышей BALB/C в возрасте от шести до восьми недель (BioLASCO, Тайвань). Инокуляцию раковых клеток СТ26 (5 × 10⁶) проводили путем подкожного введения в правый бок каждой мыши. Опухоли росли в течение 8 дней (средний размер опухоли около 160 мм³) перед началом терапии первой линии с применением антител к PD-L1 (2,5 мг/кг), которые вводили дважды (интервал между двумя введениями – 3 дня). Когда опухоли соответствовали критериям неудачи, что означало постепенное трехкратное увеличение размера в течение 3 дней (средний размер опухоли – 320 мм³) после введения второй дозы антител к PD-L1 (партия № 720619F1), а объемы опухоли составляли < 600 мм³, мышей повторно включали в исследование. Мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-L1, дополнительно рандомизировали. Мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-L1, лечили по семи различным схемам, включая антитела IgG (2,5 мг/кг; партия № 65481701), антитела к PD-1 (2,5 мг/кг; партия № 717918D1), антитела к PD-1 (2,5 мг/кг) в сочетании с энтиностатом (20 мг/кг), антитела к PD-1 (2,5 мг/кг) в сочетании с комбинацией соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг), комбинацию соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг), антитела к CTLA-4 (2,5 мг/кг; партия № 702418A2B) по отдельности или в сочетании с комбинацией соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг). Антитела вводили интраперитонеально на 14, 17, 20, 23, 26 и 29 день (шесть процедур, интервал между двумя введениями – 3 дня), все антитела разводили до соответствующих значений концентрации в 100 мкл стерильного ФБР (рН 7,4) (Invitrogen Life Technologies). Целекоксиб-Na соль, соль хидамид-HCl и энтиностат вводили перорально с 14 по 29 день. Целекоксиб-Na соль (50 мг/кг), соль хидамид-HCl (50 мг/кг) давали ежедневно, а энтиностат (20 мг/кг) – каждые два дня. Противоопухолевую активность измеряли с начала терапии, направленной на уменьшение роста опухоли, до момента достижения опухолью объема 3000 мм³. Объем опухоли рассчитывали по формуле: длина × ширина² × 0,5. Исследование на животных было проработано и позволило продемонстрировать потенциальный вариант лечения при неэффективности терапии первой линии с применением антител к PD-L1 у больных раком людей, у которых развилась первичная/вторичная резистентность в отношении терапии с применением антител к PD-L1.

Анализ фармакокинетических (ФК) профилей соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли на крысах линии Вистар. Фармакокинетические исследования хидамида, целекоксиба и их солевых форм (соль хидамид-HCl и целекоксиб-Na соль) проводили на самцах крыс линии Вистар в возрасте 7 недель путем перорального введения соединений в дозировке 50 мг/кг в воде. Самцы крыс линии Вистар были приобретены в компани BioLasco (Тайвань). Перед началом фармакокинетических исследований животных не кормили в течение 12 ч, не ограничивая доступ к воде. Образцы крови отбирали (n > 5/момент времени) через 0,08, 0,25, 0,5, 0,75, 1, 1,5, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 и 72 ч после введения дозы. В каждый момент времени около 250 мкл крови отбирали из яремной вены в маркированную пробирку Microtainer™, содержащую этилендиаминтетрауксусную кислоту. Образцы крови обрабатывали для получения образцов плазмы в течение 30 минут от запланированного времени отбора образцов. Все образцы плазмы до начала анализа хранили при температуре ниже -80°C. Образцы плазмы анализировали на наличие следов лечения с применением вещества хидамид-К30, соли хидамид-HCl, целекоксиба (капсула/Целебрекс®, 200 мг) и аморфной формой целекоксиб-Na соли методом жидкостной хромато-масс-спектрометрии (ЖХ-МС/МС, 6470 Agilent Tech., США) с пределами количественного определения 14,2 нг/мл (хидамид) и 45,5 нг/мл (целекоксиб). ФК-параметры вещества хидамид-К30, соли хидамид-HCl, целекоксиба/Целебрекс® и целекоксиб-Na соли рассчитывали по правилу трапеций, а также с применением инструмента некомпартментного анализа валидированного программного обеспечения Phoenix WinNonlin (версия 6.3). Фармакокинетические исследования были проведены в Тайбэйском медицинском университете и одобрены Комиссией по контролю содержания и использования лабораторных животных (IACUC №: LAC-2017-0331). Приготовление и анализ образцов выполняли согласно описанию, представленному далее. К 50 мкл калибровочных стандартов или образцов плазмы добавляли 150 мкл ацетонитрила (содержащего 10 % метанола), затем образцы встряхивали в течение 1 мин для осаждения белка. После центрифугирования при температуре 4°C и скорости вращения 21130g в течение 15 мин, 5 мкл надосадочной жидкости вводили непосредственно в ЖХ-МС/МС для анализа. Анализ выполняли на жидкостном хроматографе серии 6470 (Agilent Tech., США), оснащенном насосом с для четырехкомпонентных смесей (ЖХ-система 1260 Infinity II Quaternary Pump), дегазатором, автоматическим пробоотборником, термостатируемым отделением для колонки и ЖХ-МС/МС-масс-спектрометром 6470 (Agilent Tech., США). Хроматографическое разделение осуществляли на колонке LiChrospher® 60 RP-select B (5 мкм, 125 × 4,6 мм, Merck, Германия) при температуре 40°C, в режиме градиентного элюирования, как описано в таблице ниже. Скорость потока составляла 0,5 мл/мин. Общее время анализа – 10 мин. Скорости потока сушильного газа и распыляющего газа составляли 6 и 1,5 л/мин. Температура сухого газа и капиллярное напряжение системы составляли 250°С и 3000 В, соответственно. ЖХ-МС/МС-анализ проводили в режиме селективной регистрации избранных реакций распада нескольких ионов с использованием ионов-мишеней со значениями m/z 391,1 и 265,1 для хидамида при ионизации электрораспылением в режиме регистрации положительных ионов, и значениями m/z 380 и m/z 316 для целекоксиба при ионизации электрораспылением в режиме регистрации отрицательных ионов.

Таблица данных режима градиентного элюирования ЖХ/МС

Время (минуты) 2,5% муравьиная кислота вода ацетонитрил 0 – 3 2% 68% 30% 3,01 – 5 2% 48% 50% 5,01 – 9 2% 38% 60% 9,01 – 12 2% 68% 30%

Статистические показатели. Были вычислены средние значения и стандартные ошибки для всех точек данных, исследованных в рамках, как минимум, четырех независимых экспериментов. Были проведены попарные сравнения размеров опухоли между каждым из вариантов экспериментальных условий и контрольной группой IgG с использованием двухвыборочного t-критерия Стьюдента (Systat Software, Сан-Хосе, Калифорния, США). Для оценки данных об эффективности исследований на животных использовали критерий Стьюдента или однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA). Кривые Каплана-Мейера и и логарифмический ранговый критерий генерировали с использованием программного обеспечения sigma stat 3.5. Все значения P < 0,05 считались статистически значимыми.

Пример 1. Определение характеристик новой кристаллической формы соли хидамид-HCl.

Хидамид был одобрен Китайского Управления по контролю за продуктами и лекарственными средствами (CFDA) и Национальным управлением по изделиям медицинского назначения (NMPA) для лечения рецидивирующей или рефрактерной периферической Т-клеточной лимфомы (ПТКЛ) в 2014 году. Хидамид (торговое название Эипдаза®) выпускается в виде таблеток для перорального применения, содержащих 5 мг хидамида, а рекомендуемая доза составляет 30 мг дважды в неделю с интервалом более 3 дней. Таблетка содержит хидамид-АФИ, покрытый поливинилпирролидоном К30 (ПВП-K30) для улучшения его растворимости в воде и пероральной биодоступности. В настоящем изобретении были разработаны рецептуры для вещества хидамид-АФИ с целью получения солей хидамид-HCl и хидамид-H₂SO₄ в новых кристаллических формах. Свойства солей хидамид-HCl и хидамид-H₂SO₄ могут существенно улучшить растворимость в воде и пероральную биодоступность. Структуру солей хидамида идентифицировали методами ¹H-ЯМР- и ¹³C-ЯМР-спектроскопии, результаты представлены на Фигуре 1. ¹H-ЯМР-спектр регистрировали на приборе Bruker AVANCE 400MHz PLUS с использованием в качестве растворителя диметилсульфоксида (ДМСО-d₆). ¹³C-ЯМР-спектр регистрировали при 100 МГц. Данные ¹H-ЯМР-спектра продемонстрировали, что химический сдвиг δ_H 5,20 группы NH₂ анилина в соли хидамид-HCl исчезает, в отличие от вещества хидамид-АФИ, как показано на Фигуре 1, фрагменты А и В. Согласно полученным результатам, солевая форма образуется в положении C₂₁-NH₂. Ее можно обозначить как соль C₂₁-NH₃⁺ Cl^- или соль хидамид-HCl. Данные ¹³C-ЯМР-спектра вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-HCl показаны на Фигуре 1, фрагменты D и E. Подробные сведения о химическом сдвиге вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-HCl представлены в Таблице 1 и на Фигуре 1, фрагмент G. Кроме того, для определения молекулярной массы использовали метод МС (ESI). Масс-спектры соли хидамид-HCl регистрировали на приборе Bruker microTOF с источником ESI в режиме регистрации положительных/отрицательных ионов. МС-спектры (ESI) соли хидамид-HCl, полученные в режиме регистрации положительных ионов, показаны на Фигуре 2, фрагмент A. Самый распространенный пик характеризуется значением m/z 391,158 [M+H]⁺. МС-спектры (ESI) соли хидамид-HCl, полученные в режиме регистрации отрицательных ионов, показаны на Фигуре 2, фрагмент B. Самый распространенный пик характеризуется значением m/z 425,118 [M+Cl]^-. Затем определяли параметры кристаллической формы соли хидамид-HCl методом XRD. Были проанализированы различия между рентгенограммами вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-HCl. Измерения методом XRD проводили на рентгеновском дифрактометре PANalytical EMPYREAN. В качестве источника рентгеновского излучения использовали медный (Cu) (λ=45 кВ, 40 мА) анод, значения 2θ находились в диапазоне от 3° до 40°, скорость сканирования составляла 1/мин. Результаты анализа методом XRD продемонстрировали, что рентгенограммы вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-HCl отличаются, как показано на Фигуре 3, фрагменты A (хидамид-АФИ) и B (соль хидамид-HCl). Значения 2θ для вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-HCl отличались меду собой, как показано на Фигуре 3, фрагмент D. Полученные данные показали, что соль хидамид-HCl имеет новую кристаллическую форму, отличную от формы вещества хидамид-АФИ. Две разные кристаллические формы вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-HCl исследовали в рамках оценки растворимости при насыщении. Растворимость в воде соли хидамид-HCl существенно превышала растворимость веществ хидамид-АФИ и хидамид-K30, как показано в Таблице 2. Вещество хидамид-АФИ не растворялось в воде, а хидамид-K30, входящий в состав рецептуры препарата хидамида в таблетках (Эпидаза®), показал низкую растворимость в воде (около 26,03 мкг/мл). Были исследованы три независимые серии соли хидамид-HCl, которые продемонстрировали растворимость при насыщении на уровне около 554,83, 566,90 и 536,06 мкг/мл, соответственно. Полученные результаты продемонстрировали, что соль хидамид-HCl способствовала существенному улучшению растворимости в воде (более чем в 20 раз) по сравнению с веществом хидамид-K30, как показано в Таблице 2. Улучшение растворимости в воде соли хидамид-HCl может привести к повышению пероральной биодоступности, что в последствии приведет к улучшению ФК профиля и повышению противоопухолевой активности. Структуру соли хидамид-HCl дополнительно подтверждали методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), результаты представлены на Фигуре 4. ИК-спектры (FTIR) регистрировали на приборе Perkin Elmer Spotlight 200i Sp2 с системой AutoATR System (ИК-спектрометр Perkin Elmer). ИК-спектры (FTIR) снимали в диапазоне 4000 – 700 см^-1. На спектре соли хидамид-HCl отсутствовал сигнал валентных колебаний связи N-H анилина с волновым числом 3275 и 3309 см^-1, как показано на Фигуре 4, фрагмент B. Различия между данными BR-спектров вещества хидамид-АФИ (Фигура 4, фрагмент А) и соли хидамид-HCl, полученных методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), показаны на Фигуре 4, фрагмент D.

Пример 2. Определение характеристик новой кристаллической формы соли хидамид-H₂SO₄.

Вторую солевую форму хидамида получали с использованием H₂SO₄. Структуру соли хидамид-H₂SO₄ идентифицировали методами ¹H-ЯМР- и ¹³C-ЯМР-спектроскопии, результаты представлены на Фигуре 1, фрагменты C и F. ¹H-ЯМР-спектр регистрировали на приборе Bruker AVANCE 400MHz PLUS с использованием в качестве растворителя диметилсульфоксида (ДМСО-d₆). ¹³C-ЯМР-спектр регистрировали при 100 МГц. Данные ¹H-ЯМР-спектра продемонстрировали, что химический сдвиг δ_H 5,20 группы NH₂ анилина в соли хидамид-H₂SO₄ исчезает, в отличие от вещества хидамид-АФИ, как показано на Фигуре 1, фрагменты С и А. Согласно полученным результатам, солевая форма образуется в положении C₂₁-NH₂. Ее можно обозначить как соль C₂₁-NH₃⁺ HSO₄^- или соль хидамид-H₂SO₄. Подробные сведения о химическом сдвиге вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-H₂SO₄ представлены в Таблице 1 и на Фигуре 1, фрагмент G. Кроме того, для определения молекулярной массы использовали метод МС (ESI). Масс-спектры соли хидамид-H₂SO₄ регистрировали на приборе Bruker microTOF с источником ESI в режиме регистрации положительных/отрицательных ионов. МС-спектры (ESI) соли хидамид-H₂SO₄, полученные в режиме регистрации отрицательных ионов, показаны на Фигуре 2, фрагмент С. Самый распространенный пик характеризуется значением m/z 391,16 [M+H]⁺. МС-спектры (ESI) соли хидамид-H₂SO₄, полученные в режиме регистрации отрицательных ионов, показаны на Фигуре 2, фрагмент D. Самый распространенный пик характеризуется значением m/z 487,12 [M+ HSO₄]^-. Затем определяли параметры кристаллической формы соли хидамид-H₂SO₄ методом XRD. Были проанализированы различия между рентгенограммами вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-H₂SO₄. Измерения методом XRD проводили на рентгеновском дифрактометре PANalytical EMPYREAN. В качестве источника рентгеновского излучения использовали медный (Cu) (λ=45 кВ, 40 мА) анод, значения 2θ находились в диапазоне от 3° до 40°, скорость сканирования составляла 1/мин. Результаты анализа методом XRD продемонстрировали, что рентгенограммы вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-H₂SO₄ отличаются, как показано на Фигуре 3, фрагменты A (хидамид-АФИ) и B (соль хидамид-H₂SO₄). Значения 2θ для вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-H₂SO₄ отличались меду собой, как показано на Фигуре 3, фрагмент D. Полученные данные показали, что соль хидамид-H₂SO₄ имеет новую кристаллическую форму, отличную от формы вещества хидамид-АФИ. Две разные кристаллические формы вещества хидамид-АФИ и соли хидамид-H₂SO₄ исследовали в рамках оценки растворимости при насыщении. Растворимость в воде соли хидамид-H₂SO₄ существенно превышала растворимость веществ хидамид-АФИ и хидамид-K30, как показано в Таблице 2. Вещество хидамид-АФИ не растворялось в воде, а хидамид-K30, входящий в состав рецептуры препарата хидамида в таблетках (Эпидаза®), показал низкую растворимость в воде (около 26,03 мкг/мл). Были исследованы три независимые серии соли хидамид-H₂SO₄, которые продемонстрировали растворимость при насыщении на уровне около 597,39, 652,90 и 561,5 мкг/мл, соответственно. Полученные результаты продемонстрировали, что соль хидамид-H₂SO₄ способствовала существенному улучшению растворимости в воде (более чем в 20 раз) по сравнению с веществом хидамид-K30, как показано в Таблице 2. Улучшение растворимости в воде соли хидамид-H₂SO₄ может привести к повышению пероральной биодоступности, что в последствии приведет к улучшению ФК профиля и повышению противоопухолевой активности. Структуру соли хидамид-H₂SO₄ дополнительно подтверждали методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), результаты представлены на Фигуре 4, фрагмент С. ИК-спектры (FTIR) регистрировали на приборе Perkin Elmer Spotlight 200i Sp2 с системой AutoATR System (ИК-спектрометр Perkin Elmer). ИК-спектры (FTIR) снимали в диапазоне 4000 – 700 см^-1. На спектре соли хидамид-H₂SO₄ отсутствовал сигнал валентных колебаний связи N-H анилина с волновым числом 3412 и 3309 см^-1, как показано на Фигуре 4, фрагмент С. Различия между данными ИК-спектров вещества хидамид-АФИ (Фигура 4, фрагмент А) и соли хидамид-H₂SO₄ показаны на Фигуре 4, фрагмент D.

Пример 3. Определение характеристик новой аморфной формы целекоксиб-Na соли.

Аморфные формы характеризуются наличием ближнего молекулярного порядка, в отличие от кристаллических форм с дальним порядком молекулярной упаковки. Целекоксиб был отнесен к классу II БКС (биофармацевтическая классификационная система). Он характеризовался низкой растворимостью и высокой проницаемостью. Большинство коммерческих лекарственных препаратов обладают приемлемым уровнем проницаемости; растворение является стадией, ограничивающей скорость абсорбции этих препаратов. С другой стороны, в рамках разработки лекарственного препарата растворимость являлась одним из важных вопросов; приготовление аморфной формы обеспечивает эффективное решение проблемы низкой растворимости. Была выполнена разработка и испытания уникального способа получения аморфной формы целекоксиб-Na соли. В условиях воздействия сильного основания NaH произошла замена водорода в сульфонамидной группе вещества целекоксиб-АФИ на Na, и через нескольких стадий, включая очистку и конденсацию, была получена новая аморфная целекоксиб-Na соль. В первую очередь сравнивали ¹H-ЯМР-спектры вещества целекоксиб-АФИ и целекоксиб-Na соли, которые показаны на Фигуре 5, фрагменты A и 5B. Было однозначно показано, что два сигнала, соответствующие водороду в сульфонамиде, исчезли, см. Фигура 5, фрагмент В. Было высказано предположение, что два атома Na заменили два атома водорода сульфонамидной группы участвуют в образовании новой целекоксиб-Na соли. Данные ¹H-ЯМР-спектра (400 МГц, CDCl₃) вещества целекоксиб-АФИ: δ 2,36 (3H, s), 4,86 (2H, s), 6,72 (1H, s), 7,09 (2H, dd), 7,16 (2H, d), 7,46 (2H, m), 7,89 (2H, m). Данные ¹H-ЯМР-спектра (400 МГц, CDCl₃) целекоксиб-Na соли: δ 2,09 (3H, s), 6,59 (1H, s), 6,87 (4H, s), 6,94 (2H, d), 7,61 (2H, d). Данные ¹H-ЯМР-спектра продемонстрировали, что химический сдвиг δ_H 4,86 группы NH₂ сульфонамида в целекоксиб-Na соли исчезает, в отличие от вещества целекоксиб-АФИ, как показано на Фигуре 5, фрагменты В и А. Кроме того, данные ¹³C-ЯМР-спектра показаны на Фигуре 5, фрагменты C, D и E. Затем для оценки молекулярной массы целекоксиб-Na соли использовали метод МС (FAB), данные представлены на Фигуре 6. Масс-спектры целекоксиб-Na соли регистрировали на приборе JEOL JMS-700 с источником FAB в режиме регистрации положительных ионов. Согласно полученным данным, экспериментальное значение m/z составляло 426,1 [M+H⁺]. Было высказано предположение, что формула целекоксиб-Na соли – C₁₇H₁₂F₃N₃Na₂O₂S, а молекулярная масса составляет 425,04. Расчетное значение m/z для C₁₇H₁₂F₃N₃Na₂O₂S составляло 425,04, экспериментальное – 426,1 (M+H)⁺ (метод МС (FAB)). Данные повторно подтвердили, что целекоксиб-Na соль содержит два атома натрия вместо двух атомов водорода. Затем оценивали растворимость в воде аморфной целекоксиб-Na соли. Как показано в Таблице 3, вещество целекоксиб-АФИ не растворялось в воде, а целекоксиб в капсулах (Целебрекс®) был слабо растворим в воде (около 1,19 мкг/мл). Были исследованы три независимые серии аморфной формы целекоксиб-Na соли, которые продемонстрировали растворимость при насыщении на уровне около 54,72, 54,45 и 56,72 мкг/мл, соответственно. Растворимость в воде целекоксиб-Na соли, в отличие от растворимости вещества целекоксиб-АФИ и целекоксиба в капсулах, существенно улучшилась. Полученные результаты свидетельствуют о том, что улучшенная растворимость в воде аморфной формы целекоксиб-Na соли может способствовать повышению пероральной биодоступности и, как следствие, терапевтической эффективности. Кроме того, как показано на Фигуре 7, согласно результатам анализа методом XRD, веществу целекоксиб-АФИ соответствует специфическая рентгенограмма (Фигура 7, фрагмент A), а аморфной целекоксиб-Na соли соответствует аморфная рентгенограмма, как показано на Фигуре 7, фрагмент B. Полученные результаты свидетельствуют о том, что аморфная целекоксиб-Na соль характеризуется специфической формой в сочетании с существенным улучшением растворимости в воде при насыщении. Многие исследования были посвящены получению аморфной формы целекоксиба при использовании различных полимеров в качестве носителей. Структуру аморфной целекоксиб-Na соли повторно подтверждали методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), результаты представлены на Фигуре 8. На спектре аморфной целекоксиб-Na соли отсутствовал сигнал валентных колебаний связи N-H сульфонамида с волновым числом 3234 и 3341 см^-1, как показано на Фигуре 8, фрагменты А и В. Различия между данными ИК-спектров вещества целекоксиб-АФИ и аморфной целекоксиб-Na соли, полученных методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), показаны на Фигуре 8, фрагмент D.

Таблица 3. Растворимость вещества целекоксиб-АФИ, целекоксиба в капсулах и целекоксиб-Na соли (аморфная или кристаллическая форма) при насыщении

Вещества Растворимость при насыщении (мкг/мл) Целекоксиб-АФИ НПО Целекоксиб в капсулах (Целебрекс®) 1,19±0,05 Целекоксиб-Na соль № 1903261 (аморф.) 54,72±1,0 Целекоксиб-Na соль № 1903262 (аморф.) 54,45±1,8 Целекоксиб-Na соль № 1903263 (аморф.) 56,72±0,8 Целекоксиб-Na соль № 190307 (крист.) 111,5±5,7 Целекоксиб-Na соль № 1903282 (крист.) 133,63±1,8 Целекоксиб-Na соль № 1903283 (крист.) 95,34±5,7

*НПО: ниже предела обнаружения

аморф.: аморфная форма; крист.: кристаллическая форма

Пример 4. Определение характеристик кристаллической формы целекоксиб-Na соли.

После приготовления определяли характеристики кристаллической целекоксиб-Na соли методами ¹H-ЯМР, ¹³C-ЯМР, XRD, МС, FTIR. Как показано в Таблице 3, растворимость в воде кристаллической формы целекоксиб-Na соли из трех разных серий составляет около 111,5, 133,63 и 95,34 мкг/мл. Как показано на Фигуре 7, фрагменты C и D, рентгенограмма кристаллической целекоксиб-Na соли отличается от рентгенограммы вещества целекоксиб-АФИ. Полученные результаты свидетельствуют о том, что кристаллическая целекоксиб-Na соль характеризуется специфической кристаллической формой, которая способствует существенному улучшению растворимости в воде. Структуру кристаллической целекоксиб-Na соли повторно подтверждали методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), результаты представлены на Фигуре 8, фрагмент С. На спектре целекоксиб-Na соли, в отличие от спектра вещества целекоксиб-АФИ, отсутствовал сигнал валентных колебаний связи N-H сульфонамида с волновым числом 3234 и 3341 см^-1, как показано на Фигуре 8, фрагмент С и D.

Пример 5. Сравнение противоопухолевой активности вещества хидамид-К30 и соли хидамид-HCl в сочетании с целекоксибом в капсулах и антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26

Чтобы выяснить, будет ли способствовать применение солевой формы хидамида повышению эффективности ингибирования роста опухоли, была проведена оценка терапевтического эффекта от воздействия комбинации хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сравнении с комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг; партия № 640517M1) у мышей, несущих опухоль CT26. Как показано на Фигуре 9, на 11 день размер опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, увеличился до около 200 – 250 мм³. Затем мышей лечили по 6 различным схемам, как показано далее. Как показано на Фигуре 9, фрагмент А, комбинация вещества хидамид-К30 в (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 способствовала существенному повышению эффективности ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль CT26, в сравнении с группой антител к PD-1. Результаты применения комбинации соли хидамид-HCl в дозировке 12,5, 25 или 50 мг/кг и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 также показали существенное повышение эффективности ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль CT26, в сравнении с группой антител к PD-1. В рамках сравнения противоопухолевой активности солевой формы хидамида и вещества хидамид-К30, эффективность оценивали согласно системе классификации, представленной далее. В настоящем исследовании определяли полный ответ (CR, увеличение размера опухоли у мышей, несущих опухоль, в ≤ 0,5 раз в конце лечения); частичный ответ (PR, увеличение размера опухоли у мышей, несущих опухоль, в диапазоне от > 0,5 до ≤ 2 раз в конце лечения); стабильное заболевание (SD, увеличение размера опухоли у мышей, несущих опухоль, в диапазоне от 2 до 5 раз конце лечения); прогрессирующее заболевание (PD, увеличение размера опухоли у мышей, несущих опухоль, в 5 или более раз, в конце лечения).

Как показано на Фигуре 9, фрагмент B, комбинация соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг) еще более эффективна в отношении воздействия на процесс ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль CT26, в сравнении с комбинацией вещества хидамид-К30 (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1. Лечение с применением комбинации вещества хидамид-К30 (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 привело к следующим результатам: 6 мышей с CR (60%) и 4 мыши с PD и умеренным ростом опухоли; лечение с применением комбинации соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и соли целекоксиб-HCl (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 позволило достигнуть 89% положительного клинического ответа у 5 мышей с PR и 3 мышей с CR (мыши с PD отсутствовали). Полученные результаты свидетельствуют о том, что эффективность соли хидамид-HCl была выше эффективности вещества хидамид-К30 благодаря лучшей растворимости в воде и пероральной биодоступности и, как следствие, терапевтической эффективности. Как показано на Фигуре 9, фрагмент А и В, в сочетании с антителами к PD-1, комбинации соли хидамид-HCl (12,5 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) было достаточно, чтобы оказать воздействие на микроокружение опухоли и реактивировать цитотоксические Т-лимфоциты для уничтожения опухоли. Как показано на Фигуре 9, фрагмент С, ни у одной из мышей в группах лечения не наблюдалось потери массы тела. После прекращения лечения на 26 день опухоль у мышей, несущих опухоль CT26, росла быстрее в контрольной группе IgG. Тем не менее, схема с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек демонстрировала высокую эффективность в отношении воздействия на процесс ингибирования роста опухоли и, таким образом, способствовала существенному увеличению показателей выживаемости (Фигура 9, фрагмент D). Как показано на Фигуре 9, фрагмент D, комбинация соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 способствовала существенному увеличению показателей выживаемости до около 77,7%, однако комбинация вещества хидамид-K30 (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 позволила достигнуть только 60% выживаемости на модели с участием мышей, несущих опухоль CT26. Примечательно, что комбинация соли хидамид-HCl (25 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами PD-1 способствовала существенному увеличению показателей выживаемости до около 66,6%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиба в капсулах была эффективнее комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в отношении контроля и регуляции микроокружения опухоли и, в некоторой степени, повышения эффективности иммунотерапии.

Настоящее исследование также доказало, что комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиба в капсулах в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек была эффективнее комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в отношении повышения скорости формирования противоопухолевого иммунного ответа. С другой стороны, прямое сравнение между комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиба в капсулах и комбинацией вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировало, что противоопухолевая активность при реализации комбинированной схемы с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли выше противоопухолевой активности при реализации комбинированной схемы с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах.

Пример 6. Сравнение противоопухолевой активности комбинации вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах и комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 у мышей, несущих опухоль СТ26

Чтобы продемонстрировать повышение эффективности ингибирования роста опухоли, была проведена оценка терапевтического эффекта от воздействия комбинации хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сравнении с комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг; партия № 640517M1) у мышей, несущих опухоль CT26. Как показано на Фигуре 10, лечение в каждой группе начинали на 10 день, когда размер опухоли у мышей, несущих опухоль СТ26, увеличивался до около 200 – 250 мм³. В первую очередь, комбинация вещества хидамид-К30 (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 способствует существенному повышению эффективности ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль CT26, в сравнении с группой антител к PD-1 (Фигура 10, фрагмент А). Результаты применения комбинации соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и аморфной целекоксиб-Na соли в дозировке 12,5, 25 и 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 показали существенное повышение эффективности ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль CT26, в сравнении с группой антител к PD-1 (Фигура 10, фрагмент А). Как показано на Фигуре 10, фрагмент B, комбинация соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и аморфной целекоксиб-Na соли в разных дозировках в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг) еще более эффективна в отношении воздействия на процесс ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль CT26, в сравнении с комбинацией вещества хидамид-К30 (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг). Полученные результаты свидетельствуют о том, что соль хидамид-HCl и целекоксиб-Na соль были эффективнее вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах благодаря лучшей растворимости в воде и пероральной биодоступности, а также, как следствие, терапевтической эффективности солевых форм.

Как показано на Фигуре 10, фрагменты А и В, соли хидамид-HCl (50 мг/кг) в сочетании с целекоксиб-Na солью (12,5 мг/кг) было достаточно, чтобы оказать воздействие на микроокружение опухоли и реактивировать цитотоксические Т-лимфоциты для уничтожения опухоли. Прямое сравнение противоопухолевой активности между одинаковыми дозировками (50 мг/кг) комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах (4 мыши с CR, 50%) и комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг) показало, что последняя схема с применением комбинации солевых форм обладала большей эффективностью ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль CT26, при этом присутствовали 7 мышей с CR (100%), как показано на Фигуре 10, фрагмент B. Кроме того, как показано на Фигуре 10, фрагмент C, долю животных без опухолей (CR) оценивали в разных группах лечения. В сочетании с антителами к PD-1, все схемы с применением солевых форм были эффективнее (характеризовались более высокой долей случаев с отсутствием опухоли) схем с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в отношении ингибирования роста опухоли. Полученные результаты свидетельствуют о том, что целекоксиб-Na соль была эффективнее целекоксиба в капсулах в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек в отношении ингибирования роста опухоли у мышей, несущих опухоль CT26. Аналогичный результат был продемонстрирован для хидамида-HCl при сравнении с веществом хидамид-К30. Это открытие также продемонстрировало, что дозировка комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли может быть снижена при ее применении в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек для реактивации цитотоксических Т-лимфоцитов в микроокружении опухоли и последующего ингибирования роста опухоли, как показано на Фигуре 10, фрагмент A и B. Как показано на Фигуре 10, фрагмент D, ни у одной из мышей в группах лечения не наблюдалось потери массы тела.

После прекращения лечения на 25 день опухоль у мышей, несущих опухоль CT26, росла быстрее в контрольной группе IgG (2,5 мг/кг; партия № 65481701). Как показано на Фигуре 10, фрагмент E, в сочетании с антителами к PD-1, комбинация соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг) способствовала существенному увеличению показателей выживаемости до около 100% в сравнении с комбинацией вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах (около 75%) у мышей, несущих опухоль CT26. Выживаемость в группе антител к PD-1 составила всего 37,5%. Полученные результаты свидетельствуют о том, что комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли была эффективнее комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в отношении контроля и регуляции микроокружения опухоли и, в некоторой степени, повышения скорости формирования иммунного ответа. В конечном итоге, схема с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек демонстрировала высокую эффективность в отношении воздействия на процесс ингибирования роста опухоли и, таким образом, способствовала существенному увеличению показателей выживаемости (Фигура 10, фрагмент E). Настоящее исследование доказало, что комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек была эффективнее комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в отношении повышения скорости формирования противоопухолевого иммунного ответа. С другой стороны, прямое сравнение между комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли и комбинацией вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировало, что противоопухолевая активность при реализации комбинированной схемы с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли выше противоопухолевой активности при реализации комбинированной схемы с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах.

Пример 7 Подтверждение оптимальных дозировок, соответствующих терапевтическому ответу на комбинацию соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1, и оценка терапевтического ответа на комбинацию соли хидамид-H₂SO₄ и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1, возникающего у мышей, несущих опухоль СТ26

Для проверки оптимальных дозировок, соответствующих терапевтическому ответу на комбинацию соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1, возникающему у мышей, несущих опухоль СТ26, мышей с опухолями размером около 300 мм³ лечили с применением разных дозировок комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1. Как показано на Фигуре 11, фрагмент А, комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в дозировке 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг; партия № 717918D1) действовала эффективнее, чем аналогичные комбинации в дозировке 25 мг/кг и 12,5 мг/кг. Полученные результаты свидетельствуют о том, что комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в дозировках 25 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг) и комбинация вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в дозировках 50 мг/кг в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг) соответствовали схожему терапевтическому ответу. Было высказано предположение, что комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сравнении с комбинацией вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в аналогичной дозировке в сочетании с антителами к PD-1 обладала более высокой противоопухолевой активностью у мышей, несущих опухоль СТ26. Кроме того, в сочетании с антителами к PD-1, комбинация соли хидамид-HCl и кристаллической целекоксиб-Na соли в сравнении с комбинацией соли хидамид-HCl и аморфной целекоксиб-Na соли в аналогичной дозировке обладала меньшей противоопухолевой активностью у мышей, несущих опухоль СТ26, как показано на Фигуре 11, фрагмент В. С другой стороны, комбинация соли хидамид-H₂SO₄ и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 обладала очень высокой противоопухолевой активностью, подобной противоопухолевой активности комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1, как показано на Фигуре 11, фрагмент B. В настоящем исследовании, поскольку средний объем опухолей достигал около 300 мм³ до применения различных видов лечения, а активность антител к белкам PD-1 была ниже по сравнению с предыдущими исследованиями, противоопухолевый терапевтический эффект лечения с применением антител к PD-1 был существенно хуже. Как показано на Фигуре 11, фрагмент B, в настоящем исследовании оптимальная дозировка комбинации соли хидамид-HCl (50 мг/кг) или соли хидамид-H₂SO₄ (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг /кг) соответствовала наилучшему терапевтическому ответу. Кроме того, применение аморфной целекоксиб-Na соли в сравнении с применением кристаллической целекоксиб-Na соли в рамках комбинированной схемы позволило достигнуть более высоких уровней положительного клинического ответа. Когда размер опухоли достигал в среднем около 300 мм³ до начала лечения, применение комбинации вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 позволяло достигнуть только около 33% положительного клинического ответа. Однако комбинация соли хидамид-HCl или соли хидамид-H₂SO₄ и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 способствовала существенному увеличению уровней положительного клинического ответа до 62,5% и 55,5%, соответственно. Полученные результаты демонстрировали, что у мышей, несущих опухоль СТ26, солевые формы хидамида и целекоксиба, в отличие от вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах, более эффективно способствовали повышению скорости формирования иммунного ответа. Как показано на Фигуре 11, фрагмент С, ни у одной из мышей в группах лечения не наблюдалось потери массы тела.

После прекращения лечения на 26 день опухоль у мышей, несущих опухоль CT26, росла быстрее в контрольной группе IgG. Тем не менее, схема с применением комбинации соли хидамид-HCl или соли хидамид-H₂SO₄ и целекоксиб-Na соли в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек демонстрировала высокую эффективность в отношении воздействия на процесс ингибирования роста опухоли и, таким образом, способствовала существенному увеличению показателей выживаемости (Фигура 11, фрагмент D). Как показано на Фигуре 11, фрагмент D, в рамках настоящего исследования комбинация вещества хидамид-K30 (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 способствовала увеличению показателей выживаемости до около 22%, поскольку противоопухолевая активность антител к PD-1 в сравнении с предыдущими результатами была ниже. С другой стороны, комбинация соли хидамид-HCl или соли хидамид-H₂SO₄ (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 способствовала существенному увеличению показателей выживаемости до около 37,5% или 44,4%, соответственно, у мышей, несущих опухоль CT26. Полученные результаты свидетельствуют о том, что комбинация соли хидамид-HCl или соли хидамид-H₂SO₄ и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 была эффективнее комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 в отношении контроля и регуляции микроокружения опухоли и, в некоторой степени, повышения скорости формирования иммунного ответа. Настоящее исследование также доказало, что комбинация соли хидамид-HCl или соли хидамид-H₂SO₄ и целекоксиб-Na соли в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек была эффективнее комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек в отношении повышения скорости формирования противоопухолевого иммунного ответа. С другой стороны, прямое сравнение между комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли и комбинацией вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировало, что противоопухолевая активность при реализации комбинированной схемы с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли выше противоопухолевой активности при реализации комбинированной схемы с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах.

Пример 8. Преодоление резистентности в отношении терапии первой линии с применением антител к PD-1 путем включения в терапию второй линии с применением антител к PD-1/антител к CTLA-4 в сочетании с комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли у мышей, несущих опухоль СТ26

В настоящем исследовании мыши проходили терапию второй линии для имитации процесса лечения резистентности, возникающей у людей, больных раком, в отношении лекарственных препартов, применяемых в терапии первой линии с применением антител к PD-1, для оценки противоопухолевой активности в рамках терапии второй линии с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1/антителами к CTLA-4 в случаях, когда терапия первой линии с применением антител к PD-L1 оказалась неэффективной. Оценивали, может ли комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли способствовать повышению чувствительности ингибиторов иммунных контрольных точек посредством регуляции микроокружения опухоли. Опухоли росли в течение 8 дней (средний размер опухоли около 120 мм³) перед началом терапии первой линии с применением антител к PD-1 (2,5 мг/кг; партия № 717918D1), которые вводили дважды (интервал между двумя введениями – 3 дня). Когда опухоли соответствовали критериям неудачи терапии, что означало постепенное трехкратное увеличение размера в течение 3 дней (средний размер опухоли – 360 мм³) после второй дозы антител к PD-1 в рамках терапии первой линии, а объемы опухоли составляли < 600 мм³, мышей повторно включали в исследование . Мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-1, дополнительно рандомизировали. Использовали десять различных схем лечения (n=9 – 11 мышей/группа). Мышей рандомизировали по разным группам терапии второй линии, включая группу антител IgG (2,5 мг/кг; партия № 65481701), группу антител к PD-1 (2,5 мг/кг; партия № 717918D1), положительную контрольную группу энтиностата (20 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг), группу комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах, группу комбинации соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг), группу комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1, группу комбинации соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг), группу антител к CTLA-4 (2,5 мг/кг; партия № 702418A2B), группу комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к CTLA-4 (2,5 мг/кг), группу комбинации соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг) в сочетании с антителами к CTLA-4 (2,5 мг/кг). Антитела вводили интраперитонеально шесть раз (интервал между двумя инъекциями – 3 дня). Энтиностат вводили перорально восемь раз (каждые 2 дня). Комбинацию вещества хидамид-K30 или соли хидамид-HCl и целекоксиба в капсулах или целекоксиб-Na соли вводили перорально 16 раз (ежедневно). Как показано на Фигуре 12, фрагменты А и В, в группе антител к PD-1 отсутствовали мыши с PR (положительный клинический ответ – 0%), при этом было 8 мышей с PD и быстрым ростом опухоли. Лечение с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли было эффективнее лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в отношении ингибирования роста опухоли. В группе лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли присутствовали 3 мыши с CR и 4 мыши с PD и быстрым ростом опухоли (положительный клинический ответ – 33,3%). Тем не менее, в группе лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах присутствовала только 1 мышь с PR и 8 мышей с PD и быстрым ростом опухоли (положительный клинический ответ – 10%). В группе лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 присутствовали 4 мыши с CR (положительный клинический ответ – 36,3%) и 6 мышей с PD и гораздо более медленным ростом опухоли. Тем не менее, в группе лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 присутствовала только 1 мышь с PR и 9 мышей с PD и умеренным ростом опухоли (положительный клинический ответ – 10%). Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии противоопухолевой активности антител к PD-1 у мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-1. Более того, схема с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли демонстрировала высокую эффективность в отношении контроля микроокружения опухоли и повышения чувствительности к антителам к PD-1 у мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-1. Лечение с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сравнении с лечением с применением комбинации солевых форм (соль хидамид-HCl и целекоксиб-Na соль) продемонстрировало гораздо меньшую противоопухолевую активность. Как показано на Фигуре 12, фрагмент B, группа антител к CTLA-4 в сравнении с группой антител к PD-1 демонстрировала умеренные темпы ингибирования роста опухоли; отсутствовали мыши с CR или PR, при этом было 7 мышей с PD и умеренным ростом опухоли. Тем не менее, в группе лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к CTLA-4 было 4 мыши с CR, 2 мыши с PR (положительный клинический ответ – 60%), при этом мыши с PD отсутствовали. В группе лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к CTLA-4 присутствовали 2 мыши с CR, 1 мышь с PR (положительный клинический ответ – 25%) и 5 мышей с PD и умеренным ростом опухоли. В положительной контрольной группе энтиностата в сочетании с антителами к PD-1 присутствовала 1 мышь с PR (положительный клинический ответ – 9%) и 8 мышей с PD и быстрым ростом опухоли. Можно заключить, что схема лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли была эффективной в отношении повышения скорости формирования иммунного ответа у мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-1. Кроме того, комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли была эффективнее в сочетании с антителами к CTLA-4, чем в сочетании с антителами к PD-1 в отношении повышения скорости формирования иммунного ответа у мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-1.

После прекращения лечения на 31 день опухоли у мышей, несущих опухоль CT26, росли быстрее в группах антител к PD-1 и антител к CTLA-4 (Фигура 12, фрагмент D). Выживаемость оценивали на 60 день. Лечение с применением комбинации вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах без антител к PD-1 в сравнении с лечением в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировало лучшие показатели выживаемости; значения составили 11,1% и 0%, соответственно. Лечение с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли без антител к PD-1 в сравнении с лечением в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировало лучшие показатели выживаемости; значения составили 44% и 40%, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что после прекращения лечения комбинация вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах или комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 неожиданно соответствовали более быстрому росту опухоли, чем комбинация вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах или комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли. Настоящее исследование также доказало, что комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к CTLA-4 была эффективнее комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 в отношении повышения скорости формирования противоопухолевого иммунного ответа. Однако комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к CTLA-4 была эффективнее комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к CTLA-4 в отношении воздействия на процесс ингибирования роста опухоли; при этом показатели выживаемости составили 77,8%% и 41,6%, соответственно (Фигура 12, фрагмент D). С другой стороны, прямое сравнение между комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли и MS-275 в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировало, что противоопухолевая активность при реализации комбинированной схемы с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли выше противоопухолевой активности при реализации комбинированной схемы с применением MS-275 в условиях резистентности в отношении антител к PD-1.

Пример 9. Преодоление резистентности в отношении терапии первой линии с применением антител к PD-L1 путем включения в терапию второй линии с применением антител к PD-1/антител к CTLA-4 в сочетании с комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли у мышей, несущих опухоль СТ26

В настоящем исследовании дополнительно исследовали комбинированную терапию второй линии касательно частоты возникновения резистентности в отношении лекарственных препаратов после проведения терапии первой линии с применением антител к PD-L1, а также оценивали противоопухолевую активность в рамках терапии второй линии с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1/антителами к CTLA-4 в случаях, когда терапия первой линии с применением антител к PD-L1 оказалась неэффективной. Проверяли может ли комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли способствовать повышению чувствительности ингибиторов иммунных контрольных точек посредством регуляции микроокружения опухоли после обнаружения резистентности в отношении терапии первой линии с применением антител к PD-L1. Мыши, несущие опухоль СТ26 (средний объем опухоли – около 160 мм³) проходили терапию первой линии с применением антител к PD-L1 (2,5 мг/кг; партия № 720619F1), которые вводили дважды (интервал между двумя инъекциями – 3 дня). Когда опухоли соответствовали критериям неудачи терапии, что означало постепенное трехкратное увеличение размера в течение 3 дней (средний размер опухоли – 320 мм³) после второй дозы антител к PD-L1 в рамках терапии первой линии, а объемы опухоли составляли < 600 мм³, мышей повторно включали в исследование . Мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-L1, дополнительно рандомизировали. Использовали десять различных схем лечения (n=9 – 11 мышей/группа). Мышей рандомизировали по разным группам терапии второй линии, включая группу антител IgG (2,5 мг/кг; партия № 65481701), группу антител к PD-1 (2,5 мг/кг; партия № 717918D1), положительную контрольную группу комбинации энтиностата (20 мг/кг) и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг), группу комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах, группу комбинации соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг), группу комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1, группу комбинации соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг) в сочетании с антителами к PD-1 (2,5 мг/кг), группу антител к CTLA-4 (2,5 мг/кг; партия № 702418A2B), группу комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к CTLA-4 (2,5 мг/кг), группу комбинации соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг) в сочетании с антителами к CTLA-4 (2,5 мг/кг). Антитела вводили интраперитонеально шесть раз (каждые 3 дня). Энтиностат вводили перорально восемь раз (каждые 2 дня). Комбинацию вещества хидамид-K30 или соли хидамид-HCl и целекоксиба в капсулах или целекоксиб-Na соли вводили перорально 16 раз (ежедневно). Как показано на Фигуре 13, фрагменты A и B, в контрольной группе антител IgG присутствовали 2 мыши с PR и 3 мыши с PD и быстрым ростом опухоли (положительный клинический ответ – 28,6%), это было связано с тем, что мыши, реагирующие на терапию первой линии с применением антител к PD-L1, были ошибочно приняты за резистентных в отношении антител к PD-L1 из-за отсроченного ответа на терапию первой линии. Тем не менее, в группе антител к PD-1 присутствовала 1 мышь с PR, 2 мыши с CR и 3 мыши с PD и быстрым ростом опухоли (положительный клинический ответ – 33,3%). Лечение с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли было более эффективнее лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в отношении ингибирования роста опухоли. В группе лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли было 6 мышей с CR, 1 мышь с PR, при этом мыши с PD отсутствовали (положительный клинический ответ – 70%). Тем не менее, в группе лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах присутствовали 2 мыши с CR, 4 мыши с PR и 3 мыши с PD и быстрым ростом опухоли (положительный клинический ответ – 54,5%). В группе лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 присутствовали 6 мышей с CR (положительный клинический ответ – 66,6%) и 1 мышь с PD и медленным ростом опухоли. Тем не менее, в группе лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 присутствовали 4 мыши с CR, 1 мышь с PR (положительный клинический ответ – 62,5%) и 1 мышь с PD и быстрым ростом опухоли. Полученные данные свидетельствуют о том, что схема лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли была эффективнее схемы лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в отношении контроля микроокружения опухоли и повышения чувствительности к антителам к PD-1 у мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-L1.

Как показано на Фигуре 13, фрагмент B, терапия второй линии с применением антител к CTLA-4 способствовала существенному повышению эффективности ингибирования роста опухоли, при этом присутствовали 2 мыши с CR, 3 мыши с PR и 3 мыши с PD и быстрым ростом опухоли (положительный клинический ответ – 55,5%). Тем не менее, в группе лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к CTLA-4 было 4 мыши с CR, 3 мыши с PR, при этом мыши с PD отсутствовали (положительный клинический ответ – 77,7%). В группе лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к CTLA-4 присутствовали 2 мыши с CR, 3 мыши с PR и 1 мышь с PD и быстрым ростом опухоли (положительный клинический ответ – 55,5%). В положительной контрольной группе лечения с применением комбинации энтиностата и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 присутствовали 2 мыши с CR, 1 мышь с PR и 3 мыши с PD и быстрым ростом опухоли (положительный клинический ответ – 50 %). Можно заключить, что схема лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли была эффективной в отношении повышения скорости формирования иммунного ответа у мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-L1. Настоящее исследование доказало, что комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек была эффективнее комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с ингибитором иммунных контрольных точек в отношении повышения скорости формирования иммунного ответа у мышей, проявляющих резистентность в отношении антител к PD-L1.

После прекращения лечения на 31 день опухоли у мышей, несущих опухоль CT26, росли быстрее в группах антител к PD-1 и антител к CTLA-4 (Фигура 13, фрагмент D). Выживаемость оценивали на 62 день. Лечение с применением комбинации вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 в сравнении с лечением без использования антител к PD-1 продемонстрировало лучшие показатели выживаемости; значения составили 62,5% и 27,2%, соответственно. Лечение с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1 в сравнении с лечением без использования антител к PD-1 продемонстрировало лучшие показатели выживаемости; значения составили 77% и 44%, соответственно. Полученные результаты свидетельствуют о том, что после прекращения лечения комбинация вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах или комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли неожиданно соответствовали более быстрому росту опухоли, чем комбинация вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах или комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к PD-1. Настоящее исследование также доказало, что комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к CTLA-4 была эффективна в отношении повышения скорости формирования противоопухолевого иммунного ответа. Однако комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли в сочетании с антителами к CTLA-4 была эффективнее комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к CTLA-4 в отношении воздействия на процесс ингибирования роста опухоли; при этом показатели выживаемости составили 66,6%% и 44,4%, соответственно (Фигура 13, фрагмент D). С другой стороны, прямое сравнение между комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли и комбинацией MS-275 и целекоксиба в капсулах в сочетании с антителами к PD-1 продемонстрировало, что противоопухолевая активность при реализации комбинированной схемы с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли выше противоопухолевой активности при реализации комбинированной схемы с применением комбинации MS-275 и целекоксиба в капсулах в условиях резистентности в отношении антител к PD-L1.

Пример 10 Исследование фармакокинетического (ФК) профиля соли хидамид-HCl в сочетании с целекоксиб-Na солью на самцах крыс линии Вистар

Комбинация соли хидамид-HCl и аморфной целекоксиб-Na соли отдельно или в сочетании с антителами к PD-1 обладала очень высокой противоопухолевой активностью. Поэтому проводили исследования ФК профиля соли хидамид-HCl в сочетании с целекоксиб-Na солью в сравнении с веществом хидамид-K30 в сочетании с целекоксибом в капсулах на крысах линии Вистар. Как показано на Фигуре 14, фрагмент А, анализировали профили зависимости концентрации хидамида в крови от времени для соли хидамид-HCl (50 мг/кг) и вещества хидамид-K30 (50 мг/кг) при пероральном введении крысам линии Вистар. Согласно результатам, представленным в Таблице 4, значения C_max и T_max хидамида для солевой формы существенно изменились. В группе соли хидамид-HCl значение C_max составляло 2065,2 нг/мл, а T_max – 0,14 ч. Однако в группе вещества хидамид-К30 значение C_max составляло 786,3 нг/мл, а Т_max – 0,39 ч. Наблюдалось существенное увеличение скорости абсорбции соли хидамид-HCl в сравнении со скоростью адсорбции вещества хидамид-К30. Тем не менее, значения AUC, MRT и T_1/2 существенно не изменились, как показано в Таблице 4. Полученные результаты свидетельствуют о том, что соль хидамид-HCl быстрее абсорбировалась и достигала более высоких значений C_max, при этом не способствовала увеличению общего количества хидамида в системе кровообращения по сравнению с вариантом применения вещества хидамид-K30 у крыс линии Вистар. Как показано на Фигуре 14, фрагмент В, анализировали профили зависимости концентрации целекоксиба в крови от времени для соли целекоксиб-Na соли (50 мг/кг) и целекоксиба в капсулах (50 мг/кг) при пероральном введении крысам линии Вистар. Полученные результаты свидетельствуют о том, что значения T_max, C_max, AUC (площадь под фармакокинетической кривой), AUMC (площадь под первым моментом фармакокинетической кривой), MRT (среднее время удержания препарата) и T_1/2, полученные на крысах линии Вистар, существенно не отличались после перорального введения целекоксиб-Na соли и целекоксиба в капсулах, как показано в Таблице 5.

Затем были проанализированы различия между ФК профилями хидамида на примере комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли и комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах в дозировке 50 мг/кг при пероральном введении крысам линии Вистар. Как показано на Фигуре 14, фрагмент C и в Таблице 4, значения C_max хидамида были существенно повышены в группе лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли, по сравнению с группой лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах; значения составляли около 2244,5 и 862,3 нг/мл, соответственно. Как показано в Таблице 4, значения Т_max хидамида были существенно снижены в группе лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли, по сравнению с группой лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах; значения составляли около 0,14 и 0,25 ч, соответственно. Значения AUC хидамида были немного повышены в группе лечения с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли, по сравнению с группой лечения с применением комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах; значения составляли около 5977 и 4201 нг·ч/мл, соответственно. Аналогичные результаты сравнения значений AUMC двух комбинаций показаны в Таблице 4. Значения MRT и T_1/2 демонстрировали отсутствие различий между двумя группами, как показано в Таблице 4. Результаты сравнения ФК профилей соли хидамид-HCl и комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли показали небольшие изменения, см. Фигура 14, фрагмент E и Таблицу 4. Было высказано предположение, что присутствие целекоксиб-Na соли, при лечении с применением комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли, не оказывало существенного влияния на ФК профиль хидамида с точки зрения ADME (абсорбция, распределение, метаболизм и экскреция). При этом на значения AUC хидамида оказывалось некоторое влияние; значения AUC в группах лечения с применением соли хидамид-HCl и комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли составляли около 4113 и 5977 нг/мл, соответственно, как показано в Таблице 4.

С другой стороны, ФК профиль целекоксиба существенно не изменился при сравнении комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах и комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли (50 мг/кг) при пероральном введении крысам линии Вистар, как показано на Фигуре 14, фрагмент D и в Таблице 5. Однако целекоксиб-Na соль или целекоксиб в капсулах по отдельности имели существенно более низкие значения C_max и AUC, чем комбинация вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах или комбинация соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли, как показано на Фигуре 14, фрагмент F и в Таблице 5. Полученные результаты свидетельствуют о том, что присутствие вещества хидамид-K30 или соли хидамид-HCl оказывает существенное влияние на профиль ADME целекоксиба и, следовательно, заметно увеличивает значения C_max и AUC целекоксиба. Однако присутствие целекоксиб-Na соли или целекоксиба в капсулах не оказывало существенного влияния на ФК профиль хидамида. В заключение было продемонстрировано, что профиль ADME комбинации соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли существенно изменен, что позволяет обеспечить эффективное ингибирование роста опухоли и увеличение показателей выживаемости при ее использовании в сочетании с ингибиторами иммунных контрольных точек; в рамках решения проблемы резистентности в отношении лекарственных препаратов при проведении терапии второй линии можно предположить, что противоопухолевая активность солевых форм превышает противоопухолевую активность комбинации вещества хидамид-K30 и целекоксиба в капсулах.

Таблица 4. Фармакокинетические параметры хидамида при лечении самцов крыс линии Вистар веществом хидамид-K30, солью хидамид-HCl, комбинацией вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах и комбинацией соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли.

Перечень Хидамид-К30
N=6 Соль хидамид
-HCl
N=6 Комбинация вещества хидамид-К30 и
целекоксиба в капсулах N=6 Комбинация вещества хидамид-HCl и
целекоксиб-Na соли
N=6 T_max, (ч) 0,39±0,2 0,14±0,1^a 0,25±0,01^a,b 0,14±0,09^a,c C_max (нг/мл) 786±243 2065±1136^a 862±245^a 2244±841^b AUC_0→t, (нг·ч/мл) 4422±1894 4113±1773 4201±848 5977±2161 AUMC, (нг·ч²/мл) 57808±43710 46570±25207 38478±5671 53542±19097 MRT (ч) 12,1±5,5 11,3±2,8 8,9±1,1 9,0±2,9 T_1/2 (ч) 16,9±3,7 14,0±4,9 20,7±3,1 18,8±2,2

Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (СО). ^aP < 0,05 по сравнению с веществом хидамид-К30, ^bP< 0,05 по сравнению с солью хидамид-HCl; ^cP < 0,05 по сравнению с комбинацией вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах. Различия между крысами, которым вводили вещество хидамид-К30, соль хидамид-HCl, комбинацию вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах и комбинацию соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли, представляли в как среднее значение ± СО и анализировали в рамках однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

T_max: Время достижения C_max.

C_max: Пиковая концентрация лекарственного препарата в плазме крови после введения.

AUC_0→t : площадь под фармакокинетической кривой.

MRT: среднее время удержания препарата

T_1/2: Время, необходимое для достижения концентрацией лекарственного препарата половины начального значения.

Таблица 5. Фармакокинетические параметры хидамида при лечении самцов крыс линии Вистар с применением целекоксиба в капсулах, целекоксиб-Na соли, комбинации целекоксиба в капсулах и вещества хидамид-К30 и комбинации целекоксиб-Na соли и соли хидамид-HCl.

Перечень Целекоксиб в капсулах
N=5 Целекоксиб-Na соль
N=5 Комбинация вещества хидамид-К30 и
целекоксиба в капсулах
N=6 Комбинация соли
хидамид-HCl
и
целекоксиб-Na
соли
N=6 T_max, (ч) 4,8±1,0 5,2±1 4,3±0,8^a 3,3±1,0^c C_max (нг/мл) 7104±2962 7631±2727 15021±1563^b 16576±1181^c AUC_0→t, (нг·ч/мл) 105511±34816 106723±35778 163453±11461^b 168033±14588^a,b AUMC, (нг·ч²/мл) 1062627±301118 1124599±333210 1481893±243790^a 1330378±158873 MRT (ч) 9,3±0,4 9,4±0,5 9,0±1,1 7,9±0,6^a,b,c T_1/2 (ч) 6,2±2 7,7±3,1 3,7±0,2^a,b 3,4±0,1^a,b

Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение (СО). ^aP < 0,05 по сравнению с целекоксибом в капсулах, ^bP< 0,05 по сравнению с целекоксиб-Na солью; ^cP < 0,05 по сравнению с комбинацией вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах. Различия между крысами, которым вводили вещество хидамид-К30, соль хидамид-HCl, комбинацию вещества хидамид-К30 и целекоксиба в капсулах и комбинацию соли хидамид-HCl и целекоксиб-Na соли, представляли в как среднее значение ± СО и анализировали в рамках однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки.

T_max: Время достижения C_max.

C_max: Пиковая концентрация лекарственного препарата в плазме крови после введения.

AUC_0→t : площадь под фармакокинетической кривой.

MRT: среднее время удержания препарата.

T_1/2: Время, необходимое для достижения концентрацией лекарственного препарата половины начального значения.

Группа изобретений относится к области медицины, в частности к онкологии, и раскрывает противоопухолевую комбинацию, содержащую кислую соль хидамида и основную соль целекоксиба, в которой кислая соль хидамида представляет собой хлористоводородную или сульфатную соль. Также раскрыт способ регуляции микроокружения опухоли при иммунотерапии рака, способ лечения рака и способ лечения рака, посредством регуляции микроокружения опухоли и повышения скорости формирования иммунного ответа. Технический результат, обеспечиваемый группой изобретений, заключается в повышении скорости формирования иммунного ответа и противоопухолевой активности. 4 н. и 27 з.п. ф-лы, 5 табл., 14 ил., 10 пр.

1. Противоопухолевая комбинация, содержащая кислую соль хидамида и основную соль целекоксиба, в которой кислая соль хидамида представляет собой хлористоводородную или сульфатную соль.

2. Комбинация по п. 1, в которой количества кислотной соли хидамида и основной соли целекоксиба находятся в диапазоне от 5% по весу до 80% по весу и от 95% по весу до 20% по весу, соответственно.

3. Комбинация по п. 1, в которой количества кислотной соли хидамида и основной соли целекоксиба находятся в массовом соотношении 8:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4 или 1:8.

4. Комбинация по п. 1, в которой количества кислотной соли хидамида и основной соли целекоксиба содержатся в одинаковой лекарственной форме или независимо распределены по разным лекарственным формам.

5. Комбинация по п. 4, в которой лекарственная форма представляет собой таблетку или капсулу.

6. Комбинация по п. 1, в которой кислая соль хидамида находится в кристаллической форме.

7. Комбинация по п. 1, в которой хлористоводородная соль хидамида находится в кристаллической форме (форма A), при этом на рентгенограмме, полученной методом порошкового рентгеноструктурного анализа (XRPD), наблюдаются пики со значениями 2θ на уровне около 16,12°, около 19,02°, около 21,62°, около 23,38° и около 30,16°.

8. Комбинация по п. 7, в которой на рентгенограмме формы A наблюдаются дополнительные пики со значениями 2θ на уровне около 21,08°, около 23,76°, около 25,58°, около 27,82° и около 28,18°

9. Комбинация по п. 1, в которой хлористоводородная соль хидамида находится в кристаллической форме (форма А), при этом на спектре, полученном методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), наблюдаются пики на уровне около 3162 см^-1, около 3059 см^-1, около 3036 см^-1, около 2751 см^-1, около 2588 см^-1, около 2359 см^-1, около 2341 см^-1, около 1667 см^-1, около 1658 см^-1, около 1639 см^-1, около 1620 см^-1, около 1610 см^-1, около 1562 см^-1, около 1517 см^-1, около 1508 см^-1, около 1485 см^-1, около 1468 см^-1, около 1444 см^-1, около 1431 см^-1, около 1307 см^-1, около 1282 см^-1, около 1265 см^-1, около 1243 см^-1, около 1220 см^-1, около 1182 см^-1, около 1145 см^-1, около 1074 см^-1, около 1046 см^-1.

10. Комбинация по п. 7 или 9, в которой рентгенограмма формы А повторяет профиль рентгенограммы, представленной на Фиг. 3, фрагмент В, или ИК-спектр, полученный методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), повторяет профиль спектра, представленного на Фиг. 4, фрагмент В.

11. Комбинация по п. 1, в которой сульфатная соль хидамида находится в кристаллической форме (форма В), при этом на рентгенограмме, полученной методом порошкового рентгеноструктурного анализа (XRPD), наблюдаются пики со значениями 2θ на уровне около 21,15°, около 24,65°, около 17,00°, около 18,49° и около 26,69°.

12. Комбинация по п. 11, в которой на рентгенограмме формы В наблюдаются дополнительные пики со значениями 2θ на уровне около 14,74°, около 19,45°, около 22,00°, около 23,55° и около 27,94°.

13. Комбинация по п. 1, в которой сульфатная соль хидамида находится в кристаллической форме (форма В), при этом на спектре, полученном методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), наблюдаются пики на уровне около 3249 см^-1, около 3067 см^-1, около 2578 см^-1, около 2360 см^-1, около 1689 см^-1, около 1664 см^-1, около 1647 см^-1, около 1614 см^-1, около 1568 см^-1, около 1521 см^-1, около 1510 см^-1, около 1486 см^-1, около 1467 см^-1, около 1434 см^-1, около 1412 см^-1, около 1388 см^-1, около 1354 см^-1, около 1328 см^-1, около 1283 см^-1, около 1266 см^-1, около 1252 см^-1, около 1226 см^-1, около 1184 см^-1, около 1099 см^-1, около 1059 см^-1, около 1034 см^-1 и около 1022 см^-1.

14. Комбинация по п. 11 или 13, в которой рентгенограмма формы B повторяет профиль рентгенограммы, представленной на Фиг. 3, фрагмент С, или ИК-спектр, полученный методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием (FTIR), повторяет профиль спектра, представленного на Фиг. 4, фрагмент С.

15. Комбинация по п. 1, в которой основная соль целекоксиба представляет собой натриевую соль.

16. Комбинация по п. 15, в которой натриевая соль целекоксиба находится в аморфной или кристаллической форме.

17. Комбинация по п. 16, в которой рентгенограмма аморфной формы натриевой соли целекоксиба повторяет профиль рентгенограммы, представленной на Фиг. 7, фрагмент B.

18. Комбинация по п. 16, в которой натриевая соль целекоксиба находится в кристаллической форме (форма I), при этом на рентгенограмме, полученной методом порошкового рентгеноструктурного анализа (XRPD), наблюдаются пики со значениями 2θ на уровне около 19,85°, около 20,51°, около 21,51°, около 22,55° и около 18,25°.

19. Комбинация по п. 18, в которой на рентгенограмме формы I наблюдаются дополнительные пики со значениями 2θ на уровне около 10,95°, около 14,05°, около 14,601°, около 17,2°, около 25,80° и около 27,30°.

20. Комбинация по п. 18, в которой рентгенограмма формы I повторяет профиль рентгенограммы, представленной на Фиг. 7, фрагмент С.

21. Комбинация по п. 1, которая дополнительно содержит ингибитор иммунных контрольных точек и/или химиотерапевтическое средство, при этом в некоторых из вариантов осуществления изобретения ингибиторы иммунных контрольных точек представляют собой антитела к CTLA-4, антитела к PD-1 или антитела к PD-L1.

22. Комбинация по п. 21, в которой ингибиторами иммунных контрольных точек являются пембролизумаб, пидилизумаб, ниволумаб, дурвалумаб, авелумаб, атезолизумаб, торипалимаб, синтилимаб, камрелизумаб или MIH1.

23. Способ регуляции микроокружения опухоли при иммунотерапии рака, включающий введение эффективного количества противоопухолевой комбинации, по любому из пп. 1-22.

24. Способ по п. 23, в котором кислую соль хидамида и основную соль целекоксиба вводят одновременно, раздельно или последовательно.

25. Способ лечения рака, включающий введение субъекту эффективного количества противоопухолевой комбинации, описанной в пп. 1-22.

26. Способ по п. 23 или 25, который дополнительно включает введение ингибитора иммунных контрольных точек.

27. Способ по п. 23 или 25, в котором введение кислой соли хидамида и основной соли целекоксиба, в отличие от способа с использованием хидамида в виде свободного основания и целекоксиба в виде свободной кислоты, улучшает фармакокинетический профиль.

28. Способ по п. 26, в котором противоопухолевую комбинацию по любому из пп. 1-22 и ингибитор иммунных контрольных точек, вводят одновременно, раздельно или последовательно.

29. Способ по п. 23 или 25, в котором виды рака включают глиобластому, рак печени, колоректальную карциному, глиобластому, рак желудка, колоректальный рак, рак пищевода, рак легкого, рак поджелудочной железы, почечно-клеточную карциному, доброкачественную гиперплазию предстательной железы, рак предстательной железы, рак яичников, меланому, рак молочной железы, хронический лимфолейкоз (ХЛЛ), карциному из клеток Меркеля, неходжкинскую лимфому, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ), рак желчного пузыря, холангиокарциному, рак мочевого пузыря и рак матки.

30. Способ лечения рака посредством регуляции микроокружения опухоли и повышения скорости формирования иммунного ответа, включающий введение противоопухолевой комбинации по любому из пп. 1-22.

31. Способ по п. 30, в котором хидамид и целекоксиб вводят одновременно, раздельно или последовательно.