СПОСОБ СЕЛЕКТИВНОГО РАЗРУШЕНИЯ МАКРОФАГОВ В КЛЕТОЧНОЙ СУСПЕНЗИИ И ЦЕЛОСТНОМ ОРГАНИЗМЕ С ПОМОЩЬЮ ПРЕПАРАТОВ КОЛЛОИДНОГО СЕРЕБРА - ПРОТАРГОЛА И КОЛЛАРГОЛА Российский патент 2024 года по МПК G09B23/28 A61K33/38 A61P43/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины и биотехнологии. Метод может быть использован в исследованиях, где изучается функциональное значение макрофагов.

Уровень техники

Прототипами изобретения являются методы удаления (разрушения) макрофагов с использованием каррагинана или диоксид кремния (1. Allison AC, Harington JS, Birbeck M An examination of the cytotoxic effects of silica on macrophages. J Exp Med. 1966 Aug 1;124(2):141-54; 2) Jerry A. Bash, Andrew M. Singer and Byron H. Waksman The Suppressive Effect of Immunization on the Proliferative Responses of Rat T Cells in Vitro II. Abrogation of Antigen-Induced Suppression by Selective Cytotoxic Agents . J Immunol May 1, 1976, 116 (5) 1350-1353; 3) G. Pawelic & G. Brons. Modification of lymphocyte responsiveness in vitro by а carrageenan compared with colloidal silica and depletion of surface adherent cells). Clin. exp. Immunol. (1978) 31,426-435).

Сходными признаками с настоящим изобретением является то , что упомянутые агенты приводят к разрушению исключительно макрофагов, не влияя на жизнеспособность Т- и В-лимфоцитов, а также, от их воздействия не страдает функциональная активность последних. Кроме того, общим является и то, что оба препарата проявляют свою активность только в условиях IN VITRO (когда жизнедеятельность клеток поддерживается в искусственной питательной среде).

Недостатками прототипов являются:

а)дороговизна препаратов, а протаргол и колларгол можно купить в любой аптеке;

б) плохая доступность, поскольку в России калиброванные и высокоочищенные их субстанции не производятся;

в) в отличии от препаратов серебра ни диоксид кремния, ни каррагинан в медицине не нашли применения;

г) в условиях IN VIVO (когда испытания проводятся непосредственно в живом организме ) диоксид кремния проявляет фибротические свойства и связанные с этим нежелательные реакции со стороны лимфоцитов, в свою очередь, каррагинан вызывает выраженные нарушения в системе свертывания крови, все вышесказанное не может не сказаться на характере получаемых результатов;

д) к весомым недостаткам карргинана и диоксида кремния можно отнести их высокие используемые дозировки необходимые для достижения эффективного результата – это порядка 100мкг/мл, против 10-20 мкг/мл для колларгола и протаргола, в случае если эксперименты проводятся в условиях IN VITRO, и 1мг каррагинана на мышь против 25 мкг на мышь для протаргола и колларгола (диоксид кремния вообще нежелательно вводить внутривенно!) для экспериментов, где препараты вводятся непосредственно в живой организм, то есть в условиях IN VIVO.

е) оба прототипа имеют плохую растворимость в воде и связанную с этим нестабильность их используемых растворов, что создает некоторые неудобства в процессе их применения.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является снижение токсичности, минимизирование используемых доз, снижение затратности, увеличение доступности препарата, наличие биоцидных свойств, хорошей растворимости и удобством в применении, а также отсутствие выраженных побочных эффектов при введении препаратов непосредственно в вену.

Осуществление изобретения.

Эксперименты проводились на мышах (CBA x C57BL)F1. В серии опытов проводившихся в условиях IN VITRO, использовалась суспензия спленоцитов и отмытые из брюшной полости мыши перитонеальные макрофаги, вызванные туда введением суспензии 4% крахмала ( за 4 дня до выделения макрофагов в брюшную полость мышке был введен 1 мл 4% суспензии крахмала). Культивирование спленоцитов проводили общепринятым способом - в полной культуральной среде на основе среды RPMI 1640 с добавлением L-глютамина , меркаптоэтанола , 10% эмбриональной телячьей сыворотки с добавлением гентамицина. Время экспозиции с препаратами серебра составляло 4 часа в условиях культивирования в СО2- инкубаторе при 37С. Жизнеспособность клеток определялась с помощью МТТ теста ( [4,5-диметилтиазол-2-ил]-3,5-дифенилтетразолиум бромид, который закапывали в каждую лунку 96-луночного планшета по 20мкл в концентрации 5мг/мл. Затем планшеты вновь помещали в СО2 – инкубатор для 3х часовой экспозиции по истечении указанного срока с каждой лунки быстро удалялась питательная среда и к осадку клеток смешанному с образовавшимися в процессе жизнедеятельности клеток микрочастицами формазана, добавляли 100мкл подкисленного соляной кислотой раствора изопропанола для растворения частиц формазана и не позднее 15 минут этот планшет сканировали в 8-ми канальном спектрофотометре при длине волны 570нм.

Результаты выявили , что жизнеспособность лимфоцитов от воздействия вышеперечисленных доз не страдает (Таблица -1), , а вот перитонеальные

Таблица -1. Влияние различных концентраций препаратов серебра на жизнеспособность спленоцитов мыши. Концентрация
препарата,
мкг/мл Количество жизнеспособных клеток, усл.ед Опыт I Опыт 2 Колларгол:
------------ 657 ± 21 460 ± 28 0,016 644 ± 8 542 ± 25 0,08 649 - 30 511 ± 9 0,4 677 ± 18 523 ± 18 2 706 ± 24 445 ± 25 10 680 ± 11 430 ± 18 20
Протаргол: 615 ± 25 426 ± 40 0,016 693 ±29 448 ± 11 0,08 656 ± 20 494 ± 17 0,4 . 654 ± 10 . 484 ± 15 2
10
20 716 ± 54 528 ± 12 703 ± 30
703 ± 12
587 ± 30
527 ± 11

макрофаги оказались уязвимыми от воздействия указанных препаратов, поскольку проявили токсичность в диапазоне от 2 до 20 мкг/мл в, случае обработки колларголом, и 10-20 мкг/мл с использованием протаргола (Таблица-2):

Таблица 2.

Влияние различных концентраций препаратов серебра на жизнеспособность перитонеальных макрофагов мыши.

Концентрация
препарата,
мкг/мл Количество жизнеспособных клеток, уел. ед. Средние данные двух опытов,
% от контроля Опыт I Опыт 2 - 412 ± 16 297 ± 27 100 ± 4 Колларгол 0,016 364 ± 37 251 ± 4 86 ± 4 0,08 385 ± 35 252 ± 6 89 ± 4 0,4 389 ± 23 286 ± 32 95 ± 6 2 302 ± 24 146 ± 8 61 ± 5 ** 10 204 ± 34 83 ± 13 39 ± 6 ** 20 108 ± 5 76 ± 9 26 ± 1 ** Протаргол 95 ± 5 0,016 351 ± 14 311 ± 14 0,08 373 ± 9 345 ± 34 103 ± 7 0,4 341 ± 12 301 ± 21 92 ± 4 2 372 ± 29 269 ± 16 91 ± 4 10 356 ± 30 193 ± 10 76 ± 5 ** 20 195 ^± 26 113 ± 10 43 ± 4 **

**- достоверное отличие от контроля (Р<0,01)

Чтобы исключить какое-либо влияние указанного диапазона доз препаратов серебра на функциональную активность лимфоцитов, с последними был проведен пролиферативный тест со стимуляцией их липополисахаридом (10мкг/мл E.coli. serotype 055:В5). Интактные или обработанные в течении 4 часов различными концентрациями препаратов коллоидного серебра спленоциты мышей СВА помещали по 3 х 10⁵ в лунки 96-луночного круглодонного планшета в 0,2 мл полной культуральной среды, содержащей 10мкг/мл липополисахарида. В контрольные лунки липополисахарид не добавляли. Клетки инкубировали в течение 96 часов в описанных выше условиях. За 18 часов до окончания культивирования в лунки вносили по 0, 5 мкКи ³Н-тимидина. Включение ³Н-тимидина в клетки учитывали с помощью стандартного метода. Величину пролиферативного индекса вычисляли по формуле:

И= 0/К,

Где 0 – включение ³Н-тимидина (имп/мин) в пробе с липополисахаридом; К – включение ³Н- тимидина в соответствующей контрольной пробе без митогена.

Тестирование показало, что все исследуемые дозировки не оказывают никакого влияния на функционирование лимфоцитов, что указывает на то, что поверхностные мембранные структуры лимфоцитов под воздействием препаратов серебра не повреждаются (Таблица-3).

Таблица-3.Влияние различных концентраций препаратов серебра на пролиферативный ответ спленоцитов мыши при стимуляции их липопoлисахаридом.

Концентрация
препарата,
мкг/мл Величина пролиферативного индекса Опыт I Опыт 2 Средняя двух опытов - 22,2 ± 1,7 35,5 ± 0,9 28,8 ± 2,7 Колларгол
0,5 27,9 ± 1,4 28,3 ± 0,2 28,1 ± 0,7 5 22,4 ± 1,8 35,7 ± 2,9 29,0 ± 3,0 50 - 26,2 ± 1,1 26,2 ± I,I Протаргол
0,5 29,4 ± 4,7 31,3 ± 3,2 30,3 ± 2,5 5 37,8 ± 5,6 37,4 ± 0,9 37,6 ± 2,6 50 28,0 ± 3,4 31,3 ± 2,4 29,7 ± 2,0

Для убедительности была проведена еще одна серия опытов по выявлению влияния исследуемых препаратов на пролиферацию смешанной культуры лимфоцитов. Интактные или обработанные в течение 4 часов аналогичными концентрациями препаратов серебра спленоциты мышей СВА (Н-2ᵏ) в количестве 3 х 10⁵ (клетки- респондеры ) смешивали с облученными дозой 2000 рад клетками селезенки мышей С57BL|6 (Н-2ᵇ) в количестве 3 х 10⁵ или 6 х 10⁵ ( клетки –стимуляторы) в лунках 96-луночного круглодонного планшета . В контрольных лунках клетки–респондеры смешивали с соответствующими количествами сингенных клеток–стимуляторов . Лимфоциты культивировали в полной среде в обьеме 0.2 мл в течение 120 часов. За 18 часов до окончания культивирования в лунки вносили по 0, 5 мкКи ³Н-тимидина. Включение ³Н-тимидина в клетки учитывали с помощью стандартного метода . Полученные в результате опытов данные также не выявили каких –либо различий в опытных и контрольных группах (Таблица-4,5):

Таблица-4.

Влияние препаратов на пролиферацию спленоцитов мыши в смешанной культуре лимфоцитов (количество клеток- стимуляторов - 3•10⁵)

Концентрация Уровень пролиферации, имп/мин препарата , мкг/мл Опыт 1 Опыт 2 Сингенная
культура Смешаная
культура Сингенная
культура Смешаная
культура Колларгол 1683 ± 304 7240 ± 863 385 ± 87 2871 ± 194 0,06 993 ± 318 7900 ± 2567 - - 0,5 1522 ± 282 6090 ± 3533 1074 ± 90 10747 ± 682 5 1074 ± 185 7612 ± 1148 898 ± 135 9437 ± 1584 50 1049 ± 61 7211 ± 891 - - Протаргол 0,5 2583 ±1347 12377 ± 620 1756 ± 133 12435 ± 609 5 1253 ± 372 6911 ± 1106 2004 ± 567 18073 ± 935 50 1382 ± 899 3864 ± 727 2147 ± 50 16636 ± 780 500 Т Т Т Т

Т - токсический эффект

Таблица -5.

Влияние препаратов серебра на пролиферацию спленоцитов мыши в смешанной культуре лимфоцитов (средние пролиферативные индексы)

Концентрация
препарата,
мкг/мл
Пролиферативный индекс 3•10⁵
клеток-стимуляторов 6•10⁵
клеток-стимулятор Колларгол 5,9 ± 0,8 7,8 ± 2,0 0_,05 8,0 ± 2,6 9,4 ± 1,1 0_,5 9,1 ± 1,0 * 11,9 ± 1,4 5 8,8 ± 1,2 12,5 ± 2,7 50
Протаргол 6,9 ± 0,8 5,6 ±0,7 0,5 8,7 ± 0,8 * 10,1 ± 1,7 5 7,3 ± 1,3 8,2 ± 0,9 50 5,3 ± 1,1 6,9 ± 1,2

^{⁎ -} Достоверное отличие от контроля (Р < 0.05)

Оценка величины гуморального иммунного ответа на тимус зависимый антиген (этот тест характеризует функциональный статус клеток лимфоцитарного ряда в условиях IN VIVO).

Мышам-гибридам (СВА х С57BL6)F1 вводили внутривенно тестируемые препараты в дозе 1мг/кг веса тела (эта доза рассчитана на концентрацию в крови животного эквивалентную токсическому диапазону доз для макрофагов в условиях IN VITRO) в 0.5 мл среды 199 (контрольным животным вводили 0.5 мл среды) и через сутки после введения исследуемых препаратов, мышей иммунизировали их внутривенно иммунизировали эритроцитами барана (тимус-зависимый антиген) в дозе 2 х 10⁸ эритроцитов барана. На 4-е сутки после иммунизации мышей забивали и готовили супензию клеток селезенки в 5мл среды 199, подсчитывая количество клеток. Суспензию спленоцитов разводили в 10 раз и смешивали 10% взвесью эритроцитов барана и комплементом в соотношении 1:1:1. Полученной смесью заполняли стеклянные камеры известного обьема и инкубировали при 37 °Св течение 1 часа . После инкубации под бинокулярной лупой подсчитывали количество антителообразующих клеток (зон локального гемолиза ) в каждой камере. Результаты выражали в виде числа антителообразующих клеток на селезенку и числа антителообразующих на 10⁵ ядросодержащих клеток селезенки. Полученные данные свидетельствуют, что как протаргол, так и колларгол в используемой дозировке не оказали влияния на величину гуморального иммунного ответа на тимус –зависимый антиген (эритроциты барана) и, следовательно, они не имеют какого–либо существенного влияния на функционирование лимфоцитов в этой иммунной реакции (Таблица-6):

Таблица-6.
Влияние препаратов серебра (при их внутривенном введении мышам) на величину гуморального иммунного ответа на эритроциты барана. Контроль Колларгол, 1мг/кг Протаргол, мг/кг Опыт I АОК ⃰ /селезенку 19748 ± 2348 20990 ± 3910 22010 ± 3931 АОК/10⁶ клеток 132 ± 17 146 ± 30 158 ± 26 Опыт 2 АОК/селезенку 32798 ± 7973 22696 ± 6399 33979 ± 6274 АОК/10⁶ клеток 240 ± 47 194 ± 51 265 ± 51 ^{⃰ ⃰} - АОК - антителообразующие клетки

Оценка реакции гиперчувствительности замедленного типа (этот тест определяется функциональным состоянием клеток моноцитарно-макрофагального происхождения).

Аналогично, как и в предыдущем тесте, мышей обрабатывали препаратами коллоидного серебра и через сутки после этого иммунизировали их внутрибрюшинно эритроцитами барана в дозе 10⁷ клеток. На 4-е сутки после иммунизации под подошвенный апоневроз задней лапки мыши вводили разрешающую дозу антигена (10⁸ эритроцитов барана в 50мкл среды 199), одновременно в другую заднюю лапку мыши вводили такой же обьем среды. Через 24 часа мышей забивали и штанген-циркулем замеряли толщину лапок на уровне плюсневых костей. За величину реакции ГЗТ принимали разницу между толщиной лапки, в которую была введена разрешающая доза эритроцитов барана, и толщиной контрольной лапки.

В результате полученных данных было выяснено, что колларгол и, в меньшей степени, протаргол, при введении их мышам до сенсибилизации, значительно подавляют реакцию гиперчувствительности замедленного типа.

Основываясь на результатах ранее описанных экспериментов, можно предположить, что это действие препаратов коллоидного серебра обусловлено не их влиянием на Т- клеточные эффекторы реакции гиперчувствительности замедленного типа , а подавлением функции макрофагов, которые также являются клетками - эффекторами при развитии указанной иммунологической реакции (Таблица-7):

Таблица-7.
Влияние препаратов серебра (при их внутривенном введении мышам) на величину реакции гиперчувствительности замедленного типа. Препарат Разность толщины лапок, мм Опыт I Опыт 2 -------------
Колларгол,
1мг/кг
Протаргол,
1мг/кг
0,86 ± 0,07

0,46 ± 0,06 **

0,61 ± 0,07 *
0,82 ± 0,04
0,42 ± 0,05 **

0,53 ± 0,06 **

⃰ - Достоверное отличие от контроля (Р < 0,05)

⃰⃰ ⃰ - Достоверное отличие от контроля (Р < 0,01)

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и экспериментальной медицине, и может быть использовано для селективного разрушения макрофагов в клеточной суспензии или в организме. Способ включает добавление препарата либо непосредственно в питательную среду для культивирования живых клеток, либо введение внутривенно в организм мыши. В качестве селективного токсического агента для макрофагов используют препарат коллоидного серебра – либо протаргол, либо колларгол. При проведении экспериментов в условиях искусственного культивирования выделенных из организма мыши макрофагов диапазоне концентраций составляет от 10 до 20 мкг/мл, экспозиция 4 часа с каждым агентом по отдельности. В экспериментах, где препарат вводится непосредственно в организм мыши внутривенным способом, используют дозу из расчета 1мг/кг веса животного и времени экспозиции в 24 часа с каждым агентом по отдельности. Использование изобретения позволяет достичь селективного разрушения мышиных макрофагов при снижении токсичности, минимизировании используемых доз, хорошей растворимости и удобстве в применении. 7 табл.

Способ селективного разрушения мышиных макрофагов, включающий добавление препарата либо непосредственно в питательную среду для культивирования живых клеток, либо вводя его внутривенно прямо в организм мыши, отличающийся тем, что в качестве селективного токсического агента для макрофагов используют препарат коллоидного серебра – либо протаргол, либо колларгол, в диапазоне концентраций от 10 до 20 мкг/ мл и 4-х часовой экспозиции с каждым агентом по отдельности в случае проведения экспериментов в условиях искусственного культивирования выделенных из организма мыши макрофагов, а в экспериментах, где препарат вводится непосредственно в организм мыши внутривенным способом, используют дозу из расчета 1мг/кг веса животного и времени экспозиции в 24 часа с каждым агентом по отдельности.