СПОСОБ ПРИМЕНЕНИЯ ГРАНУЛЕМАОБРАЗУЮЩИХ ПРЕПАРАТОВ С ПРИМИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ НА ЦИТОТОКСИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ МАКРОФАГОВ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ БАРЬЕРНО-ФИЛЬТРАЦИОННОЙ ФУНКЦИИ ЛИМФАТИЧЕСКИХ УЗЛОВ В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ ОПУХОЛЕЙ Российский патент 2025 года по МПК A61K35/15 A61K39/04 A61K31/739 A61P35/00 

Область техники

Изобретение относится к области медицины.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Известно, что первые метастатические очаги злокачественных опухолей обнаруживаются в региональных лимфатических узлах, именно состояние их барьерно-фильтрационной функции определяет дальнейшую динамику распространения опухолевого роста. Основным путём метастазирования солидных опухолей является лимфогенный. Одним из ближайших, по существу, прототипов настоящего изобретения является способ, предложенный нашим соотечественником Левиным Ю.В., который описан в его монографии «Основы лечебной лимфологии» / Ю.М. Левин. - Москва : Медицина, 1986. - 287 с. Сущность этого способа заключается в следующем - эндолимфотически в лимфоузлы вводится жирорастворимый препарат дибунол (2,6-дитрет-бутил-4-метил-фенол), растворенный в рентгенконтрастном веществе со свойствами жира - йодолипол. Дибунол обладает выраженным противоопухолевым свойством, малотоксичен, стимулирует процессы регенерации, имеет антигипоксическое, противовоспалительное и антиоксидантное свойства. Этот препарат, имеет ряд особенно ценных свойств, необходимых для блокирования лимфатической системы - это прямое контактное воздействие вызывающее атрофию и склероз лимфоидной ткани, а также, в отличие от других используемых для инфузии противоопухолевых средств, дибунол нерастворим в воде, но хорошо растворим в жирах, что препятствует быстрой его эвакуации из лимфатических узлов.

После эндолимфатического введения дибунол сразу переходит в тканевые структуры, накапливаясь преимущественно в лимфатической ткани, и длительно (до 8 мес) депонируется в ней. Результаты морфологических исследований лимфатических узлов показали, что в сроки от 1 нед до 6 мес после введения раствора дибунола в корковых и мозговых синусах лимфатических узлов сохраняется выраженная макрофагальная реакция. Она уменьшалась и почти полностью исчезала через 1-1,5 года. Атрофия лимфоидной ткани была значительно более выражена в сроки от 2 до 4 недель после эндолимфатического введения масляного раствора дибунола. Ни в одном из лимфатических узлов после воздействия раствора дибунола, даже через 1-1,5 года после его инфузии, не отмечалось полной регенерации лимфоидной ткани. В приводящих и отводящих лимфатических сосудах при всех сроках наблюдения была выявлена картина облитерирующего лимфангоита с реканализацией просвета отдельных сосудов через 9 мес и более, после введения препарата. В первые дни после введения масляного препарата наблюдаются продуктивная клеточная реакция в синусоидах с пролиферацией гистиоцитов, эозинофильная инфильтрация, появление макрофагов. К концу 2-й недели количество макрофагов нарастает, образуются гранулемы, включающие в себя рентгеноконтрастное вещество.

В клинических условиях, когда невозможно предугадать, проникли или нет злокачественные клетки в лимфатическую систему из первичного очага опухоли, следует учитывать, что любое эндолимфатическое введение при опухолевом процессе таит в себе потенциальную угрозу вытеснения в кровь опухолевых клеток, особенно если нарушается методика и не используются автоматические инъекторы, ограничивающие в определенных пределах эндолимфатическое давление. Йодолипол, обладающий значительной вязкостью и медленно покидающий лимфатическую систему, препятствует миграции вводимых опухолевых клеток из лимфатической системы в кровь.

Таким образом, к недостатком прототипа можно отнести следующие:

1) основной задачей прототипа является предотвращение возможной лимфогенной диссеминации опухолевых клеток, а борьба с уже имеющимися метастазами ставится под сомнение, поскольку дибунол не нашёл широкого своего применения в онкологии, за исключением рака мочевого пузыря; кроме того, авторы утверждают, что препарат быстро! переходит, будучи веществом плохо растворимым в воде?, в окружающее пространство лимфоузла, при этом авторы сами утверждают, что масляный его растворитель обнаруживается в лимфоузле даже по прошествии 8 месяцев! Кроме того, авторы тут же себе противоречат и пишут, что дибунол нерастворим в воде, но хорошо растворим в жирах, что препятствует быстрой его эвакуации из лимфатических узлов?????….

2) блокирование регионального лимфодренажа из-за повреждения и деформации лимфатических узлов и их сосудов;

3) введение дибунола не ведёт к гиперплазии лимфоузла, а более того, он вызывает атрофию его лимфоидной ткани, которая даже спустя месяцы, не восстанавливается!;

4) имеется потенциальная угроза вытеснения в кровь опухолевых клеток, особенно если нарушается методика и не используются автоматические инъекторы, ограничивающие в определенных пределах эндолимфатическое давление;

5) полностью отсутствует защитный иммунный компонент барьерно-фильтрационной функции лимфоузлов - противоопухолевая активность иммуноцитов;

6) комбинация дибунола и рентгенконтрастного вещества не проявляет иммуноактивных свойств уже потому, что оба препарата обладают оппозитным действием на функциональную активность иммуноцитов.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Задачами изобретения являются:

1) максимально увеличить объём лимфатических узлов(гиперплазия) за счёт стимуляции в нём пролиферации иммуноцитов;

2) активизировать в лимфоузлах противоопухолевую цитотоксичность макрофагов;

3) исключить повреждения и деформации лимфатических узлов и их сосудов, избежать атрофию лимфоидной ткани;

4) исключить возможность вытеснения в кровь опухолевых клеток;

5) улучшить воспроизводимость процедуры введения препаратов.

Осуществление изобретения

Барьерно-фильтрационная функция лимфатического узла является одной из важнейших, благодаря ей затрудняется распространение по организму как инфекционных патогенов, так и метастатических клеток злокачественной опухоли.

Изобретение направлено на усиление структурно-функциональных составляющих барьерно-фильтрационной функции лимфатического узла, то есть, создание препятствий (вплоть до полной блокады), имеющих обратимый характер, для продвижения различных патогенов и опухолевых клеток внутри лимфатического узла.

Этими составляющими являются:

1) увеличенный объём лимфатического узла, а также количество и плотность иммуноцитов в нём;

2) биоцидная и противоопухолевая активность иммуноцитов лимфатического узла.

Изобретение имеет двойное назначение - это 1) терапевтическое (замедление, а в некоторых случаях и полное блокирование процесса метастазирования опухоли по лимфоузлам) и 2) диагностическое, которое способствует ранней диагностики метастазов в лимфоузле, поскольку если искусственно увеличить объем лимфоузла (стимулируя пролиферацию его клеток), то на фоне такого увеличенного изображения лимфоузла, будь то на УЗИ-, МРТ- или КТ-снимках, можно хорошо различать и определять границы между метастатическим очагом и пульпой (стромой) лимфоузла. Кроме того, появляется возможность оценивать динамику роста метастатического очага, поскольку в лимфоузле размером от 0,3 до 0,7 см это сделать очень проблематично, чтобы достоверно высказаться о дифференцированности структуры лимфатического узла и наличии в нем метастатического очага, а так, на фоне гиперплазии, это будет сделать много проще. Таким же образом, этот способ можно использовать для отслеживания динамики распространения опухоли, заключающееся в том, что продвижение опухолевых клеток по лимфоузлу замедляется, вплоть до полного блокирования, такая ситуация, в случае если опухолевые клетки не погибают от активности иммуноцитов, способствует дальнейшему росту объема метастатического очага внутри лимфоузла, что позволяет осуществлять раннюю диагностику поражения опухолью региональных сторожевых лимфоузлов, что является не менее важной проблемой для онкологии.

РЕАЛИЗАЦИЯ ПЕРВОЙ СОСТАВЛЯЮЩЕЙ (УВЕЛИЧЕНИЕ ОБЪЁМА И КЛЕТОЧНОСТИ ИММУНОЦИТОВ ЛИМФОУЗЛА)

Если с помощью какого-либо агента инициировать в лимфоузле пролиферативную активность иммуноцитов, то через некоторое время мы будем наблюдать следующее:

а) размер (объем) лимфатического узла начнет увеличиваться в диаметре (с 0,5 см до 3 см и более!); б) внутри лимфоузла будет нарастать клеточная плотность (гиперплазия), а наружная эластичная соединительнотканная оболочка лимфоузла естественным образом будет оказывать этому сопротивление, что приведет к формированию у лимфоузла плотноэластической консистенции, это обстоятельство будет затруднять движение внутри лимфоузла как клеточных элементов, так и лимфы. Именно поэтому в клинической практике в случаях с воспаленными увеличенными лимфоузлами (лимфадениты) пальпаторно определяются ПЛОТНЫЕ по консистенции и подчас болезненные (из-за перерастяжения наружной капсулы) лимфоузлы. В такой ситуации в процессе эволюции выносящий лимфатический сосуд БЛОКИРУЕТСЯ и дренажная функция лимфоузла прекращается, чтобы обезопасить организм от распространения патогена, этим объясняется то, что в клинической практике мы не наблюдаем единовременно равноувеличенных всех близлежащих к патологическому очагу региональных узлов, то есть, как правило, по ходу оттока лимфы от очага инфекции или злокачественной опухоли первый на пути оттока лимфы узел имеет наибольший размер, а по мере удаления от патологического очага, размер, даже увеличенных лимфоузлов, экспоненциально снижается. Это происходит благодаря тому, что ресурс барьерно-фильтрационной способности любого лимфоузла имеет свой предел и как только он иссякается (прорывается), патоген попадает в следующий по пути оттока лимфы узел.

Скорость продвижения патогена через лимфатический узел находится в прямо пропорциональной зависимости от увеличения объема лимфатического узла, поскольку снижается геометрическая вероятность выхода патогена из лимфоузла через выносящий сосуд, при условии, что он не меняет своего диаметра просвета, а он его не меняет (более того, он его СУЖАЕТ!).

Напомним, что классическое определение вероятности звучит следующим образом:

Вероятностью Р наступления случайного события А называется отношение , где n - число всех возможных исходов эксперимента, а m - число всех благоприятных исходов

Исходя из вышеупомянутой формулировки, определение геометрической вероятности представляется так:

Если предположить, что попадание в любую точку области Ω равно - возможно, то вероятность попадания случайной точки в заданное множество А будет равна отношению площадей:

P(A) = ;

Если А имеет нулевую площадь, то вероятность попадания в А равна нулю.

Таким же образом, можно определить геометрическую вероятность в пространстве, заменив в формуле символ площади S на символ величины объема V:

P(A) = .

РЕАЛИЗАЦИЯ ВТОРОЙ СОСТАВЛЯЮЩЕЙ - ЭТО АКТИВИЗАЦИЯ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТИ ИММУНОЦИТОВ ЛИМФОУЗЛА.

Она заключается в активации иммуноцитов, в частности, их антипролиферативной, биоцидной и цитотоксической функций (фагоцитоз, активные формы кислорода, TNF-alpha, цитокины, ферменты и т.д.). Очевидно, что увеличенная по пути распространения опухолевых клеток или инфекционных агентов плотность функционально-активированных иммуноцитов и секретированных ими во внеклеточное пространство лимфоузла упомянутых молекул будет создавать дополнительные препятствия для распространения патогена.

Иммунофармакологии известен большой спектр препаратов стимулирующих пролиферацию различных субпопуляций лимфоцитов, но НЕ ВСЕГДА стимуляция пролиферации каким-либо иммуноактивным агентом будет сопровождаться усилением антипролиферативных и биоцидных свойств иммуноцитов по отношению к патогену. Да, конечно, пролиферация иммуноцитов усилит барьерно-фильтрационную функцию лимфоузла в отношении патогенов, но это, по сути, является ПОЛУМЕРОЙ. Поэтому наиболее эффективным является применение агентов, которые обладают двойным действием - то есть вызывают и пролиферативный эффект на иммуноциты лимфоузла и одновременно увеличивают их биоцидную и антипролиферативную активность в отношении опухолей и инфекционных агентов. К этим препаратам относятся, как правило, вещества с низкой (плохой) биодеградабельностью, которые инициируют гранулематозное воспаление (G.T. Williams and W.J. Granulomatous inflammation a review // J.Clin. Path. - 1983 - Vol. 36. - P. 723-733). Гранулематозное воспаление можно определить как локальное хроническое воспаление, вызванное нерастворимыми или медленно разрушающимися (персистирующими) раздражителями и сопровождающееся очаговыми скоплениями макрофагов или макрофагов и эпителиоидных клеток с наличием гигантских многоядерных клеток, лимфоцитов и гранулоцитов или без них (a) Boros D.L. The Granulomatous inflammatory response: an Overview // Basic and clinical aspects of granulomatous diseases / Ed. D.L. Bros, T. Yoshida. New York, 1980. - P. 1-14; b) Adams D.O. The biology of the granulomas // Pathology of granulomas / Ed. H.L. Ioachim. - New York, 1983. – P. 19.) К такой группе агентов относятся вакцина БЦЖ, частичковый глюкан (зимозан), каррагинан, оксид кремния и многие другие. Функциональная активность макрофагов во время формирования гранулемы претерпевает фазные изменения - от фазы гиперактивации до фазы полного подавления макрофагальной активности (Цырендоржиев, Д.Д. «Реактивность системы мононуклеарных фагоцитов при гранулематозном воспалении: автореферат дис. … доктора медицинских наук: 14.00.16 / НИИ региональной патологии и патоморфологии. - Новосибирск, 1997. - 47 с.). В начальной фазе наблюдается повышение цитотоксической активности макрофагов с функциональным фенотипом М1. Такой тип цитотоксической активности макрофагов формируется из двух последовательных этапов - первый этап именуется примирование, а второй этап именуется как собственно активация, последний запускается триггерным агентом - это второй дополнительный сигнал (D O Adams, T A Hamilton. Molecular transductional mechanisms by which IFN gamma and other signals regulate macrophage development. Immunol Rev. 1987 Jun:97:5-27).

Осуществление изобретения

В качестве экспериментальной модели лимфоузла использовалась селезенка мыши, поскольку эксперимент на мышиных лимфоузлах провести невозможно в связи с их мизерной величиной. Аналогия селезенки с лимфоузлами основывается на следующих фактах:

1) Селезенка и лимфоузлы относятся к лимфоидным органам иммунной системы, поэтому морфологические элементы этих органов идентичные;

2) гистологическая структура селезенки очень схожа со структурой лимфоузла, с разницей лишь в том, что в ней присутствуют очаги красной пульпы (место локализации зрелых элементов крови к коим относятся эритроциты и тромбоциты);

3) Селезенка, также как и лимфоузлы, увеличивается в размерах при целом ряде патологических лимфопролиферативных генерализованных процессах, таких как лимфаденопатии;

4) Одна из теорий происхождения селезенки основывается на том, что в процессе эволюции она сформировалась из лимфатического узла;

5) Соединительнотканная капсула селезенки, также как лимфоузла, способна растягиваться, за счет этого она увеличиватется в размерах.

СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА

В эксперименте использовались мыши-гибриды (CBA х C57BL/6)F1 самки в возрасте 6 месяцев и средним весом около 32-38 грамм.

Эксперимент №1 (пример препарата 1)

Цель: исследование известного классического гранулемообразующего и активирующего противоопухолевую активность макрофагов и других иммуноцитов агента - вакцины БЦЖ на барьерно-фильтрационную функцию лимфоузлов.

Перед началом эксперимента была приготовлена суспензия клеток мышиной меланомы В16, её готовили в питательной среде RPMI1640 в концентрации 300000 клеток в 1.0 мл. Полученную таким образом клеточную суспензию в объеме 0.1мл вводили, в стерильных условиях, в верхний полюс селезенки мыши, находящейся под эфирным наркозом, таким образом имитировался процесс протекания лимфы через лимфоузел (селезенку). Эксперимент проводился на 2-х группах животных:

1-я группа - контроль опухолевого роста мышиной меланомы В16;

2-я группа - предварительно обработанные внутривенным введением 2,5 мг/мышь живой вакциной BCG (за 12 дней до инокуляции мышиной меланомы В16) с целью получения гиперплазии селезенки (пролиферации лимфоцитов) и активации в последней противоопухолевой активности макрофагов и лимфоцитов. Результаты отражены в Таблице 1.

Таблица 1. Подавление опухолевого роста мышиной меланомы В16 в печени и селезёнке мышей (CBA x C57BL/6)F1 после предварительной обработки вакциной БЦЖ

Вес мышиной меланомы В16 в селезенке (мг) Вес мышиной меланомы В16 в печени (мг) КОНТРОЛЬ 1132 ± 370
ОПЫТ единичные мелкие КОНТРОЛЬ 2183 ± 1783
ОПЫТ 0

Вывод:

Через 12 дней после внутривенного введения 2.5мг вакцины БЦЖ масса селезёнки увеличилась в 3.3 раза, внутриселезёночная инокуляция 30000 клеток мышиной меланомы В16 в общем объёме 0.1мл не приводила к возникновению узелков опухолевого роста в печени этих мышей. Однако, в самих селезёнках мелкие единичные узелки (не более 1мм в диаметре) обнаруживались.

Эксперимент №2

Этот эксперимент является продолжением предыдущего и имел своей целью исследовать возможности барьерно-фильтрационной функции селезёнки при инокуляции в неё уже 100000 клеток опухоли, то есть в 3.3 раза больше, чем в предыдущем эксперименте. Перед началом эксперимента была приготовлена суспензия клеток мышиной меланомы В16, её готовили в питательной среде RPMI1640 в концентрации 1000000 клеток в 1.0 мл. Полученную таким образом клеточную суспензию в объеме 0.1мл (или 100000 клеток на мышь) вводили в стерильных условия в верхний полюс селезенки мыши, находящейся под эфирным наркозом, таким образом имитировался процесс протекания лимфы через лимфоузел (селезенку). Эксперимент проводился на 2-х группах животных:

1-я группа - контроль опухолевого роста мышиной меланомы В16;

2-я группа - предварительно обработанные (вакцина вводилась за 12 дней до начала инокуляции клеток мышиной меланомы) внутривенным введением живой вакциной BCG (2,5 мг/мышь) с целью получения гиперплазии селезенки (пролиферация лимфоцитов) и активации в последней противоопухолевой активности макрофагов и лимфоцитов. Результаты отражены в Таблице 2.

Таблица 2. Подавление опухолевого роста мышиной меланомы В16 в печени и селезёнки мышей (CBA x C57BL/6)F1 после предварительной обработки вакциной БЦЖ

Вес мышиной меланомы В16 в селезенке (мг) Вес мышиной меланомы В16 в печени (мг) КОНТРОЛЬ 1132 ± 370
ОПЫТ 71 ± 59* КОНТРОЛЬ 2183 ± 1783
ОПЫТ 315 ± 314*

* - Р < 0.001.

Вывод:

Увеличение количества клеток инокулированных в гиперплазированную селезёнку, в результате обработки мышей вакциной БЦЖ, приводило к прорыву барьерно-фильтрационной возможности селезёнки и появлению в печени мышей значительных очагов опухолевого роста, в отличие от введения меньшего числа клеток, то есть 30000 клеток, как в предыдущем эксперименте №1, где рост опухоли в печени полностью отсутствовал!

Эксперимент №3

Этот эксперимент также является логическим продолжением двух предыдущих экспериментов, а именно, было исследовано ещё большее усиливающее влияние на обе составляющие барьерно-фильтрационной функции селезенки, такого дополнительного триггерного агента, как липополисахарида (пирогенал). Перед началом эксперимента была приготовлена суспензия клеток мышиной меланомы В16, её готовили в питательной среде RPMI1640 в концентрации уже 10000000 клеток в 1.0 мл. Полученную таким образом клеточную суспензию в объеме 0.1мл вводили, в стерильных условиях, в верхний полюс селезенки мыши, находящейся под эфирным наркозом, таким образом имитировался процесс протекания лимфы через лимфоузел (селезенку). Эксперимент проводился на 2-х группах животных:

1-я группа - контроль опухолевого роста мышиной меланомы В16;

2-я группа - предварительно обработанные (вакцина вводилась за 12 дней до начала инокуляции клеток мышиной меланомы) внутривенным введением живой вакциной BCG (2,5 мг/мышь) с целью получения гиперплазии селезенки (пролиферации лимфоцитов) и активации (стадия ПРИМИРОВАНИЯ) в последней противоопухолевой активности макрофагов и лимфоцитов. По истечении 12 дней под эфирным наркозом мышкам внутриселезеночно в объёме 0.1 мл вводилась суспензия клеток мышиной меланомы В16 в количестве 1000000 клеток на мышь, а после непродолжительной экспозиции - 3 часа внутривенно вводился пирогенал, который в последствии стимулировал пролиферацию спленоцитов, увеличивая гиперплазию органа и активировал вторую стадию активации макрофагов - собственно АКТИВАЦИЯ! Результаты отражены в Таблице 3.

Таблица 3. Подавление опухолевого роста мышиной меланомы В16 в печени и селезёнки мышей (CBA x C57BL/6)F1 после предварительной обработки вакциной БЦЖ и последующего введения пирогенала

Вес мышиной меланомы В16 в селезенке (мг) Вес мышиной меланомы В16 в печени (мг) КОНТРОЛЬ 1132 ± 370
ОПЫТ 0! КОНТРОЛЬ 2183 ± 1783
ОПЫТ 0!

ВЫВОД: в результате последовательной обработки мышей вакциной БЦЖ (экспозиция 12 дней) и последующего внутривенного введения пирогенала (7,5 кг) произошёл дополнительный прирост гиперплазированной массы селезёнки до среднего значения в 660 ± 45, против 115 ± 21 мг в интактном контроле и инициация второй фазы активации макрофагов - собственно АКТИВАЦИЯ. В результате такой комбинированной обработки даже многократно превышающее количество внутриселезёночно введённых опухолевых клеток (1000000 на мышь!) не приводит к возникновению очагов злокачественного роста, как в селезёнке, так и в печени мышей.

Эксперимент №4 (пример препарата 2)

Ещё одним известным гранулёмообразующим стимулятором как гиперплазии, так и противоопухолевой активности иммуноцитов в лимфомдных органах является зимозан, который производится из пекарских дрожжей. Эксперимент проводился на самцах линии мышей (CBA х C57BL/6) F1 в возрасте 6-8 недель. Зимозан гомогенизировали тефлоновым пестиком при 2000 об/мин в течение 90 секунд. Допустимый размер гранул колебался от 1-5 микрон. Гомогенизированный зимозан инкубировали при 37°С в течении 30 минут в неинактивированной сыворотке мышей. Затем частички зимозана трижды отмывали в 10 миллилитрах забуференного физиологического раствора центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 минут. Опытной группе мышей зимозан вводили внутриселезёночно по 1мг в объме 0,1 мл физиологического раствора. Через 6 дней после введения мыши умерщвлялись цервико-спинальной дислокацией, и у них изымались селезёнки для взвешивания. Результаты отображены в Таблице 4.

Таблица 4. Увеличение веса селезенки от внутриселезёночного введения 1миллиграмма зимозана у мышей линии (CBA х C57BL/6)

ВЕС СЕЛЕЗЁНКИ (МГ) КОНТРОЛЬ 109 ± 21 ОПЫТ 237 ± 35*

* - Р < 0.05.

В этой же серии экспериментов была изучена противоопухолевая активность селезеночных иммуноцитов активированных всё тем же зимозаном. С этой целью на той же линии мышей было проведено нижеследующее исследование. За сутки до введения зимозана каждой опытной мышке в селезёнку инокулировали по 20 000 клеток мышинной меланомы В16. На следующие сутки мышам опытной группы внутривенно было введено по 2 миллиграмм зимозана растворенного в 0.5 мл физиологического раствора. По прошествии 21 дня от момента введения клеток меланомы мыши умерщвлялись цервико-спинальной дислокацией и производилось изъятие из тушек мышей печени и селезёнок для взвешивания и подсчетов. Результаты исследования отображены в таблице 5.

Таблица 5. Подавление роста мышиной меланомы В16 в печени и селезёнке мышей (CBA x C57BL/6) F1 после классической активации макрофагов с провоспалительным М1 функциональным фенотипом

Контроль (мг) + Зимозан (мг) Селезенка 278 ± 85 157 ± 61* Печень 786 ± 113 477 ± 30*

* - Р < 0.05 с контролем.

Выводы: после воздействия зимозана противоопухолевая активность спленоцитов селезёнки достоверно и существенно повысилась на 43%, наряду с этим значительно снизилась масса опухоли в печени, которая являлась следствием метастазирования клеток мышиной меланомы В16 из селезёнки, разница в весе между весом опухоли в печени контрольных мышей и мышей из опытной группы составила 39%.

В этой же серии экспериментов была изучена противоопухолевая активность печеночных и селезеночных макрофагов с М1 - функциональным фенотипом активированных по классической схеме. В опытах использовался общеизвестный активатор макрофагальных функций зимозан. С этой целью на той же линии мышей было проведено нижеследующее исследование. За сутки до введения зимозана в печень и селезёнку инокулировали по 20 000 клеток мышиной меланомы В16. Первую стадию активации - примирование у опытной группы мышей осуществляли внутривенным введением 2 миллиграмм зимозана растворённого в 0.5 мл физиологического раствора, по истечении трёх суток запускали вторую стадию активации - собственно активация, внутривенным введением 7,5 мкг триггерного агента - липополисахарида в 0.3 мл физиологического раствора. Результаты исследования отображены в таблице 6.

Таблица 6. Подавление роста мышиной меланомы В16 в печени и селезёнке мышей (CBA x C57BL/6) F1 после классической активации макрофагов с провоспалительным М1 функциональным фенотипом

Контроль
(мг) + Зимозан (мг) + Зимозан + ЛПС
(мг) + ЛПС (мг) Селезенка 278 ± 85 157 ± 61* 104 ± 67** 358 ± 89* Печень 786 ±113 477 ± 30* 285 ± 87* 1197 ± 156*

* - Р < 0.05 с контролем.

**- Р < 0.05 c группой «+ Зимозан».

Выводы:

1) после воздействия зимозана макрофаги примировались, и у них существенно повысилась противоопухолевая активность на 43% в селезёнке и 39% в печени;

2) внутривенное введение липополисахарида в группе мышей обработанных зимозаном, с целью мобилизации полного потенциала противоопухолевой активности макрофагов, привело к дополнительному увеличению противоопухолевой активности на 20% в селезенке и 25% в печени, что подтверждает наличие у животных двухступенчатого каскада классической схемы активации М1-провоспалительного фенотипа;

3) обработка мышей одним липополисахаридом, напротив, привела к стимуляции опухолевого роста меланомы В16, как печени, так и в селезенке, что согласуется с литературными данными.

Эксперимент №6 (пример препарата 3)

Целью эксперимента было выявить у ещё одного известного представителя гранулёмообразующих препаратов и макрофаг-примирующих агентов - каррагинана, способность к усилению барьерно-фильтрационной функции лимфатических узлов в отношении клеток злокачественных опухолей.

В эксперименте были использованы мыши (CBA x C57Bl/6) F1 в возрасте 6 месяцев, самцы весом 30-32 гр. Тестировался препарат k-каррагинан.

За сутки до введения опухолевых клеток мышам внутрибрюшинно вводили 0,5мг/мышь k-каррагинан, предварительно его растворяли в кипящей воде в течении 30минут, по истечении 24 часов у всех мышей выявлялась спленомегалия (увеличенная селезёнка). Повторное внутрибрюшинное введение каррагинана проводили через трое суток и в тот же день внутриселезёночно инокулировали клетки мышиной меланомы В16 в количестве 10000 клеток в 0.1 мл питательной среды RPMI1640. Оценка опухолевого роста проводилась на 21 день от начала введения мышиной меланомы В16. Результаты отражены в Таблице 7.

Таблица 7. Подавление роста мышиной меланомы В16 в печени и селезёнке мышей (CBA x C57BL/6) F1 после обработки мышей k-каррагинаном (вес опухоли в миллиграммах)

Контроль (мг) + Каррагинан (N) Селезенка 600 ± 185 единичные метастазы* Печень 2318 ± 413 единичные метастазы*

N - число опухолевых узелков.

Вывод: введение в гиперплазированную селезёнку, от воздействия k-каррагинана (также является примирующим агентом для инициации противоопухолевой активности у макрофагов), клеток мышиной меланомы В16 значительно предотвращает их проникновение (метастазирование) в печень, а также приводит к почти полному подавлению роста меланомы в самих селезёнках, куда изначально инокулировались последние.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для усиления барьерно-фильтрационной функции лимфоузлов в отношении клеток злокачественных опухолей. Способ включает эндолимфатическое введение лекарственного раствора, содержащего иммунотропный препарат с противоопухолевым действием. Мышам в эксперименте в качестве иммунотропного препарата с противоопухолевым действием вводят агенты, обладающие примирующим влиянием на функциональную активность макрофагов и гранулемообразующими свойствами, выбранные из: вакцины БЦЖ по 2,5 мг/мышь, зимозана по 2 мг/мышь, k-каррагинана по 0,5 мг/мышь, по прошествии 3 или 12 дней эндолимфатически дополнительно вводится триггерный агент липополисахарид по 7,5 мкг/мышь. Использование изобретения позволяет достичь усиления структурно-функциональных составляющих барьерно-фильтрационной функции лимфатического узла, замедления процесса метастазирования опухоли по лимфоузлам. 7 табл.

Способ усиления барьерно-фильтрационной функции лимфоузлов путем эндолимфатического введения лекарственного раствора, содержащего иммунотропный препарат с противоопухолевым действием, отличающийся тем, что мышам в эксперименте в качестве иммунотропного препарата с противоопухолевым действием вводят агенты, обладающие примирующим влиянием на функциональную активность макрофагов и гранулемообразующими свойствами, выбранные из: вакцины БЦЖ по 2,5 мг/мышь, зимозана по 2 мг/мышь, k-каррагинана по 0,5 мг/мышь, по прошествии 3 или 12 дней эндолимфатически дополнительно вводится триггерный агент липополисахарид по 7,5 мкг/мышь.