Способ оценки эффективности терапевтических конструкций, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN Российский патент 2024 года по МПК C12Q1/68 

Данное изобретение относится к медицине, фармацевтике, клинической генетике и может быть использовано для оценки эффективности препаратов, направленных на коррекцию сплайсинга пре-мРНК гена SMN2, а также основанных на доставке функциональной копии гена SMN1 на клеточной модели спинальной мышечной атрофии.

Спинальная мышечная атрофия (СМА) - одно из наиболее тяжелых наследственных нервно-мышечных заболеваний, приводящее в большинстве случаев к летальному исходу. СМА является аутосомно-рецессивным заболеванием, которое развивается вследствие мутаций в гене выживания моторных нейронов SMN1, расположенном на 5 хромосоме в локусе 5q13 (Lefebvre S., Reboullet S., Clermont O., Burlet P., Viollet L., Benichou В., Cruaud C, Millasseau P., Zeviani M., Le Paslier D., Cohen D., Weissenbach J., Munnich Α., Melki J. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell. 1995. 80(1), 155-165). Данный локус содержит обширную дупликацию, в результате которой ген SMN1 имеет функционально неполноценную копию - ген SMN2. Гены SMN1 и SMN2 различаются всего пятью нуклеотидами, при этом только замена С на Τ в 7 экзоне гена SMN2 является функционально значимой и нарушает сплайсинг пре-мРНК (Monani U., Lorson С, Parsons D., Prior Т., Androphy Ε., Burghes Α., McPherson J. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Human molecular genetics. 1999. 8(7), 1177-1183). В результате большинство транскриптов гена SMN2 лишены 7 экзона. Белок, транслируемый с усеченной мРНК, имеет неправильную конформацию и неактивен. При этом небольшое количество полноразмерных транскриптов, производимых геном SMN2, способно обеспечить клетку некоторым количеством функционального белка SMN. Ген SMN2 является основным модификатором СМА - у пациентов он является единственным источником белка SMN и количество его копий коррелирует с тяжестью заболевания (Mailman Μ., Heinz J., Papp Α., Snyder P., Sedra M., Wirth В., Burghes Α., Prior T. Molecular analysis of spinal muscular atrophy and modification of the phenotype by SMN2. Genetics in Medicine. 2002. 4(1), 20-26).

На сегодняшний день коррекция сплайсинга гена SMN2 является одним из наиболее эффективных подходов к терапии СМА наряду с доставкой функциональной копии гена SMN1 в клетки больных СМА. Подходы с использованием антисмысловых олигонуклеотидов (АО), комплементарных последовательностям сайленсоров сплайсинга, а также малых молекул, модифицирующих сплайсинг, легли в основу препаратов для терапии заболевания, мишенью для которых является пре-мРНК гена SMN2 (Spinraza, Risdiplam). Терапия с помощью препарата Zolgensma основана на доставке в клетки больных СМА гена SMN1 в составе вектора аденоассоциированного вируса (AAV9). При этом по-прежнему актуальна разработка новых препаратов, что позволит существенно снизить цену лечения пациентов. Помимо высокой стоимости, у существующих препаратов для терапии СМА имеется ряд недостатков, к которым относится неспецифичность доставки, постпункционный синдром (в случае препарата Spinraza), нарушение функций печени. Для разработки альтернативных подходов к терапии заболевания также возникает необходимость в точных методах оценки их эффективности in vitro.

Существующие функциональные тесты для оценки моторных функций пациентов позволяют определить эффективность препарата лишь по прошествии длительного времени. Кроме того, такие показатели не подходят для оценки эффективности препарата в доклинических испытаниях, при использовании в качестве модели заболевания клеточных культур. Очевидно, что для тестирования препаратов необходимо иметь молекулярные биомаркеры, которые позволяли бы быстро и точно оценить эффект препарата] на клеточной модели заболевания.

На сегодняшний день не существует общепризнанного молекулярного биомаркера СМА и оптимального метода оценки его показателей. Во многих исследованиях эффективность терапии определяли по изменению процента полнорамерных (FL-SMN) и усеченных транскриптов SMN (Δ7-SMN) методом полуколичественной ГТЦР с обратной траскрипцией (ОТ-ПЦР) с использованием радиоактивной метки (Singh Ν., Shishimorova Μ., CaonnL., Gangwani L., Singh R. A short antisense oligonucleotide masking a unique intronic motif prevents skipping of a critical exon in spinal muscular atrophy. RNA biology. 2009. 6(3), 341-350; Hua Y., Sahashi K., Hung G., Rigo F., Passini M., Bennett C, & Krainer A. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes & development. 2010. 24(15), 1634-1644; Keil J., Seo J., Howell M., Hsu W., Singh R., DiDonato C. A short antisense oligonucleotide ameliorates symptoms of severe mouse models of spinal muscular atrophy. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 2014. 3, e174). Также в ряде работ определяли уровень FL-SMN и Δ7-SMN, а также соотношение этих транскриптов, которые детектировали методом количественной ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) (Brichta L., Holker I., Haug K., Klockgether Т., Wirth, В. In vivo activation of SMN in spinal muscular atrophy carriers and patients treated with valproate. Annals of Neurology: Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society. 2006. 59(6), 970-975; Tiziano F., Pinto Α., Fiori S., Lomastro R., Messina S., Bruno C, Pini Α., Pane M., D’Amico Α., Ghezzo Α., Bertini E., Mercuri E., Neri G., Brahe C. SMN transcript levels in leukocytes of SMA patients determined by absolute real-time PCR. European journal of human genetics. 2010. 18(1), 52-58; Crawford Т., Paushkin S., Kobayashi D., Forrest S., Joyce C, Finkel R., Kaufmann P., Swoboda K., Tiziano D., Lomastro R., Li R., Trachtenberg F., Plasterer Т., Chen K. Evaluation of SMN protein, transcript, and copy number in the biomarkers for spinal muscular atrophy (BforSMA) clinical study. PloS one. 2012. 7(4), е33572). В работе Vezain et al., 2007 в качестве потенциального биомаркера рассматривали соотношение полноразмерных и усеченных транскриптов SMN, а также их относительный уровень, определенный методом количественной флуоресцентной ПЦР (КФ-ПЦР) (Vezain Μ., Saugier-Veber P., Melki J., Toutain Α., Bieth E., Husson M., Pedespan J.-M., Viollet L., Fehrenbach S., Bou J., Tosi M. A sensitive assay for measuring SMN mRNA levels in peripheral blood and in muscle samples of patients affected with spinal muscular atrophy. European journal of human genetics. 2007. 15(10), 1054-1062).

Несмотря на то, что в ряде перечисленных исследований было продемонстрировано изменение показателей указанных биомаркеров после воздействия препаратами, направленными на коррекцию сплайсинга гена SMN2, и в некоторых из работ были выявлены значимые различия в значениях исследуемых биомаркеров между пациентами со СМА и здоровыми индивидами, использование данных биомаркеров не всегда имеет под собой четкие экспериментально подтвержденные обоснования. В большинстве исследований, в которых оценивали эффективность терапии, не была предварительно проанализирована чувствительность используемого биомаркера и методики, на основе которой оценивали изменение показателей биомаркера. Такой анализ может быть проведен на образцах пациентов со СМА, носителей заболевания и здоровых индивидов. Поскольку для этих трех групп индивидов характерно разное число копий генов SMN1 и SMN2, выявление статистически значимых различий в значениях уровня или соотношения транскриптов SMN между этими группами будет подтверждать чувствительность выбранного биомаркера и метода его оценки. В исследованиях, посвященных анализу потенциальных биомаркеров СМА, четких различий между группами выявлено не было. В работе Crawford et al., 2012 различия в относительном уровне полноразмерных транскриптов SMN и соотношении FL-SMN к Δ7-SMN были выявлены только между пациентами со СМА и здоровыми индивидами. Интересно, что в работе Tiziano et al., 2010 уровень полноразмерных транскриптов SMN оказался даже выше у носителей заболевания по сравнению с группой здоровых индивидов.

В качестве потенциального биомаркера СМА рассматривается также уровень белка SMN. В ряде исследований с помощью Вестерн блоттинга и иммуноферментного анализа было продемонстрировано увеличение уровня белка SMN в культуре фибробластов пациентов со СМА и в крови пациентов в результате воздействия терапевтическими препаратами (Hua et al., 2007; thi Man et al., 2008; Singh et al., 2009; Kobayashi et al, 2011; Piepers et al., 2011). При этом показано, что уровень белка SMN сильно варьирует даже в пределах одной ткани в различные периоды времени, и его показатели могут меняться под воздействием таких факторов, как питание, инфекции и др. (thi Man et al., 2008; Kobayashi et al., 2011; Kobayashi et al., 2012; Groen et al., 2018).

В ряде исследований проводили сравнение уровня транскриптов и белка SMN у пациентов с I, II и III типами СМА. Четких различий между всеми тремя типами обнаружено не было (Crawford et al., 2012; Czech et al., 2015; Wadman et al., 2016). Стоит учесть, что выводы о чувствительности биомаркеров СМА и различных методик для их определения, сделанные на основе сравнения детектируемых показателей транскриптов и белка SMN между образцами пациентов с разными формами СМА, могут быть не совсем корректны, т.к. границы между разными типами СМА весьма условны.

В работе Sumner et al. уровень белка SMN оказался ниже только в крови пациентов с I формой СМА по сравнению с носителями заболевания и здоровыми индивидами, тогда как у пациентов со II и III формами СМА уровень SMN понижен не был (Sumner et al., 2006). На основе результатов исследований было сделано предположение, что уровень белка SMN может достигать определенного плато, выше которого он не поднимается, в то время как уровень полноразмерных и усеченных транскриптов SMN является более чувствительным биомаркером, который точнее демонстрирует эффективность терапевтических препаратов и различия между индивидами с различным числом копий генов SMN1 и SMN2 (Sumner et al., 2006; Also-Rallo et al., 2011).

Для оценки эффективности терапии определяют также изменение количества телец gems после воздействия терапевтическими молекулами (Mattis et al., 2006; Coady et al., 2008; Osman et al., 2011). Однако такой способ является трудозатратным и дорогостоящим, и поэтому не подходит для анализа большого количества образцов, но может выступать в качестве дополнительного метода проверки эффективности терапии.

Используемые методы для определения уровня транскриптов также имеют свои недостатки. При анализе транскриптов SMN методом ПЦР в реальном времени амплификация FL-SMN и Δ7-SMN транскриптов происходит с использованием различных пар праймеров в отдельных реакциях, в связи с чем эффективность амплификации может сильно различаться. При этом использование генов домашнего хозяйства в качестве референсных генов не совсем корректно, так как было показано, что их уровень экспрессии значительно варьирует не только межиндивидуально, но и у отдельно взятого индивида в разные периоды времени (Bustin S. Absolute quantification of mRNA using real-time reverse transcription polymerase chain reaction assays. Journal of molecular endocrinology. 2000. 25(2), 169-193; Tiziano et al., 2010). К тому же, в случае использования интеркалирующего красителя, постановка амплификации FL-SMN и Δ7-SMN транскриптов, а также референсных транскриптов в отдельных реакциях существенно увеличивает объем работы и не позволяет одновременно проанализировать большое количество проб. Тогда как использование флуоресцентно-меченых зондов для каждого гена значительно увеличивает стоимость анализа.

Во многих исследованиях, посвященных разработке подходов к терапии СМА с помощью антисмысловых олигонуклеотидов, результаты полуколичественной ОТ-ПЦР визуализируют с помощью нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора (Singh et al., 2009; Hua Y., Liu Y., Sahashi K., Rigo F., Bennett C, Krainer A. Motor neuron cell-nonautonomous rescue of spinal muscular atrophy phenotypes in mild and severe transgenic mouse models. Genes & development. 2015. 29(3), 288-297). Серьезным недостатком такого способа визуализации результатов является то, что используемый фосфор-32 представляет собой опасный радионуклид, для которого характерно излучение, сходное по своей природе с рентгеновским, и его проникающая способность очень высокая.

Таким образом, существует необходимость в выявлении чувствительного и надежного биомаркера для оценки эффективности терапевтических конструкций in vitro, а также доступного, быстрого и точного метода для детекции его показателей.

В основу настоящего изобретения положена задача разработки способа оценки эффективности терапевтических молекул, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN. Такой способ обеспечивается настоящим изобретением.

Достижение поставленной технической задачи обеспечивается тем, что в способе оценки эффективности терапевтических конструкций, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN, определяют долю полноразмерных и усеченных транскриптов SMN в образце после проведения ОТ-ПЦР с праймерами F 5’-GTCC AGATTCTCTTGATGAT-3’ и R 5’-CTATAACGCTTCACATTCCA-3’, компементарными последовательностям 6 и 8 экзонов генов SMN1 и SMN2, с последующей визуализацией продуктов амплификации с помощью электрофореза. Детекция продуктов амплификации проводится на экспоненциальной фазе.

В одном воплощении данного изобретения визуализация результатов производится на полиакриламидном геле при окрашивании в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл). Оценка интенсивности свечения продуктов амплификации проводится в программе Image J.

В другом воплощении изобретения один из праймеров мечен флуоресцентным красителем и визуализация продуктов амплификации производится с помощью капиллярного электрофореза. Значения уровня флуоресценции, соответствующие полноразмерным и усеченным транскриптам SMN, определяются в программе Gene Mapper (или в аналогичной программе, позволяющей обрабатывать результаты капиллярного электрофореза).

Доля FL-SMN рассчитывается как отношение значений, полученных для полноразмерных транскриптов, к общей сумме значений транскриптов FL-SMN+Delta7-SMN.

Важным условием существования изобретения являются данные о чувствительности указанного способа оценки эффективности терапевтических молекул, полученные при анализе доли полноразмерных и усеченных транскриптов SMN в образцах крови пациентов со СМА, носителей заболевания и здоровых индивидов с помощью вышеприведенных методик.

Изобретение поясняется с помощью фиг. 1-5.

На фиг. 1 показана визуализация результатов полуколичественной ОТ-ПЦР на полиакриламидном геле при окраске этидиум бромидом. В качестве матрицы в ОТ-ПЦР выступала кДНК, полученная из образцов РНК крови здоровых индивидов (а), носителей заболевания (b) и пациентов со СМА (с). I - полноразмерный транскрипт SMN (218 п. н.), II - усеченный транскрипт SMN (164 п. н.) На фиг. 2 продемонстрирован полуколичественный метод анализа полноразмерных и усеченных транскриптов SMN с помощью программы Image J. В данной программе выделяли области, соответствующие полноразмерному транскрипту SMN (I) и усеченному транскрипту SMN (II), и получали средние значения интенсивности их свечения по отношению к значению фона.

На фиг. 3 приведена визуализация результатов количественной флуоресцентной ОТ-ПЦР в программе Gene Mapper после проведения капиллярного электрофореза. По оси У отложен уровень флуоресценции, по оси X - размер амплифицируемого фрагмента (п.н.). Результаты, полученные данным методом, совпали с детектируемыми полуколичественным методом. Фиг. З а соответствует носителю СМА, фиг. 3b соответствует больному СМА. I - полноразмерный транскрипт SMN (218 п. н.), II - усеченный транскрипт SMN (164 п. н.).

На фиг. 4 показана доля полноразмерных транскриптов SMN у здоровых индивидов (а), носителей заболевания (b) и пациентов со СМА (с) после проведения ОТ-ПЦР. Значение доли FL-SMN рассчитывалось как отношение значений, полученных в программе ImageJ для полноразмерных транскриптов, к общей сумме значений транскриптов FL-SMN+Delta7-SMN. Были выявлены статистически значимые различия по значениям данного показателя между тремя группами обследуемых (*** - ρ<0,001).

Т.о. результаты на фиг. 1-4 свидетельствуют о чувствительности выбранного биомаркера и методов оценки его показателей, которые легли в основу данного изобретения, и указывают на целесообразность их использования в качестве способа оценки эффективности терапевтических молекул, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN.

На фиг. 5 приведены результаты трансфекции фиброб ластов СМА антисмысловыми олигонуклеотидами. Для коррекции сплайсинга пре-мРНК гена SMN2 на основе литературных данных был выбран терапевтический РНК олигонуклеотид 3UP8 (1), комплементарный сайленсеру сплайсинга ISS-N1 в 7 интроне, а также контрольный олигонуклеотид F8 (2), который не продемонстрировал терапевтического эффекта в предыдущих исследованиях (Singh et al., 2009). В качестве носителя мы выбрали коммерческий носитель X-tremeGENE, который разработан специально для доставки РНК-олигонуклеотидов в клетки. Были протестированы различные весовые соотношения носитель:РНК (10:1, 5:1) и различные концентрации РНК (100 nM и 200 nM). Также для сравнения были проведены трансфекции клеток терапевтической РНК без носителя (3). Долю полноразмерных транскриптов оценивали с помощью методик полуколичественной ОТ-ПЦР и количественной флуоресцентной ПЦР, полученные результаты объединяли. Было показано значимое дозозависимое увеличение доли полноразмерных транскриптов SMN по отношению к интактным клеткам после доставки в клетки терапевтического РНК-олигонуклеотида 3UP8 (* - ρ<0,05, *** - ρ<0,001, приведена стандартная ошибка среднего).

Осуществление изобретения можно пояснить следующим образом. Задача настоящего изобретения состоит в обеспечении способа оценки эффективности терапевтических молекул, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN на клеточной модели СМА.

На первом этапе осуществляют доставку терапевтических конструкций в клеточные модели СМА при проведении доклинических испытаний. По прошествии не менее суток, необходимых для проявления терапевтического эффекта препарата, из клеток выделяют РНК, на основе которой синтезируют кДНК. Далее данную кДНК используют в качестве матрицы в ПЦР с праймерами F 5’-GTCCAGATTCTCTTGATGAT-3’ и R 5’-CTATAACGCTTCACATTCCA-3’, комплементарными последовательностям 6 и 8 экзонов генов SMN1 и SMN2.

В одном воплощении данного изобретения продукты амплификации разгоняют на 6-7,5% полиакриламидном геле, окрашивают в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл) и фотографируют на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете (длина волны 380 нм). Далее в программе Image J выделяют области с одинаковой площадью, соответствующие транскриптам FL-SMN и Delta7-SMN, а также область фона, и для каждой выделенной области получают средние значения интенсивности свечения (фиг. 1, 2). Из полученных значений, соответствующих областям анализируемых транскриптов, вычитают значения области фона.

В другом воплощении изобретения праймер F мечен флуоресцентным красителем FAM. После проведения ПЦР продукты амплификации визуализируют с помощью капиллярного электрофореза. В программе Gene Mapper (или в аналогичной программе, позволяющей обрабатывать результаты капиллярного электрофореза) получают значения уровня флуоресценции, соответствующие полноразмерным и усеченным транскриптам SMN (фиг. 3).

В обоих воплощениях долю полноразмерных транскриптов рассчитывают как отношение значений интенсивности свечения (или флуоресценции) данных транскриптов к сумме значений FL-SMN и Delta7-SMN транскриптов. Аналогично рассчитывают долю усеченных транскриптов.

Эффективность действия терапевтических молекул оценивают по отношению к интактным клеткам, к которым не добавляли терапевтических конструкций (фиг. 5).

Пример 1. Определение доли полноразмерных транскриптов SMN у пациентов со СМА, носителей заболевания и здоровых индивидов.

На первом этапе из образцов крови 31 здорового индивида, 44 носителей заболевания и 32 пациентов со СМА выделяли РНК с помощью TRIzol реагента (Ambion, USA), далее синтезировали кДНК с использованием M-MLV обратной транскриптазы и случайных гекса праймеров и проводили ПЦР с праймерами F 5’-GTCCAGATTCTCTTGATGAT-3’ и R 5’-CTATAACGCTTCACATTCCA-3’. Для наиболее корректного определения соотношения транскриптов анализ продуктов амплификации осуществлялся на экспоненциальной фазе ПЦР. В связи с различной концентрацией кДНК в каждом образце количество циклов амплификации подбирали для каждого образца индивидуально.

Для визуализации результатов полуколичественной ОТ-ПЦР продукты амплификации разделяли в 6% полиакриламидном геле. Гель окрашивали в водном растворе этидиум-бромида (0,5 мкг/мл) и фотографировали на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете (длина волны 380 нм). Оценка интенсивности свечения продуктов амплификации проводилась в программе Image J.

Для каждой группы в программе Excel было посчитано среднее значение доли FL-SMN. Были выявлены статистически значимые различия по значениям данного показателя между тремя группами обследуемых (*** - ρ<0,001). Результаты представлены на фиг. 4.

Поскольку пациенты со СМА, носители заболевания и здоровые индивиды четко различаются по значениям доли полноразмерных транскриптов SMN, был сделан вывод о том, что данный показатель может рассматриваться как перспективный биомаркер спинальной мышечной атрофии и может быть предложен как критерий эффективности терапевтических конструкций, направленных на повышение доли полноразмерных транскриптов SMN. А определение показателей данного биомаркера с помощью описанной методики может выступать в качестве подходящего способа оценки эффективности препаратов, разрабатываемых для терапии СМА.

Пример 2. Определение доли полноразмерных транскриптов SMN в культурах фибробластов пациентов после проведение трансфекций антисмысловыми РНК-олигонуклеотидами.

Для проведения трансфекций фибробласты рассеивали на 24-луночном планшете (Nunc) за сутки до проведения трансфекции в объеме 500 мкл на лунку в среде ДМЕМ с L-глутамином (Биолот) и 10% фетальной сывороткой (Gibco).

В день проведения трансфекции приготавливали раствор РНК с носителем X-tremeGENE, перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин, затем добавляли комплексы РНК. Через 4 часа меняли среду в лунках на полную ДМЕМ с сывороткой и антибиотиком. Планшет с клетками инкубировали в термостате при температуре 37°С и 5% содержанием СО₂ в течение 48 часов.

Через двое суток клетки снимали трипсин-версеном 3:1 (Биолот), выделяли РНК, синтезировали кДНК и ставили ПЦР в соответствие с примером 1. Помимо обычной ПЦР, проводили КФ-ПЦР. Долю полноразмерных транскриптов SMN оценивали в программе Image J и программе Gene Mapper, на основе полученных значений находили среднее.

Было показано статистически значимое увеличение доли полноразмерных транскриптов SMN по сравнению с интактными клетками после доставки в клетки терапевтического РНК-олигонуклеотида 3UP8 (* - ρ<0,05, *** - ρ<0,001). При этом эффективность коррекции сплайсинга коррелировала с концентрацией 3UP8. Контрольный РНК-олигонуклеотид F8, а также РНК без носителя не приводили к повышению доли полноразмерных транскриптов SMN. Результаты представлены на фиг. 5.

Таким образом, нами был разработан способ оценки эффективности терапевтических конструкций, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN in vitro, чувствительность которого была подтверждена при сравнении доли FL-SMN транскриптов у пациентов со СМА, носителей заболевания и здоровых индивидов.

Изобретение относится к медицине, фармацевтике, клинической генетике. Предложен способ оценки эффективности терапевтических конструкций in vitro, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN. Принцип заключается в определении доли полноразмерных и усеченных транскриптов SMN в образце после проведения ОТ-ПЦР с праймерами, компементарными последовательностям 6 и 8 экзонов генов SMN1 и SMN2, с последующей визуализацией продуктов амплификации с помощью электрофореза. Изобретение позволяет оценивать эффективность терапевтических конструкций, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN in vitro. А именно, данное изобретение может применяться для анализа эффекта терапевтических препаратов, направленных на коррекцию сплайсинга пре-мРНК гена SMN2, а также основанной на доставке функциональной копии гена SMN1 на клеточной модели СМА. 5 ил., 2 пр.

Способ оценки эффективности терапевтических конструкций in vitro, направленных на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN, характеризующийся тем, что в качестве биомаркера СМА рассматривают долю полноразмерных транскриптов SMN, производят амплификацию с использованием праймеров F 5'-GTCCAGATTCTCTTGATGAT-3' и R 5'-CTATAACGCTTCACATTCCA-3', детекцию продуктов амплификации проводят на экспоненциальной фазе, при этом детекцию результатов ОТ-ПЦР производят или на полиакриламидном геле без использования радиоактивной метки с последующим анализом в программе Image J, или праймер F 5'-GTCCAGATTCTCTTGATGAT-3' метят флуоресцентным красителем FAM, и детекцию результатов ОТ-ПЦР производят с помощью капиллярного электрофореза, анализируют долю полноразмерных транскриптов SMN у пациентов со СМА, носителей заболевания и здоровых индивидов; эффективность терапевтических конструкций оценивают относительно интактных клеток больного СМА, при этом если доля полноразмерных транскриптов SMN в трансфецированных клетках превышает долю полноразмерных транскриптов, наблюдаемых в интактных клетках, то терапевтические конструкции, направленные на повышение уровня полноразмерных транскриптов SMN, являются эффективными; если доли полноразмерных транскриптов SMN достигают значений, характерных для носителей СМА или здоровых индивидов, то терапевтические конструкции также эффективны.