Генетическая конструкция, содержащая последовательности химерных направляющих РНК для делеции гена SMN1 человека в культурах клеток человека Российский патент 2024 года по МПК C12N15/85 

Область техники

Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается генетической конструкции, несущей гены направляющих РНК с последовательностями, специфичными к фланкирующим областям экзона 7 гена SMN1 человека, под управлением промоторов U6. Изобретение может служить для нокаута гена SMN1 человека в культурах клеток для получения клеточных моделей для испытания препаратов для борьбы со спинальными мышечными атрофиями.

Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального государственного бюджетного учреждения «Фонд содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере» (Фонд содействия инновациям) в рамках Договора (Соглашения) №№4174ГС1/68618 от 23.07.2021.

Уровень техники

Спинальная мышечная атрофия (СМА) является тяжелым аутосомно-рецессивным нейродегенеративным заболеванием, характеризующимся прогрессирующей слабостью и атрофией проксимальных мышц, возникающих в результате дегенерации альфа-нейронов в передних рогах спинного мозга. Несмотря на то, что глобальная оценочная заболеваемость СМА не превышает 1 случая на 10000 живорождений (Verhaart, I. E. С. Prevalence, incidence and carrier frequency of 5q-linked spinal muscular atrophy a literature review / I. E. C. Verhaart, A. Robertson, I. J. Wilson, A. Aartsma-Rus, S. Cameron, С.C. Jones et al. // Orphanet J Rare Dis. - 2017. - v. 12. - P. 15.), данное заболевание является вторым по распространенности аутосомно-рецессивным наследственным заболеванием в мире и, более того, является наиболее распространенным моногенным заболеванием, приводящим к младенческой смертности. Частота встречаемости мутантного аллеля СМА варьирует от 1 на 38 до 1 на 72 случая, что в среднем в популяции составляет 1 на 54 (Chen, Т. New and Developing Therapies in Spinal Muscular Atrophy: From Genotype to Phenotype to Treatment and Where Do We Stand? / T. Chen // Int J Mol Sci. - 2020. v. 21. P. 3297.).

Причиной развития СМА более чем в 95% случаев является снижение уровня экспрессии белка выживания моторных нейронов SMN (Survival of Motor Neuron), возникающее в результате гомозиготной делеции или конверсии гена SMN1. В геноме находится практически идентичный аналог этого гена - SMN2, однако он обеспечивает только 10-15% синтеза функционального белка (Blasco-Perez, L. Beyond copy number: A new, rapid, and versatile method for sequencing the entire SMN2 gene in SMA patients / L. Blasco-Perez, I. Paramonov, J. Leno, S. Bernal, L. Alias, P. Fuentes-Prior et al. // Hum Mutat. -2021.-v. 42. - P. 787-795.).

Именно гены SMN1 и SMN2 являются главными мишенями для разработки современных методов терапии спинальной мышечной атрофии. В настоящее время три препарата - Нусинерсен ("Спинраза"; Biogen), Рисдиплам ("Эврисди"; Roche) и Онасемноген абепарвовек ("Золгенсма"; Novartis) - одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) и Европейским агентством по лекарственным средствам (ЕМА). Все одобренные препараты имеют крайне высокую стоимость, достигающую несколько миллионов долларов, в связи с этим они недоступны для большинства населения. В России и других странах идет разработка терапевтических и генотерапевтических подходов для борьбы с этими заболеваниями и для их испытания требуется биологическая модель. В качестве такой модели может выступать клеточная линия с делецией гена SMN1. Создание генно-инженерной конструкции для быстрого нокаута гена SMN1 в любой клеточной линии человека позволит в короткие сроки получать удобные модели для исследования эффективности терапии спинальных мышечных атрофий.

Раскрытие сущности изобретения

В данном изобретении гены направляющих РНК кодируют хнРНК комплементарные фланкирующим областям 7 экзона гена SMN1 человека. В кассете располагаются два гена направляющих РНК под управлением промотора U6, после каждого гена находится конститутивная часть (scaffold) (фигура). Генетическая кассета пригодна для клонирования в любую генетическую конструкцию и обеспечивает нокаут целевого гена SMN1 человека при работе в комплексе с эндонуклеазами типа Cas, узнающими РАМ-мотив NGG. Наличие промотора U6 будет обеспечивать синтез хнРНК, комплементарных фланкирующим областям экзона 7 гена SMN1, в культуре клеток, для направления нуклеазы и вырезания экзона 7 указанного гена.

Задачей заявляемого изобретения является применение для создания модельных клеточных линий с нокаутом гена SMN1, моделирующих спинальную мышечную атрофию человека для исследования терапевтических подходов.

Задача решается тем, что получена новая генетическая конструкция pDUAL_GUIDE_SMN1, для чего:

1. Попарно одноцепочечные олигонуклеотиды SMN1_G1-Up (SEQ ID NO:1) и SMN1_G1-Down (SEQ ID NO:2), а также SMN1_G2-Up (SEQ ID NO:3) и SMN1_G2-Down (SEQ ID NO:4) гибридизуются друг с другом с образованием двуцепочечных молекул G1 и G2 соответственно длиной 24 пары нуклеотидов каждая с липкими концами САСС и АААС, каждая из которых кодирует ген направляющей РНК.

2. Генетическая конструкция для клонирования двух направляющих РНК G1 и G2 под управлением промоторов U6 для каждой из них гидролизуется с помощью эндонуклеазы рестрикции BbsI с образованием липких концов. Далее гидролизованная конструкция смешивается с двуцепочечной молекулой G2 и происходит лигирование с помощью ДНК-лигазы фага Т4 и последующее клонирование в бактериальных клетках Escherichia coli штамма NEB Stable.

3. После выделения готовых конструкций, несущих ген направляющей РНК G2, производится их гидролиз эндонуклеазой рестрикции BsaI с образованием липких концов. Далее гидролизованная конструкция смешивается с двуцепочечной молекулой G1 и происходит лигирование с помощью ДНК-лигазы фага Т4 и последующее клонирование в бактериальных клетках Escherichia coli штамма NEB Stable.

4. Подтверждение правильности сборки конструкции pDUAL_GUIDE_SMN1 осуществляется с помощью секвенирования по методу Сенгера.

Технический результат изобретения: получена генетическая конструкция, несущая гены направляющих РНК G1 и G2 под управлением промоторов U6, обеспечивающая направление нуклеаз системы CRISPR, узнающих РАМ NGG и конститутивную часть (scaffold) к фланкирующим областям экзона 7 гена SMN1 человека.

Изобретение иллюстрируется фигурой и перечнем использованных последовательностей.

Краткое описание чертежей

На фигуре представлена схема конструкции pDUAL_GUIDE_SMN1. Два гена направляющих РНК расположены между собственными промоторами U6 и конститутивными частями (scaffold).

Осуществление изобретения

Способ осуществляется следующим образом:

Получение генов направляющих РНК. Олигонуклеотиды SMN1_G1-Up (SEQ ID NO:1) и SMN1_G1-Down (SEQ ID NO:2), а также SMN1_G2-Up (SEQ ID NO:3) и SMN1_G2-Down (SEQ ID NO:4) гибридизовали попарно в буфере, содержащем: 65 mM Tris-HCl (рН 8,9), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 1,5 mM MgCl₂, 0,05% Tween-20, по температурной схеме 96°С - 10 мин, 85°С - 5 мин, 80°С - 5 мин, 75°С - 5 мин, 70°С - 5 мин, 65°С - 5 мин, 60°С - 5 мин, 55°С - 5 мин, 50°С - 5 мин, 45°С - 5 мин, 40°С - 5 мин, 35°С - 5 мин.

Генетическую конструкцию pDUAL_GUIDE, несущую сайты клонирования двух генов направляющих РНК гидролизовали с помощью эндонуклеазы рестрикции BbsI (SibEnzyme) и очищали с помощью экстракции из агарозного геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

Лигирование гена направляющей РНК G2 и выделенного из геля фрагмента проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Thermo Fisher Scientific). Расчет необходимого количества фрагментов для проведения реакции лигирования производился с помощью онлайн калькулятора NEBioCalculator (NEB). Для успешного прохождения реакции было выбрано соотношение копий ДНК вставок относительно копий ДНК вектора 7 к 1, при этом на реакцию было взято 100 нг фрагмента. Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки NEB Stable (NEB), колонии скринировали, наращивали в ночной культуре, плазмидную ДНК из них выделяли и проводили второй этап клонирования.

Плазмиду гидролизовали с помощью эндонуклеазы рестрикции BsaI (SibEnzyme) и очищали с помощью экстракции из агарозного геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).

Лигирование гена направляющей РНК G1 и выделенного из геля фрагмента проводили с помощью ДНК-лигазы фага Т4 (Thermo Fisher Scientific). Расчет необходимого количества фрагментов для проведения реакции лигирования производился с помощью онлайн калькулятора NEBioCalculator (NEB). Для успешного прохождения реакции было выбрано соотношение копий ДНК вставок относительно копий ДНК вектора 7 к 1, при этом на реакцию было взято 100 нг фрагмента. Лигазную смесь трансформировали в компетентные клетки NEB Stable (NEB), колонии скринировали, наращивали в ночной культуре, плазмидную ДНК из них выделяли и проводили секвенирование по методу Сенгера для подтверждения структуры.

--->

Перечень последовательностей

<110> ОБЩЕСТВО С ОГРАНИЧЕННОЙ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ ТРАНСГЕН

(OBSCHESTVO S OGRANICHENNOI OTVETSTVENNOSTYU TRANSGEN)

<120> Генетическая конструкция, содержащая последовательности химерных

направляющих РНК для делеции гена SMN1 человека в культурах клеток человека

<160> 4

<210> 1

<211> 24

<212> ДНК

<213> artifficial sequence

<220> олигонуклеотид

<223> SMN1_G1-Up

<400> 1 tgc tgt gta cag tgc agt atg cct 24 н.

<210> 2

<211> 24

<212> ДНК

<213> artifficial sequence

<220> олигонуклеотид

<223> SMN1_G1-Down

<400> 1 aaa cag gca tac tgc act gta cac 24 н.

<210> 3

<211> 24

<212> ДНК

<213> artifficial sequence

<220> олигонуклеотид

<223> SMN1_G2-Up

<400> 1 cac cgg gtc tca tta tgt tgc cca 24 н.

<210> 4

<211> 24

<212> ДНК

<213> artifficial sequence

<220> олигонуклеотид

<223> SMN1_G2-Down

<400> 1 aaa ctg ggc aac ata atg aga ccc 24 н.

<---

Изобретение относится к областям молекулярных биотехнологии и медицины и касается генетической конструкции, несущей гены направляющих РНК, комплементарных фланкирующим областям экзона 7 гена SMN1 человека. Наличие промоторов U6 обеспечивает экспрессию в клетках человека, а наличие конститутивной части (scaffold) обеспечивает узнавание синтезированных в клетке направляющих РНК нуклеазами системы CRISPR, узнающими РАМ NGG. Изобретение позволяет создать клеточные линии, моделирующие спинальную мышечную атрофию человека, которые могут быть использованы для исследования средств терапии данного заболевания. 1 ил.

Рекомбинантная кассета DUAL_GUIDE_SMN1, предназначенная для синтеза в клеточных линиях человека направляющих РНК, комплементарных фланкирующим последовательностям экзона 7 гена SMN1 человека для его нокаута и создания модельных клеточных линий для исследования методов терапии спинальной мышечной атрофии, имеет размер 743 пары нуклеотидов и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на Фиг. 1, два гена направляющих РНК (G1 и G2), имеющих нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 3 длиной 24 нуклеотида каждая, включая сайты рестрикции, комплементарные фланкирующим последовательностям 7 экзона гена SMN1 человека, и состоит из следующих элементов:

a) промотор U6, имеющий координаты с 11 по 251 пару нуклеотидов и с 378 по 618 пару нуклеотидов, для обеспечения транскрипции генов направляющих РНК с помощью клеточной ДНК-зависимой РНК полимеразы III;

b) вариабельные фрагменты химерных направляющих РНК, имеющие координаты с 260 по 279 пару нуклеотидов для G2 варианта и с 627 по 646 пару нуклеотидов для G1 варианта, комплементарные целевым фланкирующим последовательностям экзона 7 гена SMN1 человека;

c) конститутивная часть химерных направляющих РНК, имеющая координаты с 280 по 355 пару нуклеотидов для G2 варианта и с 647 по 722 пару нуклеотидов для G1 варианта, для обеспечения узнавания хнРНК эндонуклеазами системы CRISPR.