МОЛЕКУЛА ОЛИГОМЕРНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2025 года по МПК C12N15/113 A61K48/00 A61P21/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[1] Настоящее изобретение касается области техники «нуклеиновые кислоты», в частности молекулы олигомерной нуклеиновой кислоты, связанной с активацией гена, и ее применения.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[2] Спинальная мышечная атрофия (СМА) - это наследственное нервно-мышечное заболевание, характеризующееся прогрессирующей слабостью и атрофией скелетных мышц и дыхательной мускулатуры, которое чаще, чем какие-либо другие наследственные заболевания, является причиной смерти у детей младше двух лет. В соответствии с клинической классификацией, СМА подразделяют на четыре типа в зависимости от возраста начала заболевания и степени его тяжести - от наиболее тяжелой СМА I типа до наиболее легкой СМА IV типа (1). СМА является одним из самых распространенных аутосомно-рецессивных заболеваний детского возраста. Частота возникновения СМА у живых новорожденных составляет 1/11 000, в то время как частота встречаемости у взрослых носителей колеблется от менее 1/67 до 1/40 (2); при этом в китайской популяции частота носительства составляет около 1/42 (3).

[3] СМА вызывается мутацией гена SMN1 (белка выживания моторных нейронов-1, Survival of Motor Neuron 1), а пациенты с СМА являются носителями различного количества копий высокогомологичного гена SMN2 (4; 5). Ген SMN1 и ген SMN2 расположены в области 5q13 хромосомы и кодируют один и тот же белок выживания моторных нейронов (SMN). Ген SMN2 отличается от гена SMN1 на 11 нуклеотидов, в то время как остальные нуклеотиды у них совпадают. Из 11 нуклеотидов только один расположен в кодирующей области SMN2: это - C (цитозин), шестой нуклеотид экзона 7, который заменен на T (C6T) и находится в области экзонного энхансера сплайсинга. Такое замещение не меняет кодирующую последовательность, но изменяет эффективность сплайсинга экзона 7 SMN2, что приводит к тому, что большинство матричных РНК-предшественников (пре-мРНК) SMN2 теряют экзон 7 при сплайсинге, а также к трансляции очень нестабильного мутантного белка SMN (SMNΔ7) и небольшого количества полноразмерного белка SMN с нормальной функцией (5; 6). Вследствие этого у пациентов с СМА функция полноразмерного белка SMN, который в небольшом количестве синтезируется с гена SMN2, оказывается недостаточной для того, чтобы компенсировать потерю белка SMN, вызванную мутацией гена SMN1. Таким образом, любой метод, способный повысить уровень экспрессии полноразмерного белка SMN, считываемого с гена SMN2, может быть полезным для лечения СМА.

[4] Эффективность стратегий модуляции сплайсинга SMN2 для увеличения количества полноразмерного белка с помощью низкомолекулярных соединений или олигонуклеотидов продемонстрирована в моделях на животных и в клинических исследованиях (7-11). Так, в 2016 году FDA одобрило антисмысловой олигонуклеотид Спинраза в качестве первого олигонуклеотидного препарата для лечения СМА у детей и взрослых. Хотя регуляция сплайсинга пре-мРНК является эффективной стратегией терапии, ее эффективность ограничена доступным количеством пре-мРНК SMN2. Если уровень экспрессии пре-мРНК SMN2 самой по себе не меняется или является низким, то количество полноразмерного белка SMN, индуцируемого терапией, также ограничено. Другая стратегия повышения уровня белка SMN состоит в повышении уровня транскрипции SMN2, с тем чтобы экспрессия полноразмерного белка SMN2 также увеличивалась. Исследования показали, что низкомолекулярные ингибиторы гистондеацетилазы (ингибиторы HDAC) могут активировать ген SMN2 и повышать уровень транскрипции SMN2 за счет подавления активности гистондеацетилазы, что приводит к выработке большего количества пре-мРНК SMN2; эффективность такой стратегии продемонстрирована в моделях СМА на животных (12; 13). Однако низкомолекулярные ингибиторы HDAC не продемонстрировали клинической эффективности у пациентов (людей) с СМА. Возможная причина состоит в том, что, подавляя активность гистондеацетилазы, ингибиторы HDAC могут активировать многие другие гены, поэтому они не проявляют специфичности и высокой активности в отношении промотора SMN2 (14; 15). Предметом настоящего изобретения является новая молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты, которая способна активировать транскрипцию SMN2 с высокой специфичностью, действуя на промотор гена SMN2.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[5] Для того чтобы решить упомянутую выше проблему, в рамках настоящего изобретения предложена молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты, в частности короткой активирующей РНК (каРНК), которая помогает при лечении заболеваний или состояний, вызванных дефицитом полноразмерного белка SMN, таких как СМА, путем активации/стимуляции транскрипции SMN2 и повышения уровня экспрессии полноразмерного белка SMN за счет механизма активации РНК (акт. РНК).

[6] Одним из аспектов настоящего изобретения является молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты (в частности молекула каРНК), активирующая/стимулирующая экспрессию гена SMN2 в клетке, причем одна цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты по крайней мере на 75% гомологична или комплементарна фрагменту длиной 16-35 нуклеотидов в промоторной области гена SMN2, благодаря чему она активирует или стимулирует экспрессию гена, причем промоторная область содержит последовательность из 2000 пар оснований (п. о.), расположенную выше сайта начала транскрипции. В конкретном случае, одна цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты по крайней мере на 75% (например, по крайней мере на примерно 79%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 99%) гомологична или комплементарна фрагменту длиной 16-35 постоянных нуклеотидов в положениях от -1639 до -1481 (SEQ ID №: 476), в положениях от -1090 до -1008 (SEQ ID №: 477), в положениях от -994 до -180 (SEQ ID №: 478) или в положениях от -144 до -37 (SEQ ID №: 479) выше сайта начала транскрипции промотора гена SMN2. В более конкретном случае, одна цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты по крайней мере на 75% (например, по крайней мере на примерно 79%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 99%) гомологична или комплементарноа любой последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID №: 315-471.

[7] Согласно настоящему изобретению, молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты содержит фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты, причем фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты содержат комплементарные области, способные формировать между двумя фрагментами структуру двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая может индуцировать экспрессию гена SMN2 в клетке по механизму акт. РНК. Фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты могут находиться как в двух разных цепях нуклеиновой кислоты, так и в одной цепи нуклеиновой кислоты. Если фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты находятся в двух разных цепях, то как минимум одна цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты имеет «липкий» 3'-конец в длиной от 0 до 6 нуклеотидов, а, предпочтительно, обе цепи имеют «липкий» 3'-конец длиной от 2 до 3 нуклеотидов, причем нуклеотидом «липкого» конца является предпочтительно dT. Если фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты находятся в одной цепи нуклеиновой кислоты, то молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты предпочтительно представляет собой «шпильку», образованную одной цепью нуклеиновой кислоты, причем комплементарные области фрагмента смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмента антисмысловой нуклеиновой кислоты образуют между собой структуру двухцепочечной нуклеиновой кислоты. В упомянутой выше молекуле короткой активирующей нуклеиновой кислоты фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты имеют длину от 16 до 35 нуклеотидов (например, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 или 35 нуклеотидов).

[8] В одном варианте осуществления изобретения смысловая цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, по крайней мере на 75% (например, по крайней мере на примерно 79%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 99%) гомологична любой последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID №: 1-157, а антисмысловая цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, по крайней мере на 75% (например, по крайней мере на примерно 79%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или примерно 99%) гомологична любой последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID №: 158-314. В конкретном случае, смысловая цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, содержит, представляет собой или состоит из любой последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID №: 1-157; а антисмысловая цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, содержит, представляет собой или состоит из любой последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID №: 158-314.

[9] В молекуле короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, все нуклеотиды могут быть природными или модифицированными нехимическим путем, или как минимум один нуклеотид модифицирован химически, причем химическая модификация представляет собой одну или несколько модификаций из числа перечисленных ниже:

(1) модификация фосфодиэфирной связи между нуклеотидами в нуклеотидной последовательности молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты;

(2) модификация 2'-OH рибозы в нуклеотидной последовательности молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты; и

(3) модификация нуклеотидного основания в молекуле короткой активирующей нуклеиновой кислоты.

[10] Химическая модификация, описанная в данном документе, представляет собой модификацию, хорошо известную специалистам в данной области; при этом модификация фосфодиэфирной связи относится к модификации кислорода в фосфодиэфирной связи, в том числе фосфоротиоатной и боранофосфатной модификации. Оба типа модификации могут стабилизировать структуру каРНК и поддерживать высокую специфичность и высокую аффинность при спаривании оснований.

[11] Модификация рибозы относится к модификации 2'-OH в пентозном кольце нуклеотида, т. е. к введению определенных заместителей в гидроксильные положения рибозы, например 2'-фтор-модификация, 2'-оксиметил-модификация, 2'-оксиэтилиденметокси-модификация, 2,4'-динитрофенол-модификация, модификация для получения закрытой нуклеиновой кислоты (LNA), 2'-амино-модификация и 2'-деокси-модификация.

[12] Модификация основания относится к модификации нуклеотидного основания, например 5'-бромурацил-модификация, 5'-йодурацил-модификация, N-метилурацил-модификация и 2,6-диаминопурин-модификация.

[13] Эти модификации могут повысить биодоступность молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, увеличить аффинность связывания с целевой последовательностью, а также повысить устойчивость к гидролизу под действием нуклеаз в клетке.

[14] Кроме того, для увеличения эффекта, оказываемого короткой активирующей нуклеиновой кислотой в клетке, к концу смысловой цепи или антисмысловой цепи молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты можно присоединить липофильную группу, например, холестерин, что позволит облегчить трансмембранный перенос через двухслойную липидную клеточную мембрану и оболочку ядра для ее связывания с промотором гена-мишени в клеточном ядре.

[15] Попав в клетку, молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, может эффективно активировать или стимулировать экспрессию гена SMN2 в клетке, предпочтительно стимулируя экспрессию не менее чем на 10%.

[16] Одним из аспектов настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, кодирующая молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе. В одном варианте осуществления изобретения молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, представляет собой молекулу короткой активирующей РНК (каРНК). В одном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота представляет собой молекулу ДНК.

[17] Одним из аспектов настоящего изобретения является клетка, содержащая молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе. В одном варианте осуществления изобретения клетка представляет собой клетку млекопитающего, предпочтительно человека. Упомянутая выше клетка может существовать in vitro, например в виде клеточной линии или клеточного штамма, либо присутствовать в организме млекопитающего, например человека.

[18] Другим аспектом настоящего изобретения является композиция, например фармацевтическая композиция, которая содержит упомянутую выше молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, и, опционально, фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления изобретения фармацевтически приемлемый носитель включает водный носитель, липосому, высокомолекулярный полимер или полипептид. В одном варианте осуществления изобретения фармацевтически приемлемый носитель выбирается из водного носителя, липосомы, высокомолекулярного полимера или полипептида. В одном варианте осуществления изобретения водный носитель может представлять собой, например, воду, не содержащую РНКаз, или буфер, не содержащий РНКаз. Композиция может содержать упомянутую выше молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, в концентрации 1-150 нМ (например, 1-100 нМ, 1-50 нМ, 1-20 нМ, 10-100 нМ, 10-50 нМ, 20-50 нМ, 20-100 нМ или 50 нМ).

[19] Другой аспект настоящего изобретения касается применения упомянутой выше молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или композиции, содержащей упомянутую выше молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, для приготовления препарата, служащего для активации/стимуляции экспрессии гена SMN2 в клетке.

[20] Настоящее изобретение также касается метода активации/стимуляции экспрессии гена SMN2 в клетке, где данный метод включает введение в клетку упомянутой выше молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или композиции, содержащей упомянутую выше молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе.

[21] Упомянутую выше молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или композицию, содержащую упомянутую выше молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, можно ввести непосредственно в клетку или произвести в клетке по нуклеотидной последовательности, кодирующей молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, введенной в клетку. Клетка предпочтительно представляет собой клетку млекопитающего, а более предпочтительно - человека. Упомянутая выше клетка может существовать in vitro, например в виде клеточной линии или клеточного штамма, либо присутствовать в организме млекопитающего, например человека. Человеческим организмом является пациент, у которого имеется заболевание или симптом, вызванные снижением экспрессии полноразмерного белка SMN по причине мутации, делеции или недостаточной экспрессии гена SMN1 и/или вследствие недостаточной экспрессии полноразмерного белка SMN2. Молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или композицию, содержащую упомянутую выше молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, вводят в количестве, достаточном для лечения указанного заболевания или симптома. В частности, симптом, вызванный дефицитом полноразмерного белка SMN, возникшим из-за мутации или делеции гена SMN1 и/или из-за недостаточной экспрессии полноразмерного белка SMN2, включает, например, спинальную мышечную атрофию. В одном варианте осуществления изобретения заболевание, вызванное недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN либо мутацией или делецией гена SMN1 или недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN1, представляет собой спинальную мышечную атрофию. В одном варианте осуществления изобретения спинальная мышечная атрофия, описанная в данном документе, включает СМА I типа, II типа, III типа и IV типа.

[22] Другим аспектом настоящего изобретения является изолированный целевой сайт молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты на гене SMN2, где целевой сайт представляет собой непрерывную нуклеотидную последовательность длиной от 16 до 35 нуклеотидов в промоторной области гена SMN2; предпочтительно целевой сайт представляет собой любую последовательность, выбранную из SEQ ID № 476-479, длиной от 16 до 35 постоянных нуклеотидов. В конкретном случае, целевой сайт содержит или выбран из любых нуклеотидных последовательностей SEQ ID №: 315-471.

[23] Другой аспект настоящего изобретения касается метода лечения заболевания, вызванного недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN по причине мутации или делеции гена SMN1 и/или вследствие недостаточной экспрессии полноразмерного белка SMN2, у индивидуума. Метод состоит во введении индивидууму терапевтически эффективной дозы упомянутой выше молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или композиции, содержащей молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе. Индивидуум может быть млекопитающим, например, человеком. В одном варианте осуществления изобретения заболевание, вызванное недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN из-за мутации гена SMN1, может включать, например, спинальную мышечную атрофию. В одном варианте осуществления изобретения заболевание, вызванное недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN из-за мутации или делеции гена SMN1 и/или недостаточной экспрессии полноразмерного белка SMN2, представляет собой спинальную мышечную атрофию. В одном варианте осуществления изобретения спинальная мышечная атрофия, описанная в данном документе, включает СМА I типа, II типа, III типа и IV типа.

[24] Другой аспект настоящего изобретения касается применения молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, нуклеиновой кислоты, кодирующей молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или композиции, содержащей молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, или нуклеиновую кислоту, кодирующую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, раскрытой в данном документе, для приготовления препарата для лечения заболевания или состояния, вызванного недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN вследствие мутации или делеции гена SMN1 или недостаточной экспрессии полноразмерного белка SMN1 и/или недостаточной экспрессии полноразмерного белка SMN2. Индивидуум может быть млекопитающим, например человеком. В одном варианте осуществления изобретения заболевание, вызванное недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN вследствие мутации или делеции гена SMN1 или недостаточной экспрессии полноразмерного белка SMN1 и/или недостаточной экспрессии полноразмерного белка SMN2, может включать, например, спинальную мышечную атрофию. В одном варианте осуществления изобретения заболевание, вызванное недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN вследствие мутации или делеции гена SMN1 или недостаточной экспрессии полноразмерного белка SMN1 и/или недостаточной экспрессии белка SMN2, является спинальной мышечной атрофией. В одном варианте осуществления изобретения спинальная мышечная атрофия, описанная в данном документе, включает СМА I типа, II типа, III типа и IV типа.

[25] Преимущества настоящего изобретения

[26] Молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты, активирующая/стимулирующая экспрессию гена SMN2, которая описана в данном документе (например, молекула каРНК), может эффективно и специфично стимулировать экспрессию гена SMN2 и повышать уровень экспрессии полноразмерной мРНК SMN2, вызывая лишь незначительные токсические реакции и нежелательные эффекты. Она также может применяться для приготовления препарата для лечения расстройств, связанных с недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN, и заболеваний или состояний, вызванных мутацией или делецией гена SMN1 или недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN1 и/или недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN2.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

[27] РИС. 1 представляет собой схематическое изображение структуры гена SMN2 с указанием промоторной области длиной 2 kb, использованной для дизайна каРНК, и расположения праймеров для ПЦР. РИС. 1A иллюстрирует структуру гена SMN2 и промоторную область длиной 2 kb, использованную для дизайна каРНК. РИС. 1B иллюстрирует расположение праймеров для ОТ-ПЦР, используемых для амплификации мРНК SMN2. SMN F1+SMN R1 - пара праймеров для ОТ-кПЦР, используемых для высокопроизводительного скрининга каРНК; SMN F2+SMN R2 - пара праймеров для ОТ-кПЦР, используемых для валидации прототипов каРНК; SMN-экзон6-F+SMN-экзон8-R - пара праймеров для обычной ОТ-ПЦР.

[28] РИС. 2 иллюстрирует изменения уровня экспрессии мРНК SMN, опосредованные молекулами короткой активирующей нуклеиновой кислоты. 980 каРНК, направленных к промотору SMN2, были использованы для независимой трансфекции клеток почки эмбриона человека HEK293T. Через 72 ч после трансфекции определяли уровень экспрессии мРНК SMN с помощью одноэтапной ОТ-кПЦР. На рисунке показаны относительные кратные изменения уровня экспрессии мРНК SMN, вызванные каждой из 980 каРНК, которые представлены в порядке уменьшения кратности изменения.

[29] РИС. 3 иллюстрирует активные участки для каРНК к промотору SMN2. 980 каРНК, направленных к промотору SMN2, были использованы для независимой трансфекции клеток почки эмбриона человека HEK293T, а через 72 ч после трансфекции определяли уровень экспрессии мРНК SMN с помощью одноэтапной ОТ-кПЦР. На рисунке показаны кратные изменения уровня экспрессии мРНК SMN, вызванные каждой каРНК, в сравнении с контролем (холостой раствор), которые представлены в порядке приближения участка связывания каРНК в промоторе (от -1949 до -37) к сайту начала транскрипции (TSS) SMN2. На рисунке также показано расположение четырех активных участков для каРНК (прямоугольники H1-H4). Числа над прямоугольниками показывают границы активных участков (относительно TSS-сайта SMN2).

[30] РИС. 4 иллюстрирует количественную оценку способности 50 выбранных случайным образом каРНК активировать экспрессию гена SMN в клетках HEK293T. Клетки HEK293T трансфицировали указанными каРНК (n=50, конечная концентрация: 20 нМ). Через 72 ч из трансфицированных клеток выделяли РНК с помощью набора Qiagen RNeasy. После обратной транскрипции проводили кПЦР-амплификацию генов SMN с помощью системы 7500FAST для ПЦР в режиме реального времени; при этом определяли уровни мРНК генов HPRT1 и TBP, а их средние геометрические значения использовали в качестве внутренних референтных значений для нормирования нагрузки РНК. На оси Y представлены изменения уровня экспрессии мРНК SMN в каждом образце, обработанном каРНК, в сравнении с контролем (холостой раствор) после нормирования на уровни экспрессии внутренних референтных генов. dsCon2- контроль с двуспиральной РНК, а siSMN2-1 - контроль с киРНК SMN2.

[31] РИС. 5 представляет собой схематическую иллюстрацию метода ПЦР-амплификации с последующим расщеплением рестриктазой DdeI для определения экспрессии SMN. РИС. 5A иллюстрирует различия между геном SMN1 и геном SMN2. Генетическая вариация G?A в экзоне 8 гена SMN2 создает сайт рестрикции для рестриктазы Ddel. ПЦР-амплификация кДНК с использованием праймеров SMN-экзон6-F и SMN-экзон8-R позволяла получить полноразмерный продукт SMN (SMN2FL) (507 п.о.) (РИС. 5B) и/или продукт с пропуском/делецией экзона 7 (SMN2Δ7) (453 п.о.) (РИС. 5C). Чтобы различить продукты SMN2 от продуктов SMN1, продукты ПЦР расщепляли ферментом DdeI и разделяли в агарозном геле. Продукт, полученный из полноразмерного гена SMN1, не подвергался расщеплению, в то время как продукт полноразмерного гена SMN2, расщеплялся на два фрагмента (392 п.о. и 115 п.о.) (РИС. 5B), а продукт гена SMN2Δ7 расщеплялся на фрагменты длиной 338 п.о. и 115 п.о. (РИС. 5C).

[32] На РИС. 6 изображены электрофореграммы, иллюстрирующие способность 50 выбранных случайным образом каРНК повышать уровень экспрессии мРНК полноразмерного гена SMN2 в клетках HEK293T. Клетки HEK293T трансфицировали указанными каРНК (n=50, конечная концентрация: 20 нМ). В качестве контроля использовали холостой раствор, dsCon2, siSMN2-1 и вектор-опосредованную гиперэкспрессию (вектор SMN) (полосы 51, 52, 53 и 54 соответственно). Через 72 ч из трансфицированных клеток выделяли РНК с помощью набора Qiagen RNeasy. После обратной транскрипции проводили обычную амплификацию методом ОТ-ПЦР; при этом в качестве внутреннего контроля для нагрузки РНК амплифицировали ген HPRT1. Продукт амплификации гена SMN расщепляли с помощью рестриктазы DdeI, затем подвергали гель-электрофорезу и количественно оценивали интенсивность полос. Продукт амплификации гена HPRT1 анализировали методом гель-электрофореза непосредственно, то есть без расщепления. На РИС. 6A изображена гель-электрофореграмма продукта амплификации гена SMN после расщепления ферментом DdeI; на РИС. 6B изображена гель-электрофореграмма продукта амплификации гена HPRT1; на РИС. 6C приведен список названий образцов для полос на РИС. 6A и РИС. 6B. FL: продукт амплификации полноразмерного гена; SMN2Δ7: продукт с пропуском/делецией экзона 7; SMN2 partial: фрагмент после расщепления, характерный для SMN2. Черные стрелки указывают каРНК, способные увеличивать соотношение между продуктом полноразмерного гена SMN2 и продуктом гена с пропуском/делецией экзона 7.

[33] РИС. 7 иллюстрирует способность 50 выбранных случайным образом каРНК индуцировать экспрессию общей мРНК SMN2 и полноразмерного SMN2. Количественная оценка интенсивности полос на электрофореграмме на РИС. 6 позволяла определить уровни общей мРНК SMN2 (РИС. 7A) и соотношение между уровнями мРНК SMN2 и мРНК SMN2Δ7 (РИС. 7B). Для каждого образца значения нормировали на интенсивность полосы HPRT1 и представляли в виде значений в сравнении с контролем (холостой раствор).

[34] РИС. 8 показывает дозовую зависимость эффекта каРНК, то есть ее способности увеличивать экспрессию мРНК и белка, кодируемых генами SMN и SMN2FL. Две каРНК SMN2 (RAG6-281 и RAG6-550) использовали для независимой трансфекции клеток HEK293T в указанных концентрациях (1 нМ, 10 нМ, 20 нМ, 50 нМ и 100 нМ) в течение 72 ч. Из трансфицированных клеток выделяли общую РНК и подвергали ее обратной транскрипции; белок выделяли и анализировали методом вестерн-блоттинга. РИС. 8A иллюстрирует относительный уровень экспрессии общей мРНК SMN, определенный методом ОТ-кПЦР. Также амплифицировали гены TBP и HPRT1, а средние геометрические значения их уровней экспрессии использовали в качестве внутренних референтных значений. На РИС. 8B показаны уровни мРНК SMN, амплифицированных с помощью обычной ОТ-ПЦР, с последующим расщеплением ферментом DdeI и электрофорезом. Ген HPRT1 амплифицировали и использовали в качестве внутреннего контроля. Значения (после надписи SMN2 FL/Δ7), указанные под электрофореграммой, представляют собой количественные соотношения между полноразмерным SMN2 и SMN2Δ7 для каждого обработанного образца, в сравнении с соотношением для образца, обработанного холостым раствором. На РИС. 8C показана экспрессия белка SMN, выявленного методом вестерн-блоттинга; в качестве внутреннего референтного белка использовали тубулин α/β. M: контроль после трансфекции холостым раствором; C: контроль dsCon2 для дсРНК; FL: полноразмерный продукт амплификации; SMN2Δ7: продукт с пропуском/делецией экзона 7.

[35] РИС. 9 иллюстрирует результат генотипирования новорожденных мышей с экспериментальной СМА. Детеныши были получены скрещиванием мышей Smn1^+/-, SMN2^-/- с мышами Smn1^-/-, SMN2^+/+. Генотип определяли с помощью ПЦР геномной ДНК. Использовали мышей со следующими двумя генотипами: мыши с СМА типа 1 (СМА 1) - носители гомозиготной делеции гена Smn мыши и гетерозиготного нокина SMN2 человека с генотипом Smn1^-/-, SMN2^+/-; обычные контрольные мыши (Het) - носители гетерозиготной делеции гена Smn мыши и гетерозиготного нокина SMN2 человека с генотипом Smn1^+/-, SMN2^+/-. ПЦР-продукт для мышей СМА 1 обнаруживался в виде единственной полосы 160 п.о., а для мышей Het - в виде двух полос: 160 п.о. и 180 п.о.

[36] РИС. 10 иллюстрирует улучшение моторной функции мышей СМА I после терапии препаратом каРНК SMN2. Новорожденных мышей разделяли на 4 группы: контрольная группа нормальных мышей (Het), контрольная группа мышей СМА I (не получавших препарат), группа каРНК SMN2 RAG6-539 в смеси с реагентом in vivo-jetPEI (DS06-0013B, 1 мг/мл) и группа каРНК SMN2 RAG6-538 в смеси с реагентом HKP (DS06-0002B, 2 мг/мл). Новорожденные мыши получали интрацеребровентрикулярную (ИЦВ) инъекцию в 1-й день после рождения (P1). Моторную функцию у мышей оценивали с помощью теста на рефлекс переворачивания в день P7 или P8.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[37] В настоящем изобретении связанные термины определяются следующим образом.

[38] Термин «комплементарный», используемый в данном документе, относится к способности образовывать пары оснований между двумя цепями олигонуклеотида. Пары оснований в основном образуются за счет водородных связей между нуклеотидами в антипараллельных цепях олигонуклеотида. Основания комплементарных цепей олигонуклеотида могут спариваться, как описано Уотсоном - Криком (например, A с T, A с U и C с G), или любым другим способом, который позволяет сформировать двойную спираль (например, путем образования пар оснований Хугстина или обратных водородных связей Хугстина).

[39] Комплементарность включает в себя полную комплементарность и неполную комплементарность. «Полная комплементарность», или «100%-ная комплементарность», означает, что каждый нуклеотид из первой олигонуклеотидной цепи может образовывать водородную связь с нуклеотидом в соответствующем положении второй олигонуклеотидной цепи в двухцепочечной области молекулы двухцепочечного олигонуклеотида, и при этом ни одна пара оснований не будет «неправильно спаренной». «Неполная комплементарность» означает, что не все нуклеотиды двух цепей связаны между собой водородными связями. Например, в случае двух олигонуклеотидных цепей, каждая длиной 20 нуклеотидов в двухцепочечной области, если водородную связь способны образовать только две пары оснований в этой двухцепочечной области, то олигонуклеотидные цепи обладают комплементарностью в 10%. В том же примере, если водородную связь способны образовать 18 пар оснований в этой двухцепочечной области, то олигонуклеотидные цепи обладают комплементарностью в 90%. Существенная комплементарность подразумевает комплементарность не менее примерно 75%, примерно 79%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или 99%.

[40] Термин «олигонуклеотид», используемый в данном документе, относится к полимерам или нуклеотидам и включает, помимо прочего, одноцепочечные или двухцепочечные молекулы ДНК, РНК или гибридной ДНК/РНК, олигонуклеотидные цепи, содержащие регулярно и нерегулярно чередующиеся дезоксирибозные и рибозные участки, а также модифицированные, природные или неприродные каркасы для таких олигонуклеотидов. Олигонуклеотидом, активирующим транскрипцию целевого гена, описанным в данном документе, является молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты.

[41] Термины «олигонуклеотидная цепь» и «олигонуклеотидная последовательность», используемые в данном документе, могут использоваться на равных основаниях и относятся к общему термину для коротких нуклеотидных последовательностей, имеющих менее 35 оснований (включая нуклеотиды в дезоксирибонуклеиновой кислоте (ДНК) или рибонуклеиновой кислоте (РНК)). В настоящем изобретении длина олигонуклеотидной цепи может быть любой, в пределах от 16 до 35 нуклеотидов.

[42] Термин «ген», используемый в данном документе, относится ко всем нуклеотидным последовательностям, необходимым для кодирования полипептидной цепи или транскрипции функциональной РНК. «Ген» может быть эндогенным либо частично или полностью рекомбинантным геном для клетки-хозяина (например, если в клетку-хозяина вводятся экзогенный олигонуклеотид и кодирующая промотор последовательность, или если в клетку-хозяина вводятся гетерогенный промотор, соседствующий с эндогенной кодирующей последовательностью). Например, термин «ген» включает в себя последовательность нуклеиновых кислот, состоящую из экзонов и интронов. Последовательностями, кодирующими белок, являются, например, последовательности, состоящие из экзонов в открытой рамке считывания между старт-кодоном и стоп-кодоном, а термин «ген», используемый в данном документе, может включать регуляторную последовательность гена, например последовательность промотора, энхансера и все другие последовательности, известные специалистам в данной области, служащие для контроля транскрипции, экспрессии или активности другого гена, независимо от того, содержит ли ген кодирующую последовательность или некодирующую последовательность. В одном случае, например, термин «ген» может использоваться для описания функциональной нуклеиновой кислоты, содержащей регуляторную последовательность, такую как промотор или энхансер. Экспрессия рекомбинантного гена может контролироваться гетерогенными регуляторными последовательностями одного или нескольких типов.

[43] Термин «целевой ген», используемый в данном документе, может относиться к последовательностям нуклеиновых кислот, трансгенам, вирусным или бактериальным последовательностям, хромосомам или внехромосомным генам, которые обычно присутствуют в организме и/или могут быть перенесены путем транзитной или стабильной трансфекции или инкорпорированы в клетки или клеточный хроматин. Целевой ген может быть геном, кодирующим белок, или геном, не кодирующим белок (например, ген микроРНК и геном длинной некодирующей РНК). Целевой ген, как правило, содержит последовательность промотора, а позитивная регуляция целевого гена может быть достигнута путем дизайна молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, имеющей идентичную последовательность (также называемую гомологией) с последовательностью промотора, которая характеризуется способностью стимулировать (ап-регулировать) экспрессию целевого гена. «Последовательность промотора целевого гена» относится к некодирующей последовательности целевого гена, и ссылка на последовательность промотора целевого гена во фразе «комплементарна последовательности промотора целевого гена» настоящего изобретения означает кодирующую цепь последовательности, также известную как нематричная цепь, т. е. последовательность нуклеиновых кислот, которая совпадает с кодирующей последовательностью гена. «Целевая последовательность» относится к фрагменту последовательности промотора целевого гена, которая гомологична или комплементарна смысловой олигонуклеотидной цепи или антисмысловой олигонуклеотидной цепи в молекуле короткой активирующей нуклеиновой кислоты.

[44] Термины «смысловая цепь» и «смысловая олигонуклеотидная цепь», используемые в данном документе, могут использоваться на равных основаниях, и смысловая олигонуклеотидная цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты относится к первой цепи нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность, гомологичную кодирующей цепи последовательности промотора целевого гена в двуспиральной молекуле короткой активирующей нуклеиновой кислоты.

[45] Термины «антисмысловая цепь» и «антисмысловая олигонуклеотидная цепь», используемые в данном документе, могут использоваться на равных основаниях, и антисмысловая олигонуклеотидная цепь молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты относится ко второй цепи нуклеиновой кислоты, которая комплементарна смысловой олигонуклеотидной цепи в двуспиральной молекуле короткой активирующей нуклеиновой кислоты.

[46] Термин «кодирующая цепь», используемый в данном документе, относится к цепи ДНК целевого гена, которую нельзя использовать для транскрипции, а нуклеотидная последовательность данной цепи совпадает с последовательностью РНК, получаемой в результате транскрипции (в РНК T из ДНК заменяется на U). Кодирующая цепь последовательности двухцепочечной ДНК промотора целевого гена, описанная в данном документе, относится к последовательности промотора той же самой цепи ДНК, что и кодирующая цепь ДНК целевого гена.

[47] Термин «матричная цепь», используемый в данном документе, относится к другой цепи, комплементарной кодирующей цепи двухцепочечной ДНК целевого гена, т. е. к цепи, которую, как матрицу, можно транскрибировать в РНК, и эта цепь комплементарна транскрибированной РНК (A с U, а G с C). В процессе транскрипции РНК-полимераза связывается с матричной цепью, двигается в направлении 3'→5' матричной цепи и за счет катализа обеспечивает синтез РНК в направлении 5'→3'. Матричная цепь последовательности двухцепочечной ДНК промотора целевого гена, описанная в данном документе, относится к последовательности промотора той же самой цепи ДНК, что и матричная цепь ДНК целевого гена.

[48] Термин «промотор», используемый в данном документе, относится к последовательности, которая пространственно связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или РНК, и играет регуляторную роль в транскрипции последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или РНК. Обычно промотор эукариотического гена состоит из 100-5000 пар оснований, однако этот диапазон длины не предназначен для ограничения термина «промотор», используемого в данном документе. Хотя последовательность промотора обычно расположена на 5'-конце последовательности, кодирующей белок или РНК, она также может присутствовать в последовательностях экзона и интрона.

[49] Термин «сайт начала транскрипции», используемый в данном документе, относится к нуклеотиду, обозначающему начало транскрипции на матричной цепи гена. Сайт начала транскрипции может находиться на матричной цепи в промоторной области. Ген может иметь более одного сайта начала транскрипции.

[50] Термин «идентичность» или «гомология», используемый в данном документе, означает, что одна олигонуклеотидная цепь (смысловая или антисмысловая цепь) каРНК имеет последовательность, сходную с последовательностью кодирующей цепи или матричной цепи в промоторной области целевого гена. В данном документе степень «идентичности» или «гомологии» может составлять по крайней мере примерно 75%, примерно 79%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95% или 99%.

[51] Термин «липкий конец», используемый в данном документе, относится к неспаренным основаниям нуклеотидов на конце (5' или 3') олигонуклеотидной цепи; он формируется, когда одна цепь выступает за край другой цепи двухцепочечного олигонуклеотида. Одноцепочечный участок, выступающий за край двойной спирали на 3'-конце и/или 5'-конце, называют «липким» концом.

[52] Термины «активация гена», «активация экспрессии гена», а также «стимуляция гена» и «стимуляция экспрессии гена», используемые в данном документе, могут использоваться на равных основаниях. Они означают увеличение транскрипции, трансляции, экспрессии или активности определенной нуклеиновой кислоты, определенное путем измерения уровня транкрипции, уровня мРНК, уровня белка, ферментативной активности, статуса метилирования, состояния или конфигурации хроматина, уровня трансляции, а также активности или состояния клетки или биологической системы гена. Эти виды активности или состояния можно определять прямыми или непрямыми методами. Кроме того, термины «активация гена», «активация экспрессии гена», «стимуляция гена» и «стимуляция экспрессии гена» относятся к повышению активности, связанному с последовательностью нуклеиновой кислоты, независимо от механизма такой активации. Например, активация гена на уровне транскрипции приводит к увеличению транскрипции в РНК, а РНК транслируется в белок, повышая таким образом экспрессию белка.

[53] Термины «короткая активирующая РНК», «каРНК» и «молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты», используемые в данном документе, могут использоваться на равных основаниях. Они относятся к молекуле нуклеиновой кислоты, которая может стимулировать экспрессию целевого гена и состоять из первого фрагмента нуклеиновой кислоты (антисмысловая цепь, также называемая антисмысловой олигонуклеотидной цепью), содержащего нуклеотидную последовательность, идентичную некодирующей нуклеотидной последовательности целевого гена (например, промотора или энхансера), а также из второго фрагмента нуклеиновой кислоты (смысловая цепь, также называемая смысловой олигонуклеотидной цепью), содержащего нуклеотидную последовательность, комплементарную первому фрагменту нуклеиновой кислоты. При этом первый фрагмент нуклеиновой кислоты и второй фрагмент нуклеиновой кислоты формируют двойную спираль. Молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты также может включать синтезированную или экспрессированную посредством вектора одноцепочечную молекулу РНК, которая может формировать структуру в форме «шпильки» с помощью двух комплементарных областей внутри молекулы. При этом первая область содержит нуклеотидную последовательность, идентичную целевой последовательности промотора гена, а вторая область содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную первой области. Длина двуспиральной области в молекуле короткой активирующей нуклеиновой кислоты обычно составляет примерно 10-50, примерно 12-48, примерно 14-46, примерно 16-44, примерно 18-42, примерно 20-40, примерно 22-38, примерно 24-36, примерно 26-34 и примерно 28-32 пар оснований, а также обычно примерно 10, примерно 15, примерно 20, примерно 25, примерно 30, примерно 35, примерно 40, примерно 45 или примерно 50 пар оснований. Кроме того, термины «каРНК», «короткая активирующая РНК» и «молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты» также включают другие нуклеиновые кислоты, отличные от рибонуклеиновой, в том числе, помимо прочего, модифицированные нуклеотиды и их аналоги.

[54] Термин «активный участок» относится к промоторной области гена длиной не менее 30 п.о., для которой процент функциональных молекул коротких активирующих нуклеиновых кислот увеличен, т. е. не менее 30% молекул коротких активирующих нуклеиновых кислот, созданных с целью воздействия на эту область, являются функциональными и способны индуцировать изменение экспрессии мРНК в целевом гене в 1,2 или более раз.

[55] Термин «синтез», используемый в данном документе, относится к методу получения олигонуклеотида, включая любой метод, позволяющий синтезировать РНК, например, химический синтез, транскрипция in vitro или экспрессия посредством вектора.

[56] В соответствии с настоящим изобретением, экспрессию гена SMN2 стимулируют путем активации РНК, а связанное заболевание (в частности, спинальную мышечную атрофию) лечат путем повышения уровня экспрессии полноразмерного белка SMN. Ген SMN2 в настоящем изобретении иногда также называют целевым геном.

[57] Настоящее изобретение относится к методу получения молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты, который включает в себя дизайн последовательности и синтез.

[58] Молекулы короткой активирующей нуклеиновой кислоты можно химически синтезировать или получить от биотехнологической компании, специализирующейся на синтезе нуклеиновых кислот.

[59] В общих чертах, химический синтез нуклеиновых кислот включает следующие четыре этапа: (1) синтез олигомерных рибонуклеотидов; (2) удаление защитных групп; (3) очистка и выделение; (4) обессоливание и ренатурация.

[60] В качестве примера ниже приводятся конкретные этапы химического синтеза РНК, описанных в данном документе:

(1) Синтез олигомерных рибонуклеотидов

[61] Синтез 1 мкМ РНК осуществляли в автоматическом ДНК/РНК-синтезаторе (например, EXPEDITE8909 компании Applied Biosystems), причем время связывания в каждом цикле было установлено на 10-15 мин. В качестве инициатора использовали иммобилизованный на твердой фазе субстрат, 5'-O-p-диметокситрифенилметилтимидин. В первом цикле с субстратом, иммобилизованным на твердой фазе, связывалось одно основание, а в n-ном цикле (19≥n≥2) одно основание связывалось с основанием, которое связалось в цикле n-1. Этот процесс повторялся до тех пор, пока не была синтезирована вся последовательность нуклеиновой кислоты.

(2) Удаление защитных групп

[62] Иммобилизованный на твердой фазе субстрат, связанный с каРНК, помещали в пробирку для анализа, и добавляли 1 мл раствора смеси этанола и гидроксида аммония (соотношение по объему: 1:3). После этого пробирку для анализа герметично закрывали, помещали в инкубатор, и инкубировали смесь при температуре 25-70°C от 2 до 30 ч. Раствор, содержащий иммобилизованный на твердой фазе субстрат, связанный с каРНК, отфильтровывали и собирали фильтрат. Иммобилизованный на твердой фазе субстрат дважды промывали дистиллированной водой, полученной двойной перегонкой (по 1 мл за раз), и собирали фильтрат. Собранные элюенты объединяли и высушивали в вакууме в течение 1-12 ч. Затем к раствору добавляли 1 мл раствора фторида тетрабутиламмония в тетрагидрофуране (1 М), оставляли стоять при комнатной температуре на 4-12 ч, а затем добавляли 2 мл н-бутанола. Методом высокоскоростного центрифугирования собирали осадок, который представлял собой неочищенную одноцепочечную каРНК.

(3) Очистка и выделение

[63] Полученную неочищенную каРНК растворяли в 2 мл водного раствора ацетата аммония с концентрацией 1 моль/мл, и раствор отделяли с помощью жидкостной хроматографии высокого давления на колонке с обращенной фазой C18 для получения очищенной одноцепочечной каРНК.

(4) Обессоливание и ренатурация

[64] Соли удаляли гель-фильтрацией (эксклюзионной хроматографией). Олигомерную рибонуклеиновую кислоту в виде одной смысловой цепи и олигомерную рибонуклеиновую кислоту в виде одной антисмысловой цепи смешивали в 1-2 мл буфера (Tris, 10 мМ, pH=7,5-8,0; NaCl, 50 мМ) в молярном соотношении 1:1. Раствор нагревали до 95°C, а затем медленно охлаждали до комнатной температуры для получения раствора, содержащего каРНК.

[65] В этом исследовании было обнаружено, что упомянутая выше каРНК после введения в клетку способна эффективно повышать уровень экспрессии мРНК и белка, кодируемых полноразмерным геном SMN2.

[66] Настоящее изобретение далее будет проиллюстрировано конкретными примерами и рисунками. Следует понимать, что эти примеры предназначены исключительно для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения его объема. В следующих примерах использовались общие методы, которые, как правило, соответствовали стандартным методам, описанным в справочнике Sambrook, et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), или методам, рекомендованным производителем.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Дизайн и синтез молекул коротких активирующих нуклеиновых кислот, направленных к промотору SMN2

[67] Смысловая последовательность промотора гена SMN2, ограниченная сайтом начала транскрипции (TSS) и нуклеотидом. находящимся в положении -2000 п.о. выше сайта TSS, была получена из базы данных геномов UCSC.

[68] Для выявления функциональных коротких активирующих РНК (каРНК), способных активировать экспрессию гена SMN2, была выбрана серия из 19-нуклеотидных мишеней каРНК в последовательности промотора SMN2 из 2000 п.о. (РИС. 1), начиная с положения -2000 п.о. выше сайта TSS. Продвижение в сторону сайта TSS осуществляли с шагом 1 п.о., что дало в общей сложности 1982 мишени. Затем провели фильтрацию целевых последовательностей, чтобы оставить лишь те, которые соответствовали следующим критериям: (1) содержание GC - от 35% до 65%; (2) менее 5 идентичных нуклеотидов подряд; (3) 3 или меньше динуклеотидных повторов; (4) 3 или меньше тринуклеотидных повторов. После фильтрации осталось 980 целевых последовательностей, для которых были химически синтезированы соответствующие им двухцепочечные каРНК. Каждая из смысловых цепей и антисмысловых цепей каРНК, использованных в исследовании, имела длину в 21 нуклеотид. 19 нуклеотидов в 5'-области первой цепи рибонуклеиновой кислоты (смысловая цепь) в каРНК имела последовательность, на 100% совпадающую с целевой последовательностью промотора, а 3'-конец первой цепи рибонуклеиновой кислоты имел последовательность dTdT. 19 нуклеотидов в 5'-области второй цепи рибонуклеиновой кислоты были комплементарны последовательности первой цепи рибонуклеиновой кислоты, а 3'-конец второй цепи рибонуклеиновой кислоты имел последовательность dTdT. Две цепи каРНК, упомянутые выше, смешали в молярном соотношении 1:1 и ренатурировали для получения двуспиральной каРНК.

Пример 2. Высокопроизводительный скрининг каРНК, направленных к промотору SMN2

1) Клеточная культура и трансфекция

[69] Клетки почки эмбриона человека линии HEK293T (ATCC® CRL-3216™) культивировали в среде DMEM (Gibco), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco) и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco). Клетки культивировали в 5% CO₂ при 37°C. Клетки HEK293T высевали в 96-луночные планшеты в количестве 5000 клеток на лунку. Каждую из каРНК использовали для независимой трансфекции клеток HEK293T в лунках; конечная концентрация каРНК составляла 10 нМ (если не указано иное), а для трансфекции использовали 0,3 мкл реагента RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA) в соответствии с протоколом обратной трансфекции. Трансфекцию проводили в течение 72 часов. В качестве контроля использовали пустой (холостой) раствор, двуспиральный олигонуклеотид с неспецифической последовательностью (dsCon2, смысловая цепь: 5'-ACUACUGAGUGACAGUAGA[dT][dT]-3' (SEQ ID №: 472), антисмысловая цепь: 5'-UCUACUGUCACUCAGUAGU[dT][dT]-3' (SEQ ID №: 473)), короткую интерферирующую РНК к SMN2 (siMSN2-1, смысловая цепь: 5'-GGGAUGAUACAGCACUGAU[dT][dT]-3' (SEQ ID №: 474), антисмысловая цепь: 5'AUCAGUGCUGUAUCAUCCC[dT][dT]-3' (SEQ ID №: 475)); при этом контроль с пустым (холостым) раствором представлял собой трансфекцию без использования нуклеиновой кислоты.

2) Одноэтапная ОТ-кПЦР

[70] По окончании трансфекции среду выбрасывали, а каждую лунку однократно промывали 150 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ). После удаления ФСБ в каждую лунку добавляли 100 мкл буфера для лизиса клеток (набор Power SYBR® Green Cells-to-Ct™, Life Technologies) и инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин. Из каждой лунки отбирали по 0,5 мкл полученного клеточного лизата и проводили анализ методом ОТ-кПЦР с помощью набора II для ОТ-ПЦР One Step TB Green™ PrimeScrip™ (Takara, RR086A) на приборе для ПЦР в режиме реального времени Lightcycler 480 компании Roche. Пробы для ПЦР готовили с помощью платформы Bravo Automated Liquid Handling Platform (Agilent). Каждый образец после трансфекции амплифицировали в трех параллельных лунках. Условия проведения ПЦР показаны в таблице 1.

Таблица 1. Подготовка проб для ПЦР Реагент Объем/реакция 2 × буфер-4 для ОТ-ПЦР One Step TB Green 2,5 мкл Смесь 2 ферментов PrimeScript для одноэтапной ПЦР 0,2 мкл Смесь, содержащая прямой и обратный праймеры (5 мМ) 0,4 мкл Дист. H₂O, не содержащая РНКаз 1,4 мкл Неочищенный лизат (РНК) 0,5 мкл Общий объем 5 мкл

[71] Условия реакции были следующими: реакция обратной транскрипции (этап 1): 5 мин при 42°C, 10 с при 95°C; ПЦР (этап 2): 5 с при 95°C, 20 с при 60°C, 45 циклов амплификации. HPRT1 и TBP также амплифицировали в качестве внутренних референтных генов. Праймеры для ПЦР, использованные для амплификации генов SMN, HPRT1 и TBP, показаны в таблице 4; при этом ген SMN был амплифицирован с использованием пары праймеров SMN F1/R1.

[72] Для расчета уровня экспрессии (E_rel) SMN2 (целевого гена) в образце, трансфицированном каРНК, в сравнении с контролем (холостой раствор), в формуле 1 использовали значения Ct целевого гена и двух внутренних референтных генов.

(формула 1)

где CtT_m - значение Ct целевого гена для образца после после обработки холостым раствором; CtT_s - значение Ct целевого гена для образца после обработки каРНК; CtR1_m - значение Ct внутреннего референтного гена 1 для образца после обработки холостым раствором; CtR1_s - значение Ct внутреннего референтного гена 1 для образца после обработки каРНК; CtR2_m - значение Ct внутреннего референтного гена 2 для образца после обработки холостым раствором, а CtR2_s - значение Ct внутреннего референтного гена 2 для образца после обработки каРНК.

3) Скрининг функциональных каРНК

[74] Для выявления каРНК, способных активировать транскрипцию SMN2, клетки HEK293T трансфицировали каждой из 980 упомянутых выше каРНК; концентрация каРНК при трансфекции составляла 10 нМ. Через 72 часа лизированные клетки анализировали с помощью одноэтапной ОТ-кПЦР, чтобы определить относительный уровень экспрессии гена SMN2 в каждом образце, обработанном каРНК (в сравнении с обработкой холостым раствором). Как видно из таблицы 2, 157 (16,02%) каРНК обладали активирующей способностью, в то время как 416 (42,45%) каРНК обладали ингибирующей способностью; 407 (41,53%) каРНК не оказывали явного эффекта на экспрессию гена SMN2. Наблюдаемый максимальный эффект активации составил 1,82 (повышение уровня экспрессии), а максимальный эффект ингибирования - 0,33 (снижение уровня экспрессии). каРНК с активирующими свойствами считаются функциональными каРНК. Их целевые последовательности, смысловые и антисмысловые последовательности, а также соответствующие относительные уровни экспрессии SMN приведены в таблице 3.

Таблица 2. Сводка результатов высокопроизводительного скрининга каРНК SMN2 Категория активности (функции) каРНК Значение log₂ (кратность изменения) для уровня экспрессии мРНК SMN Число различных каРНК Процент Высокая активирующая способность ≥ 0,49 (1,50) - ≤ 0,86 (1,82) 10 1,0 Умеренная активирующая способность ≥ 0,26 (1,20) - < 0,49 (1,50) 54 5,5 Низкая активирующая способность ≥ 0,13 (1,10) - < 0,26 (1,20) 93 9,5 Отсутствие эффекта < 0,13 (1,10) - > -0,13 (0,91) 407 41,5 Низкая ингибирующая способность ≤ -0,13 (0,91) - ≥ -0,26 (0,84) 201 20,5 Умеренная ингибирующая способность ≤ -0,26 (0,84) - > -0,49 (0,71) 171 17,4 Высокая ингибирующая способность ≤ -0,49 (0,71) - ≥ -1,58 (0,33) 44 4,5 Всего 980 100

Таблица 3. Список последовательностей функциональных каРНК, последовательностей их мишеней (целевых последовательностей) и уровни экспрессии SMN каРНК Целевая последовательность (5'-3') Смысловая последовательность (5'-3') Антисмысловая последовательность (5'-3') Относительная экспрессия мРНК SMN (кратность изменения) Относительная экспрессия мРНК SMN (log₂) RAG6-1763 ATCTGTGAGATGTACCTTT
(SEQ ID №:315) AUCUGUGAGAUGUACCUUU[dT][dT]
(SEQ ID №:1) AAAGGUACAUCUCACAGAU[dT][dT]
(SEQ ID №:158) 1.20 0.26 RAG6-1634 CACTCTGTCACTCAGGCTG
(SEQ ID №:316) CACUCUGUCACUCAGGCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:2) CAGCCUGAGUGACAGAGUG[dT][dT]
(SEQ ID №:159) 1.11 0.16 RAG6-1633 ACTCTGTCACTCAGGCTGG
(SEQ ID №:317) ACUCUGUCACUCAGGCUGG[dT][dT]
(SEQ ID №:3) CCAGCCUGAGUGACAGAGU[dT][dT]
(SEQ ID №:160) 1.13 0.17 RAG6-1631 TCTGTCACTCAGGCTGGAG
(SEQ ID №:318) UCUGUCACUCAGGCUGGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:4) CUCCAGCCUGAGUGACAGA[dT][dT]
(SEQ ID №:161) 1.29 0.36 RAG6-1623 TCAGGCTGGAGTGCAGTGG
(SEQ ID №:319) UCAGGCUGGAGUGCAGUGG[dT][dT]
(SEQ ID №:5) CCACUGCACUCCAGCCUGA[dT][dT]
(SEQ ID №:162) 1.11 0.15 RAG6-1615 GAGTGCAGTGGCGTGATCT
(SEQ ID №:320) GAGUGCAGUGGCGUGAUCU[dT][dT]
(SEQ ID №:6) AGAUCACGCCACUGCACUC[dT][dT]
(SEQ ID №:163) 1.16 0.22 RAG6-1612 TGCAGTGGCGTGATCTTGG
(SEQ ID №:321) UGCAGUGGCGUGAUCUUGG[dT][dT]
(SEQ ID №:7) CCAAGAUCACGCCACUGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:164) 1.25 0.33 RAG6-1611 GCAGTGGCGTGATCTTGGC
(SEQ ID №:322) GCAGUGGCGUGAUCUUGGC[dT][dT]
(SEQ ID №:8) GCCAAGAUCACGCCACUGC[dT][dT]
(SEQ ID №:165) 1.13 0.17 RAG6-1606 GGCGTGATCTTGGCTCACT
(SEQ ID №:323) GGCGUGAUCUUGGCUCACU[dT][dT]
(SEQ ID №:9) AGUGAGCCAAGAUCACGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:166) 1.11 0.15 RAG6-1603 GTGATCTTGGCTCACTGCA
(SEQ ID №:324) GUGAUCUUGGCUCACUGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:10) UGCAGUGAGCCAAGAUCAC[dT][dT]
(SEQ ID №:167) 1.24 0.31 RAG6-1602 TGATCTTGGCTCACTGCAA
(SEQ ID №:325) UGAUCUUGGCUCACUGCAA[dT][dT]
(SEQ ID №:11) UUGCAGUGAGCCAAGAUCA[dT][dT]
(SEQ ID №:168) 1.12 0.16 RAG6-1600 ATCTTGGCTCACTGCAACC
(SEQ ID №:326) AUCUUGGCUCACUGCAACC[dT][dT]
(SEQ ID №:12) GGUUGCAGUGAGCCAAGAU[dT][dT]
(SEQ ID №:169) 1.13 0.18 RAG6-1598 CTTGGCTCACTGCAACCTC
(SEQ ID №:327) CUUGGCUCACUGCAACCUC[dT][dT]
(SEQ ID №:13) GAGGUUGCAGUGAGCCAAG[dT][dT]
(SEQ ID №:170) 1.50 0.59 RAG6-1597 TTGGCTCACTGCAACCTCC
(SEQ ID №:328) UUGGCUCACUGCAACCUCC[dT][dT]
(SEQ ID №:14) GGAGGUUGCAGUGAGCCAA[dT][dT]
(SEQ ID №:171) 1.34 0.42 RAG6-1578 GCCTCCCGAGTTCAAGTGA
(SEQ ID №:329) GCCUCCCGAGUUCAAGUGA[dT][dT]
(SEQ ID №:15) UCACUUGAACUCGGGAGGC[dT][dT]
(SEQ ID №:172) 1.36 0.45 RAG6-1577 CCTCCCGAGTTCAAGTGAT
(SEQ ID №:330) CCUCCCGAGUUCAAGUGAU[dT][dT]
(SEQ ID №:16) AUCACUUGAACUCGGGAGG[dT][dT]
(SEQ ID №:173) 1.25 0.32 RAG6-1576 CTCCCGAGTTCAAGTGATT
(SEQ ID №:331) CUCCCGAGUUCAAGUGAUU[dT][dT]
(SEQ ID №:17) AAUCACUUGAACUCGGGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:174) 1.31 0.39 RAG6-1575 TCCCGAGTTCAAGTGATTC
(SEQ ID №:332) UCCCGAGUUCAAGUGAUUC[dT][dT]
(SEQ ID №:18) GAAUCACUUGAACUCGGGA[dT][dT]
(SEQ ID №:175) 1.24 0.31 RAG6-1567 TCAAGTGATTCTCCTGGCT
(SEQ ID №:333) UCAAGUGAUUCUCCUGGCU[dT][dT]
(SEQ ID №:19) AGCCAGGAGAAUCACUUGA[dT][dT]
(SEQ ID №:176) 1.25 0.33 RAG6-1565 AAGTGATTCTCCTGGCTCA
(SEQ ID №:334) AAGUGAUUCUCCUGGCUCA[dT][dT]
(SEQ ID №:20) UGAGCCAGGAGAAUCACUU[dT][dT]
(SEQ ID №:177) 1.24 0.31 RAG6-1564 AGTGATTCTCCTGGCTCAG
(SEQ ID №:335) AGUGAUUCUCCUGGCUCAG[dT][dT]
(SEQ ID №:21) CUGAGCCAGGAGAAUCACU[dT][dT]
(SEQ ID №:178) 1.30 0.38 RAG6-1563 GTGATTCTCCTGGCTCAGC
(SEQ ID №:336) GUGAUUCUCCUGGCUCAGC[dT][dT]
(SEQ ID №:22) GCUGAGCCAGGAGAAUCAC[dT][dT]
(SEQ ID №:179) 1.64 0.72 RAG6-1548 CAGCCTCCCAAGCAGCTGT
(SEQ ID №:337) CAGCCUCCCAAGCAGCUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:23) ACAGCUGCUUGGGAGGCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:180) 1.29 0.37 RAG6-1545 CCTCCCAAGCAGCTGTCAT
(SEQ ID №:338) CCUCCCAAGCAGCUGUCAU[dT][dT]
(SEQ ID №:24) AUGACAGCUGCUUGGGAGG[dT][dT]
(SEQ ID №:181) 1.59 0.67 RAG6-1543 TCCCAAGCAGCTGTCATTA
(SEQ ID №:339) UCCCAAGCAGCUGUCAUUA[dT][dT]
(SEQ ID №:25) UAAUGACAGCUGCUUGGGA[dT][dT]
(SEQ ID №:182) 1.10 0.14 RAG6-1535 AGCTGTCATTACAGGCCTG
(SEQ ID №:340) AGCUGUCAUUACAGGCCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:26) CAGGCCUGUAAUGACAGCU[dT][dT]
(SEQ ID №:183) 1.59 0.66 RAG6-1534 GCTGTCATTACAGGCCTGC
(SEQ ID №:341) GCUGUCAUUACAGGCCUGC[dT][dT]
(SEQ ID №:27) GCAGGCCUGUAAUGACAGC[dT][dT](SEQ ID №:184) 1.14 0.19 RAG6-1533 CTGTCATTACAGGCCTGCA
(SEQ ID №:342) CUGUCAUUACAGGCCUGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:28) UGCAGGCCUGUAAUGACAG[dT][dT]
(SEQ ID №:185) 1.28 0.36 RAG6-1483 GGAGAAACAGGGTTTCACC
(SEQ ID №:343) GGAGAAACAGGGUUUCACC[dT][dT]
(SEQ ID №:29) GGUGAAACCCUGUUUCUCC[dT][dT]
(SEQ ID №:186) 1.12 0.17 RAG6-1481 AGAAACAGGGTTTCACCAT
(SEQ ID №:344) AGAAACAGGGUUUCACCAU[dT][dT]
(SEQ ID №:30) AUGGUGAAACCCUGUUUCU[dT][dT]
(SEQ ID №:187) 1.14 0.19 RAG6-1403 AAGTGCTGGGATTATAGGC
(SEQ ID №:345) AAGUGCUGGGAUUAUAGGC[dT][dT]
(SEQ ID №:31) GCCUAUAAUCCCAGCACUU[dT][dT]
(SEQ ID №:188) 1.21 0.28 RAG6-1392 TTATAGGCATGAGCCACCG
(SEQ ID №:346) UUAUAGGCAUGAGCCACCG[dT][dT]
(SEQ ID №:32) CGGUGGCUCAUGCCUAUAA[dT][dT]
(SEQ ID №:189) 1.23 0.30 RAG6-1241 ATTCTCCCCTTCCTCCACA
(SEQ ID №:347) AUUCUCCCCUUCCUCCACA[dT][dT]
(SEQ ID №:33) UGUGGAGGAAGGGGAGAAU[dT][dT]
(SEQ ID №:190) 1.26 0.33 RAG6-1239 TCTCCCCTTCCTCCACAGA
(SEQ ID №:348) UCUCCCCUUCCUCCACAGA[dT][dT]
(SEQ ID №:34) UCUGUGGAGGAAGGGGAGA[dT][dT]
(SEQ ID №:191) 1.10 0.13 RAG6-1119 CATTTAGCAACCCTAGATG
(SEQ ID №:349) CAUUUAGCAACCCUAGAUG[dT][dT]
(SEQ ID №:35) CAUCUAGGGUUGCUAAAUG[dT][dT]
(SEQ ID №:192) 1.11 0.14 RAG6-1118 ATTTAGCAACCCTAGATGC
(SEQ ID №:350) AUUUAGCAACCCUAGAUGC[dT][dT]
(SEQ ID №:36) GCAUCUAGGGUUGCUAAAU[dT][dT]
(SEQ ID №:193) 1.13 0.18 RAG6-1117 TTTAGCAACCCTAGATGCT
(SEQ ID №:351) UUUAGCAACCCUAGAUGCU[dT][dT]
(SEQ ID №:37) AGCAUCUAGGGUUGCUAAA[dT][dT]
(SEQ ID №:194) 1.14 0.19 RAG6-1116 TTAGCAACCCTAGATGCTT
(SEQ ID №:352) UUAGCAACCCUAGAUGCUU[dT][dT]
(SEQ ID №:38) AAGCAUCUAGGGUUGCUAA[dT][dT]
(SEQ ID №:195) 1.19 0.26 RAG6-1115 TAGCAACCCTAGATGCTTA
(SEQ ID №:353) UAGCAACCCUAGAUGCUUA[dT][dT]
(SEQ ID №:39) UAAGCAUCUAGGGUUGCUA[dT][dT]
(SEQ ID №:196) 1.22 0.29 RAG6-1089 ATACTGGAGGCCCGGTGTG
(SEQ ID №:354) AUACUGGAGGCCCGGUGUG[dT][dT]
(SEQ ID №:40) CACACCGGGCCUCCAGUAU[dT][dT]
(SEQ ID №:197) 1.61 0.69 RAG6-1075 GTGTGGTGGCTCACACCTG
(SEQ ID №:355) GUGUGGUGGCUCACACCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:41) CAGGUGUGAGCCACCACAC[dT][dT]
(SEQ ID №:198) 1.11 0.15 RAG6-1072 TGGTGGCTCACACCTGTAA
(SEQ ID №:356) UGGUGGCUCACACCUGUAA[dT][dT]
(SEQ ID №:42) UUACAGGUGUGAGCCACCA[dT][dT]
(SEQ ID №:199) 1.14 0.20 RAG6-1071 GGTGGCTCACACCTGTAAT
(SEQ ID №:357) GGUGGCUCACACCUGUAAU[dT][dT]
(SEQ ID №:43) AUUACAGGUGUGAGCCACC[dT][dT]
(SEQ ID №:200) 1.15 0.21 RAG6-1070 GTGGCTCACACCTGTAATC
(SEQ ID №:358) GUGGCUCACACCUGUAAUC[dT][dT]
(SEQ ID №:44) GAUUACAGGUGUGAGCCAC[dT][dT]
(SEQ ID №:201) 1.17 0.23 RAG6-1068 GGCTCACACCTGTAATCCC
(SEQ ID №:359) GGCUCACACCUGUAAUCCC[dT][dT]
(SEQ ID №:45) GGGAUUACAGGUGUGAGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:202) 1.22 0.29 RAG6-1064 CACACCTGTAATCCCAGCA
(SEQ ID №:360) CACACCUGUAAUCCCAGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:46) UGCUGGGAUUACAGGUGUG[dT][dT]
(SEQ ID №:203) 1.19 0.26 RAG6-1063 ACACCTGTAATCCCAGCAC
(SEQ ID №:361) ACACCUGUAAUCCCAGCAC[dT][dT]
(SEQ ID №:47) GUGCUGGGAUUACAGGUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:204) 1.16 0.21 RAG6-1061 ACCTGTAATCCCAGCACTT
(SEQ ID №:362) ACCUGUAAUCCCAGCACUU[dT][dT]
(SEQ ID №:48) AAGUGCUGGGAUUACAGGU[dT][dT]
(SEQ ID №:205) 1.34 0.42 RAG6-1057 GTAATCCCAGCACTTTGGG
(SEQ ID №:363) GUAAUCCCAGCACUUUGGG[dT][dT]
(SEQ ID №:49) CCCAAAGUGCUGGGAUUAC[dT][dT]
(SEQ ID №:206) 1.10 0.14 RAG6-1056 TAATCCCAGCACTTTGGGA
(SEQ ID №:364) UAAUCCCAGCACUUUGGGA[dT][dT]
(SEQ ID №:50) UCCCAAAGUGCUGGGAUUA[dT][dT]
(SEQ ID №:207) 1.17 0.22 RAG6-1055 AATCCCAGCACTTTGGGAG
(SEQ ID №:365) AAUCCCAGCACUUUGGGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:51) CUCCCAAAGUGCUGGGAUU[dT][dT]
(SEQ ID №:208) 1.14 0.18 RAG6-1050 CAGCACTTTGGGAGGCCGA
(SEQ ID №:366) CAGCACUUUGGGAGGCCGA[dT][dT]
(SEQ ID №:52) UCGGCCUCCCAAAGUGCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:209) 1.14 0.19 RAG6-1033 GAGGCGGTCGGATTACGAG
(SEQ ID №:367) GAGGCGGUCGGAUUACGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:53) CUCGUAAUCCGACCGCCUC[dT][dT]
(SEQ ID №:210) 1.15 0.20 RAG6-1031 GGCGGTCGGATTACGAGGT
(SEQ ID №:368) GGCGGUCGGAUUACGAGGU[dT][dT]
(SEQ ID №:54) ACCUCGUAAUCCGACCGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:211) 1.11 0.16 RAG6-1030 GCGGTCGGATTACGAGGTC
(SEQ ID №:369) GCGGUCGGAUUACGAGGUC[dT][dT]
(SEQ ID №:55) GACCUCGUAAUCCGACCGC[dT][dT]
(SEQ ID №:212) 1.11 0.15 RAG6-1029 CGGTCGGATTACGAGGTCA
(SEQ ID №:370) CGGUCGGAUUACGAGGUCA[dT][dT]
(SEQ ID №:56) UGACCUCGUAAUCCGACCG[dT][dT]
(SEQ ID №:213) 1.15 0.20 RAG6-1028 GGTCGGATTACGAGGTCAG
(SEQ ID №:371) GGUCGGAUUACGAGGUCAG[dT][dT]
(SEQ ID №:57) CUGACCUCGUAAUCCGACC[dT][dT]
(SEQ ID №:214) 1.16 0.22 RAG6-1027 GTCGGATTACGAGGTCAGG
(SEQ ID №:372) GUCGGAUUACGAGGUCAGG[dT][dT]
(SEQ ID №:58) CCUGACCUCGUAAUCCGAC[dT][dT]
(SEQ ID №:215) 1.16 0.21 RAG6-1026 TCGGATTACGAGGTCAGGA
(SEQ ID №:373) UCGGAUUACGAGGUCAGGA[dT][dT]
(SEQ ID №:59) UCCUGACCUCGUAAUCCGA[dT][dT]
(SEQ ID №:216) 1.22 0.28 RAG6-1025 CGGATTACGAGGTCAGGAG
(SEQ ID №:374) CGGAUUACGAGGUCAGGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:60) CUCCUGACCUCGUAAUCCG[dT][dT]
(SEQ ID №:217) 1.10 0.14 RAG6-1022 ATTACGAGGTCAGGAGTTC
(SEQ ID №:375) AUUACGAGGUCAGGAGUUC[dT][dT]
(SEQ ID №:61) GAACUCCUGACCUCGUAAU[dT][dT]
(SEQ ID №:218) 1.18 0.24 RAG6-1021 TTACGAGGTCAGGAGTTCA
(SEQ ID №:376) UUACGAGGUCAGGAGUUCA[dT][dT]
(SEQ ID №:62) UGAACUCCUGACCUCGUAA[dT][dT]
(SEQ ID №:219) 1.17 0.22 RAG6-1020 TACGAGGTCAGGAGTTCAA
(SEQ ID №:377) UACGAGGUCAGGAGUUCAA[dT][dT]
(SEQ ID №:63) UUGAACUCCUGACCUCGUA[dT][dT]
(SEQ ID №:220) 1.26 0.34 RAG6-1019 ACGAGGTCAGGAGTTCAAG
(SEQ ID №:378) ACGAGGUCAGGAGUUCAAG[dT][dT]
(SEQ ID №:64) CUUGAACUCCUGACCUCGU[dT][dT]
(SEQ ID №:221) 1.13 0.17 RAG6-1016 AGGTCAGGAGTTCAAGACC
(SEQ ID №:379) AGGUCAGGAGUUCAAGACC[dT][dT]
(SEQ ID №:65) GGUCUUGAACUCCUGACCU[dT][dT]
(SEQ ID №:222) 1.15 0.20 RAG6-1008 AGTTCAAGACCAGCCTGGC
(SEQ ID №:380) AGUUCAAGACCAGCCUGGC[dT][dT]
(SEQ ID №:66) GCCAGGCUGGUCUUGAACU[dT][dT]
(SEQ ID №:223) 1.14 0.19 RAG6-980 GAAACCCCATCTTTACTAA
(SEQ ID №:381) GAAACCCCAUCUUUACUAA[dT][dT]
(SEQ ID №:67) UUAGUAAAGAUGGGGUUUC[dT][dT]
(SEQ ID №:224) 1.10 0.14 RAG6-951 ATTAGCCGGGTGTGGTGGT
(SEQ ID №:382) AUUAGCCGGGUGUGGUGGU[dT][dT]
(SEQ ID №:68) ACCACCACACCCGGCUAAU[dT][dT]
(SEQ ID №:225) 1.13 0.18 RAG6-937 GTGGTGGGCGCCTGTAATC
(SEQ ID №:383) GUGGUGGGCGCCUGUAAUC[dT][dT]
(SEQ ID №:69) GAUUACAGGCGCCCACCAC[dT][dT]
(SEQ ID №:226) 1.21 0.27 RAG6-931 GGCGCCTGTAATCCCAGCT
(SEQ ID №:384) GGCGCCUGUAAUCCCAGCU[dT][dT]
(SEQ ID №:70) AGCUGGGAUUACAGGCGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:227) 1.13 0.17 RAG6-923 TAATCCCAGCTACTCGGGG
(SEQ ID №:385) UAAUCCCAGCUACUCGGGG[dT][dT]
(SEQ ID №:71) CCCCGAGUAGCUGGGAUUA[dT][dT]
(SEQ ID №:228) 1.13 0.18 RAG6-905 GGGCTGAGGCAGAATTGCT
(SEQ ID №:386) GGGCUGAGGCAGAAUUGCU[dT][dT]
(SEQ ID №:72) AGCAAUUCUGCCUCAGCCC[dT][dT]
(SEQ ID №:229) 1.17 0.23 RAG6-898 GGCAGAATTGCTTGAACCT
(SEQ ID №:387) GGCAGAAUUGCUUGAACCU[dT][dT]
(SEQ ID №:73) AGGUUCAAGCAAUUCUGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:230) 1.23 0.30 RAG6-896 CAGAATTGCTTGAACCTGG
(SEQ ID №:388) CAGAAUUGCUUGAACCUGG[dT][dT]
(SEQ ID №:74) CCAGGUUCAAGCAAUUCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:231) 1.10 0.13 RAG6-886 TGAACCTGGGAGGCAGAGG
(SEQ ID №:389) UGAACCUGGGAGGCAGAGG[dT][dT]
(SEQ ID №:75) CCUCUGCCUCCCAGGUUCA[dT][dT]
(SEQ ID №:232) 1.24 0.31 RAG6-885 GAACCTGGGAGGCAGAGGT
(SEQ ID №:390) GAACCUGGGAGGCAGAGGU[dT][dT]
(SEQ ID №:76) ACCUCUGCCUCCCAGGUUC[dT][dT]
(SEQ ID №:233) 1.14 0.19 RAG6-883 ACCTGGGAGGCAGAGGTTG
(SEQ ID №:391) ACCUGGGAGGCAGAGGUUG[dT][dT]
(SEQ ID №:77) CAACCUCUGCCUCCCAGGU[dT][dT]
(SEQ ID №:234) 1.12 0.17 RAG6-866 TGCAGTGAGCTGAGATCAC
(SEQ ID №:392) UGCAGUGAGCUGAGAUCAC[dT][dT]
(SEQ ID №:78) GUGAUCUCAGCUCACUGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:235) 1.15 0.20 RAG6-857 CTGAGATCACGCCACTGCA
(SEQ ID №:393) CUGAGAUCACGCCACUGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:79) UGCAGUGGCGUGAUCUCAG[dT][dT]
(SEQ ID №:236) 1.16 0.22 RAG6-852 ATCACGCCACTGCATTCCA
(SEQ ID №:394) AUCACGCCACUGCAUUCCA[dT][dT]
(SEQ ID №:80) UGGAAUGCAGUGGCGUGAU[dT][dT]
(SEQ ID №:237) 1.59 0.67 RAG6-829 GGGTGACAGAGCAATACTC
(SEQ ID №:395) GGGUGACAGAGCAAUACUC[dT][dT]
(SEQ ID №:81) GAGUAUUGCUCUGUCACCC[dT][dT]
(SEQ ID №:238) 1.22 0.28 RAG6-826 TGACAGAGCAATACTCTGT
(SEQ ID №:396) UGACAGAGCAAUACUCUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:82) ACAGAGUAUUGCUCUGUCA[dT][dT]
(SEQ ID №:239) 1.16 0.21 RAG6-822 AGAGCAATACTCTGTCGCA
(SEQ ID №:397) AGAGCAAUACUCUGUCGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:83) UGCGACAGAGUAUUGCUCU[dT][dT]
(SEQ ID №:240) 1.10 0.14 RAG6-796 AAAAGAATACTGGAGGCTG
(SEQ ID №:398) AAAAGAAUACUGGAGGCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:84) CAGCCUCCAGUAUUCUUUU[dT][dT]
(SEQ ID №:241) 1.17 0.23 RAG6-795 AAAGAATACTGGAGGCTGG
(SEQ ID №:399) AAAGAAUACUGGAGGCUGG[dT][dT]
(SEQ ID №:85) CCAGCCUCCAGUAUUCUUU[dT][dT]
(SEQ ID №:242) 1.11 0.15 RAG6-790 ATACTGGAGGCTGGGCGAG
(SEQ ID №:400) AUACUGGAGGCUGGGCGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:86) CUCGCCCAGCCUCCAGUAU[dT][dT]
(SEQ ID №:243) 1.50 0.58 RAG6-775 CGAGGTGGCTCACACCTGT
(SEQ ID №:401) CGAGGUGGCUCACACCUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:87) ACAGGUGUGAGCCACCUCG[dT][dT]
(SEQ ID №:244) 1.10 0.14 RAG6-772 GGTGGCTCACACCTGTAAT
(SEQ ID №:402) GGUGGCUCACACCUGUAAU[dT][dT]
(SEQ ID №:88) AUUACAGGUGUGAGCCACC[dT][dT]
(SEQ ID №:245) 1.16 0.21 RAG6-769 GGCTCACACCTGTAATCCC
(SEQ ID №:403) GGCUCACACCUGUAAUCCC[dT][dT]
(SEQ ID №:89) GGGAUUACAGGUGUGAGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:246) 1.19 0.25 RAG6-768 GCTCACACCTGTAATCCCA
(SEQ ID №:404) GCUCACACCUGUAAUCCCA[dT][dT]
(SEQ ID №:90) UGGGAUUACAGGUGUGAGC[dT][dT]
(SEQ ID №:247) 1.12 0.16 RAG6-765 CACACCTGTAATCCCAGCA
(SEQ ID №:405) CACACCUGUAAUCCCAGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:91) UGCUGGGAUUACAGGUGUG[dT][dT]
(SEQ ID №:248) 1.11 0.14 RAG6-757 TAATCCCAGCATTTTGGGA
(SEQ ID №:406) UAAUCCCAGCAUUUUGGGA[dT][dT]
(SEQ ID №:92) UCCCAAAAUGCUGGGAUUA[dT][dT]
(SEQ ID №:249) 1.11 0.16 RAG6-728 GGGCGGAATATCTTGAGCT
(SEQ ID №:407) GGGCGGAAUAUCUUGAGCU[dT][dT]
(SEQ ID №:93) AGCUCAAGAUAUUCCGCCC[dT][dT]
(SEQ ID №:250) 1.11 0.15 RAG6-722 AATATCTTGAGCTCAGGAG
(SEQ ID №:408) AAUAUCUUGAGCUCAGGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:94) CUCCUGAGCUCAAGAUAUU[dT][dT]
(SEQ ID №:251) 1.41 0.49 RAG6-703 TTCGAGACCAGCCTACACA
(SEQ ID №:409) UUCGAGACCAGCCUACACA[dT][dT]
(SEQ ID №:95) UGUGUAGGCUGGUCUCGAA[dT][dT]
(SEQ ID №:252) 1.36 0.45 RAG6-696 CCAGCCTACACAATATGCT
(SEQ ID №:410) CCAGCCUACACAAUAUGCU[dT][dT]
(SEQ ID №:96) AGCAUAUUGUGUAGGCUGG[dT][dT]
(SEQ ID №:253) 1.14 0.19 RAG6-689 ACACAATATGCTCCAAACG
(SEQ ID №:411) ACACAAUAUGCUCCAAACG[dT][dT]
(SEQ ID №:97) CGUUUGGAGCAUAUUGUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:254) 1.12 0.16 RAG6-688 CACAATATGCTCCAAACGC
(SEQ ID №:412) CACAAUAUGCUCCAAACGC[dT][dT]
(SEQ ID №:98) GCGUUUGGAGCAUAUUGUG[dT][dT]
(SEQ ID №:255) 1.21 0.28 RAG6-687 ACAATATGCTCCAAACGCC
(SEQ ID №:413) ACAAUAUGCUCCAAACGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:99) GGCGUUUGGAGCAUAUUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:256) 1.10 0.14 RAG6-676 CAAACGCCGCCTCTACAAA
(SEQ ID №:414) CAAACGCCGCCUCUACAAA[dT][dT]
(SEQ ID №:100) UUUGUAGAGGCGGCGUUUG[dT][dT]
(SEQ ID №:257) 1.10 0.14 RAG6-622 CTGTGGTCCTAGCTACTTG
(SEQ ID №:415) CUGUGGUCCUAGCUACUUG[dT][dT]
(SEQ ID №:101) CAAGUAGCUAGGACCACAG[dT][dT]
(SEQ ID №:258) 1.21 0.27 RAG6-591 GGGAGGATCGCTTGAGCTC
(SEQ ID №:416) GGGAGGAUCGCUUGAGCUC[dT][dT]
(SEQ ID №:102) GAGCUCAAGCGAUCCUCCC[dT][dT]
(SEQ ID №:259) 1.14 0.18 RAG6-589 GAGGATCGCTTGAGCTCGG
(SEQ ID №:417) GAGGAUCGCUUGAGCUCGG[dT][dT]
(SEQ ID №:103) CCGAGCUCAAGCGAUCCUC[dT][dT]
(SEQ ID №:260) 1.13 0.17 RAG6-571 GGAGGTCGAGGCTGCAATG
(SEQ ID №:418) GGAGGUCGAGGCUGCAAUG[dT][dT]
(SEQ ID №:104) CAUUGCAGCCUCGACCUCC[dT][dT]
(SEQ ID №:261) 1.10 0.14 RAG6-568 GGTCGAGGCTGCAATGAGC
(SEQ ID №:419) GGUCGAGGCUGCAAUGAGC[dT][dT]
(SEQ ID №:105) GCUCAUUGCAGCCUCGACC[dT][dT]
(SEQ ID №:262) 1.15 0.21 RAG6-557 CAATGAGCCGAGATGGTGC
(SEQ ID №:420) CAAUGAGCCGAGAUGGUGC[dT][dT]
(SEQ ID №:106) GCACCAUCUCGGCUCAUUG[dT][dT]
(SEQ ID №:263) 1.11 0.16 RAG6-556 AATGAGCCGAGATGGTGCC
(SEQ ID №:421) AAUGAGCCGAGAUGGUGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:107) GGCACCAUCUCGGCUCAUU[dT][dT]
(SEQ ID №:264) 1.37 0.45 RAG6-550 CCGAGATGGTGCCACTGCA
(SEQ ID №:422) CCGAGAUGGUGCCACUGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:108) UGCAGUGGCACCAUCUCGG[dT][dT]
(SEQ ID №:265) 1.23 0.30 RAG6-548 GAGATGGTGCCACTGCACT
(SEQ ID №:423) GAGAUGGUGCCACUGCACU[dT][dT]
(SEQ ID №:109) AGUGCAGUGGCACCAUCUC[dT][dT]
(SEQ ID №:266) 1.15 0.20 RAG6-547 AGATGGTGCCACTGCACTC
(SEQ ID №:424) AGAUGGUGCCACUGCACUC[dT][dT]
(SEQ ID №:110) GAGUGCAGUGGCACCAUCU[dT][dT]
(SEQ ID №:267) 1.24 0.31 RAG6-545 ATGGTGCCACTGCACTCTG
(SEQ ID №:425) AUGGUGCCACUGCACUCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:111) CAGAGUGCAGUGGCACCAU[dT][dT]
(SEQ ID №:268) 1.37 0.46 RAG6-539 CCACTGCACTCTGACGACA
(SEQ ID №:426) CCACUGCACUCUGACGACA[dT][dT]
(SEQ ID №:112) UGUCGUCAGAGUGCAGUGG[dT][dT]
(SEQ ID №:269) 1.41 0.50 RAG6-538 CACTGCACTCTGACGACAG
(SEQ ID №:427) CACUGCACUCUGACGACAG[dT][dT]
(SEQ ID №:113) CUGUCGUCAGAGUGCAGUG[dT][dT]
(SEQ ID №:270) 1.37 0.46 RAG6-530 TCTGACGACAGAGCGAGAC
(SEQ ID №:428) UCUGACGACAGAGCGAGAC[dT][dT]
(SEQ ID №:114) GUCUCGCUCUGUCGUCAGA[dT][dT]
(SEQ ID №:271) 1.15 0.20 RAG6-529 CTGACGACAGAGCGAGACT
(SEQ ID №:429) CUGACGACAGAGCGAGACU[dT][dT]
(SEQ ID №:115) AGUCUCGCUCUGUCGUCAG[dT][dT]
(SEQ ID №:272) 1.13 0.17 RAG6-516 GAGACTCCGTCTCAAAACA
(SEQ ID №:430) GAGACUCCGUCUCAAAACA[dT][dT]
(SEQ ID №:116) UGUUUUGAGACGGAGUCUC[dT][dT]
(SEQ ID №:273) 1.23 0.30 RAG6-515 AGACTCCGTCTCAAAACAA
(SEQ ID №:431) AGACUCCGUCUCAAAACAA[dT][dT]
(SEQ ID №:117) UUGUUUUGAGACGGAGUCU[dT][dT]
(SEQ ID №:274) 1.28 0.35 RAG6-465 TCTAGTGTTTAAGGATCTG
(SEQ ID №:432) UCUAGUGUUUAAGGAUCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:118) CAGAUCCUUAAACACUAGA[dT][dT]
(SEQ ID №:275) 1.20 0.26 RAG6-463 TAGTGTTTAAGGATCTGCC
(SEQ ID №:433) UAGUGUUUAAGGAUCUGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:119) GGCAGAUCCUUAAACACUA[dT][dT]
(SEQ ID №:276) 1.11 0.14 RAG6-460 TGTTTAAGGATCTGCCTTC
(SEQ ID №:434) UGUUUAAGGAUCUGCCUUC[dT][dT]
(SEQ ID №:120) GAAGGCAGAUCCUUAAACA[dT][dT]
(SEQ ID №:277) 1.13 0.17 RAG6-453 GGATCTGCCTTCCTTCCTG
(SEQ ID №:435) GGAUCUGCCUUCCUUCCUG[dT][dT]
(SEQ ID №:121) CAGGAAGGAAGGCAGAUCC[dT][dT]
(SEQ ID №:278) 1.39 0.48 RAG6-425 TTGTCTTTCCTTGTTTGTC
(SEQ ID №:436) UUGUCUUUCCUUGUUUGUC[dT][dT]
(SEQ ID №:122) GACAAACAAGGAAAGACAA[dT][dT]
(SEQ ID №:279) 1.13 0.17 RAG6-423 GTCTTTCCTTGTTTGTCTT
(SEQ ID №:437) GUCUUUCCUUGUUUGUCUU[dT][dT]
(SEQ ID №:123) AAGACAAACAAGGAAAGAC[dT][dT]
(SEQ ID №:280) 1.11 0.15 RAG6-395 CAAGCAGGTTTTAAATTCC
(SEQ ID №:438) CAAGCAGGUUUUAAAUUCC[dT][dT]
(SEQ ID №:124) GGAAUUUAAAACCUGCUUG[dT][dT]
(SEQ ID №:281) 1.10 0.14 RAG6-392 GCAGGTTTTAAATTCCTAG
(SEQ ID №:439) GCAGGUUUUAAAUUCCUAG[dT][dT]
(SEQ ID №:125) CUAGGAAUUUAAAACCUGC[dT][dT]
(SEQ ID №:282) 1.31 0.39 RAG6-364 ACATTTACTTTTCCAAGGG
(SEQ ID №:440) ACAUUUACUUUUCCAAGGG[dT][dT]
(SEQ ID №:126) CCCUUGGAAAAGUAAAUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:283) 1.27 0.35 RAG6-294 ACACTGGAGTTCGAGACGA
(SEQ ID №:441) ACACUGGAGUUCGAGACGA[dT][dT]
(SEQ ID №:127) UCGUCUCGAACUCCAGUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:284) 1.13 0.17 RAG6-291 CTGGAGTTCGAGACGAGGC
(SEQ ID №:442) CUGGAGUUCGAGACGAGGC[dT][dT]
(SEQ ID №:128) GCCUCGUCUCGAACUCCAG[dT][dT]
(SEQ ID №:285) 1.19 0.26 RAG6-285 TTCGAGACGAGGCCTAAGC
(SEQ ID №:443) UUCGAGACGAGGCCUAAGC[dT][dT]
(SEQ ID №:129) GCUUAGGCCUCGUCUCGAA[dT][dT]
(SEQ ID №:286) 1.30 0.38 RAG6-282 GAGACGAGGCCTAAGCAAC
(SEQ ID №:444) GAGACGAGGCCUAAGCAAC[dT][dT]
(SEQ ID №:130) GUUGCUUAGGCCUCGUCUC[dT][dT]
(SEQ ID №:287) 1.14 0.19 RAG6-281 AGACGAGGCCTAAGCAACA
(SEQ ID №:445) AGACGAGGCCUAAGCAACA[dT][dT]
(SEQ ID №:131) UGUUGCUUAGGCCUCGUCU[dT][dT]
(SEQ ID №:288) 1.82 0.86 RAG6-280 GACGAGGCCTAAGCAACAT
(SEQ ID №:446) GACGAGGCCUAAGCAACAU[dT][dT]
(SEQ ID №:132) AUGUUGCUUAGGCCUCGUC[dT][dT]
(SEQ ID №:289) 1.11 0.16 RAG6-273 CCTAAGCAACATGCCGAAA
(SEQ ID №:447) CCUAAGCAACAUGCCGAAA[dT][dT]
(SEQ ID №:133) UUUCGGCAUGUUGCUUAGG[dT][dT]
(SEQ ID №:290) 1.17 0.22 RAG6-272 CTAAGCAACATGCCGAAAC
(SEQ ID №:448) CUAAGCAACAUGCCGAAAC[dT][dT]
(SEQ ID №:134) GUUUCGGCAUGUUGCUUAG[dT][dT]
(SEQ ID №:291) 1.30 0.38 RAG6-271 TAAGCAACATGCCGAAACC
(SEQ ID №:449) UAAGCAACAUGCCGAAACC[dT][dT]
(SEQ ID №:135) GGUUUCGGCAUGUUGCUUA[dT][dT]
(SEQ ID №:292) 1.19 0.26 RAG6-219 TGGTGGCGCACGCCTATAG
(SEQ ID №:450) UGGUGGCGCACGCCUAUAG[dT][dT]
(SEQ ID №:136) CUAUAGGCGUGCGCCACCA[dT][dT]
(SEQ ID №:293) 1.33 0.42 RAG6-218 GGTGGCGCACGCCTATAGT
(SEQ ID №:451) GGUGGCGCACGCCUAUAGU[dT][dT]
(SEQ ID №:137) ACUAUAGGCGUGCGCCACC[dT][dT]
(SEQ ID №:294) 1.19 0.26 RAG6-206 CTATAGTCCTAGCTACTGG
(SEQ ID №:452) CUAUAGUCCUAGCUACUGG[dT][dT]
(SEQ ID №:138) CCAGUAGCUAGGACUAUAG[dT][dT]
(SEQ ID №:295) 1.22 0.29 RAG6-205 TATAGTCCTAGCTACTGGG
(SEQ ID №:453) UAUAGUCCUAGCUACUGGG[dT][dT]
(SEQ ID №:139) CCCAGUAGCUAGGACUAUA[dT][dT]
(SEQ ID №:296) 1.10 0.13 RAG6-181 TGAGGTGGGAGGATCGCTT
(SEQ ID №:454) UGAGGUGGGAGGAUCGCUU[dT][dT]
(SEQ ID №:140) AAGCGAUCCUCCCACCUCA[dT][dT]
(SEQ ID №:297) 1.19 0.24 RAG6-144 CTGCAGTGAGCCGAGATCG
(SEQ ID №:455) CUGCAGUGAGCCGAGAUCG[dT][dT]
(SEQ ID №:141) CGAUCUCGGCUCACUGCAG[dT][dT]
(SEQ ID №:298) 1.23 0.30 RAG6-143 TGCAGTGAGCCGAGATCGC
(SEQ ID №:456) UGCAGUGAGCCGAGAUCGC[dT][dT]
(SEQ ID №:142) GCGAUCUCGGCUCACUGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:299) 1.53 0.62 RAG6-119 TGCACTCCAGCCTGAGCGA
(SEQ ID №:457) UGCACUCCAGCCUGAGCGA[dT][dT]
(SEQ ID №:143) UCGCUCAGGCUGGAGUGCA[dT][dT]
(SEQ ID №:300) 1.24 0.31 RAG6-117 CACTCCAGCCTGAGCGACA
(SEQ ID №:458) CACUCCAGCCUGAGCGACA[dT][dT]
(SEQ ID №:144) UGUCGCUCAGGCUGGAGUG[dT][dT]
(SEQ ID №:301) 1.26 0.34 RAG6-101 ACAGGGCGAGGCTCTGTCT
(SEQ ID №:459) ACAGGGCGAGGCUCUGUCU[dT][dT]
(SEQ ID №:145) AGACAGAGCCUCGCCCUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:302) 1.29 0.37 RAG6-98 GGGCGAGGCTCTGTCTCAA
(SEQ ID №:460) GGGCGAGGCUCUGUCUCAA[dT][dT]
(SEQ ID №:146) UUGAGACAGAGCCUCGCCC[dT][dT]
(SEQ ID №:303) 1.56 0.64 RAG6-97 GGCGAGGCTCTGTCTCAAA
(SEQ ID №:461) GGCGAGGCUCUGUCUCAAA[dT][dT]
(SEQ ID №:147) UUUGAGACAGAGCCUCGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:304) 1.18 0.24 RAG6-96 GCGAGGCTCTGTCTCAAAA
(SEQ ID №:462) GCGAGGCUCUGUCUCAAAA[dT][dT]
(SEQ ID №:148) UUUUGAGACAGAGCCUCGC[dT][dT]
(SEQ ID №:305) 1.26 0.34 RAG6-93 AGGCTCTGTCTCAAAACAA
(SEQ ID №:463) AGGCUCUGUCUCAAAACAA[dT][dT]
(SEQ ID №:149) UUGUUUUGAGACAGAGCCU[dT][dT]
(SEQ ID №:306) 1.14 0.20 RAG6-92 GGCTCTGTCTCAAAACAAA
(SEQ ID №:464) GGCUCUGUCUCAAAACAAA[dT][dT]
(SEQ ID №:150) UUUGUUUUGAGACAGAGCC[dT][dT]
(SEQ ID №:307) 1.16 0.22 RAG6-91 GCTCTGTCTCAAAACAAAC
(SEQ ID №:465) GCUCUGUCUCAAAACAAAC[dT][dT]
(SEQ ID №:151) GUUUGUUUUGAGACAGAGC[dT][dT]
(SEQ ID №:308) 1.15 0.20 RAG6-90 CTCTGTCTCAAAACAAACA
(SEQ ID №:466) CUCUGUCUCAAAACAAACA[dT][dT]
(SEQ ID №:152) UGUUUGUUUUGAGACAGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:309) 1.18 0.24 RAG6-45 AACACAGTGAAATGAAAGG
(SEQ ID №:467) AACACAGUGAAAUGAAAGG[dT][dT]
(SEQ ID №:153) CCUUUCAUUUCACUGUGUU[dT][dT]
(SEQ ID №:310) 1.22 0.29 RAG6-44 ACACAGTGAAATGAAAGGA
(SEQ ID №:468) ACACAGUGAAAUGAAAGGA[dT][dT]
(SEQ ID №:154) UCCUUUCAUUUCACUGUGU[dT][dT]
(SEQ ID №:311) 1.16 0.22 RAG6-41 CAGTGAAATGAAAGGATTG
(SEQ ID №:469) CAGUGAAAUGAAAGGAUUG[dT][dT]
(SEQ ID №:155) CAAUCCUUUCAUUUCACUG[dT][dT]
(SEQ ID №:312) 1.23 0.30 RAG6-39 GTGAAATGAAAGGATTGAG
(SEQ ID №:470) GUGAAAUGAAAGGAUUGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:156) CUCAAUCCUUUCAUUUCAC[dT][dT]
(SEQ ID №:313) 1.15 0.20 RAG6-37 GAAATGAAAGGATTGAGAG
(SEQ ID №:471) GAAAUGAAAGGAUUGAGAG[dT][dT]
(SEQ ID №:157) CUCUCAAUCCUUUCAUUUC[dT][dT]
(SEQ ID №:314) 1.21 0.27

Таблица 4. Последовательности праймеров для анализа методом ОТ-кПЦР Праймер № последовательности Последовательность (5'-3') SMN F1 SMN R1 SEQ ID №: 480 SEQ ID №: 481 CACAGGCCAGAGCGATGA CGAAGTTTCACAAATGTCACCAT HPRT1 F HPRT1 R SEQ ID №: 482 SEQ ID №: 483 ATGGACAGGACTGAACGTCTT TCCAGCAGGTCAGCAAAGAA TBP F TBP R SEQ ID №: 484 SEQ ID №: 485 ATAATCCCAAGCGGTTTGCT CTGCCAGTCTGGACTGTTCT SMN F2 SMN R2 SEQ ID №: 486 SEQ ID №: 487 CCACCACCTCCCATATGTCC GCTCTATGCCAGCATTTCTCCT SMN-экзон6-F
SMN-экзон8-R SEQ ID №: 488
SEQ ID №: 489 CCCCCACCACCTCCCATATG
CCCTTCTCACAGCTCATAAAATTAC

[75] РИС. 2 иллюстрирует распределение каРНК SMN2 по активности; каРНК отсортированы в порядке уменьшения активирующей способности (от молекул с высокой активирующей способностью к молекулам с высокой ингибирующей способностью). Сортировка 980 каРНК по их расположению в промоторе SMN2 позволила показать, что распределение функциональных каРНК по промотору носило кластерный характер, т. е. они группировались лишь в определенных областях промотора: можно было выделить «активные участки», в которых число функциональных каРНК было увеличено (РИС. 3). Как видно из РИС. 3, имеется 4 активных участка, которые находятся в областях промотора от -1639 до -1481 (H1), от -1090 до -1008 (H2), от -994 до -180 (H3) и от -144 до -37 (H4) и в которых число функциональных каРНК заметно увеличено. Такой результат говорит о том, что функциональные каРНК распределялись в промоторе неслучайным образом и что в особых активных участках их число было увеличено.

[76] Последовательность активного участка H1 (от -1639 до -1481) (SEQ ID №: 476):

agtcgcactctgtcactcaggctggagtgcagtggcgtgatcttggctcactgcaacctccgcctcccgagttcaagtgattctcctggctcagcctcccaagcagctgtcattacaggcctgcaccaccacacccggctgatttttgtatttttagga (SEQ ID №: 476)

[77] Последовательность активного участка H2 (от -1090 до -1008) (SEQ ID №: 477):

aatactggaggcccggtgtggtggctcacacctgtaatcccagcactttgggaggccgaggcggtcggattacgaggtcagg (SEQ ID №: 477)

[78] Последовательность активного участка H3 (от -994 до -180) (SEQ ID №: 478):

ctggccaacatggtgaaaccccatctttactaaaaatacaaaaattagccgggtgtggtggtgggcgcctgtaatcccagctactcggggggctgaggcagaattgcttgaacctgggaggcagaggttgcagtgagctgagatcacgccactgcattccagcctgggtgacagagcaatactctgtcgcaaaaaaaaaaaagaatactggaggctgggcgaggtggctcacacctgtaatcccagcattttgggatgccagaggcgggcggaatatcttgagctcaggagttcgagaccagcctacacaatatgctccaaacgccgcctctacaaaacatacagaaactagccgggtgtggtggcgtgcccctgtggtcctagctacttgggaggttgaggcgggaggatcgcttgagctcgggaggtcgaggctgcaatgagccgagatggtgccactgcactctgacgacagagcgagactccgtctcaaaacaaacaacaaataaggttgggggatcaaatatcttctagtgtttaaggatctgccttccttcctgcccccatgtttgtctttccttgtttgtctttatatagatcaagcaggttttaaattcctagtaggagcttacatttacttttccaagggggagggggaataaatatctacacacacacacacacacacacacacacacacacactggagttcgagacgaggcctaagcaacatgccgaaaccccgtctctactaaatacaaaaaatagctgagcttggtggcgcacgcctatagtcctagctactggggaggctg (SEQ ID №: 478)

[79] Последовательность активного участка H4 (от -144 до -37) (SEQ ID №: 479):

ctgcagtgagccgagatcgcgccgctgcactccagcctgagcgacagggcgaggctctgtctcaaaacaaacaaacaaaaaaaaaaggaaaggaaatataacacagtg(SEQ ID №: 479).

Пример 3. Дополнительный скрининг и валидация функциональных каРНК, способных активировать ген SMN

[80] Для дополнительного скрининга и проверки функциональных каРНК, способных активировать ген SMN (выявленных в ходе высокопроизводительного скрининга), из 157 функциональных каРНК были случайным образом выбраны 50 каРНК для дополнительной проверки их способности активировать экспрессию генов SMN в клетках HEK293T, HS27 (линия фибробластов кожи человека) и NHDF (нормальные фибробласты дермы человека). Клетки HEK293T, HS27 и NHDF трансфицировали отдельными каРНК (n=50, конечная концентрация: 20 нМ), перечисленными в таблице 5; метод трансфекции описан в примере 2. Через 72 ч РНК из трансфицированных клеток выделяли РНК с помощью набора Qiagen RNeasy. После обратной транскрипции проводили кПЦР-амплификацию генов SMN с помощью системы 7500FAST для ПЦР в режиме реального времени; также амплифицировали гены HPRT1 и TBP, а средние геометрические значения их экспрессии использовали в качестве внутренних референтных значений. РИС. 4 иллюстрирует эффект активирующей каРНК на экспрессию гена SMN в клетках HEK293T, а таблица 5 иллюстрирует эффект активирующей каРНК на экспрессию гена SMN в клетках HS27 и NHDF. Из этих результатов видно, что такие каРНК способны активировать экспрессию генов SMN в различных клетках в различной степени, вплоть до 19-кратного увеличения уровня экспрессии.

Таблица 5. 50 каРНК, выбранных случайным образом для валидации каРНК 293T HS27 NHDF Среднее значение RAG6-1061 2.10 1.51 19.07 7.56 RAG6-219 1.78 3.45 4.19 3.14 RAG6-790 2.40 2.67 2.79 2.62 RAG6-1392 1.79 3.19 2.80 2.59 RAG6-392 1.77 2.82 2.81 2.47 RAG6-550 1.60 2.55 2.50 2.22 RAG6-556 2.08 2.30 2.06 2.15 RAG6-1612 1.28 2.70 2.45 2.14 RAG6-1089 1.64 2.28 2.39 2.10 RAG6-281 2.21 1.99 1.86 2.02 RAG6-143 1.46 2.42 2.11 2.00 RAG6-545 1.84 1.85 1.98 1.89 RAG6-852 1.69 1.65 2.08 1.81 RAG6-1535 1.56 1.80 1.98 1.78 RAG6-1020 1.56 1.71 2.05 1.77 RAG6-1533 1.63 1.74 1.88 1.75 RAG6-285 2.10 1.54 1.54 1.73 RAG6-722 1.54 1.59 2.05 1.73 RAG6-272 1.51 1.77 1.88 1.72 RAG6-98 1.69 1.51 1.89 1.70 RAG6-117 1.17 2.12 1.73 1.68 RAG6-539 1.37 1.84 1.75 1.65 RAG6-538 1.27 1.72 1.93 1.64 RAG6-703 1.44 1.46 1.70 1.53 RAG6-364 1.39 1.57 1.58 1.51 RAG6-144 1.07 1.76 1.60 1.48 RAG6-1575 1.35 1.70 1.26 1.44 RAG6-1598 1.02 1.93 1.31 1.42 RAG6-1576 1.15 1.25 1.86 1.42 RAG6-1563 1.38 1.17 1.67 1.40 RAG6-1597 1.22 1.35 1.39 1.32 RAG6-1603 1.24 0.87 1.80 1.30 RAG6-886 1.13 1.22 1.42 1.26 RAG6-898 1.07 1.18 1.50 1.25 RAG6-1241 1.53 1.09 1.12 1.25 RAG6-1578 0.85 1.35 1.49 1.23 RAG6-515 1.19 1.12 1.36 1.22 RAG6-547 1.04 1.38 1.24 1.22 RAG6-1567 0.96 1.32 1.31 1.20 RAG6-1548 0.80 1.35 1.21 1.12 RAG6-1631 0.93 1.26 1.16 1.12 RAG6-516 0.82 1.24 1.16 1.08 RAG6-1564 0.94 1.31 0.96 1.07 RAG6-101 0.90 1.24 1.08 1.07 RAG6-1577 0.91 1.00 1.28 1.06 RAG6-453 1.10 1.03 0.79 0.97 RAG6-119 0.97 0.99 0.95 0.97 RAG6-1545 0.82 1.12 0.97 0.97 RAG6-96 1.15 0.70 0.72 0.86 RAG6-1565 0.69 1.35 0.24 0.76

Пример 4. Оценка экспрессии SMN2 с помощью ОТ-ПЦР и расщепления рестриктазой

[81] Поскольку ген SMN2 в высокой степени гомологичен гену SMN1, описанные выше праймеры для ОТ-кПЦР сами по себе не позволяют различить последовательности мРНК генов SMN2 и SMN1. Чтобы обнаружить именно экспрессию мРНК SMN2 после обработки каРНК, а также различить мРНК SMN2 с включением и пропуском экзона 7, кДНК из клеток, обработанных каРНК, амплифицировали с использованием пары праймеров SMN-экзон6-F и SMN-экзон8-R, а продукты такой ПЦР расщепляли рестриктазой DdeI. После гель-электрофореза продуктов расщепления оценивали уровни экспрессии полноразмерной мРНК SMN2 и мРНК SMN2 с делецией экзона 7 (SMN2Δ7) по интенсивности отдельных полос ДНК. Вкратце, клетки HEK293T высевали на 6-луночные планшеты в количестве 2-3×10⁵ клеток на лунку и проводили обратную трансфекцию каРНК при конечной концентрации 10 нМ. По окончании трансфекции выделяли общую клеточную РНК с помощью набора RNeasy Plus Mini (Qiagen; Hilden, Германия) согласно инструкции, вложенной в набор. РНК (1 мкг) подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора PrimeScript RT, содержащего средство удаления геномной ДНК gDNA Eraser (Takara, Shlga, Япония), после чего проводили ПЦР-амплификацию с использованием праймеров SMN-экзон6-F и SMN-экзон8-R и реагента для ПЦР компании Takara (RR010A) в следующих условиях: 10 с при 98°C, 15 с при 60°C, 32 с при 72°C и 28 циклов амплификации (подробнее см. в таблице 6). После ПЦР-амплификации продукты ПЦР расщепляли ферментом DdeI для того, чтобы различить SMN1 и SMN2, после чего продукты расщепления разделяли в 2,5%-ном агарозном геле с помощью электрофореза. Интенсивность полос, соответствующих каждому продукту ПЦР или продуктам расщепления рестриктазой, анализировали с помощью системы Image Lab (BIO-RAD, система визуализации Chemistry Doc^tm MP). В качестве контроля для нормирования интенсивности полос исследуемых образцов использовали полосу 500 п.о. из набора маркеров для электрофореза ДНК компании Takara 100 bp DNA ladder (3407A) (в лунку геля вносили 5 мкл образца, содержащего приблизительно 150 нг ДНК). Нормированную интенсивность полос затем выражали в относительных единицах в сравнении с интенсивностью полос для образца, обработанного холостым раствором. Реакция расщепления рестриктазой и условия проведения этой реакции показаны в таблице 7. В качестве внутреннего референтного гена использовали ген HPRT1; последовательности использованных праймеров приведены в таблице 4.

[82] Ниже описана процедура конструирования вектора для гиперэкспрессии SMN2, использованного в данном примере, и трансфекции клеток этим вектором.

[83] Из клеток HEK293T выделяли общую клеточную РНК и подвергали ее обратной транскрипции в кДНК с использованием праймеров OligodT. Открытую рамку считывания (ORF) полноразмерного гена SMN2 амплифицировали с помощью праймеров для клонирования ПЦР-продуктов cSMN2-F2 (TAAGCA GGATCC ATG GCG ATG AGC AGC GGC GGC (SEQ ID №: 490)) и cSMN2-R2 (TAAGCA GAATTC TTA ATT TAA GGA ATG TGA GCA (SEQ ID №: 491)). Полученные продукты расщепляли с помощью ферментов BamHI и EcoRI. Те же ферменты использовали для расщепления плазмиды pcDNA3.1 (Invitrogen). Расщепленные плазмиды и расщепленные продукты ПЦР лигировали с помощью лигазы T4. Компетентные клетки DH5α трансформировали продуктами, полученными в результате реакции лигирования. Из клеток, оставленных на ночь для размножения, выделяли плазмиды с помощью набора Qiagen Miniprep. Полученные плазмиды (1 мкг) использовали для трансфекции клеток HEK293T с помощью реагента Lipofectamine 3000 (Invitrogen). Через 72 часа из трансфицированных клеток выделяли общую РНК и анализировали ее с помощью ОТ-ПЦР и расщепления рестриктазой.

Таблица 6. ОТ-ПЦР условия ее проведения Реагент (Takara, R010A) Объем (мкл) Конечная концентрация 5-кратный буфер primeSTAR 5 1× Смесь dNTP 2 200 мкМ каждого вещества Праймеры F+R (5 мкМ) 1 0,2-0,3 мкМ каждого вещества Матрица 2 ДНК-полимераза PrimeSTAR HS 0,25 Дистиллированная вода двойной перегонки 14,75 Условия ПЦР 98°C 10 с 28 циклов 60°C 15 с 72°C 32 с

Таблица 7. Реакция расщепления рестриктазой DdeI и условия ее проведения Компоненты реакции расщепления рестриктазой (NEB, R0175L) Объем (мкл) Рестриктаза DdeI 1 кДНК 8 10-кратный буфер NEB 1 Общий реакционный объем 10 Температура инкубации 37°C Время инкубации 1 ч

[84] Как видно из РИС. 6 и РИС. 7A, по сравнению с пустым (холостым) контролем и контролем с двуспиральным олигонуклеотидом (dsCON2) (полосы 51-52), общий уровень экспрессии мРНК SMN2 во всех клетках, обработанных кмРНК, был увеличен; при этом максимально этот уровень повысился в 2,49 раз. Также показано, что большинство кмРНК (28, 56%) вызывали увеличение соотношения между количеством мРНК полноразмерного гена SMN2 и мРНК гена SMN2 с делецией экзона 7 (указана черными стрелками на РИС. 6 и РИС. 7B).

Пример 5. Исследование дозовой зависимости эффекта каРНК, состоящего в активации экспрессии SMN и повышении экспрессии мРНК и белка, кодируемых полноразмерным геном SMN2

[85] Чтобы установить дозовую зависимость эффекта каРНК, состоящего в активации экспрессии SMN, были выбраны 2 каРНК (RAG6-281 и RAG6-550), которые были использованы для трансфекции клеток HEK293T при концентрациях 1 нМ, 10 нМ, 20 нМ, 50 нМ и 100 нМ. Через 72 часа после трансфекции из обработанных клеток выделяли РНК и белок. РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК, а полученную кДНК амплифицировали методом ОТ-кПЦР, после чего расщепляли рестриктазой DdeI. Белок анализировали методом вестерн-блоттинга с использованием специфического антитела к SMN для определения уровня экспрессии белка SMN. Вкратце, обработанные клетки лизировали с помощью буфера для лизиса клеток (1-кратный буфер RIPA, Cell Signaling Technology (CST), Danvers, MA, США, № 9806). В буфер для лизиса клеток добавляли ингибитор протеаз (Sigma, серия № 126M4015v). Белок количественно определяли методом с бицинхониновой кислотой (BCA) и отделяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. После электрофореза белок переносили на мембрану из ПВДФ с размером пор 0,45 мкм. Блоты анализировали с использованием моноклонального мышиного антитела к SMN (CST, № 12976) или поликлонального кроличьего антитела к α/β-тубулину (CST, № 2148); в качестве второго антитела использовали связанное с пероксидазой хрена (HRP) антитело к IgG мыши (CST, № 7076) или связанное с HRP антитело к IgG кролика (CST, № 7074). Для обнаружения сигналов белка мембрану сканировали на аппарате Image Lab.

[86] Как показано на РИС. 8A, препараты RAG6-281 и RAG6-550 вызывали значительную активацию экспрессии мРНК SMN, увеличивая ее более чем в 1,5 раза, даже в случае трансфекции в концентрации 1 нМ; максимальное увеличение экспрессии SMN (в 2,38 раза и 2,16 раза соответственно) наблюдалось в том случае, когда концентрация каРНК при трансфекции составляла 50 нМ. В случае когда концентрация каРНК при трансфекции составляла 100 нМ, дополнительного увеличения экспрессии SMN не наблюдалось. Кроме того, анализ с использованием ОТ-ПЦР и расщепления рестриктазой DdeI показал, что обе каРНК (RAG6-281 и RAG6-550) стимулировали экспрессию мРНК SMN1 и SMN2, что находится в согласии с результатами ОТ-кПЦР. Количественная оценка соотношения интенсивностей полос, соответствующих продуктам полноразмерного гена SMN2 и гена SMN2Δ7, показала, что препараты RAG6-281 и RAG6-550 значительно повышали экспрессию мРНК полноразмерного гена SMN2 при всех изученных концентрациях (РИС. 8B). По сравнению с холостым контролем, каРНК RAG6-281 увеличивала отношение мРНК полноразмерного гена SMN2 к мРНК гена SMN2Δ7 в 1,9, 2,39, 2,41, 2,39 и 2,1 раза в случае трансфекции при концентрациях 1 нМ, 10 нМ, 20 нМ, 50 нМ и 100 нМ соответственно; при этом каРНК RAG6-550 увеличивала отношение мРНК полноразмерного гена SMN2 к мРНК гена SMN2Δ7 в 1,52, 1,99, 1,91, 2,3 и 1,7 раза соответственно в случае трансфекции при концентрациях, указанных выше. Величина изменений, индуцируемых препаратами RAG6-281 и RAG6-550, в случае трансфекции при концентрациях от 1 нМ до 50 нМ зависела от дозы (РИС. 8B). Изменение экспрессии белка SMN также анализировали методом вестерн-блоттинга, и полученные результаты очень хорошо соответствовали результатам анализа мРНК методом ОТ-кПЦР, из чего можно заключить, что обе каРНК (RAG6-281 и RAG6-550) значительно повышали уровень экспрессии полноразмерного белка SMN, причем эффект зависел от дозы (РИС. 8C). Однако при вестерн-блоттинге не удалось обнаружить полос, соответствующих белку SMN с делецией экзона 7 (SMN2Δ7), что, вероятно, связано с его существенной нестабильностью, о чем ранее уже сообщалось в литературе (Hua et al, PLoS Biol 2007;5(4)e73).

Пример 6. Эффективность каРНК in vivo: улучшение моторной функции у мышей с СМА I типа

1. Разведение и генотипирование мышей с СМА I типа (СМА I)

[87] Новорожденных мышей получали путем скрещивания мышей Smn1^+/-, SMN2^-/- (с гетерозиготным нокаутом гена Smn1 мыши) и мышей Smn1^-/-, SMN2^+/+ (мыши с СМА III типа и двумя копиями трансгена SMN2 человека) (предоставлены Пекинским институтом генной терапии редких заболеваний Руйси) и генотипировали путем ПЦР геномной ДНК (РИС. 9). В данном исследовании использовали детенышей со следующими генотипами: мыши с СМА I - носители гомологичной делеции гена Smn мыши и гетерозиготного трансгена SMN2 человека с генотипом Smn1^-/-, SMN2^+/-, гетерозиготные мыши с СМА (Het, контрольная группа нормальных мышей) - носители гетерозиготной делеции гена Smn1 мыши и гетерозиготного трансгена SMN2 человека с генотипом of Smn^+/-, SMN2^+/-.

2. Приготовление олигонуклеотидов в смеси с реагентами in vivo-jetPEI и HKP

[88] Подготовка лекарственной формы с помощью in-vivo jetPEI. Для приготовления маточного раствора (5 мг/мл) каРНК SMN2 RAG6-539 (DS06-0013B) растворяли в воде, не содержащей РНКаз (Invitrogen, 2063810). 5 мкл DS06-0013B и 12,5 мкл 10% раствора глюкозы (Polyplus-transfection, G181106) аккуратно перемешивали с 3,5 мкл воды, не содержащей РНКаз, для получения рабочего раствора DS06-0013B. Рабочий раствор добавляли к 4 мкл реагента in-vivo jetPEI (Polyplus-transfection, 26031A1C) и перемешивали, после чего смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 15 мин; конечная концентрация РНК составляла 1 мг/мл.

[89] Приготовление раствора с реагентом HKP. каРНК SMN2 RAG6-538 (DS06-0002B) растворяли в воде, не содержащей РНКаз, для получения маточного раствора (4 мг/мл). Сополимер гистидина и лизина (HKP) (Suzhou Sirnaomics Biopharmaceuticals Co. Ltd., AKF271/042-79-11) растворяли в воде, не содержащей РНКаз, для получения маточного раствора (16 мг/мл). 7,5 мкл маточного раствора HKP быстро смешивали с 7,5 мкл маточного раствора DS06-0002B, после чего смесь оставляли стоять на 30 мин при комнатной температуре; конечная концентрация РНК составляла 2 мг/мл.

3. Интрацеребровентрикулярная инъекция олигонуклеотидов в смеси с реагентами in-vivo jetPEI и HKP мышам с СМА I

[90] Детенышей мышей с генотипами, указанными выше, разделили на четыре группы: контрольные мыши Het, контрольные мыши с СМА (мыши с СМА I, не получавшие никаких препаратов), DS06-0013B-J (мыши с СМА I, получавшие препарат DS06-0013B в смеси с реагентом in vivo-jetPEI, 1 мг/мл) и DS06-0002B-H (мыши с СМА I, получавшие препарат DS06-0002B в смеси с реагентом с HKP, 2 мг/мл). Новорожденным мышам проводили интрацеребровентрикулярную инъекцию (ИЦВ) в 1-й день после рождения (P1); объем введенного раствора составлял 5 мкл. Группы животных, способ введения, объем введенного раствора и время проведения инъекции показаны в таблице 8.

Таблица 8. Введение каРНК и контрольные группы Группа Количество животных Способ введения Объем введенного раствора Время проведения инъекции DS06-0002B-H (RAG6-538) 4 ИЦВ 5 мкл P1 DS06-0013B-J (RAG6-539) 2 ИЦВ 5 мкл P1 Контрольные мыши с СМА 3 Н/п Н/п Н/п Контрольные мыши Het 4 Н/п Н/п Н/п

4. Оценка моторной функции у мышей с СМА I

[91] Моторную функцию мышей оценивали в день P7 или P8 с помощью теста на рефлекс переворачивания. Вкратце, мышей из нормального положения стоя переворачивали на спину, так что спина касалась поверхности лабораторного стола, а лапы были подняты вверх; затем их отпускали, чтобы они могли вернуться в нормальное положение стоя. Время (в секундах), необходимое мышам для возврата в нормальное положение, регистрировали и описывали как время рефлекса переворачивания или время переворота. Если мышь не могла вернуться в нормальное положение в течение 60 с, то время переворота регистрировали как > 60 с. Время переворота отражает моторную функцию мышей: чем короче время переворота, тем лучше моторная функция у мыши. В таблице 9 перечислены значения времени переворота у мышей в данном исследовании.

Таблица 9. Время переворота у мышей Группа Количество животных № животного Дата оценки Время переворота (с) DS06-0002B-H (RAG6-538) 2 15081503 P7 4 15081505 P7 5 DS06-0013B-J (RAG6-539) 4 15081509 P7 3,5 35081405 P8 3 35081406 P8 4 35081407 P8 > 60 Контрольные мыши с СМА 3 35081403 P7 > 60 15081502 P7 12 35081404 P8 > 60 Контрольные мыши Het 4 15081506 P7 2 15081507 P7 2 15081510 P7 2 35081402 P8 1,5

[92] РИС. 10 иллюстрирует улучшение моторной функции у мышей с СМА I типа после введения препаратов каРНК SMN2. Как видно из таблицы 9, время переворота со спины на лапы у нормальных мышей из контрольной группы (Het) находилось в пределах 2 с, в то время как у мышей с СМА I из контрольной группы (не получавших препарат) время переворота со спины на лапы составляло не менее 12 с; при этом две мыши из этой группы полностью утратили способность переворачиваться (время переворота > 60 с). В двух группах терапии каРНК [RAG6-538 (DS06-0002B-H) и DS06-0013B (DS06-0013B-J)] время переворота было ближе к показателям для нормальных мышей, особенно у мышей из группы DS06-0002B-H. По сравнению с контрольной группой СМА I, время переворота у мышей из группы DS06-0002B-H сократилось почти в 10 раз, а у мышей из группы DS06-0013B-J время переворота сократилось в 2,5 раза (таблица 9, РИС. 10). Этот результат демонстрирует, что моторная функция у мышей с СМА I типа после введения каРНК SMN2 значительно улучшилась, из чего можно заключить, что терапия каРНК может отсрочить начало болезни.

[93] В целом, в результате высокопроизводительного скрининга каРНК, направленных к промотору SMN2, был выявлен целый ряд каРНК, способных заметно активировать экспрессию гена SMN. Эти каРНК способны не только вызывать дозозависимую стимуляцию экспрессии гена SMN2, но также значительно увеличивать соотношение между количеством полноразмерного белка SMN2 и белка SMN2Δ7 в клетках. Кроме того, исследование эффективности in vivo доказало, что каРНК, раскрытые в данном документе, способны значительно улучшать моторную функцию у мышей с СМА I типа. Эти результаты убедительно говорят о том, что активация экспрессии SMN2 на уровне транскрипции с помощью каРНК, направленных к промотору SMN2, с целью повышения уровня экспрессии полноразмерного белка SMN, является перспективной стратегией лечения СМА.

Литература

1. Kolb SJ, Coffey CS, Yankey JW, Krosschell K, Arnold WD, et al. 2017. Natural history of infantile-onset spinal muscular atrophy. Ann Neurol 82:883-91

2. Sugarman EA, Nagan N, Zhu H, Akmaev VR, Zhou Z, et al. 2012. Pan-ethnic carrier screening and prenatal diagnosis for spinal muscular atrophy: clinical laboratory analysis of >72,400 specimens. Eur J Hum Genet 20:27-32

3. Zhang C, Lang Q, 2017. New Therapeutic medication for treating Spinal Muscular Atrophy-SPINRAZA. Journal of Clinical Phamacology 15:83-4

4. Lefebvre S, Burglen L, Reboullet S, Clermont O, Burlet P, et al. 1995. Identification and characterization of a spinal muscular atrophy-determining gene. Cell 80:155-65

5. Lorson CL, Hahnen E, Androphy EJ, Wirth B. 1999. A single nucleotide in the SMN gene regulates splicing and is responsible for spinal muscular atrophy. Proc Natl Acad Sci USA 96:6307-11

6. Monani UR, Lorson CL, Parsons DW, Prior TW, Androphy EJ, et al. 1999. A single nucleotide difference that alters splicing patterns distinguishes the SMA gene SMN1 from the copy gene SMN2. Hum Mol Genet 8:1177-83

7. Hua Y, Sahashi K, Hung G, Rigo F, Passini MA, et al. 2010. Antisense correction of SMN2 splicing in the CNS rescues necrosis in a type III SMA mouse model. Genes Dev 24:1634-44

8. Hua Y, Sahashi K, Rigo F, Hung G, Horev G, et al. 2011. Peripheral SMN restoration is essential for long-term rescue of a severe spinal muscular atrophy mouse model. Nature 478:123-6

9. Naryshkin NA, Weetall M, Dakka A, Narasimhan J, Zhao X, et al. 2014. Motor neuron disease. SMN2 splicing modifiers improve motor function and longevity in mice with spinal muscular atrophy. Science 345:688-93

10. Palacino J, Swalley SE, Song C, Cheung AK, Shu L, et al. 2015. SMN2 splice modulators enhance U1-pre-mRNA association and rescue SMA mice. Nat Chem Biol 11:511-7

11. Michelson D, Ciafaloni E, Ashwal S, Lewis E, Narayanaswami P, et al. 2018. Evidence in focus: Nusinersen use in spinal muscular atrophy: Report of the Guideline Development, Dissemination, and Implementation Subcommittee of the American Academy of Neurology. Neurology

12. Avila AM, Burnett BG, Taye AA, Gabanella F, Knight MA, et al. 2007. Trichostatin A increases SMN expression and survival in a mouse model of spinal muscular atrophy. J Clin Invest 117:659-71

13. Somers E, Riessland M, Schreml J, Wirth B, Gillingwater TH, Parson SH. 2013. Increasing SMN levels using the histone deacetylase inhibitor SAHA ameliorates defects in skeletal muscle microvasculature in a mouse model of severe spinal muscular atrophy. Neurosci Lett 544:100-4

14. Swoboda KJ, Scott CB, Crawford TO, Simard LR, Reyna SP, et al. 2010. SMA CARNI-VAL trial part I: double-blind, randomized, placebo-controlled trial of L-carnitine and valproic acid in spinal muscular atrophy. PLoS One 5:e12140

15. Kissel JT, Scott CB, Reyna SP, Crawford TO, Simard LR, et al. 2011. SMA CARNIVAL TRIAL PART II: a prospective, single-armed trial of L-carnitine and valproic acid in ambulatory children with spinal muscular atrophy. PLoS One 6:e21296.

--->

Список последовательностей

<110> Ractigen Therapeutics

<120> МОЛЕКУЛА ОЛИГОМЕРНОЙ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ

И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> 20191126

<160> 491

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 1

aucugugaga uguaccuuut t 21

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 2

cacucuguca cucaggcugt t 21

<210> 3

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 3

acucugucac ucaggcuggt t 21

<210> 4

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 4

ucugucacuc aggcuggagt t 21

<210> 5

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 5

ucaggcugga gugcaguggt t 21

<210> 6

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 6

gagugcagug gcgugaucut t 21

<210> 7

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 7

ugcaguggcg ugaucuuggt t 21

<210> 8

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 8

gcaguggcgu gaucuuggct t 21

<210> 9

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 9

ggcgugaucu uggcucacut t 21

<210> 10

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 10

gugaucuugg cucacugcat t 21

<210> 11

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 11

ugaucuuggc ucacugcaat t 21

<210> 12

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 12

aucuuggcuc acugcaacct t 21

<210> 13

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 13

cuuggcucac ugcaaccuct t 21

<210> 14

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 14

uuggcucacu gcaaccucct t 21

<210> 15

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 15

gccucccgag uucaagugat t 21

<210> 16

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 16

ccucccgagu ucaagugaut t 21

<210> 17

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 17

cucccgaguu caagugauut t 21

<210> 18

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 18

ucccgaguuc aagugauuct t 21

<210> 19

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 19

ucaagugauu cuccuggcut t 21

<210> 20

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 20

aagugauucu ccuggcucat t 21

<210> 21

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 21

agugauucuc cuggcucagt t 21

<210> 22

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 22

gugauucucc uggcucagct t 21

<210> 23

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 23

cagccuccca agcagcugut t 21

<210> 24

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 24

ccucccaagc agcugucaut t 21

<210> 25

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 25

ucccaagcag cugucauuat t 21

<210> 26

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 26

agcugucauu acaggccugt t 21

<210> 27

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 27

gcugucauua caggccugct t 21

<210> 28

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 28

cugucauuac aggccugcat t 21

<210> 29

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 29

ggagaaacag gguuucacct t 21

<210> 30

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 30

agaaacaggg uuucaccaut t 21

<210> 31

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 31

aagugcuggg auuauaggct t 21

<210> 32

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 32

uuauaggcau gagccaccgt t 21

<210> 33

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 33

auucuccccu uccuccacat t 21

<210> 34

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 34

ucuccccuuc cuccacagat t 21

<210> 35

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 35

cauuuagcaa cccuagaugt t 21

<210> 36

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 36

auuuagcaac ccuagaugct t 21

<210> 37

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 37

uuuagcaacc cuagaugcut t 21

<210> 38

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 38

uuagcaaccc uagaugcuut t 21

<210> 39

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 39

uagcaacccu agaugcuuat t 21

<210> 40

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 40

auacuggagg cccggugugt t 21

<210> 41

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 41

gugugguggc ucacaccugt t 21

<210> 42

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 42

ugguggcuca caccuguaat t 21

<210> 43

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 43

gguggcucac accuguaaut t 21

<210> 44

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 44

guggcucaca ccuguaauct t 21

<210> 45

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 45

ggcucacacc uguaauccct t 21

<210> 46

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 46

cacaccugua aucccagcat t 21

<210> 47

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 47

acaccuguaa ucccagcact t 21

<210> 48

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 48

accuguaauc ccagcacuut t 21

<210> 49

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 49

guaaucccag cacuuugggt t 21

<210> 50

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 50

uaaucccagc acuuugggat t 21

<210> 51

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 51

aaucccagca cuuugggagt t 21

<210> 52

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 52

cagcacuuug ggaggccgat t 21

<210> 53

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 53

gaggcggucg gauuacgagt t 21

<210> 54

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 54

ggcggucgga uuacgaggut t 21

<210> 55

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 55

gcggucggau uacgagguct t 21

<210> 56

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 56

cggucggauu acgaggucat t 21

<210> 57

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 57

ggucggauua cgaggucagt t 21

<210> 58

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 58

gucggauuac gaggucaggt t 21

<210> 59

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 59

ucggauuacg aggucaggat t 21

<210> 60

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 60

cggauuacga ggucaggagt t 21

<210> 61

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 61

auuacgaggu caggaguuct t 21

<210> 62

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 62

uuacgagguc aggaguucat t 21

<210> 63

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 63

uacgagguca ggaguucaat t 21

<210> 64

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 64

acgaggucag gaguucaagt t 21

<210> 65

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 65

aggucaggag uucaagacct t 21

<210> 66

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 66

aguucaagac cagccuggct t 21

<210> 67

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 67

gaaaccccau cuuuacuaat t 21

<210> 68

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 68

auuagccggg ugugguggut t 21

<210> 69

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 69

guggugggcg ccuguaauct t 21

<210> 70

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 70

ggcgccugua aucccagcut t 21

<210> 71

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 71

uaaucccagc uacucggggt t 21

<210> 72

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 72

gggcugaggc agaauugcut t 21

<210> 73

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 73

ggcagaauug cuugaaccut t 21

<210> 74

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 74

cagaauugcu ugaaccuggt t 21

<210> 75

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 75

ugaaccuggg aggcagaggt t 21

<210> 76

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 76

gaaccuggga ggcagaggut t 21

<210> 77

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 77

accugggagg cagagguugt t 21

<210> 78

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 78

ugcagugagc ugagaucact t 21

<210> 79

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 79

cugagaucac gccacugcat t 21

<210> 80

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 80

aucacgccac ugcauuccat t 21

<210> 81

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 81

gggugacaga gcaauacuct t 21

<210> 82

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 82

ugacagagca auacucugut t 21

<210> 83

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 83

agagcaauac ucugucgcat t 21

<210> 84

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 84

aaaagaauac uggaggcugt t 21

<210> 85

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 85

aaagaauacu ggaggcuggt t 21

<210> 86

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 86

auacuggagg cugggcgagt t 21

<210> 87

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 87

cgagguggcu cacaccugut t 21

<210> 88

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 88

gguggcucac accuguaaut t 21

<210> 89

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 89

ggcucacacc uguaauccct t 21

<210> 90

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 90

gcucacaccu guaaucccat t 21

<210> 91

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 91

cacaccugua aucccagcat t 21

<210> 92

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 92

uaaucccagc auuuugggat t 21

<210> 93

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 93

gggcggaaua ucuugagcut t 21

<210> 94

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 94

aauaucuuga gcucaggagt t 21

<210> 95

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 95

uucgagacca gccuacacat t 21

<210> 96

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 96

ccagccuaca caauaugcut t 21

<210> 97

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 97

acacaauaug cuccaaacgt t 21

<210> 98

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 98

cacaauaugc uccaaacgct t 21

<210> 99

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 99

acaauaugcu ccaaacgcct t 21

<210> 100

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 100

caaacgccgc cucuacaaat t 21

<210> 101

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 101

cugugguccu agcuacuugt t 21

<210> 102

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 102

gggaggaucg cuugagcuct t 21

<210> 103

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 103

gaggaucgcu ugagcucggt t 21

<210> 104

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 104

ggaggucgag gcugcaaugt t 21

<210> 105

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 105

ggucgaggcu gcaaugagct t 21

<210> 106

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 106

caaugagccg agauggugct t 21

<210> 107

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 107

aaugagccga gauggugcct t 21

<210> 108

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 108

ccgagauggu gccacugcat t 21

<210> 109

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 109

gagauggugc cacugcacut t 21

<210> 110

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 110

agauggugcc acugcacuct t 21

<210> 111

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 111

auggugccac ugcacucugt t 21

<210> 112

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 112

ccacugcacu cugacgacat t 21

<210> 113

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 113

cacugcacuc ugacgacagt t 21

<210> 114

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 114

ucugacgaca gagcgagact t 21

<210> 115

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 115

cugacgacag agcgagacut t 21

<210> 116

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 116

gagacuccgu cucaaaacat t 21

<210> 117

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 117

agacuccguc ucaaaacaat t 21

<210> 118

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 118

ucuaguguuu aaggaucugt t 21

<210> 119

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 119

uaguguuuaa ggaucugcct t 21

<210> 120

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 120

uguuuaagga ucugccuuct t 21

<210> 121

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 121

ggaucugccu uccuuccugt t 21

<210> 122

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 122

uugucuuucc uuguuuguct t 21

<210> 123

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 123

gucuuuccuu guuugucuut t 21

<210> 124

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 124

caagcagguu uuaaauucct t 21

<210> 125

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 125

gcagguuuua aauuccuagt t 21

<210> 126

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 126

acauuuacuu uuccaagggt t 21

<210> 127

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 127

acacuggagu ucgagacgat t 21

<210> 128

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 128

cuggaguucg agacgaggct t 21

<210> 129

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 129

uucgagacga ggccuaagct t 21

<210> 130

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 130

gagacgaggc cuaagcaact t 21

<210> 131

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 131

agacgaggcc uaagcaacat t 21

<210> 132

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 132

gacgaggccu aagcaacaut t 21

<210> 133

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 133

ccuaagcaac augccgaaat t 21

<210> 134

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 134

cuaagcaaca ugccgaaact t 21

<210> 135

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 135

uaagcaacau gccgaaacct t 21

<210> 136

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 136

ugguggcgca cgccuauagt t 21

<210> 137

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 137

gguggcgcac gccuauagut t 21

<210> 138

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 138

cuauaguccu agcuacuggt t 21

<210> 139

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 139

uauaguccua gcuacugggt t 21

<210> 140

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 140

ugagguggga ggaucgcuut t 21

<210> 141

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 141

cugcagugag ccgagaucgt t 21

<210> 142

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 142

ugcagugagc cgagaucgct t 21

<210> 143

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 143

ugcacuccag ccugagcgat t 21

<210> 144

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 144

cacuccagcc ugagcgacat t 21

<210> 145

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 145

acagggcgag gcucugucut t 21

<210> 146

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 146

gggcgaggcu cugucucaat t 21

<210> 147

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 147

ggcgaggcuc ugucucaaat t 21

<210> 148

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 148

gcgaggcucu gucucaaaat t 21

<210> 149

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 149

aggcucuguc ucaaaacaat t 21

<210> 150

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 150

ggcucugucu caaaacaaat t 21

<210> 151

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 151

gcucugucuc aaaacaaact t 21

<210> 152

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 152

cucugucuca aaacaaacat t 21

<210> 153

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 153

aacacaguga aaugaaaggt t 21

<210> 154

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 154

acacagugaa augaaaggat t 21

<210> 155

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 155

cagugaaaug aaaggauugt t 21

<210> 156

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 156

gugaaaugaa aggauugagt t 21

<210> 157

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 157

gaaaugaaag gauugagagt t 21

<210> 158

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 158

aaagguacau cucacagaut t 21

<210> 159

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 159

cagccugagu gacagagugt t 21

<210> 160

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 160

ccagccugag ugacagagut t 21

<210> 161

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 161

cuccagccug agugacagat t 21

<210> 162

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 162

ucaggcugga gugcaguggt t 21

<210> 163

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 163

agaucacgcc acugcacuct t 21

<210> 164

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 164

ugcaguggcg ugaucuuggt t 21

<210> 165

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 165

gccaagauca cgccacugct t 21

<210> 166

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 166

agugagccaa gaucacgcct t 21

<210> 167

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 167

ugcagugagc caagaucact t 21

<210> 168

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 168

uugcagugag ccaagaucat t 21

<210> 169

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 169

gguugcagug agccaagaut t 21

<210> 170

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 170

gagguugcag ugagccaagt t 21

<210> 171

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 171

ggagguugca gugagccaat t 21

<210> 172

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 172

ucacuugaac ucgggaggct t 21

<210> 173

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 173

aucacuugaa cucgggaggt t 21

<210> 174

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 174

aaucacuuga acucgggagt t 21

<210> 175

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 175

gaaucacuug aacucgggat t 21

<210> 176

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 176

agccaggaga aucacuugat t 21

<210> 177

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 177

ugagccagga gaaucacuut t 21

<210> 178

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 178

cugagccagg agaaucacut t 21

<210> 179

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 179

gcugagccag gagaaucact t 21

<210> 180

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 180

acagcugcuu gggaggcugt t 21

<210> 181

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 181

augacagcug cuugggaggt t 21

<210> 182

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 182

uaaugacagc ugcuugggat t 21

<210> 183

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 183

caggccugua augacagcut t 21

<210> 184

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 184

gcaggccugu aaugacagct t 21

<210> 185

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 185

ugcaggccug uaaugacagt t 21

<210> 186

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 186

ggugaaaccc uguuucucct t 21

<210> 187

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 187

auggugaaac ccuguuucut t 21

<210> 188

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 188

gccuauaauc ccagcacuut t 21

<210> 189

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 189

cgguggcuca ugccuauaat t 21

<210> 190

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 190

uguggaggaa ggggagaaut t 21

<210> 191

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 191

ucuguggagg aaggggagat t 21

<210> 192

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 192

caucuagggu ugcuaaaugt t 21

<210> 193

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 193

gcaucuaggg uugcuaaaut t 21

<210> 194

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 194

agcaucuagg guugcuaaat t 21

<210> 195

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 195

aagcaucuag gguugcuaat t 21

<210> 196

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 196

uaagcaucua ggguugcuat t 21

<210> 197

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 197

cacaccgggc cuccaguaut t 21

<210> 198

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 198

caggugugag ccaccacact t 21

<210> 199

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 199

uuacaggugu gagccaccat t 21

<210> 200

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 200

auuacaggug ugagccacct t 21

<210> 201

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 201

gauuacaggu gugagccact t 21

<210> 202

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 202

gggauuacag gugugagcct t 21

<210> 203

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 203

ugcugggauu acaggugugt t 21

<210> 204

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 204

gugcugggau uacaggugut t 21

<210> 205

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 205

aagugcuggg auuacaggut t 21

<210> 206

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 206

cccaaagugc ugggauuact t 21

<210> 207

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 207

ucccaaagug cugggauuat t 21

<210> 208

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 208

cucccaaagu gcugggauut t 21

<210> 209

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 209

ucggccuccc aaagugcugt t 21

<210> 210

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 210

cucguaaucc gaccgccuct t 21

<210> 211

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 211

accucguaau ccgaccgcct t 21

<210> 212

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 212

gaccucguaa uccgaccgct t 21

<210> 213

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 213

ugaccucgua auccgaccgt t 21

<210> 214

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 214

cugaccucgu aauccgacct t 21

<210> 215

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 215

ccugaccucg uaauccgact t 21

<210> 216

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 216

uccugaccuc guaauccgat t 21

<210> 217

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 217

cuccugaccu cguaauccgt t 21

<210> 218

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 218

gaacuccuga ccucguaaut t 21

<210> 219

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 219

ugaacuccug accucguaat t 21

<210> 220

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 220

uugaacuccu gaccucguat t 21

<210> 221

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 221

cuugaacucc ugaccucgut t 21

<210> 222

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 222

ggucuugaac uccugaccut t 21

<210> 223

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 223

gccaggcugg ucuugaacut t 21

<210> 224

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 224

uuaguaaaga ugggguuuct t 21

<210> 225

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 225

accaccacac ccggcuaaut t 21

<210> 226

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 226

gauuacaggc gcccaccact t 21

<210> 227

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 227

agcugggauu acaggcgcct t 21

<210> 228

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 228

ccccgaguag cugggauuat t 21

<210> 229

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 229

agcaauucug ccucagccct t 21

<210> 230

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 230

agguucaagc aauucugcct t 21

<210> 231

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 231

ccagguucaa gcaauucugt t 21

<210> 232

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 232

ccucugccuc ccagguucat t 21

<210> 233

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 233

accucugccu cccagguuct t 21

<210> 234

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 234

caaccucugc cucccaggut t 21

<210> 235

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 235

gugaucucag cucacugcat t 21

<210> 236

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 236

ugcaguggcg ugaucucagt t 21

<210> 237

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 237

uggaaugcag uggcgugaut t 21

<210> 238

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 238

gaguauugcu cugucaccct t 21

<210> 239

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 239

acagaguauu gcucugucat t 21

<210> 240

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 240

ugcgacagag uauugcucut t 21

<210> 241

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 241

cagccuccag uauucuuuut t 21

<210> 242

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 242

ccagccucca guauucuuut t 21

<210> 243

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 243

cucgcccagc cuccaguaut t 21

<210> 244

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 244

acagguguga gccaccucgt t 21

<210> 245

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 245

auuacaggug ugagccacct t 21

<210> 246

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 246

gggauuacag gugugagcct t 21

<210> 247

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 247

ugggauuaca ggugugagct t 21

<210> 248

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 248

ugcugggauu acaggugugt t 21

<210> 249

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 249

ucccaaaaug cugggauuat t 21

<210> 250

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 250

agcucaagau auuccgccct t 21

<210> 251

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 251

cuccugagcu caagauauut t 21

<210> 252

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 252

uguguaggcu ggucucgaat t 21

<210> 253

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 253

agcauauugu guaggcuggt t 21

<210> 254

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 254

cguuuggagc auauugugut t 21

<210> 255

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 255

gcguuuggag cauauugugt t 21

<210> 256

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 256

ggcguuugga gcauauugut t 21

<210> 257

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 257

uuuguagagg cggcguuugt t 21

<210> 258

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 258

caaguagcua ggaccacagt t 21

<210> 259

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 259

gagcucaagc gauccuccct t 21

<210> 260

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 260

ccgagcucaa gcgauccuct t 21

<210> 261

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 261

cauugcagcc ucgaccucct t 21

<210> 262

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 262

gcucauugca gccucgacct t 21

<210> 263

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 263

gcaccaucuc ggcucauugt t 21

<210> 264

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 264

ggcaccaucu cggcucauut t 21

<210> 265

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 265

ugcaguggca ccaucucggt t 21

<210> 266

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 266

agugcagugg caccaucuct t 21

<210> 267

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 267

gagugcagug gcaccaucut t 21

<210> 268

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 268

cagagugcag uggcaccaut t 21

<210> 269

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 269

ugucgucaga gugcaguggt t 21

<210> 270

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 270

cugucgucag agugcagugt t 21

<210> 271

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 271

gucucgcucu gucgucagat t 21

<210> 272

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 272

agucucgcuc ugucgucagt t 21

<210> 273

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 273

uguuuugaga cggagucuct t 21

<210> 274

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 274

uuguuuugag acggagucut t 21

<210> 275

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 275

cagauccuua aacacuagat t 21

<210> 276

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 276

ggcagauccu uaaacacuat t 21

<210> 277

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 277

gaaggcagau ccuuaaacat t 21

<210> 278

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 278

caggaaggaa ggcagaucct t 21

<210> 279

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 279

gacaaacaag gaaagacaat t 21

<210> 280

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 280

aagacaaaca aggaaagact t 21

<210> 281

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 281

ggaauuuaaa accugcuugt t 21

<210> 282

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 282

cuaggaauuu aaaaccugct t 21

<210> 283

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 283

cccuuggaaa aguaaaugut t 21

<210> 284

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 284

ucgucucgaa cuccagugut t 21

<210> 285

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 285

gccucgucuc gaacuccagt t 21

<210> 286

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 286

gcuuaggccu cgucucgaat t 21

<210> 287

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 287

guugcuuagg ccucgucuct t 21

<210> 288

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 288

uguugcuuag gccucgucut t 21

<210> 289

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 289

auguugcuua ggccucguct t 21

<210> 290

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 290

uuucggcaug uugcuuaggt t 21

<210> 291

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 291

guuucggcau guugcuuagt t 21

<210> 292

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 292

gguuucggca uguugcuuat t 21

<210> 293

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 293

cuauaggcgu gcgccaccat t 21

<210> 294

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 294

acuauaggcg ugcgccacct t 21

<210> 295

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 295

ccaguagcua ggacuauagt t 21

<210> 296

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 296

cccaguagcu aggacuauat t 21

<210> 297

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 297

aagcgauccu cccaccucat t 21

<210> 298

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 298

cgaucucggc ucacugcagt t 21

<210> 299

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 299

gcgaucucgg cucacugcat t 21

<210> 300

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 300

ucgcucaggc uggagugcat t 21

<210> 301

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 301

ugucgcucag gcuggagugt t 21

<210> 302

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 302

agacagagcc ucgcccugut t 21

<210> 303

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 303

uugagacaga gccucgccct t 21

<210> 304

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 304

uuugagacag agccucgcct t 21

<210> 305

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 305

uuuugagaca gagccucgct t 21

<210> 306

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 306

uuguuuugag acagagccut t 21

<210> 307

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 307

uuuguuuuga gacagagcct t 21

<210> 308

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 308

guuuguuuug agacagagct t 21

<210> 309

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 309

uguuuguuuu gagacagagt t 21

<210> 310

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 310

ccuuucauuu cacuguguut t 21

<210> 311

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 311

uccuuucauu ucacugugut t 21

<210> 312

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 312

caauccuuuc auuucacugt t 21

<210> 313

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 313

cucaauccuu ucauuucact t 21

<210> 314

<211> 21

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 314

cucucaaucc uuucauuuct t 21

<210> 315

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 315

atctgtgaga tgtaccttt 19

<210> 316

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 316

cactctgtca ctcaggctg 19

<210> 317

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 317

actctgtcac tcaggctgg 19

<210> 318

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 318

tctgtcactc aggctggag 19

<210> 319

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 319

tcaggctgga gtgcagtgg 19

<210> 320

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 320

gagtgcagtg gcgtgatct 19

<210> 321

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 321

tgcagtggcg tgatcttgg 19

<210> 322

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 322

gcagtggcgt gatcttggc 19

<210> 323

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 323

ggcgtgatct tggctcact 19

<210> 324

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 324

gtgatcttgg ctcactgca 19

<210> 325

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 325

tgatcttggc tcactgcaa 19

<210> 326

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 326

atcttggctc actgcaacc 19

<210> 327

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 327

cttggctcac tgcaacctc 19

<210> 328

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 328

ttggctcact gcaacctcc 19

<210> 329

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 329

gcctcccgag ttcaagtga 19

<210> 330

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 330

cctcccgagt tcaagtgat 19

<210> 331

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 331

ctcccgagtt caagtgatt 19

<210> 332

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 332

tcccgagttc aagtgattc 19

<210> 333

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 333

tcaagtgatt ctcctggct 19

<210> 334

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 334

aagtgattct cctggctca 19

<210> 335

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 335

agtgattctc ctggctcag 19

<210> 336

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 336

gtgattctcc tggctcagc 19

<210> 337

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 337

cagcctccca agcagctgt 19

<210> 338

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 338

cctcccaagc agctgtcat 19

<210> 339

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 339

tcccaagcag ctgtcatta 19

<210> 340

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 340

agctgtcatt acaggcctg 19

<210> 341

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 341

gctgtcatta caggcctgc 19

<210> 342

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 342

ctgtcattac aggcctgca 19

<210> 343

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 343

ggagaaacag ggtttcacc 19

<210> 344

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 344

agaaacaggg tttcaccat 19

<210> 345

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 345

aagtgctggg attataggc 19

<210> 346

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 346

ttataggcat gagccaccg 19

<210> 347

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 347

attctcccct tcctccaca 19

<210> 348

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 348

tctccccttc ctccacaga 19

<210> 349

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 349

catttagcaa ccctagatg 19

<210> 350

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 350

atttagcaac cctagatgc 19

<210> 351

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 351

tttagcaacc ctagatgct 19

<210> 352

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 352

ttagcaaccc tagatgctt 19

<210> 353

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 353

tagcaaccct agatgctta 19

<210> 354

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 354

atactggagg cccggtgtg 19

<210> 355

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 355

gtgtggtggc tcacacctg 19

<210> 356

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 356

tggtggctca cacctgtaa 19

<210> 357

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 357

ggtggctcac acctgtaat 19

<210> 358

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 358

gtggctcaca cctgtaatc 19

<210> 359

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 359

ggctcacacc tgtaatccc 19

<210> 360

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 360

cacacctgta atcccagca 19

<210> 361

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 361

acacctgtaa tcccagcac 19

<210> 362

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 362

acctgtaatc ccagcactt 19

<210> 363

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 363

gtaatcccag cactttggg 19

<210> 364

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 364

taatcccagc actttggga 19

<210> 365

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 365

aatcccagca ctttgggag 19

<210> 366

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 366

cagcactttg ggaggccga 19

<210> 367

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 367

gaggcggtcg gattacgag 19

<210> 368

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 368

ggcggtcgga ttacgaggt 19

<210> 369

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 369

gcggtcggat tacgaggtc 19

<210> 370

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 370

cggtcggatt acgaggtca 19

<210> 371

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 371

ggtcggatta cgaggtcag 19

<210> 372

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 372

gtcggattac gaggtcagg 19

<210> 373

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 373

tcggattacg aggtcagga 19

<210> 374

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 374

cggattacga ggtcaggag 19

<210> 375

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 375

attacgaggt caggagttc 19

<210> 376

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 376

ttacgaggtc aggagttca 19

<210> 377

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 377

tacgaggtca ggagttcaa 19

<210> 378

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 378

acgaggtcag gagttcaag 19

<210> 379

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 379

aggtcaggag ttcaagacc 19

<210> 380

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 380

agttcaagac cagcctggc 19

<210> 381

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 381

gaaaccccat ctttactaa 19

<210> 382

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 382

attagccggg tgtggtggt 19

<210> 383

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 383

gtggtgggcg cctgtaatc 19

<210> 384

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 384

ggcgcctgta atcccagct 19

<210> 385

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 385

taatcccagc tactcgggg 19

<210> 386

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 386

gggctgaggc agaattgct 19

<210> 387

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 387

ggcagaattg cttgaacct 19

<210> 388

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 388

cagaattgct tgaacctgg 19

<210> 389

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 389

tgaacctggg aggcagagg 19

<210> 390

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 390

gaacctggga ggcagaggt 19

<210> 391

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 391

acctgggagg cagaggttg 19

<210> 392

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 392

tgcagtgagc tgagatcac 19

<210> 393

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 393

ctgagatcac gccactgca 19

<210> 394

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 394

atcacgccac tgcattcca 19

<210> 395

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 395

gggtgacaga gcaatactc 19

<210> 396

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 396

tgacagagca atactctgt 19

<210> 397

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 397

agagcaatac tctgtcgca 19

<210> 398

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 398

aaaagaatac tggaggctg 19

<210> 399

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 399

aaagaatact ggaggctgg 19

<210> 400

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 400

atactggagg ctgggcgag 19

<210> 401

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 401

cgaggtggct cacacctgt 19

<210> 402

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 402

ggtggctcac acctgtaat 19

<210> 403

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 403

ggctcacacc tgtaatccc 19

<210> 404

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 404

gctcacacct gtaatccca 19

<210> 405

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 405

cacacctgta atcccagca 19

<210> 406

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 406

taatcccagc attttggga 19

<210> 407

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 407

gggcggaata tcttgagct 19

<210> 408

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 408

aatatcttga gctcaggag 19

<210> 409

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 409

ttcgagacca gcctacaca 19

<210> 410

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 410

ccagcctaca caatatgct 19

<210> 411

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 411

acacaatatg ctccaaacg 19

<210> 412

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 412

cacaatatgc tccaaacgc 19

<210> 413

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 413

acaatatgct ccaaacgcc 19

<210> 414

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 414

caaacgccgc ctctacaaa 19

<210> 415

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 415

ctgtggtcct agctacttg 19

<210> 416

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 416

gggaggatcg cttgagctc 19

<210> 417

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 417

gaggatcgct tgagctcgg 19

<210> 418

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 418

ggaggtcgag gctgcaatg 19

<210> 419

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 419

ggtcgaggct gcaatgagc 19

<210> 420

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 420

caatgagccg agatggtgc 19

<210> 421

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 421

aatgagccga gatggtgcc 19

<210> 422

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 422

ccgagatggt gccactgca 19

<210> 423

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 423

gagatggtgc cactgcact 19

<210> 424

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 424

agatggtgcc actgcactc 19

<210> 425

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 425

atggtgccac tgcactctg 19

<210> 426

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 426

ccactgcact ctgacgaca 19

<210> 427

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 427

cactgcactc tgacgacag 19

<210> 428

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 428

tctgacgaca gagcgagac 19

<210> 429

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 429

ctgacgacag agcgagact 19

<210> 430

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 430

gagactccgt ctcaaaaca 19

<210> 431

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 431

agactccgtc tcaaaacaa 19

<210> 432

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 432

tctagtgttt aaggatctg 19

<210> 433

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 433

tagtgtttaa ggatctgcc 19

<210> 434

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 434

tgtttaagga tctgccttc 19

<210> 435

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 435

ggatctgcct tccttcctg 19

<210> 436

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 436

ttgtctttcc ttgtttgtc 19

<210> 437

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 437

gtctttcctt gtttgtctt 19

<210> 438

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 438

caagcaggtt ttaaattcc 19

<210> 439

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 439

gcaggtttta aattcctag 19

<210> 440

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 440

acatttactt ttccaaggg 19

<210> 441

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 441

acactggagt tcgagacga 19

<210> 442

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 442

ctggagttcg agacgaggc 19

<210> 443

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 443

ttcgagacga ggcctaagc 19

<210> 444

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 444

gagacgaggc ctaagcaac 19

<210> 445

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 445

agacgaggcc taagcaaca 19

<210> 446

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 446

gacgaggcct aagcaacat 19

<210> 447

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 447

cctaagcaac atgccgaaa 19

<210> 448

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 448

ctaagcaaca tgccgaaac 19

<210> 449

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 449

taagcaacat gccgaaacc 19

<210> 450

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 450

tggtggcgca cgcctatag 19

<210> 451

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 451

ggtggcgcac gcctatagt 19

<210> 452

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 452

ctatagtcct agctactgg 19

<210> 453

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 453

tatagtccta gctactggg 19

<210> 454

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 454

tgaggtggga ggatcgctt 19

<210> 455

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 455

ctgcagtgag ccgagatcg 19

<210> 456

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 456

tgcagtgagc cgagatcgc 19

<210> 457

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 457

tgcactccag cctgagcga 19

<210> 458

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 458

cactccagcc tgagcgaca 19

<210> 459

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 459

acagggcgag gctctgtct 19

<210> 460

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 460

gggcgaggct ctgtctcaa 19

<210> 461

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 461

ggcgaggctc tgtctcaaa 19

<210> 462

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 462

gcgaggctct gtctcaaaa 19

<210> 463

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 463

aggctctgtc tcaaaacaa 19

<210> 464

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 464

ggctctgtct caaaacaaa 19

<210> 465

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 465

gctctgtctc aaaacaaac 19

<210> 466

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 466

ctctgtctca aaacaaaca 19

<210> 467

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 467

aacacagtga aatgaaagg 19

<210> 468

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 468

acacagtgaa atgaaagga 19

<210> 469

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 469

cagtgaaatg aaaggattg 19

<210> 470

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 470

gtgaaatgaa aggattgag 19

<210> 471

<211> 19

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 471

gaaatgaaag gattgagag 19

<210> 472

<211> 19

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 472

acuacugagu gacaguagatt 21

<210> 473

<211> 19

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 473

ucuacuguca cucaguagutt 21

<210> 474

<211> 19

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 474

gggaugauac agcacugautt 21

<210> 475

<211> 19

<212> ДНК/РНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 475

aucagugcug uaucauccctt 21

<210> 476

<211> 159

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 476

agtcgcactc tgtcactcag gctggagtgc agtggcgtga tcttggctca ctgcaacctc 60

cgcctcccga gttcaagtga ttctcctggc tcagcctccc aagcagctgt cattacaggc 120

ctgcaccacc acacccggct gatttttgta tttttagga 159

<210> 477

<211> 82

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 477

aatactggag gcccggtgtg gtggctcaca cctgtaatcc cagcactttg ggaggccgag 60

gcggtcggat tacgaggtca gg 82

<210> 478

<211> 815

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 478

ctggccaaca tggtgaaacc ccatctttac taaaaataca aaaattagcc gggtgtggtg 60

gtgggcgcct gtaatcccag ctactcgggg ggctgaggca gaattgcttg aacctgggag 120

gcagaggttg cagtgagctg agatcacgcc actgcattcc agcctgggtg acagagcaat 180

actctgtcgc aaaaaaaaaa aagaatactg gaggctgggc gaggtggctc acacctgtaa 240

tcccagcatt ttgggatgcc agaggcgggc ggaatatctt gagctcagga gttcgagacc 300

agcctacaca atatgctcca aacgccgcct ctacaaaaca tacagaaact agccgggtgt 360

ggtggcgtgc ccctgtggtc ctagctactt gggaggttga ggcgggagga tcgcttgagc 420

tcgggaggtc gaggctgcaa tgagccgaga tggtgccact gcactctgac gacagagcga 480

gactccgtct caaaacaaac aacaaataag gttgggggat caaatatctt ctagtgttta 540

aggatctgcc ttccttcctg cccccatgtt tgtctttcct tgtttgtctt tatatagatc 600

aagcaggttt taaattccta gtaggagctt acatttactt ttccaagggg gagggggaat 660

aaatatctac acacacacac acacacacac acacacacac acactggagt tcgagacgag 720

gcctaagcaa catgccgaaa ccccgtctct actaaataca aaaaatagct gagcttggtg 780

gcgcacgcct atagtcctag ctactgggga ggctg 815

<210> 479

<211> 108

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 479

ctgcagtgag ccgagatcgc gccgctgcac tccagcctga gcgacagggc gaggctctgt 60

ctcaaaacaa acaaacaaaa aaaaaaggaa aggaaatata acacagtg 108

<210> 480

<211> 18

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 480

cacaggccag agcgatga 18

<210> 481

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 481

cgaagtttca caaatgtcac cat 23

<210> 482

<211> 21

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 482

atggacagga ctgaacgtct t 21

<210> 483

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 483

tccagcaggt cagcaaagaa 20

<210> 484

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 484

ataatcccaa gcggtttgct 20

<210> 485

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 485

ctgccagtct ggactgttct 20

<210> 486

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 486

ccaccacctc ccatatgtcc 20

<210> 487

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 487

gctctatgcc agcatttctc ct 22

<210> 488

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 488

cccccaccac ctcccatatg 20

<210> 489

<211> 25

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 489

cccttctcac agctcataaa attac 25

<210> 490

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 490

taagcaggat ccatggcgat gagcagcggc ggc 33

<210> 491

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственно синтезированная

<400> 491

taagcagaat tcttaattta aggaatgtga gca 33

<---

Изобретение относится к молекулярной биологии и медицине, в частности к молекуле короткой активирующей нуклеиновой кислоты для лечения СМА. Молекула короткой активирующей нуклеиновой кислоты содержит смысловую и антисмысловую цепи нуклеиновой кислоты, представляющие собой независимые олигонуклеотидные цепи длиной от 16 до 35 нуклеотидов, и одна из нуклеотидных цепей по крайней мере на 75% гомологична или комплементарна целевой последовательности нуклеотидов из промоторной области целевого гена SMN2. Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, методу стимуляции экспрессии целевого гена в клетках и методам лечения заболевания, вызванного недостаточной экспрессией целевого гена. Изобретение предлагает новую молекулу короткой активирующей нуклеиновой кислоты, которая способна активировать транскрипцию SMN2 с высокой специфичностью, действуя на промотор гена SMN2. 11 н. и 32 з.п. ф-лы, 10 ил., 9 табл., 6 пр.

1. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты для активации/стимуляции экспрессии гена SMN2 в клетке, содержащая фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты, в которой фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты содержат комплементарные области, и при этом комплементарные области образуют структуру двухцепочечной нуклеиновой кислоты, которая может активировать экспрессию гена SMN2 в клетках, где фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты или фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по крайней мере на 90% гомологичен или комплементарен непрерывной нуклеотидной последовательности длиной от 19 нуклеотидов в промоторной области гена SMN2 от -1639 до -1481 последовательности SEQ ID №: 476, области от -1090 до -1008 последовательности SEQ ID №: 477, области от -994 до -180 последовательности SEQ ID №: 478 или области от -144 до -37 последовательности SEQ ID №: 479 выше сайта начала транскрипции гена SMN2, где двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты активирует/стимулирует экспрессию гена SMN2 как минимум на 10% по сравнению с исходной экспрессией в клетке.

2. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, в которой фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты находятся в двух разных цепях нуклеиновой кислоты.

3. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, в которой фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты находятся в одной и той же цепи нуклеиновой кислоты, предпочтительно в форме «шпильки», образованной одной цепью нуклеиновой кислоты, причем комплементарные области фрагмента смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмента антисмысловой нуклеиновой кислоты образуют структуру двухцепочечной нуклеиновой кислоты.

4. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по п. 2, в которой как минимум одна цепь имеет липкий 3'-конец длиной от 0 до 6 нуклеотидов.

5. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по п. 4, в которой обе цепи имеют липкий 3'-конец длиной от 2 до 3 нуклеотидов.

6. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-5, в которой фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты независимо имеют длину от 16 до 35 нуклеотидов.

7. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по п. 1, в которой фрагмент смысловой нуклеиновой кислоты или фрагмент антисмысловой нуклеиновой кислоты двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по крайней мере на 75% гомологичен или комплементарен последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID №: 315-471.

8. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по п. 7, в которой смысловой фрагмент двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по крайней мере на 75% гомологичен последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID №: 1-157, а антисмысловой фрагмент двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по крайней мере на 75% гомологичен последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID №: 158-314.

9. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по п. 8, в которой смысловой фрагмент двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID №: 1-157, или идентичен ей, а антисмысловой фрагмент двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеотидов, выбранную из SEQ ID №: 158-314, или идентичен ей.

10. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по п. 9, где комбинацию фрагмента смысловой нуклеиновой кислоты и фрагмента антисмысловой нуклеиновой кислоты выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 158; SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 159; SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 160; SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 161; SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 162; SEQ ID NO: 6 и SEQ ID NO: 163; SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 164; SEQ ID NO: 8 и SEQ ID NO: 165; SEQ ID NO: 9 и SEQ ID NO: 166; SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 167; SEQ ID NO: 11 и SEQ ID NO: 168; SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 169; SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 170; SEQ ID NO: 14 и SEQ ID NO: 171; SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 172; SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 173; SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 174; SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 175; SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 176; SEQ ID NO: 20 и SEQ ID NO: 177; SEQ ID NO: 21 и SEQ ID NO: 178; SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 179; SEQ ID NO: 23 и SEQ ID NO: 180; SEQ ID NO: 24 и SEQ ID NO: 181; SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 182; SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 183; SEQ ID NO: 27 и SEQ ID NO: 184; SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 185; SEQ ID NO: 29 и SEQ ID NO: 186; SEQ ID NO: 30 и SEQ ID NO: 187; SEQ ID NO: 31 и SEQ ID NO: 188; SEQ ID NO: 32 и SEQ ID NO: 189; SEQ ID NO: 33 и SEQ ID NO: 190; SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 191; SEQ ID NO: 35 и SEQ ID NO: 192; SEQ ID NO: 36 и SEQ ID NO: 193; SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 194; SEQ ID NO: 38 и SEQ ID NO: 195; SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 196; SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 197; SEQ ID NO: 41 и SEQ ID NO: 198; SEQ ID NO: 42 и SEQ ID NO: 199; SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 200; SEQ ID NO: 44 и SEQ ID NO: 201; SEQ ID NO: 45 и SEQ ID NO: 202; SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 203; SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 204; SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 205; SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 206; SEQ ID NO: 50 и SEQ ID NO: 207; SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 208; SEQ ID NO: 52 и SEQ ID NO: 209; SEQ ID NO: 53 и SEQ ID NO: 210; SEQ ID NO: 54 и SEQ ID NO: 211; SEQ ID NO: 55 и SEQ ID NO: 212; SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 213; SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 214; SEQ ID NO: 58 и SEQ ID NO: 215; SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 216; SEQ ID NO: 60 и SEQ ID NO: 217; SEQ ID NO: 61 и SEQ ID NO: 218; SEQ ID NO: 62 и SEQ ID NO: 219; SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 220; SEQ ID NO: 64 и SEQ ID NO: 221; SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 222; SEQ ID NO: 66 и SEQ ID NO: 223; SEQ ID NO: 67 и SEQ ID NO: 224; SEQ ID NO: 68 и SEQ ID NO: 225; SEQ ID NO: 69 и SEQ ID NO: 226; SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 227; SEQ ID NO: 71 и SEQ ID NO: 228; SEQ ID NO: 72 и SEQ ID NO: 229; SEQ ID NO: 73 и SEQ ID NO: 230; SEQ ID NO: 74 и SEQ ID NO: 231; SEQ ID NO: 75 и SEQ ID NO: 232; SEQ ID NO: 76 и SEQ ID NO: 233; SEQ ID NO: 77 и SEQ ID NO: 234; SEQ ID NO: 78 и SEQ ID NO: 235; SEQ ID NO: 79 и SEQ ID NO: 236; SEQ ID NO: 80 и SEQ ID NO: 237; SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 238; SEQ ID NO: 82 и SEQ ID NO: 239; SEQ ID NO: 83 и SEQ ID NO: 240; SEQ ID NO: 84 и SEQ ID NO: 241; SEQ ID NO: 85 и SEQ ID NO: 242; SEQ ID NO: 86 и SEQ ID NO: 243; SEQ ID NO: 87 и SEQ ID NO: 244; SEQ ID NO: 88 и SEQ ID NO: 245; SEQ ID NO: 89 и SEQ ID NO: 246; SEQ ID NO: 90 и SEQ ID NO: 247; SEQ ID NO: 91 и SEQ ID NO: 248; SEQ ID NO: 92 и SEQ ID NO: 249; SEQ ID NO: 93 и SEQ ID NO: 250; SEQ ID NO: 94 и SEQ ID NO: 251; SEQ ID NO: 95 и SEQ ID NO: 252; SEQ ID NO: 96 и SEQ ID NO: 253; SEQ ID NO: 97 и SEQ ID NO: 254; SEQ ID NO: 98 и SEQ ID NO: 255; SEQ ID NO: 99 и SEQ ID NO: 256; SEQ ID NO: 100 и SEQ ID NO: 257; SEQ ID NO: 101 и SEQ ID NO: 258; SEQ ID NO: 102 и SEQ ID NO: 259; SEQ ID NO: 103 и SEQ ID NO: 260; SEQ ID NO: 104 и SEQ ID NO: 261; SEQ ID NO: 105 и SEQ ID NO: 262; SEQ ID NO: 106 и SEQ ID NO: 263; SEQ ID NO: 107 и SEQ ID NO: 264; SEQ ID NO: 108 и SEQ ID NO: 265; SEQ ID NO: 109 и SEQ ID NO: 266; SEQ ID NO: 110 и SEQ ID NO: 267; SEQ ID NO: 111 и SEQ ID NO: 268; SEQ ID NO: 112 и SEQ ID NO: 269; SEQ ID NO: 113 и SEQ ID NO: 270; SEQ ID NO: 114 и SEQ ID NO: 271; SEQ ID NO: 115 и SEQ ID NO: 272; SEQ ID NO: 116 и SEQ ID NO: 273; SEQ ID NO: 117 и SEQ ID NO: 274; SEQ ID NO: 118 и SEQ ID NO: 275; SEQ ID NO: 119 и SEQ ID NO: 276; SEQ ID NO: 120 и SEQ ID NO: 277; SEQ ID NO: 121 и SEQ ID NO: 278; SEQ ID NO: 122 и SEQ ID NO: 279; SEQ ID NO: 123 и SEQ ID NO: 280; SEQ ID NO: 124 и SEQ ID NO: 281; SEQ ID NO: 125 и SEQ ID NO: 282; SEQ ID NO: 126 и SEQ ID NO: 283; SEQ ID NO: 127 и SEQ ID NO: 284; SEQ ID NO: 128 и SEQ ID NO: 285; SEQ ID NO: 129 и SEQ ID NO: 286; SEQ ID NO: 130 и SEQ ID NO: 287; SEQ ID NO: 131 и SEQ ID NO: 288; SEQ ID NO: 132 и SEQ ID NO: 289; SEQ ID NO: 133 и SEQ ID NO: 290; SEQ ID NO: 134 и SEQ ID NO: 291; SEQ ID NO: 135 и SEQ ID NO: 292; SEQ ID NO: 136 и SEQ ID NO: 293; SEQ ID NO: 137 и SEQ ID NO: 294; SEQ ID NO: 138 и SEQ ID NO: 295; SEQ ID NO: 139 и SEQ ID NO: 296; SEQ ID NO: 140 и SEQ ID NO: 297; SEQ ID NO: 141 и SEQ ID NO: 298; SEQ ID NO: 142 и SEQ ID NO: 299; SEQ ID NO: 143 и SEQ ID NO: 300; SEQ ID NO: 144 и SEQ ID NO: 301; SEQ ID NO: 145 и SEQ ID NO: 302; SEQ ID NO: 146 и SEQ ID NO: 303; SEQ ID NO: 147 и SEQ ID NO: 304; SEQ ID NO: 148 и SEQ ID NO: 305; SEQ ID NO: 149 и SEQ ID NO: 306; SEQ ID NO: 150 и SEQ ID NO: 307; SEQ ID NO: 151 и SEQ ID NO: 308; SEQ ID NO: 152 и SEQ ID NO: 309; SEQ ID NO: 153 и SEQ ID NO: 310; SEQ ID NO: 154 и SEQ ID NO: 311; SEQ ID NO: 155 и SEQ ID NO: 312; SEQ ID NO: 156 и SEQ ID NO: 313; и SEQ ID NO: 157 и SEQ ID NO: 314.

11. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-10, в которой как минимум один нуклеотид является химически модифицированным.

12. Двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по п. 11, в которой химически модифицированный нуклеотид имеет как минимум одну из следующих модификаций:

a) модификация фосфодиэфирной связи, соединяющей нуклеотиды в нуклеотидной последовательности двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты;

b) модификация 2'-OH рибозы в нуклеотидной последовательности двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты; и

с) модификация основания в нуклеотидной последовательности двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты.

13. Нуклеиновая кислота, кодирующая двуцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-10, где нуклеиновая кислота имеет по меньшей мере 75% гомологию или комплементарность непрерывной нуклеотидной последовательности длиной от 16 до 35 в последовательности SEQ ID NO: 476, SEQ ID NO: 477, SEQ ID NO: 478 или SEQ ID NO: 479.

14. Нуклеиновая кислота по п. 13, где нуклеиновая кислота является молекулой ДНК.

15. Экспрессирующая ген SMN2 клетка, имеющая активированную/стимулированную экспрессию гена SMN2, где указанная клетка содержит терапевтически эффективное количество двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, или нуклеиновой кислоты по п. 13 или 14.

16. Композиция для активации/стимуляции экспрессии гена SMN2 в клетке, содержащая терапевтически эффективное количество двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12 или нуклеиновой кислоты по п. 13 или 14 и фармацевтически приемлемый носитель.

17. Композиция по п. 16, где композиция содержит фармацевтически приемлемый носитель.

18. Композиция по п. 16, в которой фармацевтически приемлемый носитель выбран из водного носителя, липосомы, высокомолекулярного полимера и/или полипептида.

19. Композиция по п. 16 или 17, где композиция содержит двуцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты в концентрации 1-150 нМ.

20. Способ терапии заболевания или состояния, вызванного недостаточной экспрессией белка SMN у индивидуума, включающий введение терапевтической дозы двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, нуклеиновой кислоты по п. 13 или 14 или композиции по любому из пп. 16-19 индивидууму.

21. Способ терапии заболевания или состояния, вызванного недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN2 у индивидуума, который включает введение индивидууму терапевтической дозы двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, нуклеиновой кислоты по п. 13 или 14 или композиции по любому из пп. 16-19.

22. Способ по п. 20 или 21, где заболевание или состояние является наследственным нервно-мышечным заболеванием, предпочтительно спинальной мышечной атрофией.

23. Способ по п. 20 или 21, где индивидуум является млекопитающим, предпочтительно человеком.

24. Применение двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, нуклеиновой кислоты по п. 13 или 14 или композиции по любому из пп. 16-19 для приготовления препарата для лечения заболевания или состояния, вызванного недостаточной экспрессией белка SMN.

25. Применение двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, нуклеиновой кислоты по п. 13 или 14 или композиции по любому из пп. 16-19 для приготовления препарата для лечения заболевания или состояния, вызванного недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN2 у индивидуума.

26. Применение по п. 24 или 25, где заболевание или состояние является наследственным нервно-мышечным заболеванием, предпочтительно спинальной мышечной атрофией.

27. Применение по п. 24 или 26, где индивидуум является млекопитающим, предпочтительно человеком.

28. Применение двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, нуклеиновой кислоты по п. 13 или 14 или композиции по любому из пп. 16-19 для приготовления препарата для активации/стимуляции экспрессии гена SMN2 в клетке.

29. Применение по п. 28, где двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, нуклеиновая кислота по п. 13 или 14 или композиция по любому из пп. 16-19 вводится непосредственно в клетку.

30. Применение по п. 28, где двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты производится в клетке после введения в клетку нуклеотидной последовательности, кодирующей двуцепочечную молекулу нуклеиновой кислот.

31. Применение по любому из пп. 28-30, где клетка представляет собой клетку млекопитающего, предпочтительно клетку человека.

32. Применение по п. 31, где клетка находится в организме человека.

33. Применение по п. 32, где организм человека является пациентом, у которого имеется симптом, вызванный недостаточной экспрессией белка SMN, мутацией или делецией гена SMN1 или недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN1 и/или недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN2, причем двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, нуклеиновая кислота или композиция вводится в количестве, достаточном для лечения симптома.

34. Применение по п. 33, где этот симптом, вызванный недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN, является наследственным нервно-мышечным заболеванием, предпочтительно спинальной мышечной атрофией.

35. Выделенный целевой сайт двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты, активирующей SMN2, по п. 1, для активации/стимуляции экспрессии гена SMN2 в клетке, где выделенный целевой сайт представляет собой непрерывную последовательность длиной от 16 до 35 нуклеотидов в промоторной области гена SMN2 от -1639 до -1481 последовательности SEQ ID №: 476, области от -1090 до -1008 последовательности SEQ ID №: 477, области от -994 до -180 последовательности SEQ ID №: 478 или области от -144 до -37 последовательности SEQ ID №: 479 выше сайта начала транскрипции гена SMN2.

36. Целевой сайт двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по п. 35, где целевой сайт находится в последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID №: 315-471.

37. Способ активации/стимуляции экспрессии гена SMN2 в клетке, включающий введение в клетку двуцепочечной молекулы нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, нуклеиновой кислоты по п. 13 или 14 или композиции по любому из пп. 16-19.

38. Способ по п. 37, где двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты по любому из пп. 1-12, нуклеиновая кислота по п. 13 или 14 или композиция по любому из пп. 16-19 вводится непосредственно в клетку.

39. Способ по п. 37, где двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты производится в клетке после введения в клетку нуклеотидной последовательности, кодирующей двуцепочечную молекулу нуклеиновой кислоты.

40. Способ по любому из пп. 37-39, где клетка представляет собой клетку млекопитающего, предпочтительно клетку человека.

41. Способ по п. 40, где клетка находится в организме человека.

42. Способ по п. 41, где организм человека является пациентом, у которого имеется симптом, вызванный недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN, мутацией или делецией гена SMN1 или недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN1 и/или недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN2, причем двуцепочечная молекула нуклеиновой кислоты, нуклеиновая кислота или композиция вводится в количестве, достаточном для лечения симптома.

43. Способ по п. 42, где симптом, вызванный недостаточной экспрессией полноразмерного белка SMN, является наследственным нервно-мышечным заболеванием, предпочтительно спинальной мышечной атрофией.