Способ диагностики генетической предрасположенности к развитию феномена коронарной микрососудистой обструкции при выполнении чрескожных коронарных вмешательств у пациентов с инфарктом миокарда с элевацией сегмента ST Российский патент 2024 года по МПК G01N33/58 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области медицины, в частности к кардиологии, рентгенэндоваскулярной хирургии и молекулярно-генетической диагностике и может быть использовано для диагностики генетической предрасположенности к развитию феномена коронарной микрососудистой обструкции (КМСО, no-reflow) при выполнении чрескожных коронарных вмешательств (ЧКВ) у пациентов с инфарктом миокарда с элевацией сегмента ST (ИМпST).

Выполнение экстренного ЧКВ является основным и наиболее эффективным методом достижения реперфузии при ИМпST. Однако в ряде случаев, несмотря на механическое восстановление просвета эпикардиальной коронарной артерии, реперфузии миокарда не происходит вследствие развития КМСО. Данный феномен является одним из самых частых осложнений ЧКВ и встречается примерно в 10% случаев при использовании стандартных ангиографических и электрокардиографических диагностических критериев.

Известно, что в основе развития КМСО лежит несколько механизмов, выраженность и сочетание которых может быть различным у отдельно взятых пациентов [Фролов А.А., Починка И.Г., Шахов Б.Е. и др. Феномен коронарной микрососудистой обструкции (no-reflow) при проведении чрескожных коронарных вмешательств у пациентов с инфарктом миокарда. Патология кровообращения и кардиохирургия. 2020; 24 (1): 18-27. doi: 10.17691/stm2021.13.6.01]. По всей видимости именно этим фактом можно объяснить существующие трудности в прогнозировании, профилактике и лечении обсуждаемого осложнения. Среди наиболее значимых факторов, ассоциированных с развитием КМСО, стоит отметить: выраженность тромбоза коронарной артерии, структуру инфаркт-ответственной атеросклеротической бляшки, тяжесть ишемического повреждения миокарда, наличие эндотелиальной дисфункции, воспаления и сопутствующей патологии, а также тактику и различные аспекты проведенного ЧКВ [Niccoli G., Montone R.A., Ibanez B., et al. Optimized treatment of ST-elevation myocardial infarction. Circ Res. 2019; 125 (2): 245-258. doi: 10.1161/circresaha.119.315344].

Очевидно, что, как и большинство патологических состояний, развитие КМСО в той или иной степени генетически детерминировано. Понимание генетических предпосылок КМСО может существенно улучшить качество прогнозирования и профилактики, а также открыть возможность к выбору оптимальной лечебной стратегии.

Известен способ диагностики генетической предрасположенности к развитию КМСО при выполнении ЧКВ у пациентов с ИМпST путем выполнения полимеразной цепной реакции (ПЦР) с анализом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов для определения варианта ОНП rs1333040 в гене CDKN хромосомы 9p21 [Fracassi F., Niccoli G., Vetrugno V. et al. The 9p21 Rs 1333040 polymorphism is associated with coronary microvascular obstruction in ST-segment elevation myocardial infarction treated by primary angioplasty. Eur Heart J Acute Cardiovasc Care. 2019; 8 (8): 703-707. doi: 10.1177/2048872617735808]. Согласно данному способу, ОНП rs1333040 с генотипом TT ассоциирован с большей частотой развития КМСО при выполнении ЧКВ у пациентов с ИМпST, а также с худшей развитостью коллатералей к инфаркт-ответственной артерии. Поскольку ОНП rs1333040 влияет на синтез ингибиторов циклинзависимых киназ 2A и 2B (ответственны за ангиогенез), а плохой коллатеральный кровоток является причиной тяжелого ишемического повреждения (один из патогенетических механизмов КМСО), предполагается, что данный полиморфизм ассоциирован с ишемическим механизмом развития обсуждаемого осложнения.

Недостатком данного способа является диагностика генетической предрасположенности к развитию КМСО на основе анализа только одного ОНП, который ассоциирован с ишемическим повреждением, являющимся не самым распространенным механизмом развития обсуждаемого осложнения. Последние годы в Российской Федерации идет планомерная работа, направленная на улучшение помощи пациентам с ИМпST. В частности, постепенно удается достичь оптимизации логистики выявления инфаркта миокарда и организации своевременного поступления подобных пациентов в стационар. В связи с этим уменьшается количество больных, имеющих большой объем необратимо поврежденного миокарда на момент выполнения ЧКВ. Соответственно минимизируется доля пациентов с КМСО, обусловленной тяжелой ишемией.

Прототипом представленного нами способа диагностики наследственной предрасположенности к развитию КМСО при выполнении ЧКВ у пациентов с ИМпST можно считать способ, основанный на выполнении ПЦР в реальном времени с анализом кривой плавления, для определения ОНП rs2305619 в гене PTX3 хромосомы 3q25 [Dharma S., Sari N.Y., Parlautan A. et al. The 3q25 rs2305619 polymorphism is associated with coronary microvascular obstruction following primary angioplasty for acute ST-segment-elevation myocardial infarction. Circ Cardiovasc Interv. 2019; 12 (12): e008228. doi: 10.1161/circinterventions.119.008228]. Согласно данному способу, наличие генотипа AA в ОНП rs2305619 ассоциировано с более высокой частотой развития КМСО. Отношение шансов (ОШ) и 95% доверительный интервал (ДИ) развития КМСО в случае генотипа AA составляет 4,48 (1,73-11,59) соответсвенно, p-value = 0,002. Как отмечают авторы, связь данного генотипа с развитием КМСО реализуется через его влияние на концентрацию белка PTX3 (пентраксин-3): при генотипе AA она наибольшая. Данный белок является эффектором воспаления и иммунитета, а его экспрессия в эндотелиальных клетках способствует протромботическому состоянию, которое опосредованно связано с КМСО.

Недостатком данного способа является диагностика генетической предрасположенности к развитию КМСО на основе анализа только одного ОНП, который ассоциирован с эндотелиальной дисфункцией, являющейся лишь одним из механизмов развития данного осложнения. Видимо этим и следует объяснить умеренное изменение ОШ (4,48) развития КМСО в случае наличия прогностически неблагоприятного варианта генотипа (AA).

Задачей заявляемого решения является расширение арсенала технических средств диагностики генетической предрасположенности к развитию КМСО при выполнении ЧКВ у пациентов с ИМпST.

Техническим результатом заявляемого решения является диагностика наследственной предрасположенности к развитию КМСО при выполнении ЧКВ у пациентов с ИМпST.

Технический результат достигается тем, что выполняют забор цельной периферической крови, методом ПЦР в реальном времени с анализом кривой плавления определяют наличие генотипа GT или TT для ОНП 1378G>T в гене ADD1, генотипа CC для ОНП -344C>T в гене CYP11B2, генотипа CC для ОНП 677C>T в гене MTHFR и в случае выявления всех трех указанных вариантов ОНП диагностируют предрасположенность к развитию феномена КМСО.

Способ осуществляют следующим образом.

Производят забор цельной периферической крови в пробирки объёмом 2,0-4,0 мл с добавленной в качестве антикоагулянта соли этилендиаминтетраацетата в конечной концентрации 2,0 мг/мл. Для перемешивания крови с антикоагулянтом после взятия материала пробирку переворачивают 2-3 раза. До транспортировки в лабораторию пробирку хранят в медицинском холодильнике с температурой от 2°С до 8°С. В течение 24 часов после забора крови пробирку доставляют в генетическую лабораторию. Для транспортировки используют специальный транспортный термический контейнер с температурой от 2°С до 8°С. В генетической лаборатории методом ПЦР в реальном времени с анализом кривой плавления в высоком разрешении с использованием флуоресцентных зондов TaqMan определяют варианты ОНП 1378G>T в гене ADD1, ОНП -344C>T в гене CYP11B2 и ОНП 677C>T в гене MTHFR. Для повышения чувствительности и специфичности реакции применяют функцию «горячий» старт, которая обеспечивается использованием Taq-полимеразы, блокированной антителами (исключает неспецифический отжиг праймеров на ДНК-мишени при начальном прогреве пробирки). В смесь для амплификации включают сигнальные зонды с флуоресцентными метками Fam и Hex для определяемых ОНП и систему для амплификации фрагмента геномной ДНК человека с целью контроля количество ДНК в пробирке и исключения ошибки генотипирования. В результате генетического анализа выявляют один из трех вариантов (генотипов) для каждого ОНП: для 1378G>T в гене ADD1 - GG, GT или TT, для -344C>T в гене CYP11B - CC, CT или TT, для 677C>T в гене MTHFR - CC, CT или TT. При выявлении комбинации: генотип GT или TT для ОНП 1378G>T в гене ADD1, генотип CC для ОНП -344C>T в гене CYP11B2 и генотип CC для ОНП 677C>T в гене MTHFR констатируют наличие наследственной предрасположенности к развитию КМСО при выполнении ЧКВ у пациентов с ИМпST.

Способ апробирован в 2022-2023 годах в ГБУЗ НО «Городская клиническая больница №13 Автозаводского района» г. Нижний Новгород в исследовании «случай-контроль» с сопоставлением 1 к 1 на группе из 80 пациентов с ИМпST и ЧКВ (40 пациентов с КМСО и 40 без КМСО). ОШ и 95% ДИ развития КМСО для диагностики генетической предрасположенности к развитию феномена коронарной микрососудистой обструкции при выполнении чрескожных коронарных вмешательств у пациентов с инфарктом миокарда с элевацией сегмента ST по предложенному способу составляют 10,00 (1,28-78,12) соответственно, что более чем в два раза превосходит аналогичный показатель для прототипа (ОШ развития КМСО для прототипа - 4,48).

Далее представлены три примера использования предлагаемого способа для выявления наследственной предрасположенности к развитию КМСО при выполнении ЧКВ у пациентов с ИМпST.

Пример 1. Мужчина, 63 лет. Доставлен в региональный сосудистый центр из дома с диагнозом ИМпST через 6 часов после начала ангинозного статуса, без явлений острой сердечной недостаточности. Системная тромболитическая терапия не проводилась. Из сопутствующей патологии артериальная гипертензия. На момент поступления сохраняются остаточные ангинозные боли, по данным электрокардиографии - нижний ИМпST. Уровень сердечного тропонина I - 9,8 нг/мл, глюкозы крови - 6,7 ммоль/л, нейтрофилов - 6,1×10⁹ ед./л, креатинина - 95 ммоль/л. По предложенному способу определены генотипы ОНП 1378G>T (TT), ОНП -344C>T (CC) и ОНП 677C>T (СС). Диагностировано наличие генетической предрасположенности к развитию КМСО. Для определения ОНП использовали наборы реагентов «Кардиогенетика гипертония» и «Генетика метаболизма фолатов» от производителя «ДНК-Технология» (Россия). На селективной коронароангиографии - субокклюзия проксимального сегмента правой коронарной артерии, антеградный кровоток по TIMI flow grade (TFG) - 2 балла, ангиографических признаков интракоронарного тромба по TIMI thrombus grade (TTG) нет - 0 баллов. Выполнена баллонная ангиопластика поражения комплаенсным баллоном 2,0-20 мм. На контрольной ангиограмме: восстановлен антеградный кровоток 3 балла по TFG; в проксимальном сегменте правой коронарной артерии визуализируется остаточный стеноз 50%, протяженностью 22 мм, без признаков тромбоза; диаметр артерии в месте окклюзии - 4 мм. Выполнена имплантация стента с лекарственным покрытием 4,0-28 мм, с давлением имплантации - 10 атм. На контрольной ангиограмме тяжелая КМСО (кровоток по TFG - 1 балл), сопровождающаяся интенсивной ангинозной болью и брадикардией. Данный пример демонстрирует развитие тяжелой КМСО у пациента, не имеющего общеизвестных предикторов развития КМСО (большой интракоронарный тромб, агрессивное механическое воздействие на атеросклеротическую бляшку), но имеющего генетическую предрасположенность к развитию КМСО (TT генотип ОНП 1378G>T, CC генотип ОНП -344C>T и CC генотип ОНП 677C>T).

Пример 2. Женщина, 71 года. Доставлен в региональный сосудистый центр из дома с диагнозом ИМпST через 3 часа после начала ангинозного статуса, без явлений острой сердечной недостаточности. Системная тромболитическая терапия не проводилась. Из сопутствующей патологии артериальная гипертензия и сахарный диабет 2-го типа. На момент поступления сохраняются ангинозные боли, по данным электрокардиографии - передний ИМпST. Уровень сердечного тропонина I - 1,7 нг/мл, глюкозы крови - 8,9 ммоль/л, нейтрофилов - 5,7×10⁹ ед./л, креатинина - 103 ммоль/л. По предложенному способу определены генотипы ОНП 1378G>T (GT), ОНП -344C>T (CC) и ОНП 677C>T (СС). Диагностировано наличие генетической предрасположенности к развитию КМСО. Для определения ОНП использовали наборы реагентов «Кардиогенетика гипертония» и «Генетика метаболизма фолатов» от производителя «ДНК-Технология» (Россия). На селективной коронароангиографии - субокклюзия проксимального сегмента передней межжелудочковой артерии, антеградный кровоток по TIMI flow grade (TFG) - 2 балла, явных ангиографических признаков интракоронарного тромба по TIMI thrombus grade (TTG) нет - 1 балл. Выполнена баллонная ангиопластика поражения комплаенсным баллоном 2,0-20 мм. На контрольной ангиограмме: восстановлен антеградный кровоток 3 балла по TFG; в проксимальном сегменте передней межжелудочковой артерии визуализируется остаточный стеноз 60%, протяженностью 18 мм, без признаков тромбоза; диаметр артерии в месте окклюзии - 3 мм. Выполнена имплантация стента с лекарственным покрытием 3,0-22 мм, с давлением имплантации - 8 атм. На контрольной ангиограмме КМСО (кровоток по TFG - 1 балл). Данный пример демонстрирует развитие КМСО у пациентки, имеющей другое сочетание вариантов ОНП, определяющих генетическую предрасположенность к развитию КМСО (GT генотип ОНП 1378G>T, CC генотип ОНП -344C>T и CC генотип ОНП 677C>T).

Пример 3. Мужчина, 59 лет. Доставлен в региональный сосудистый центр с диагнозом ИМпST через 8 часов после начала ангинозных болей. Системная тромболитическая терапия не проводилась. На момент поступления сохраняется ангинозная боль, явлений острой сердечной недостаточности нет, по данным электрокардиографии - передний ИМпST. Уровень сердечного тропонина I - 15,1 нг/мл, глюкозы крови - 7,2 ммоль/л, нейтрофилов - 6,8×10⁹ ед./л, креатинина - 79 ммоль/л. Из сопутствующей патологии артериальная гипертензия, хронический панкреатит. По предложенному способу определены генотипы ОНП 1378G>T (GG), ОНП -344C>T (TT) и ОНП 677C>T (СТ). Диагностировано отсутствие генетической предрасположенности к развитию КМСО. Для определения ОНП использовали наборы реагентов «Кардиогенетика гипертония» и «Генетика метаболизма фолатов» от производителя «ДНК-Технология» (Россия). На селективной коронароангиографии - острая тромботическая окклюзия проксимального сегмента передней межжелудочковой артерии, выраженность тромбоза по TTG - 4 балла. Выполнена аспирационная мануальная тромбэктомия, эвакуированы тромботически массы. На контрольной ангиограмме стеноз проксимального сегмента передней межжелудочковой артерии 60%, протяженностью 25 мм, с переходом на ствол левой коронарной артерии. Выполнено стентирование ствола левой коронарной артерии и передней межжелудочковой артерии стентом с лекарственным покрытием 3,5-35 мм. Далее выполнены проксимальная оптимизация стента ствола левой коронарной артерии некомплаенсным баллоном 4,5-15 мм, баллонная ангиопластика бифуркации левой коронарной артерии по методу «целующихся баллонов» и повторная проксимальная оптимизация. На контрольной коронарограмме явлений КМСО нет, кровоток 3 балла по TFG, ангинозные боли купировались. Данный пример демонстрирует отсутствие развития КМСО у пациента без наследственной предрасположенности к развитию КМСО (GG генотип ОНП 1378G>T, TT генотип ОНП -344C>T и CT генотип ОНП 677C>T), несмотря на наличие крупного интракоронарного тромба (TTG - 4 баллов) и достаточно агрессивное механическое воздействие на атеросклеротическую бляшку в ходе ЧКВ.

Изобретение относится к медицине, а именно к кардиологии, рентгенэндоваскулярной хирургии и молекулярно-генетической диагностике, и может быть использовано для диагностики генетической предрасположенности к развитию феномена коронарной микрососудистой обструкции (КМСО) при выполнении чрескожных коронарных вмешательств (ЧКВ) у пациентов с инфарктом миокарда с элевацией сегмента ST (ИМпST). Выполняют забор цельной периферической крови. Методом полимеразной цепной реакции определяют генотипы однонуклеотидных полиморфизмов 1378G>T гена ADD1, -344C>T гена CYP11B2, 677C>T гена MTHFR. При выявлении сочетания: генотип GT или TT 1378G>T в гене ADD1, генотип CC -344C>T в гене CYP11B2, генотип CC 677C>T в гене MTHFR констатируют наличие генетической предрасположенности к развитию феномена коронарной микрососудистой обструкции. Способ обеспечивает диагностику наследственной предрасположенности к развитию КМСО при выполнении ЧКВ у пациентов с ИМпST за счет определения генотипов однонуклеотидных полиморфизмов 1378G>T гена ADD1, -344C>T гена CYP11B2 и 677C>T гена MTHFR. 3 пр.

Способ диагностики генетической предрасположенности к развитию феномена коронарной микрососудистой обструкции при выполнении чрескожных коронарных вмешательств у пациентов с инфарктом миокарда с элевацией сегмента ST, включающий забор цельной периферической крови и её генетическое исследование методом полимеразной цепной реакции, отличающийся тем, что в качестве антикоагулянта при заборе крови применяют соли этилендиаминтетраацетата в конечной концентрации 2,0 мг/мл; методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с анализом кривой плавления в высоком разрешении с использованием флуоресцентных зондов TaqMan и функции амплификатора «горячий» старт определяют генотипы однонуклеотидного полиморфизма (ОНП) 1378G>T в гене ADD1, ОНП -344C>T в гене CYP11B2, ОНП 677C>T в гене MTHFR; при выявлении сочетания: генотип GT или TT для ОНП 1378G>T в гене ADD1, генотип CC для ОНП -344C>T в гене CYP11B2, генотип CC для ОНП 677C>T в гене MTHFR констатируют наличие генетической предрасположенности к развитию феномена коронарной микрососудистой обструкции.