МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ГЕНЫ АТАКСИИ ФРИДРЕЙХА И ВЕКТОРЫ ДЛЯ ГЕННОЙ ТЕРАПИИ Российский патент 2021 года по МПК A61K48/00 

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[1] Изобретение касается модифицированных генов фратаксина (FXN), векторов, содержащих модифицированные гены FXN, способов использования модифицированных генов FXN и векторов, содержащих их, в лечении атаксии Фридриха, включая кардиомиопатию и/или нейродегенеративное заболевание, связанное с нею, обеспечивая повышенные уровни экспрессии немутированного (немутантного типа) митохондриального белка фратаксина.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Атаксия Фридрейха (FRDA) связана с уменьшением экспрессии и/или мутацией в гене FXN, который кодирует белок фратаксин митохондрий. FRDA является аутосомно-рецессивным заболеванием, что означает, что у индивидуумов это заболевание развивается только в том случае, если они наследуют дефектный ген от обоих родителей. FRDA вызвана мутациями в гене FXN, что приводит к снижению уровней мРНК и белка фратаксина. Дефектная экспрессия фратаксина вызывает критические метаболические изменения, включая редокс-дисбаланс и дефицит АТФ.

[2] FRDA представляет собой нейродегенеративное заболевание, которое поражает детей и молодых людей и приводит к прогрессирующей инвалидности и преждевременной смерти. Неврологические признаки связаны с дегенерацией сенсорных нейронов и потоком сенсорной информации через периферические нервы и сильно страдает спинной мозг. Имеет место также некоторое нарушение сигналов контроля мышц от мозжечка и спинного мозга. Эти проблемы приводят к постепенной потере равновесия, координации и мышечной силы, которые характеризуют FRDA. Кроме того, у пациентов часто развивается гипертрофическая кардиомиопатия, которая, вероятно, является причиной преждевременной смерти. Очевидными являются увеличение сердца, нерегулярное сердцебиение и другие симптомы сердечной недостаточности.

[3] Считается, что белок фратаксин регулирует уровни железа внутри митохондрий, которые необходимы для использования кислорода для получения энергии. Фратаксин, по-видимому, действует как хранилище для железа, высвобождая его только тогда, когда он необходим для синтеза ферментов в митохондрии. Таким образом, дефицит фратаксина приводит к дефициту этих ферментов и дополнительно уменьшает митохондриальную функцию, которая, вероятно, объясняет, почему атаксия Фридрейха влияет на клетки нервной системы и сердца.

[4] На сегодняшний день не существует лечения для остановки или замедления отрицательных эффектов FRDA. Существующие терапевтические подходы в клиническом использовании или исследовании, направлены на облегчение симптомов и максимизацию качества жизни. Для улучшения движений использовались физиотерапия и речевая терапия. Кроме того, некоторые лекарства были использованы для лечения заболеваний сердца. Таким образом, существует важная потребность в новом терапевтическом подходе к лечению симптомов, связанных с FRDA.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[5] Раскрытыми и проиллюстрированными в данном документе являются модифицированные нуклеиновые кислоты, кодирующие фратаксин (FXN), и векторы, содержащие модифицированную нуклеиновую кислоту, и способы лечения заболевания, опосредованного пониженным уровнем FXN, путем введения модифицированной нуклеиновой кислоты или вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, пациенту, который нуждается в этом.

[6] Квалифицированный специалист распознает или сможет установить, используя не более, чем обычные эксперименты, многие эквиваленты конкретных вариантов осуществления изобретения, описанных в данном документе. Такие эквиваленты предназначены для охвата следующими варианты осуществления (Е).

Е1. Модифицированный FXN ген для лечения FRDA у субъекта-человека, причем модифицированный FXN ген был модифицирован для изменения содержания GC нуклеотидов и/или уменьшения количества CpG динуклеотидов.

Е2. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 1, в котором уменьшенное количество CpG динуклеотидов находится в количестве, достаточном для подавления сайлесинга экспрессии гена из-за метилирования мотивов CpG.

Е3. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 1, в котором содержание нуклеотидов GC является больше, чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70% относительно немутантного типа гена.

Е4. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 3, имеющий индекс адаптации кодонов, который составляет >0,75, >0,80, >0,85, >0,90, или >0,95.

Е5. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 3, содержащий последовательность, выбранную из какой-либо одной из SEQ ID NO: 3-9.

Е6. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 1, в котором содержание нуклеотидов GC составляет меньше, чем 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60% или 70% относительно немутантного типа гена.

Е7. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 1, включенный в вирусный вектор или плазмиду.

Е8. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 7, в котором вирусный вектор является самокомплементарной AAV последовательностью.

Е9. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 8, в котором вирусный вектор выбирают из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAV Hu.26, AAV2i8, AAV2G9, rhAAV10, rhAAV74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, AAV-LK03, и их комбинаций и вариантов.

Е10. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 8, в котором вирусный вектор представляет собой анцестральный вектор AAV.

Е11. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 8, в котором вирусный вектор представляет собой химерный AAV, включая комбинацию AAV скелетов от AAV2, AAV3B, AAV6 или AAV8 и дополнительно содержащую галактозу (Gal), связывая область узнавания из AAV9.

Е12. Модифицированный FXN ген согласно варианту осуществления 1, в котором белок фратаксина имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 1 или ее функциональный фрагмент.

Е13. Способ лечения заболевания, связанного с дефицитом фратаксина, у субъекта, который нуждается в этом, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества модифицированного FXN гена, причем модифицированный FXN ген был модифицирован для увеличения или уменьшения содержания нуклеотидов GC и/или для уменьшения количества CpG динуклеотидов.

Е14. Способ согласно варианту осуществления 13, в котором модифицированный FXN ген кодирует белок фратаксина, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO. 1.

Е15. Способ согласно варианту осуществления 13, в котором модифицированный FXN ген экспрессируется в клетках-мишенях, причем клетки-мишени представляют собой клетки сердца или нейрона.

Е16. Способ согласно варианту осуществления 13, в котором модифицированный FXN ген доставляется в вирусный или невирусный вектор клеток-мишеней.

Е17. Способ согласно варианту осуществления 16, в котором вектор доставляется путем системной инъекции или путем непосредственной сердечной или внутричерепной инъекции.

Е18. Способ лечения атаксии Фридрейха (FRDA) у субъекта, который нуждается в этом, где способ включает: обеспечение, по меньшей мере, одного рекомбинантного вирусного вектора, содержащего модифицированный FXN ген, причем модифицированный FXN ген был модифицирован для увеличения или уменьшения содержания нуклеотидов GC и/или для уменьшения количества CpG динуклеотидов; и введение рекомбинантного вирусного вектора субъекту в условиях, при которых модифицированный FXN ген экспрессируется на уровне, который вырабатывает терапевтически эффективное количество фратаксина в сердечной и/или нейронной ткани субъекта.

Е19. Способ согласно варианту осуществления 18, в котором рекомбинантный вирусный вектор вводится в нейроны или клетки сердечных мышц субъекта.

Е20. Клетка-хозяин трансфицированная модифицированным FXN геном, который кодирует пептид фратаксина или его функциональный фрагмент, причем модифицированный FXN ген был модифицирован для увеличения или уменьшения содержание нуклеотидов GC и/или для уменьшения количества CpG динуклеотидов.

Е21. Способ получения пептида фратаксина или его фрагмента, включающий: трансфекцию клетки-хозяина модифицированным FXN геном, который кодирует пептид фратаксина или его функциональный фрагмент; и поддержание клетки-хозяина в биологических условиях, достаточных для экспрессии пептида фратаксина.

Е22. Способ согласно варианту осуществления 21, в котором модифицированный FXN ген имеет повышенные уровни нуклеотидов GC и/или пониженные уровни CpG динуклеотидов по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты немутантного типа фратаксина как представлено в SEQ ID NO: 2.

Е23. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированный FXN ген, причем модифицированный FXN ген, имеет повышенное или пониженное содержание нуклеотидов GC и/или уменьшенное количество CpG динуклеотидов, и фармацевтически приемлемый носитель.

Е24. Способ лечения FRDA, включающий доставку субъекту, который нуждается в лечении, вектора, содержащего модифицированную полинуклеотидную последовательность, кодирующую FXN ген, причем FXN ген экспрессируется в клетках-мишенях, тем самым проводя лечение FRDA у субъекта. Клетки-мишени предпочтительно представляют собой сердечные или нейронные клетки, и вектор предпочтительно доставляется в клетки-мишени путем непосредственной сердечной или внутричерепной инъекции.

Е25. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 1, где модифицированная нуклеиновая кислота имеет пониженное содержание GC по сравнению немутантного типа геном, что составляет на 20%, 30%, 40%, 50%, или 60% меньше, чем немутантного типа ген, при этом как все еще имея такой же уровень экспрессии как и у немутантного типа. Молчащие мутации могут быть введены в кодирующую последовательность кодирующую последовательность для того, чтобы уменьшить GC содержание в гене.

Е26. Модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN с пониженным уровнем CpG динуклеотидов.

Е27. Модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN (также называемая как "модифицированный FXN ген") для лечения FRDA у субъекта-человека, который нуждается в этом, причем модифицированный FXN ген был модифицирован для увеличения содержания GC и уменьшения некоторых цис-мотивов по отношению к немутантного типа последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей FXN, представленной как SEQ ID NO: 2.

Е28. Модифицированный FXN ген, имеющий уменьшенное количество CpG динуклеотидов в количестве, подавляющем сайлесинг экспрессии гена из-за метилирования мотивов CpG по сравнению с количеством CpG динуклеотидов, присутствующим в немутантного типа последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей FXN, представленной как SEQ ID NO: 2.

Е29. Способ лечения FRDA у субъекта, где способ включает:

обеспечение по меньшей мере одного рекомбинантного вирусного вектора, содержащего модифицированный FXN ген согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, и 25-28, и введение рекомбинантного вирусного вектора субъекту в условиях таких, что модифицированный FXN ген экспрессируется на уровне, который вырабатывает терапевтически эффективное количество фратаксина в сердечной и или нейронной ткани субъекта.

Е30. Способ снижения эффектов или лечения атаксия Фридрейха в нейронах и клетках сердечной мышцы субъекта, который нуждается в этом, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества рекомбинантного вирусного вектора, который содержит модифицированную FXN нуклеиновую кислоту, кодирующую белок фратаксин.

Е31. Способ для лечения атаксия Фридрейха у субъекта, который нуждается в этом, включающий генную терапию на основе введения нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из последовательности SEQ ID NO: 3-9.

Е32. Композиция, содержащая вектор аденоассоциированного вируса (AAV), содержащий модифицированный FXN ген, или ее функциональный фрагмент, причем AAV вектор содержит одноцепочечный AAV векторный геном, двухцепочечный AAV векторный геном или самокомплементарный (sc) AAV векторный геном.

Е33. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид, который включает модифицированный FXN ген или его фрагмент.

Е34. Вектор согласно варианту осуществления 33, где AAV содержит капсид серотипа, выбранного из группы, состоящей из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, rhAAV10, rhAAV74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1 (SEQ ID NO: 15), AAV2.5 (SEQ ID NO. 13), AAV6.1 (SEQ ID NO: 17), AAV6.3.1 (SEQ ID NO: 18), AAV9.45, AAV2i8 (SEQ ID NO: 29), AAV2G9, AAV2-TT (SEQ ID NO: 31), AAV2-TT-S312N (SEQ ID NO: 33), AAV3B-S312N, и AAV-LK03.

E35. Вектор согласно варианту осуществления 34, дополнительно содержащий AAV1.1 капсид, в котором аминокислотный остаток 265 удален (SEQ ID NO: 15), AAV 6.1 капсид, в котором аминокислотный остаток 265 удален (SEQ ID NO: 17), AAV 6,3.1 капсид, в котором аминокислотный остаток 265 удален и аминокислотный остаток 531 замещается с Lys на Glu (SEQ ID NO: 18). Нуклеотидная последовательность немутантного типа AAV 1 капсида показана в (SEQ ID NO: 14), и нуклеотидная последовательность немутантного типа AAV 6 капсида представлена в (SEQ ID NO: 16).

Е36. Химерный AAV вирусный вектор, содержащий модифицированный FXN ген согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, и 25-28, дополнительно содержащий капсид, который включает комбинацию AAV скелетов из AAV2, AAV3, AAV6, AAV8, с галактозой (Gal), связывающей область узнавания из AAV9. В частности, галактоза (Gal), связывающая область узнавания из AAV9, прививается к серотипу 2 связывающего гепарин сульфат AAV для того, чтобы улучшить эффективность трансдукции.

Е37. Химерный AAV вирусный вектор, содержащие модифицированный FXN ген согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, и 25-28, дополнительно содержащий, где вектор капсид включает тирозиновые мутанты в комбинации с 265 делеционными мутациями AAV1 и или AAV6, а также добавление галактозы, связывающей область узнавания с капсидным белком.

Е38. Химерный AAV вирусный вектор, содержащий модифицированный FXN ген согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, и 25-28, дополнительно содержащий нацеливающие пептиды, вставленные в HI структурную петлю AAV или в положение 585 аа в AAV 2 скелете. Кроме того, анцестральные AAV векторы могут быть использованы для терапевтической in vivo генной терапии. Примечательно, что использование вирусных частиц собранных из анцестральных вирусных последовательностей, демонстрирует сниженную восприимчивость к ранее существовавшему иммунитету в современной человеческой популяции, чем современные вирусы или их части.

Е39. Клетка-хозяин, содержащая модифицированный FXN ген согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, и 25-28.

Е40. Способ получения пептида фратаксина или его фрагмента, включающий: трансфекцию клетки-хозяина модифицированным FXN геном согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, и 25-28, и

поддержание клетки-хозяина в биологических условиях, достаточных для экспрессии пептида фратаксина.

Е41. Применение модифицированного FXN гена согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, и 25-28, в лечении атаксии Фридрейха.

Е42. Фармацевтическая композиция, содержащая модифицированный FXN ген для лечения атаксия Фридрейха, которая вызывает дегенерацию нейронов и клеток в сердечных тканях субъекта-человека, причем модифицированный FXN ген имеет повышенное количество нуклеотидов GC, уменьшенное количество нуклеотидов GC и/или имеет уменьшенное количество CpG динуклеотидов; и фармацевтически приемлемый носитель.

Е43. Экспрессирующая оптимизированная нуклеиновая кислота, кодирующая фратаксин, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из какой-либо одной из SEQ ID NO: 3-9.

Е44. Модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фратаксин, содержащий аминокислоту, представленную в SEQ ID NO: 1, причем нуклеиновая кислота имеет содержание GC, по меньшей мере, 55%, уменьшенное количество CpG динуклеотидов по сравнению с последовательностью нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, индекс адаптации кодонов (CAI), по меньшей мере, 0,8, и где она экспрессируется на более высоком уровне по сравнению с уровнем экспрессии немутантного типа фратаксина, содержащего последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2.

Е45. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 44, в которой CAI составляет, по меньшей мере, 0,86.

Е46. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 44, в которой CAI составляет, по меньшей мере, 0,95.

Е47. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 44, в которой CAI составляет, по меньшей мере, 0,98.

Е48. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 44-47, в которой содержание GC составляет, по меньшей мере, 61%.

Е49. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 44-47, в которой содержание GC составляет, по меньшей мере, 69%.

Е50. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 44-49, в которой количество CpG динуклеотидов составляет от приблизительно 114 до 124.

Е51. Модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фратаксин (FXN), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, причем указанная нуклеиновая кислота экспрессируется на более высоком уровне по сравнению с уровнем экспрессии немутантного типа FXN последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, и причем указанная модифицированная нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, одну характеристику, выбранную из группы, состоящей из: содержания GC, по меньшей мере, 55%, количества CpG динуклеотидов не больше, чем 124, и индекса адаптации кодонов (CAI), по меньшей мере, 0,76.

Е52. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 51, где указанная нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, одну характеристику, выбранную из группы, состоящей из: CAI, по меньшей мере, 0,86, по меньшей мере, 0,95, или по меньшей мере 0,98; содержание GC составляет по меньшей мере 57%, по меньшей мере 61%, или по меньшей мере 69%; количество CpG динуклеотидов составляет меньше, чем 124; и последовательность нуклеиновой кислоты выбирают из группы, состоящей из последовательности как представлено в SEQ ID NO: 3-9.

Е53. Модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN, где указанная нуклеиновая кислота экспрессируется на более высоком уровне по сравнению с уровнем экспрессии немутантного типа FXN последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2, и причем нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, одну из: последовательностей нуклеиновой кислоты, выбраных из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-9; содержание GC - по меньшей мере, 55%; количество CpG динуклеотидов не больше, чем 117; и CAI - по меньшей мере 0,86.

Е54. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 53, причем последовательность нуклеиновой кислоты выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7.

E55. Модифицированная нуклеиновая кислота по какому-либо одному пункту из вариантов осуществления 43-54, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7.

Е56. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, 25-28 и 43-55, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей, по меньшей мере, один AAV терминальный повтор (TR).

Е57. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 55 где нуклеиновая кислота является одноцепочечной, двухцепочечной, и/или самокомплементарной.

Е58. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 57, в которой нуклеиновая кислота является самокомплементарной.

Е59. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, 25-28, и 43-58, дополнительно содержащая енхансер.

Е60. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 59, в которой енхансер представляет собой непосредственный ранний энхансер цитомегаловируса (CMV).

Е61. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, 25-28, и 43-60, дополнительно содержащая промотор.

Е62. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, 25-28, и 43-61, в которой промотор является конститутивным или регулируемым.

Е63. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 62, в которой промотор является регулируемым.

Е64. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 63, в которой промотор является индуцибельным или репрессируемым.

Е65. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, 25-28, и 43-64, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей последовательность стабилизации коллагена (CSS).

Е66. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, 25-28, и 43-65, дополнительно содержащая стоп-кодон.

Е67. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, 25-28, и 43-66, дополнительно содержащая сигнальную последовательность полиаденилирования (polyA).

Е68. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 67, в которой промотор выбирают из группы, состоящей из куриного бета-актинового (СВА) промотора, цитомегаловирусного (CMV) промотор, CMV енхансера/СВА промотора (CBh), и синтетического CAG промотора.

Е69. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно варианту осуществления 68, в которой промотор представляет собой CBh промотор.

Е70. Модифицированная нуклеиновая кислота согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-6, 12, 25-28, и 44-69, дополнительно содержащая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую последовательность стабилизации коллагена (CSS).

Е71. Рекомбинантный AAV вектор (rAAV), содержащий модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, 25-28, и 43-70.

Е72. rAAV согласно варианту осуществления 71, в котором rAAV содержит капсид, выбранный из группы, состоящей из капсида из AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, AAV2.5 (SEQ ID NO. 13), AAV hu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV2i8, AAV2G9, AAV9.45, AAV2i8G9, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, и AAV-LK03.

E73. rAAV согласно варианту осуществления 72, в котором капсид выбирают из группы, состоящей из AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, и AAV2i8 капсида.

Е74. rAAV согласно варианту осуществления 73, в котором модифицированная нуклеиновая кислота содержит последовательность SEQ ID NO: 7, и в котором капсид выбирают из AAV2i8 капсида и AAV2-TT-S312N капсида.

Е75. rAAV согласно варианту осуществления 74, в котором нуклеиновая кислота дополнительно содержит две последовательности AAV терминального повтора, фланкирующие последовательность, кодирующую FXN, и дополнительно содержит CBh промотор против хода транскрипции последовательности, кодирующей FXN.

Е76. rAAV согласно варианту осуществления 75, где указанная нуклеиновая кислота дополнительно содержит последовательность стабилизации коллагена (CSS; SEQ ID NO: 25) 3' из последовательности, кодирующей FXN.

Е77. rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 71-76, в котором нуклеиновая кислота содержит сигнальную последовательность бычьего гормона роста polyA (bGHpolyA).

Е78. Вектор rAAV, содержащий AAV2i8 капсид, в котором VP1 содержит аминокислоту SEQ ID NO: 29, и дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, содержащую, от 5' до 3':

(a) AAV2 терминальный повтор (TR);

(b) CBh промотор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-9;

(d) CSS, имеющий последовательность SEQ ID NO: 25;

(e) bGHpolyA сигнальную последовательность, имеющую последовательность SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 TR.

E79. Вектор rAAV, содержащий AAV2-TT капсид, в котором VP1 содержит аминокислоту SEQ ID NO: 31, и дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, содержащую, от 5' до 3':

(a) AAV2 TR;

(b) CBh промотор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-9;

(d) CSS, имеющий последовательность SEQ ID NO: 25;

(e) bGHpolyA сигнальную последовательность, имеющую последовательность SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 TR.

E80. Вектор rAAV, содержащий AAV2-TT-S312N капсид, в котором VP1 содержит аминокислота SEQ ID NO: 33, и дополнительно содержит нуклеиновую кислоту содержащую, от 5' до 3':

(a) AAV2 TR;

(b) CBh промотор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-9;

(d) CSS, имеющий последовательность SEQ ID NO: 25;

(e) bGHpolyA сигнальную последовательность, имеющую последовательность SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 TR.

E81. Вектор rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 71-80, в котором модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7.

Е82. Вектор rAAV для лечения атаксии Фридрейха у субъекта, который нуждается в этом, причем указанный вектор содержит модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фратаксин согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-6, 12, 25-28 и 71-81.

Е83. Фармацевтическая композиция, содержащая вектор rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 7-11, 33-39, и 71-82, и фармацевтически приемлемый носитель.

Е84. Способ лечения FRDA у субъекта, где способ включает введение, по меньшей мере, одной из: модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фратаксин согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-12, 23, 25-28 и 43-70; вектора rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 7-11, 33-39 и 71-82; и фармацевтической композиции согласно варианту осуществления 83.

Е85. Способ согласно варианту осуществления 84, в котором вектор rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 7-11, 33-39, и 71-82, вводится системно, или путем непосредственного сердечного или внутричерепного введения.

Е86. Способ согласно варианту осуществления 85, в котором вектор rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 71-82 вводится внутричерепным путем.

Е87. Способ согласно варианту осуществления 85, в котором вектор rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 71-82 вводится непосредственно в сердце.

Е88. Способ согласно варианту осуществления 84, в котором модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 6.

Е89. Способ согласно варианту осуществления 84, в котором модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7.

Е90. Способ лечения заболевание, расстройства или состояния, опосредованного пониженным уровнем FTX, где способ включает введение, по меньшей мере, одной из: модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фратаксин согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-6, 12, 25-28 и 43-70; вектора rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 7-11, 33-39 и 71-82; и фармацевтической композиции согласно варианту осуществления 83.

Е91. Клетка-хозяин, содержащая модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-6, 12, 25-28 и 43-70.

Е92. Клетка-хозяин согласно варианту осуществления 91, причем клетку выбирают из группы, состоящей из VERO, WI38, MRC5, А549, HEK293 клетки, В-50 или каких-либо других HeLa клеток, HepG2, Saos-2, HuH7, и НТ1080.

Е93. Клетка-хозяин согласно варианту осуществления 92, причем клетка-хозяин представляет собой HEK293, адаптированную к росту в суспензионной культуре.

Е94. Клетка-хозяин согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 91-93, причем клетка представляет собой HEK293 клетку, имеющую АТСС No. РТА 13274.

Е95. Упаковывающая клетка, содержащая вектор rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 7-11, 33-39, и 70-82, причем указанная клетка дополнительно содержит, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую AAV Rep белок, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующие AAV Сар белок, и, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую хелперный функциональный элемент.

E96. Способ получения вектора rAAV, где способ включает культивирование клетки согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 91-95 в условиях, при которых продуцируется rAAV.

Е97. Способ согласно варианту осуществления 96, дополнительно включающий выделение продуцированного rAAV.

Е98. Применение, по меньшей мере, одной модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фратаксин согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-6, 12, 25-28 и 43-70; вектора rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 7-11, 33-39 и 71-82; и фармацевтической композиции согласно варианту осуществления 83 для увеличения уровня фратаксина в клетке.

Е99. Модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фратаксин согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-6, 12, 25-28 и 43-70; вектор rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 7-11, 33-39 и 71-82; и фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 83 для применения в увеличении уровня фратаксина у субъекта.

Е100. Модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фратаксин согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 1-6, 12, 25-28 и 43-70; вектор rAAV согласно какому-либо одному из вариантов осуществления 7-11, 33-39 и 71-82; и фармацевтическая композиция согласно варианту осуществления 83 для применения в лечении атаксии Фридрейха у субъекта.

[7] Другие признаки и преимущества изобретения будут очевидны из следующего ниже подробного описания, чертежей, иллюстративных вариантов осуществления и формулы изобретения

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[8] Фигуры 1А и 1В. На фигурах 1А и 1В показаны результаты экспрессии в клетках HeLa фратаксина из выбранных модифицированных нуклеиновых кислот, кодирующих FXN, по сравнению с нуклеиновой кислотой немутантного типа (дорожка 1). Экстракты из клеток HeLa, включающие следующие модифицированные нуклеиновые кислоты, были исследованы для обнаружения FXN, продуцируемого в клетках. Фратаксин был обнаружен вестерн-блоттингом с использованием антитела против фратаксина, обнаруженного с использованием вторичного антитела, конъюгированного с HRP (пероксидазой хрена) для определения хемилюминесценции, путем воздействия Вестерн-блоттинга на светочувствительную пленку. Дорожки загружали экстрактами из клеток HeLa, трансфицированными следующими модифицированными нуклеиновыми кислотами, кодирующими фратаксин: дорожка 1: нуклеиновая кислота немутантого типа; дорожка 2: IDT2; дорожка 3: IDT5; дорожка 4: JCAT; дорожка 5: GeneArt; дорожка 6: Genscript (контроль); и дорожка 7: Genscript (низкий CpG).

[9] На фигурах 2A-2F показана последовательность различных модифицированных генных конструктов FXN для клонирования в самокомплементарный rAAV-вектор pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA - где ген маркера EGFP заменен геном FXN немутантного типа (SEQ ID NO: 2) или его модифицированной версией (например, SEQ ID NO: 3-9). На каждой фигуре показан WT FXN (фиг. 2А) или модифицированный ген FXN (фиг. 2В-2Р). Каждый конструкт содержит (от 5' до 3') сайт разрезания Agel, ген FXN/модифицированный ген FXN, сайт разрезания Avrll, последовательность стабильности коллагена (CSS), сайт разрезания Spel, сигнальную последовательность bGHpolyA и сайт разрезания Mlul, На фигуре 2А показан конструкт pTRs-KS-CBh-WT FXN-bGHpolyA (SEQ ID NO: 19); На фигуре 2B показан конструкт ген PTRs-KS-CBh-IDT1 FXN-bGHpolyA (SEQ ID NO: 20) модифицированного FXN гена Integrated DNA Technologies IDT1 (IDT1), На фигуре 2C показан модифицированный IDT3 генный конструкт FXN pTRs-KS-CBh-IDT3 FXN-bGHpolyA (SEQ ID NO: 21); На фигуре 2D показан модифицированный IDT4 генный конструкт FXN pTRs-KS-CBh-IDT4 FXN-bGHpolyA (SEQ ID NO: 22); На фигуре 2E показан GenScript конструкт pTRs-KS-CBh-GenScript FXN-bGHpolyA (SEQ ID NO: 23) модифицированного гена FXN; и на фигуре 2F показана генный GenScript конструкт pTRs-KS-CBh-Genscript (низкий CpG) FXN-bGHpolyA (SEQ ID NO: 24) (низкий CpG) модифицированного гена FXN, каждая последовательность включает в себя элементы (например, Agel, Avrll, CSS, Spel, bGHpolyA и Mlul), которые обозначены следующим образом: от 5' до 3', на фигуре 2A-2F: сайт разрезания Agel (ACCGGT), выделенный жирным шрифтом; ген FXN в строчных буквах, сайт разрезания Avrll (CCTAGG), обозначенный подчеркиванием: последовательность, кодирующая последовательность стабилизации коллагена (CSS), обозначенная двойным подчеркиванием; сайт разрезания Spel (ACTAGT), выделенный жирным шрифтом с подчеркиванием; сигнальная последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (bGHpolyA), выделенная курсивом; и сайт Mlul cut (ACGCGT), выделенный жирным курсивом. Ген FXN в конструкте находится под контролем промотора CBh против хода транскрипции сайта разрезания Agel. Последовательность промотора CBh не показана на фигурах 2A-2F, но представлена в SEQ ID NO: 25.

[10] На фигуре 3 показана векторная (плазмидная) карта для конструкта клонирования pTRs-KS-CBh-eGFP, изображающая различные сайты (элементы) рестрикции (разрезания) и элементы вектора, включая промотор CBh, против хода транскрипции от сайта среза Agel.

[11] На фигурах 4А и 4В показаны графики, иллюстрирующие базовый сердечный фенотип у контрольной, подвергнутой лечению мутантной и не подвергавшйся лечению мутантной самца (фигура 4А) и самки (фигура 4В) мышей. На фигуре 4А показан сердечный фенотип слева направо в каждой группе: контрольные самцы, подвергнутые лечению мутанты и неподвергнутые лечению мутанты, где группы: EF (фракция выброса), FS (фракционное сокращение); LV Vol_d (объем левого желудочка диастолический); и LV Vol_s (объем левого желудочка систолический). На фигуре 4В показан базовый сердечный фенотип для групп самок мышей: контроль (круги); подвергнутые лечению мутанты (квадраты); и неподвергнутые лечению мутанты (треугольники).

[12] На фигурах 5А и 5В показаны графики, иллюстрирующие трансформацию сердечного фенотипа FRDA у мутантных мышей Mck, подвергнутых лечению, по сравнению с сердечным фенотипом у мутантных мышей Mck, неподвергнутых лечению, в возрасте 5 недель (и через 14 дней после лечения у мутантов, подвергнутых лечению). На фигуре 5А показан сердечный фенотип контроля (круги), мутантов, подвергнутых лечению (квадраты) и мутантов, неподвергнутых лечению (треугольники) самцов мышей через 14 дней после инъекции rAAV-FXN. Сокращения обозначают следующее: AoV SV (объем хода аортального клапана); AoV СО (сердечный выброс аортального клапана); FS (дробное сокращение); и LV Mass AW (передняя стенка массы левого желудочка). На фигуре 5В показан сердечный фенотип контроля (круги), мутантов, подвергнутых лечению (квадраты) и мутантов, неподвергнутых лечению (треугольники) самок мышей через 14 дней после инъекции rAAV-FXN. Сокращения обозначают следующее: ES (фракция выброса): FS (дробное сокращение); AoV SV (объем аортального клапана); AoV СО (сердечный выброс аортального клапана).

[13] На фигурах 6А-6С показаны графики, иллюстрирующие сердечную функцию у самцов и самок контрольных мышей (кружки), мутантов, подвергнутых лечению (квадраты) и мутантов, неподвергнутых лечению (треугольники) самцов и самок мышей в течение 28 (восьми) дней после - RAAV-FXN в обработанной мутантной группе Mck, подвергнутой лечению. На рис. 6А показана оценка эхокардиографии массы левого желудочка (LVM) для всех трех групп мышей в течение последующих недель, т.е. в возрасте 3 недель (время введения rAAV), 5-недельного возраста (14 дней после введения rAAV) и 7 недель (28 дней после введения rAAV), где лечение проводилось в возрасте 5 недель. На фигуре 6 В показана эхокардиографическая оценка фактора сокращения (SF) для всех трех групп мышей в течение последующих недель. На фигуре 6С показана эхокардиографическая оценка сердечноо выброса для всех трех групп мышей в течение последующих недель. Данные являются средними±S.E.M из 8 мышей на группу. Данные мутантных мышей Mck сравнивали с положительной контрольной группой Mck с использованием нескольких сравнительных критериев Стьюдента (способ Сидак-Бонферрони). * р<0,05.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Определения

[14] Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понимаемое квалифицированным специалистом в данной области техники, к которому относится настоящее изобретение. Терминология, используемая в данном документе, предназначена только для описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения изобретения. Как используется в описании изобретения и прилагаемой формуле изобретения, единственные формы также включают в себя множественные формы, если контекст явно не указывает иначе. Следующие термины имеют следующие значения:

[15] Термин "приблизительно", как используется в данном документе, когда касается измеряемого значения, такого как количество биологической активности, длина полинуклеотидной или полипептидной последовательности, содержание G и С нуклеотидов, индекс адаптации кодонов, количество CpG динуклеотидов, доза, время, температура, и тому подобное, предназначен для охвата изменений в 20%, 10%, 5%, 1%, 0.5% или даже 0.1% от указанного количества.

[16] Как используется в данном документе, термин "и/или" касается и охватывает какие-либо и все возможные комбинации одного или нескольких связанных перечисленных элементов, а также отсутствия комбинаций при интерпретации в альтернативе («или»).

[17] AAV "rep" и "cap" гены касаются полинуклеотидных последовательностей, кодирующих репликацию и инкапсидирование белков аденоассоциированного вируса. AAV rep и cap называются в данном документе как AAV "упаковывающие гены."

[18] Представленное изобретение предусматривает рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор. "AAV" является сокращением для аденоассоциированного вируса, и могут быть использованы для обозначения самого вируса или его производных. Термин охватывает все подтипы и как, те, которые встречаются в природе, так и рекомбинантные формы, за исключением случаев, когда это требуется в противном случае. Сокращение "rAAV" касается рекомбинантного аденоассоциированного вируса, также называемого как рекомбинантный AAV вектор (или "rAAV вектор") или просто, "AAV вектор." Термин "AAV" включает, например, AAV различных серотипов, например, AAV типа 1 (AAV-1), AAV типа 2 (AAV-2), AAV типа 3 (AAV-3), AAV типа 4 (AAV-4), AAV типа 5 (AAV-5), AAV типа 6 (AAV-6), AAV типа 7 (AAV-7), AAV типа 8 (AAV-8), AAV типа 9 (AAV-9), AAV типа 10 (AAV-10, включая AAVrhIO), AAVrh74, AAV типа 12 (AAV-12), aviAAV, бычий AAV, собачий AAV, конский AAV, приматный AAV, неприматный AAV, и овечий AAV. "Приматный AAV" касается AAV, который заражает приматов, "неприматный AAV" касается AAV, который заражает млекопитающих, не относящихся к приматам, "бычий AAV" касается AAV, которые заражают бычьих млекопитающих, и так далее.

[19] Различные серотипы AAV привлекательны по нескольким причинам, наиболее заметно, что AAV, как считается, является непатогенным, и что немутантного типа вирус может интегрировать свой геном сайт-специфично в хромосому человека 19 (Linden et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93:11288-11294). Сайт вставки AAV в геном человека называется AAVS1. Сайт-специфичная интеграция, в отличие от случайной интеграции, как считается, может в результате привести к предсказуемому долгосрочному профилю экспрессии.

[20] Геномные последовательности различных серотипов AAV, а также последовательности нативных терминальных повторов (TRs), Rep белки, и капсидные субединицы известны в данной области. Такие последовательности могут быть найдены в литературе или в публичных базах данных, таких как GenBank. Смотрите, например, номера доступа GenBank NC-002077 (AAV-1), AF063497 (AAV-1), NC-001401 (AAV-2), AF 043303 (AAV-2), NC-001729 (AAV-3), NC-001829 (AAV-4), U89790 (AAV-4), NC-006152 (AAV-5), AF 513851 (AAV-7), AF 513852 (AAV-8), и NC-006261 (AAV-8); раскрытие которых включены в качестве ссылки в данный документ. Смотрите также, например, Srivistava et al., 1983, J. Virology 45:555; Chiorini et al., 1998, J. Virology 71:6823; Chiorini et al., 1999, J. Virology 73: 1309; Bantel-Schaal et al., 1999, J. Virology 73:939; Xiao et al., 1999, J. Virology 73:3994; Muramatsu et al., 1996, Virology 221:208; Shade et al., 1986, J. Virol. 58:921; Gao et al., 2002, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 99: 11854; Moris et al., 2004, Virology 33:375-383; международные патентные публикации WO 00/28061, WO 99/61601, WO 98/11244; WO 2013/063379; WO 2014/194132; WO 2015/121501, и Патенты США №№6,156,303 и 7,906,111.

[21] "rAAV вектор" как используется в данном документе касается AAV вектора, содержащего полинуклеотидную последовательность не AAV происхождения (то есть, полинуклеотид гетерологичный по отношению к AAV), как правило, последовательность представляющую интерес для генетической трансформации клетки. В некоторых вариантах осуществления, гетерологичный полинуклеотид может быть фланкирован, по меньшей мере, одним, и иногда двумя, AAV инвертированными последовательностями терминального повтора (ITR). Термин rAAV вектор охватывает как rAAV как векторные частицы и rAAV векторные плазмиды. Вектор rAAV может быть либо одноцепочечным (ssAAV), либо самокомплементарный (scAAV). "AAV вирус" или "AAV вирусная частица" или "rAAV векторная частица" касается вирусной частицы, состоящей, по меньшей мере, из одного AAV капсидного белка (как правило, всеми капсидными белками немутантного типа AAV) и инкапсидированного полинуклеотидного rAAV вектора. Если частица содержит гетерологичный полинуклеотид (то есть, полинуклеотид отличный от немутантного типа AAV геном, такой как трансген, который должен быть доставлен в клетку млекопитающего), его, как правило, называют как "rAAV векторная частица" или просто "rAAV вектор". Таким образом, получение rAAV частицы обязательно включает в себя получение rAAV вектора, так как такой вектор содержится внутри rAAV частицы.

[22] "Рекомбинантный," как используется в данном документе, означает, что вектор, полинуклеотид, полипептид или клетка представляет собой продукт различных комбинаций стадий клонирования, рестрикции или лигирования (например, относящихся к полинуклеотиду или полипептиду, содержащемуся в нем), и/или других процедур, которые в результате приводят к конструкту, который отличается от продукта, найденного в природе. Рекомбинантный вирус или вектор представляет собой вирусную частицу, содержащую рекомбинантный полинуклеотид. Термины, соответственно, включают репликаты исходного полинуклеотидного конструкта и потомство исходного вирусного конструкта.

[23] "AAV Rep" означает AAV репликационные белки и их аналоги.

[24] "AAV Сар" означает AAV капсидные белки, VP1, VP2 и VP3 и их аналоги. В немутантного типа AAV вирусе, три капсидных гена vp1, vp2 и vp3 перекрывают друг друга. Смотрите, Grieger и Samulski, 2005, J. Virol. 79(15):9933-9944. Один Р40 промотор позволяет всем трем капсидным белкам быть экспрессированными в соотношении приблизительно 1:1:10, vp1, vp2, vp3, соответственно, которые дополняют rAAV продуцированием. Для продуцирования рекомбинантных AAV векторов, желаемое соотношение VP1:VP2:VP3 находится в диапазоне от приблизительно 1:1:1 до приблизительно 1:1:100, предпочтительно в диапазоне от приблизительно 1:1:2 до приблизительно 1:1:50, более предпочтительно в диапазоне от приблизительно 1:1:5 до приблизительно 1:1:20. Хотя желаемое соотношение VP1.VP2 составляет 1:1, диапазон соотношения VP1:VP2 может варьировать от 1:50 до 50:1.

[25] Полный список и выравнивание аминокислотных последовательностей капсид известных AAV серотипов предоставлен в Marsic et al., 2014, Molecular Therapy 22(11): 1900-1909, особенно на дополнительной фигуре 1.

[26] Только для иллюстративных целей, немутантного типа AAV2 содержит малый (20-25 нм) икосаэдрический вирусный капсид AAV, состоящий из трех белков (VP1, VP2, и VP3; в общей сложности 60 капсидных белков составляют AAV капсид) с перекрытием последовательностей. Белки VP1 (735 аа; Genbank Accession No. ААС03780), VP2 (598 аа; Genbank Accession No. AAC03778) и VP3 (533 aa; Genbank Accession No. AAC03779) существуют в соотношении 1:1:10 в капсиде. То есть для AAVs, VP1 представляет собой полноразмерный белок и VP2 и VP3 являются прогрессирующе более короткими версиями VP1, с увеличением усечения N-конца относительно VP1.

[27] "AAV TR" означает последовательность палиндромного терминального повтора на или вблизи концов AAV генома, содержащего в основном комплементарные, симметрично расположенные последовательности, и включает аналоги нативных AAV TR и их аналоги.

[28] "Cis-мотивы" включают консервативные последовательности, такие как найденные на или вблизи к концам геномной последовательность и распознаваемые для начала репликации; криптические промоторы или последовательности во внутренних позициях, которые, вероятно, используются для инициации транскрипции,, сплайсинга или терминации.

[29] "Лечение" или "лечить" означает улучшение состояния, облегчение, или ингибирование развития расстройства или состояния, к которому применяется такой термин, или одного или нескольких симптомов такого расстройства или состояния.

[30] "Терапевтически эффективного количества" означает минимальное количество активного агента, которое необходимо для придания терапевтической пользы субъекту. Например, «терапевтически эффективное количество» для пациента представляет собой такое количество, которое индуцирует, улучшает, стабилизирует, замедляет прогрессирование или иным образом вызывает улучшение патологических симптомов, прогрессирования заболевания или физиологических состояний, связанных с или резистентных к уступкам расстройства.

[31] "Ген" означает полинуклеотид, содержащий, по меньшей мере, одну открытую рамку считывания, которая способна кодировать конкретный полипептид или белок после транскрибирования и трансляции.

[32] "Кодирующая последовательность" означает последовательность, которая кодирует конкретный белок", или "кодирующая нуклеиновая кислота", обозначает последовательность нуклеиновой кислоты, которая транскрибируется (в случае ДНК) и транслируется (в случае мРНК) в полипептид in vitro или in vivo, когда они находятся под контролем (функционально связанных с) соответствующих регуляторных последовательностей. Границы кодирующей последовательности определяются стартовым кодоном на 5' (амино) конце и стоп-кодоном трансляции в 3' (карбокси) конце. Кодирующая последовательность может включать, но не ограничивается этим, кДНК из прокариотической или эукариотической мРНК, последовательности геномной ДНК из прокариотической или эукариотической ДНК и даже синтетические последовательности ДНК.

[33] "Химерный" означает, по отношению к вирусному капсиду или частице, что капсид или частица включает последовательности из разных парвовирусов, предпочтительно различных серотипов AAV, как описано в Rabinowitz et al., патент США 6,491,907, раскрытие которого включено во всей своей полноте в данный документ в качестве ссылки. Смотрите также Rabinowitz et al., 2004, J. Virol. 78(9):4421-4432. Особенно предпочтительным вирусным капсидом является AAV2.5 капсид, который имеет последовательность AAV2 капсида со следующими мутациями: 263 Q до А; 265 вставка Т; 705 N до А; 708 V до А; и 716 Т до N. где нуклеотидная последовательность, кодирующая такой капсид определена как SEQ ID NO: 15 как описано в WO 2006/066066. Другие предпочтительные химерные AAV включают, но не ограничиваются этим, AAV2i8, описаный в WO 2010/093784, AAV2G9 и AAV8G9 описаные в WO 2014/144229, и AAV9.45 (Pulicherla et al., 2011, Molecular Therapy 19(6): 1070-1078).

[34] "Фланкированные," относительно последовательности, которая является фланкированной другими элементами, указывает наличие одного или нескольких фланкирующих элементов против хода транскрипции и/или по ходу транскрипции, то есть, 5' и/или 3', относительно последовательности. Термин "фланкированные" не означает, что последовательности обязательно смежны. Например, могут существовать промежуточные последовательности между нуклеиновой кислотой, кодирующей трансген и фланкирующий элемент. Последовательность (например, трансген), которая является "фланкированной" двумя другими элементами (например, TR), указывает на то, что один элемент располагается 5' в последовательности, а другой располагается 3' в последовательности; однако между ними могут быть промежуточные последовательности.

[35] "Полинуклеотид" означает последовательность нуклеотидов, connected by фосфодисложноэфирными связями. Полинуклеотидов представлены в данном документе в направлении от 5' до 3'. Полинуклеотид согласно представленному изобретению может представлять собой молекулу дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или молекулу рибонуклеиновой кислоты (РНК). Если полинуклеотид представляет собой молекулу ДНК, то молекула может представлять собой ген или кДНК молекулу. Нуклеотидные основания указываются в данном документе однобуквенным кодом: аденин (А), гуанин (G), тимин (Т), цитозин (С), инозин (I) и урацил (U). Полинуклеотид согласно представленному изобретению может быть получен с использованием стандартных методик, хорошо известных квалифицированному специалисту в данной области.

[36] "Трансдукция" клетки вирусом означает, что происходит перенос нуклеиновой кислоты из вирусной частицы в клетку.

[37] "Модифицированный FXN ген" означает модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN (например, аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1) с, по меньшей мере, одной модификацией по сравнению с немутантного типа нуклеиновой кислотой, кодирующей FXN (например, SEQ ID NO: 2), где модификация включает, но не ограничивается этим, повышенное содержание GC, уменьшенное содержание GC или FXN ген с уменьшенным содержанием CpG. Предпочтительно, модифицированный FXN ген демонстрирует улучшенную экспрессию белка, например, белка, кодированного, тем самым экспрессированным на обнаруживаемо большем уровне в клетке по сравнению с уровнем экспрессии белка, предоставленного немутантного типа геном в иным образом идентичной клетке.

[38] "Трансфекция" клетки означает, что генетический материал вводится в клетку с целью генетической модификации клетки. Трансфекция может осуществляться с помощью различных средств, известных в данной области, таких как фосфат кальция, полиэтиленимин, электропорация и тому подобное.

[39] "Полипептид" охватывает как пептиды, так и белки, если не указано иное.

[40] "Передача гена" или "доставка гена" касается способов или систем для надежной всиавки чужеродной ДНК в клетки-хозяины. Такие способы могут в результате приводить к временной экспрессии неинтегрированной перенесенной ДНК, экстрахромосомной репликации и экспрессии перенесенных репликонов (например, эписомы), или интеграции перенесенного генетического материала в геномную ДНК клеток-хозяев.

[41] Термины "клетка-хозяин," "линия клеток-хозяев," и "культура клеток-хозяев" используются взаимозаменяемо и касаются клеток, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают "трансформанты, "трансформированные клетки," и "трансдуцированные клетки," которые включают первично трансформированную клетку и полученное из нее потомство без учета количества пассирований.

[42] "Трансген" используется для обозначения какой-либо гетерологичной нуклеотидной последовательности, включенной в вектор, включая вирусный вектор, для доставки и включая экспрессию в клетке-мишени (также называемой в данном документе как "клетка-хозяин"), и связанные последовательности контроля экспрессии, такие как промоторы. Специалистам в данной области техники понятно, что последовательности контроля экспрессии будут выбираться на основе способности стимулировать экспрессию трансгена в клетке-мишени. Примером трансгена является нуклеиновая кислота, кодирующая терапевтический полипептид.

[43] "Вектор," означает рекомбинантную плазмиду или вирус, который содержит полинуклеотид, который доставляется в клетку-хозяин, или in vitro, или in vivo.

[44] "Существенная гомология" или "существенная подобность," означает, когда речь идет о нуклеиновой кислоте или ее фрагменте, что при оптимальном выравнивании с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью), существует нуклеотидная последовательность с идентичностью, по меньшей мере, приблизительно от 95 до 99% к последовательности.

[45] "Рекомбинантного вирусный вектор" означает рекомбинантный полинуклеотидный вектор, содержащий одну или несколько гетерологичных последовательностей (то есть, полинуклеотидную последовательность не вирусного происхождения). В случае рекомбинантных парвовирусных векторов рекомбинантный полинуклеотид фланкирован, по меньшей мере, одной, предпочтительно двумя инвертированными терминальными повторными последовательностями (ITRs).

[46] "Гомологичный" используемый в отношении пептидов, касается подобности аминокислотной последовательности между двумя пептидами. Когда положение аминокислоты в обоих пептидах занимается одинаковыми аминокислотами, они являются гомологичными в этом положении. Таким образом, «по существу гомологичный» означает аминокислотную последовательность, которая в значительной степени, но не полностью, является гомологичной и которая сохраняет большую часть или всю активность как и последовательность, к которой она гомологична. Как используется в данном документе, "по существу гомологичный" означает, что последовательность является, по меньшей мере, на 50% идентичной, и предпочтительно, по меньшей мере, на 75% и более предпочтительно на 95% гомологичной эталонному пептиду. Дополнительная модификация пептидной последовательности, такая как незначительные вариации, делеции, замещения или производные аминокислотной последовательности, описанные в данном документе, при условии, что пептид имеет практически такую же активность или функцию, что и немодифицированные пептиды. Производные аминокислоты могут включать, но не ограничиваются этим, трифторлейцин, гексафторлейцин, 5,5,5-трифторизолейцин, 4,4,4-трифторвалин, п-фторфенилалин, о-фтортирозин, м-фтортирозин, 2,3-дифтортирозин, 4-фторгистидин, 2-фторгистидин, 2,4-дифторгистидин, фторпролин, дифторпролин, 4-гидроксипролин, селенометионин, теллурометионин, селеноцистеин, селенотриптофаны, 4-аминотриптофан, 5-аминотриптофан, 5-гидрокситриптофан, 7-азатриптофан, 4-фтортриптофан, 5-фтортриптофан, 6-фтортриптофан, гомоалглиглицин, гомопропаргилглицин, 2-бутинил глицин, цис-кротилглицин, аллилглицин, дегидролейцин, дегидропролин, 2-амино-3-метил-4-пентеновую кислоту, азидогомоаланин, азидоаланин, азидонорлейцин, п-этинилфенилаланин, азидофенилаланин, п-бромфенилаланин, п-ацетилфенилаланин и бензофуранилаланин. Примечательно, что модифицированный пептид будет сохранять активность или функцию, связанную с немодифицированным пептидом, модифицированный пептид как правило, будет иметь аминокислотную последовательность «по существу гомологичную» с аминокислотной последовательностью немодифицированной последовательности.

[0042] Полинуклеотид или полипептид имеет определенную процентную "идентичность последовательности" к другому полинуклеотиду или полипептиду, что означает, что при выравнивании этот процент оснований или аминокислот является одинаковым при сравнении двух последовательностей. Подобность последовательности может быть определена несколькими различными способами. Для того, чтобы определить идентичность последовательности, последовательности могут быть выровнены с использованием способов и компьютерных программ, включая BLAST, доступных по всему миру в сети интернет ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Другой алгоритм выравнивания представляет собой FASTA, доступный пакет Genetics Computing Group (GCG) от Madison, Wis., USA. Другие методы выравнивания описаны в Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc. Особый интерес представляют программы выравнивания, которые допускают пробелы в последовательности. Смит-Ватерман представляет собой один тип алгоритма, который допускает разрывы в выравниваниях последовательностей. Смотрите Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997). Кроме того, программа GAP, использующая способ выравнивания Needleman и Wunsch может использоваться для выравнивания последовательностей. Смотрите J. Mol. Biol. 48: 443-453 (1970).

[0043] Представляет интерес программа BestFit, использующая алгоритм локальной гомологии Смита и Ватермана (1981, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489) для определения идентичности последовательности. Штраф за генерацию пропуска, как правило, колеблется от 1 до 5, обычно от 2 до 4, и во многих вариантах осуществления будет составлять 3. Штраф за расширение пропуска, как правило, колеблется от 0,01 до 0,20 и во многих случаях будет составлять 0,10. Программа имеет параметры по умолчанию, определенные последовательностями, введенными для сравнения. Предпочтительно, идентичность последовательности определяется с использованием параметров по умолчанию, определенных программой. Эта программа доступна также из пакета Genetics Computing Group (GCG) от Madison, Wis., USA.

[0044] Другая программа, представляющая интерес, представляет собой алгоритм FastDB. FastDB описан в Current Methods in Sequence Comparison and Analysis, Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1988, Alan R. Liss, Inc.

[0045] Процентная идентичность последовательности вычисляется по FastDB на основе следующих параметров:: Штраф за несоответствие: 1.00; Штраф за пропуск: 1.00; Штраф за размер пропуска: 0,33; и штраф за присоединение: 30.0.

[47] Представленное изобретение предусматривает модифицированные FXN гены.

Изобретение также предусматривает конструкты нуклеиновой кислоты, такой как векторы, которые включают, как часть своей последовательности, модифицированный FXN ген, например, оптимизированную FXN генную последовательность по содержанию GC, содержащую большие или меньшие количества нуклеотидов GC по сравнению с немутантного типа FXN генной последовательностью и/или FXN генной последовательностью, имеющей пониженные уровни CpG динуклеотидов по сравнению с уровнем CpG динуклеотидов, присутствующих в немутантного типа FXN гене. Например, изобретение включает плазмиды и/или другие векторы, которые включают модифицированную FXN последовательность вместе с другими элементами, такими как регуляторные элементы. Кроме того, изобретение предусматривает упакованный носитель для доставки гена, такой как вирусный капсид, включая модифицированную FXN последовательность. Изобретение также включает способы доставки и, предпочтительно, экспрессирования модифицированного FXN гена путем доставки модифицированной последовательности в клетку вместе с элементами, требуемыми для стимулирования экспрессии в клетке. Изобретение также предусматривает способы генной терапии, в которых модифицированная FXN генная последовательность вводится субъекту, например, в качестве компонента вектора и/или упакованного как компонент носителя вирусной доставки гена. Лечение может быть, например, эффективным для увеличения уровней фратаксина у субъекта и лечения дефицита фратаксина у субъекта. Каждый из этих аспектов изобретения обсуждается далее в следующих разделах. Модифицированная нуклеиновая кислота для экспрессии фратаксина

[48] Изобретение предусматривает модифицированную нуклеотидную последовательность, кодирующую фратаксин. Модифицированная нуклеотидная последовательность включает немутантного типа или нативную FXN генную последовательность, включая одну или больше модификаций.

[49] В одном аспекте, модифицированная последовательность нуклеиновой кислоты обеспечивает значительно более высокий уровень экспрессии фратаксина в клетке по сравнению с экспрессией фратаксина из немутантного типа последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 при иных обстоятельствах идентичной клетки. Это может называться как "оптимизированная экспрессия" или "улучшенная экспрессия" нуклеиновой кислоты, или просто, как "модифицированная нуклеиновая кислота."

[50] "Оптимизированная" или "кодон-оптимизированная" как упоминается взаимозаменяемо в данном документе, касается кодирующей последовательности, которая была оптимизирована относительно немутантного типа кодирующей последовательности (например, кодирующей последовательности для фратаксина) для увеличения экспрессии кодирующей последовательности, например, путем минимизации использования редких кодонов, уменьшения количества CpG динуклеотидов, удаления донорных или акцепторных сайтов криптографического сплайсинга, удаления последовательностей Козака, удаления сайтов рибосомного входа, и тому подобного.

[51] Примеры модификаций включают в себя устранение одного или нескольких цис-действующих мотивов и введение одной или нескольких последовательностей Козака. В одном варианте осуществления один или несколько цис-действующих мотивов исключаются и вводятся одна или несколько последовательностей Козака.

[52] Примеры цис-действующих мотивов, которые могут быть устранены, включают внутренние ТАТА-боксы; chi-сайты; сайты рибосомного входа; ARE, INS, и/или CRS элементы последовательности; повторяющиеся последовательности и/или вторичные структуры РНК; (криптические) донорные и/или акцепторные сайты сплайсинга, точки ветвления; и Sall.

[53] В одном варианте осуществления, содержание GC (например, количество G и С нуклеотидов, присутствующих в последовательности нуклеиновой кислоты) увеличивается по сравнению с немутантного типа FXN генной последовательностью SEQ ID NO: 2. Содержание GC предпочтительно составляет, по меньшей мере, на 5%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 6%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 7%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 8%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 9%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 10%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 12%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 14%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 15%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 17%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 20%, даже особенно предпочтительно, по меньшей мере, на 30%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 40%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 50%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 60%, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере, на 70% больше, чем у немутантного типа гена (SEQ ID NO: 2).

[54] В другом варианте осуществления, содержание GC выражается в процентах от нуклеотидов G (гуанин) и С (цитозин) в последовательности. То есть, содержание GC в немутантного типа нуклеиновой кислоте, кодирующей фратаксин (SEQ ID NO: 1), составляет приблизительно 55%, тогда как содержание GC типичных модифицированных FXN генов согласно изобретению находится в диапазоне от приблизительно 57% для IDT-3 (SEQ ID NO: 8), 57% для Genescript (SEQ ID NO: 6); 61% для GeneArt (SEQ ID NO: 5), и 69% для JCAT (SEQ ID NO: 4). Таким образом, модифицированная нуклеиновая кислота согласно изобретению содержит, по меньшей мере 57%, более предпочтительно, содержание GC по меньшей мере 61%, еще более предпочтительно, содержание GC по меньшей мере 69%, по сравнению с содержание GC приблизительно 55% немутантного типа последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей фратаксин как представлено в SEQ ID NO: 2.

[55] В одном варианте осуществления, содержание GC в модифицированной нуклеиновой кислоте согласно изобретению является больше, чем содержание GC в немутантного типа нуклеиновой кислоте, кодирующей фратаксин, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2. Квалифицированному специалисту в данной области было бы понятно, что, зная вырождение кода нуклеиновой кислоты, независимо от последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, аминокислотная последовательность экспрессируемого из нее фтатаксина представляет собой предпочтительно аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

[56] В одном варианте осуществления, содержание GC в модифицированной нуклеиновой кислоте, кодирующей FXN согласно изобретению является приблизительно такой же, то есть, 55%, как и содержание GC в немутантного типа FNX гене (SEQ ID NO: 2).

[57] Кроме того, индекс адаптации кодонов модифицированной нуклеиновой кислоты, кодирующей фратаксин (то есть, модифицированный FXN ген) составляет предпочтительно, по меньшей мере, 0,74, предпочтительно, по меньшей мере, 0,76, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 0,77, еще более предпочтительно, по меньшей мере 0,80, предпочтительно, по меньшей мере, 0,85, более предпочтительно, по меньшей мере, 0,86, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 0,87, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 0,90, еще более предпочтительно, по меньшей мере, 0,95, и наиболее предпочтительно, по меньшей мере 0,98.

[58] В другом варианте осуществления модифицированная FXN последовательность имеет пониженный уровнь CpG динуклеотидов который представляет собой уменьшение приблизительно на приблизительно 10%, 20%, 30%, 50% или более, по сравнению с немутантного типа последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей FXN (например, SEQ ID NO: 2).

[59] Известно, что метилирование CpG динуклеотидов играет важную роль в регуляции экспрессии генов у эукариот. В частности, метилирование CpG динуклеотидов у эукариот по существу служит для молчания экспрессии генов путем вмешательства в механизм транскрипции. Таким образом, из-за сайленсинга гена, вызванного метилированием мотивов CpG, нуклеиновые кислоты и векторы согласно изобретению имеющие уменьшенное количество CpG динуклеотидов, будут обеспечивать высокий и длительный уровень экспрессии трансгена.

[60] В одном варианте осуществления, модифицированный FXN ген содержит меньше потенциальных CpG островковых областей, чем немутантного типа FXN ген, то есть, 128. Предпочтительно, модифицированный FXN ген содержит приблизительно 124 потенциальных CpG островковых областей, более предпочтительно, приблизительно 123, еще более предпочтительно, приблизительно 117, и более предпочтительно, приблизительно 114 потенциальных CpG островковых областей.

[61] Модифицированная FXN генная последовательность может также включать фланкирующие сайты рестрикции для облегчения субклонирования в вектор экспрессии.

Многие такие сайты рестрикции хорошо известны в данной области, и включают, но не ограничиваются этим, те, которые показаны на фигурах 2A-2F, и фигуре 3 (плазмидная карта scAAV плазмидного вектора pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH) и таблицы 8 (SEQ ID NO: 19-23), такие как, Agel, Avrll, Spel и Mlul.

[62] Изобретение также включает фрагменты какой-либо одной из последовательностей SEQ ID NO: 3 по 9, которые кодируют функционально активный фрагмент фратаксина. "Функционально активный" или "функциональный фратаксин" указывает на то, что фрагмент обеспечивает такую же или подобную биологическую активность как и полноразмерный фратаксин. То есть, фрагмент предусматривает такую же активность, включая, но не ограничиваются этим, коррекцию первичного Fe-S дефицита кластеров,, уменьшение накопления митохондриального железа (Pucclo et al., 2001, Nature Genetics 27:181-186; Seznec et al., 2004, Human Mol. Genet. 13:1017-1024) и другие недостатки, как обсуждается в Perdomini et al., 2014, Nature Med. 20(5):542-547. Биологическая активность FXN, или его функциональный фрагмент, также охватывает улучшение состояния или предотвращения сердечного фенотипа, связанного с FRDA, как показано в другом месте в данном документе у Mck мышей.

[63] Изобретение включает вектор нуклеиновой кислоты, включающий модифицированную FXN генную последовательность и различные регуляторные или контрольные элементы. Точный характер регуляторных элементов, полезных для экспрессии генов, будет варьироваться от организма к организму и от типа клеток до типа клеток. В общем, они включают промотор, который направляет инициирование транскрипции РНК в клетке, представляющей интерес. Промотор может быть конститутивным или регулируемым. Конститутивные промоторы представляют собой те, которые приводят к тому, что функционально связанный ген экспрессируется по существу во все времена. Регулируемые промоторы представляют собой те, которые могут быть активироваными или дезактивироваными. Регулируемые промоторы включают индуцибельные промоторы, которые обычно являются "выключенными", но которые могут быть индуцированы для переключения на "включено", и "репрессируемые" промоторы, которые обычно являются «включенными», но могут быть переключены на "выключено". Многие различные регуляторы известны, включая температуру, гормоны, цитокины, тяжелые металлы и регуляторные белки. Различия не являются абсолютными; конститутивный промотор часто может регулироваться до некоторой степени. В некоторых случаях эндогенный путь может быть использован для обеспечения регуляции экспрессии трансгена, например, с использованием промотора, который естественным образом регулируется, когда улучшается патологическое состояние.

[64] Примеры подходящих промоторов включают аденовирусные промоторы, такие как аденовирусный основной поздний промотор; гетерологичные промоторы, такие как промотор цитомегаловируса (CMV); промотор респираторного синцитиального вируса; промотор вируса саркомы Rous (RSV); промотор альбумина; индуцибельные промоторы, такие как промотор вируса опухоли молочной железы мышей (MMTV); промотор металлотионеина; промоторы теплового шока; промотор α-1-антитрипсина; поверхностный антиген гепатита В; промотор трансферрина; промотор аполипопротеина А-1; промотор куриного бета-актина СВА), CBh промотор (SEQ ID NO: 25), и CAG промотор (элемент цитомегаловирусного раннего енхансера и промотор, первый экзон и первый интрон гена куриного бета-актина и акцептор сплайсинга гена бета-глобина кролика) (Alexopoulou et al., 2008, BioMed. Central Cell Biol. 9:2), и человеческие FXN промоторы. Промотор может представлять собой тканеспецифический промотор, такой как промотор альбумина мыши, который активен в клетках печени, а также промотор транстиретина (TTR).

[65] В другом аспекте, модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN, дополнительно содержит енхансер для увеличения экспрессии белка FXN. Многие енхансеры известны в данной области, включая, но не ограничиваются этим, цитомегаловирусный основной немедленный ранний энхансер. Более конкретно, CMV MIE промотор содержит три области: модулятор, уникальную область и энхансер (Isomura и Stinski, 2003, J. Virol. 77(6):3602-3614). Область CMV енхансера может быть комбинирована с другими промоторами или их частью с образованием гибридных промоторов для дальнейшего увеличения экспрессии нуклеиновой кислоты, функционально связанной с ним. Например, промотор куриного бета-актина (СВА), или его часть, может быть комбинирован с CMV промотором/енхансером, или его частью, чтобы сделать версию СВА, называемый промотором "CBh", который обозначает куриный бета-актиновый гибридный промотор, как описано в Gray et al. (2011, Human Gene Therapy 22:1143-1153).

[66] Кроме того, контрольные элементы могут включать последовательность стабилизации коллагена (CSS), стоп-кодон, последовательность терминации, и сигнальную последовательность полиаденилирования, такую как, но не ограничиваются этим, сигнальная последовательность бычьего гормона роста poly A (bGHpolyA), для введения эффективного добавления полиаденозинового "хвоста" на 3'-конце эукариотической мРНК (смотрите, например, Goodwin and Rottman, 1992, J. Biol. Chem. 267(23): 16330-16334).

Невирусные векторы

[67] В конкретном варианте осуществления, вектор, использованный в соответствии с изобретением, представляет собой невирусный вектор. Как правило, невирусный вектор может представлять собой плазмиду, которая включает последовательности нуклеиновых кислот, считывающих модифицированный FXN ген, или их варианты.

Упакованная модифицированная FXN последовательность

[68] Модифицированная FXN генная последовательность также может быть предоставлена в виде компонента упакованного вирусного вектора. В общем, упакованные вирусные векторы включают вирусный вектор, упакованный в капсид. Вирусные векторы и вирусные капсиды обсуждаются в следующих разделах. Нуклеиновая кислота, упакованная в вектор rAAV, может быть одноцепочечной (ss), самокомплементарной (sc), или двухцепочечной (ds).

Вирусный Вектор

[69] Как правило, вирусные векторы, несущие трансгены, собираются из полинуклеотидов, кодирующих трансген, подходящих регуляторных элементов и элементов, необходимых для продуцирования вирусных белков, которые опосредуют клеточную трансдукцию. Примеры вирусного вектора включают но не ограничиваются этим, аденовирусные, ретро вирусные, лентивирусные вирусы, вирусы герпеса и аденоассоциированные вирусы (AAV).

[70] Вирусный векторный компонент упакованных вирусных векторов, полученных в соответствии со способами согласно изобретению, включает, по меньшей мере, один трансген, например, модифицированную FXN генную последовательность и связанные с ним последовательности контроля экспрессии для контроля экспрессии модифицированной FXN генной последовательности.

[71] В предпочтительном варианте осуществления, вирусный вектор включает часть парвовирусного гена, такого как AAV геном с rep и cap удаленной и/или замещенной модифицированной FXN генной последовательностью и связанными с ней последовательностями контроля экспрессии. Модифицированная FXN генная последовательность является, как правило, вставленной рядом с одним или двумя (то есть, являются фланкированными) AAV TR, или TR элементами, адекватными для репликации вируса (Xiao et al., 1997, J. Virol. 71(2): 941-948), вместо нуклеиновой кислоты, кодирующей вирусные rep и cap белки. Также могут быть включены другие регуляторные последовательности, пригодные для использования в облегчении тканеспецифической экспрессии модифицированной FXN генной последовательности в клетке-мишени.

[72] Квалифицированному специалисту в данной области было бы понятно, что вектор AAV, содержащий трансген и отсутствие вирусных белков, необходимых для репликации вируса (например, cap и rep), не может быть реплицирован, поскольку такие белки необходимы для репликации и упаковки вируса. Кроме того, AAV представляет собой депендовирус, при этом он не может реплицироваться в клетке без соинфекции клетки хелперным вирусом. Хелперные вирусы включают, как правило, аденовирус или вирус простого герпеса. Альтернативно, как обсуждается ниже, хелперные функциональные элементы (Е1а, E1b, Е2а, Е4, и VA RNA) могут быть предоставлены в упаковывающей клетке, включая путем трансфекции клетки с одной или несколькими нуклеиновыми кислотами, кодирующими различные хелперные элементы и/или клетку может содержать нуклеиновую кислоту, кодирующую хелперный белок. Например, HEK 293 были получены путем трансформации клеток человека с ДНК аденовируса 5 и теперь экспрессируют ряд аденовирусных генов, включая, но не ограничиваются этим, Е1 и Е3 (смотрите, например, Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36:59-72). Таким образом, данные хелперные функциональные элементы могут быть предоставлены HEK 293 упаковывающей клеткой без необходимости их доставки в клетку, например, с помощью плазмиды, кодирующей их.

[73] Вирусный вектор может представлять собой какой-либо подходящий конструкт нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК конструкт, и может быть одноцепочечным, двухцепочечным, или дуплексным (то есть, самокомплементарным, как описаный в WO 2001/92551).

[74] Квалифицированному специалисту в данной области было бы понятно, что вектор rAAV может дополнительно включать в себя последовательность "лишний" или "наполнитель" (наполнитель/лишний), причем нуклеиновая кислота, содержащая трансген составляет меньше, чем размер приблизительно от 4,1 до 4,9 т.о. для оптимальной упаковки нуклеиновой кислоты в AAV капсид. Смотрите, Grieger и Samulski, 2005, J. Virol. 79(15):9933-9944. То есть векторы AAV обычно принимают вставки ДНК, имеющей определенный диапазон размеров, который обычно составляет от приблизительно 4 до приблизительно 5,2 т.о. или немного больше. Таким образом, для более коротких последовательностей включение наполнителя/лишнего в фрагмент вставки для того, чтобы отрегулировать длину до близкого или нормального размера вирусной геномной последовательности, приемлемой для AAV вектора, упаковывающегося в вирусную частицу. В различных вариантах осуществления, наполнительная/лишняя последовательность нуклеиновой кислоты представляет собой нетранслируемый (небелковый кодирующий) сегмент нуклеиновой кислоты. В конкретных вариантах осуществления вектора rAAV гетерологичная полинуклеотидная последовательность имеет длину меньше, чем 4,7 т.о., и наполнительная/лишняя полинуклеотидная последовательность имеет длину, которая при комбинировании (например, вставленные в вектор) с гетерологичной полинуклеотидной последовательностью, имеет общую длину от приблизительно 3,0 до 5,5 т.о., или от приблизительно 4,0 до 5,0 т.о., или от приблизительно 4,3 до 4,8 т.о.

[75] Интрон может также функционировать в качестве наполнительной/лишней полинуклеотидной последовательности для того, чтобы достичь длины для упаковки AAV-вектора в вирусную частицу Интроны и интронные фрагменты, которые функционируют в качестве наполнительной/лишней полинуклеотидной последовательности также могут усилить экспрессию. Например, включение интронного элемента может усилить экспрессию по сравнению с экспрессией в отсутствие интронного элемента (Kurachi et al., 1995, J. Biol. Chem. 270(10):5276-5281). Кроме того, наполнительные/лишние полинуклеотидные последовательности хорошо известны в данной области и включают, но не ограничиваются этим, те, которые описаны в WO 2014/144486.

Вирусный капсид

[76] Вирусный капсидный компонент упакованных вирусных векторов может представлять собой паравирусный капсид. AAV Сар и химерный капсиды являются предпочтительными. Примеры подходящих парвовирусных вирусных капсидных компонентов включают капсидные компоненты из семейства Parvoviridae, такого как автономный парвовирус или депендовирус.Например, вирусный капсид может представлять собой AAV капсид (например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7 AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6,3.1, AAV9.45, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1 (SEQ ID NO: 5 из WO 2015/013313), AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N, AAV-LK03, змеиный AAV, aviAAV, бычий AAV, собачий AAV, конский AAV, овечий AAV, козий AAV, креветочный AAV, и какой-либо другой AAV известный на данный момент или позднее обнаруженные. Смотрите, например, Fields et al., VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4^th ed., Lippincott-Raven Publishers). Капсиды могут быть получены из ряда серотипов AAV, раскрытых в патенте США No. 7,906,111; Gao et al., 2004, J. Virol. 78:6381; Moris et al., 2004, Virol. 33:375; WO 2013/063379; WO 2014/194132; и включают варианты истинного типа AAV (AAV-TT), раскрытые в WO 2015/121501, и RHM4-1, RHM15-1 по RHM15-6, и их варианты, раскрытые в WO 2015/013313, и специалист в данной области знает, что вероятнее всего другие варианты, которые еще не определены, выполняют ту же или подобную функцию, или могут включать компоненты из двух или более AAV капсидов. Полный комплемент AAV Сар белков включает VP1, VP2, и VP3. ORF, содержащая нуклеотидные последовательности, кодирующие AAV VP капсидные белки, может содержать меньше, чем полный комплемент AAV Сар белков или полный комплемент AAV Сар белков может быть предусмотрен.

[77] Один или несколько белков AAV Сар могут представлять собой химерный белок, включая аминокислотные последовательности AAV Сар из двух или больше вирусов, предпочтительно двух или больше AAV, как описано в Rabinowitz et al., патенте США 6,491,907, полное раскрытие которых включено в данный документ в качестве ссылки.

Например, химерный вирусный капсид может включать AAV1 Сар белок или субединицу и, по меньшей мере, один AAV2 Сар или субединицу. Химерный капсид может, например, включать AAV капсид с одной или несколькими В19 Сар субъединицами, например, AAV Сар белок или субединица может быть замещенной на В19 Сар белок или субединицу. Например, в предпочтительном варианте осуществления, Vp3 субединица AAV капсида может быть замещенной на Vp2 субединицу В19.

[78] Другой вариант осуществления включает химерные вирусные штаммы, синтезированные, включающие комбинацию AAV-скелетов из AAV2, AAV3, AAV6, AAV8 и т.д., с галактозой (Gal), связывающей область узнавания от AAV9. Аденоассоциированные вирусы (AAV) представляют собой хелпер-зависимые парвовирусы, которые используют гепарана сульфат (HS), галактозу (Gal) или сиаловые кислоты (Sia) в качестве первичных рецепторов для связывания поверхности клеток. Например, AAV серотипы 2 и 3b используют HS. AAV1, 4 и 5 связывают Sia с различными специфическими связями, серотипом AAV 6, который распознает как Sia, так и HS, тогда как AAV9 использует Gal для прикрепления клеток-хозяев. В частности, галактоза (Gal) связывающая область узнавания от AAV9 была привита на связывающий гепарин сульфат AAV серотип 2 и только прививка ортогональных гликан связывающих областей узнавания улучшает эффективность трансдукции. Новый двойной гликан-связывающий штамм (AAV2G9) и химерный, мышечно-тропический штамм (AAV2i8G9) были получены путем включения Gal-связующей области узнавания из AAV9 в основную цепь AAV2 VP3 или химерную матрицу капсида AAV2i8 с использованием структурного выравнивания и сайт-направленного мутагенеза, Исследования на связывание и трансдукцию in vitro подтвердили использование как HS, так и Gal-рецепторов AAV2G9 для клеточного ввода. Последующая in vivo характеристика кинетики трансгенной экспрессии и профилей биораспределения векторного генома указывает на быструю, устойчивую и усиленную экспрессию трансгена с помощью этого рационально сконструированного химерного штамма AAV. Аналогичный улучшенный профиль трансдукции наблюдался с детерминированной печенью, мышц-специфической химерной AAV2i8G9 (Shen, et al., 2013, J. Biol., Chem., 288 (4): 28814-28823). Такая новая прививочная комбинация полностью описана в WO 2014/144229, содержание которой включено в данный документ в качестве ссылки. Дополнительные печень- ненацеленными AAV, такие как AAV9.45, описаны в Pulicherla et al., 2011, Molecular Therapy 19 (6): 1070-1078, содержание которых включено в качестве ссылки, так если бы они были представлены в данном документе полностью.

[79] В еще одном варианте осуществления представленное изобретение предусматривает использование анцестральных AAV векторов для применения в терапевтической in vivo генной терапии. В частности, виртуально полученные последовательности были синтезированы de novo и охарактеризованы касательно биологических активностей. Эти усилия привели к генерации девяти функциональных предполагаемых анцестральных AAV и идентификации Anc80, предсказанного предка AAV серотипов 1, 2, 8 и 9 (Zinn et al., 2015, Cell Reports 12:1056-1068). Предсказание и синтез таких анцестральных последовательностей в дополнение к сбору в вирусную частицу могут быть выполнены с использованием способов, описанных в WO 2015/054653, содержания которых включены в качестве ссылки в данный документ. Примечательно, что использование вирусных частиц, собранных из анцестральных вирусных последовательностей демонстрирует сниженную восприимчивость к ранее существовавшему иммунитету в современной человеческой популяции, чем современные вирусы или их части.

Продуцирование упакованного вирусного вектора

[80] Изобретение включает в себя упаковочные клетки, которые охватываются «клетками-хозяевами», которые могут быть культивированы для получения упакованных вирусных векторов согласно изобретению. Упаковывающие клетки согласно изобретению обычно включают клетки с гетерологичной (1) вирусной векторной функцией (функциями), (2) упаковывающей(ими) функцией(ями), и (3) хелперный(ые) функциональный(ые) элемент(ы). Каждая из этих компонентных функций обсуждается в следующих разделах.

[81] Первоначально векторы могут быть сконтруированы несколькими способами, известными квалифицированным специалистам (смотрите, например, WO 2013/063379). Предпочтительный способ описан в Grieger, et al. 2015, Molecular Therapy 24(2):287-297, содержания которых включены в качестве ссылки в данный документ для всех целей. Вкратце, эффективная трансфекция клеток HEK293 используется в качестве отправной точки, в которой адгезивная клеточная линия HEK293 из квалифицированного клинического банка клеток-хозяев используется для выращивания в условиях суспензии без животных компонентов в шейкерных колбах и биореакторах WAVE, что позволяет быстрое и масштабируемое продуцирование rAAV. Используя способ тройной трансфекции (например, WO 96/40240), суспензионная клеточная линия HEK293 генерирует больше, чем 1×10⁵ векторного генома, содержащего частицы (уд)/клетка или больше, чем 1×10¹⁴ vg/л культуры клеток при сборе через 48 часов после трансфекции. Более конкретно, тройная трансфекция относится к тому факту, что упаковывающая клетка трансфицируется тремя плазмидами: одна плазмида кодирует гены AAV rep и cap, другая плазмида кодирует различные хелперные функциональные элементы (например, аденовирус или HSV белки, такие как Е1а, E1b, Е2а, Е4, и VA RNA, и другая плазмида кодирует трансген и его различные контрольные элементы (например, модифицированный FXN ген и CBh промотор).

[82] Для достижения желаемых результатов оптимизируется ряд переменных, таких как выбор совместимой бессывороточной суспензионной среды, которая поддерживает как рост, так и трансфекцию, выбор трансфекционного реагента, условия трансфекции и плотность клеток. Была также разработана универсальная стратегия очистки, основанная на методах ионообменной хроматографии, которая привела к созданию высокочистых векторных препов серотипов AAV 1-6, 8, 9 и различных химерных капсидов. Этот удобный для пользователя процесс может быть завершен в течение одной недели, что в результате приводит к высоким коэффициентам заполнения до нуля (>90% полных частиц), обеспечивает выходы после очистки (>1×10¹³ vg/л) и чистоту, пригодную для клинических применений, и является универсальной по отношению ко всем серотипам и химерным частицам. Эта масштабируемая технология производства была использована для производства GMP клинических векторов AAV фазы I для неоваскуляризации сетчатки (AAV2), гемофилии В (scAAV8), гигантской аксональной нейропатии (scAAV9) и ретинита пигментозы (AAV2), которые вводились пациентам. Кроме того, как минимум 5-кратное увеличение общего продуцирования векторов путем внедрения способа перфузии, который влечет за собой сбор rAAV из культуральной среды при многочисленных посттрансфекциях по времени.

Вирусные векторные функции

[83] Упаковывающие клетки согласно изобретению включают вирусные векторные функции, вместе с упаковывающими и векторными функциями. Вирусные векторные функции, как правило, включают часть парвовирусного генома, такого как AAV геном, с удоленными и замещенными rep и cap модифицированной FXN последовательностью и связанными с ней последовательностями контроля экспрессии. Вирусные векторные функции включают достаточные последовательности контроля экспрессии, что в результате приводит у репликации вирусного вектора для упаковки. Как правило, вирусный вектор включает часть парвовирусного генома, такого как AAV геном с удаленными и замещенными rep и cap трансгеном и связанными с ним последовательностями контроля экспрессии. Трансген, как правило, фланкирован двумя AAV TR, вместо удаленных вирусных rep и cap ORF. Включенными являются соответствующие последовательности контроля экспрессии, такие как тканеспецифический промотор и другие регуляторные последовательности, подходящие для использования для облегчения тканеспецифической экспрессии трансгена в клетке-мишени. Трансген обычно представляет собой последовательность нуклеиновой кислоты, которая может быть экспрессирована для получения терапевтического полипептида или маркерного полипептида.

[84] "Дуплексные векторы" могут взаимозаменяемо упоминаться в данном документе как «димерные» или "самокомплементарные" векторы. Дуплексные парвовирусные частицы могут, например, содержать панвирусный капсид, содержащий вирион ДНК (vДHK). vДHK является самокомплементарной так что она может образовывать шпилечную структуру после высвобождения из вирусного капсида. Дуплексная vДHK, по-видимому, обеспечивает клетке-хозяину двухцепочечную ДНК, которая может быть экспрессирована (то есть транскрибирована и, необязательно, транслирована) клеткой-хозяином, без необходимости синтеза второй цепи, как требуется с обычными векторами парвовируса. Дуплексные/самокомплементарные rAAV векторы хорошо известны в данной области и описаны, например, в WO 2001/92551, WO 2015/006743, и многих других.

[85] Вирусные векторные функции могут быть надлежащим образом представлены в виде дуплексных векторных шаблонов, как описано в патенте США No. 7,465,583 Samulski et al. (полное раскрытие которого включено в данный документ в качестве ссылки для его обучения в отношении дуплексных векторов). Дуплексные векторы представляют собой димерные самокомплементарные (sc) полинуклеотиды (как правило, ДНК). Дуплексный векторный геном предпочтительно содержит достаточные упаковывающие последовательности для инкапсидирования пределах выбранного парвовирусного капсида (например, AAV капсид). Квалифицированный специалист в данной области поймет, что дуплексная vДHK может не существовать в двухцепочечной форме при любых условиях, но обладает способностью делать это в условиях, которые способствуют отжигу комплементарных нуклеотидных оснований. "Дуплексная парвовирусная частица" охватывает гибридные, химерные и целевые вирусные частицы. Предпочтительно, дуплексная парвовирусная частица имеет AAV капсид, который может далее быть химерным или целевым капсидом, как описано выше.

[86] Вирусные векторные функции могут быть соответственно предоставлены в виде дуплексных векторных темплатов, как описано в патенте США No. 7,465,583 Samulski et al. (полное раскрытие которого включено в данный документ в качестве ссылки для его обучения в отношении дуплексных векторов). Дуплексным векторы представляют собой димерные самокомплементарные (sc) полинуклеотиды (как правило, ДНК). Например, ДНК дуплексных векторов может быть выбрана так, чтобы образовать структуру с двумя цепочками шпилек из-за внутриповерхностного спаривания. Обе нити дуплексных ДНК-векторов могут быть упакованы внутри вирусного капсида. Дуплексный вектор обеспечивает функцию, сравнимую с двухцепочечными ДНК-вирусными векторами, и может облегчить потребность клетки-мишени для синтеза комплементарной ДНК в одноцепочечном геноме, обычно инкапсулированном вирусом.

[87] TR(s) (разрешимые и неразрешимые), выбранные для использования в вирусных векторах, предпочтительно представляют собой последовательности AAV, причем серотипы 1, 2, 3, 4, 5 и 6 являются предпочтительными. Разрешимые AAV TR не должны иметь немутантного типа TR последовательность (например, немутантного типа последовательность может быть изменена путем вставки, удаления, усечения или миссенс-мутаций), если TR связывает желаемые функции, например, упаковку вирусов, интеграцию, и/или провирусное спасение, и тому подобного. TR могут представлять собой синтетические последовательности, которые функционируют как AAV инвертированные терминальне повторы, такие как "двойная -D последовательность" как описано в патенте США №5,478,745 Samulski et al., полное раскрытие которого включено во всей своей полноте в данный документ в качестве ссылки. Как правило, но необязательно, TRs относятся к одному и тому же парвовирусу, например, обе TR последовательности из AAV2

[88] Упаковывающие функции включают капсидные компоненты. Капсидные компоненты предпочтительно представляют собой парвовирусный капсид, такой как AAV капсид или химерная AAV капсидная функция. Примерами подходящих парвовирусных вирусных капсидных компонентов являются капсидные компоненты из семейства Parvoviridae, такие как автономный парвовирус или депендовирус. Например, капсидные компоненты могут быть выбраны из капсидов AAV капсидов, например, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1 (SEQ ID NO: 15), AAV2.5 (SEQ ID NO. 13), AAV6.1 (SEQ ID NO: 17), AAV6.3.1 (SEQ ID NO: 18), AAV9.45, AAV2i8 (SEQ ID NO: 29), AAV2G9, AAV2i8G9, AAV2-TT (SEQ ID NO: 31), AAV2-TT-S312N (SEQ ID NO: 33), AAV3B-S312N, и AAV-LK03, а также другие новые капсиды, еще не идентифицированные или от источников приматов, отличных от человека. Капсидные компоненты могут включать компоненты из двух или более капсидов AAV.

[89] В более предпочтительном варианте осуществления один или несколько из капсидных белков VP представляют собой химерный белок, содержащий аминокислотные последовательности из двух или более вирусов, предпочтительно двух или более AAV, как описано в Rabinowitz et al., патенте США 6,491,907. Химерный капсид описан в данном документе, как имеющий, по меньшей мере, один аминокислотный остаток из одного серотипа в сочетании с другим серотипом, который достаточен для модификации а) вирусного выхода, b) иммунного ответа, с) нацеливания, d) денацеливания, и т.д.

[90] Другие химерные белки могут быть получены по инструкции, изложенной в Li, et al., 2008, Mol. Ther. 16(7): 1252-1260, содержание которых включено в качестве ссылки в данный документ. В частности, подход, основанный на перетасовке ДНК, использовался для разработки векторов, специфичных для конкретного типа клеток, посредством направленной эволюции. Капсидные геномы аденоассоциированного вируса (AAV) серотипы 1-9 были случайным образом фрагментированы и повторно собраны с использованием ПЦР для генерации химерной библиотеки капсидов. Один инфицированный клон (химерный-1829), содержащий геномные фрагменты из AAV1, 2, 8 и 9, был выделен из линии клеток интегрина минус хомячка меланомы, ранее показанной, что она имеет низкую допустимость к AAV. Исследования молекулярного моделирования показывают, что AAV2 вносит вклад в поверхностные петли на икосаэдрической трехмерной оси симметрии, тогда как AAV1 и 9 вносят вклад в двух- и пятикратные взаимодействия симметрии соответственно. С-терминальный домен (AAV9) был идентифицирован как критическая структурная детерминанта тропизма меланомы посредством рационального мутагенеза. Химерный-1829 использует гепарансульфат в качестве первичного рецептора и трансформирует клетки меланомы более эффективно, чем все серотипы. Применение этой технологии для альтернативных типов клеток / тканей с использованием AAV или других вирусных капсидных последовательностей, вероятно, даст новый класс биологических наночастиц в качестве векторов для переноса генов человека.

[91] Упакованный вирусный вектор обычно включает модифицированную последовательность гена FXN и последовательности контроля экспрессии, фланкированные элементами TR, обозначенные в данном документе как «трансген» или «трансгенная экспрессионная кассета», достаточные для обеспечения упаковки векторной ДНК и последующей экспрессии модифицированной FXN генной последовательности в трансдуцированную клетку. Вирусные векторные функции, например, могут подаваться в клетку в виде компонента плазмиды или ампликона. Вирусные векторные функции могут существовать экстрахромосом но внутри клеточной линии и/или могут быть интегрированы в хромосомную ДНК клетки.

[92] Может использоваться какой-либо способ введения нуклеотидной последовательности, несущей вирусные векторные функции в клеточный хозяин для репликации и упаковывания, включая, но не ограничиваются этим, электропорацию, осаждение фосфатом кальция, микроинъекцию, катионные или анионные липосомы и липосомы в комбинации с сигналом ядерной локализации. В вариантах осуществления в которых вирусные векторные функции обеспечиваются трансфекцией с использованием вирусного вектора; могут использоваться стандартные способы получения вирусной инфекции.

Упаковывающие функции

[93] Упаковывающие функции включают гены для репликации и упаковки вирусных векторов. Таким образом, например, упаковывающие функции могут включать в себя необходимые функции для экспрессии вирусного гена, репликации вирусного вектора, спасения вирусного вектора из интегрированного состояния, экспрессии вирусного гена и упаковки вирусного вектора в вирусную частицу. Упаковывающие функции могут поставляться вместе или отдельно в упаковывающую клетку с использованием генетического конструкта, такого как плазмида или ампликон, бакуловирус, или HSV хелперный конструкт. Упаковывающие функции могут существовать экстрахромосомно внутри упаковывающей клетки, но предпочтительно интегрированы в хромосомную ДНК клетки. Примеры включают гены, кодирующие AAV Rep и Сар белки.

Хелперные функциональные элементы

[94] Хелперные функциональные элементы включают хелперные вирусные элементы, необходимые для установления активного заражения упаковывающей клетки, что необходимо для начала упаковки вирусного вектора. Примеры включают функции, полученные из аденовируса, бакуловируса и/или вируса герпеса, достаточные для того, чтобы в результате привести к упаковке вирусного вектора. Например, аденовирусные хелперные функциональные элементы, как правило, будут включать аденовирусные компоненты Е1а, E1b, Е2а, Е4, и VA RNA. Упаковывающие функции могут быть обеспечены путем заражения упаковывающей клетки необходимым вирусом. Упаковывающие функции могут поставляться вместе или отдельно в упаковывающую клетку с использованием генетического конструкта, такого как плазмида или ампликон. Смотрите, например, pXR хелперные плазмиды, как описано в Rabinowitz et al., 2002, J. Virol. 76:791, и pDG плазмиды, описанные в Grimm et al., 1998, Human Gene Therapy 9:2745-2760. Упаковывающие функции могут существовать экстрахромосомно внутри упаковывающей клетки, но предпочтительно интегрированы в хромосомную ДНК клетки (например, Е1 или Е3 в НЕК 293 клетках).

[95] Использованными могут быть какие-либо подходящие хелперные вирусные функции. Например, когда упаковывающие клетки представляют собой клетки насекомых, бакуловирус может служить как хелперный вирус. Вирус герпеса может также использоваться в качестве хелперного вируса в AAV упаковывающих способах. Гибридные вирусы герпеса, кодирующие белок (ы) AAV Rep, могут преимущественно способствовать созданию более масштабируемых схем производства AAV векторов.

[96] Использованным может быть какой-либо способ введения нуклеотидной последовательности, несущей хелперные функциональные элементы в клеточный хозяин для репликации и упаковки, включая, но не ограничиваясь ими, электропорацию, осаждение фосфатом кальция, микроинъекцию, катионные или анионные липосомы и липосомы в сочетании с сигнал ядерной локализации. В вариантах осуществления в которых хелперные функциональные элементы предоставляются посредством трансфекции с использованием вирусного вектора или инфекции с использованием хелперного вируса; стандартные способы получения вирусной инфекции могут быть использованы.

Упаковывающая клетка

[97] Какая-либо подходящая разрешающая или упаковывающая клетка, известная в данной области, может быть использована для получения упакованного вирусного вектора. Предпочтительными являются клетки млекопитающих или клетки насекомых. Примеры клеток, пригодных для продуцирования упаковывающих клеток в практике изобретения, включают, например, клеточные линии человека, такие как клетки VERO, WI38, MRC5, А549, HEK 293 клетки (которые экспрессируют функциональный аденовирусный Е1 под контролем конститутивного промотора), В-50 или какие-либо другие HeLa клетки, HepG2, Saos-2, HuH7, и НТ1080 клеточные линии. В одном аспекте, упаковывающая клетка способна расти в суспензионной культуре, более предпочтительно клетка способна расти в культуре без сыворотки. В одном варианте осуществления, упаковывающая клетка представляет собой HEK293, которая растет в суспензии в бессывороточной среде. В другом варианте осуществления, упаковывающая клетка представляет собой HEK293 клетку, описаную в в патенте США №9,441,206 и депонированную как АТСС No. РТА 13274. В данной области известны многочисленные rAAV упаковывающие клеточные линии, включая, но не ограничиваются этим, те, которые раскрыты в WO 2002/46359.

[98] Клеточные линии для использования в качестве упаковывающих клеток включают линии клеток насекомых. Клеточные линии для использования в качестве упаковочных клеток включают линии клеток насекомых. В соответствии с представленным изобретением использованными могут быть какие-либо клетки насекомого, которые позволяют реплицировать AAV и которые могут поддерживаться в культуре. Примеры включают Spodoptera frugiperda, такие как Sf9 или Sf21 клеточные линии, Drosophila spp. клеточные линии, или клеточные линии москитов, например, производные Aedes albopictus клеточные линии. Предпочтительная клеточная линия представляет собой Spodoptera frugiperda Sf9 клеточную линию. Следующие ссылки включены в данный документ для их учения относительно использования клеток насекомых для экспрессии гетерологичных полипептидов, способов введения нуклеиновых кислот в такие клетки и способов поддержания таких клеток в культуре: Methods in Molecular Biology, ed. Richard, Humana Press, NJ (1995); O'Reilly et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual, Oxford Univ. Press (1994); Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828; Kajigaya et al., 1991, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 88: 4646-4650; Ruffing et al., 1992, J. Virol. 66:6922-6930; Kimbauer et al., 1996, Virol. 219:37-44; Zhao et al., 2000, Virol. 272:382-393; and Samulski et al., U.S. Pat. No. 6,204,059.

[99] Вирусные капсиды в соответствии с изобретением могут быть получены с использованием какого-либо способа, известного в данной области, например, путем экспрессии из бакуловируса (Brown et al., (1994) Virology 198:477-488). В качестве дополнительной альтернативы вирусные векторы согласно изобретению могут быть получены в клетках насекомых с использованием векторов бакуловируса для доставки генов гер/сар и rAAV темплаты как описано, например, Urabe et al., 2002, Human Gene Therapy 13:1935-1943.

[100] В другом аспекте, представленное изобретение предусматривает способ rAAV продуцирования в клетках насекомых, в котором может быть сконструирована система или векторы упаковки бакуловируса для переноса AAV Rep и Сар кодирующей области путем конструирования данных генов в область кодирования полиэдрина бакуловирусного вектора и продуцирования вирусных рекомбинантов путем трансфекции в клетку-хозяина. В частности, при использовании продуцирования бакулавируса для AAV предпочтительно AAV ДНК векторный продукт представляет собой самокомплементарную AAV-подобную молекулу без использования мутации AAV ITR. Это, по-видимому, является побочным продуктом неэффективной регенерации AAV в клетках насекомых, что в результате приводит к самокомплементарной молекуле ДНК в силу отсутствия функциональной активности фермента Rep.Клетка-хозяин представляет собой инфицированную бакуловирусом клетку или вводит в нее дополнительную нуклеиновую кислоту, кодирующую бакуловирусные хелперные функциональные элементы или включает данные бакуловирусные хелперные функциональные элементы в нем. Данные бакуловирусные вирусы могут экспрессировать AAV компоненты и впоследствии способствовать продуцированию капсидов.

[101] Во время продуцирования, упаковывающие клетки обычно включают одну или несколько вирусных векторных функций вместе с хелперными функциональными элементами и упаковывающими функциями, достаточными, чтобы в результате привести к репликации и упаковке вирусного вектора. Данные различные функции могут поставляться вместе или отдельно в упаковывающую клетку с использованием генетического конструкта, такого как плазмида или ампликон, и они могут существовать экстрахромосомно внутри клеточной линии или интегрироваться в хромосомы клетки.

[102] Клетки могут быть снабжены какой-либо одной или несколькими заявленными функциями уже включенными, например, клеточной линии с одной или несколькими векторными функциями, включенными внехромосомно или интегрированными в хромосомную ДНК клетки, клеточной линией с одной или несколькими функциями упаковки включается экстрахромосомноили интегрируется в хромосомную ДНК клетки или клеточную линию с хелперными функциональными элементами, включенными экстрахромосомно или интегрированными в хромосомную ДНК клетки.

Очистка rAAV

[103] Вектор rAAV может быть очищен стандартными методами в данной области, такими как колоночная хроматография или градиенты хлорида цезия. Способы очистки векторов rAAV известны в данной области и включают способы, описанные в Clark et al., 1999, Human Gene Therapy 10(6):1031-1039; Schenpp and Clark, 2002, Methods Mol. Med. 69:427-443; патент США №6,566,118 и WO 98/09657.

Способы лечения

[104] Модифицированный FXN ген может быть использован для генной терапии расстройств, связанных с атаксией Фридрейха, таких как дегенеративные нейро-мышечные расстройства и/или кардиомиопатия, связанная с атаксией Фридрейха. Индивидуум может нуждаться в генной терапии, потому что в результате одной или нескольких мутаций в кодирующей последовательности FXN гена, FXN экспрессируется ненадлежащим образом, например, имеет неправильную аминокислотную последовательность, или экспрессируется в неправильных тканях или в неподходящие времена или недоэкспрессируется. Модифицированный FXN ген согласно представленному изобретению может быть использован в качестве генной терапии для усиления продуцирования белка фратаксин и, таким образом, для увеличения производства энергии в митохондриях. Смотрите., например, патент США No. 9,066,966.

[105] Клетки-мишени векторов настоящего изобретения представляют собой клетки, способные экспрессировать фратаксин, такой как сердечная система млекопитающих, нейронных клеток, мышечных клеток и других клеток с соответствующим клеточным механизмом для обработки предшественника к конечному белку с активностью фратаксина.

Фармацевтическая композиция

[106] В конкретных вариантах осуществления, представленное изобретение предусматривает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения заболевания или состояния, опосредованного или связанного с уменьшенной экспрессией фратаксина, например, атаксии Фридрейха. Композиция содержит терапевтически эффективное количество вектора, который содержит модифицированный FXN ген, который может повысить уровень экспрессии FXN в клетке. Композиция содержит вектор, содержащий модифицированную, например, оптимизированную, нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, где композиция дополнительно содержит фармацевтически-приемлемый носитель и/или другие лекарственные средства, фармацевтические агенты, носители, адъюванты, разбавители и т.д. Для инъекции носитель, как правило, будет жидкостью. В качестве среды для инъекций предпочтительно использовать воду, которая содержит добавки, обычные для инъекционных растворов, такие как стабилизирующие агенты, соли или физиологический раствор и/или буферы.

[107] Иллюстративные фармацевтически приемлемые носители включают стерильную, не содержащую пирогенов воду и стерильный, не содержащий пирогенов, забуференный фосфатом физиологический раствор. Физиологически приемлемые носители включают фармацевтически приемлемые носители. Фармацевтически приемлемыми носителями являются те, которые не являются биологически или иным образом нежелательными, то есть материал может вводиться субъекту, не вызывая нежелательных биологических эффектов, которые перевешивают выгодные биологические эффекты материала.

[108] Фармацевтическая композиция может быть использована, например, при трансфекции клетки ex vivo или при введении вирусного вектора или клетки непосредственно субъекту.

[109] Рекомбинантные вирусные векторы, содержащие модифицированный ген FXN, предпочтительно вводят в клетку в биологически эффективном количестве. Если вектор вируса вводят в клетку in vivo (например, вирус вводится субъекту, как описано ниже), биологически эффективное количество вирусного вектора представляет собой количество, достаточное для получения трансдукции и экспрессии трансгена в клетке-мишени.

[110] В одном варианте осуществления, изобретение включает способ увеличения уровня фратаксина в клетке путем введения в клетку нуклеиновой кислоты, либо отдельно, либо в векторе (включая плазмиду, вирус, наночастицу, липосому, или какой-либо известный способ обеспечения нуклеиновой кислоты в клетке), содержащий модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фратаксин. Способ включает способ, в котором уровень мРНК, кодирующий фратаксин и/или уровень экспрессированного белка фратаксина обнаруживается выше, чем уровень фратаксина (мРНК и/или белок) в какой-либо другой идентичной клетке, в которую не вводится нуклеиновая кислота. Квалифицирванный специалист в данной области понимает, что клетку можно культивировать или выращивать in vitro или может присутствовать в организме (то есть, in vivo). Кроме того, клетка может экспрессировать эндогенный фтаксин, так что уровень фратаксина в клетке может быть увеличен, и/или клетка может экспрессировать эндогенный фратаксин, который является мутантом или вариантом немутантного типа фратаксина, например, фратаксин, имеющий последовательность SEQ ID NO: 2, особенно, поскольку может быть более одного немутантного типа аллелей для человеческого фратаксина. Таким образом, уровень фратаксина увеличивается по сравнению с уровнем фратаксина по сравнению с уровнем фратаксина, экспрессированного инным образом идентичной, но не обработанной клеткой.

[111] Еще одним аспектом изобретения является способ лечения субъектов in vivo вектором, содержащим модифицированные гены. Введение вектора субъекту-человеку или или животному, которое нуждается в этом, может быть каким-либо способом, известным в данной области для введения вирусных векторов.

[112] Вектор может быть введен дополнительно и в качестве дополнения к стандарту по уходу. То есть, вектор может вводиться совместно с другим терапевтическим агентом или соединением либо одновременно, либо продолжительно, либо с определенным интервалом дозирования, как это будет определено специалистом в данной области с использованием обычных способов.

[113] В одном аспекте, rAAV согласно изобретению может совместно вводиться с пустыми капсидами (то есть капсидом вируса, который не содержит молекулы нуклеиновой кислоты), содержащим такой же, или другой капсидный белок, как rAAV-FXN вектор. Это объясняется тем, что квалифицированный специалист в данной области понимает, что совместное введение пустых капсидов может уменьшить иммунный ответ, например нейтрализующий ответ, rAAV согласно изобретению. То есть пустой капсид может служить приманкой, позволяющей вектору rAAV-FXN избегать иммунного ответа нейтрализующего антитела (Nab), как описано в, например, WO 2015/013313.

[114] Иллюстративные способы системного введения, включая, но не ограничиваясь этим, внутривенное, подкожное, внутрикожное, внутримышечное и внутрисуставное введение и тому подобное, а также прямую инъекцию в ткани или органы.

[115] В одном варианте осуществления, вектор вводится системно. Квалифицированному специалисту в данной области должно быть понятно, что системное введение может доставлять терапевтический ген, кодирующий FXN, ко всем тканям, включая все мышцы, пораженные пониженным уровнем FXN в нем.

[116] Тем не менее, квалифицированный специалист в данной области оценит, что вектор может быть доставлен непосредственно в области, пораженные дефицитом FXN, то есть мозг и сердце.

[117] Соответственно, в других предпочтительных вариантах осуществления, вектор согласно изобретению, содержащий модифицированный FXN ген, вводится путем непосредственной инъекции в ткань сердца или центральной нервной системы (ЦНС).

[118] В одном варианте осуществления, модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FNX, вектор, или композиция, содержащая вектор, доставляется внутричерепно включая, интратекальное, интраневральное, внутрицеребральное, интравентрикулярное введение.

[119] В одном варианте осуществления, модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FNX, вектор, или композиция, содержащая вектор, доставляется в сердце путем непосредственного введения в миокард путем эпикардиальной инъекции с последующей миниторакотомией, интракоронарной инъекцией, эндомиокардиальной инъекцией или другим тип инъекции полезен в сердце.

[120] Дополнительные пути введения могут также включать локальное применение вектора при непосредственной визуализации, например, поверхностное корковое применение или другое нестероидное применение. Вектор также может быть доставлен, например, интратекально, в желудочки или путем внутривенной инъекции.

[121] Клетки-мишени векторов согласно представленному изобретению представляют собой клетки миокарда субъекта, страдающего кардиомиопатией, связанной с атаксией Фридрейха. Предпочтительно субъектом является человек, взрослый или ребенок. Тем не менее, ветеринарные применения также рассматриваются.

[122] Клетки-мишени векторов согласно представленному изобретению также включают клетки ЦНС, предпочтительно нейроны. Доставка в мозг для лечения нейродегенеративных аспектов атаксии Фридрейха может осуществляться путем интратекального введения.

[123] В одном аспекте, модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FNX, вектор, или композиция, содержащая вектор, представляет собой системную доставку, например внутривенно, для лечения связанной с FA кардиомиопатии и/или нейродегенеративного аспекта заболевания.

[124] В другом варианте осуществления, вектор вводится, по меньшей мере, двумя способами. То есть, вектор может вводиться системно и также непосредственно в мозг и/или сердце, или какую-либо их комбинацию.

[125] Если выполняется через, по меньшей мере, два маршрута, введение вектора может быть, но не обязательно, одновременным или единовременным. Вместо этого введения по разным способам могут выполняться отдельно с интервалом времени между каждым введением. Квалифицированные специалисты в данной области обычно определяют подходящие режимы дозирования для достижения максимальной терапевтической пользы для каждого отдельного пациента.

[126] В одном аспекте, изобретение включает, по меньшей мере, одну модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фратаксин согласно изобретению, включая, но не ограничиваются этим, нуклеиновую кислоту в векторе или фармацевтическую композицию, для применения в повышении уровня фратаксина у субъекта.

[127] В одном аспекте, изобретение включает, по меньшей мере, одну модифицированную нуклеиновую кислоту, rAAV вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, и фармацевтическую композицию, содержащую либо нуклеиновую кислоту, либо вектор, для применения в лечении атаксии Фридрейха у субъекта.

[128] Применение охватывает введение модифицированной нуклеиновой кислоты, или вектора, содержащего ее, в дополнение к и/или одновременно со стандартным лечением для FRDA, как известно в данной области техники.

[129] Инъекции могут быть приготовлены в обычных формах либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий, твердых форм, пригодных для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией, или в виде эмульсий.

[130] Дозировки вирусного вектора модифицированным FXN геном будут зависеть от способа введения, заболевания или состояния, подлежащего лечению, состояния отдельного субъекта, конкретного вирусного вектора и гена, подлежащего доставке, и могут быть определены в обычном порядке. Типичными дозами для достижения терапевтического эффекта являются титры вируса, по меньшей мере, приблизительно 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³, 10¹⁴, 10¹⁵ единиц трансдуцирования или более,, предпочтительно приблизительно 10⁸-10¹³ единиц трансдуцирования, еще более предпочтительно 10¹² единиц трансдуцирования/кг массы тела.

[131] Модифицированный FXN ген может вводиться в качестве компонентов молекулы ДНК, имеющих регуляторные элементы, подходящие для экспрессии в клетках-мишенях. Модифицированный FXN ген может вводиться в качестве компонентов вирусных плазмид, таких как векторы rAAV. Вирусные частицы могут вводиться в качестве вирусных частиц самостоятельно, независимо от того, как непосредственная доставка in vivo в сосудистую сеть портала или в виде обработки ex vivo, включающей введение векторных вирусных частиц in vitro клеткам из принимающей животных, с последующим введением трансдуцированных клеток назад в донора.

Эквиваленты

[132] Вышеупомянутое письменное описание, как считается, является достаточным, чтобы позволить квалифицированному специалисту в данной области практиковать раскрытие. В приведенном выше описании и примерах подробно описаны некоторые иллюстративные варианты осуществления раскрытия. Следует, однако, принять во внимание, что независимо от того, насколько подробно изложено указанное выше в тексте, раскрытие информации может быть осуществлено многими способами, и раскрытие должно толковаться в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и какими-либо ее эквивалентами.

[133] Все ссылки, цитируемые в данном документе, включая патенты, заявки на патент, документы, учебники и тому подобное, и ссылки, приведенные в нем, в той мере, в которой они еще не включены, являются тем самым включенными в данный документ в качестве ссылки во всей их полноте.

Иллюстративные варианты осуществления

[134] Изобретение далее подробно описано со ссылкой на следующие экспериментальные примеры. Данные приведены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Таким образом, изобретение никоим образом не должно истолковываться как ограниченное следующими примерами, а скорее должно толковаться как охватывающее какие-либо и все варианты, которые становятся очевидными в результате приведенного обоснования в данном документе.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Генерация самокомплементарного rAAV-FXN конструкта Материалы и способы

[135] Векторный конструкт

[136] pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA конструкт (схематически изображенный на фигуре 3), кодирующий самокомплементарный AAV ген, использовался в качестве основы трансгенного экспрессирующего конструкта (Gray et al., 2011, Human Gene Therapy 22:1143-1153). Два вставных гена FXN с оптимизированными кодонами были заказаны из GenScript в pUC57, то есть Genscript и Genscript (низкий CpG), и используются для замены EGFP в базовом векторе. Genscript (SEQ ID NO: 6) и Genscript (низкий CpG) (SEQ ID NO: 7) модифицированные гены FXN были функционально связаны с промотором CBh, как показано на фигуре 3. GenScript FXN (SEQ ID NO: 6 и 7) конструкты включали N-терминальный Agel сайт, последовательность стабильности коллагена (CSS) (5'-CCCAGCCCACTTTTCCCCAA-3') по ходу транскрипции FXN стоп-кодона, polyA последовательность бычьего гормона роста (BGH) по ходу транскрипции CSS, и Mlul сайт по ходу транскрипции BGH polyA всех как показано на фигурах 2Е (Genscript) и 2F (Genscript (низкий CpG)). Иллюстративные вставки для вставок в pTRs-KS-CBh-FXN-bGHpolyA конструкты показаны на фигурах 2A-2F и представлены в таблице 8. Более конкретно, немутантного типа ген фратаксина (WT FXN; SEQ ID NO: 2) был клонирован в pTRs-KS-CBh-WT FXN-bGHpolyA (Фиг. 2А); IDT1 модифицированный FXN ген (SEQ ID NO: 11) был клонирован в pTRs-KS-CBh-IDT1-bGHpolyA (Фиг. 2В); нуклеиновая кислота, кодирующая IDT3 низко экспрессированный модифицированный FXN ген (SEQ ID NO: 8) была клонирована в pTRs-KS-CBh-IDT3-bGHpolyA (Фиг. 2С); IDT4 модифицированный FXN ген (SEQ ID NO: 12) был клонирован в pTRs-KS-CBh-IDT4-bGHpolyA (Фиг. 2D); Genscript (контроль) модифицированный FXN ген (SEQ ID NO: 6) был клонирован в pTRs-KS-CBh-Genescript-bGHpolyA (Фиг. 2E); и Genscript (низкий CpG) модифицированный FXN ген (SEQ ID NO: 7) был клонирован в pTRs-KS-CBh-Genescript (низкий CpG)-bGHpolyA (Фиг. 2F). Каждая вставка, кодирующая FXN ген была клонирована в вектор и ген был фланкирован Agel сайтом в 5' стороне и Avrll усеченным сайтом в 3' стороне, а затем последовательностью CSS после Avrll сайта, Spel усеченным сайтом после CSS, bGHpolyA сигнальной последовательностью после Spel усеченного сайта, и Mlul усеченным сайтом после polyA сигнальной последовательности.

[137] Скелет pTRs-KS-CBh-EGFP-bGHpolyA и FXN генные конструкты расщепляли Agel и Mlul (New England Biolabs, R0552S и R0198S соответственно), гель экстрагировали и лигировали с использованием полимеразы ExTaq (Clontech, RR001A). Реакцию лигирования превращали в клетки SURE (Agilent, 200227), помещали в среду для восстановления СОС (кат. №15544-034, Invitrogen) в течение одного часа при 37°С, затем высевали на пластины LB с ампициллином (10 мг / мл). Колонии были секвенированы и выбраны для амплификации для продуцирования вируса. Рекомбинантные векторы AAV (rAAV) с капсидом AAV серотипа 2 продуцировали UNC Векторное ядро методом тройной трансфекции в клетках эмбриональной почки 293 (HEK293) человека, как описано (Grieger et al., 2006, Nature Protocols 1: 1412-1428). В качестве альтернативы аналогичным образом получали вектор rAAV с капсидом серотипа 2i8 (аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 28). Высокочистый рекомбинантный вирус, содержащий самокомплементарные геномы, выделяли путем пропускания через неионный градиент иодиксанола с последующей ионообменной хроматографией. Пиковые фракции определяли с помощью количественной ПЦР, затем диализовали в забуференном фосфатом физиологическом растворе (PBS), содержащем 5% d-сорбита. Вирусные титры определяли с помощью количественной ПЦР (Gray et al., 2010, J. Amer. Soc. Gene Therapy 18:570-578). После предварительного тестирования in vitro (ниже) GenScript (низкий CpG) использовался для создания конструкции с тегом НА TACCCATACGATGTTCCAGATTACGCT, вставленным до стоп-кодона FXN в pTRs-KS-CBh-Genescript (низкий CpG)-bGHpolyA.

[138] В Университете Северной Каролины (UNC) векторное ядро были созданы вирусы с конструкцией FXN-HA с серотипами rAAV ТК. [139] In vitro исследование sc rAAV-FXN.

[140] Клетки HEK293 (АТСС: CRL-1573) и HeLa (АТСС: CCL-2) поддерживали в модифицированной Дульбекко среде Игл (DMEM, Gibco). Среда для роста клеток была дополнена 9% фетальной бычьей сывороткой (FBS, Gibco), 3.4 мМ 1-глутамина, 100 ед / мл пенициллина и 100 мкг/ мл стрептомицина (Gibco). Клетки выдерживали в атмосфере 5% CO₂ при 37°С. Экспресс-проба с импрегнированным субстратом: Клетки высевали в 24-луночные планшеты, чтобы они достигали приблизительно 60% слияния в течение 24 часов (ч), затем обрабатывали или инфицировали в трех повторах с помощью scAAV-FXN (взаимозаменяемо называемый в данном документе как «rAAV-FXN» или «rAAV-FXN», rAAV-FXN-HA") при MOI 10000 (VG/клетка Через 60 ч после трансдукции (ч п. т.) клетки были в соответствии с протоколом изготовителя для анализа количества белка фратаксина Quantity Dipstick Assay (Abcam, ab109881). Данные обрабатывались с использованием ImageJ.

[141] Вестерн-блоттинг:

[142] Клетки высевали в 6-луночные планшеты, так что они достигали приблизительно 60% слияния через 24 часа, затем обрабатывались или заражали scAAV-FXN при MOI 10000 (VG/клетка). Через 60 ч после трансдукции клетки лизировали с помощью клеточного лизисного буфера (0,0625 М Трис-HCl, рН 6,8, 10% глицерина, 2% SDS, 5% 2-меркаптоэтанола, 0,02% (масс/об.) Бромфенолового синего). Пятнадцать (15) мкл белкового лизата HeLa разделяли с помощью гель-электрофореза на 15-4% TGX-геле, и белки подвергали электроблоттунгу на нитроцеллюлозной мембране (NCM). NCM блокировали с использованием 5% обезжиренного сухого молока в PBS-T. Анти-фратаксин антитело (Abcam, 18A5DB1) использовали в PBS-T с 5% молоком. Для обнаружения присутствия анти-фратаксина использовали пероксидазу хрена (HRP)-конъюгированное вторичное антитело в PBS-T с 5%-ными молочными антителами. Набор WesternBright ECL Western Blotting Detection kit (Advansta, K-12045-D50) использовался для обнаружения в соответствии с инструкциями производителя.

[143] ФИГ. 1А-1В показывает результаты экспрессии различных оптимизированных последовательностей по сравнению с экспрессией неоптимизированной, то есть, немутантного типа, последовательности, кодирующей FXN (SEQ ID NO: 1) в HeLa клетках. Более конкретно, обе фигуры 1А и 1В показывают фотографию вестерн-блоттинга, показывающую экспрессию фратаксина (FXN) в HeLa клетках, трансфицированных вектором экспрессии, содержащим вставку, кодирующую фратаксин. Фигура 1А показывает экспрессию FXN в HeLa клетках на фотографии вестерн-блоттинга блот-пленки экспонированной в течение 1 секунды. Фигура 1В показывает повтор эксперимента, показанного на Фиг. 1А, демонстрирующего экспрессию FXN в HeLa клетках, как показано на фотографии вестерн-блоттинга блот-пленки, экспонированной в течение 1 секунды. Каждая гелевая дорожка на фигурах 1А и 1 В показывает экспрессию FXN из модифицированного FXN гена согласно изобретению по сравнению с экспрессией из немутантного типа последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей FXN. То есть, дорожка 1 показывает экспрессию обусловленную немутантного типа немодифицированной нуклеиновой кислотой, кодирующей FXN (SEQ ID NO: 2); дорожка 2 показывает экспрессию, обусловленную IDT2 модифицированным FXN геном (SEQ ID NO: 3); дорожка 3 показывает экспрессию, обусловленную IDT5 модифицированным FXN геном (SEQ ID NO: 9); дорожка 4 показывает экспрессию, обусловленную JCAT модифицированным FXN геном (SEQ ID NO: 4); дорожка 5 показывает экспрессию, обусловленную GeneArt модифицированным FXN геном (SEQ ID NO: 5); дорожка 6 показывает экспрессию, обусловленную GenScript (контроль) модифицированным FXN геном (SEQ ID NO: 6); дорожка 7 показывает экспрессию, обусловленную Genscript (низкий CpG) модифицированным FXN геном (SEQ ID NO: 7); и дорожка GFP показывает экспрессию трансгена, кодирующего зеленый флуоресцентный белок, детектируемый маркер, который кодируется вставкой вместо нуклеиновой кислоты, кодирующей FXN.

[144] Показанные данные демонстрируют, что несколько модифицированных последовательностей нуклеиновых кислот FXN, особенно дорожек 4 (JCAT), 5 (GeneArt), 6 (Genscript) и 7 (Genscript низкий CpG), обеспечивали большую экспрессию фратаксина в HeLa клетках по отношению к немутантного типа последовательности нуклеиновой кислоты (дорожка 1 Контроль загрузки актина в каждой дорожке представляет собой контролем загрузки белка.

[145] Содержание нуклеотида GC в последовательности нуклеиновой кислоты, обычно выраженное в процентах от общего количества нуклеотидов в последовательности, может иметь множественное влияние, включая, но не ограничиваясь этим, стабильность мРНК увеличивается, и вторичная структура и трансгены, на которые обычно негативно влияет повышенное содержание GC. Таким образом, квалифицированный специалист в данной области должен понимать, что содержание GC в модифицированной нуклеиновой кислоте отражает баланс между повышенной стабильностью нуклеиновой кислоты и транскрибируемой из нее мРНК против отрицательного эффекта, например, на вторичную структуру, опосредованную повышенным содержанием GC.

[146] CAI (индекс адаптации кодонов) является показателем смещения синонимичного кодона. Индекс использует ссылочный набор высоко экспрессируемых генов из вида для оценки относительных значений каждого кодона, а оценка для гена рассчитывается по частоте использования всех кодонов в этом гене. Индекс оценивает степень, в которой выбор был эффективным при выборе схемы использования кодонов. Его можно использовать для прогнозирования уровня экспрессии гена и для сравнения использования кодонов у разных организмов / видов. Оптимизация кодонов человека проводилась на гене фратаксин для достижения баланса следующих факторов:

[147] Эффективность транскрипции - содержание GC, содержание динуклеотидов CpG, сайты критического сплайсинга и т.д.;

[148] Эффективность трансляции - стандартная ошибка использования кодонов, содержание GC, вторичная структура мРНК, преждевременные polyA сайты, мотивы нестабильности РНК, внутренние сайты рибосомного связывания; и

[149] Рефолдинг белка - стандартная ошибка использования кодонов, взаимодействие кодона и антикодона, вторичные структуры РНК.

[150] В принципе, оптимизация кодонов уравновешивает эти переменные, предпочтительно, достигая более высокой экспрессии последовательности гена фратаксина, повышает стабильность транскрипта (содержание GC, вторичная структура как в ДНК, так и в РНК) и тому подобное, как хорошо известно в данной области.

[151] Острова CpG могут быть распознаны Tol-подобным-рецептором девять (TLR9) в трансдуцированной клетке и могут вызывать иммунный ответ на чужую (экзогенную) ДНК. Соответственно, в одном варианте осуществления изобретение охватывает модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фратаксин, причем количество островов CpG было уменьшено по сравнению с количеством мотивов CpG-островков в немутантного типа последовательности нуклеиновой кислоты (например, SEQ ID NO: 2), кодирующей фратаксин.

[152] CAI, процентное содержание GC, и количество потенциальных CpG островковых областей для каждого модифицированного FXN гена, проиллюстрированного в данном документе, показано в таблице 1 ниже.

[153] То есть, для немутантного типа нуклеиновой кислоты, кодирующей FXN (WT-FXN; SEQ ID NO: 2), последовательность нуклеиновой кислоты демонстрирует CAI 0,71 и % содержание GC - 55%. Напротив, JCAT модифицированный FXN ген демонстрирует CAI 0,98 и содержание GC - 69%, оба из которых существенно выше, чем значения для WT-FXN.

[154] Потенциальные острова CpG были идентифицированы с использованием общедоступного программного обеспечения, найденного по адресу http://vvww.bioinformatics.org/sms2/cpg_islands.html. Программное обеспечение касательно островов CpG сообщило о потенциальных CpG островковых областях с использованием способа, описанного Gardiner-Garden и Frommer, 1987, J. Mol. Biol. 196(2):261-282. Расчет проводился с использованием окна из 200 пар оснований (п.ос.) перемещающегося по последовательности с интервалами 1 п. ос. Острова CpG определяются как диапазоны последовательностей, где значение Obs/Exp является больше, чем 0.6 и содержание GC является больше, чем 50%. Ожидаемое количество димеров CpG в окне рассчитывалось как число «С» в окне, умноженное на число «G» в окне, деленное на длину окна. Таким образом, потенциальные CpG-острова, присутствующие в последовательности нуклеиновой кислоты, могут быть легко определены путем ввода последовательности в окно, предоставленное программным обеспечением (указано в инструкциях " Вставьте исходную последовательность или одну или несколько последовательностей FASTA в текстовую область ниже. Предел ввода - 100000 символов."). Острова CpG часто встречаются в 5'-областях позвоночных генов, поэтому эту программу можно использовать для выделения потенциальных генов в геномных последовательностях.

[155] Из-за высокого уровня экспрессии и высокого содержания GC (55%), высокого CAI (0,86) и низкого количества динуклеотидов CpG (117), модифицированный FXN ген выбирали для продуцирования scAAV-2i8 вектора, использованного в экспериментах на животных, приведенных ниже.

Пример 2: In vivo обработка в мышинной модели атаксии Фридрейха

[156] Для оценки потенциальной эффективности rAAV-опосредованной генной терапии FXN использовали искусственную модель мыши FRDA (Perdomini et al., 2014, Nature Med., 20 (5): 542). Таким образом, были исследованы три группы мышей: необработанные Mck положительные контрольные мыши (Mck-Cre × FXN L3/WT), необработанные Mck мутантные мыши (Mck-Cre × FXN L3/L-), и обработанные Mck мутантные мыши, которые получали дозу rAAV, содержащего ген FXN, где модифицированный FXN ген включал последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7 (GenScript (низкий CpG)) и FXN ген был клонирован в pTRs-KS-CBh-EGFP-BGH конструкт, как описано выше для обеспечения pTRs-KS-CBh-Genscript (низкий CpG)-bGHpolyA.

[157] rAAV-FXN вектор, использованный в исследованиях на мышах, также содержал капсид AAV2i8. Кроме того, pTRs-KS-CBh-Genscript (низкий CpG)-bGHpolyA конструкт дополнительно содержал последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую детектируемую метку гемагглютинина (rAAV-FXN-HA), причем последовательность, кодирующая метку НА была расположена 3' модифицированного FXN гена, таким образом, что экспрессия фратаксина может быть легко обнаружена и локализована путем обнаружения присутствия НА, например, с использованием анти-НА антитела, такого как анти-НА мыши mAb (НА.11 клон 16 В12, Covance Research Products, Inc., Princeton, NJ). Вектор был обозначен как rAAV-FXN-HA.

[158] Три группы животных исследования перечислены и описаны в таблице 2.

А. Исследование биомаркера

Способы

Измерение галектина-3 и H-FABP в плазме

[159] Кровь была собрана путем ретро-орбитальной пункции после анестезии изофлураном в возрасте 5 недель (через 2 недели после лечения) и 8 недель (через 5 недель после лечения).

[160] Галектин-3 измеряли в плазме с использованием набора мышиного галектина-3 для ИФА от RayBiotech в соответствии с инструкциями производителя.

[161] H-FABP измеряли в плазме с использованием набора мышиного H-FABP для ИФА от HycultBiotech в соответствии с инструкциями производителя.

Измерение активности сукцинатдегидрогеназы в гомогенате сердца

[162] После умерщвления, было собрано сердце, и половина сердца 4 мышей каждой группы была заморожена для измерения активности SDH.

[163] Измерение активности SDH в гомогенате сердца проводилось в соответствии с инструкцией колориметрического набора для оценки активности сукцинатдегидрогеназы (Catalog # К660-100) от Biovision.

Измерение человеческого фратаксина в тканях

[164] После умерщвления, было собрано сердце (половина), скелетная мышца (икроножная мышца) и ткани печени и замораживались для измерение фратаксина.

[165] Измерение в гомогенатах тканей проводили в соответствии с инструкциями к набору человеческого фратаксина для ИФА (Abeam; ab176112).

Гистология

[166] Мозжечок (включая зубчатое ядро), гонады, сердце, почки, печень, легкие, поджелудочную железу, скелетную мышцу (икроножную и подошвенную), селезенку и шейные, грудные и поясничные позвонки были фиксированными. Затем позвонки декальцифицировали с использованием раствора ЭДТА. Все органы были введены в парафин, чтобы получить участки толщиной 5 мкм; поперечные срезы для позвонков (включая спинномозговые и дорзальные корневые ганглии) и сердца. Все органы были окрашены гематоксилином и эозином; сердечный фиброз оценивали с использованием окраски трихрома Массон.

Эхокардиография:

[167] Трансторакальные эхокардиографические изображения были зафиксированы средним линейным зондом 30 МГц (MS 400) на эхографе Vevo-2100 Visual Sonics у анестезированных мышей (изофлуран 1-2%).

[168] Следующие параметры измеряются для оценки:

a) Сердечная морфология и систолическая функция желудочков (короткая ось, SAX): конечный диастолический левый желудочек (LVEDD) и концевые систолические диаметры (LVESD), септальная (SW) и толщина задней стенки (PW), масса левого желудочка (LVM=1,055×[(EDD+SW+PW)3-EDD3)]), выброс и укорочение фракции и сердечный выброс;

b) Гемодинамические профили: скорость и давление в легочной и аортальной артериях для определения изменений внутрисердечного давления (функция AoV и RV).

Мыши

[169] Мышей поддерживали на животноводческом объекте с контролируемой температурой и влажностью, с 12-часовым циклом свет-темнота и свободным доступом к воде и стандартным кормом для грызуном (D03, SAFE, Villemoisson-sur-Orge, France). Все процедуры и эксперименты на животных были одобрены местным этическим комитетом (Comite d'Ethique en Experimentation Animale IGBMC-ICS) для ухода за животными и их использования (Com'Eth 2011-007).

[170] Было проведено двухдневное клиническое наблюдение за мышами, масса тела регистрировалась еженедельно и потребление пищи каждые 2 дня до конца протокола.

[171] Для исследований биораспределения и генной терапии мышей 3-недельного возраста анестезировали изофлуран (1-2%) и вводили внутривенно в ретроорбитальную вену вектор rAAV-FXN-HA в дозе 1 × 1013 vg / кг для обработанной группы и с эквивалентным объемом соленой воды для необработанных мутантных мышей МСК и контроля.

[172] Функцию сердечной деятельности мышей оценивали при анестезии изофлураном (1-2%) с помощью эхокардиографии за 2 дня до начала лечения (исходный фенотип), в возрасте 5 недель (через 14 дней после лечения) и 7 недель (28 дней после лечение). В возрасте 5 и 8 недель проводили сбор крови для измерения концентрации сердечного типа связывающего белка жирной кислоты (H-FABP), галектина-3 и сукцинатдегидрогеназы (SDH), как подробно описано в данном документе.

[173] у всех животных регистрировались масса тела, длина тела, сердце, селезенка, почка, надпочечники и вес печени. Надпочечниковые, мозжечковые, шейные, грудные и поясничные позвонки, гонады (яички и яичники), сердце, почки, печень, легкие, поджелудочная железа, простата у самцов, скелетные мышцы (икроножные мышцы и подошва), селезенка и тимус были собраны у 4 животных на группу для патологической оценки и анализа ИФА.

[174] Собирают мозжечок (включая зубчатое ядро), шейные, грудные и поясничные дорзальные корневые ганглии, сердце, почки, печень, легкие, гонады, поджелудочную железу, скелетную мышцу (икроножные мышцы и подошву) и селезенку от 4 других животных на группу немедленно замораживают для молекулярной биологии.

Результаты

Идентификация потенциальных биомаркеров

[175] Уровни различных биомаркеров определяли в трех группах мышей: необработанный Mck-положительный контроль, необработанные мутантные мыши Mck и обработанные мутантные мыши Mck, которые получали дозу rAAV2i8, содержащую ген FXN, и дополнительно содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую НА-метку пептид (AAV-FXN-HA).

Измерение галектина-3 и H-FABP в плазме

[176] Кровь была собрана путем ретроорбитальной пункции после изофлурановой анестезии в возрасте 5 недель (2 недели лечения AAV для обработанных мутантных мышей Mck) и 8 недель (5 недель лечения rAAV для обработанных мутантных мышей Mck) и уровни галектин-3 и H-FABP измеряли стандартными способами. Галектин-3:

[177] В возрасте 5 недель уровни галектина-3 были сопоставимы между 3 группами, даже если уровни галектина-3 были выше в необработанной положительной контрольной группе Mck и в группе мутантных мышей Mck по сравнению с необработанной группой Mck мутантных мышей.

[178] Как показано в таблице 3, в возрасте 8 недель уровни галектина-3 были значительно ниже в необработанной мутантной группе Mck, чем в отрицательной контрольной группе. Уровни Галектин-3 в экспериментальной группе были ниже, чем в отрицательной контрольной группе, тогда как уровни Галектина-3 были сопоставимы между экспериментальной группой и положительной контрольной группой.

[179] Неожиданно, но мышей необработанной положительной контрольной группы Mck показали более высокие уровни Галектина-3 в возрасте 8 недель, чем в возрасте 5 недель, тогда как уровни Галектина-3 в возрасте 8 недель были сопоставимы с уровни в возрасте 5 недель для группы необработанных мутантных мышей Mck и для обработанной группы мутантных мышей Mck.

[180] В заключение, похоже, что Галектин-3 не является подходящим сердечным биомаркером для этого исследования на мышах Mck. Мыши необработанной группы мутантных мышей Mck не показали ожидаемого, если галектин-3 был подходящим биомаркером, увеличивая этот параметр.

H-FABP:

[181] Большая изменчивость наблюдалась в уровнях H-FABP между мышами в одной и той же группе образцов с использованием стандартных методов обнаружения.

[182] Как показано в таблице 4, уровни H-FABP в крови были сопоставимы между 3 группами мышей как в возрасте от 5 недель до 8 недель.

[183] Никаких существенных изменений не наблюдалось в уровнях H-FABP в возрасте от 5 до 8 недель в каждой группе.

[184] В заключение, кажется, что H-FABP не является подходящим биомаркером сердца для этого исследования на мышах Mck; ожидаемое увеличение этого параметра не наблюдалось в необработанной мутантной группе Mck, и значительная изменчивость наблюдалась между мышами в одной и той же группе.

SDH активность в гомогенатах сердца

[185] Активность SDH измеряли в гомогенате сердца из сердца, собранного в конце исследования (8 недель, 5 недель лечения AAV в группе обработанных мутантных мышей) с использованием стандартных способов. Каждая группа состояла из четырех (4) мышей.

[186] Результаты, показанные в таблице 5, показывают, что активность SDH была сопоставимой между 3 группами мышей. Не наблюдалось никакого снижения активности SDH в необработанной положительной контрольной группе Mck по сравнению с необработанной мутантной группой Mck.

[187] Важная изменчивость в активности SDH наблюдалась между мышами в одной и той же группе. Кроме того, ожидаемое снижение активности SDH в необработанной положительной контрольной группе Mck не наблюдалось.

Уровни фратаксина в сердце, скелетных мышцах и гомогенатах печени

[188] Уровень человеческого белка фратаксина измеряли из сердца, скелетной мышцы и печени, собранных после умерщвления, используя стандартные способы, как показано в таблице 6.

[189] Фратаксин человека не обнаруживался ни в одной из исследованных тканей (сердце, скелетные мышцы и печень) необработанного положительного контроля Mck и необработанных групп мутантов Mck (то есть уровень был ниже нижнего предела обнаружения [LLD] анализа).

[190] У обработанных мутантных мышей Mck, получавших rAAV-FXN, человеческий белок фратаксина был обнаружен в гомогенате сердца на уровне 38,35+/-1,99 нг/мг, и в скелетной мышце при более низкой концентрации: 4,57±0,39 нг/мг. Кроме того, в печени обнаружены следы человеческого фратаксина (0,07±0,01 нг/мг белков).

[191] Эти данные демонстрируют, что лечение вектором rAAV, содержащим ген FXN, может увеличивать уровни братаксина в мышиной модели атаксии Фридрейха (FRDA).

Кроме того, эти данные показывают, что уровни FXN могут быть увеличены in vivo системным введением rAAV-FXN, так что уровни FXN увеличены в сердце и, в меньшей степени, скелетной мышце с гораздо более низким уровнем в печени. Таким образом, эти данные показывают, что уровни in vivo FXN могут избирательно увеличиваться в пораженных тканях, например, сердечной и скелетной мышцах, при этом минимизируя доставку FXN, где он не нужен и/или не желателен, то есть в печень.

Макропатология

[192] Необработанные Mck положительные контрольные самцы мышей были значительно более длинными по сравнению с необработанными и AAV-обработанными Mck мутантными животными (9,39 см против 8,89 см [+5.62%]. Р = 0,011 [критерий Стьюдента]). Никакого другого значительного макроскопического поражения не наблюдалось, особенно макроскопическое поражение или значительные изменения наблюдались в массе сердца у самцов и самок.

Гистология Сердце

[193] Минимальный интерстициальный фиброз наблюдался у одного необработанного Mck положительного контрольного животного (№58). Все остальные сердца 3 необработанных Mck положительных контрольных групп были нормальными.

[194] Тем не менее, минимальный (мышь №38) и умеренный (мыши №41, №49 и 81) интерстициальный фиброз наблюдался у всех 4 необработанных мутантных животных Mck. Это поражение было связано с эндокардиальным фокусом опухоли кардиомиоцитов у мышей №38 (минимальный) и №81 (незначительный). Фиброз ассоциировался с умеренным макрофагическим воспалением, минимальным распространенным отеком и легкой вакуолизацией кардиомиоцитов у мышей №41 и №49. Ядра Аничкова (формы глаза совы) наблюдались у мышей №41 и №81.

[195] В отличие от необработанной когорты мутантов Mck, при общей оценке сердца обработанных rAAV-FXN мутантных мышей Mck оказались нормальными, за исключением того, что у мышей №47 и №13 наблюдалось мало ядер Аничкова.

Почки

[196] Во всех группах часто наблюдалась значительная минерализация в просвете нескольких мозговых канальцев. Частота составляла 4/4 для необработанных животных с положительным контролем Mck (хотя они экспрессируют Cre трансген), 3/4 для необработанных мутантных животных Mck и 2/4 для обработанных мутантных животных Mck, получающих дозу rAAV-FXN. Тяжесть минерализации оказалась уменьшенной в группе мутантов Mck, обработанной rAAV, по сравнению с необработанными Mck-положительными контрольными и необработанными группами мутантов Mck. Тубулярную базофилию (регенерацию) наблюдали у 2/4 животных в необработанной положительной контрольной группе Mck, у 3/4 животных в необработанной мутантной группе Mck и у 1 животного в AAV-обработанной Mck-мутантной группе.

Печень: минимальное перипортальное воспаление наблюдалось у одного необработанного Mck-положительного контрольного животного (№38).

Легкое: небольшое воспаление перибронхии наблюдалось у одного необработанного мутантного животного Mck (№41)..

[197] Никакого другого значительного микроскопического поражения не наблюдалось. В частности, спинной мозг, ганглии дорзального корня и мозжечок были нормальными.

Эхокардиография

Базальный фенотип перед обработкой

[198] Измерения эхокардиографии показали снижение левожелудочковой функции у необработанных мутантных мышей Mck самцов по сравнению с необработанным Mck-положительным контролем. Эта сердечная недостаточность характеризуется уменьшением сократимости левого желудочка (ЛЖ) (сокращающей фракции и фракции выброса) и увеличением объема ЛЖ как систолического, так и диастолического. На этом этапе не наблюдался сердечный фенотип у необработанных мутантных самок мышей Mck.

[199] Фигура 4А показывает графики оценки систолической функции и объема ЛЖ эхокардиографией у (А) самцов и (В) самок в возрасте 3 недель. Данные являются средними значениями ± S.E.M из 8 мышей на группы. Данные Mck мутантных (как обработанные, так и необработанные) мышей сравнивали с необработанной Mck положительной контрольной группой с использованием нескольких сравнений критериев Стьюдента (Сидак-Бонферрони способ). * р<0,05

Результаты через 14 дней после обработки rAAV (5 недельный возраст):

[200] Для того, чтобы исследовать потенциал подхода генной терапии для лечения кардиомиопатии FRDA, однократную внутривенную инъекцию AAV.FXN-HA в дозе 1 × 10¹³ мкг/кг вводили мышам мутантов 3-х недель (лечение Mck). Через 14 дней после инъекции (возраст 5 недель) эхокардиографические измерения показали улучшение сердечной гемодинамики (сердечный выброс) и почти нормальное морфологическое развитие у обработанных Mck мутантов (сократимость, масса LV). Напротив, сердечная недостаточность все еще наблюдалась у необработанных мутантных мышей Mck. Удивительно, но у самок дефект сердечной сократительной способности наблюдался у всех мутантных мышей Mck, независимо от того, были ли они обработаны или необработаны.

[201] Фигуры 5А-5В показывают оценку систолической функции и объема ЛЖ эхокардиографией в возрасте 5 недель у самцов (фиг. 5А) и самок (фиг. 5В). Данные являются средними значениями ± S.E.M от 8 мышей на группы. Данные мутантных мышей сравнивали с контрольными группами с использованием множественных сравнений по критерию Стьюдента (способ Сидак-Бонферрони). * р<0,05.

Результаты через 28 дней после обработки rAAV (7 недельный возраст):

[202] Двадцать восемь (28) дней лечения rAAV (7 недельный возраст), обработанные мутантные Mck самцы и самки были полностью нормализованы и стали неразличимыми между ними и от необработанных Mck-положительных контрольных мышей. Таким образом, у обработанных мутантных мышей Mck была продемонстрирована полная коррекция (самцы) и профилактика (самки) сердечной болезни. Напротив, у необработанных мутантных мышей Mck развивалась быстро прогрессирующая сердечная недостаточность с заметным уменьшением фракции сокращения левого желудочка и сердечного выброса, а также гипертрофией левого желудочка.

[203] Фигуры 6А-6С показывают графики, изображающие данные, полученные с использованием оценки эхокардиографией массы левого желудочка (LVm), сокращающей фракции (SF) и сердечного выброса для необработанного положительного контроля Mck, и обработанных и необработанных мутантных мышей Mck в течение последующих недель. Данные являются средними значениями ± S.E.M от 8 мышей на группы. Данные мутантных мышей Mck сравнивали с необработанной контрольной группой Mck с использованием нескольких сравнений по критерию Стьюдента (способ Сидак-Бонферрони). * p<0,05

Выводы

Результаты эхокардиографии

[204] В этом исследовании оценивали эффективность rAAV-FXN, необязательно дополнительно содержащего детектируемый вектор гемагглютининовой метки (НА) (называемый в данном документе как rAAV-FXN-HA) в дозе 1 × 10¹³ мкг/кг. Эта доза была приблизительно в 5 раз меньше дозы, ранее описанной в такой же мышиной модели для Mck мышиной сердечно специфичной атаксии Фридрейха с использованием вектора rrhAAV10, кодирующего немутантного типа FXN (Perdomini et al., 2014, Nature Medicine 20(5):542).

[205] Как показано на фигуре 5А, у 3 недельного возраста, необработанных Mck мутантных самцов мышей начали развиваться дисфункция левого желудочка (LV), не наблюдаемая у самок такой же группы в таком же возрасте (Фигура 5В). Через четырнадцать (14) дней после инъекции AAV.FXN-HA (в возрасте 5 недель), прогрессирующая коррекция сердечного фенотипа наблюдалась у Mck мутантных самцов, но его было меньше у Mck мутантных самок. Не желая связывать себя какой-либо конкретной теорией, это различие может быть связано с более поздним началом сердечного фенотипа у самок по сравнению с самцами или с уменьшенным числом мышей, используемых до сих пор в этом протоколе.

[206] Данные результаты показывают, что системное введение rAAV-модифицированного FXN изменяет фенотип сердечного заболевания в модели на Mck мутантных мышах FRDA. Данные результаты дополнительно указывают на то, что введение rAAV-модифицированного FXN может предотвращать и/или обращать вспять FRDA у субъекта, который нуждается в этом.

[207] Через двадцать восемь (28) дней после инъекции rAAV-FXN, полное восстановление сердечной функции наблюдалось у обработанных мутантных Mck самцов и самок, что указывает на надежную коррекцию патологии с помощью инъекционного FXN-трансгена. То есть данные, показанные на фигурах 6А-6С, демонстрируют коррекцию в сердечном фенотипе FRDA через двадцать восемь (28) дней после введения rAAV-FXN. Более конкретно, Фигура 6А показывает массу левого желудочка (LVM) как обработанных мутантных мышей Mck, так и контрольных (WT немутантного типа Mck-Cre мыши) неразличима, в то время как необработанные (треугольные) мыши Mck-мутантов проявляют значительно большее LVm (*р<0,05). Фигура 6В показывает данные, демонстрирующего, что через 28 дней после обработки rAAV-FXN, как пожительные контроль (WT L3 Mck-Cre мыши; кружочки) и обработанные Mck мутантные (L-) мыши (квадрат), демонстрирующие по существу идентичные измерения сокращения (SF). Напротив, фигура 6 В демонстрирует, что необработанные Mck мутантные мыши (треугольники), демонстрирующие значительно уменьшенные SF (*р<0,05). Кроме того, на фигуре 6С показаны данные, демонстрирующие, что через 28 дней после лечения rAAV обработанные мутантные мыши Mck (квадраты) показали сердечный выброс, который был неотличим от контрольных мышей (кружочки) по сравнению с необработанными мутантными мышами Mck (треугольники), которые показали заметно уменьшенный сердечный выход (треугольники; * р<0,05). Все (обработанные и необработанные) мутантные мыши Mck сравнивали с контрольными необработанными мышами с использованием множественных критериев Стьюдента (способ Сидак-Бонферрони). Для каждого графика, показанного на фигурах 6А-6С, указывается *<0,05.

[208] Эти данные наглядно демонстрируют, что введение rAAV, включающего модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую фратаксин, может отменить и/или предотвратить фенотип Mck в искусственно распознанной мышиной модели FRDA.

Таким образом, эти данные подтверждают, что rAAV-модифицированное FXN-опосредованное лечение может быть потенциальным полезным терапевтическим средством для лечения или профилактики FRDA или заболевания, расстройства или состояния, опосредуемого уменьшенным уровнем немутантного типа (например, функционального) фратаксина у субъекта, который нуждается в этом. Хотя эти данные демонстрируют, что rAAX/-модифицированный-РХМ, который системно может лечить или предотвращать FRDA, эти результаты также подтверждают, что терапия также включает другие, например, более непосредственные пути введения rAAV-FXN, такие как, но не ограничиваясь этим, внутричерепные или прямое сердечное введение. То есть, поскольку системное введение было продемонстрировано как терапевтическое, квалифицированный специалист в данной области понимает на основании раскрытого в данном документе описания, что более прямые пути введения могут также обеспечивать терапевтическое преимущество.

[209] Данные результаты явно показывают, что генная терапия с использованием rAAV векторной доставки модифицированного FXN гена представляет собой потенциальный терапевтический подход для пациентов с FRDA и для лечения или предупреждения камней в почках у субъекта, демонстрирующего пониженный уровнь немутантного типа/функционального фратаксина.

Пример 3: Гистологическое исследование in vivo введения rAAV-FXN в мышиной модели атаксии Фридрейха

Дизайн исследования

[210] Двадцать четыре (24) 8-недельного возраста C57BL6/N самцов и самок мышей были оценены для гистопатологических анализов.

[211] Восемь (8) мышей содержали трансген Mck-Cre (MCK: Muscular Creatine Kinase), связанный с функционально сконструированным человеческим аллелем фратаксина (Mck-Cre × FXN L3/WT; далее в данном документе называемым как "Mck положительные контрольные мыши"). Шестнадцать (16) мышей содержали тот же самый трансген, который теперь ассоциирован с неактивным сконструированным аллелем фратаксина (Mck -Cre × FXN L3/L-; далее в данном документе называемым как "Mck мутантные мыши"). Среди мутантных мышей Mck, восьми (8) инъекционно вводили фратаксин-кодирующие rAAV2i8 (rAAV-FXN; 10¹³vg/кг) (далее в данном документе "обработанные Mck мутантные мыши"). Остальные восемь (8) мутантных мышей Mck получали эквивалентный объем солевой воды (далее в данном документе "необработанные Mck мутантные мыши"). Положительной контрольной группе мышей (Mck-Сге × FXN L3/WT) вводили солевую воду. Смотрите таблицу 7 ниже.

Способы

[212] После умерщвления, от всех животных регистрировали массу тела, длину тела и сердце, селезенку, почки, надпочечники и вес тела. Надпочечники, мозжечок, шейка матки, грудные и поясничные позвонки, гонады (яички и яичники), сердце, почки, печень, легкие, поджелудочная железа, простата у самцов, скелетные мышцы (икроножная мышца и камбаловидная мышца), селезенка и тимус были собраны от четырех (4) животных в группе для патологической оценки и анализа ИФА.

[213] Мозжечок (включая зубчатое ядро), шейные, грудные и поясничные дорзальные корневые ганглии, сердце, почки, печень, легкие, гонады, поджелудочная железа, скелетные мышцы (икроножные мышцы и подошва) и селезенка от 4 других животных на группу были сбраны и едленно замораженыя молекулярной биологии.

Гистология

[214] Мозжечок (включая зубчатое ядро), гонады, сердце, почки, печень, легкие, поджелудочную железу, скелетную мышцу (икроножную мышцу и подошву), селезенку и шейные, грудные и поясничные позвонки были фиксированными. Затем позвонки декальцифицировали, используя раствор ЭДТА. Все органы были прикреплены к парафину, чтобы получить участки размером 5 мкм, поперечные срезы для позвонков (включая как спинной мозг, так и спинные корневые ганглии) и сердце. Все органы были окрашены гематоксилином и эозином. Фиброз сердца оценивали с использованием окрашивания трихрома Массон.

Анализы ИФА

[215] Половина сердца, правая доля печени, и камбаловидная мышца и икроножная мышца были мгновенно заморожены сразу после сбора.

Результаты

[216] Макропатология

[217] Mck положительные контрольные самцы мышей были значительно более длинными по сравнению с необработанными мутантными мышами Mck и обработанными мутантными мышами Mck (9,39 см против 8,89 см [+5,62%]. Р = 0,011 [критерий Стьюдента]). Никакого другого значительного макроскопического поражения не наблюдалось, особенно никакого макроскопическое поражение или значительных изменений не наблюдалось в массе сердца у самцов и самок.

Гистология

Сердце

[218] Mck-Cre × FXN L3/WT: Минимальный интерстициальный фиброз наблюдался у одного положительного контрольного животного Mck (№58). Все остальные 3 сердца у положительных контрольных мышей были нормальными.

[219] Необработанные Mck-Cre × FXN L3/L-: Напротив, минимальный (мышь №38) и умеренный (мышей №41, №49 и 81) интерстициальный фиброз наблюдался у всех 4 необработанных мутантных мышей Mck. Это поражение было связано с эндокардиальным фокусом опухоли кардиомиоцитов у мышей №38 (минимальный) и №81 (незначительный). Фиброз ассоциировался с умеренным макрофагическим воспалением, минимальным распространенным отеком и легкой вакуолизацией кардиомиоцитов у мышей №41 и №49. Клетка Аничкова (совья форма глаза) наблюдались у мышей №41 и №81.

[220] Обработанные Mck-Cre × FXN L3/L-: В отличие от необработанных мутантных мышей Mck, сердца обработанных rAAV-FXN мутантных мышей Mck оказались нормальными, за исключением того, что у мышей №47 и №13 наблюдалось несколько ядер Аничкова.

Почки

[221] Во всех трех группах значительная минерализация часто наблюдалась в просвете нескольких мозговых канальцев. Частота минерализации составляла 4/4 для положительных контрольных животных Mck, 3/4 для необработанных мутантных животных Mck и 2/4 для обработанных rAAV-FXN мутантных животных Mck. Тяжесть минерализации оказалась уменьшенной в группе мутантов Mck, обработанной rAAV-FXN, по сравнению с Mck положительной контрольной и Mck необработанной мутантной группами. Тубулярную базофилию (регенерацию) наблюдали у 2/4 животных положительных контрольных мышей Mck, у 3/4 животных в необработанной мутантной группе Mck и у 1 животного в группе мутантов Mck, обработанной rAAV-FXN.

Печень: минимальное перипортальное воспаление наблюдалось у одного положительного контрольного животного Mck (№38).

Легкое: небольшое воспаление перибронхии наблюдалось у одного необработанного мутантного животного Mck (№41).

[222] Никаких других значительных микроскопических повреждений не наблюдалось. В частности, спинной мозг, ганглии дорзального корня и мозжечок были нормальными для всех групп.

Результаты гистологии

[223] Что касается гистологии, глазные ядра совы, опухоль и вакуолизация, наблюдаемые в кардиомиоцитах необработанных мутантных мышей Mck, являются основные этапы развития дегенерации сердца. Интерстициальный фиброз, связанный с воспалением макрофагов, может соответствовать смерти клеток кардиомиоцитов. Таким образом, кардиомиоциты необработанных мутантных мышей Mck дегенерируют, то есть клетки подвергаются пониженной функции, и патология развивается до гибели клеток и последующей сердечной недостаточности.

[224] Поразительно, что системная доставка rAAV-FXN меняет этот фенотип, и мутантные мыши Mck, обработанные rAAV (как самцы, так и самки), оказались нормальными и не показали значительного признака дегенерации кардиомиоцитов. Эти данные демонстрируют, что трансдукция rAAV-huFXN достаточно эффективна для того, чтобы обратить вспять эффекты инактивации гена эндогенного мышиного FXN. Таким образом, эти данные также подтверждают, что системное введение, опосредованное rAAV-FXN, может отменять и/или предотвращать заболевание, расстройство или состояние, опосредуемые сниженным уровнем немутантного типа (функционального) фратаксина, такого как, но не ограничиваясь этим, атаксия Фридрейха, у субъекта, который нуждается в этом. Как отмечалось ранее, квалифицированный специалист, вооруженный учениями по мгновенному раскрытию, будет понимать, что другие пути введения, например, более прямые маршруты, включая внутричерепные и в сердце, могут быть использованы для обеспечения терапевтического преимущества субъекту, который нуждается в этом.

[225] Анализ почек выявил наличие почечных камней в мозге как необработанного Mck-положительного контроля, так и необработанных мутантных животных Mck, что является необычным поражением. Поскольку для этих животных не было предложено никакой конкретной диеты и с учетом их возраста, частота и тяжесть поражений явно указывают на то, что это не побочное поражение, и поражение, связанное с генотипом. Интересно, что это серьезное поражение частично снижается при лечении rAAV-FXN, что указывает на то, что развитие камней в почках связано с изменением функции F×n и/или уровнем белка. Следовательно, так называемый L3-аллель, в котором мышиный ген фратаксина фланкирован последовательностями loxP (хотя и в интронных областях), может быть аллелем гипоморфа. Это согласуется с критической ролью митохондрий в этих клетках для поддержания активных транс-эпителиальных электролитов. Согласно знаний и убеждений заявителей, эти повреждения не сообщались в клинических наблюдениях при атаксии Фридрейха или в моделях мыши FRDA на сегодняшний день.

[226] Таким образом, изобретение охватывает способ лечения или профилактики заболевания, расстройства или состояния почек, включая, но не ограничиваясь этим, развитие или рост камней в почках у субъекта, нуждающегося в этом, в котором заболевание, расстройство или состояние почек опосредуется сниженным уровнем фратаксина (например, функционального и/или немутантного типа фратаксина) у субъекта.

[227] В одном варианте осуществления, изобретение включает оценку уровня фратаксина у субъекта, сравнивая уровень фратаксина у субъекта с уровнем фратаксина у субъекта который, как известно, не страдает камнями в почках, и/или сравнивая уровень фратаксина со " стандартным уровнем фратаксина", определяемым для здоровых людей или известных в данной области, и введения субъекту rAAV-модифицированного фратаксина, если уровень фратаксина у субъекта составляет меньше, чем уровень фратаксина у иного здорового индивидуума и/или ниже стандартного уровня фратаксина, тем самым обеспечивая лечение и/или предотвращая камни в почках у субъекта.

[228] Наконец, НА-окрашивание может использоваться для обнаружения rAAV-FXN-HA в клетках. Во-первых, это было бы важно, чтобы количественно определить, сколько клеток должно экспрессировать FXN для восстановления или поддержания сердечной функции. Во-вторых, ген Mck (и, следовательно, рекомбиназа Cre, приводимая в действие промотором Mck), как ожидается, не будет экспрессироваться в почках. Обнаружение или нет, rAAV-FXN-HA в почках может помочь выяснить, является ли образование камней в почках неожиданным прямым эффектом HA-FXN на гомеостазе мозга или нет.

Вывод

[229] В целом, представленные в данном документе данные демонстрируют, что введение, даже системное, rAAV, кодирующего модифицированный ген FXN, может лечить (предотвращать и/или реверсировать) эффекты, связанные с уменьшением или отсутствием фратаксина. Таким образом, данные, подтверждают, что rAAV-опосредованная экспрессия фратаксина в клетках и субъекты, нуждающиеся в этом, могут быть полезным терапевтическим средством для лечения заболевания или расстройства, связанного с или опосредованного отсутствием или дефицитом фратаксина, такого как, но не ограничиваясь этим, атаксия Фридрейха.

[230] Хотя раскрытые учения были описаны со ссылкой на различные применения, способы, наборы и композиции, будет понятно, что могут быть сделаны различные изменения и модификации без отступления от принципов настоящего изобретения и заявленного изобретения ниже. Вышеприведенные примеры приведены для лучшей иллюстрации раскрытых учений и не предназначены для ограничения сферы охвата представленных в данном документе представлений. Хотя настоящее изобретение описано в терминах этих иллюстративных вариантов осуществления, квалифицированный специалист в данной области легко поймет, что многочисленные варианты и модификации этих иллюстративных вариантов осуществления возможны без чрезмерного эксперимента. Все такие изменения и модификации находятся в рамках представленного раскрытия.

[231] Все цитируемые в данном документе ссылки, включая патенты, заявки на патент, документы, учебники и т.п., а также ссылки, цитируемые в них, в той мере, в которой они еще не включены, включены в настоящее описание посредством ссылки во всей их полноте. В случае, если одна или несколько включенных литературных источников и аналогичных материалов отличаются или противоречат данной заявке, включая, но не ограничиваясь определенными терминами, использование термина, описанные методы или тому подобное, регулируется данной заявкой.

[232] Вышеупомянутое описание и примеры подробно описывают некоторые конкретные варианты осуществления изобретения и описывают наилучший режим, предложенный изобретателями. Однако будет понятно, что независимо от того, насколько подробно изложено приведенное выше в тексте, изобретение может быть осуществлено на практике многими способами, и изобретение должно толковаться в соответствии с прилагаемой формулой изобретения и какими-либо ее эквивалентами.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Представленное изобретение касается модифицированного FXN гена, обеспечивающего повышенную экспрессию кодированного белка фратаксина, который может быть использован для лечения атаксии Фридрейха. 9 н. и 29 з.п. ф-лы, 6 ил., 8 табл., 3 пр.

1. Модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фратаксин (FXN), где модифицированная нуклеиновая кислота экспрессируется на более высоком уровне по сравнению с уровнем экспрессии немутантного типа FXN последовательности нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 2 в другой идентичной клетке, и причем модифицированная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты, выбранную из группы, состоящей из последовательности какой-либо одной из SEQ ID NO: 3-7.

2. Модифицированная нуклеиновая кислота по п. 1, где модифицированная нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, одну характеристику, выбранную из группы, состоящей из:

(a) CAI, по меньшей мере, 0,76, по меньшей мере, 0,86, по меньшей мере, 0,95, или, по меньшей мере, 0,98;

(b) содержания GC, по меньшей мере, 55%, по меньшей мере, 57%, по меньшей мере, 61%, или, по меньшей мере, 69%;

(c) количества CpG динуклеотидов меньше чем 124 или меньше чем 144.

3. Модифицированная нуклеиновая кислота по п. 1, где нуклеиновая кислота содержит, по меньшей мере, один из:

(a) содержания GC, по меньшей мере, 55%;

(c) количества CpG динуклеотидов не больше чем 117; и

(d) CAI, по меньшей мере, 0,86.

4. Модифицированная нуклеиновая кислота по п. 1, причем последовательность нуклеиновой кислоты выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 и SEQ ID NO: 7.

5. Модифицированная нуклеиновая кислота по п. 1, содержащая последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7.

6. Рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор для лечения атаксии Фридрейха (FRDA) у пациента, который в этом нуждается, содержащий модифицированную нуклеиновую кислоту по п. 1.

7. Вектор по п. 6, где модифицированная нуклеиновая кислота является самокомплементарной.

8. Рекомбинантный аденоассоциированный вирусный (rAAV) вектор для лечения атаксии Фридрейха (FRDA) у пациента, который в этом нуждается, содержащий модифицированную нуклеиновую кислоту по п. 1 и капсид, выбранный из группы, состоящей из капсида серотипа AAV: AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh10, AAVrh74, RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4, RHM15-6, AAV Hu.26, AAV1.1, AAV2.5, AAV6.1, AAV6.3.1, AAV9.45, AAV2i8, AAV2G9, AAV2i8G9, AAV2-TT, AAV2-TT-S312N, AAV3B-S312N и AAV-LK03.

9. Вектор rAAV по п. 8, в котором капсид выбирают из капсида серотипа AAV: AAV2i8, AAV9, AAV-LK03 и AAV2-TT-S312N.

10. Вектор rAAV по п. 9, в котором нуклеиновая кислота дополнительно содержит, по меньшей мере, один элемент, выбранный из группы, состоящей из: по меньшей мере, одной последовательности AAV терминального повтора, энхансера, промотора, последовательности стабилизации коллагена (CSS), стоп-кодона и сигнальной последовательности полиаденилирования (polyA).

11. Вектор rAAV по п. 10, в котором rAAV содержит две последовательности AAV терминального повтора, энхансер цитомегаловируса/промотор бета-актина кур (CBh), CSS, и сигнальную последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (bGHpolyA).

12. Вектор rAAV для лечения атаксии Фридрейха (FRDA) у пациента, который в этом нуждается, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую от 5’ до 3’:

(a) AAV2 терминальный повтор,

(b) промотор CBh, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты какую-либо одну из SEQ ID NO: 3 - 7;

(d) CSS, содержащая последовательность SEQ ID NO: 25;

(e) сигнальную последовательность bGHpolyA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 терминальный повтор.

13. Вектор rAAV по п. 12, дополнительно содержащий AAV2i8 капсид, причем VP1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 29, и где вектор содержит нуклеиновую кислоту, содержащую от 5’ до 3’:

(a) AAV2 терминальный повтор,

(b) промотор CBh, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты какую-либо одну из SEQ ID NO: 3 - 7;

(d) CSS, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25;

(e) сигнальную последовательность bGHpolyA, содержащую последовательность SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 терминальный повтор.

14. Вектор rAAV по п. 12, дополнительно содержащий капсид AAV2-TT-S312N, в котором VP1 содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 33, и где вектор содержит нуклеиновую кислоту, содержащую от 5’ до 3’:

(a) AAV2 терминальный повтор,

(b) промотор CBh, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты какую-либо одну из SEQ ID NO: 3 - 7;

(d) CSS, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25;

(e) сигнальную последовательность bGHpolyA, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 терминальный повтор.

15. Вектор rAAV по п. 12, дополнительно содержащий капсид AAV9, и где вектор содержит нуклеиновую кислоту, содержащую от 5’ до 3’:

(a) AAV2 терминальный повтор,

(b) промотор CBh, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты какую-либо одну из SEQ ID NO: 3 - 7;

(d) CSS, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25;

(e) сигнальную последовательность bGHpolyA, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 терминальный повтор.

16. Вектор rAAV по п. 6, где модифицированная нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7.

17. Фармацевтическая композиция для лечения атаксии Фридрейха (FRDA) у пациента, который в этом нуждается, содержащая вектор rAAV по п. 6 и фармацевтически приемлемый носитель.

18. Способ лечения FRDA у субъекта, где указанный способ включает введение терапевтически эффективного количества вектора rAAV по п. 6.

19. Способ по п. 18, в котором указанный вектор rAAV вводится системно, путем непосредственного сердечного введения или путем внутричерепного введение.

20. Способ по п. 19, в котором системное введение представляет собой внутривенное введение.

21. Способ по п. 19, в котором вектор rAAV вводится внутричерепно.

22. Способ по п. 19, в котором вектор rAAV вводится непосредственно в сердце.

23. Способ по п. 19, в котором указанная модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая FXN, содержит последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7.

24. Способ лечения заболевания, расстройства или состояния, опосредованного пониженным уровнем FXN у субъекта, где способ включает введение терапевтически эффективного количества вектора rAAV по п. 6.

25. Клетка-хозяин для продуцирования вектора rAAV, содержащая модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN по п. 1.

26. Клетка-хозяин по п. 25, где клетку выбирают из группы, состоящей из VERO, WI38, MRC5, A549, HEK293, B-50 HeLa клеток, HepG2, Saos-2, HuH7 и HT1080.

27. Клетка-хозяин по п. 26, где клетка представляет собой клетку HEK293, адаптированную к росту в суспензионной культуре.

28. Клетка-хозяин по п. 26, где клетка представляет собой клетку HEK293, имеющую номер в американской коллекции клеточных культур (ATCC) No. PTA 13274.

29. Клетка-хозяин по п. 25, где указанная клетка содержит, по меньшей мере, одну нуклеиновую кислоту, кодирующую, по меньшей мере, один белок, который выбирают из группы, состоящей из белка репликации (Rep), капсидного (Cap) белка, белка аденовируса ранней области 1а (E1a), E1b белка, E2a белка, E4 белка и вирус-ассоциированной (VA) РНК.

30. Модифицированная нуклеиновая кислота, кодирующая фратаксин по п. 1 для применения в увеличении уровня фратаксина в клетке.

31. Способ повышения уровня фратаксина в клетке, где способ включает трансдуцирование клетки с вектором rAAV по п. 12.

32. Вектор rAAV по п. 12 для применения в лечении атаксии Фридрейха у субъекта.

33. Вектор rAAV по п. 10, содержащий нуклеиновую кислоту, содержащую от 5 'до 3':

(а) AAV2 терминальный повтор;

(b) промотор CBh, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7;

(d) сигнальную последовательность bGHpolyA, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27; и

(e) AAV2 терминальный повтор.

34. Вектор rAAV по п. 33, дополнительно содержащий капсид, выбранный из группы, состоящей из капсида серотипа AAV: AAV2i8, AAV9, AAV-LK03 и AAV2-TT-S312N.

35. Вектор rAAV по п. 33, дополнительно содержащий СSS, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25 непосредственно после последовательности, кодирующей FXN.

36. Вектор rAAV по п. 33, содержащий капсид AAV2i8 и содержащий неклеиновую кислоту, содержащую от 5 'до 3':

(а) AAV2 терминальный повтор;

(b) промотор CBh, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7;

(d) СSS, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25;

(e) сигнальную последовательность bGHpolyA, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 терминальный повтор.

37. Вектор rAAV по п. 33, содержащий капсид AAV9 и содержащий неклеиновую кислоту, содержащую от 5 'до 3':

(а) AAV2 терминальный повтор;

(b) промотор CBh, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7;

(d) СSS, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25;

(e) сигнальную последовательность bGHpolyA, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 терминальный повтор.

38. Вектор rAAV по п. 33, содержащий капсид AAV-LK03 и содержащий неклеиновую кислоту, содержащую от 5 'до 3':

(а) AAV2 терминальный повтор;

(b) промотор CBh, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 26;

(c) модифицированную нуклеиновую кислоту, кодирующую FXN, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 7;

(d) СSS, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 25;

(e) сигнальную последовательность bGHpolyA, содержащую последовательность нуклеиновой кислоты SEQ ID NO: 27; и

(f) AAV2 терминальный повтор.