ВАРИАНТЫ КИСЛОЙ АЛЬФА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C12N9/24 C12N15/62 C12N15/86 C12N5/10 A61K38/47 A61P3/00 

Настоящее изобретение относится к вариантам кислой α-глюкозидазы и их применению.

Болезнь Помпе, также известная как болезнь накопления гликогена (GSD) II типа и недостаточность кислой мальтазы, представляет собой аутосомно-рецессивную метаболическую миопатию, обусловленную недостаточностью лизосомного фермента кислой α-глюкозидазы (GAA). GAA представляет собой экзо-1,4 и 1,6-α-глюкозидазу, которая гидролизует гликоген до глюкозы в лизосоме. Недостаточность GAA ведет к накоплению гликогена в лизосомах и вызывает нарастающее повреждение дыхательных, сердечных и скелетных мышц. Заболевание варьирует от быстро прогрессирующего детского течения, которое обычно фатально к возрасту в 1-2 года, до более медленно прогрессирующего и гетерогенного течения, которое обуславливает значимую распространенность болезни и раннюю смертность у детей и взрослых. Hirschhorn RR, The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, 3: 3389-3420 (2001, McGraw-Hill); Van der Ploeg and Reuser, Lancet 372: 1342-1351 (2008).

Существующая терапия человека для лечения болезни Помпе включает введение рекомбинантной GAA человека, которое иначе называют ферментозаместительной терапией (ERT). Продемонстрирован ERT эффект при тяжелой детской GSDII. Однако польза ферментативной терапии ограничена необходимостью частых инфузий и развитием ингибиторных антител против рекомбинантной hGAA (Amalfitano, A., et al. (2001) Genet. In Med. 3:132-138). Кроме того, ERT не обеспечивает эффективную коррекцию во всем организме, вероятно, из-за комбинации плохого биораспределения белка после доставки в периферическую вену, отсутствия захвата из некоторых тканей и высокой иммуногенности.

В качестве альтернативы или вспомогательного средства для ERT исследовали выполнимость подходов генной терапии для того, чтобы лечить GSDII (Amalfitano, A., et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8861-8866, Ding, E., et al. (2002) Mol. Ther. 5:436-446, Fraites, T. J., et al. (2002) Mol. Ther. 5:571-578, Tsujino, S., et al. (1998) Hum. Gene Ther. 9:1609-1616). Однако направленный в мышцы перенос генов для того, чтобы корректировать генетический дефект, столкнулся с ограничением системной природой заболевания и тем фактом, что экспрессия трансгена в мышцах обычно бывает более иммуногенной по сравнению с другими тканями.

Doerfler et al., 2016 описывают комбинированное введение двух конструкций, кодирующих GAA человека с оптимизацией кодонов, одна под управлением специфического промотора печени и другая под управлением специфического промотора мышц. Управляемую специфическим промотором печени экспрессию GAA используют для содействия иммунологической толерантности к GAA в модели на Gaa-/- мышах, тогда как управляемая специфическим промотором мышц экспрессия GAA обеспечивает экспрессию терапевтического белка в части тканей, на которые направлена терапия. Однако эта стратегия не является полностью удовлетворительной в том отношении, что она требует использования нескольких конструкций и не ведет к экспрессии GAA по всему организму.

В прошлом предложены модифицированные белки GAA для усовершенствования лечения лизосомной болезни накопления. В частности, в заявке WO2004064750 и Sun et al. 2006 раскрыт химерный полипептид GAA, содержащий сигнальный пептид, функционально связанный с GAA, в качестве способа усиления направленности белка в секреторный путь.

Однако терапия, доступная пациенту, не является полностью удовлетворительной, и в данной области все еще необходимы усовершенствованные полипептиды GAA и продуцирование GAA. В частности, все еще существует потребность в долгосрочном эффекте лечения с использованием GAA, продуцировании GAA на высоком уровне, усовершенствованной иммунологической толерантности к получаемому полипептиду GAA и усовершенствованном захвате GAA клетками и тканями, нуждающимися в нем. Кроме того, в WO2004064750 и Sun et al., 2006, раскрыто распределение химерного полипептида GAA в тканях, которое не является полностью удовлетворительным. Следовательно, все еще существует потребность в полипептиде GAA, который будет полностью терапевтическим, допуская коррекцию накопления гликогена в большинстве, если не во всех, тканей, представляющих интерес.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к вариантам GAA, которые экспрессируют и секретируют на более высоких уровнях по сравнению с белком GAA дикого типа и которые обеспечивают усовершенствованную коррекцию патологического накопления гликогена по всему организму и ведут к индукции иммунологической толерантности к GAA.

По одному из аспектов, изобретение относится к усеченному полипептиду GAA, который содержит делецию по меньшей мере одной аминокислоты с N-конца родительского полипептида GAA, где родительский полипептид соответствует форме предшественника полипептида GAA, свободного от его сигнального пептида. В конкретном варианте осуществления указанный усеченный полипептид GAA имеет по меньшей мере 2, в частности, по меньшей мере 2, в частности, по меньшей мере 3, в частности, по меньшей мере 4, в частности, по меньшей мере 5, в частности, по меньшей мере 6, в частности, по меньшей мере 7, в частности, по меньшей мере 8 последовательных аминокислот, на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA. В другом варианте осуществления указанный усеченный полипептид GAA имеет самое большее 75, в частности самое большее 70, в частности самое большее 60, в частности самое большее 55, в частности самое большее 50, в частности самое большее 47, в частности самое большее 46, в частности самое большее 45, в частности самое большее 44, в частности самое большее 43 последовательных аминокислот, удаленных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA. В дополнительном конкретном варианте осуществления, указанный усеченный полипептид GAA имеет самое большее 47, в частности самое большее 46, в частности самое большее 45, в частности самое большее 44, в частности самое большее 43 последовательных аминокислот, удаленных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA. В другом конкретном варианте осуществления указанный усеченный полипептид GAA имеет от 1 до 75, в частности, от 1 до 47, в частности, от 1 до 46, в частности, от 1 до 45, в частности, от 1 до 44, в частности, от 1 до 43 последовательных аминокислот, удаленных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA. В другом варианте осуществления указанный усеченный полипептид GAA имеет от 2 до 43, в частности, от 3 до 43, в частности, от 4 до 43, в частности, от 5 до 43, в частности, от 6 до 43, в частности, от 7 до 43, в частности, от 8 до 43 последовательных аминокислот, удаленных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA. В более конкретном варианте осуществления, указанный усеченный полипептид GAA имеет 6, 7, 8, 9, 10, 27, 28, 29, 30, 31, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 или 47 последовательных аминокислот, удаленных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA, в частности, 7, 8, 9, 28, 29, 30, 41, 42, 43 или 44, более конкретно 8, 29, 42 или 43 последовательных аминокислот, усеченных на его N-конце, по сравнению с родительским полипептидом GAA. В дополнительном конкретном варианте осуществления, родительский полипептид представляет собой GAA человека (hGAA), в частности hGAA, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В конкретном варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34 и SEQ ID NO: 35.

Кроме того, усеченный полипептид GAA по изобретению дополнительно может содержать сигнальный пептид, слитый с его N-концом, в частности сигнальный пептид, выбранный в группе, состоящей из SEQ ID NO: с 3 до 7, в частности сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3.

В другом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченный полипептид GAA, как описано выше, необязательно слитый с сигнальным пептидом через его N-конец. В некоторых вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты имеет нуклеотидную последовательность, оптимизированную для того, чтобы усовершенствовать экспрессию и/или усовершенствовать иммунологическую толерантность для усеченного полипептида GAA in vivo, в частности у человеческого субъекта.

В еще одном аспекте изобретение относится к конструкции нуклеиновой кислоты, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, функционально связанную с одной или несколькими регуляторными последовательностями, таким как промотор, интрон, сигнал полиаденилирования и/или энхансер (например, цис-регуляторный модуль, или CRM). В конкретном варианте осуществления промотор представляет собой специфический промотор печени, предпочтительно выбранный в группе, состоящей из промотора α-1-антитрипсина (hAAT), промотора транстиретина, промотора альбумина и промотора тироксинсвязывающего глобулина (TBG). В другом конкретном варианте осуществления промотор представляет собой специфически промотор мышц, такой как промоторы Spc5-12, MCK и десмина. В другом варианте осуществления промотор представляет собой универсальный промотор, такой как промоторы CMV, CAG и PGK. Конструкция нуклеиновой кислоты дополнительно может необязательно содержать интрон, в частности интрон, выбранный в группе, состоящей из интрона β-глобина b2 человека (или HBB2), интрона FIX, интрона β-глобина курицы и интрона SV40, где указанный интрон необязательно представляет собой модифицированный интрон, такой как модифицированный интрон HBB2 из SEQ ID NO: 17, модифицированный интрон FIX из SEQ ID NO: 19 или модифицированный интрон β-глобина курицы из SEQ ID NO: 21. В конкретном варианте осуществления конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению указанная конструкция содержит, предпочтительно в этом порядке: энхансер; интрон; промотор, в частности специфический промотор печени; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок GAA; и сигнал полиаденилирования, конструкция содержит, предпочтительно в этом порядке: управляющую область ApoE; интрон HBB2, в частности, модифицированный интрон HBB2; промотор hAAT; последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую усеченный полипептид GAA; и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста. В конкретных вариантах осуществления указанная конструкция нуклеиновой кислоты более конкретно содержит нуклеотидную последовательность из любой одной из SEQ ID NO: с 22 до 26.

В другом аспекте изобретение относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию нуклеиновой кислоты, раскрытые в настоящем описании. Вектор по изобретению в частности может представлять собой вирусный вектор, предпочтительно ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор, или AAV вектор. Предпочтительно, вектор представляет собой одноцепочечный или двухцепочечный самокомплементарный AAV вектор, предпочтительно AAV вектор с происходящим из AAV капсидом, например, капсидом из AAV1, AAV2, варианта AAV2, AAV3, варианта AAV3, AAV3B, варианта AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, варианта AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, такого как AAVcy10 и AAVrh10, AAVrh74, AAVdj, AAV-Anc80, AAV-LK03, AAV2i8, AAV свиньи, таким как капсид AAVpo4 и AAVpo6, или с химерным капсидом. В конкретном варианте осуществления вектор представляет собой AAV вектор с капсидом AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8, в частности капсидом AAV8, AAV9 или AAVrh74, более конкретно капсидом AAV8.

В еще одном аспекте изобретение относится к клетке, трансформированной молекулой нуклеиновой кислоты, конструкцией нуклеиновой кислоты или вектором по изобретению. Более конкретно, клетка представляет собой клетку печени или клетку мышцы.

В конкретном аспекте, изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит, в фармацевтически приемлемом носителе, усеченный полипептид GAA, молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты, вектор или клетку по изобретению.

Изобретение дополнительно относится к усеченному полипептиду GAA, молекуле нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектору или клетке по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Изобретение дополнительно предусматривает усеченный полипептид GAA, молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты, вектор или клетку по изобретению для применения в способе лечения болезни накопления гликогена. В конкретном варианте осуществления болезнь накопления гликогена представляет собой GSDI, GSDII, GSDIII, GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII или летальную врожденную болезнь накопления гликогена в сердце. В более конкретном варианте осуществления, болезнь накопления гликогена выбирают в группе, состоящей из GSDI, GSDII и GSDIII, более конкретно в группе, состоящей из GSDII и GSDIII. В даже более конкретном варианте осуществления болезнь накопления гликогена представляет собой GSDII.

ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. Делеция частей hGAA увеличивает ее секрецию in vitro. Часть A. Клетки гепатомы человека (Huh7) трансфицировали с использованием Lipofectamine^TM и контрольной плазмиды, экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), или плазмид, экспрессирующих hGAA дикого типа (hGAA) или последовательность hGAA, оптимизированную в соответствии с двумя различными алгоритмами (hGAAco1 и co2, соответственно). Различные конструкции hGAA содержали сигнальный пептид дикого типа или сигнальный пептид α-1-антитрипсина человека (sp2). Усеченную hGAA получали посредством делеции 8 аминокислот после сигнального пептида (Δ8). Через 48 часов после трансфекции, активность hGAA в средах для культивирования измеряли посредством флуорогенного ферментативного анализа и активность GAA оценивали по калибровочной кривой продукта реакции, как указано в Материалах и способах. График гистограммы показывает усредненное±SE для уровней секретируемой hGAA, происходящих из трех различных экспериментов. Статистический анализ выполняли посредством парного критерия Стьюдента, на гистограмме приведены полученные p-значения (*=p<0,05, как указано). Часть B. Клетки гепатомы человека (Huh7) трансфицировали с использованием липофектамина и контрольной плазмиды, экспрессирующей GFP, или плазмид, экспрессирующих hGAAco1 с сигнальным пептидом дикого типа или сигнального пептида химотрипсиногена B1 (sp7). Белок hGAA усекали посредством удаления 8 или 42 аминокислот после сигнального пептида (Δ8 и Δ42, соответственно). Через 48 часов после трансфекции, активность hGAA в средах для культивирования измеряли посредством флуорогенного ферментативного анализа, как указано выше. График гистограммы показывает усредненное±SE для уровней секретируемой hGAA, происходящих из трех различных экспериментов. Статистический анализ выполняли посредством ANOVA (*=p<0,05, как указано).

Фиг. 2. Делеция частей hGAA увеличивает ее секрецию в кровоток в модели болезни Помпе на мышах. В возрасте 3 месяцев GAA-/- мышам (n=4-5 мышей/группа) внутривенно инъецировали PBS или 2E12 вг/кг AAV8 векторов, экспрессирующих hGAA с оптимизированной последовательностью (hGAAco1) под транскрипционным управлением специфического промотора печени. Сигнальный пептид дикого типа из hGAA заменяли на сигнальный пептид химотрипсиногена B1 (sp7), а последовательность hGAA использовали в качестве полноразмерной нативной последовательности или усеченной посредством удаления 8 или 42 аминокислот после сигнального пептида (Δ8 и Δ42, соответственно). Через один месяц после инъекции у мышей брали кровь и измеряли активность hGAA с использованием флуорогенного анализа в сыворотке. Статистический анализ осуществляли посредством ANOVA (*=p<0,05, как указано).

Фиг. 3. Сигнальные пептиды усиливают секрецию hGAA. Клетки гепатомы человека (Huh7) трансфицировали с использованием Lipofectamine^TM и контрольной плазмиды (GFP), плазмиды, экспрессирующей hGAA дикого типа (обозначено как sp1), или плазмид, экспрессирующих Δ8 hGAA (hGAAco) с оптимизированной последовательностью, слитую с сигнальными пептидами 6-8 (sp6-8). Через 48 часов после трансфекции активность hGAA в средах для культивирования измеряли посредством флуорогенного ферментативного анализа, и активность GAA оценивали по калибровочной кривой для 4-метилумбеллиферона. График гистограммы показывает усредненное±SE для уровней секретируемой hGAA, происходящих из трех различных экспериментов. Статистический анализ выполняли посредством ANOVA (*=p<0,05 в сравнении с клетками с имитированной трансфекцией).

Фиг. 4. Усеченная Δ8 hGAA эффективно корректирует накопление гликогена в модели болезни Помпе на мышах. В возрасте 4 месяцев мышам дикого типа (WT) и GAA-/- мышам (n=4-5 мышей/группа) внутривенно инъецировали PBS или 6E11 вг/кг AAV8 векторов, экспрессирующих Δ8 hGAA (hGAAco) с оптимизированной последовательностью под транскрипционным управлением промотора α-1-антитрипсина человека и слитую с сигнальным пептидом 1, 2, 7 и 8 (sp1, 2, 7, 8). Часть A. Гистограмма показывает активность hGAA, измеряемую посредством флуорогенного анализа в крови через 3 месяца после инъекции векторов. Статистический анализ выполняли посредством ANOVA, на гистограмме приведены полученные p-значения в сравнении с GAA-/- животными, которых лечили PBS (*=p<0,05). Часть B-D. Биохимическая коррекция содержания гликогена в сердце, диафрагме и квадрицепсе. В возрасте 4 месяцев GAA-/- мышей лечили как описано выше. Через 3 месяца после инъекций мышей умерщвляли и оценивали содержание гликогена. Гистограммы показывают содержание гликогена, выражаемое в виде глюкозы, высвобождаемой после ферментативного расщепления гликогена, измеряемого в сердце (часть B), диафрагме (часть C) и квадрицепсе (часть D). Статистический анализ выполняли посредством ANOVA (*=p<0,05 в сравнении с GAA-/- мышами, которым инъецировали PBS).

Фиг. 5. Высоко секретируемая hGAA снижает гуморальный ответ в модели болезни Помпе на мышах. В возрасте 4 месяцев GAA-/- мышам внутривенно инъецировали PBS или две различные дозы (5E11 или 2E12 вг/кг) AAV8 векторов, содержащих оптимизированную последовательность под транскрипционным управлением промотора α-1-антитрипсина человека, которые кодируют Δ8 hGAA, слитой с сигнальным пептидом 1 (co), сигнальным пептидом 2 (sp2-Δ8-co), сигнальным пептидом 7 (sp7-Δ8-co) или сигнальным пептидом 8 (sp8-Δ8-co). Через 1 месяц после инъекций, сыворотки анализировали на присутствие антител против hGAA посредством ELISA. Количественное определение выполняли с использованием очищенного IgG мыши в качестве стандарта. Статистический анализ выполняли посредством ANOVA с использованием апостериорного критерия Даннета (*=p<0,01).

Фиг. 6. Инъекция AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1 ведет к эффективной секреции hGAA в крови и захвату в мышце у NHP. Двум обезьянам Macaca fascicularis в сутки 0 инъецировали 2E12 вг/кг AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1. Часть A. Выполняли вестерн-блоттинг hGAA в сыворотке от двух обезьян, которую получали за 12 суток до и через 30 суток после введения вектора. Слева показаны положения полос маркера молекулярной массы, идущего параллельно с образцами. Часть B. Через 3 месяца после инъекции вектора обезьян умерщвляли и собирали ткани для биохимической оценки захвата hGAA. Вестерн-блоттинг hGAA осуществляли в экстрактах тканей, полученных из бицепса и диафрагмы. Антитело против тубулина использовали в качестве контроля загрузки. Слева показаны положения полос маркера молекулярной массы, идущего параллельно с образцами.

Фиг. 7. Биохимическая коррекция содержания гликогена в печени GDE-/- животных, которым инъецировали экспрессирующий hGAA вектор. В возрасте 3 месяцев мышам дикого типа (WT) или GDE-/- мышам внутривенно инъецировали PBS или AAV8 векторы, экспрессирующие hGAA с оптимизированными кодонами под транскрипционным управлением промотора α-1-антитрипсина человека и слитую с сигнальным пептидом 7 (AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1) в дозе 1E11 или 1E12 вг/мышь. График гистограммы показывает содержание гликогена, выражаемое в виде глюкозы, высвобождаемой после ферментативного расщепления гликогена, измеряемого в печени. Статистический анализ осуществляли посредством ANOVA (*=p<0,05 в сравнении с GDE-/- мышами, которым инъецировали PBS, =p<0,05 в сравнении с животными WT, которым инъецировали PBS).

Фиг. 8. Активность GAA в средах клеток, трансфицированных плазмидами, кодирующими различные варианты GAA. Активность GAA измеряли в средах клеток HuH7 через 24 (часть A) и 48 (часть B) часов после трансфекции плазмидами, содержащими оптимизированные последовательности, кодирующие нативную GAA, комбинированную с нативным сигнальным пептидом sp1 GAA (co), или кодирующие сконструированную GAA, содержащую нативную GAA, комбинированную с гетерологичным сигнальным пептидом sp7 (sp7-co). Оценивали эффект различных делеций в кодирующей последовательности GAA после сигнального пептида sp7 (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co, sp7-Δ47-co, sp7-Δ62-co). Плазмиду, кодирующую eGFP, использовали в качестве отрицательного контроля. Статистический анализ осуществляли посредством однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки. Знак диез (#) в столбцах обозначает статистически значимые различия в сравнении с co; символ тау (τ) обозначает статистически значимые различия в сравнении с sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co. Данные представляют собой усредненное±SD для двух независимых экспериментов. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001, за исключением использования различных символов.

Фиг. 9. Внутриклеточная активность GAA различных вариантов GAA. Активность GAA измеряли в лизатах клеток HuH7 через 48 часов после трансфекции плазмидами, содержащими оптимизированные последовательности, кодирующие нативную GAA, комбинированную с нативным сигнальным пептидом sp1 GAA (co), или кодирующие сконструированную GAA, содержащую нативную GAA, комбинированную с гетерологичным сигнальным пептидом sp7 (sp7-co). Оценивали эффект различных делеций в кодирующей последовательности GAA после сигнального пептида (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co, sp7-Δ47-co, sp7-Δ62-co). Плазмиду, кодирующую eGFP, использовали в качестве отрицательного контроля. Статистический анализ осуществляли посредством однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки. Символ тау (τ) обозначает статистически значимые различия в сравнении с sp7-co, sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co. Данные представляют собой усредненное±SD для двух независимых экспериментов. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001, за исключением использования различных символов.

Фиг. 10. Увеличенная активность GAA в средах клеток при использовании делеции Δ8, комбинированной с сигнальными пептидами sp6 или sp8. Активность GAA измеряли в средах (часть A) и лизатах (часть B) клеток HuH7 через 48 часов после трансфекции плазмидами, содержащими оптимизированные последовательности, кодирующие нативную GAA, комбинированную с нативным сигнальным пептидом sp1 GAA (co), или кодирующие сконструированную GAA, содержащую нативную GAA, комбинированную с гетерологичным сигнальным пептидом sp6 или sp8 (sp6-co или sp8-co). Оценивали эффект делеции 8 аминокислот в кодирующей последовательности GAA после сигнального пептида (sp6-Δ8-co, sp8-Δ8-co). Плазмиду, кодирующую eGFP, использовали в качестве отрицательного контроля. Статистический анализ осуществляли посредством однофакторного дисперсионного анализа с апостериорным критерием Тьюки. Звездочки в столбцах обозначают статистически значимые различия в сравнении с co. Данные представляют собой усредненное±SD для двух независимых экспериментов. *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ****p<0,0001, за исключением использования различных символов.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к усеченному полипептиду GAA, к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей такой усеченный полипептид GAA, к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей указанную нуклеиновую кислоту, к вектору, содержащему указанную конструкцию нуклеиновой кислоты, к клетке, содержащей указанную молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию или вектор, и к фармацевтической композиции, содержащей полипептид, молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты, вектору или клетку в соответствии с изобретением. Авторы изобретения к удивлению показали, что усеченная форма GAA в соответствии с изобретением значительно усовершенствует секрецию GAA, при этом снижая ее иммуногенность.

Лизосомная кислая α-глюкозидаза или «GAA» (E.C. 3.2.1.20) (1,4-α-D-глюканглюкогидролаза) представляет собой экзо-1,4-α-D-глюкозидазу, которая гидролизует как α-1,4, так и α-1,6 связи в олигосахаридах для того, чтобы высвобождать глюкозу. Недостаточность GAA ведет к болезни накопления гликогена II типа (GSDII), также обозначаемой как болезнь Помпе (несмотря на то, что этот термин формально относится к форме заболевания с детским началом). Она катализирует полное разрушение гликогена с замедлением в точках ветвления. ген кислой α-глюкозидазы человека в 28 т. о. на хромосоме 17 кодирует мРНК в 3,6 т. о., которая продуцирует полипептид из 951 аминокислот (Hoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697; Martiniuk et al., (1990) DNA and Cell Biology 9: 85). Фермент допускает котрансляционное N-связанное гликозилирование в эндоплазматическом ретикулуме. Он синтезируются в виде формы предшественника 110 кДа, которая созревает путем обширной модификации гликозилирования, фосфорилирования и путем протеолитического процессинга через эндосомальную промежуточную структуру приблизительно 90 кДа до конечных лизосомных форм 76 и 67 кДа (Hoefsloot, (1988) EMBO J. 7: 1697; Hoefsloot et al., (1990) Biochem. J. 272: 485; Wisselaar et al., (1993) J. Biol. Chem. 268: 2223; Hermans et al., (1993) Biochem. J. 289: 681).

У пациентов с GSDII недостаточность кислой α-глюкозидазы вызывает массовое накопление гликогена в лизосомах, нарушая клеточную функцию (Hirschhorn, R. and Reuser, A. J. (2001), The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease, (ред. Scriver, C. R. et al.), стр. 3389-3419 (McGraw-Hill, New York). При наиболее распространенной детской форме пациенты демонстрируют нарастающую дегенерацию мышц и кардиомиопатию и погибают до достижения возраста в два года. В формах с ювенильным и взрослым началом имеет место тяжелое истощение.

Кроме того, пациенты, имеющие другие GSD, могут получать пользу от введения оптимизированной формы GAA. Например, показано (Sun et al. (2013) Mol Genet Metab 108(2): 145; WO2010/005565), что введение GAA снижает гликоген в первичных миобластах у пациентов с болезнью накопления гликогена III типа (GSDIII).

В частности, в контексте настоящего изобретения, «форма предшественника GAA» представляет собой форму полипептида GAA, которая содержит ее природный сигнальный пептид. Например, последовательность из SEQ ID NO: 2 представляет собой форму предшественника GAA человека (hGAA). В SEQ ID NO: 2 аминокислотные остатки 1-27 соответствуют сигнальному пептиду из полипептида hGAA. Эта последовательность сигнального пептида hGAA также представлена в SEQ ID NO: 4.

В контексте настоящего изобретения, усеченный полипептид GAA по изобретению происходит из родительского полипептида GAA. В соответствии с настоящим изобретением, «родительский полипептид GAA» представляет собой функциональную последовательность предшественника GAA, как определено выше, но свободную от ее сигнального пептида. Например, со ссылкой на типичный полипептид GAA человека дикого типа, полный полипептид GAA дикого типа (т. е. форма предшественника GAA) представлен в SEQ ID NO: 2 или в SEQ ID NO: 30 и имеет сигнальный пептид (соответствующий аминокислотам 1-27 из SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 30), тогда как родительский полипептид GAA, служащий в качестве основы для усеченных форм GAA этих полипептидов GAA человека дикого типа, представлены в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 33, соответственно, и не имеют сигнального пептида. В этом примере, последнее, соответствующее аминокислотам 28-952 из SEQ ID NO: 2 и аминокислотам 28-952 из SEQ ID NO: 30, обозначают как родительский полипептид GAA.

В соответствии с изобретением, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой функциональный полипептид GAA, т. е. он обладает функциональностью полипептида GAA дикого типа. Как определено выше, функциональность GAA дикого типа состоит в том, чтобы гидролизовать как α-1,4, так и α-1,6 связи олигосахаридов и полисахаридов, более конкретно гликогена, чтобы высвобождать глюкозу. Функциональный белок GAA, кодируемый нуклеиновой кислотой по изобретению, может иметь гидролитическую активность в отношении гликогена по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или по меньшей мере 100% по сравнению с полипептидом GAA дикого типа из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33. Активность белка GAA кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению даже может быть больше чем 100%, например, больше чем 110%, 120%, 130%, 140% или даже больше чем 150% от активности белка GAA дикого типа из SEQ ID NO: 1 или из SEQ ID NO: 33.

Аминокислотная последовательность родительского полипептида GAA или ее кодирующая последовательность могут происходить из любого источника, в том числе биологических видов птиц и млекопитающих. Термин «птицы», как используют в настоящем описании, включает, но не ограничиваясь этим, курицу, утку, гуся, перепелку, индюшку и фазана. Термин «млекопитающее», как используют в настоящем описании, включает, но не ограничиваясь этим, человека, обезьянообразных и других не являющиеся человеком приматов, корову, овцу, козу, лошадь, кошку, собаку, зайцеобразных и т. д. В вариантах осуществления изобретения, родительский полипептид GAA представляет собой полипептид GAA человека, мыши или перепелки, в частности человека.

Кроме того, родительский полипептид GAA может представлять собой функциональный вариант полипептида GAA, который содержит одну или несколько аминокислотных модификаций, таких как аминокислотная инсерция, делеция и/или замена по сравнению с полипептидом GAA. Например, родительский полипептид может представлять собой функциональное производное полипептида GAA человека, такого как полипептид из SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, обладающее по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или по меньшей мере 99% идентичностью последовательностей с этим полипептидом GAA человека. Например, в дополнение к усечению, которое определено выше, функциональный вариант полипептида GAA может иметь между 0 и 50, между 0 и 30, между 0 и 20, между 0 и 15, между 0 и 10 или между 0 и 5 аминокислотными изменениями в родительском полипептиде GAA, таком как родительский полипептид GAA, приведенный в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1. В частности, родительский полипептид GAA может состоять из полипептида GAA человека, имеющего аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

Термин «идентичный» и его производные относятся к идентичности последовательностей между двумя молекулами нуклеиновой кислоты. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занимает одно и то же основание, например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занимает аденин, то молекулы идентичны в этом положении. % идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа совпадающих положений, которыми обладают две последовательности, деленного на число сравниваемых положений, × 100. Например, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают, то две последовательности идентичны на 60%. В целом, сравнение выполняют, когда две последовательности выровнены для того, чтобы давать максимальную идентичность. Различные биоинформационные инструменты, известные специалисту в данной области, можно использовать для выравнивания последовательностей нуклеиновой кислоты, например, BLAST или FASTA.

Родительский полипептид GAA также может представлять собой вариант GAA, такой как GAA II, как описано Kunita et al., (1997) Biochemica et Biophysica Acta 1362: 269; полиморфизмы и SNP в GAA описаны Hirschhorn, R. and Reuser, A. J. (2001), The Metabolic and Molecular Basis for Inherited Disease (ред. Scriver, C. R., Beaudet, A. L., Sly, W. S. и Valle, D.), стр. 3389-3419. McGraw-Hill, New York, см. стр. 3403-3405. Любой вариант полипептида GAA, известный в данной области, можно использовать в качестве основы для определения родительского полипептида GAA. Иллюстративные варианты полипептидов GAA включают SEQ ID NO: 2 (эталонная последовательность NCBI NP_000143.2); SEQ ID NO: 29 (GenBank AAA52506.1); SEQ ID NO: 30 (GenBank CAA68763.1); SEQ ID NO: 31 (GenBank: EAW89583.1) и SEQ ID NO: 32 (GenBank ABI53718.1). Другие эффективные варианты включают те, которые описаны в Hoefsloot et al., (1988) EMBO J. 7: 1697; и Van Hove et al., (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 65 (человек), и номер доступа Genbank NM_008064 (мышь). Другие варианты полипептидов GAA включают те, которые описаны в WO2012/145644, WO00/34451 и US6858425. В конкретном варианте осуществления родительский полипептид GAA происходит от аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 30.

Усеченная форма GAA в соответствии с изобретением представляет собой усеченную по N-концу форму родительского полипептида GAA, в которой по меньшей мере одна аминокислота удалена с N-конца указанного родительского полипептида GAA.

Под «усеченной формой» понимают полипептид GAA, который содержит одну или несколько последовательных аминокислот, удаленных из N-концевой части родительского полипептида GAA. Например, фрагмент GAA может иметь от 1 до 75 последовательных аминокислот или больше чем 75 последовательных аминокислот, усеченных с ее N-конца, по сравнению с родительским полипептидом GAA. В частности, усеченный полипептид GAA может иметь 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74 или 75 последовательных аминокислот, усеченных с ее N-конца по сравнению с родительским белком GAA (в частности, усеченная форма родительского белка hGAA, приведенная в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1). Используя альтернативную номенклатуру, полипептид GAA в результате усечения 1 аминокислоты в родительском полипептиде GAA обозначают как Δ1 усеченную форму GAA, полипептид GAA в результате усечения 2 последовательных аминокислот с N-конца обозначают как Δ2 усеченную форму GAA, полипептид GAA в результате усечения 3 последовательных аминокислот в родительском полипептиде GAA обозначают как Δ3 усеченную форму GAA) и т. д. В конкретном варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46, Δ47, Δ48, Δ49, Δ50, Δ51, Δ52, Δ53, Δ54, Δ55, Δ56, Δ57, Δ58, Δ59, Δ60, Δ61, Δ62, Δ63, Δ64, Δ65, Δ66, Δ67, Δ68, Δ69, Δ70, Δ71, Δ72, Δ73, Δ74 или Δ75 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В другом конкретном варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46 или Δ47 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В другом конкретном варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45 или Δ46 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В другом конкретном варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 или Δ45 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 или Δ44 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 или Δ42 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности усеченную форму родительского белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ6, Δ7, Δ8, Δ9 или Δ10 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1), в частности Δ7, Δ8 или Δ9 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1), более конкретно Δ8 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ27, Δ28, Δ29, Δ30 или Δ31 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1), в частности Δ28, Δ29 или Δ30 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1), более конкретно Δ29 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1).

В другом конкретном варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, или Δ44 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1), в частности Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1), более конкретно Δ42 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1).

В дополнительном конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 или Δ45 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1), в частности Δ42, Δ43 или Δ44 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1), более конкретно Δ43 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46 или Δ47 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ7, Δ8, Δ9, Δ28, Δ29, Δ30, Δ41, Δ42, Δ43 или Δ44 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 или Δ44, усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ8, Δ29, Δ42, Δ43 или Δ47 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ8, Δ29, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1).

В другом варианте осуществления усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ8 или Δ42 усеченную форму GAA (в частности белка hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, конкретно в SEQ ID NO: 1).

В конкретном варианте осуществления изобретения, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой усеченную форму функционального полипептида GAA человека. В дополнительном конкретном варианте осуществления, родительский полипептид hGAA представляет собой полипептид hGAA, приведенный в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1. В варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46, Δ47, Δ48, Δ49, Δ50, Δ51, Δ52, Δ53, Δ54, Δ55, Δ56, Δ57, Δ58, Δ59, Δ60, Δ61, Δ62, Δ63, Δ64, Δ65, Δ66, Δ67, Δ68, Δ69, Δ70, Δ71, Δ72, Δ73, Δ74 или Δ75 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45, Δ46 или Δ47 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44, Δ45 или Δ46 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 или Δ45 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 или Δ44 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ1, Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 или Δ42 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 или Δ42 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 или Δ42 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 или Δ42 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 или Δ42 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 или Δ42 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 или Δ42 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41 или Δ42 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ2, Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ3, Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ4, Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ5, Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ8, Δ9, Δ10, Δ11, Δ12, Δ13, Δ14, Δ15, Δ16, Δ17, Δ18, Δ19, Δ20, Δ21, Δ22, Δ23, Δ24, Δ25, Δ26, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ32, Δ33, Δ34, Δ35, Δ36, Δ37, Δ38, Δ39, Δ40, Δ41, Δ42 или Δ43 усеченную форму GAA полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, даже более конкретно в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ6, Δ7, Δ8, Δ9 или Δ10, в частности Δ7, Δ8 или Δ9, более конкретно Δ8 усеченную форму полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ27, Δ28, Δ29, Δ30 или Δ31, в частности Δ28, Δ29 или Δ30, более конкретно Δ29 усеченную форму полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 или Δ44, в частности Δ41, Δ42 или Δ43, более конкретно Δ42 усеченную форму полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 или Δ45, в частности Δ42, Δ43 или Δ44, более конкретно Δ43 усеченную форму полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ27, Δ28, Δ29, Δ30, Δ31, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43, Δ44 или Δ45, в частности Δ7, Δ8, Δ9, Δ28, Δ29, Δ30, Δ41, Δ42, Δ43 или Δ44, в частности Δ8, Δ29, Δ42 или Δ43 усеченную форму полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ6, Δ7, Δ8, Δ9, Δ10, Δ40, Δ41, Δ42, Δ43 или Δ44, в частности Δ8 или Δ42 усеченную форму полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ8, Δ29, Δ42, Δ43 или Δ47 усеченную форму полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ8, Δ29, Δ42 или Δ43 усеченную форму полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

В другом варианте по этому варианту осуществления, усеченный полипептид GAA по изобретению представляет собой Δ8 или Δ42 усеченную форму полипептида hGAA, и более конкретно полипептида hGAA, приведенного в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, или его функционального варианта, содержащего замены аминокислот в последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1, и обладающего по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичностью с SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности в SEQ ID NO: 1.

В конкретном варианте осуществления усеченный полипептид hGAA по изобретению имеет аминокислотную последовательность, состоящую из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36, или ее функциональный вариант, содержащий от 1 до 5, в частности от 1 до 4, в частности от 1 до 3, более конкретно от 1 до 2, в частности 1 замену аминокислоты, по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35 или SEQ ID NO: 36. В другом конкретном варианте осуществления, усеченный полипептид hGAA по изобретению имеет аминокислотную последовательность, состоящую из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35, или ее функциональный вариант, содержащий от 1 до 5 замен аминокислот по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35. В конкретном варианте осуществления усеченный полипептид hGAA по изобретению имеет аминокислотную последовательность, состоящую из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 28, или ее функциональный вариант, содержащий от 1 до 5, в частности от 1 до 4, в частности от 1 до 3, более конкретно от 1 до 2, в частности 1 замену аминокислоты, по сравнению с последовательностью, приведенной в SEQ ID NO: 27 или SEQ ID NO: 28.

Усеченный полипептид GAA в соответствии с изобретением дополнительно может содержать сигнальный пептид, такой как природный сигнальный пептид GAA или альтернативный сигнальный пептид, происходящих из другого секретируемого белка. Неограничивающие примеры таких сигнальных пептидов включают те, которые приведены в SEQ ID NO: с 3 до 7. Авторы изобретения к удивлению показали, что слияние усеченного полипептида GAA по изобретению с альтернативным сигнальным пептидом даже дополнительно усиливает его секрецию. Изобретение тем самым предусматривает химерный полипептид GAA, содержащий сигнальный фрагмент и усеченный полипептидный фрагмент GAA, усеченный полипептидный фрагмент GAA представляет собой усеченный полипептид GAA, как определено выше. В конкретном варианте осуществления сигнальный пептид представляет собой природный сигнальный пептид GAA, такой как сигнальный пептид hGAA, приведенный в SEQ ID NO: 4. В другом варианте осуществления сигнальный пептид представляет собой экзогенный (или альтернативный) сигнальный пептид, происходящий из белка, отличного от GAA. В конкретном варианте осуществления альтернативный сигнальный пептид выбирают в группе, состоящей из SEQ ID NO: 3, 5, 6 и 7 или ее функционального производного, как определено далее.

Авторы изобретения показали, что экзогенный сигнальный пептид, слитый с остальной частью белка GAA, увеличивает секрецию получаемого химерного полипептида GAA, по сравнению с соответствующим полипептидом GAA, содержащим свой природный сигнальный пептид. Кроме того, усеченный полипептидный фрагмент GAA также увеличивает секрецию химерного полипептида GAA (включая как сигнальный пептид, так и усеченный полипептид GAA) по сравнению с химерным полипептидом GAA, содержащим тот же сигнальный пептид, слитый с родительским полипептидом GAA.

Конкретные экзогенные сигнальные пептиды, работающие в настоящем изобретении, включают аминокислоты 1-20 из химотрипсиногена B2 (SEQ ID NO: 3), сигнальный пептид α-1-антитрипсина человека (SEQ ID NO: 5), аминокислоты 1-25 из идуронат-2-сульфатазы (SEQ ID NO: 6), и аминокислоты 1-23 из ингибитора протеазы C1 (SEQ ID NO: 7). Сигнальные пептиды из SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: с 5 до 7 делают возможной более высокую секрецию химерного белка GAA как in vitro, так и in vivo по сравнению с GAA, содержащей ее природный сигнальный пептид. В конкретном варианте осуществления сигнальный пептид имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: с 3 до 7, или представляет собой ее функциональное производное, т. е. последовательность, содержащую от 1 до 5, в частности от 1 до 4, в частности от 1 до 3, более конкретно от 1 до 2, в частности 1 аминокислотную делецию, инсерцию или замену, по сравнению с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: с 3 до 7, до тех пор, пока получаемая последовательность соответствует функциональному сигнальному пептиду, т. е. сигнальному пептиду, который делает возможной секрецию белка GAA. В конкретном варианте осуществления последовательность фрагмента сигнального пептида состоит из последовательности, выбранной в группе, состоящей из SEQ ID NO: с 3 до 7.

В конкретных вариантах осуществления полипептид GAA по изобретению выбирают из:

- комбинации из SEQ ID NO: 3 с Δ8 усеченной формой GAA, такой как Δ8 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 27;

- комбинации из SEQ ID NO: 4 с Δ8 усеченной формой GAA, такой как Δ8 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 27;

- комбинации из SEQ ID NO: 5 с Δ8 усеченной формой GAA, такой как Δ8 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 27;

- комбинации из SEQ ID NO: 6 с Δ8 усеченной формой GAA, такой как Δ8 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 27;

- комбинации из SEQ ID NO: 7 с Δ8 усеченной формой GAA, такой как Δ8 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 27;

- комбинации из SEQ ID NO: 3 с Δ29 усеченной формой GAA, такой как Δ29 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 34;

- комбинации из SEQ ID NO: 4 с Δ29 усеченной формой GAA, такой как Δ29 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 34;

- комбинации из SEQ ID NO: 5 с Δ29 усеченной формой GAA, такой как Δ29 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 34;

- комбинация из SEQ ID NO: 6 с Δ29 усеченной формой GAA, такой как Δ29 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 34;

- комбинации из SEQ ID NO: 7 с Δ29 усеченной формой GAA, такой как Δ29 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 34;

- комбинации из SEQ ID NO: 3 с Δ42 усеченной формой GAA, такой как Δ42 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 28;

- комбинации из SEQ ID NO: 4 с Δ42 усеченной формой GAA, такой как Δ42 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 28;

- комбинации из SEQ ID NO: 5 с Δ42 усеченной формой GAA, такой как Δ42 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 28;

- комбинации из SEQ ID NO: 6 с Δ42 усеченной формой GAA, такой как Δ42 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 28;

- комбинации из SEQ ID NO: 7 с Δ42 усеченной формой GAA, такой как Δ42 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 28;

- комбинации из SEQ ID NO: 3 с Δ43 усеченной формой GAA, такой как Δ43 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 35;

- комбинации из SEQ ID NO: 4 с Δ43 усеченной формой GAA, такой как Δ43 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 35;

- комбинации из SEQ ID NO: 5 с Δ43 усеченной формой GAA, такой как Δ43 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 35;

- комбинации из SEQ ID NO: 6 с Δ43 усеченной формой GAA, такой как Δ43 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 35; и

- комбинации из SEQ ID NO: 7 с Δ43 усеченной формой GAA, такой как Δ43 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 35;

- комбинации из SEQ ID NO: 3 с Δ47 усеченной формой GAA, такой как Δ47 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 36;

- комбинации из SEQ ID NO: 4 с Δ47 усеченной формой GAA, такой как Δ47 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 36;

- комбинации из SEQ ID NO: 5 с Δ47 усеченной формой GAA, такой как Δ47 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 36;

- комбинации из SEQ ID NO: 6 с Δ47 усеченной формой GAA, такой как Δ47 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 36; и

- комбинации из SEQ ID NO: 7 с Δ47 усеченной формой GAA, такой как Δ47 усеченная форма hGAA, представленная в SEQ ID NO: 36;

или он представляет собой их функциональное производное, обладающее по меньшей мере 90% идентичностью, в частности, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью с получаемой комбинацией последовательностей. В этих вариантах осуществления, как указано выше, фрагмент сигнального пептида может представлять собой последовательность, содержащую от 1 до 5, в частности от 1 до 4, в частности от 1 до 3, более конкретно от 1 до 2, в частности 1 аминокислотную делецию, инсерцию или замену, по сравнению с последовательностями, приведенными в SEQ ID NO: с 3 до 7, до тех пор пока получаемая последовательность соответствует функциональному сигнальному пептиду, т. е. сигнальному пептиду, который допускает секрецию получаемого химерного усеченного белка GAA.

Относительная доля вновь синтезированной GAA, которую секретирует клетка, можно обычным образом определять с помощью известных в данной области способов и как описано в примерах. Секретируемые белки можно обнаруживать путем непосредственного измерения самого белка (например, путем Вестерн-блоттинга) или путем анализа активности белка (например, ферментативный анализ) в клеточной культуральной среде, сыворотке, молоке и т. д.

Специалисты в данной области, кроме того, должны понимать, что усеченный полипептид GAA или химерный полипептид GAA может содержать дополнительные аминокислоты, например, в результате манипуляций с конструкцией нуклеиновой кислоты, таких как добавление участка рестрикции, до тех пор пока эти дополнительные аминокислоты не делают сигнальный пептид или полипептид GAA нефункциональным. Дополнительные аминокислоты могут отщепляться или можно сохраняться в зрелом полипептиде до тех пор, пока сохранение не ведет к нефункциональному полипептиду.

В другом аспекте изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей усеченный полипептид GAA по изобретению или химерный полипептид GAA по изобретению.

Последовательность молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, кодирующую усеченный GAA, оптимизируют для экспрессии полипептида GAA in vivo. Оптимизация последовательности может включать множество изменений в последовательности нуклеиновой кислоты, в том числе оптимизацию кодонов, увеличение содержания GC, снижение числа островков CpG, снижение числа альтернативных открытых рамок считывания (ARF) и снижение числа участков доноров сплайсинга и акцепторов сплайсинга. По причине вырожденности генетического кода, различные молекулы нуклеиновой кислоты могут кодировать один и тот же белок. Также хорошо известно, что генетические коды различных организмов часто смещены в сторону использования одного из нескольких кодонов, которые кодируют одну и ту же аминокислоту, относительно других. Через оптимизацию кодонов в нуклеотидную последовательность вводят изменения, которые дают преимущество предпочтения кодонов, существующего в заданном клеточном контексте, чтобы экспрессия получаемой нуклеотидной последовательности с оптимизированными кодонами с большей вероятностью происходила в таком заданном клеточном контексте на относительно высоком уровне по сравнению с последовательностью без оптимизированных кодонов. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, такая нуклеотидная последовательность с оптимизированной последовательностью, кодирующая усеченную GAA, имеет оптимизацию кодонов для того, чтобы усовершенствовать ее экспрессию в клетках человека по сравнению с нуклеотидными последовательностями без оптимизированных кодонов, кодирующими тот же усеченный белок GAA, например, используя преимущество предпочтения конкретных кодонов у человека.

В конкретном варианте осуществления оптимизированная кодирующая последовательность GAA имеет оптимизированные кодоны и/или имеет повышенное содержание GC и/или имеет сниженное число альтернативных открытых рамок считывания и/или имеет сниженное число участков доноров сплайсинга и/или акцепторов сплайсинга по сравнению с нуклеотидами 82-2859 из кодирующей hGAA дикого типа последовательности из SEQ ID NO: 8. Например, последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению ведет к по меньшей мере 2, 3, 4, 5 или 10% увеличению содержания GC в последовательности GAA по сравнению с последовательностью последовательности GAA дикого типа. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению ведет к 2, 3, 4 или, более конкретно, 5% или 10% (в частности 5%) увеличению содержания GC в последовательности GAA по сравнению с последовательность нуклеотидной последовательности GAA дикого типа. В конкретном варианте осуществления последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, кодирующая функциональный полипептид GAA, является «по существу идентичной», то есть приблизительно на 70% идентичной, более предпочтительно приблизительно на 80% идентичной, даже более предпочтительно приблизительно на 90% идентичной, даже более предпочтительно приблизительно на 95% идентичной, даже более предпочтительно приблизительно на 97%, 98% или даже 99% идентичной нуклеотидам 82-2859 из последовательности, приведенной в SEQ ID NO: 8. Как указано выше, в дополнение к содержанию GC и/или числу ARF, оптимизация последовательности также может включать снижение числа островков CpG в последовательности и/или снижение числа участков доноров сплайсинга и акцепторов сплайсинга. Конечно, специалистам в данной области хорошо известно, что оптимизация последовательности представляет собой баланс между всеми этими параметрами, что обозначает, что последовательность можно считать оптимизированной, если по меньшей мере один из вышеуказанных параметров усовершенствован, тогда как один или несколько других параметров нет, до тех пор пока оптимизированная последовательность ведет к усовершенствованию трансгена, такому как усовершенствованная экспрессия и/или сниженный иммунный ответ на трансген in vivo.

Кроме того, адаптивность нуклеотидной последовательности, кодирующей функциональную GAA, к использованию кодонов клетками человека можно выражать в виде коэффициента адаптации кодонов (CAI). Коэффициент адаптации кодонов определяют в настоящем описании как измерение относительной адаптивности к использованию кодонов гена относительно использования кодонов высоко экспрессируемыми генами человека. Относительная адаптивность (w) каждого кодона представляет собой соотношение использования каждого кодона к таковому для наиболее распространенного кодона для одной и той же аминокислоты. CAI определяют как геометрическое среднее этих значений относительной адаптивности. Не синонимические кодоны и терминирующие кодоны (в зависимости от генетического кода) исключают. Значения CAI находятся в диапазоне от 0 до 1, причем более высокие значения указывают на более высокую долю наиболее распространенных кодонов (см. Sharp and Li, 1987, Nucleic Acids Research 15: 1281-1295; также см.: Kim et al, Gen. 1997, 199:293-301; zur Megede et al, Journal of Virology, 2000, 74: 2628-2635). Предпочтительно, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая GAA, имеет CAI по меньшей мере 0,75 (в частности 0,77), 0,8, 0,85, 0,90, 0,92 или 0,94.

Термин «последовательность нуклеиновой кислоты» (или молекула нуклеиновой кислоты) относится к молекуле ДНК или РНК в одно- или двухцепочечной форме, в частности ДНК, кодирующей белок GAA в соответствии с изобретением.

Авторы изобретения обнаружили, что описанный выше усеченный полипептид GAA, при экспрессии с молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей его, обеспечивает к удивлению высокие уровни экспрессии функционального белка GAA как in vitro, так и in vivo по сравнению с кДНК GAA дикого типа. Кроме того, что также показано авторами изобретения, усеченный белок GAA, продуцируемый клетками печени и мышцы, экспрессирующими молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, не индуцирует иммунный ответ. Это обозначает, что эту молекулу нуклеиновой кислоты можно использовать для получения высоких уровней белка GAA, и она обеспечивает терапевтические эффекты, такие как возможность избежать иммуносупрессорного лечения, возможность иммуносупрессорного лечения в низких дозах и возможность повторного введения молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Следовательно, усеченный полипептид GAA по изобретению и молекула нуклеиновой кислоты по изобретению представляют особый интерес в контексте дефицита экспрессии и/или активность GAA или где высокие уровни экспрессии GAA могут улучшать заболевание, например, при болезни накопления гликогена. Конкретно болезнь накопления гликогена может представлять собой GSDI (болезнь Гирке), GSDII (болезнь Помпе), GSDIII (болезнь Кори), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII или летальную врожденную болезнь накопления гликогена в сердце. Более конкретно, болезнь накопления гликогена выбирают в группе, состоящей из GSDI, GSDII и GSDIII, даже более конкретно в группе, состоящей из GSDII и GSDIII. В даже более конкретном варианте осуществления, болезнь накопления гликогена представляет собой GSDII. В частности, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно использовать при генной терапии для того, чтобы лечить GAA-дефицитные состояния или другие состояния, ассоциированные с накоплением гликогена, такими как GSDI (болезнь Гирке), GSDII (болезнь Помпе), GSDIII (болезнь Кори), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII и летальная врожденная болезнь накопления гликогена в сердце, более конкретно GSDI, GSDII или GSDIII, даже более конкретно GSDII и GSDIII. В даже более конкретном варианте осуществления, молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению можно использовать при генной терапии для того, чтобы лечить GSDII.

В другом варианте осуществления изобретения, часть молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, кодирующей усеченный полипептидный фрагмент GAA, обладает по меньшей мере 75% (например, 77,7%) или по меньшей мере 80% или по меньшей мере 82% (например, 83,1%) идентичностью с соответствующей частью нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33, в частности SEQ ID NO: 1, которые представляют собой последовательности полипептидов hGAA дикого типа, свободные от сигнального пептида.

Усеченный фрагмент GAA молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению предпочтительно обладает по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и даже более предпочтительно по меньшей мере 92% идентичностью, в частности, по меньшей мере 95% идентичностью, например, по меньшей мере 98, 99 или 100% идентичностью с нуклеотидной последовательностью из SEQ ID NO: 10 или 11, которые представляют собой последовательности с оптимизированной последовательностью.

Термин «идентичный» и его производные относятся к идентичности последовательностей между двумя молекулами нуклеиновой кислоты. Когда положение в обеих из двух сравниваемых последовательностей занимает одно и то же основание (например, если положение в каждой из двух молекул ДНК занято аденином), то молекулы идентичны в этом положении. % идентичности между двумя последовательностями представляет собой функцию числа совпадающих положений, которые имеют две последовательности, деленного на число сравниваемых положений, × 100. Например, если совпадает 6 из 10 положений в двух последовательностях, то две последовательности идентичны на 60%. В целом, сравнение выполняют, когда две последовательности выравнивают так, чтобы давать максимальную идентичность. Различные биоинформационные инструменты, известные специалисту в данной области, можно использовать для выравнивания последовательностей нуклеиновой кислоты, например, BLAST или FASTA.

Кроме того, молекула нуклеиновой кислоты по изобретению кодирует функциональный белок GAA, т. е. она кодирует белок GAA человека, который, при экспрессии, обладает функциональностью белка GAA дикого типа. Как определено выше, функциональность GAA дикого типа состоит в том, чтобы гидролизовать как α-1,4, так и α-1,6 связи олигосахаридов и полисахаридов, более конкретно гликогена, чтобы высвобождать глюкозу. Функциональный белок GAA, кодируемый нуклеиновой кислотой по изобретению, может иметь гидролитическую активность в отношении гликогена по меньшей мере 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% или по меньшей мере 100% по сравнению с белком GAA дикого типа из SEQ ID NO: 1, 2, 30 или 33. Активность белка GAA, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению, даже может составлять больше чем 100%, например, больше чем 110%, 120%, 130%, 140% или даже больше чем 150% от активности белка GAA дикого типа из SEQ ID NO: 1, 2, 30 или 33.

Специалист без труда сможет определять, экспрессирует ли нуклеиновая кислота в соответствии с изобретением функциональный белок GAA. Подходящие способы будут видны специалистам в данной области. Например, один подходящий способ in vitro включает встраивание нуклеиновой кислоты в вектор, такой как плазмида или вирусный вектор, трансфекцию или трансдукцию клеток-хозяев, таких как клетки 293T или HeLa, или других клеток, таких как Huh7, с использованием вектора, и анализ активности GAA. Альтернативно, подходящий способ in vivo включает трансдукцию вектора, содержащего нуклеиновую кислоту, в модели болезни Помпе на мышах или другого нарушения накопления гликогена и анализ функциональной GAA в плазме мыши и присутствия GAA в тканях. Подходящие способы описаны более подробно далее в экспериментальной части.

В конкретном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27; последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 49, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 28; последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 35; или последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 52 или SEQ ID NO: 53, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 36. В дополнительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27; последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 49, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 28; или последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 35. В конкретном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты по изобретению содержит последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 12 или SEQ ID NO: 13, кодирующую полипептид, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27.

Изобретение также относится к конструкции нуклеиновой кислоты, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению. Конструкция нуклеиновой кислоты может соответствовать экспрессирующей кассете, содержащей последовательность нуклеиновой кислоты по изобретению, функционально связанную с одной или несколькими управляющими экспрессией последовательностями и/или другими последовательностями, усовершенствующими экспрессию трансгена, и/или последовательностями, усиливающими секрецию кодируемого белка, и/или последовательностями, усиливающими захват кодируемого белка. Как используют в настоящем описании, термин «функционально связанный» относится к связи полинуклеотидных элементов в функциональных отношениях. Нуклеиновая кислота «функционально связана», когда ее помещают в функциональные отношения с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или другая регулирующая транскрипцию последовательность функционально связаны с кодирующей последовательностью, если они влияют на транскрипцию кодирующей последовательности. В данной области известны такие управляющие экспрессией последовательности, например, промоторы, энхансеры (такие как цис-регуляторные модули (CRM)), интроны, сигналы полиА и т. д.

В частности, экспрессирующая кассета может содержать промотор. Промотор может представлять собой универсальный или тканеспецифический промотор, в частности, промотор способен содействовать экспрессии в клетках или тканях, в которых экспрессия GAA желательна, например, в клетках или тканях, в которых экспрессия GAA желательна, у пациентов с дефицитом GAA. В конкретном варианте осуществления промотор представляет собой специфический промотор печени, такой как промотор α-1-антитрипсина (hAAT) (SEQ ID NO: 14), промотор транстиретина, промотор альбумина, промотор тироксинсвязывающего глобулина (TBG), промотор LSP (содержащий последовательность промотора глобулина, связывающего тиреоидный гормон, две копии энхансерной последовательности α1-микроглобулина/бикунина и лидерную последовательность - 34.Ill, C. R., et al. (1997). Optimization of the human factor VIII complementary DNA expression plasmid for gene therapy of hemophilia A. Blood Coag. Fibrinol. 8: S23-S30.) и т. д. Другие эффективные специфические промоторы печени известны в данной области, например, те, которые перечислены в Liver Specific Gene Promoter Database, компилированной Cold Spring Harbor Laboratory (http://rulai.cshl.edu/LSPD/). Предпочтительным промотором в контексте изобретения является промотор hAAT. В другом варианте осуществления промотор представляет собой промотор, управляющий экспрессией в одной ткани или клетке, представляющей интерес, (например, в клетках мышцы), и в клетках печени. Например, в определенной степени, промоторы со специфичностью к клеткам мышцы, такие как промоторы десмина, Spc5-12 и MCK, могут давать некоторую утечку экспрессии в клетки печени, что может быть благоприятно для индукции иммунологической толерантности у субъекта к полипептиду GAA, экспрессируемому с нуклеиновой кислоты по изобретению.

Другие тканеспецифические или не тканеспецифические промоторы можно использовать при практической реализации изобретения. Например, экспрессирующая кассета может содержать тканеспецифический промотор, который представляет собой промотор, отличный от специфического промотора печени. Например, промотор может обладать специфичностью к мышцам, такой как промотор десмина (и вариант промотора десмина, такой как промотор десмина, содержащий природные или искусственные энхансеры), промотор SPc5-12 или MCK. В другом варианте осуществления промотор представляет собой промотор со специфичностью к другой клеточной линии дифференцировки, такой как промотор эритропоэтина, для экспрессии полипептида GAA в клетках эритроидной линии дифференцировки.

В другом варианте осуществления промотор представляет собой универсальный промотор. Репрезентативные универсальные промоторы включают энхансер цитомегаловируса/промотор β-актина курицы (CAG), энхансер/промотор цитомегаловируса (CMV), промотор PGK, ранний промотор SV40 и т. д.

Кроме того, промотор также может представлять собой эндогенный промотор, такой как промотор альбумина или промотор GAA.

В конкретном варианте осуществления промотор ассоциирован с энхансерной последовательностью, такой как цис-регуляторные модули (CRM) или искусственная энхансерная последовательность. Например, промотор может быть ассоциирован с энхансерной последовательностью, такой как управляющая область ApoE человека (или локус гена аполипопротеина E/C-I человека, печеночная управляющая область HCR-1 - номер доступа GenBank U32510, приведена в SEQ ID NO: 15). В конкретном варианте осуществления энхансерная последовательность, такая как последовательность ApoE, ассоциирована со специфическим промотором печени, таким как те, что перечислены выше, и в частности такими, как промотор hAAT. Другие CRM, эффективные при практической реализации настоящего изобретения, включают те, которые описаны в Rincon et al., Mol Ther. 2015 Jan;23(1):43-52, Chuah et al., Mol Ther. 2014 Sep;22(9):1605-13 или Nair et al., Blood. 2014 May 15;123(20):3195-9.

В другом конкретном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит интрон, в частности интрон, размещенный между промотором и кодирующей последовательностью GAA. Интрон можно вводить для увеличения стабильности мРНК и продуцирования белка. В дополнительном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты содержит интрон β-глобина b2 человека (или HBB2), интрон фактора свертывания IX (FIX), интрон SV40 или интрон β-глобина курицы. В другом дополнительном варианте осуществления, конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению содержит модифицированный интрон (в частности, модифицированный интрон HBB2 или FIX), разработанный для уменьшения числа, или даже полного удаления, альтернативных открытых рамок считывания (ARF), найденных в указанном интроне. Предпочтительно, удаляют ARF, длина которых превышает 50 п. о. и которые имеют терминирующий кодон в рамке считывания инициирующего кодона. ARF может быть удалена посредством модификации последовательности интрона. Например, модификацию можно осуществлять посредством нуклеотидной замены, инсерции или делеции, предпочтительно посредством нуклеотидной замены. В качестве иллюстрации, один или несколько нуклеотидов, в частности один нуклеотид, в инициирующем кодоне ATG или GTG, присутствующем в последовательности интрона, представляющего интерес, можно заменить на ведущий к не инициирующему кодону. Например, ATG или GTG можно заменить на CTG, который не является инициирующим кодоном, в последовательности интрона, представляющего интерес.

Классический интрон HBB2, используемый в конструкциях нуклеиновой кислоты, приведен в SEQ ID NO: 16. Например, этот интрон HBB2 можно модифицировать посредством элиминации инициирующих кодонов (кодонов ATG и GTG) в указанном интроне. В конкретном варианте осуществления модифицированный интрон HBB2, содержащийся в конструкции, имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 17. Классический интрон FIX, используемый в конструкциях нуклеиновой кислоты, происходит из первого интрона FIX человека и приведен в SEQ ID NO: 18. Интрон FIX можно модифицировать посредством элиминации инициирующих кодонов (кодонов ATG и GTG) в указанном интроне. В конкретном варианте осуществления модифицированный интрон FIX, содержащийся в конструкции по изобретению, имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 19. Классический интрон β-глобина курицы, используемый в конструкциях нуклеиновой кислоты, приведен в SEQ ID NO: 20. Интрон β-глобина курицы можно модифицировать посредством элиминации инициирующих кодонов (кодонов ATG и GTG) в указанном интроне. В конкретном варианте осуществления модифицированный интрон β-глобина курицы, содержащийся в конструкции по изобретению, имеет последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 21.

Авторы изобретения предварительно показали в WO2015/162302, что такой модифицированный интрон, в частности модифицированный интрон HBB2 или FIX, имеет благоприятные свойства и может значительно усовершенствовать экспрессию трансгена.

В конкретном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению представляет собой экспрессирующую кассету, содержащую, в ориентации от 5' к 3', промотор, которому необязательно предшествует энхансер, кодирующую последовательность по изобретению (т. е. оптимизированную кодирующую последовательность GAA по изобретению, химерную кодирующую последовательность GAA по изобретению или химерную и оптимизированную кодирующую последовательность GAA по изобретению) и сигнал полиаденилирования (такой как сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, сигнал полиаденилирования SV40 или другой встречаемый в природе или искусственный сигнал полиаденилирования). В конкретном варианте осуществления конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению представляет собой экспрессирующую кассету, содержащую, в ориентации от 5' к 3', промотор, которому необязательно предшествует энхансер, (такой как управляющая область ApoE), интрон (в частности, интрон как определено выше), кодирующую последовательность по изобретению и сигнал полиаденилирования. В дополнительном конкретном варианте осуществления, конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению представляет собой экспрессирующую кассету, содержащую, в ориентации от 5' к 3', энхансер, такой как управляющая область ApoE, промотор, интрон (в частности, интрон как определено выше), кодирующую последовательность по изобретению и сигнал полиаденилирования. В дополнительном конкретном варианте осуществления изобретения экспрессирующая кассета содержит, в ориентации от 5' к 3', управляющую область ApoE, специфический промотор hAAT печени, интрон HBB2 (в частности, модифицированный интрон HBB2 как определено выше), кодирующую последовательность по изобретению и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, например, конструкцию, представленную в:

- SEQ ID NO: 22, содержащая не оптимизированную нуклеотидную последовательность, кодирующую Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 и кодирующую сигнальный пептид из SEQ ID NO: 5;

- SEQ ID NO: 23, содержащая оптимизированную последовательность, кодирующую Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующую сигнальный пептид из SEQ ID NO: 5;

- SEQ ID NO: 24, содержащая другую оптимизированную последовательность, кодирующую Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующую сигнальный пептид из SEQ ID NO: 5;

- SEQ ID NO: 25, содержащая оптимизированную последовательность, кодирующую Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 26, содержащая оптимизированную последовательность, кодирующую Δ42 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 37, содержащая не оптимизированную последовательность, кодирующую Δ29 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из не оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 9), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 38, содержащая оптимизированную последовательность, кодирующую Δ29 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 39, содержащая другую оптимизированную последовательность, кодирующую Δ29 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 40: содержит не оптимизированную последовательность, кодирующую Δ42 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из не оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 9), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 41, содержащая другую оптимизированную последовательность, кодирующую Δ42 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 42, содержащая не оптимизированную последовательность, кодирующую Δ43 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из не оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 9), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 43, содержащая оптимизированную последовательность, кодирующую Δ43 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3; и

- SEQ ID NO: 44, содержащая другую оптимизированную последовательность, кодирующую Δ43 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 45, содержащая не оптимизированную последовательность, кодирующую Δ47 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из не оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 9), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3;

- SEQ ID NO: 46, содержащая оптимизированную последовательность, кодирующую Δ47 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3; и

- SEQ ID NO: 47, содержащая другую оптимизированную последовательность, кодирующую Δ47 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и сигнальный пептид из SEQ ID NO: 3.

Другие экспрессирующие кассеты по изобретению могут содержать следующие последовательности нуклеиновой кислоты:

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ29 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ42 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ43 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ47 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ29 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ29 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ42 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ42 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ43 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ43 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ47 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ47 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7.

В альтернативных вариантах осуществления этих конкретных конструкций, последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 1, заменяют на последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 33.

В конкретном варианте осуществления экспрессирующая кассета содержит управляющую область ApoE, специфический промотор hAAT печени, интрон HBB2 с оптимизацией кодонов, кодирующую последовательность по изобретению и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста.

При разработке конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению, специалист в данной области уделит внимание ограничению размера вектора, используемого для доставки указанной конструкции в клетку или орган. В частности, специалист в данной области знает, что основное ограничение AAV вектора состоит в его полезной вместимости, которая может варьировать от одного серотипа AAV к другом, но предположительно ограничена приблизительным размером родительского вирусного генома. Например, 5 т. о. Это максимальный размер, который обычно планируют упаковать в капсид AAV8 (Wu Z. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 80-86; Lai Y. et al., Mol Ther., 2010, 18(1): 75-79; Wang Y. et al., Hum Gene Ther Methods, 2012, 23(4): 225-33). Соответственно, специалисты в данной области, при практическом осуществлении настоящего изобретения, уделят внимание тому, чтобы выбирать компоненты конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению с тем, чтобы получаемая последовательность нуклеиновой кислоты, в том числе последовательности, кодирующие AAV 5'- и 3'-ITR, предпочтительно не превышала 110% от полезной вместимости внедряемого AAV вектора, в частности, предпочтительно не превышала 5,5 т. о.

Изобретение также относится к вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию, как раскрыто в настоящем описании. В частности, вектор по изобретению представляет собой вектор, подходящий для экспрессии белка, предпочтительно для использования в генной терапии. В одном из вариантов осуществления вектор представляет собой плазмидный вектор. В другом варианте осуществления вектор представляет собой наночастицу, содержащую молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, в частности информационную РНК, кодирующую полипептид GAA по изобретению. В другом варианте осуществления вектор представляет собой систему на основе транспозонов, которая делает возможным встраивание молекулы нуклеиновой кислоты или конструкции по изобретению в геном целевой клетки, такой как гиперактивная транспозонная система Sleeping Beauty (SB100X) (Mates et al. 2009). В другом варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, подходящий для генной терапии, который направлен на любую клетку, представляющую интерес, такую как ткань или клетки печени, клетка мышцы, клетки CNS (такие как клетки головного мозга) или гематопоэтические стволовые клетки, такие как клетки эритроидной линии дифференцировки (такие как эритроциты). В этом случае, конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению также содержит последовательности, подходящие для получения эффективного вирусного вектора, как хорошо известно в данной области. В конкретном варианте осуществления вирусный вектор происходит из интегрирующего вируса. В частности, вирусный вектор может происходить из ретровируса или лентивируса. В дополнительном конкретном варианте осуществления, вирусный вектор представляет собой AAV вектор, такой как AAV вектор, подходящий для трансдукции тканей или клеток печени, более конкретно AAV-1, -2 и варианты AAV-2 (такие как оптимизированный AAV-2 с четверной мутацией капсида, содержащие сконструированный капсид с изменениями Y44+500+730F+T491V, как раскрыто в Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods [электронная публикация перед печатью]), -3 и варианты AAV-3 (такие как вариант AAV3-ST, содержащий сконструированный капсид AAV3 с двумя аминокислотными изменениями, S663V+T492V, как раскрыто в Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. том 24(6), стр. 1042), -3B и варианты AAV-3B, -4, -5, -6 и варианты AAV-6 (такие как вариант AAV6, содержащий форму капсида AAV6 с тройной мутацией Y731F/Y705F/T492V, как раскрыто в Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, стр. 16026), -7, -8, -9, -10, например, -cy10 и -rh10, -rh74, -dj, Anc80, LK03, AAV2i8, серотипы AAV свиньи, такие как AAVpo4 и AAVpo6 и т. д., вектор или ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор и альфаретровирус. Как известно в данной области, в зависимости от конкретного вирусного вектора, рассматриваемого для использования, дополнительные подходящие последовательности вводят в конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению для получения функционального вирусного вектора. Подходящие последовательности включают ITR AAV для AAV вектора или LTR для лентивирусных векторов. По существу, изобретение также относится к экспрессирующей кассете, как описано выше, фланкированной с помощью ITR или LTR с каждой стороны.

Преимущества вирусных векторов рассмотрены в следующей части этого раскрытия. Вирусные векторы предпочтительны для доставки молекулы нуклеиновой кислоты или конструкции по изобретению, такой как ретровирусный вектор, например, лентивирусный вектор, или непатогенный парвовирус, более предпочтительно AAV вектор. Парвовирусный аденоассоциированный вирус (AAV) человека представляет собой депендовирус, имеющий природный дефект репликации, который способен встраиваться в геном инфицированной клетки для того, чтобы устанавливать латентную инфекцию. Последнее свойство, по-видимому, является уникальным среди вирусов млекопитающих, поскольку встраивание происходит в конкретном участке в геноме человека, называемом AAVS1, который расположен на хромосоме 19 (19q13.3-qter).

Следовательно, AAV векторы вызывают существенный интерес в качестве потенциальных векторов для генной терапии человека. Среди благоприятных свойств вируса имеют место отсутствие у него связи с любым заболеванием человека, его способность инфицировать делящиеся и не делящиеся клетки, и широкий диапазон клеточных линий, происходящих из различных тканей, которые могут быть инфицированы.

Среди серотипов AAV, выделенных у человека или не являющихся человеком приматов (NHP) и хорошо охарактеризованных, серотип 2 человека представляет собой первый AAV, который разрабатывали в качестве вектора переноса генов. Другие используемые в настоящее время серотипы AAV включают AAV-1, варианты AAV-2 (такие как оптимизированный AAV-2 с четверной мутацией капсида, содержащий сконструированный капсид с изменениями Y44+500+730F+T491V, как раскрыто в Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods [электронная публикация перед печатью]), -3 и варианты AAV-3 (такие как вариант AAV3-ST, содержащий сконструированный капсид AAV3 с двумя аминокислотными изменениями, S663V+T492V, как раскрыто в Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. том 24(6), стр. 1042), -3B и варианты AAV-3B, -4, -5, -6 и варианты AAV-6 (такие как вариант AAV6, содержащий форму капсида AAV6 с тройной мутацией Y731F/Y705F/T492V, как раскрыто в Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, стр. 16026), -7, -8, -9, -10, например, cy10 и -rh10, -rh74, -dj, Anc80, LK03, AAV2i8, серотипы AAV свиньи, такие как AAVpo4 и AAVpo6, и тирозиновые, лизиновые и сериновые мутантные капсиды серотипов AAV и т. д. Кроме того, другие не природные сконструированные варианты и химерные AAV также могут быть эффективны.

Вирусы AAV можно конструировать с использованием стандартных приемов молекулярной биологии, которые позволяют оптимизировать эти частицы для доставки последовательностей нуклеиновой кислоты в конкретные клетки, для минимизации иммуногенности, для корректировки стабильности и времени жизни частиц, для эффективного разрушения, для точной доставки в ядро.

Желательные фрагменты AAV для сборки в векторы включают белки cap, в том числе vp1, vp2, vp3 и гипервариабельные области, белки rep, в том числе rep 78, rep 68, rep 52 и rep 40, и последовательности, кодирующие эти белки. Эти фрагменты легко можно использовать в различных векторных системах и клетках-хозяевах.

Рекомбинантные векторы на основе AAV, лишенные белка Rep, встраиваются с низким эффектом в геном хозяина и преимущественно представлены в виде стабильных круглых эписом, которые могут персистировать в течение лет в целевых клетках.

Альтернативно использованию природных серотипов AAV, в контексте настоящего изобретения можно использовать искусственные серотипы AAV, в том числе, без ограничения, AAV с не встречаемым в природе белком капсида. Такой искусственный капсид можно создавать с помощью любого подходящего приема, используя выбранную AAV последовательность (например, фрагмент белка капсида vp1) в комбинации с гетерологичными последовательностями, которые можно получать из другого выбранного серотипа AAV, не связанных частей AAV того же серотипа, из не AAV вирусного источника или из не вирусного источника. Искусственный серотип AAV может представлять собой, без ограничения, химерный AAV капсид, рекомбинантный AAV капсид или «гуманизированный» AAV капсид.

Соответственно, настоящее изобретение относится к AAV вектору, содержащему молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию по изобретению. В контексте настоящего изобретения, AAV вектор содержит AAV капсид, способный трансдуцировать целевые клетки, представляющие интерес, в частности, гепатоциты. В соответствии с конкретным вариантом осуществления, AAV вектор относится к AAV-1, -2, вариантам AAV-2 (например, оптимизированный AAV-2 с четверной мутацией капсида, содержащий сконструированный капсид с изменениями Y44+500+730F+T491V, как раскрыто в Ling et al., 2016 Jul 18, Hum Gene Ther Methods [электронная публикация перед печатью]), -3 и варианты AAV-3 (например, вариант AAV3-ST, содержащий сконструированный капсид AAV3 с двумя аминокислотными изменениями, S663V+T492V, как раскрыто в Vercauteren et al., 2016, Mol. Ther. том 24(6), стр. 1042), -3B и варианты AAV-3B, -4, -5, -6 и варианты AAV-6 (например, вариант AAV6, содержащий форму капсида AAV6 с тройной мутацией Y731F/Y705F/T492V, как раскрыто в Rosario et al., 2016, Mol Ther Methods Clin Dev. 3, стр. 16026), -7, -8, -9, -10, например, -cy10 и -rh10, -rh74, -dj, Anc80, LK03, AAV2i8, AAV свиньи, такой как AAVpo4 и AAVpo6, и тирозиновые, лизиновые и сериновые капсидные мутанты серотипов AAV, и т. д., серотип. В конкретном варианте осуществления AAV вектор относится к серотипу AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8 (т. е. AAV вектор имеет капсид серотипа AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8). В дополнительном конкретном варианте осуществления, AAV вектор представляет собой псевдотипированный вектор, т. е. его геном и капсид происходят из AAV различных серотипов. Например, псевдотипированный AAV вектор может представлять собой вектор, геном которого происходит из одного из указанных выше серотипов AAV и капсид которого происходит из другого серотипа. Например, геном псевдотипированного вектора может иметь капсид, происходящий из серотипа AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8, и его геном может происходить из другого серотипа. В конкретном варианте осуществления AAV вектор имеет капсид серотипа AAV8, AAV9 или AAVrh74, в частности серотипа AAV8 или AAV9, более конкретно серотипа AAV8.

В конкретном варианте осуществления, в котором вектор предназначен для использования в доставке трансгена в клетки мышцы, AAV вектор можно выбирать, среди прочих, в группе, состоящей из AAV8, AAV9 и AAVrh74.

В другом конкретном варианте осуществления, в котором вектор предназначен для использования в доставке трансгена в клетки печени, AAV вектор можно выбирать, среди прочих, в группе, состоящей из AAV5, AAV8, AAV9, AAV-LK03, AAV-Anc80 и AAV3B.

В другом варианте осуществления капсид представляет собой модифицированный капсид. В контексте настоящего изобретения, «модифицированный капсид» может представлять собой химерный капсид или капсид, содержащий один или несколько вариантов белков капсида VP, происходящих из одного или нескольких белков капсида VP AAV дикого типа.

В конкретном варианте осуществления AAV вектор представляет собой химерный вектор, т. е. его капсид содержит белки капсида VP, происходящие из по меньшей мере двух различных серотипов AAV, или содержит по меньшей мере один химерный белок VP, объединяющий области или домены белков VP, происходящие из по меньшей мере двух серотипов AAV. Примеры таких химерных AAV векторов, эффективных для трансдукции клеток печени, описаны в Shen et al., Molecular Therapy, 2007 и в Tenney et al., Virology, 2014. Например, химерный AAV вектор может происходить из комбинации последовательности капсида AAV8 с последовательностью серотипа AAV, отличного от серотипа AAV8, такого как любой из тех, что конкретно указаны выше. В другом варианте осуществления капсид AAV вектора содержит один или несколько вариантов белков капсида VP, таких как те, что описаны в WO2015013313, в частности варианты капсида RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 и RHM15-6, которые дают высокий тропизм к печени.

В другом варианте осуществления модифицированный капсид может происходить также из модификаций капсида, вставленных с помощью допускающей ошибки ПЦР и/или инсерции пептида (например, как описано в Bartel et al., 2011). Кроме того, варианты капсида могут содержать изменения одной аминокислоты, такие как тирозиновые мутанты (например, как описано в Zhong et al., 2008)

Кроме того, геном AAV вектора может представлять собой одноцепочечный или самокомплементарный двухцепочечный геном (McCarty et al., Gene Therapy, 2003). Самокомплементарные двухцепочечные AAV векторы создают посредством делеции сайта концевого разрешения (trs) из одного из концевых повторов AAV. Эти модифицированные векторы, реплицирующийся геном которых составляет половину длины от генома AAV дикого типа, обладают склонностью к упаковыванию димеров ДНК. В предпочтительном варианте осуществления AAV вектор, используемый при практической реализации настоящего изобретения, имеет одноцепочечный геном и дополнительно предпочтительно содержит капсид AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8, в частности капсид AAV8, AAV9 или AAVrh74, такой как капсид AAV8 или AAV9, более конкретно капсид AAV8.

В особенно предпочтительном варианте осуществления изобретение относится к AAV вектору, содержащему, в одноцепочечном или двухцепочечном самокомплементарном геноме (например, одноцепочечном геноме), конструкцию нуклеиновой кислоты по изобретению. В одном из вариантов осуществления AAV вектор содержит капсид AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8, в частности капсид AAV8, AAV9 или AAVrh74, такой как капсид AAV8 или AAV9, более конкретно капсид AAV8. В дополнительном конкретном варианте осуществления, указанная нуклеиновая кислота функционально связана с промотором, в частности, универсальным или специфическим промотором печени. В соответствии с вариантом осуществления конкретного варианта, промотор представляет собой универсальный промотор, такой как энхансер цитомегаловируса/промотор β-актина курицы (CAG), энхансер/промотор цитомегаловируса(CMV), промотор PGK и ранний промотор SV40. В конкретном варианте универсальный промотор представляет собой промотор CAG. В соответствии с другим вариантом, промотор представляет собой специфический промотор печени, такой как промотор α-1-антитрипсина (hAAT), промотор транстиретина, промотор альбумина и промотор тироксинсвязывающего глобулина (TBG). В конкретном варианте, специфический промотор печени представляет собой специфический промотор hAAT печени из SEQ ID NO: 14. В дополнительном конкретном варианте осуществления, конструкция нуклеиновой кислоты, содержащаяся в геноме AAV вектора по изобретению, дополнительно содержит интрон, как описано выше, такой как интрон, помещенный между промотором и последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей кодирующую последовательность GAA (т. е. оптимизированную кодирующую последовательность GAA по изобретению, химерную кодирующую последовательность GAA по изобретению или химерную и оптимизированную кодирующую последовательность GAA по изобретению). Репрезентативные интроны, которые могут быть включены в конструкцию нуклеиновой кислоты, введенную в геном AAV вектора, включают, без ограничения, интрон β-глобина b2 человека (или HBB2), интрон FIX и интрон β-глобина курицы. Указанный интрон в геноме AAV вектора может представлять собой классический (или немодифицированный) интрон или модифицированный интрон, разработанный для снижения числа, или даже полного удаления, альтернативных открытых рамок считывания (ARF) в указанном интроне. Модифицированные и немодифицированные интроны, которые можно использовать при практической реализации этого варианта осуществления, где нуклеиновую кислоту по изобретению вводят в AAV вектор, тщательно описаны выше. В конкретном варианте осуществления AAV вектор, в частности AAV вектор, содержащий капсид AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8, в частности капсид AAV8, AAV9 или AAVrh74, например, капсид AAV8 или AAV9, более конкретно капсид AAV8, по изобретению содержит в своем геноме модифицированный (или оптимизированный) интрон, такой как модифицированный интрон HBB2 из SEQ ID NO: 17, модифицированный интрон FIX из SEQ ID NO: 19 и модифицированный интрон β-глобина курицы из SEQ ID NO: 21. В дополнительном конкретном варианте осуществления, вектор по изобретению представляет собой AAV вектор, содержащий капсид AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8, в частности капсид AAV8, AAV9 или AAVrh74, например, капсид AAV8 или AAV9, более конкретно капсид AAV8, который содержит геном, содержащий, в ориентации от 5' к 3': AAV 5'-ITR (например, AAV2 5'-ITR); управляющую область ApoE; специфический промотор hAAT печени; интрон HBB2 (в частности модифицированный интрон HBB2, как определено выше); кодирующую последовательность GAA по изобретению; сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста; и AAV 3'-ITR (например, AAV2 3'-ITR), такой как геном, содержащий конструкцию нуклеиновой кислоты, приведенную в SEQ ID NO: с 22 до 26 и SEQ ID NO: с 37 до 47, фланкированную с помощью AAV 5'-ITR (например, AAV2 5'-ITR) и AAV 3'-ITR (например, AAV2 3'-ITR). Другие конструкции нуклеиновой кислоты, эффективные при практической реализации настоящего изобретения, включают те, которые описаны выше, в том числе:

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ29 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ42 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ43 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- не оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ47 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1, и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ8 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ29 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ29 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ42 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4 или 6;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ42 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ43 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ43 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ47 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 12), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7;

- оптимизированная нуклеотидная последовательность, кодирующая Δ47 усеченную форму GAA, происходящую из родительской hGAA из SEQ ID NO: 1 (нуклеотидная последовательность, происходящая из оптимизированной последовательности из SEQ ID NO: 13), и кодирующая сигнальный пептид из SEQ ID NO: 4, 6 или 7.

В альтернативных вариантах осуществления этих конкретных конструкций, последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 1, заменяют на последовательность, кодирующую SEQ ID NO: 33.

В конкретном варианте осуществления изобретения, конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению содержит специфический промотор печени, как описано выше, и вектор представляет собой вирусный вектор, способный к трансдукции ткани или клеток печени, как описано выше. Авторы изобретения приводят далее данные, показывающие, что протолерогенные и метаболические свойства печени благоприятно реализованы благодаря этому варианту осуществления для разработки высоко эффективных и оптимизированных векторов для экспрессии высоко секретируемых форм GAA в гепатоцитах и индукции иммунологической толерантности на белок.

Кроме того, в дополнительном конкретном варианте осуществления, изобретение относится к комбинации двух векторов, например, двух вирусных векторов, в частности, двух AAV векторов, для усовершенствования доставки гена и эффекта лечения в клетках, представляющих интерес. Например, два вектора могут нести молекулу нуклеиновой кислоты по изобретению, кодирующую белок GAA по изобретению, под управлением одного промотора, различного в каждом из этих двух векторов. В конкретном варианте осуществления один вектор содержит промотор, который представляет собой специфический промотор печени (как один из описанных выше), и другой вектор содержит промотор, который обладает специфичностью к другой ткани, представляющей интерес, для лечения нарушения накопления гликогена, такой как специфический промотор мышц, например, промотор десмина. В конкретном варианте по этому варианту осуществления, эта комбинация векторов соответствует нескольким совместно упакованным AAV векторам, получаемым, как описано в WO2015196179.

Изобретение также относится к клетке, например, клетке печени, которую трансформируют молекулой нуклеиновой кислоты или конструкцией по изобретению, как в случае генной терапии ex vivo. Клетки по изобретению можно доставлять субъекту, нуждающемуся в этом, такому как пациент с дефицитом GAA, с помощью любого подходящего пути введения, например, через инъекцию в печень или в кровоток указанного субъекта. В конкретном варианте осуществления изобретение включает введение молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты или вектора, в частности лентивирусного вектора, по изобретению в клетки печени, в частности в клетки печени субъекта, подлежащего лечению, и введение указанных трансформированных клеток печени, в которые вводили нуклеиновую кислоту, субъекту. Благоприятно, этот вариант осуществления можно использовать для секреции GAA из указанных клеток. В конкретном варианте осуществления клетки печени представляют собой клетки печени от пациента, подлежащего лечению, или стволовые клетки печени, которые дополнительно трансформируют и дифференцируют in vitro в клетки печени, для последующего введения пациенту.

Настоящее изобретение дополнительно относится к трансгенному не относящемуся к человеку животному, содержащему в своем геноме молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию, кодирующую полипептид GAA в соответствии с изобретением. В конкретном варианте осуществления животным является мышь.

Помимо систем специфической доставки, осуществляемых далее в примерах, известны различные системы доставки, которые можно использовать для того, чтобы вводить молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию по изобретению, например, инкапсулирование в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать кодирующую последовательность по изобретению, рецептор-опосредованный эндоцитоз, конструкция терапевтической нуклеиновой кислоты в качестве части ретровирусного или другого вектора и т. д.

В соответствии с одним из вариантов осуществления, может быть желательно вводить полипептид GAA, молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты или клетку по изобретению в печень субъекта посредством любого подходящего пути. Вдобавок депротеинизированную ДНК, такую как миникольца и транспозоны, можно использовать для векторов доставки или лентивирусных векторов. Дополнительно, технологии редактирования генов, такие как нуклеазы с цинковым пальцем, мегануклеазы, TALEN и CRISPR, также можно использовать для того, чтобы доставлять кодирующую последовательность по изобретению.

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты, вектор, полипептид GAA или клетку по изобретению. Такие композиции содержат терапевтически эффективное количество терапевтического средства (молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектора, полипептида GAA или клетки по изобретению) и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретном варианте осуществления термин «фармацевтически приемлемый» обозначает одобрение регулирующего органа государственного или регионального правительства или включение в фармакопею США или Европейскую фармакопею или другие общепризнанные фармакопеи для использования у животных и человека. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту или носителю, с которым вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, в том числе те, которые имеют происхождение из нефти, животных, овощей или синтеза, например, арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, сезамовое масло и т. п. Вода является предпочтительным носителем, когда фармацевтическую композицию вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, в частности, для инъецируемых растворов. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, стеарат натрия, глицерина моностеарат, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т. п.

Композиция, при желании, также может содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих средств или pH буферных средств. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т. п. Оральный состав может содержать стандартные носители, такие как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, целлюлоза, карбонат магния фармацевтической степени чистоты и т. д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в «Remington's Pharmaceutical Sciences», E. W. Martin. Такие композиции должны содержать терапевтически эффективное количество терапевтического средства, предпочтительно в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя с тем, чтобы предоставлять форму для надлежащего введения субъекту. В конкретном варианте осуществления нуклеиновую кислоту, вектор или клетку по изобретению формулируют в композиции, содержащей фосфатно-солевой буфер, с добавлением 0,25% сывороточного альбумина человека. В другом конкретном варианте осуществления нуклеиновую кислоту, вектор или клетку по изобретению формулируют в композиции, содержащей лактат Рингера и неионное поверхностно-активное средство, такое как pluronic F68, в конечной концентрации 0,01-0,0001%, например, в концентрации 0,001%, по массе общей композиции. Состав дополнительно может содержать сывороточный альбумин, в частности сывороточный альбумин человека, такой как сывороточный альбумин человека 0,25%. Другие подходящие составы для хранения или введения известны в данной области, в частности, из WO 2005/118792 или Allay et al., 2011.

В предпочтительном варианте осуществления композицию формулируют в соответствии со стандартными процедурами в качестве фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения человеку. Обычно композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости, композиция также может содержать солюбилизирующее средство и местный анестетик, такой как лигнокаин, чтобы снимать боль в месте инъекции.

В одном из вариантов осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты, вектор, полипептид GAA или клетку по изобретению можно доставлять в везикуле, в частности липосоме. В еще одном другом варианте осуществления молекулу нуклеиновой кислоты, конструкцию нуклеиновой кислоты, вектор, полипептид GAA или клетку по изобретению можно доставлять в системе с контролируемым высвобождением.

Способы введения молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектора, полипептида GAA или клетки по изобретению включают, но не ограничиваясь этим, внутрикожный, внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и оральный пути. В конкретном варианте осуществления введение происходит через внутривенный или внутримышечный путь. Молекула нуклеиновой кислоты, конструкция нуклеиновой кислоты, вектор, полипептид GAA или клетки по изобретению, в форме вектора или нет, можно вводить с помощью любого удобного пути, например, посредством инфузии или болюсной инъекции, посредством абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые оболочки (например, слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку прямой кишки и кишечника и т. д.), и можно вводить вместе с другими биологически активными средствами. Введение может быть системным или местным.

В конкретном варианте осуществления может быть желательно вводить фармацевтические композиции по изобретению локально в области, нуждающейся в лечении, например, печени. Этого можно достигать, например, посредством имплантата, указанный имплантат из пористого, непористого или гелеобразного материала, в том числе мембран, таких как мембраны «sialastic», или волокон.

Количество терапевтического средства (т. е. молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектора, полипептида GAA или клетки по изобретению) по изобретению, которое будет эффективным при лечении болезни накопления гликогена, можно определять с помощью стандартных клинических приемов. Кроме того, анализы in vivo и/или in vitro необязательно можно использовать для того, чтобы помогать предсказывать оптимальные диапазоны доз. Точная доза, используемая в составе, также зависит от пути введения и тяжести заболевания, и ее следует выбирать в соответствии с суждением практикующего специалиста и обстоятельствами каждого пациента. Доза молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектора, полипептида GAA или клетки по изобретению, вводимых субъекту, нуждающемуся в этом, варьирует в зависимости от нескольких факторов, включая, без ограничения, путь введения, конкретное заболевание, которое лечат, возраст субъекта или уровень экспрессии, необходимый для достижения терапевтического эффекта. Специалист в данной области может легко определять, на основе своих знаний в этой области, необходимый диапазон доз на основе этих и других факторов. В случае лечения, включающего введение вирусного вектора, такого как AAV вектор, субъекту, типичные дозы вектор составляют по меньшей мере 1×10⁸ векторных геномов на килограмм массы тела (вг/кг), например, по меньшей мере 1×10⁹ вг/кг, по меньшей мере 1×10¹⁰ вг/кг, по меньшей мере 1×10¹¹ вг/кг, по меньшей мере 1×10¹² вг/кг по меньшей мере 1×10¹³ вг/кг или по меньшей мере 1×10¹⁴ вг/кг.

Изобретение также относится к способу лечения болезни накопления гликогена, который включает стадию доставки терапевтически эффективного количества нуклеиновой кислоты, вектора, полипептида GAA, фармацевтической композиции или клетки по изобретению нуждающемуся в этом субъекту.

Изобретение также относится к способу лечения болезни накопления гликогена, указанный способ не индуцирует иммунный ответ на трансген (т. е. на полипептид GAA по изобретению) или индуцирует сниженный иммунный ответ на трансген, который включает стадию доставки терапевтически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектора, фармацевтической композиции или клетки по изобретению нуждающемуся в этом субъекту. Изобретение также относится к способу лечения болезни накопления гликогена, указанный способ включает повторное введение терапевтически эффективного количества молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектора, фармацевтической композиции или клетки по изобретению нуждающемуся в этом субъекту. В этом аспекте, молекула нуклеиновой кислоты или конструкция нуклеиновой кислоты по изобретению содержит промотор, который функционален в клетках печени, тем самым делая возможной иммунологическую толерантность к экспрессируемому полипептиду GAA, продуцируемому ими. Также в этом аспекте фармацевтическая композиция, используемая в этом аспекте, содержит молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию нуклеиновой кислоты, содержащую промотор, который функционален в клетках печени. В случае доставки клеток печени, указанные клетки могут представлять собой клетки, предварительно взятые у субъекта, нуждающегося в лечении, и сконструированные посредством введения в них молекулы нуклеиновой кислоты или конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению, чтобы тем самым делать их способными продуцировать полипептид GAA по изобретению. В соответствии с одним из вариантов осуществления, в аспекте, включающем повторное введение, указанное введение можно повторять по меньшей мере один раз или больше, и даже можно рассматривать его выполнение в соответствии с периодической схемой, например, раз в неделю, в месяц или в год. Периодическая схема также может включать введение один раз каждые 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 лет или больше чем 10 лет. В другом конкретном варианте осуществления введение каждого введения вирусного вектора по изобретению выполняют с использованием отличающегося вируса для каждого последующего введения, тем самым избегая снижения эффекта по причине возможного иммунного ответа на ранее введенный вирусный вектор. Например, можно осуществлять первое введение вирусного вектора, содержащего капсид AAV8, после чего следует введение вектора, содержащего AAV9 капсид, или даже введение вируса, не родственного с AAV, такого как ретровирусный или лентивирусный вектор.

В соответствии с настоящим изобретением, лечение может включать излечивающие, облегчающие или профилактические эффекты. Соответственно, терапевтическое и профилактическое лечение включает улучшение симптомов конкретной болезни накопления гликогена или предотвращение или иное снижение риска развития конкретной болезни накопления гликогена. Термин «профилактическое» можно рассматривать в качестве снижения тяжести или начала конкретного состояния. «Профилактическое» также включает предотвращение повторения конкретного состояния у пациента, у которого предварительно диагностировали состояние. «Терапевтическое» также может снижать тяжесть существующего состояния. Термин «лечение» используют в настоящем описании для обозначения любой схемы, которая может принести пользу животному, в частности млекопитающему, более конкретно человеческому субъекту.

Изобретение также относится к способу генной терапии ex vivo для лечения болезни накопления гликогена, который включает введение молекулы нуклеиновой кислоты или конструкции нуклеиновой кислоты по изобретению в выделенную клетку пациента, нуждающегося в этом, например, выделенную гематопоэтическую стволовую клетку, и введение указанной клетки указанному пациенту, нуждающемуся в этом. В конкретном варианте осуществления по этому аспекту, молекулу нуклеиновой кислоты или конструкцию вводят в клетку с использованием вектора, как определено выше. В конкретном варианте осуществления вектор представляет собой интегрирующий вирусный вектор. В дополнительном конкретном варианте осуществления вирусный вектор представляет собой ретровирусный вектор, такой как лентивирусный вектор. Например, лентивирусный вектор, как раскрыто в van Til et al., 2010, Blood, 115(26), стр. 5329, можно использовать при практической реализации способа по настоящему изобретению.

Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектору, полипептиду GAA или клетке по изобретению для применения в качестве лекарственного средства.

Изобретение также относится к молекуле нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектору, полипептиду GAA или клетке по изобретению для использования в способе лечения заболевания, обусловленного мутацией в гене GAA, в частности, в способе лечения болезнь Помпе. Изобретение дополнительно относится к молекуле нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектору, полипептиду GAA или клетке по изобретению для использования в способе лечения болезни накопления гликогена, такой как GSDI (болезнь Гирке), GSDII (болезнь Помпе), GSDIII (болезнь Кори), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII и летальная врожденная болезнь накопления гликогена в сердце, более конкретно GSDI, GSDII или GSDIII, даже более конкретно GSDII и GSDIII и наиболее конкретно GSDII. Усеченный полипептид GAA по изобретению можно вводить нуждающемуся в этом пациенту для использования в ферментозаместительной терапии (ERT), например, для использования в ферментозаместительной терапии болезни накопления гликогена, такой как GSDI (болезнь Гирке), GSDII (болезнь Помпе), GSDIII (болезнь Кори), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII и летальная врожденная болезнь накопления гликогена в сердце, более конкретно GSDI, GSDII или GSDIII, даже более конкретно GSDII и GSDIII и наиболее конкретно GSDII.

Изобретение дополнительно относится к использованию молекулы нуклеиновой кислоты, конструкции нуклеиновой кислоты, вектора, полипептида GAA или клетки по изобретению при изготовлении лекарственного средства, эффективного для лечения болезни накопления гликогена, такой как GSDI (болезнь Гирке), GSDII (болезнь Помпе), GSDIII (болезнь Кори), GSDIV, GSDV, GSDVI, GSDVII, GSDVIII и летальная врожденная болезнь накопления гликогена в сердце, более конкретно GSDI, GSDII или GSDIII, даже более конкретно GSDII и GSDIII и наиболее конкретно GSDII.

ПРИМЕРЫ

Изобретение дополнительно описано подробно со ссылкой на следующие экспериментальные примеры и приложенные фиг. Эти примеры приведены лишь в иллюстративных целях и не предназначены в качестве ограничения.

МАТЕРИАЛЫ И СПОСОБЫ

Активность GAA

Активность GAA измеряли после гомогенизации замороженных образцов тканей в дистиллированной воде. 50-100 мг ткани взвешивали и гомогенизировали, затем центрифугировали в течение 20 минут на 10000×g. Реакцию проводили с использованием 10 мкл супернатанта и 20 мкл субстрата - 4MUα-D-глюкозида, в 96-луночном планшете. Реакционную смесь инкубировали при 37°C в течение одного часа и затем останавливали добавлением 150 мкл буфера с карбонатом натрия pH 10,5. Калибровочную кривую (4MU 0-2500 пмоль/мкл) использовали для того, чтобы измерять высвобождаемый флуоресцентный 4MU из индивидуальной реакционной смеси, используя считыватель планшетов EnSpire α (Perkin-Elmer) на 449 нм (испускание) и 360 нм (возбуждение). Концентрацию белка осветленного супернатанта количественно определяли с помощью BCA (Thermo Fisher Scientific). Для того чтобы вычислять активность GAA, концентрацию высвобождаемого 4MU делили на концентрацию белка в образце и активность приводили в виде нмоль/час/мг белка.

Исследования мышей

GAA-/- мышь создавали посредством направленного разрушения экзона 6 и поддерживали на фоне C57BL/6J/129X1/SvJ (Raben N. et al 1998). Векторы доставляли через хвостовую вену в объеме 0,2 мл. Образцы сыворотки брали ежемесячно для того, чтобы осуществлять мониторинг уровней секретируемой hGAA. Пораженных животных, которым инъецировали PBS, и однопометников дикого типа использовали в качестве контролей.

Исследование NHP

Самцов яванских макаков содержали в клетках из нержавеющей стали и с поддержанием 12-часового цикла свет/темнота. Все макаки имели титры нейтрализующих антител < 1:5 перед началом исследования дозу 2E12 вг/кг AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1 инфузировали через подкожную вену. Образцы крови брали за 12 суток до и через 30 суток после инъекции через бедренную вену. Цельную кровь собрали в содержащие EDTA пробирки и центрифугировали для того, чтобы отделять сыворотку. Через 3 месяца после введения вектора всех макаков умерщвляли. Животных сначала анестезировали смесью кетамина/дексмедетомидина и затем эвтаназировали с использованием IV инъекции пентобарбитала натрия. Ткани собирали непосредственно и замораживали в жидком азоте.

Анализ вестерн-блоттинга

Получали полные гомогенаты замороженных мышц. Концентрацию белка определяли в экстрактах с помощью Pierce BCA Protein Assay (Thermo Fisher Scientific), придерживаясь инструкций производителя. Вестерн-блоттинг осуществляли с использованием антитела против hGAA (Abcam). Антитело против тубулина (Sigma Aldrich) использовали в качестве контроля загрузки.

РЕЗУЛЬТАТЫ

С целью разработки новых форм GAA с усовершенствованной секрецией и сниженной иммуногенностью, авторы изобретения решали получать усеченные формы GAA, необязательно комбинируя их с альтернативными сигнальными пептидами.

GAA человека, приведенная в SEQ ID NO: 2, служила в качестве основы для разработки этих новых форм. SEQ ID NO: 1 соответствует последовательности из SEQ ID NO: 2, свободной от соответствующего природного сигнального пептида GAA (аминокислоты 1-27 из SEQ ID NO: 2). Конструкции нуклеиновой кислоты разрабатывали для того, чтобы кодировать полипептиды GAA, происходящие из SEQ ID NO: 1, усеченные по их N-концу. Авторы изобретения начинали с разработки последовательности нуклеиновой кислоты на основе кодирующей последовательности hGAA дикого типа (SEQ ID NO: 9, соответствующая нуклеотидам 82-2859 из SEQ ID NO: 8, которая представляет собой кодирующую последовательность hGAA дикого типа, содержащую кодирующую последовательность сигнального пептида) с делецией кодонов, соответствующих первым 8 аминокислотам из SEQ ID NO: 1 (Δ8). В дополнение к кодирующей последовательности hGAA дикого типа, авторы изобретения разрабатывали оптимизированную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую Δ8 усеченный полипептид hGAA (SEQ ID NO: 10 и SEQ ID NO: 11 соответствуют оптимизированной кодирующей последовательности hGAAco1 и hGAAco2, соответственно), чтобы исключать возможный эффект конкретной последовательности.

Последовательность WT co1 co2 CAI^a 0,84 0,94 0,77 Содержание GC^b 64,7 61,9 54,4 aORF 5'→3'^c 2 3 0 aORF 3'→5'^d 5 4 0 SA^e 3 0 1 SD^f 3 0 0 % идентичность в сравнении с wt^g 83,1 77,7 % идентичность в сравнении с co1^h 80,8 Островки CpGⁱ 4 5 1

Таблица 1. Описание оптимизированных последовательностей. В таблице приведены характеристики двух оптимизированных последовательностей hGAA по сравнению с последовательностью дикого типа. a) коэффициент адаптации кодонов и b) содержание GC вычисляли с использованием инструмента анализа редких кодонов (http://www.genscript.com). c) и d) соответственно представляют собой альтернативные открытые рамки считывания, вычисленные на 5'-3' (aORF 5'→3') и 3'-5' (aORF 3'→5') нитях. e) и f) соответственно представляют собой участки акцепторов (SA) и доноров (SD) сплайсинга, вычисленные с использованием онлайн-инструмента предсказания участков сплайсинга (http://www.fruitfly.org/seq_tools/splice.html). g) и h) соответственно представляют собой процент идентичности, вычисляемый в сравнении с последовательностью дикого типа (wt) и оптимизированной последовательностью co1. i) островки CpG вычисляли с использованием онлайн-инструмента MethDB (http://www.methdb.de/links.html). Островки CpG представляют собой последовательности длиннее 100 п. о., с содержанием GC > 60% и соотношением наблюдаемые/ожидаемые > 0,6.

Аминокислоты 1-27 из последовательностей hGAA (соответствующие природному сигнальному пептиду hGAA, здесь определены как sp1; их последовательность приведена в SEQ ID NO: 4) заменяли на аминокислоты 1-24 из последовательности α-1-антитрипсина человека (NP_000286.3), здесь определяемую как sp2 (последовательность приведена в SEQ ID NO: 5). Авторы изобретения трансфицировали клетки гепатомы человека (Huh-7) кодирующими усеченную hGAA конструкциями параллельно с их полноразмерными версиями, и авторы изобретения измеряли количество hGAA, высвобождаемой в среду, через 48 часов фиг. 1A). Делеция Δ8 в последовательностях hGAA вела к значимому, 50% увеличению уровня секреции, как для последовательности дикого типа (hGAA), так и для последовательности с оптимизированными кодонами (hGAAco2). То же усечение, выполняемое на другой последовательности с оптимизированными кодонами (hGAAco1), также усовершенствовало секрецию hGAA в той же степени.

Для того чтобы подтверждать, что изменение в последовательности следующего сигнального пептида может усовершенствовать секрецию hGAA, авторы изобретения дополнительно усекали полипептид hGAA. Авторы изобретения устраняли кодоны, соответствующие первым 42 аминокислотам hGAA, из конструкции hGAAco1 (Δ42), и авторы изобретения заменяли их на сигнальный пептид, происходящий из химотрипсиногена B1 (sp7; последовательность приведена в SEQ ID NO: 3). Затем авторы изобретения сравнивали эффект секреции, получаемый с использованием этой новой конструкции с делецией, с ее Δ8 версией, слитой с сигнальным пептидом sp7 и полноразмерной hGAAco1 с sp1 или с sp7. Авторы изобретения трансфицировали клетки Huh-7 этим конструкциями, и авторы изобретения измеряли активность hGAA в среде через 48 часов. Как ожидали, авторы изобретения могли измерять активность hGAA после трансфекции полноразмерной hGAAco1 (p=0,055 в сравнении с GFP), и ее секреция двукратно возрастала при замене сигнального пептида дикого типа на sp7 (p=0,006 в сравнении с hGAAco1). К удивлению, обе последовательности Δ8 и Δ42 hGAA, слитые с сигнальным пептидом sp7, демонстрировали двукратное увеличение секретируемой hGAA по сравнению с полноразмерной последовательностью (p=0,0002 и 0,0003, соответственно, в сравнении с sp7-hGAAco1, фиг. 1B).

В совокупности, эти данные демонстрируют, что усечение последовательности hGAA, соединенной с эффективным сигнальным пептидом, позволяет увеличивать секрецию белка in vitro. Дополнительно, усечение имеет одно важное преимущество по сравнению с мутагенезом нативной последовательности, поскольку при нем не возникают основные неоантигены, что является преимуществом при конструировании терапевтического продукта.

Затем авторы изобретения верифицировали эти находки in vivo, в модели болезни Помпе на мышах. Авторы изобретения инъецировали GAA-/- мышам (Raben et al J. Bio. Chem. 1998) AAV8 векторы, экспрессирующие полноразмерную hGAAco1, Δ8 или Δ42, слитую с сигнальным пептидом sp7 под транскрипционным управлением высоко активного специфического промотора печени, полученного слиянием энхансера аполипопротеин B и промотора α-1-антитрипсина человека (hAAT). Через один месяц после инъекции 2E12 вг/кг векторов, описанных выше, у мышей брали кров и измеряли активность hGAA в сыворотке. Лечение мышей векторами, экспрессирующими полноразмерную hGAAco1, слитую с sp7, показывало повышенный уровень hGAA в кровотоке (p=0,115 в сравнении с PBS). К удивлению, обе усеченные hGAA, Δ8 и Δ42, вели к значимому увеличению уровня hGAA в сыворотке (p=0,014 и 0,013, соответственно).

Эти данные показывают, что делеция первых аминокислот hGAA вела к значимому усовершенствованию уровня hGAA, секретируемой в кровоток.

Кроме того, другой сигнальный пептид сливали с Δ8 усеченной формой hGAA, соответствующий аминокислотам 1-25, из идуронат-2-сульфатазы (sp6; SEQ ID NO: 6). Авторы изобретения трансфицировали клетки гепатомы (Huh-7) плазмидами, экспрессирующими GFP или hGAA дикого типа (hGAA; родительский полипептид, соответствующий аминокислотным остаткам 28-952 из SEQ ID NO: 30), параллельно с плазмидами, экспрессирующими оптимизированную hGAA (hGAAco1), слитую с sp1, sp2, sp6, sp7 или sp8. Через 48 часов после трансфекции, среду для выращивания анализировали на присутствие hGAA. Следует отметить, что эти конструкции вели к значительно более высоким уровням секреции hGAA, чем то, то наблюдали в отрицательном контроле, представленном GFP-трансфицированными клетками (фиг. 3).

Затем авторы изобретения оценивали содержание гликогена в сердце, диафрагме и квадрицепсе GAA-/- мышей, которых лечили, как описано выше, с использованием Δ8-hGAA. Следует отметить, что авторы изобретения наблюдали высокие уровни hGAA в тканях после лечения с использованием экспрессирующих Δ8-hGAAco векторов (данные не представлены), которые коррелировали со значимым снижением содержания гликогена во всех рассматриваемых тканях (фиг. 4B-D). В частности, в сердце (фиг. 4B) уровень гликогена, измеряемый после лечения векторами, несущими высоко эффективные сигнальные пептиды sp7 и 8, неотличим от того, который наблюдали у не пораженных животных (p=0,983 и 0,996 в сравнении с WT, соответственно). Важно, что уровень, наблюдаемый после лечения с использованием векторов sp7 и sp8, значительно снижался по сравнению с GAA-/- животными, которые получали инъекции PBS или лечение вектором, экспрессирующим hGAAco, слитую с сигнальным пептидом sp1.

Авторы изобретения также тестировали, индуцировала ли трансдукция печени с использованием векторов авторов изобретения гуморальный ответ на трансген. Мышам внутривенно инъецировали AAV8 векторы, экспрессирующие hGAAco1 с нативным сигнальным пептидом sp1 (co) или Δ8-hGAAco1, слитую с sp2, sp7 или sp8, под транскрипционным управлением специфического промотора печени. Результаты представлены на фиг. 5. Gaa-/- получали внутримышечную инъекцию AAV, экспрессирующего Δ8-hGAAco1 под транскрипционным управлением конститутивного промотора, который демонстрировал очень высокий уровень общего IgG (~150 мкг/мл), тогда как в целом вектор, экспрессирующий тот же белок в печени, демонстрировал более низкий уровень гуморального ответа. Интересно, что мыши, которым инъецировали экспрессирующий sp1 hGAAco1 (co) вектор, демонстрировали поддающийся обнаружению уровень антител при обеих дозах, тогда как мыши, которым инъецировали сконструированные векторы высокой секреции, имели неподдающиеся обнаружению уровни IgG. Эти данные показывают, что экспрессия трансгена в печени является необходимой для индукции периферической толерантности, также они предоставляют указания на то, что высокие уровни циркулирующей hGAA, которых достигали посредством слияния с эффективным сигнальным пептидом, индуцируют снижение гуморального ответа на сам белок.

Наиболее действенный вектор, выбранный в исследовании на мышах, инъецировали двум не являющимся человеком приматам (NHP, Macaca fascicularis sp.) для того, чтобы верифицировать эффект секреции вектора авторов изобретения и захват в мышцах. Авторы изобретения инъецировали двум обезьянам 2E12 вг/кг AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1. Через один месяц после инъекции авторы изобретения измеряли уровни hGAA в сыворотке двух животных посредством вестерн-блоттинга с использованием специфического антитела против hGAA. У двух обезьян авторы изобретения наблюдали четкую полосу с размером, совместимым с таковым у hGAA. Эта полоса отсутствовала в образцах сыворотки, полученных за 12 суток до инъекции вектора, что, таким образом, подтверждает специфичность способа обнаружения авторов изобретения (фиг. 6A). Через 3 месяца после инъекции авторы изобретения умерщвляли животных и авторы изобретения получали ткани для того, чтобы верифицировать, если hGAA, секретируемая печенью в кровоток, эффективно захватывалась мышцей. Авторы изобретения выполняли вестерн-блоттинг с использованием антитела со специфичностью к hGAA на общих лизатах, полученных из бицепса и диафрагмы двух обезьян. Интересно, что авторы изобретения могли наблюдать четкую полосу у животного № 2, которое также демонстрировало самые высокие уровни hGAA в кровотоке (фиг. 6B). Также у животного № 1 авторы изобретения могли наблюдать слабую полосу с молекулярной массы, соответствующей таковой у hGAA, в обеих анализируемых мышцах. Эти данные показывают, что вектор AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1 эффективно трансдуцирует печень у NHP. Также они демонстрируют, что белок, секретируемый в кровоток, эффективно захватывается мышцей и что это захват коррелирует с уровнем hGAA, измеряемой в крови.

Авторы изобретения также определяли эффект наиболее действенного вектора, выбранного в исследовании на мышах (AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1) в модели GSDIII на мышах. Авторы изобретения разрабатывали модель на мышах с нокаутом для гликоген-деветвящего фермента (GDE). Эта модель повторяет фенотип заболевания, наблюдаемый у людей, пораженных болезнью накопления гликогена III типа (GSDIII). В частности, GDE-/- мыши, у которых полностью отсутствует активность GDE, имеют ослабление силы мышц и накопление гликогена в различных тканях. Также интересно, что они накапливают гликоген в печени, что также наблюдают у человека. Здесь авторы изобретения тестировали, предотвращает ли сверхэкспрессия sp7-Δ8-hGAA в печени накопление гликогена, наблюдаемое у GDE-/- мышей. Авторы изобретения инъецировали GDE-/- мышам 1E11 или 1E12 вг/мышь AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1. В качестве контролей авторы изобретения параллельно инъецировали PBS мышам дикого типа (WT) и GDE-/- мышам. Через 3 месяца после введения вектора, мышей умерщвляли и количественно определяли уровень гликогена в печени. Результаты приведены на фиг. 7. Как уже сообщалось (Pagliarani et al и модель авторов изобретения), GDE-/- мыши демонстрировали значимое увеличение накопления гликогена в печени (p=1,3E-7) - в 5 раз больше гликогена по сравнению с животными дикого типа. К удивлению, лечение с использованием 1E11 и 1E12 вг/мышь вектора AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1 вызывало статистически значимое снижение содержания гликогена (p=4,5E-5 и 1,4E-6, соответственно). Важно, что уровни гликогена, измеряемого в печени мышей, которым инъецировали вектор AAV8-hAAT-sp7-Δ8-hGAAco1, не отличались от таковых, измеряемых у животных дикого типа, в частности, в самой высокой дозе (p=0,053 для когорты дозы 1E11 и 0,244 для когорты дозы 1E12).

Авторы изобретения проводили анализ активности GAA в средах и лизатах клеток HuH7, трансфицированных различными версиями GAA (все с оптимизацией кодонов): 1. нативная GAA, содержащая нативный сигнальный пептид sp1 GAA (co), 2. сконструированная GAA, содержащая гетерологичный сигнальный пептид sp7 (sp7-co), и 3. сконструированная GAA, содержащая гетерологичный сигнальный пептид sp7, после которого следует делеция переменного числа аминокислот (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co, sp7-Δ47-co и sp7-Δ62-co, в которых удаляют, соответственно, 8, 29, 42, 47 и 62 первых N-концевых аминокислот из SEQ ID NO: 1). Анализ показывал (фиг. 8) значительно более высокую активность GAA в средах клеток, трансфицированных с использованием Δ8, Δ29, Δ42 и Δ43 версий GAA по сравнению как со сконструированной GAA без делеций (sp7-co), так и с нативной GAA (co). Значительно более низкую активность GAA наоборот наблюдали в средах клеток, трансфицированных с использованием Δ47 и Δ62 версий GAA, по сравнению с другими сконструированными версиями GAA [с делециями (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co) и без делеций (sp7-co)]. Интересно, что (фиг. 9) внутриклеточная активность GAA не различалась среди продуктивных делеций (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co) и версии без делеций (sp7-co), что указывает на то, что все они эффективно продуцируются и процессируются в клетке. Внутриклеточная активность GAA наоборот была очень низкой для версий sp7-Δ47-co и sp7-Δ62-co и значительно ниже по сравнению со всеми другими сконструированными версиями [с делециями (sp7-Δ8-co, sp7-Δ29-co, sp7-Δ42-co, sp7-Δ43-co) и без делеций (sp7-co)].

Авторы изобретения также выполняли анализ активности GAA в средах и лизатах клеток HuH7, трансфицированных различными версиями GAA (все с оптимизированными кодонами): 1. нативная GAA, содержащая нативный сигнальный пептид sp1 GAA (co), 2. сконструированная GAA, содержащая гетерологичный сигнальный пептид sp6 или sp8 (sp6-co, sp8-co), и 3. сконструированная GAA, содержащая гетерологичный сигнальный пептид sp6 или sp8, после которого следует делеция 8 аминокислот (sp6-Δ8-co, sp8-Δ8-co). Анализ показывал (фиг. 10) значительно более высокую активность GAA в средах клеток, трансфицированных Δ8 версиями, по сравнению с: i. соответствующими им сконструированными версиями GAA без делеций (sp6-co или sp8-co); и ii. нативной GAA (co). Интересно, что внутриклеточная активность GAA не различалась среди всех сконструированных версий GAA (как с делециями, так и без делеций), что указывает на то, что все они эффективно продуцируются и процессируются в клетке (часть лизатов клеток). Внутриклеточная активность GAA наоборот была значительно выше при использовании нативной GAA (co) по сравнению со сконструированными версиями, что указывает на то, что нативная GAA преимущественно удерживается в клетке.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> GENETHON et al.

<120> ВАРИАНТЫ КИСЛОЙ АЛЬФА-ГЛЮКОЗИДАЗЫ И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

<130> B2299PC00

<160> 53

<170> PatentIn версии 3.3

<210> 1

<211> 925

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAwt без sp

<400> 1

Gly His Ile Leu Leu His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser

1 5 10 15

Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly

20 25 30

Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro

35 40 45

Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp

50 55 60

Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly

65 70 75 80

Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly

85 90 95

Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu

100 105 110

Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr

115 120 125

Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val

130 135 140

Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala

145 150 155 160

Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg

165 170 175

Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly

180 185 190

Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr

195 200 205

Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser

210 215 220

Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu

225 230 235 240

Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu

245 250 255

Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu

260 265 270

Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser

275 280 285

Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg

290 295 300

Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro

305 310 315 320

Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met

325 330 335

Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser

340 345 350

Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His

355 360 365

Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg

370 375 380

Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met

385 390 395 400

Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp

405 410 415

Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp

420 425 430

Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro

435 440 445

Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr

450 455 460

Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His

465 470 475 480

Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser

485 490 495

Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu

500 505 510

Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala

515 520 525

Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu

530 535 540

His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu

545 550 555 560

Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe

565 570 575

Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser

580 585 590

Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn

595 600 605

Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly

610 615 620

Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe

625 630 635 640

Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu

645 650 655

Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu

660 665 670

Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln

675 680 685

Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe

690 695 700

Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly

705 710 715 720

Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val

725 730 735

Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro

740 745 750

Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu

755 760 765

Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu

770 775 780

Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln

785 790 795 800

Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu

805 810 815

Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp

820 825 830

Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln

835 840 845

Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg

850 855 860

Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu

865 870 875 880

Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val

885 890 895

Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val

900 905 910

Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

915 920 925

<210> 2

<211> 952

<212> Белок

<213> homo sapiens

<400> 2

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

20 25 30

His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val

35 40 45

Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly

50 55 60

Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr

65 70 75 80

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

100 105 110

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser

130 135 140

Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

165 170 175

Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu

180 185 190

Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu

195 200 205

Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg

210 215 220

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

225 230 235 240

Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

245 250 255

Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

260 265 270

Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

275 280 285

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly

290 295 300

Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

305 310 315 320

Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

325 330 335

Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

340 345 350

Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

355 360 365

Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

370 375 380

Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val

385 390 395 400

Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

405 410 415

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

420 425 430

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

435 440 445

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

450 455 460

Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val

465 470 475 480

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

485 490 495

Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

500 505 510

Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

515 520 525

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

530 535 540

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

545 550 555 560

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

565 570 575

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

660 665 670

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

690 695 700

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

705 710 715 720

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

755 760 765

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly

770 775 780

Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

785 790 795 800

Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

805 810 815

His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

820 825 830

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr

835 840 845

Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser

850 855 860

Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910

Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr

915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly

930 935 940

Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

945 950

<210> 3

<211> 18

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> sp7

<400> 3

Met Ala Phe Leu Trp Leu Leu Ser Cys Trp Ala Leu Leu Gly Thr Thr

1 5 10 15

Phe Gly

<210> 4

<211> 27

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> sp1

<400> 4

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu

20 25

<210> 5

<211> 24

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> sp2

<400> 5

Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys

1 5 10 15

Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala

20

<210> 6

<211> 25

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> sp6

<400> 6

Met Pro Pro Pro Arg Thr Gly Arg Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Val

1 5 10 15

Leu Ser Ser Val Cys Val Ala Leu Gly

20 25

<210> 7

<211> 22

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> sp8

<400> 7

Met Ala Ser Arg Leu Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala

1 5 10 15

Gly Asp Arg Ala Ser Ser

20

<210> 8

<211> 2859

<212> ДНК

<213> homo sapiens

<400> 8

atgggagtga ggcacccgcc ctgctcccac cggctcctgg ccgtctgcgc cctcgtgtcc 60

ttggcaaccg cagcgctcct ggggcacatc ctactccatg atttcctgct ggttccccga 120

gagctgagtg gctcctcccc agtcctggag gagactcacc cagctcacca gcagggagcc 180

agcagaccag ggccccggga tgcccaggca caccccgggc ggccgcgagc agtgcccaca 240

cagtgcgacg tcccccccaa cagccgcttc gattgcgccc ctgacaaggc catcacccag 300

gaacagtgcg aggcccgcgg ctgttgctac atccctgcaa agcaggggct gcagggagcc 360

cagatggggc agccctggtg cttcttccca cccagctacc ccagctacaa gctggagaac 420

ctgagctcct ctgaaatggg ctacacggcc accctgaccc gtaccacccc caccttcttc 480

cccaaggaca tcctgaccct gcggctggac gtgatgatgg agactgagaa ccgcctccac 540

ttcacgatca aagatccagc taacaggcgc tacgaggtgc ccttggagac cccgcatgtc 600

cacagccggg caccgtcccc actctacagc gtggagttct ccgaggagcc cttcggggtg 660

atcgtgcgcc ggcagctgga cggccgcgtg ctgctgaaca cgacggtggc gcccctgttc 720

tttgcggacc agttccttca gctgtccacc tcgctgccct cgcagtatat cacaggcctc 780

gccgagcacc tcagtcccct gatgctcagc accagctgga ccaggatcac cctgtggaac 840

cgggaccttg cgcccacgcc cggtgcgaac ctctacgggt ctcacccttt ctacctggcg 900

ctggaggacg gcgggtcggc acacggggtg ttcctgctaa acagcaatgc catggatgtg 960

gtcctgcagc cgagccctgc ccttagctgg aggtcgacag gtgggatcct ggatgtctac 1020

atcttcctgg gcccagagcc caagagcgtg gtgcagcagt acctggacgt tgtgggatac 1080

ccgttcatgc cgccatactg gggcctgggc ttccacctgt gccgctgggg ctactcctcc 1140

accgctatca cccgccaggt ggtggagaac atgaccaggg cccacttccc cctggacgtc 1200

cagtggaacg acctggacta catggactcc cggagggact tcacgttcaa caaggatggc 1260

ttccgggact tcccggccat ggtgcaggag ctgcaccagg gcggccggcg ctacatgatg 1320

atcgtggatc ctgccatcag cagctcgggc cctgccggga gctacaggcc ctacgacgag 1380

ggtctgcgga ggggggtttt catcaccaac gagaccggcc agccgctgat tgggaaggta 1440

tggcccgggt ccactgcctt ccccgacttc accaacccca cagccctggc ctggtgggag 1500

gacatggtgg ctgagttcca tgaccaggtg cccttcgacg gcatgtggat tgacatgaac 1560

gagccttcca acttcatcag gggctctgag gacggctgcc ccaacaatga gctggagaac 1620

ccaccctacg tgcctggggt ggttgggggg accctccagg cggccaccat ctgtgcctcc 1680

agccaccagt ttctctccac acactacaac ctgcacaacc tctacggcct gaccgaagcc 1740

atcgcctccc acagggcgct ggtgaaggct cgggggacac gcccatttgt gatctcccgc 1800

tcgacctttg ctggccacgg ccgatacgcc ggccactgga cgggggacgt gtggagctcc 1860

tgggagcagc tcgcctcctc cgtgccagaa atcctgcagt ttaacctgct gggggtgcct 1920

ctggtcgggg ccgacgtctg cggcttcctg ggcaacacct cagaggagct gtgtgtgcgc 1980

tggacccagc tgggggcctt ctaccccttc atgcggaacc acaacagcct gctcagtctg 2040

ccccaggagc cgtacagctt cagcgagccg gcccagcagg ccatgaggaa ggccctcacc 2100

ctgcgctacg cactcctccc ccacctctac acactgttcc accaggccca cgtcgcgggg 2160

gagaccgtgg cccggcccct cttcctggag ttccccaagg actctagcac ctggactgtg 2220

gaccaccagc tcctgtgggg ggaggccctg ctcatcaccc cagtgctcca ggccgggaag 2280

gccgaagtga ctggctactt ccccttgggc acatggtacg acctgcagac ggtgccagta 2340

gaggcccttg gcagcctccc acccccacct gcagctcccc gtgagccagc catccacagc 2400

gaggggcagt gggtgacgct gccggccccc ctggacacca tcaacgtcca cctccgggct 2460

gggtacatca tccccctgca gggccctggc ctcacaacca cagagtcccg ccagcagccc 2520

atggccctgg ctgtggccct gaccaagggt ggggaggccc gaggggagct gttctgggac 2580

gatggagaga gcctggaagt gctggagcga ggggcctaca cacaggtcat cttcctggcc 2640

aggaataaca cgatcgtgaa tgagctggta cgtgtgacca gtgagggagc tggcctgcag 2700

ctgcagaagg tgactgtcct gggcgtggcc acggcgcccc agcaggtcct ctccaacggt 2760

gtccctgtct ccaacttcac ctacagcccc gacaccaagg tcctggacat ctgtgtctcg 2820

ctgttgatgg gagagcagtt tctcgtcagc tggtgttag 2859

<210> 9

<211> 2778

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAwt без sp

<400> 9

gggcacatcc tactccatga tttcctgctg gttccccgag agctgagtgg ctcctcccca 60

gtcctggagg agactcaccc agctcaccag cagggagcca gcagaccagg gccccgggat 120

gcccaggcac accccgggcg gccgcgagca gtgcccacac agtgcgacgt cccccccaac 180

agccgcttcg attgcgcccc tgacaaggcc atcacccagg aacagtgcga ggcccgcggc 240

tgttgctaca tccctgcaaa gcaggggctg cagggagccc agatggggca gccctggtgc 300

ttcttcccac ccagctaccc cagctacaag ctggagaacc tgagctcctc tgaaatgggc 360

tacacggcca ccctgacccg taccaccccc accttcttcc ccaaggacat cctgaccctg 420

cggctggacg tgatgatgga gactgagaac cgcctccact tcacgatcaa agatccagct 480

aacaggcgct acgaggtgcc cttggagacc ccgcatgtcc acagccgggc accgtcccca 540

ctctacagcg tggagttctc cgaggagccc ttcggggtga tcgtgcgccg gcagctggac 600

ggccgcgtgc tgctgaacac gacggtggcg cccctgttct ttgcggacca gttccttcag 660

ctgtccacct cgctgccctc gcagtatatc acaggcctcg ccgagcacct cagtcccctg 720

atgctcagca ccagctggac caggatcacc ctgtggaacc gggaccttgc gcccacgccc 780

ggtgcgaacc tctacgggtc tcaccctttc tacctggcgc tggaggacgg cgggtcggca 840

cacggggtgt tcctgctaaa cagcaatgcc atggatgtgg tcctgcagcc gagccctgcc 900

cttagctgga ggtcgacagg tgggatcctg gatgtctaca tcttcctggg cccagagccc 960

aagagcgtgg tgcagcagta cctggacgtt gtgggatacc cgttcatgcc gccatactgg 1020

ggcctgggct tccacctgtg ccgctggggc tactcctcca ccgctatcac ccgccaggtg 1080

gtggagaaca tgaccagggc ccacttcccc ctggacgtcc agtggaacga cctggactac 1140

atggactccc ggagggactt cacgttcaac aaggatggct tccgggactt cccggccatg 1200

gtgcaggagc tgcaccaggg cggccggcgc tacatgatga tcgtggatcc tgccatcagc 1260

agctcgggcc ctgccgggag ctacaggccc tacgacgagg gtctgcggag gggggttttc 1320

atcaccaacg agaccggcca gccgctgatt gggaaggtat ggcccgggtc cactgccttc 1380

cccgacttca ccaaccccac agccctggcc tggtgggagg acatggtggc tgagttccat 1440

gaccaggtgc ccttcgacgg catgtggatt gacatgaacg agccttccaa cttcatcagg 1500

ggctctgagg acggctgccc caacaatgag ctggagaacc caccctacgt gcctggggtg 1560

gttgggggga ccctccaggc ggccaccatc tgtgcctcca gccaccagtt tctctccaca 1620

cactacaacc tgcacaacct ctacggcctg accgaagcca tcgcctccca cagggcgctg 1680

gtgaaggctc gggggacacg cccatttgtg atctcccgct cgacctttgc tggccacggc 1740

cgatacgccg gccactggac gggggacgtg tggagctcct gggagcagct cgcctcctcc 1800

gtgccagaaa tcctgcagtt taacctgctg ggggtgcctc tggtcggggc cgacgtctgc 1860

ggcttcctgg gcaacacctc agaggagctg tgtgtgcgct ggacccagct gggggccttc 1920

taccccttca tgcggaacca caacagcctg ctcagtctgc cccaggagcc gtacagcttc 1980

agcgagccgg cccagcaggc catgaggaag gccctcaccc tgcgctacgc actcctcccc 2040

cacctctaca cactgttcca ccaggcccac gtcgcggggg agaccgtggc ccggcccctc 2100

ttcctggagt tccccaagga ctctagcacc tggactgtgg accaccagct cctgtggggg 2160

gaggccctgc tcatcacccc agtgctccag gccgggaagg ccgaagtgac tggctacttc 2220

cccttgggca catggtacga cctgcagacg gtgccagtag aggcccttgg cagcctccca 2280

cccccacctg cagctccccg tgagccagcc atccacagcg aggggcagtg ggtgacgctg 2340

ccggcccccc tggacaccat caacgtccac ctccgggctg ggtacatcat ccccctgcag 2400

ggccctggcc tcacaaccac agagtcccgc cagcagccca tggccctggc tgtggccctg 2460

accaagggtg gggaggcccg aggggagctg ttctgggacg atggagagag cctggaagtg 2520

ctggagcgag gggcctacac acaggtcatc ttcctggcca ggaataacac gatcgtgaat 2580

gagctggtac gtgtgaccag tgagggagct ggcctgcagc tgcagaaggt gactgtcctg 2640

ggcgtggcca cggcgcccca gcaggtcctc tccaacggtg tccctgtctc caacttcacc 2700

tacagccccg acaccaaggt cctggacatc tgtgtctcgc tgttgatggg agagcagttt 2760

ctcgtcagct ggtgttag 2778

<210> 10

<211> 2778

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco1 без sp

<400> 10

ggccatatcc tgctgcacga ctttctacta gtgcccagag agctgagcgg cagctctccc 60

gtgctggaag aaacacaccc tgcccatcag cagggcgcct ctagacctgg acctagagat 120

gcccaggccc accccggcag acctagagct gtgcctaccc agtgtgacgt gccccccaac 180

agcagattcg actgcgcccc tgacaaggcc atcacccagg aacagtgcga ggccagaggc 240

tgctgctaca tccctgccaa gcagggactg cagggcgctc agatgggaca gccctggtgc 300

ttcttcccac cctcctaccc cagctacaag ctggaaaacc tgagcagcag cgagatgggc 360

tacaccgcca ccctgaccag aaccaccccc acattcttcc caaaggacat cctgaccctg 420

cggctggacg tgatgatgga aaccgagaac cggctgcact tcaccatcaa ggaccccgcc 480

aatcggagat acgaggtgcc cctggaaacc ccccacgtgc actctagagc ccccagccct 540

ctgtacagcg tggaattcag cgaggaaccc ttcggcgtga tcgtgcggag acagctggat 600

ggcagagtgc tgctgaacac caccgtggcc cctctgttct tcgccgacca gttcctgcag 660

ctgagcacca gcctgcccag ccagtacatc acaggactgg ccgagcacct gagccccctg 720

atgctgagca catcctggac ccggatcacc ctgtggaaca gggatctggc ccctacccct 780

ggcgccaatc tgtacggcag ccaccctttc tacctggccc tggaagatgg cggatctgcc 840

cacggagtgt ttctgctgaa ctccaacgcc atggacgtgg tgctgcagcc tagccctgcc 900

ctgtcttgga gaagcacagg cggcatcctg gatgtgtaca tctttctggg ccccgagccc 960

aagagcgtgg tgcagcagta tctggatgtc gtgggctacc ccttcatgcc cccttactgg 1020

ggcctgggat tccacctgtg cagatggggc tactccagca ccgccatcac cagacaggtg 1080

gtggaaaaca tgaccagagc ccacttccca ctggatgtgc agtggaacga cctggactac 1140

atggacagca gacgggactt caccttcaac aaggacggct tccgggactt ccccgccatg 1200

gtgcaggaac tgcatcaggg cggcagacgg tacatgatga tcgtggatcc cgccatcagc 1260

tcctctggcc ctgccggctc ttacagaccc tacgacgagg gcctgcggag aggcgtgttc 1320

atcaccaacg agacaggcca gcccctgatc ggcaaagtgt ggcctggcag cacagccttc 1380

cccgacttca ccaatcctac cgccctggct tggtgggagg acatggtggc cgagttccac 1440

gaccaggtgc ccttcgacgg catgtggatc gacatgaacg agcccagcaa cttcatccgg 1500

ggcagcgagg atggctgccc caacaacgaa ctggaaaatc ccccttacgt gcccggcgtc 1560

gtgggcggaa cactgcaggc cgctacaatc tgtgccagca gccaccagtt tctgagcacc 1620

cactacaacc tgcacaacct gtacggcctg accgaggcca ttgccagcca ccgcgctctc 1680

gtgaaagcca gaggcacacg gcccttcgtg atcagcagaa gcacctttgc cggccacggc 1740

agatacgccg gacattggac tggcgacgtg tggtcctctt gggagcagct ggcctctagc 1800

gtgcccgaga tcctgcagtt caatctgctg ggcgtgccac tcgtgggcgc cgatgtgtgt 1860

ggcttcctgg gcaacacctc cgaggaactg tgtgtgcggt ggacacagct gggcgccttc 1920

taccctttca tgagaaacca caacagcctg ctgagcctgc cccaggaacc ctacagcttt 1980

agcgagcctg cacagcaggc catgcggaag gccctgacac tgagatacgc tctgctgccc 2040

cacctgtaca ccctgtttca ccaggcccat gtggccggcg agacagtggc cagacctctg 2100

tttctggaat tccccaagga cagcagcacc tggaccgtgg accatcagct gctgtgggga 2160

gaggctctgc tgattacccc agtgctgcag gcaggcaagg ccgaagtgac cggctacttt 2220

cccctgggca cttggtacga cctgcagacc gtgcctgtgg aagccctggg atctctgcct 2280

ccacctcctg ccgctcctag agagcctgcc attcactctg agggccagtg ggtcacactg 2340

cctgcccccc tggataccat caacgtgcac ctgagggccg gctacatcat accactgcag 2400

ggacctggcc tgaccaccac cgagtctaga cagcagccaa tggccctggc cgtggccctg 2460

accaaaggcg gagaagctag gggcgagctg ttctgggacg atggcgagag cctggaagtg 2520

ctggaaagag gcgcctatac ccaagtgatc ttcctggccc ggaacaacac catcgtgaac 2580

gagctggtgc gcgtgacctc tgaaggcgct ggactgcagc tgcagaaagt gaccgtgctg 2640

ggagtggcca cagcccctca gcaggtgctg tctaatggcg tgcccgtgtc caacttcacc 2700

tacagccccg acaccaaggt gctggacatc tgcgtgtcac tgctgatggg agagcagttt 2760

ctggtgtcct ggtgctga 2778

<210> 11

<211> 2778

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco2 без sp

<400> 11

ggacacatcc tgctgcacga cttcctgttg gtgcctagag agctgagcgg atcatcccca 60

gtgctggagg agactcatcc tgctcaccaa cagggagctt ccagaccagg accgagagac 120

gcccaagccc atcctggtag accaagagct gtgcctaccc aatgcgacgt gccacccaac 180

tcccgattcg actgcgcgcc agataaggct attacccaag agcagtgtga agccagaggt 240

tgctgctaca tcccagcgaa gcaaggattg caaggcgccc aaatgggaca accttggtgt 300

ttcttccccc cttcgtaccc atcatataaa ctcgaaaacc tgtcctcttc ggaaatgggt 360

tatactgcca ccctcaccag aactactcct actttcttcc cgaaagacat cttgaccttg 420

aggctggacg tgatgatgga gactgaaaac cggctgcatt tcactatcaa agatcctgcc 480

aatcggcgat acgaggtccc tctggaaacc cctcacgtgc actcacgggc tccttctccg 540

ctttactccg tcgaattctc tgaggaaccc ttcggagtga tcgttagacg ccagctggat 600

ggtagagtgc tgttgaacac tactgtggcc ccacttttct tcgctgacca gtttctgcaa 660

ctgtccactt ccctgccatc ccagtacatt actggactcg ccgaacacct gtcgccactg 720

atgctctcga cctcttggac tagaatcact ttgtggaaca gagacttggc ccctactccg 780

ggagcaaatc tgtacggaag ccaccctttt tacctggcgc tcgaagatgg cggatccgct 840

cacggagtgt tcctgctgaa tagcaacgca atggacgtgg tgctgcaacc ttcccctgca 900

ctcagttgga gaagtaccgg gggtattctg gacgtgtaca tcttcctcgg accagaaccc 960

aagagcgtgg tgcagcaata tctggacgtg gtcggatacc cttttatgcc tccttactgg 1020

ggactgggat tccacctttg ccgttggggc tactcatcca ccgccattac cagacaggtg 1080

gtggagaata tgaccagagc ccacttccct ctcgacgtgc agtggaacga tctggactat 1140

atggactccc ggagagattt caccttcaac aaggacgggt tccgcgattt tcccgcgatg 1200

gttcaagagc tccaccaggg tggtcgaaga tatatgatga tcgtcgaccc agccatttcg 1260

agcagcggac ccgctggatc ttatagacct tacgacgaag gccttaggag aggagtgttc 1320

atcacaaacg agactggaca gcctttgatc ggtaaagtgt ggcctggatc aaccgccttt 1380

cctgacttta ccaatcccac tgccttggct tggtgggagg acatggtggc cgaattccac 1440

gaccaagtcc cctttgatgg aatgtggatc gatatgaacg aaccaagcaa ttttatcaga 1500

ggttccgaag acggttgccc caacaacgaa ctggaaaacc ctccttatgt gcccggagtc 1560

gtgggcggaa cattacaggc cgcgactatt tgcgccagca gccaccaatt cctgtccact 1620

cactacaacc tccacaacct ttatggatta accgaagcta ttgcaagtca cagggctctg 1680

gtgaaggcta gagggactag gccctttgtg atctcccgat ccacctttgc cggacacggg 1740

agatacgccg gtcactggac tggtgacgtg tggagctcat gggaacaact ggcctcctcc 1800

gtgccggaaa tcttacagtt caaccttctg ggtgtccctc ttgtcggagc agacgtgtgt 1860

gggtttcttg gtaacacctc cgaggaactg tgtgtgcgct ggactcaact gggtgcattc 1920

tacccattca tgagaaacca caactccttg ctgtccctgc cacaagagcc ctactcgttc 1980

agcgagcctg cacaacaggc tatgcggaag gcactgaccc tgagatacgc cctgcttcca 2040

cacttataca ctctcttcca tcaagcgcat gtggcaggag aaaccgttgc aaggcctctt 2100

ttccttgaat tccccaagga ttcctcgact tggacggtgg atcatcagct gctgtgggga 2160

gaagctctgc tgattactcc agtgttgcaa gccggaaaag ctgaggtgac cggatacttt 2220

ccgctgggaa cctggtacga cctccagact gtccctgttg aagcccttgg atcactgcct 2280

ccgcctccgg cagctccacg cgaaccagct atacattccg agggacagtg ggttacatta 2340

ccagctcctc tggacacaat caacgtccac ttaagagctg gctacattat ccctctgcaa 2400

ggaccaggac tgactacgac cgagagcaga cagcagccaa tggcactggc tgtggctctg 2460

accaagggag gggaagctag aggagaactc ttctgggatg atggggagtc ccttgaagtg 2520

ctggaaagag gcgcttacac tcaagtcatt ttccttgcac ggaacaacac cattgtgaac 2580

gaattggtgc gagtgaccag cgaaggagct ggacttcaac tgcagaaggt cactgtgctc 2640

ggagtggcta ccgctcctca gcaagtgctg tcgaatggag tccccgtgtc aaactttacc 2700

tactcccctg acactaaggt gctcgacatt tgcgtgtccc tcctgatggg agagcagttc 2760

cttgtgtcct ggtgttga 2778

<210> 12

<211> 2754

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco1-дельта-8 без sp

<400> 12

ctactagtgc ccagagagct gagcggcagc tctcccgtgc tggaagaaac acaccctgcc 60

catcagcagg gcgcctctag acctggacct agagatgccc aggcccaccc cggcagacct 120

agagctgtgc ctacccagtg tgacgtgccc cccaacagca gattcgactg cgcccctgac 180

aaggccatca cccaggaaca gtgcgaggcc agaggctgct gctacatccc tgccaagcag 240

ggactgcagg gcgctcagat gggacagccc tggtgcttct tcccaccctc ctaccccagc 300

tacaagctgg aaaacctgag cagcagcgag atgggctaca ccgccaccct gaccagaacc 360

acccccacat tcttcccaaa ggacatcctg accctgcggc tggacgtgat gatggaaacc 420

gagaaccggc tgcacttcac catcaaggac cccgccaatc ggagatacga ggtgcccctg 480

gaaacccccc acgtgcactc tagagccccc agccctctgt acagcgtgga attcagcgag 540

gaacccttcg gcgtgatcgt gcggagacag ctggatggca gagtgctgct gaacaccacc 600

gtggcccctc tgttcttcgc cgaccagttc ctgcagctga gcaccagcct gcccagccag 660

tacatcacag gactggccga gcacctgagc cccctgatgc tgagcacatc ctggacccgg 720

atcaccctgt ggaacaggga tctggcccct acccctggcg ccaatctgta cggcagccac 780

cctttctacc tggccctgga agatggcgga tctgcccacg gagtgtttct gctgaactcc 840

aacgccatgg acgtggtgct gcagcctagc cctgccctgt cttggagaag cacaggcggc 900

atcctggatg tgtacatctt tctgggcccc gagcccaaga gcgtggtgca gcagtatctg 960

gatgtcgtgg gctacccctt catgccccct tactggggcc tgggattcca cctgtgcaga 1020

tggggctact ccagcaccgc catcaccaga caggtggtgg aaaacatgac cagagcccac 1080

ttcccactgg atgtgcagtg gaacgacctg gactacatgg acagcagacg ggacttcacc 1140

ttcaacaagg acggcttccg ggacttcccc gccatggtgc aggaactgca tcagggcggc 1200

agacggtaca tgatgatcgt ggatcccgcc atcagctcct ctggccctgc cggctcttac 1260

agaccctacg acgagggcct gcggagaggc gtgttcatca ccaacgagac aggccagccc 1320

ctgatcggca aagtgtggcc tggcagcaca gccttccccg acttcaccaa tcctaccgcc 1380

ctggcttggt gggaggacat ggtggccgag ttccacgacc aggtgccctt cgacggcatg 1440

tggatcgaca tgaacgagcc cagcaacttc atccggggca gcgaggatgg ctgccccaac 1500

aacgaactgg aaaatccccc ttacgtgccc ggcgtcgtgg gcggaacact gcaggccgct 1560

acaatctgtg ccagcagcca ccagtttctg agcacccact acaacctgca caacctgtac 1620

ggcctgaccg aggccattgc cagccaccgc gctctcgtga aagccagagg cacacggccc 1680

ttcgtgatca gcagaagcac ctttgccggc cacggcagat acgccggaca ttggactggc 1740

gacgtgtggt cctcttggga gcagctggcc tctagcgtgc ccgagatcct gcagttcaat 1800

ctgctgggcg tgccactcgt gggcgccgat gtgtgtggct tcctgggcaa cacctccgag 1860

gaactgtgtg tgcggtggac acagctgggc gccttctacc ctttcatgag aaaccacaac 1920

agcctgctga gcctgcccca ggaaccctac agctttagcg agcctgcaca gcaggccatg 1980

cggaaggccc tgacactgag atacgctctg ctgccccacc tgtacaccct gtttcaccag 2040

gcccatgtgg ccggcgagac agtggccaga cctctgtttc tggaattccc caaggacagc 2100

agcacctgga ccgtggacca tcagctgctg tggggagagg ctctgctgat taccccagtg 2160

ctgcaggcag gcaaggccga agtgaccggc tactttcccc tgggcacttg gtacgacctg 2220

cagaccgtgc ctgtggaagc cctgggatct ctgcctccac ctcctgccgc tcctagagag 2280

cctgccattc actctgaggg ccagtgggtc acactgcctg cccccctgga taccatcaac 2340

gtgcacctga gggccggcta catcatacca ctgcagggac ctggcctgac caccaccgag 2400

tctagacagc agccaatggc cctggccgtg gccctgacca aaggcggaga agctaggggc 2460

gagctgttct gggacgatgg cgagagcctg gaagtgctgg aaagaggcgc ctatacccaa 2520

gtgatcttcc tggcccggaa caacaccatc gtgaacgagc tggtgcgcgt gacctctgaa 2580

ggcgctggac tgcagctgca gaaagtgacc gtgctgggag tggccacagc ccctcagcag 2640

gtgctgtcta atggcgtgcc cgtgtccaac ttcacctaca gccccgacac caaggtgctg 2700

gacatctgcg tgtcactgct gatgggagag cagtttctgg tgtcctggtg ctga 2754

<210> 13

<211> 2754

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco2-дельта8 без sp

<400> 13

ctgttggtgc ctagagagct gagcggatca tccccagtgc tggaggagac tcatcctgct 60

caccaacagg gagcttccag accaggaccg agagacgccc aagcccatcc tggtagacca 120

agagctgtgc ctacccaatg cgacgtgcca cccaactccc gattcgactg cgcgccagat 180

aaggctatta cccaagagca gtgtgaagcc agaggttgct gctacatccc agcgaagcaa 240

ggattgcaag gcgcccaaat gggacaacct tggtgtttct tccccccttc gtacccatca 300

tataaactcg aaaacctgtc ctcttcggaa atgggttata ctgccaccct caccagaact 360

actcctactt tcttcccgaa agacatcttg accttgaggc tggacgtgat gatggagact 420

gaaaaccggc tgcatttcac tatcaaagat cctgccaatc ggcgatacga ggtccctctg 480

gaaacccctc acgtgcactc acgggctcct tctccgcttt actccgtcga attctctgag 540

gaacccttcg gagtgatcgt tagacgccag ctggatggta gagtgctgtt gaacactact 600

gtggccccac ttttcttcgc tgaccagttt ctgcaactgt ccacttccct gccatcccag 660

tacattactg gactcgccga acacctgtcg ccactgatgc tctcgacctc ttggactaga 720

atcactttgt ggaacagaga cttggcccct actccgggag caaatctgta cggaagccac 780

cctttttacc tggcgctcga agatggcgga tccgctcacg gagtgttcct gctgaatagc 840

aacgcaatgg acgtggtgct gcaaccttcc cctgcactca gttggagaag taccgggggt 900

attctggacg tgtacatctt cctcggacca gaacccaaga gcgtggtgca gcaatatctg 960

gacgtggtcg gatacccttt tatgcctcct tactggggac tgggattcca cctttgccgt 1020

tggggctact catccaccgc cattaccaga caggtggtgg agaatatgac cagagcccac 1080

ttccctctcg acgtgcagtg gaacgatctg gactatatgg actcccggag agatttcacc 1140

ttcaacaagg acgggttccg cgattttccc gcgatggttc aagagctcca ccagggtggt 1200

cgaagatata tgatgatcgt cgacccagcc atttcgagca gcggacccgc tggatcttat 1260

agaccttacg acgaaggcct taggagagga gtgttcatca caaacgagac tggacagcct 1320

ttgatcggta aagtgtggcc tggatcaacc gcctttcctg actttaccaa tcccactgcc 1380

ttggcttggt gggaggacat ggtggccgaa ttccacgacc aagtcccctt tgatggaatg 1440

tggatcgata tgaacgaacc aagcaatttt atcagaggtt ccgaagacgg ttgccccaac 1500

aacgaactgg aaaaccctcc ttatgtgccc ggagtcgtgg gcggaacatt acaggccgcg 1560

actatttgcg ccagcagcca ccaattcctg tccactcact acaacctcca caacctttat 1620

ggattaaccg aagctattgc aagtcacagg gctctggtga aggctagagg gactaggccc 1680

tttgtgatct cccgatccac ctttgccgga cacgggagat acgccggtca ctggactggt 1740

gacgtgtgga gctcatggga acaactggcc tcctccgtgc cggaaatctt acagttcaac 1800

cttctgggtg tccctcttgt cggagcagac gtgtgtgggt ttcttggtaa cacctccgag 1860

gaactgtgtg tgcgctggac tcaactgggt gcattctacc cattcatgag aaaccacaac 1920

tccttgctgt ccctgccaca agagccctac tcgttcagcg agcctgcaca acaggctatg 1980

cggaaggcac tgaccctgag atacgccctg cttccacact tatacactct cttccatcaa 2040

gcgcatgtgg caggagaaac cgttgcaagg cctcttttcc ttgaattccc caaggattcc 2100

tcgacttgga cggtggatca tcagctgctg tggggagaag ctctgctgat tactccagtg 2160

ttgcaagccg gaaaagctga ggtgaccgga tactttccgc tgggaacctg gtacgacctc 2220

cagactgtcc ctgttgaagc ccttggatca ctgcctccgc ctccggcagc tccacgcgaa 2280

ccagctatac attccgaggg acagtgggtt acattaccag ctcctctgga cacaatcaac 2340

gtccacttaa gagctggcta cattatccct ctgcaaggac caggactgac tacgaccgag 2400

agcagacagc agccaatggc actggctgtg gctctgacca agggagggga agctagagga 2460

gaactcttct gggatgatgg ggagtccctt gaagtgctgg aaagaggcgc ttacactcaa 2520

gtcattttcc ttgcacggaa caacaccatt gtgaacgaat tggtgcgagt gaccagcgaa 2580

ggagctggac ttcaactgca gaaggtcact gtgctcggag tggctaccgc tcctcagcaa 2640

gtgctgtcga atggagtccc cgtgtcaaac tttacctact cccctgacac taaggtgctc 2700

gacatttgcg tgtccctcct gatgggagag cagttccttg tgtcctggtg ttga 2754

<210> 14

<211> 397

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> промотор hAAT

<400> 14

gatcttgcta ccagtggaac agccactaag gattctgcag tgagagcaga gggccagcta 60

agtggtactc tcccagagac tgtctgactc acgccacccc ctccaccttg gacacaggac 120

gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca 180

ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag gcgggcgact cagatcccag ccagtggact 240

tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct 300

cccccgttgc ccctctggat ccactgctta aatacggacg aggacagggc cctgtctcct 360

cagcttcagg caccaccact gacctgggac agtgaat 397

<210> 15

<211> 321

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> управляющая область ApoE

<400> 15

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg g 321

<210> 16

<211> 441

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> интрон HBB2

<400> 16

gtacacatat tgaccaaatc agggtaattt tgcatttgta attttaaaaa atgctttctt 60

cttttaatat acttttttgt ttatcttatt tctaatactt tccctaatct ctttctttca 120

gggcaataat gatacaatgt atcatgcctc tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata 180

atttctgggt taaggcaata gcaatatttc tgcatataaa tatttctgca tataaattgt 240

aactgatgta agaggtttca tattgctaat agcagctaca atccagctac cattctgctt 300

ttattttatg gttgggataa ggctggatta ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa 360

tcatgttcat acctcttatc ttcctcccac agctcctggg caacgtgctg gtctgtgtgc 420

tggcccatca ctttggcaaa g 441

<210> 17

<211> 441

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> модифицированный интрон HBB2

<400> 17

gtacacatat tgaccaaatc agggtaattt tgcatttgta attttaaaaa atgctttctt 60

cttttaatat acttttttgt ttatcttatt tctaatactt tccctaatct ctttctttca 120

gggcaataat gatacaatgt atcatgcctc tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata 180

atttctgggt taaggcaata gcaatatttc tgcatataaa tatttctgca tataaattgt 240

aactgatgta agaggtttca tattgctaat agcagctaca atccagctac cattctgctt 300

ttattttctg gttgggataa ggctggatta ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa 360

tcttgttcat acctcttatc ttcctcccac agctcctggg caacctgctg gtctctctgc 420

tggcccatca ctttggcaaa g 441

<210> 18

<211> 1438

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> интрон FIX

<400> 18

ggtttgtttc cttttttaaa atacattgag tatgcttgcc ttttagatat agaaatatct 60

gatgctgtct tcttcactaa attttgatta catgatttga cagcaatatt gaagagtcta 120

acagccagca cgcaggttgg taagtactgg ttctttgtta gctaggtttt cttcttcttc 180

atttttaaaa ctaaatagat cgacaatgct tatgatgcat ttatgtttaa taaacactgt 240

tcagttcatg atttggtcat gtaattcctg ttagaaaaca ttcatctcct tggtttaaaa 300

aaattaaaag tgggaaaaca aagaaatagc agaatatagt gaaaaaaaat aaccacatta 360

tttttgtttg gacttaccac tttgaaatca aaatgggaaa caaaagcaca aacaatggcc 420

ttatttacac aaaaagtctg attttaagat atatgacatt tcaaggtttc agaagtatgt 480

aatgaggtgt gtctctaatt ttttaaatta tatatcttca atttaaagtt ttagttaaaa 540

cataaagatt aacctttcat tagcaagctg ttagttatca ccaacgcttt tcatggatta 600

ggaaaaaatc attttgtctc tatgtcaaac atcttggagt tgatatttgg ggaaacacaa 660

tactcagttg agttccctag gggagaaaag cacgcttaag aattgacata aagagtagga 720

agttagctaa tgcaacatat atcactttgt tttttcacaa ctacagtgac tttatgtatt 780

tcccagagga aggcatacag ggaagaaatt atcccatttg gacaaacagc atgttctcac 840

aggaagcatt tatcacactt acttgtcaac tttctagaat caaatctagt agctgacagt 900

accaggatca ggggtgccaa ccctaagcac ccccagaaag ctgactggcc ctgtggttcc 960

cactccagac atgatgtcag ctgtgaaatc gacgtcgctg gaccataatt aggcttctgt 1020

tcttcaggag acatttgttc aaagtcattt gggcaaccat attctgaaaa cagcccagcc 1080

agggtgatgg atcactttgc aaagatcctc aatgagctat tttcaagtga tgacaaagtg 1140

tgaagttaac cgctcatttg agaactttct ttttcatcca aagtaaattc aaatatgatt 1200

agaaatctga ccttttatta ctggaattct cttgactaaa agtaaaattg aattttaatt 1260

cctaaatctc catgtgtata cagtactgtg ggaacatcac agattttggc tccatgccct 1320

aaagagaaat tggctttcag attatttgga ttaaaaacaa agactttctt aagagatgta 1380

aaattttcat gatgttttct tttttgctaa aactaaagaa ttattctttt acatttca 1438

<210> 19

<211> 1438

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> модифицированный интрон FIX

<400> 19

ggtttgtttc cttttttaaa atacattgag tatgcttgcc ttttagatat agaaatatct 60

gatgctgtct tcttcactaa attttgatta catgatttga cagcaatatt gaagagtcta 120

acagccagca cgcaggttgg taagtactgg ttctttgtta gctaggtttt cttcttcttc 180

atttttaaaa ctaaatagat cgacattgct tttgttgcat ttatgtttaa taaacactgt 240

tcagttcatg atttggtcat gtaattcctg ttagaaaaca ttcatctcct tggtttaaaa 300

aaattaaaag tgggaaaaca aagaaatagc agaatatagt gaaaaaaaat aaccacatta 360

tttttgtttg gacttaccac tttgaaatca aattgggaaa caaaagcaca aacaatggcc 420

ttatttacac aaaaagtctg attttaagat atatgacatt tcaaggtttc agaagtatgt 480

aatgaggtgt gtctctaatt ttttaaatta tatatcttca atttaaagtt ttagttaaaa 540

cataaagatt aacctttcat tagcaagctg ttagttatca ccaacgcttt tcatggatta 600

ggaaaaaatc attttgtctc tttgtcaaac atcttggagt tgatatttgg ggaaacacaa 660

tactcagttg agttccctag gggagaaaag cacgcttaag aattgacata aagagtagga 720

agttagctat tgcaacatat atcactttgt tttttcacaa ctacagtgac tttttgtatt 780

tcccagagga aggcatacag ggaagaaatt atcccatttg gacaaacagc ttgttctcac 840

aggaagcatt tatcacactt acttgtcaac tttctagaat caaatctagt agctgacagt 900

accaggatca ggggtgccaa ccctaagcac ccccagaaag ctgactggcc ctgtggttcc 960

cactccagac atgatgtcag ctgtgaaatc gacgtcgctg gaccataatt aggcttctgt 1020

tcttcaggag acatttgttc aaagtcattt gggcaaccat attctgaaaa cagcccagcc 1080

agggtgttgg atcactttgc aaagatcctc attgagctat tttcaagtgt tgacaaagtg 1140

tgaagttaac cgctcatttg agaactttct ttttcatcca aagtaaattc aaatatgatt 1200

agaaatctga ccttttatta ctggaattct cttgactaaa agtaaaattg aattttaatt 1260

cctaaatctc catgtgtata cagtactgtg ggaacatcac agattttggc tccatgccct 1320

aaagagaaat tggctttcag attatttgga ttaaaaacaa agactttctt aagagatgta 1380

aaattttctt gttgttttct tttttgctaa aactaaagaa ttattctttt acatttca 1438

<210> 20

<211> 881

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> интрон бета-глобина курицы

<400> 20

gcgggagtcg ctgcgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 60

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 120

tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 180

aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 240

cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 300

ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 360

gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 420

gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 480

cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 540

tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 600

ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 660

cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc 720

gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 780

cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaaa tgggcgggga 840

gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct c 881

<210> 21

<211> 881

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> модифицированный интрон бета-глобина курицы

<400> 21

gcgggagtcg ctgcgttgcc ttcgccccgt gccccgctcc gccgccgcct cgcgccgccc 60

gccccggctc tgactgaccg cgttactccc acaggtgagc gggcgggacg gcccttctcc 120

tccgggctgt aattagcgct tggtttaatg acggcttgtt tcttttctgt ggctgcgtga 180

aagccttgag gggctccggg agggcccttt gtgcgggggg agcggctcgg ggggtgcgtg 240

cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg cggctccgcg ctgcccggcg gctgtgagcg 300

ctgcgggcgc ggcgcggggc tttgtgcgct ccgcagtgtg cgcgagggga gcgcggccgg 360

gggcggtgcc ccgcggtgcg gggggggctg cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt 420

gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg cgcgtcggtc gggctgcaac cccccctgca 480

cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtacggggcg 540

tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc 600

ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccc ggagcgccgg 660

cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca ttgccttttt tggtaatcgt gcgagagggc 720

gcagggactt cctttgtccc aaatctgtgc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac 780

cccctctagc gggcgcgggg cgaagcggtg cggcgccggc aggaaggaat tgggcgggga 840

gggccttcgt gcgtcgccgc gccgccgtcc ccttctccct c 881

<210> 22

<211> 4318

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> конструкция: sp2+hGAAwt-дельта-8

<400> 22

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg ggtacccggg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag 360

gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc 420

acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact 480

cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag 540

gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 600

gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 660

aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 720

agtgaataga tcctgagaac ttcagggtga gtctatggga cccttgatgt tttctttccc 780

cttcttttct atggttaagt tcatgtcata ggaaggggag aagtaacagg gtacacatat 840

tgaccaaatc agggtaattt tgcatttgta attttaaaaa atgctttctt cttttaatat 900

acttttttgt ttatcttatt tctaatactt tccctaatct ctttctttca gggcaataat 960

gatacaatgt atcatgcctc tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata atttctgggt 1020

taaggcaata gcaatatttc tgcatataaa tatttctgca tataaattgt aactgatgta 1080

agaggtttca tattgctaat agcagctaca atccagctac cattctgctt ttattttctg 1140

gttgggataa ggctggatta ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa tcttgttcat 1200

acctcttatc ttcctcccac agctcctggg caacctgctg gtctctctgc tggcccatca 1260

ctttggcaaa gcacgcgtgc caccatgccg tcttctgtct cgtggggcat cctcctgctg 1320

gcaggcctgt gctgcctggt ccctgtctcc ctggctctgc tggttccccg agagctgagt 1380

ggctcctccc cagtcctgga ggagactcac ccagctcacc agcagggagc cagcagacca 1440

gggccccggg atgcccaggc acaccccggg cggccgcgag cagtgcccac acagtgcgac 1500

gtccccccca acagccgctt cgattgcgcc cctgacaagg ccatcaccca ggaacagtgc 1560

gaggcccgcg gctgttgcta catccctgca aagcaggggc tgcagggagc ccagatgggg 1620

cagccctggt gcttcttccc acccagctac cccagctaca agctggagaa cctgagctcc 1680

tctgaaatgg gctacacggc caccctgacc cgtaccaccc ccaccttctt ccccaaggac 1740

atcctgaccc tgcggctgga cgtgatgatg gagactgaga accgcctcca cttcacgatc 1800

aaagatccag ctaacaggcg ctacgaggtg cccttggaga ccccgcatgt ccacagccgg 1860

gcaccgtccc cactctacag cgtggagttc tccgaggagc ccttcggggt gatcgtgcgc 1920

cggcagctgg acggccgcgt gctgctgaac acgacggtgg cgcccctgtt ctttgcggac 1980

cagttccttc agctgtccac ctcgctgccc tcgcagtata tcacaggcct cgccgagcac 2040

ctcagtcccc tgatgctcag caccagctgg accaggatca ccctgtggaa ccgggacctt 2100

gcgcccacgc ccggtgcgaa cctctacggg tctcaccctt tctacctggc gctggaggac 2160

ggcgggtcgg cacacggggt gttcctgcta aacagcaatg ccatggatgt ggtcctgcag 2220

ccgagccctg cccttagctg gaggtcgaca ggtgggatcc tggatgtcta catcttcctg 2280

ggcccagagc ccaagagcgt ggtgcagcag tacctggacg ttgtgggata cccgttcatg 2340

ccgccatact ggggcctggg cttccacctg tgccgctggg gctactcctc caccgctatc 2400

acccgccagg tggtggagaa catgaccagg gcccacttcc ccctggacgt ccagtggaac 2460

gacctggact acatggactc ccggagggac ttcacgttca acaaggatgg cttccgggac 2520

ttcccggcca tggtgcagga gctgcaccag ggcggccggc gctacatgat gatcgtggat 2580

cctgccatca gcagctcggg ccctgccggg agctacaggc cctacgacga gggtctgcgg 2640

aggggggttt tcatcaccaa cgagaccggc cagccgctga ttgggaaggt atggcccggg 2700

tccactgcct tccccgactt caccaacccc acagccctgg cctggtggga ggacatggtg 2760

gctgagttcc atgaccaggt gcccttcgac ggcatgtgga ttgacatgaa cgagccttcc 2820

aacttcatca ggggctctga ggacggctgc cccaacaatg agctggagaa cccaccctac 2880

gtgcctgggg tggttggggg gaccctccag gcggccacca tctgtgcctc cagccaccag 2940

tttctctcca cacactacaa cctgcacaac ctctacggcc tgaccgaagc catcgcctcc 3000

cacagggcgc tggtgaaggc tcgggggaca cgcccatttg tgatctcccg ctcgaccttt 3060

gctggccacg gccgatacgc cggccactgg acgggggacg tgtggagctc ctgggagcag 3120

ctcgcctcct ccgtgccaga aatcctgcag tttaacctgc tgggggtgcc tctggtcggg 3180

gccgacgtct gcggcttcct gggcaacacc tcagaggagc tgtgtgtgcg ctggacccag 3240

ctgggggcct tctacccctt catgcggaac cacaacagcc tgctcagtct gccccaggag 3300

ccgtacagct tcagcgagcc ggcccagcag gccatgagga aggccctcac cctgcgctac 3360

gcactcctcc cccacctcta cacactgttc caccaggccc acgtcgcggg ggagaccgtg 3420

gcccggcccc tcttcctgga gttccccaag gactctagca cctggactgt ggaccaccag 3480

ctcctgtggg gggaggccct gctcatcacc ccagtgctcc aggccgggaa ggccgaagtg 3540

actggctact tccccttggg cacatggtac gacctgcaga cggtgccagt agaggccctt 3600

ggcagcctcc cacccccacc tgcagctccc cgtgagccag ccatccacag cgaggggcag 3660

tgggtgacgc tgccggcccc cctggacacc atcaacgtcc acctccgggc tgggtacatc 3720

atccccctgc agggccctgg cctcacaacc acagagtccc gccagcagcc catggccctg 3780

gctgtggccc tgaccaaggg tggggaggcc cgaggggagc tgttctggga cgatggagag 3840

agcctggaag tgctggagcg aggggcctac acacaggtca tcttcctggc caggaataac 3900

acgatcgtga atgagctggt acgtgtgacc agtgagggag ctggcctgca gctgcagaag 3960

gtgactgtcc tgggcgtggc cacggcgccc cagcaggtcc tctccaacgg tgtccctgtc 4020

tccaacttca cctacagccc cgacaccaag gtcctggaca tctgtgtctc gctgttgatg 4080

ggagagcagt ttctcgtcag ctggtgttag ctcgagagat ctaccggtga attcaccgcg 4140

ggtttaaact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 4200

cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc 4260

gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtgggggcta gctctaga 4318

<210> 23

<211> 4318

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> конструкция: sp2+hGAAco1-дельта-8

<400> 23

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg ggtacccggg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag 360

gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc 420

acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact 480

cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag 540

gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 600

gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 660

aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 720

agtgaataga tcctgagaac ttcagggtga gtctatggga cccttgatgt tttctttccc 780

cttcttttct atggttaagt tcatgtcata ggaaggggag aagtaacagg gtacacatat 840

tgaccaaatc agggtaattt tgcatttgta attttaaaaa atgctttctt cttttaatat 900

acttttttgt ttatcttatt tctaatactt tccctaatct ctttctttca gggcaataat 960

gatacaatgt atcatgcctc tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata atttctgggt 1020

taaggcaata gcaatatttc tgcatataaa tatttctgca tataaattgt aactgatgta 1080

agaggtttca tattgctaat agcagctaca atccagctac cattctgctt ttattttctg 1140

gttgggataa ggctggatta ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa tcttgttcat 1200

acctcttatc ttcctcccac agctcctggg caacctgctg gtctctctgc tggcccatca 1260

ctttggcaaa gcacgcgtgc caccatgcct agctctgtgt cctggggcat tctgctgctg 1320

gccggcctgt gttgtctggt gcctgtgtct ctggccctac tagtgcccag agagctgagc 1380

ggcagctctc ccgtgctgga agaaacacac cctgcccatc agcagggcgc ctctagacct 1440

ggacctagag atgcccaggc ccaccccggc agacctagag ctgtgcctac ccagtgtgac 1500

gtgcccccca acagcagatt cgactgcgcc cctgacaagg ccatcaccca ggaacagtgc 1560

gaggccagag gctgctgcta catccctgcc aagcagggac tgcagggcgc tcagatggga 1620

cagccctggt gcttcttccc accctcctac cccagctaca agctggaaaa cctgagcagc 1680

agcgagatgg gctacaccgc caccctgacc agaaccaccc ccacattctt cccaaaggac 1740

atcctgaccc tgcggctgga cgtgatgatg gaaaccgaga accggctgca cttcaccatc 1800

aaggaccccg ccaatcggag atacgaggtg cccctggaaa ccccccacgt gcactctaga 1860

gcccccagcc ctctgtacag cgtggaattc agcgaggaac ccttcggcgt gatcgtgcgg 1920

agacagctgg atggcagagt gctgctgaac accaccgtgg cccctctgtt cttcgccgac 1980

cagttcctgc agctgagcac cagcctgccc agccagtaca tcacaggact ggccgagcac 2040

ctgagccccc tgatgctgag cacatcctgg acccggatca ccctgtggaa cagggatctg 2100

gcccctaccc ctggcgccaa tctgtacggc agccaccctt tctacctggc cctggaagat 2160

ggcggatctg cccacggagt gtttctgctg aactccaacg ccatggacgt ggtgctgcag 2220

cctagccctg ccctgtcttg gagaagcaca ggcggcatcc tggatgtgta catctttctg 2280

ggccccgagc ccaagagcgt ggtgcagcag tatctggatg tcgtgggcta ccccttcatg 2340

cccccttact ggggcctggg attccacctg tgcagatggg gctactccag caccgccatc 2400

accagacagg tggtggaaaa catgaccaga gcccacttcc cactggatgt gcagtggaac 2460

gacctggact acatggacag cagacgggac ttcaccttca acaaggacgg cttccgggac 2520

ttccccgcca tggtgcagga actgcatcag ggcggcagac ggtacatgat gatcgtggat 2580

cccgccatca gctcctctgg ccctgccggc tcttacagac cctacgacga gggcctgcgg 2640

agaggcgtgt tcatcaccaa cgagacaggc cagcccctga tcggcaaagt gtggcctggc 2700

agcacagcct tccccgactt caccaatcct accgccctgg cttggtggga ggacatggtg 2760

gccgagttcc acgaccaggt gcccttcgac ggcatgtgga tcgacatgaa cgagcccagc 2820

aacttcatcc ggggcagcga ggatggctgc cccaacaacg aactggaaaa tcccccttac 2880

gtgcccggcg tcgtgggcgg aacactgcag gccgctacaa tctgtgccag cagccaccag 2940

tttctgagca cccactacaa cctgcacaac ctgtacggcc tgaccgaggc cattgccagc 3000

caccgcgctc tcgtgaaagc cagaggcaca cggcccttcg tgatcagcag aagcaccttt 3060

gccggccacg gcagatacgc cggacattgg actggcgacg tgtggtcctc ttgggagcag 3120

ctggcctcta gcgtgcccga gatcctgcag ttcaatctgc tgggcgtgcc actcgtgggc 3180

gccgatgtgt gtggcttcct gggcaacacc tccgaggaac tgtgtgtgcg gtggacacag 3240

ctgggcgcct tctacccttt catgagaaac cacaacagcc tgctgagcct gccccaggaa 3300

ccctacagct ttagcgagcc tgcacagcag gccatgcgga aggccctgac actgagatac 3360

gctctgctgc cccacctgta caccctgttt caccaggccc atgtggccgg cgagacagtg 3420

gccagacctc tgtttctgga attccccaag gacagcagca cctggaccgt ggaccatcag 3480

ctgctgtggg gagaggctct gctgattacc ccagtgctgc aggcaggcaa ggccgaagtg 3540

accggctact ttcccctggg cacttggtac gacctgcaga ccgtgcctgt ggaagccctg 3600

ggatctctgc ctccacctcc tgccgctcct agagagcctg ccattcactc tgagggccag 3660

tgggtcacac tgcctgcccc cctggatacc atcaacgtgc acctgagggc cggctacatc 3720

ataccactgc agggacctgg cctgaccacc accgagtcta gacagcagcc aatggccctg 3780

gccgtggccc tgaccaaagg cggagaagct aggggcgagc tgttctggga cgatggcgag 3840

agcctggaag tgctggaaag aggcgcctat acccaagtga tcttcctggc ccggaacaac 3900

accatcgtga acgagctggt gcgcgtgacc tctgaaggcg ctggactgca gctgcagaaa 3960

gtgaccgtgc tgggagtggc cacagcccct cagcaggtgc tgtctaatgg cgtgcccgtg 4020

tccaacttca cctacagccc cgacaccaag gtgctggaca tctgcgtgtc actgctgatg 4080

ggagagcagt ttctggtgtc ctggtgctga ctcgagagat ctaccggtga attcaccgcg 4140

ggtttaaact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 4200

cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc 4260

gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtgggggcta gctctaga 4318

<210> 24

<211> 4318

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> конструкция: sp2+hGAAco2-дельта-8

<400> 24

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg ggtacccggg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag 360

gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc 420

acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact 480

cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag 540

gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 600

gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 660

aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 720

agtgaataga tcctgagaac ttcagggtga gtctatggga cccttgatgt tttctttccc 780

cttcttttct atggttaagt tcatgtcata ggaaggggag aagtaacagg gtacacatat 840

tgaccaaatc agggtaattt tgcatttgta attttaaaaa atgctttctt cttttaatat 900

acttttttgt ttatcttatt tctaatactt tccctaatct ctttctttca gggcaataat 960

gatacaatgt atcatgcctc tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata atttctgggt 1020

taaggcaata gcaatatttc tgcatataaa tatttctgca tataaattgt aactgatgta 1080

agaggtttca tattgctaat agcagctaca atccagctac cattctgctt ttattttctg 1140

gttgggataa ggctggatta ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa tcttgttcat 1200

acctcttatc ttcctcccac agctcctggg caacctgctg gtctctctgc tggcccatca 1260

ctttggcaaa gcacgcgtgc caccatgcca tcgtcagtgt cttggggcat tcttctgctc 1320

gccggattgt gttgcctggt gcctgtctca ttggccctgt tggtgcctag agagctgagc 1380

ggatcatccc cagtgctgga ggagactcat cctgctcacc aacagggagc ttccagacca 1440

ggaccgagag acgcccaagc ccatcctggt agaccaagag ctgtgcctac ccaatgcgac 1500

gtgccaccca actcccgatt cgactgcgcg ccagataagg ctattaccca agagcagtgt 1560

gaagccagag gttgctgcta catcccagcg aagcaaggat tgcaaggcgc ccaaatggga 1620

caaccttggt gtttcttccc cccttcgtac ccatcatata aactcgaaaa cctgtcctct 1680

tcggaaatgg gttatactgc caccctcacc agaactactc ctactttctt cccgaaagac 1740

atcttgacct tgaggctgga cgtgatgatg gagactgaaa accggctgca tttcactatc 1800

aaagatcctg ccaatcggcg atacgaggtc cctctggaaa cccctcacgt gcactcacgg 1860

gctccttctc cgctttactc cgtcgaattc tctgaggaac ccttcggagt gatcgttaga 1920

cgccagctgg atggtagagt gctgttgaac actactgtgg ccccactttt cttcgctgac 1980

cagtttctgc aactgtccac ttccctgcca tcccagtaca ttactggact cgccgaacac 2040

ctgtcgccac tgatgctctc gacctcttgg actagaatca ctttgtggaa cagagacttg 2100

gcccctactc cgggagcaaa tctgtacgga agccaccctt tttacctggc gctcgaagat 2160

ggcggatccg ctcacggagt gttcctgctg aatagcaacg caatggacgt ggtgctgcaa 2220

ccttcccctg cactcagttg gagaagtacc gggggtattc tggacgtgta catcttcctc 2280

ggaccagaac ccaagagcgt ggtgcagcaa tatctggacg tggtcggata cccttttatg 2340

cctccttact ggggactggg attccacctt tgccgttggg gctactcatc caccgccatt 2400

accagacagg tggtggagaa tatgaccaga gcccacttcc ctctcgacgt gcagtggaac 2460

gatctggact atatggactc ccggagagat ttcaccttca acaaggacgg gttccgcgat 2520

tttcccgcga tggttcaaga gctccaccag ggtggtcgaa gatatatgat gatcgtcgac 2580

ccagccattt cgagcagcgg acccgctgga tcttatagac cttacgacga aggccttagg 2640

agaggagtgt tcatcacaaa cgagactgga cagcctttga tcggtaaagt gtggcctgga 2700

tcaaccgcct ttcctgactt taccaatccc actgccttgg cttggtggga ggacatggtg 2760

gccgaattcc acgaccaagt cccctttgat ggaatgtgga tcgatatgaa cgaaccaagc 2820

aattttatca gaggttccga agacggttgc cccaacaacg aactggaaaa ccctccttat 2880

gtgcccggag tcgtgggcgg aacattacag gccgcgacta tttgcgccag cagccaccaa 2940

ttcctgtcca ctcactacaa cctccacaac ctttatggat taaccgaagc tattgcaagt 3000

cacagggctc tggtgaaggc tagagggact aggccctttg tgatctcccg atccaccttt 3060

gccggacacg ggagatacgc cggtcactgg actggtgacg tgtggagctc atgggaacaa 3120

ctggcctcct ccgtgccgga aatcttacag ttcaaccttc tgggtgtccc tcttgtcgga 3180

gcagacgtgt gtgggtttct tggtaacacc tccgaggaac tgtgtgtgcg ctggactcaa 3240

ctgggtgcat tctacccatt catgagaaac cacaactcct tgctgtccct gccacaagag 3300

ccctactcgt tcagcgagcc tgcacaacag gctatgcgga aggcactgac cctgagatac 3360

gccctgcttc cacacttata cactctcttc catcaagcgc atgtggcagg agaaaccgtt 3420

gcaaggcctc ttttccttga attccccaag gattcctcga cttggacggt ggatcatcag 3480

ctgctgtggg gagaagctct gctgattact ccagtgttgc aagccggaaa agctgaggtg 3540

accggatact ttccgctggg aacctggtac gacctccaga ctgtccctgt tgaagccctt 3600

ggatcactgc ctccgcctcc ggcagctcca cgcgaaccag ctatacattc cgagggacag 3660

tgggttacat taccagctcc tctggacaca atcaacgtcc acttaagagc tggctacatt 3720

atccctctgc aaggaccagg actgactacg accgagagca gacagcagcc aatggcactg 3780

gctgtggctc tgaccaaggg aggggaagct agaggagaac tcttctggga tgatggggag 3840

tcccttgaag tgctggaaag aggcgcttac actcaagtca ttttccttgc acggaacaac 3900

accattgtga acgaattggt gcgagtgacc agcgaaggag ctggacttca actgcagaag 3960

gtcactgtgc tcggagtggc taccgctcct cagcaagtgc tgtcgaatgg agtccccgtg 4020

tcaaacttta cctactcccc tgacactaag gtgctcgaca tttgcgtgtc cctcctgatg 4080

ggagagcagt tccttgtgtc ctggtgttga ctcgagagat ctaccggtga attcaccgcg 4140

ggtttaaact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 4200

cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc 4260

gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtgggggcta gctctaga 4318

<210> 25

<211> 4300

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> конструкция: sp7+hGAAco1-дельта-8

<400> 25

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg ggtacccggg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag 360

gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc 420

acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact 480

cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag 540

gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 600

gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 660

aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 720

agtgaataga tcctgagaac ttcagggtga gtctatggga cccttgatgt tttctttccc 780

cttcttttct atggttaagt tcatgtcata ggaaggggag aagtaacagg gtacacatat 840

tgaccaaatc agggtaattt tgcatttgta attttaaaaa atgctttctt cttttaatat 900

acttttttgt ttatcttatt tctaatactt tccctaatct ctttctttca gggcaataat 960

gatacaatgt atcatgcctc tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata atttctgggt 1020

taaggcaata gcaatatttc tgcatataaa tatttctgca tataaattgt aactgatgta 1080

agaggtttca tattgctaat agcagctaca atccagctac cattctgctt ttattttctg 1140

gttgggataa ggctggatta ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa tcttgttcat 1200

acctcttatc ttcctcccac agctcctggg caacctgctg gtctctctgc tggcccatca 1260

ctttggcaaa gcacgcgtgc caccatggcc tttctgtggc tgctgagctg ttgggccctg 1320

ctgggcacca ccttcggcct actagtgccc agagagctga gcggcagctc tcccgtgctg 1380

gaagaaacac accctgccca tcagcagggc gcctctagac ctggacctag agatgcccag 1440

gcccaccccg gcagacctag agctgtgcct acccagtgtg acgtgccccc caacagcaga 1500

ttcgactgcg cccctgacaa ggccatcacc caggaacagt gcgaggccag aggctgctgc 1560

tacatccctg ccaagcaggg actgcagggc gctcagatgg gacagccctg gtgcttcttc 1620

ccaccctcct accccagcta caagctggaa aacctgagca gcagcgagat gggctacacc 1680

gccaccctga ccagaaccac ccccacattc ttcccaaagg acatcctgac cctgcggctg 1740

gacgtgatga tggaaaccga gaaccggctg cacttcacca tcaaggaccc cgccaatcgg 1800

agatacgagg tgcccctgga aaccccccac gtgcactcta gagcccccag ccctctgtac 1860

agcgtggaat tcagcgagga acccttcggc gtgatcgtgc ggagacagct ggatggcaga 1920

gtgctgctga acaccaccgt ggcccctctg ttcttcgccg accagttcct gcagctgagc 1980

accagcctgc ccagccagta catcacagga ctggccgagc acctgagccc cctgatgctg 2040

agcacatcct ggacccggat caccctgtgg aacagggatc tggcccctac ccctggcgcc 2100

aatctgtacg gcagccaccc tttctacctg gccctggaag atggcggatc tgcccacgga 2160

gtgtttctgc tgaactccaa cgccatggac gtggtgctgc agcctagccc tgccctgtct 2220

tggagaagca caggcggcat cctggatgtg tacatctttc tgggccccga gcccaagagc 2280

gtggtgcagc agtatctgga tgtcgtgggc taccccttca tgccccctta ctggggcctg 2340

ggattccacc tgtgcagatg gggctactcc agcaccgcca tcaccagaca ggtggtggaa 2400

aacatgacca gagcccactt cccactggat gtgcagtgga acgacctgga ctacatggac 2460

agcagacggg acttcacctt caacaaggac ggcttccggg acttccccgc catggtgcag 2520

gaactgcatc agggcggcag acggtacatg atgatcgtgg atcccgccat cagctcctct 2580

ggccctgccg gctcttacag accctacgac gagggcctgc ggagaggcgt gttcatcacc 2640

aacgagacag gccagcccct gatcggcaaa gtgtggcctg gcagcacagc cttccccgac 2700

ttcaccaatc ctaccgccct ggcttggtgg gaggacatgg tggccgagtt ccacgaccag 2760

gtgcccttcg acggcatgtg gatcgacatg aacgagccca gcaacttcat ccggggcagc 2820

gaggatggct gccccaacaa cgaactggaa aatccccctt acgtgcccgg cgtcgtgggc 2880

ggaacactgc aggccgctac aatctgtgcc agcagccacc agtttctgag cacccactac 2940

aacctgcaca acctgtacgg cctgaccgag gccattgcca gccaccgcgc tctcgtgaaa 3000

gccagaggca cacggccctt cgtgatcagc agaagcacct ttgccggcca cggcagatac 3060

gccggacatt ggactggcga cgtgtggtcc tcttgggagc agctggcctc tagcgtgccc 3120

gagatcctgc agttcaatct gctgggcgtg ccactcgtgg gcgccgatgt gtgtggcttc 3180

ctgggcaaca cctccgagga actgtgtgtg cggtggacac agctgggcgc cttctaccct 3240

ttcatgagaa accacaacag cctgctgagc ctgccccagg aaccctacag ctttagcgag 3300

cctgcacagc aggccatgcg gaaggccctg acactgagat acgctctgct gccccacctg 3360

tacaccctgt ttcaccaggc ccatgtggcc ggcgagacag tggccagacc tctgtttctg 3420

gaattcccca aggacagcag cacctggacc gtggaccatc agctgctgtg gggagaggct 3480

ctgctgatta ccccagtgct gcaggcaggc aaggccgaag tgaccggcta ctttcccctg 3540

ggcacttggt acgacctgca gaccgtgcct gtggaagccc tgggatctct gcctccacct 3600

cctgccgctc ctagagagcc tgccattcac tctgagggcc agtgggtcac actgcctgcc 3660

cccctggata ccatcaacgt gcacctgagg gccggctaca tcataccact gcagggacct 3720

ggcctgacca ccaccgagtc tagacagcag ccaatggccc tggccgtggc cctgaccaaa 3780

ggcggagaag ctaggggcga gctgttctgg gacgatggcg agagcctgga agtgctggaa 3840

agaggcgcct atacccaagt gatcttcctg gcccggaaca acaccatcgt gaacgagctg 3900

gtgcgcgtga cctctgaagg cgctggactg cagctgcaga aagtgaccgt gctgggagtg 3960

gccacagccc ctcagcaggt gctgtctaat ggcgtgcccg tgtccaactt cacctacagc 4020

cccgacacca aggtgctgga catctgcgtg tcactgctga tgggagagca gtttctggtg 4080

tcctggtgct gactcgagag atctaccggt gaattcaccg cgggtttaaa ctgtgccttc 4140

tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc 4200

cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg 4260

tcattctatt ctggggggtg gggtgggggc tagctctaga 4300

<210> 26

<211> 4198

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAco1-дельта-42

<400> 26

aggctcagag gcacacagga gtttctgggc tcaccctgcc cccttccaac ccctcagttc 60

ccatcctcca gcagctgttt gtgtgctgcc tctgaagtcc acactgaaca aacttcagcc 120

tactcatgtc cctaaaatgg gcaaacattg caagcagcaa acagcaaaca cacagccctc 180

cctgcctgct gaccttggag ctggggcaga ggtcagagac ctctctgggc ccatgccacc 240

tccaacatcc actcgacccc ttggaatttc ggtggagagg agcagaggtt gtcctggcgt 300

ggtttaggta gtgtgagagg ggtacccggg gatcttgcta ccagtggaac agccactaag 360

gattctgcag tgagagcaga gggccagcta agtggtactc tcccagagac tgtctgactc 420

acgccacccc ctccaccttg gacacaggac gctgtggttt ctgagccagg tacaatgact 480

cctttcggta agtgcagtgg aagctgtaca ctgcccaggc aaagcgtccg ggcagcgtag 540

gcgggcgact cagatcccag ccagtggact tagcccctgt ttgctcctcc gataactggg 600

gtgaccttgg ttaatattca ccagcagcct cccccgttgc ccctctggat ccactgctta 660

aatacggacg aggacagggc cctgtctcct cagcttcagg caccaccact gacctgggac 720

agtgaataga tcctgagaac ttcagggtga gtctatggga cccttgatgt tttctttccc 780

cttcttttct atggttaagt tcatgtcata ggaaggggag aagtaacagg gtacacatat 840

tgaccaaatc agggtaattt tgcatttgta attttaaaaa atgctttctt cttttaatat 900

acttttttgt ttatcttatt tctaatactt tccctaatct ctttctttca gggcaataat 960

gatacaatgt atcatgcctc tttgcaccat tctaaagaat aacagtgata atttctgggt 1020

taaggcaata gcaatatttc tgcatataaa tatttctgca tataaattgt aactgatgta 1080

agaggtttca tattgctaat agcagctaca atccagctac cattctgctt ttattttctg 1140

gttgggataa ggctggatta ttctgagtcc aagctaggcc cttttgctaa tcttgttcat 1200

acctcttatc ttcctcccac agctcctggg caacctgctg gtctctctgc tggcccatca 1260

ctttggcaaa gcacgcgtgc caccatggcc tttctgtggc tgctgagctg ttgggccctg 1320

ctgggcacca ccttcggcgc ccaccccggc agacctagag ctgtgcctac ccagtgtgac 1380

gtgcccccca acagcagatt cgactgcgcc cctgacaagg ccatcaccca ggaacagtgc 1440

gaggccagag gctgctgcta catccctgcc aagcagggac tgcagggcgc tcagatggga 1500

cagccctggt gcttcttccc accctcctac cccagctaca agctggaaaa cctgagcagc 1560

agcgagatgg gctacaccgc caccctgacc agaaccaccc ccacattctt cccaaaggac 1620

atcctgaccc tgcggctgga cgtgatgatg gaaaccgaga accggctgca cttcaccatc 1680

aaggaccccg ccaatcggag atacgaggtg cccctggaaa ccccccacgt gcactctaga 1740

gcccccagcc ctctgtacag cgtggaattc agcgaggaac ccttcggcgt gatcgtgcgg 1800

agacagctgg atggcagagt gctgctgaac accaccgtgg cccctctgtt cttcgccgac 1860

cagttcctgc agctgagcac cagcctgccc agccagtaca tcacaggact ggccgagcac 1920

ctgagccccc tgatgctgag cacatcctgg acccggatca ccctgtggaa cagggatctg 1980

gcccctaccc ctggcgccaa tctgtacggc agccaccctt tctacctggc cctggaagat 2040

ggcggatctg cccacggagt gtttctgctg aactccaacg ccatggacgt ggtgctgcag 2100

cctagccctg ccctgtcttg gagaagcaca ggcggcatcc tggatgtgta catctttctg 2160

ggccccgagc ccaagagcgt ggtgcagcag tatctggatg tcgtgggcta ccccttcatg 2220

cccccttact ggggcctggg attccacctg tgcagatggg gctactccag caccgccatc 2280

accagacagg tggtggaaaa catgaccaga gcccacttcc cactggatgt gcagtggaac 2340

gacctggact acatggacag cagacgggac ttcaccttca acaaggacgg cttccgggac 2400

ttccccgcca tggtgcagga actgcatcag ggcggcagac ggtacatgat gatcgtggat 2460

cccgccatca gctcctctgg ccctgccggc tcttacagac cctacgacga gggcctgcgg 2520

agaggcgtgt tcatcaccaa cgagacaggc cagcccctga tcggcaaagt gtggcctggc 2580

agcacagcct tccccgactt caccaatcct accgccctgg cttggtggga ggacatggtg 2640

gccgagttcc acgaccaggt gcccttcgac ggcatgtgga tcgacatgaa cgagcccagc 2700

aacttcatcc ggggcagcga ggatggctgc cccaacaacg aactggaaaa tcccccttac 2760

gtgcccggcg tcgtgggcgg aacactgcag gccgctacaa tctgtgccag cagccaccag 2820

tttctgagca cccactacaa cctgcacaac ctgtacggcc tgaccgaggc cattgccagc 2880

caccgcgctc tcgtgaaagc cagaggcaca cggcccttcg tgatcagcag aagcaccttt 2940

gccggccacg gcagatacgc cggacattgg actggcgacg tgtggtcctc ttgggagcag 3000

ctggcctcta gcgtgcccga gatcctgcag ttcaatctgc tgggcgtgcc actcgtgggc 3060

gccgatgtgt gtggcttcct gggcaacacc tccgaggaac tgtgtgtgcg gtggacacag 3120

ctgggcgcct tctacccttt catgagaaac cacaacagcc tgctgagcct gccccaggaa 3180

ccctacagct ttagcgagcc tgcacagcag gccatgcgga aggccctgac actgagatac 3240

gctctgctgc cccacctgta caccctgttt caccaggccc atgtggccgg cgagacagtg 3300

gccagacctc tgtttctgga attccccaag gacagcagca cctggaccgt ggaccatcag 3360

ctgctgtggg gagaggctct gctgattacc ccagtgctgc aggcaggcaa ggccgaagtg 3420

accggctact ttcccctggg cacttggtac gacctgcaga ccgtgcctgt ggaagccctg 3480

ggatctctgc ctccacctcc tgccgctcct agagagcctg ccattcactc tgagggccag 3540

tgggtcacac tgcctgcccc cctggatacc atcaacgtgc acctgagggc cggctacatc 3600

ataccactgc agggacctgg cctgaccacc accgagtcta gacagcagcc aatggccctg 3660

gccgtggccc tgaccaaagg cggagaagct aggggcgagc tgttctggga cgatggcgag 3720

agcctggaag tgctggaaag aggcgcctat acccaagtga tcttcctggc ccggaacaac 3780

accatcgtga acgagctggt gcgcgtgacc tctgaaggcg ctggactgca gctgcagaaa 3840

gtgaccgtgc tgggagtggc cacagcccct cagcaggtgc tgtctaatgg cgtgcccgtg 3900

tccaacttca cctacagccc cgacaccaag gtgctggaca tctgcgtgtc actgctgatg 3960

ggagagcagt ttctggtgtc ctggtgctga ctcgagagat ctaccggtga attcaccgcg 4020

ggtttaaact gtgccttcta gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc 4080

cttgaccctg gaaggtgcca ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc 4140

gcattgtctg agtaggtgtc attctattct ggggggtggg gtgggggcta gctctaga 4198

<210> 27

<211> 917

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> hGAA-дельта-8

<400> 27

Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu

1 5 10 15

Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp

20 25 30

Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp

35 40 45

Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr

50 55 60

Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln

65 70 75 80

Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro

85 90 95

Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly

100 105 110

Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp

115 120 125

Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu

130 135 140

His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu

145 150 155 160

Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val

165 170 175

Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp

180 185 190

Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp

195 200 205

Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly

210 215 220

Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg

225 230 235 240

Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu

245 250 255

Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala

260 265 270

His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln

275 280 285

Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val

290 295 300

Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu

305 310 315 320

Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe

325 330 335

His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val

340 345 350

Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn

355 360 365

Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp

370 375 380

Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly

385 390 395 400

Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro

405 410 415

Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe

420 425 430

Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly

435 440 445

Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp

450 455 460

Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met

465 470 475 480

Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp

485 490 495

Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val

500 505 510

Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln

515 520 525

Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu

530 535 540

Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro

545 550 555 560

Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly

565 570 575

His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser

580 585 590

Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly

595 600 605

Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val

610 615 620

Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn

625 630 635 640

Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala

645 650 655

Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro

660 665 670

His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val

675 680 685

Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr

690 695 700

Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val

705 710 715 720

Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr

725 730 735

Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro

740 745 750

Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln

755 760 765

Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg

770 775 780

Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu

785 790 795 800

Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly

805 810 815

Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val

820 825 830

Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn

835 840 845

Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu

850 855 860

Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln

865 870 875 880

Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp

885 890 895

Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe

900 905 910

Leu Val Ser Trp Cys

915

<210> 28

<211> 883

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> hGAA-дельта-42

<400> 28

Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro

1 5 10 15

Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu

20 25 30

Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu

35 40 45

Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr

50 55 60

Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr

65 70 75 80

Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu

85 90 95

Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe

100 105 110

Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr

115 120 125

Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe

130 135 140

Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg

145 150 155 160

Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe

165 170 175

Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala

180 185 190

Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr

195 200 205

Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly

210 215 220

Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly

225 230 235 240

Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser

245 250 255

Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile

260 265 270

Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val

275 280 285

Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu

290 295 300

Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu

305 310 315 320

Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu

325 330 335

Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe

340 345 350

Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg

355 360 365

Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly

370 375 380

Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr

385 390 395 400

Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr

405 410 415

Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp

420 425 430

Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile

435 440 445

Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys

450 455 460

Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly

465 470 475 480

Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu

485 490 495

Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile

500 505 510

Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val

515 520 525

Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp

530 535 540

Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro

545 550 555 560

Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp

565 570 575

Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp

580 585 590

Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu

595 600 605

Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln

610 615 620

Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu

625 630 635 640

Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg

645 650 655

Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp

660 665 670

His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln

675 680 685

Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr

690 695 700

Asp Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro

705 710 715 720

Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val

725 730 735

Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly

740 745 750

Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg

755 760 765

Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala

770 775 780

Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu

785 790 795 800

Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile

805 810 815

Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu

820 825 830

Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu

835 840 845

Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys

850 855 860

Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val

865 870 875 880

Ser Trp Cys

<210> 29

<211> 952

<212> Белок

<213> homo sapiens

<400> 29

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

20 25 30

His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val

35 40 45

Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly

50 55 60

Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr

65 70 75 80

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

100 105 110

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser

130 135 140

Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

165 170 175

Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu

180 185 190

Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu

195 200 205

Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg

210 215 220

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

225 230 235 240

Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

245 250 255

Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

260 265 270

Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

275 280 285

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly

290 295 300

Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

305 310 315 320

Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

325 330 335

Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

340 345 350

Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

355 360 365

Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

370 375 380

Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val

385 390 395 400

Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

405 410 415

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

420 425 430

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

435 440 445

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

450 455 460

Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val

465 470 475 480

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

485 490 495

Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

500 505 510

Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

515 520 525

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

530 535 540

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

545 550 555 560

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

565 570 575

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

660 665 670

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

690 695 700

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

705 710 715 720

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

755 760 765

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly

770 775 780

Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

785 790 795 800

Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

805 810 815

His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

820 825 830

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr

835 840 845

Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser

850 855 860

Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910

Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr

915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly

930 935 940

Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

945 950

<210> 30

<211> 952

<212> Белок

<213> homo sapiens

<400> 30

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

20 25 30

His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val

35 40 45

Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly

50 55 60

Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr

65 70 75 80

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

100 105 110

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser

130 135 140

Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

165 170 175

Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu

180 185 190

Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu

195 200 205

Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg

210 215 220

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

225 230 235 240

Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

245 250 255

Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

260 265 270

Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

275 280 285

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly

290 295 300

Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

305 310 315 320

Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

325 330 335

Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

340 345 350

Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

355 360 365

Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

370 375 380

Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val

385 390 395 400

Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

405 410 415

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

420 425 430

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

435 440 445

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

450 455 460

Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val

465 470 475 480

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

485 490 495

Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

500 505 510

Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

515 520 525

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

530 535 540

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

545 550 555 560

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

565 570 575

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

660 665 670

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

690 695 700

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

705 710 715 720

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

755 760 765

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly

770 775 780

Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

785 790 795 800

Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

805 810 815

His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

820 825 830

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr

835 840 845

Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser

850 855 860

Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910

Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr

915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly

930 935 940

Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

945 950

<210> 31

<211> 957

<212> Белок

<213> homo sapiens

<400> 31

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

20 25 30

His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val

35 40 45

Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly

50 55 60

Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr

65 70 75 80

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

100 105 110

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser

130 135 140

Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

165 170 175

Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu

180 185 190

Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu

195 200 205

Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg

210 215 220

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

225 230 235 240

Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

245 250 255

Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

260 265 270

Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

275 280 285

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly

290 295 300

Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

305 310 315 320

Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

325 330 335

Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

340 345 350

Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

355 360 365

Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

370 375 380

Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val

385 390 395 400

Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

405 410 415

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

420 425 430

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

435 440 445

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

450 455 460

Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val

465 470 475 480

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

485 490 495

Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

500 505 510

Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

515 520 525

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

530 535 540

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

545 550 555 560

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

565 570 575

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

660 665 670

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

690 695 700

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

705 710 715 720

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

755 760 765

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly

770 775 780

Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

785 790 795 800

Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

805 810 815

His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

820 825 830

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr

835 840 845

Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser

850 855 860

Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910

Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr

915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Ala Arg Gly Pro Arg Val Leu Asp Ile Cys Val

930 935 940

Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

945 950 955

<210> 32

<211> 952

<212> Белок

<213> homo sapiens

<400> 32

Met Gly Val Arg His Pro Pro Cys Ser His Arg Leu Leu Ala Val Cys

1 5 10 15

Ala Leu Val Ser Leu Ala Thr Ala Ala Leu Leu Gly His Ile Leu Leu

20 25 30

His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser Gly Ser Ser Pro Val

35 40 45

Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly

50 55 60

Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr

65 70 75 80

Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys

85 90 95

Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro

100 105 110

Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe

115 120 125

Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser

130 135 140

Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe

145 150 155 160

Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu

165 170 175

Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu

180 185 190

Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu

195 200 205

Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val His Arg

210 215 220

Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe

225 230 235 240

Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr

245 250 255

Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser

260 265 270

Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly

275 280 285

Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly

290 295 300

Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val

305 310 315 320

Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile

325 330 335

Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln

340 345 350

Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly

355 360 365

Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr

370 375 380

Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val

385 390 395 400

Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe

405 410 415

Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His

420 425 430

Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser

435 440 445

Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Leu Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg

450 455 460

Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val

465 470 475 480

Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu

485 490 495

Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe

500 505 510

Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly

515 520 525

Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val

530 535 540

Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser

545 550 555 560

Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly

565 570 575

Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly

580 585 590

Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg

595 600 605

Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu

610 615 620

Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro

625 630 635 640

Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu

645 650 655

Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg

660 665 670

Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser

675 680 685

Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala

690 695 700

Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly

705 710 715 720

Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser

725 730 735

Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile

740 745 750

Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro

755 760 765

Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro Ile Glu Ala Leu Gly

770 775 780

Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser

785 790 795 800

Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val

805 810 815

His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr

820 825 830

Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr

835 840 845

Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser

850 855 860

Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala

865 870 875 880

Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly

885 890 895

Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala

900 905 910

Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr

915 920 925

Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly

930 935 940

Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

945 950

<210> 33

<211> 925

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> вариант hGAAwt без sp

<400> 33

Gly His Ile Leu Leu His Asp Phe Leu Leu Val Pro Arg Glu Leu Ser

1 5 10 15

Gly Ser Ser Pro Val Leu Glu Glu Thr His Pro Ala His Gln Gln Gly

20 25 30

Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro Gly Arg Pro

35 40 45

Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Asp

50 55 60

Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg Gly

65 70 75 80

Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met Gly

85 90 95

Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu Glu

100 105 110

Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg Thr

115 120 125

Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp Val

130 135 140

Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro Ala

145 150 155 160

Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro Arg Val His Ser Arg

165 170 175

Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe Gly

180 185 190

Val Ile Val His Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr Thr

195 200 205

Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr Ser

210 215 220

Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro Leu

225 230 235 240

Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp Leu

245 250 255

Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr Leu

260 265 270

Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn Ser

275 280 285

Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp Arg

290 295 300

Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu Pro

305 310 315 320

Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe Met

325 330 335

Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr Ser

340 345 350

Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala His

355 360 365

Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser Arg

370 375 380

Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala Met

385 390 395 400

Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val Asp

405 410 415

Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr Asp

420 425 430

Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln Pro

435 440 445

Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe Thr

450 455 460

Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe His

465 470 475 480

Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro Ser

485 490 495

Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu Glu

500 505 510

Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala Ala

515 520 525

Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn Leu

530 535 540

His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala Leu

545 550 555 560

Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr Phe

565 570 575

Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp Ser

580 585 590

Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe Asn

595 600 605

Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu Gly

610 615 620

Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala Phe

625 630 635 640

Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln Glu

645 650 655

Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala Leu

660 665 670

Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His Gln

675 680 685

Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu Phe

690 695 700

Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp Gly

705 710 715 720

Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu Val

725 730 735

Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val Pro

740 745 750

Ile Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg Glu

755 760 765

Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro Leu

770 775 780

Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu Gln

785 790 795 800

Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala Leu

805 810 815

Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe Trp

820 825 830

Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr Gln

835 840 845

Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val Arg

850 855 860

Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val Leu

865 870 875 880

Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro Val

885 890 895

Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys Val

900 905 910

Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

915 920 925

<210> 34

<211> 896

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> hGAA-дельта-29

<400> 34

Gln Gln Gly Ala Ser Arg Pro Gly Pro Arg Asp Ala Gln Ala His Pro

1 5 10 15

Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser

20 25 30

Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu

35 40 45

Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala

50 55 60

Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr

65 70 75 80

Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu

85 90 95

Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg

100 105 110

Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys

115 120 125

Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val

130 135 140

His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu

145 150 155 160

Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu

165 170 175

Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu

180 185 190

Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu

195 200 205

Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn

210 215 220

Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro

225 230 235 240

Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu

245 250 255

Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu

260 265 270

Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly

275 280 285

Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr

290 295 300

Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp

305 310 315 320

Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr

325 330 335

Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met

340 345 350

Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe

355 360 365

Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met

370 375 380

Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg

385 390 395 400

Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr

405 410 415

Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro

420 425 430

Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala

435 440 445

Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn

450 455 460

Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn

465 470 475 480

Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu

485 490 495

Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His

500 505 510

Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His

515 520 525

Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg

530 535 540

Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp

545 550 555 560

Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu

565 570 575

Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly

580 585 590

Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu

595 600 605

Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu

610 615 620

Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg

625 630 635 640

Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu

645 650 655

Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe

660 665 670

Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu

675 680 685

Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys

690 695 700

Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln

705 710 715 720

Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala

725 730 735

Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro

740 745 750

Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile

755 760 765

Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro

770 775 780

Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu

785 790 795 800

Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala

805 810 815

Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu

820 825 830

Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val

835 840 845

Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly

850 855 860

Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp

865 870 875 880

Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

885 890 895

<210> 35

<211> 882

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> hGAA-дельта-43

<400> 35

His Pro Gly Arg Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro

1 5 10 15

Asn Ser Arg Phe Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln

20 25 30

Cys Glu Ala Arg Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln

35 40 45

Gly Ala Gln Met Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro

50 55 60

Ser Tyr Lys Leu Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala

65 70 75 80

Thr Leu Thr Arg Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr

85 90 95

Leu Arg Leu Asp Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr

100 105 110

Ile Lys Asp Pro Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro

115 120 125

His Val His Ser Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser

130 135 140

Glu Glu Pro Phe Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val

145 150 155 160

Leu Leu Asn Thr Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu

165 170 175

Gln Leu Ser Thr Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu

180 185 190

His Leu Ser Pro Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu

195 200 205

Trp Asn Arg Asp Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser

210 215 220

His Pro Phe Tyr Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val

225 230 235 240

Phe Leu Leu Asn Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro

245 250 255

Ala Leu Ser Trp Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe

260 265 270

Leu Gly Pro Glu Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val

275 280 285

Gly Tyr Pro Phe Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys

290 295 300

Arg Trp Gly Tyr Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn

305 310 315 320

Met Thr Arg Ala His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp

325 330 335

Tyr Met Asp Ser Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg

340 345 350

Asp Phe Pro Ala Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr

355 360 365

Met Met Ile Val Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser

370 375 380

Tyr Arg Pro Tyr Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn

385 390 395 400

Glu Thr Gly Gln Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala

405 410 415

Phe Pro Asp Phe Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met

420 425 430

Val Ala Glu Phe His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp

435 440 445

Met Asn Glu Pro Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro

450 455 460

Asn Asn Glu Leu Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly

465 470 475 480

Thr Leu Gln Ala Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser

485 490 495

Thr His Tyr Asn Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala

500 505 510

Ser His Arg Ala Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile

515 520 525

Ser Arg Ser Thr Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr

530 535 540

Gly Asp Val Trp Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu

545 550 555 560

Ile Leu Gln Phe Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val

565 570 575

Cys Gly Phe Leu Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr

580 585 590

Gln Leu Gly Ala Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu

595 600 605

Ser Leu Pro Gln Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala

610 615 620

Met Arg Lys Ala Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr

625 630 635 640

Thr Leu Phe His Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro

645 650 655

Leu Phe Leu Glu Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His

660 665 670

Gln Leu Leu Trp Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala

675 680 685

Gly Lys Ala Glu Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp

690 695 700

Leu Gln Thr Val Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro

705 710 715 720

Ala Ala Pro Arg Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr

725 730 735

Leu Pro Ala Pro Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr

740 745 750

Ile Ile Pro Leu Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln

755 760 765

Gln Pro Met Ala Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg

770 775 780

Gly Glu Leu Phe Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg

785 790 795 800

Gly Ala Tyr Thr Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val

805 810 815

Asn Glu Leu Val Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln

820 825 830

Lys Val Thr Val Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser

835 840 845

Asn Gly Val Pro Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val

850 855 860

Leu Asp Ile Cys Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser

865 870 875 880

Trp Cys

<210> 36

<211> 878

<212> Белок

<213> искусственная

<220>

<223> hGAA-дельта-47

<400> 36

Pro Arg Ala Val Pro Thr Gln Cys Asp Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe

1 5 10 15

Asp Cys Ala Pro Asp Lys Ala Ile Thr Gln Glu Gln Cys Glu Ala Arg

20 25 30

Gly Cys Cys Tyr Ile Pro Ala Lys Gln Gly Leu Gln Gly Ala Gln Met

35 40 45

Gly Gln Pro Trp Cys Phe Phe Pro Pro Ser Tyr Pro Ser Tyr Lys Leu

50 55 60

Glu Asn Leu Ser Ser Ser Glu Met Gly Tyr Thr Ala Thr Leu Thr Arg

65 70 75 80

Thr Thr Pro Thr Phe Phe Pro Lys Asp Ile Leu Thr Leu Arg Leu Asp

85 90 95

Val Met Met Glu Thr Glu Asn Arg Leu His Phe Thr Ile Lys Asp Pro

100 105 110

Ala Asn Arg Arg Tyr Glu Val Pro Leu Glu Thr Pro His Val His Ser

115 120 125

Arg Ala Pro Ser Pro Leu Tyr Ser Val Glu Phe Ser Glu Glu Pro Phe

130 135 140

Gly Val Ile Val Arg Arg Gln Leu Asp Gly Arg Val Leu Leu Asn Thr

145 150 155 160

Thr Val Ala Pro Leu Phe Phe Ala Asp Gln Phe Leu Gln Leu Ser Thr

165 170 175

Ser Leu Pro Ser Gln Tyr Ile Thr Gly Leu Ala Glu His Leu Ser Pro

180 185 190

Leu Met Leu Ser Thr Ser Trp Thr Arg Ile Thr Leu Trp Asn Arg Asp

195 200 205

Leu Ala Pro Thr Pro Gly Ala Asn Leu Tyr Gly Ser His Pro Phe Tyr

210 215 220

Leu Ala Leu Glu Asp Gly Gly Ser Ala His Gly Val Phe Leu Leu Asn

225 230 235 240

Ser Asn Ala Met Asp Val Val Leu Gln Pro Ser Pro Ala Leu Ser Trp

245 250 255

Arg Ser Thr Gly Gly Ile Leu Asp Val Tyr Ile Phe Leu Gly Pro Glu

260 265 270

Pro Lys Ser Val Val Gln Gln Tyr Leu Asp Val Val Gly Tyr Pro Phe

275 280 285

Met Pro Pro Tyr Trp Gly Leu Gly Phe His Leu Cys Arg Trp Gly Tyr

290 295 300

Ser Ser Thr Ala Ile Thr Arg Gln Val Val Glu Asn Met Thr Arg Ala

305 310 315 320

His Phe Pro Leu Asp Val Gln Trp Asn Asp Leu Asp Tyr Met Asp Ser

325 330 335

Arg Arg Asp Phe Thr Phe Asn Lys Asp Gly Phe Arg Asp Phe Pro Ala

340 345 350

Met Val Gln Glu Leu His Gln Gly Gly Arg Arg Tyr Met Met Ile Val

355 360 365

Asp Pro Ala Ile Ser Ser Ser Gly Pro Ala Gly Ser Tyr Arg Pro Tyr

370 375 380

Asp Glu Gly Leu Arg Arg Gly Val Phe Ile Thr Asn Glu Thr Gly Gln

385 390 395 400

Pro Leu Ile Gly Lys Val Trp Pro Gly Ser Thr Ala Phe Pro Asp Phe

405 410 415

Thr Asn Pro Thr Ala Leu Ala Trp Trp Glu Asp Met Val Ala Glu Phe

420 425 430

His Asp Gln Val Pro Phe Asp Gly Met Trp Ile Asp Met Asn Glu Pro

435 440 445

Ser Asn Phe Ile Arg Gly Ser Glu Asp Gly Cys Pro Asn Asn Glu Leu

450 455 460

Glu Asn Pro Pro Tyr Val Pro Gly Val Val Gly Gly Thr Leu Gln Ala

465 470 475 480

Ala Thr Ile Cys Ala Ser Ser His Gln Phe Leu Ser Thr His Tyr Asn

485 490 495

Leu His Asn Leu Tyr Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ser His Arg Ala

500 505 510

Leu Val Lys Ala Arg Gly Thr Arg Pro Phe Val Ile Ser Arg Ser Thr

515 520 525

Phe Ala Gly His Gly Arg Tyr Ala Gly His Trp Thr Gly Asp Val Trp

530 535 540

Ser Ser Trp Glu Gln Leu Ala Ser Ser Val Pro Glu Ile Leu Gln Phe

545 550 555 560

Asn Leu Leu Gly Val Pro Leu Val Gly Ala Asp Val Cys Gly Phe Leu

565 570 575

Gly Asn Thr Ser Glu Glu Leu Cys Val Arg Trp Thr Gln Leu Gly Ala

580 585 590

Phe Tyr Pro Phe Met Arg Asn His Asn Ser Leu Leu Ser Leu Pro Gln

595 600 605

Glu Pro Tyr Ser Phe Ser Glu Pro Ala Gln Gln Ala Met Arg Lys Ala

610 615 620

Leu Thr Leu Arg Tyr Ala Leu Leu Pro His Leu Tyr Thr Leu Phe His

625 630 635 640

Gln Ala His Val Ala Gly Glu Thr Val Ala Arg Pro Leu Phe Leu Glu

645 650 655

Phe Pro Lys Asp Ser Ser Thr Trp Thr Val Asp His Gln Leu Leu Trp

660 665 670

Gly Glu Ala Leu Leu Ile Thr Pro Val Leu Gln Ala Gly Lys Ala Glu

675 680 685

Val Thr Gly Tyr Phe Pro Leu Gly Thr Trp Tyr Asp Leu Gln Thr Val

690 695 700

Pro Val Glu Ala Leu Gly Ser Leu Pro Pro Pro Pro Ala Ala Pro Arg

705 710 715 720

Glu Pro Ala Ile His Ser Glu Gly Gln Trp Val Thr Leu Pro Ala Pro

725 730 735

Leu Asp Thr Ile Asn Val His Leu Arg Ala Gly Tyr Ile Ile Pro Leu

740 745 750

Gln Gly Pro Gly Leu Thr Thr Thr Glu Ser Arg Gln Gln Pro Met Ala

755 760 765

Leu Ala Val Ala Leu Thr Lys Gly Gly Glu Ala Arg Gly Glu Leu Phe

770 775 780

Trp Asp Asp Gly Glu Ser Leu Glu Val Leu Glu Arg Gly Ala Tyr Thr

785 790 795 800

Gln Val Ile Phe Leu Ala Arg Asn Asn Thr Ile Val Asn Glu Leu Val

805 810 815

Arg Val Thr Ser Glu Gly Ala Gly Leu Gln Leu Gln Lys Val Thr Val

820 825 830

Leu Gly Val Ala Thr Ala Pro Gln Gln Val Leu Ser Asn Gly Val Pro

835 840 845

Val Ser Asn Phe Thr Tyr Ser Pro Asp Thr Lys Val Leu Asp Ile Cys

850 855 860

Val Ser Leu Leu Met Gly Glu Gln Phe Leu Val Ser Trp Cys

865 870 875

<210> 37

<211> 2745

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAwt-дельта-29

<400> 37

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggccagcag 60

ggagccagca gaccagggcc ccgggatgcc caggcacacc ccgggcggcc gcgagcagtg 120

cccacacagt gcgacgtccc ccccaacagc cgcttcgatt gcgcccctga caaggccatc 180

acccaggaac agtgcgaggc ccgcggctgt tgctacatcc ctgcaaagca ggggctgcag 240

ggagcccaga tggggcagcc ctggtgcttc ttcccaccca gctaccccag ctacaagctg 300

gagaacctga gctcctctga aatgggctac acggccaccc tgacccgtac cacccccacc 360

ttcttcccca aggacatcct gaccctgcgg ctggacgtga tgatggagac tgagaaccgc 420

ctccacttca cgatcaaaga tccagctaac aggcgctacg aggtgccctt ggagaccccg 480

catgtccaca gccgggcacc gtccccactc tacagcgtgg agttctccga ggagcccttc 540

ggggtgatcg tgcgccggca gctggacggc cgcgtgctgc tgaacacgac ggtggcgccc 600

ctgttctttg cggaccagtt ccttcagctg tccacctcgc tgccctcgca gtatatcaca 660

ggcctcgccg agcacctcag tcccctgatg ctcagcacca gctggaccag gatcaccctg 720

tggaaccggg accttgcgcc cacgcccggt gcgaacctct acgggtctca ccctttctac 780

ctggcgctgg aggacggcgg gtcggcacac ggggtgttcc tgctaaacag caatgccatg 840

gatgtggtcc tgcagccgag ccctgccctt agctggaggt cgacaggtgg gatcctggat 900

gtctacatct tcctgggccc agagcccaag agcgtggtgc agcagtacct ggacgttgtg 960

ggatacccgt tcatgccgcc atactggggc ctgggcttcc acctgtgccg ctggggctac 1020

tcctccaccg ctatcacccg ccaggtggtg gagaacatga ccagggccca cttccccctg 1080

gacgtccagt ggaacgacct ggactacatg gactcccgga gggacttcac gttcaacaag 1140

gatggcttcc gggacttccc ggccatggtg caggagctgc accagggcgg ccggcgctac 1200

atgatgatcg tggatcctgc catcagcagc tcgggccctg ccgggagcta caggccctac 1260

gacgagggtc tgcggagggg ggttttcatc accaacgaga ccggccagcc gctgattggg 1320

aaggtatggc ccgggtccac tgccttcccc gacttcacca accccacagc cctggcctgg 1380

tgggaggaca tggtggctga gttccatgac caggtgccct tcgacggcat gtggattgac 1440

atgaacgagc cttccaactt catcaggggc tctgaggacg gctgccccaa caatgagctg 1500

gagaacccac cctacgtgcc tggggtggtt ggggggaccc tccaggcggc caccatctgt 1560

gcctccagcc accagtttct ctccacacac tacaacctgc acaacctcta cggcctgacc 1620

gaagccatcg cctcccacag ggcgctggtg aaggctcggg ggacacgccc atttgtgatc 1680

tcccgctcga cctttgctgg ccacggccga tacgccggcc actggacggg ggacgtgtgg 1740

agctcctggg agcagctcgc ctcctccgtg ccagaaatcc tgcagtttaa cctgctgggg 1800

gtgcctctgg tcggggccga cgtctgcggc ttcctgggca acacctcaga ggagctgtgt 1860

gtgcgctgga cccagctggg ggccttctac cccttcatgc ggaaccacaa cagcctgctc 1920

agtctgcccc aggagccgta cagcttcagc gagccggccc agcaggccat gaggaaggcc 1980

ctcaccctgc gctacgcact cctcccccac ctctacacac tgttccacca ggcccacgtc 2040

gcgggggaga ccgtggcccg gcccctcttc ctggagttcc ccaaggactc tagcacctgg 2100

actgtggacc accagctcct gtggggggag gccctgctca tcaccccagt gctccaggcc 2160

gggaaggccg aagtgactgg ctacttcccc ttgggcacat ggtacgacct gcagacggtg 2220

ccagtagagg cccttggcag cctcccaccc ccacctgcag ctccccgtga gccagccatc 2280

cacagcgagg ggcagtgggt gacgctgccg gcccccctgg acaccatcaa cgtccacctc 2340

cgggctgggt acatcatccc cctgcagggc cctggcctca caaccacaga gtcccgccag 2400

cagcccatgg ccctggctgt ggccctgacc aagggtgggg aggcccgagg ggagctgttc 2460

tgggacgatg gagagagcct ggaagtgctg gagcgagggg cctacacaca ggtcatcttc 2520

ctggccagga ataacacgat cgtgaatgag ctggtacgtg tgaccagtga gggagctggc 2580

ctgcagctgc agaaggtgac tgtcctgggc gtggccacgg cgccccagca ggtcctctcc 2640

aacggtgtcc ctgtctccaa cttcacctac agccccgaca ccaaggtcct ggacatctgt 2700

gtctcgctgt tgatgggaga gcagtttctc gtcagctggt gttag 2745

<210> 38

<211> 2745

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAco1-дельта-29

<400> 38

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggccagcag 60

ggcgcctcta gacctggacc tagagatgcc caggcccacc ccggcagacc tagagctgtg 120

cctacccagt gtgacgtgcc ccccaacagc agattcgact gcgcccctga caaggccatc 180

acccaggaac agtgcgaggc cagaggctgc tgctacatcc ctgccaagca gggactgcag 240

ggcgctcaga tgggacagcc ctggtgcttc ttcccaccct cctaccccag ctacaagctg 300

gaaaacctga gcagcagcga gatgggctac accgccaccc tgaccagaac cacccccaca 360

ttcttcccaa aggacatcct gaccctgcgg ctggacgtga tgatggaaac cgagaaccgg 420

ctgcacttca ccatcaagga ccccgccaat cggagatacg aggtgcccct ggaaaccccc 480

cacgtgcact ctagagcccc cagccctctg tacagcgtgg aattcagcga ggaacccttc 540

ggcgtgatcg tgcggagaca gctggatggc agagtgctgc tgaacaccac cgtggcccct 600

ctgttcttcg ccgaccagtt cctgcagctg agcaccagcc tgcccagcca gtacatcaca 660

ggactggccg agcacctgag ccccctgatg ctgagcacat cctggacccg gatcaccctg 720

tggaacaggg atctggcccc tacccctggc gccaatctgt acggcagcca ccctttctac 780

ctggccctgg aagatggcgg atctgcccac ggagtgtttc tgctgaactc caacgccatg 840

gacgtggtgc tgcagcctag ccctgccctg tcttggagaa gcacaggcgg catcctggat 900

gtgtacatct ttctgggccc cgagcccaag agcgtggtgc agcagtatct ggatgtcgtg 960

ggctacccct tcatgccccc ttactggggc ctgggattcc acctgtgcag atggggctac 1020

tccagcaccg ccatcaccag acaggtggtg gaaaacatga ccagagccca cttcccactg 1080

gatgtgcagt ggaacgacct ggactacatg gacagcagac gggacttcac cttcaacaag 1140

gacggcttcc gggacttccc cgccatggtg caggaactgc atcagggcgg cagacggtac 1200

atgatgatcg tggatcccgc catcagctcc tctggccctg ccggctctta cagaccctac 1260

gacgagggcc tgcggagagg cgtgttcatc accaacgaga caggccagcc cctgatcggc 1320

aaagtgtggc ctggcagcac agccttcccc gacttcacca atcctaccgc cctggcttgg 1380

tgggaggaca tggtggccga gttccacgac caggtgccct tcgacggcat gtggatcgac 1440

atgaacgagc ccagcaactt catccggggc agcgaggatg gctgccccaa caacgaactg 1500

gaaaatcccc cttacgtgcc cggcgtcgtg ggcggaacac tgcaggccgc tacaatctgt 1560

gccagcagcc accagtttct gagcacccac tacaacctgc acaacctgta cggcctgacc 1620

gaggccattg ccagccaccg cgctctcgtg aaagccagag gcacacggcc cttcgtgatc 1680

agcagaagca cctttgccgg ccacggcaga tacgccggac attggactgg cgacgtgtgg 1740

tcctcttggg agcagctggc ctctagcgtg cccgagatcc tgcagttcaa tctgctgggc 1800

gtgccactcg tgggcgccga tgtgtgtggc ttcctgggca acacctccga ggaactgtgt 1860

gtgcggtgga cacagctggg cgccttctac cctttcatga gaaaccacaa cagcctgctg 1920

agcctgcccc aggaacccta cagctttagc gagcctgcac agcaggccat gcggaaggcc 1980

ctgacactga gatacgctct gctgccccac ctgtacaccc tgtttcacca ggcccatgtg 2040

gccggcgaga cagtggccag acctctgttt ctggaattcc ccaaggacag cagcacctgg 2100

accgtggacc atcagctgct gtggggagag gctctgctga ttaccccagt gctgcaggca 2160

ggcaaggccg aagtgaccgg ctactttccc ctgggcactt ggtacgacct gcagaccgtg 2220

cctgtggaag ccctgggatc tctgcctcca cctcctgccg ctcctagaga gcctgccatt 2280

cactctgagg gccagtgggt cacactgcct gcccccctgg ataccatcaa cgtgcacctg 2340

agggccggct acatcatacc actgcaggga cctggcctga ccaccaccga gtctagacag 2400

cagccaatgg ccctggccgt ggccctgacc aaaggcggag aagctagggg cgagctgttc 2460

tgggacgatg gcgagagcct ggaagtgctg gaaagaggcg cctataccca agtgatcttc 2520

ctggcccgga acaacaccat cgtgaacgag ctggtgcgcg tgacctctga aggcgctgga 2580

ctgcagctgc agaaagtgac cgtgctggga gtggccacag cccctcagca ggtgctgtct 2640

aatggcgtgc ccgtgtccaa cttcacctac agccccgaca ccaaggtgct ggacatctgc 2700

gtgtcactgc tgatgggaga gcagtttctg gtgtcctggt gctga 2745

<210> 39

<211> 2745

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAco2-дельта-29

<400> 39

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggccaacag 60

ggagcttcca gaccaggacc gagagacgcc caagcccatc ctggtagacc aagagctgtg 120

cctacccaat gcgacgtgcc acccaactcc cgattcgact gcgcgccaga taaggctatt 180

acccaagagc agtgtgaagc cagaggttgc tgctacatcc cagcgaagca aggattgcaa 240

ggcgcccaaa tgggacaacc ttggtgtttc ttcccccctt cgtacccatc atataaactc 300

gaaaacctgt cctcttcgga aatgggttat actgccaccc tcaccagaac tactcctact 360

ttcttcccga aagacatctt gaccttgagg ctggacgtga tgatggagac tgaaaaccgg 420

ctgcatttca ctatcaaaga tcctgccaat cggcgatacg aggtccctct ggaaacccct 480

cacgtgcact cacgggctcc ttctccgctt tactccgtcg aattctctga ggaacccttc 540

ggagtgatcg ttagacgcca gctggatggt agagtgctgt tgaacactac tgtggcccca 600

cttttcttcg ctgaccagtt tctgcaactg tccacttccc tgccatccca gtacattact 660

ggactcgccg aacacctgtc gccactgatg ctctcgacct cttggactag aatcactttg 720

tggaacagag acttggcccc tactccggga gcaaatctgt acggaagcca ccctttttac 780

ctggcgctcg aagatggcgg atccgctcac ggagtgttcc tgctgaatag caacgcaatg 840

gacgtggtgc tgcaaccttc ccctgcactc agttggagaa gtaccggggg tattctggac 900

gtgtacatct tcctcggacc agaacccaag agcgtggtgc agcaatatct ggacgtggtc 960

ggataccctt ttatgcctcc ttactgggga ctgggattcc acctttgccg ttggggctac 1020

tcatccaccg ccattaccag acaggtggtg gagaatatga ccagagccca cttccctctc 1080

gacgtgcagt ggaacgatct ggactatatg gactcccgga gagatttcac cttcaacaag 1140

gacgggttcc gcgattttcc cgcgatggtt caagagctcc accagggtgg tcgaagatat 1200

atgatgatcg tcgacccagc catttcgagc agcggacccg ctggatctta tagaccttac 1260

gacgaaggcc ttaggagagg agtgttcatc acaaacgaga ctggacagcc tttgatcggt 1320

aaagtgtggc ctggatcaac cgcctttcct gactttacca atcccactgc cttggcttgg 1380

tgggaggaca tggtggccga attccacgac caagtcccct ttgatggaat gtggatcgat 1440

atgaacgaac caagcaattt tatcagaggt tccgaagacg gttgccccaa caacgaactg 1500

gaaaaccctc cttatgtgcc cggagtcgtg ggcggaacat tacaggccgc gactatttgc 1560

gccagcagcc accaattcct gtccactcac tacaacctcc acaaccttta tggattaacc 1620

gaagctattg caagtcacag ggctctggtg aaggctagag ggactaggcc ctttgtgatc 1680

tcccgatcca cctttgccgg acacgggaga tacgccggtc actggactgg tgacgtgtgg 1740

agctcatggg aacaactggc ctcctccgtg ccggaaatct tacagttcaa ccttctgggt 1800

gtccctcttg tcggagcaga cgtgtgtggg tttcttggta acacctccga ggaactgtgt 1860

gtgcgctgga ctcaactggg tgcattctac ccattcatga gaaaccacaa ctccttgctg 1920

tccctgccac aagagcccta ctcgttcagc gagcctgcac aacaggctat gcggaaggca 1980

ctgaccctga gatacgccct gcttccacac ttatacactc tcttccatca agcgcatgtg 2040

gcaggagaaa ccgttgcaag gcctcttttc cttgaattcc ccaaggattc ctcgacttgg 2100

acggtggatc atcagctgct gtggggagaa gctctgctga ttactccagt gttgcaagcc 2160

ggaaaagctg aggtgaccgg atactttccg ctgggaacct ggtacgacct ccagactgtc 2220

cctgttgaag cccttggatc actgcctccg cctccggcag ctccacgcga accagctata 2280

cattccgagg gacagtgggt tacattacca gctcctctgg acacaatcaa cgtccactta 2340

agagctggct acattatccc tctgcaagga ccaggactga ctacgaccga gagcagacag 2400

cagccaatgg cactggctgt ggctctgacc aagggagggg aagctagagg agaactcttc 2460

tgggatgatg gggagtccct tgaagtgctg gaaagaggcg cttacactca agtcattttc 2520

cttgcacgga acaacaccat tgtgaacgaa ttggtgcgag tgaccagcga aggagctgga 2580

cttcaactgc agaaggtcac tgtgctcgga gtggctaccg ctcctcagca agtgctgtcg 2640

aatggagtcc ccgtgtcaaa ctttacctac tcccctgaca ctaaggtgct cgacatttgc 2700

gtgtccctcc tgatgggaga gcagttcctt gtgtcctggt gttga 2745

<210> 40

<211> 2706

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAwt-дельта-42

<400> 40

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggcgcacac 60

cccgggcggc cgcgagcagt gcccacacag tgcgacgtcc cccccaacag ccgcttcgat 120

tgcgcccctg acaaggccat cacccaggaa cagtgcgagg cccgcggctg ttgctacatc 180

cctgcaaagc aggggctgca gggagcccag atggggcagc cctggtgctt cttcccaccc 240

agctacccca gctacaagct ggagaacctg agctcctctg aaatgggcta cacggccacc 300

ctgacccgta ccacccccac cttcttcccc aaggacatcc tgaccctgcg gctggacgtg 360

atgatggaga ctgagaaccg cctccacttc acgatcaaag atccagctaa caggcgctac 420

gaggtgccct tggagacccc gcatgtccac agccgggcac cgtccccact ctacagcgtg 480

gagttctccg aggagccctt cggggtgatc gtgcgccggc agctggacgg ccgcgtgctg 540

ctgaacacga cggtggcgcc cctgttcttt gcggaccagt tccttcagct gtccacctcg 600

ctgccctcgc agtatatcac aggcctcgcc gagcacctca gtcccctgat gctcagcacc 660

agctggacca ggatcaccct gtggaaccgg gaccttgcgc ccacgcccgg tgcgaacctc 720

tacgggtctc accctttcta cctggcgctg gaggacggcg ggtcggcaca cggggtgttc 780

ctgctaaaca gcaatgccat ggatgtggtc ctgcagccga gccctgccct tagctggagg 840

tcgacaggtg ggatcctgga tgtctacatc ttcctgggcc cagagcccaa gagcgtggtg 900

cagcagtacc tggacgttgt gggatacccg ttcatgccgc catactgggg cctgggcttc 960

cacctgtgcc gctggggcta ctcctccacc gctatcaccc gccaggtggt ggagaacatg 1020

accagggccc acttccccct ggacgtccag tggaacgacc tggactacat ggactcccgg 1080

agggacttca cgttcaacaa ggatggcttc cgggacttcc cggccatggt gcaggagctg 1140

caccagggcg gccggcgcta catgatgatc gtggatcctg ccatcagcag ctcgggccct 1200

gccgggagct acaggcccta cgacgagggt ctgcggaggg gggttttcat caccaacgag 1260

accggccagc cgctgattgg gaaggtatgg cccgggtcca ctgccttccc cgacttcacc 1320

aaccccacag ccctggcctg gtgggaggac atggtggctg agttccatga ccaggtgccc 1380

ttcgacggca tgtggattga catgaacgag ccttccaact tcatcagggg ctctgaggac 1440

ggctgcccca acaatgagct ggagaaccca ccctacgtgc ctggggtggt tggggggacc 1500

ctccaggcgg ccaccatctg tgcctccagc caccagtttc tctccacaca ctacaacctg 1560

cacaacctct acggcctgac cgaagccatc gcctcccaca gggcgctggt gaaggctcgg 1620

gggacacgcc catttgtgat ctcccgctcg acctttgctg gccacggccg atacgccggc 1680

cactggacgg gggacgtgtg gagctcctgg gagcagctcg cctcctccgt gccagaaatc 1740

ctgcagttta acctgctggg ggtgcctctg gtcggggccg acgtctgcgg cttcctgggc 1800

aacacctcag aggagctgtg tgtgcgctgg acccagctgg gggccttcta ccccttcatg 1860

cggaaccaca acagcctgct cagtctgccc caggagccgt acagcttcag cgagccggcc 1920

cagcaggcca tgaggaaggc cctcaccctg cgctacgcac tcctccccca cctctacaca 1980

ctgttccacc aggcccacgt cgcgggggag accgtggccc ggcccctctt cctggagttc 2040

cccaaggact ctagcacctg gactgtggac caccagctcc tgtgggggga ggccctgctc 2100

atcaccccag tgctccaggc cgggaaggcc gaagtgactg gctacttccc cttgggcaca 2160

tggtacgacc tgcagacggt gccagtagag gcccttggca gcctcccacc cccacctgca 2220

gctccccgtg agccagccat ccacagcgag gggcagtggg tgacgctgcc ggcccccctg 2280

gacaccatca acgtccacct ccgggctggg tacatcatcc ccctgcaggg ccctggcctc 2340

acaaccacag agtcccgcca gcagcccatg gccctggctg tggccctgac caagggtggg 2400

gaggcccgag gggagctgtt ctgggacgat ggagagagcc tggaagtgct ggagcgaggg 2460

gcctacacac aggtcatctt cctggccagg aataacacga tcgtgaatga gctggtacgt 2520

gtgaccagtg agggagctgg cctgcagctg cagaaggtga ctgtcctggg cgtggccacg 2580

gcgccccagc aggtcctctc caacggtgtc cctgtctcca acttcaccta cagccccgac 2640

accaaggtcc tggacatctg tgtctcgctg ttgatgggag agcagtttct cgtcagctgg 2700

tgttag 2706

<210> 41

<211> 2706

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7-hGAAco2-дельта-42

<400> 41

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggcgcccat 60

cctggtagac caagagctgt gcctacccaa tgcgacgtgc cacccaactc ccgattcgac 120

tgcgcgccag ataaggctat tacccaagag cagtgtgaag ccagaggttg ctgctacatc 180

ccagcgaagc aaggattgca aggcgcccaa atgggacaac cttggtgttt cttcccccct 240

tcgtacccat catataaact cgaaaacctg tcctcttcgg aaatgggtta tactgccacc 300

ctcaccagaa ctactcctac tttcttcccg aaagacatct tgaccttgag gctggacgtg 360

atgatggaga ctgaaaaccg gctgcatttc actatcaaag atcctgccaa tcggcgatac 420

gaggtccctc tggaaacccc tcacgtgcac tcacgggctc cttctccgct ttactccgtc 480

gaattctctg aggaaccctt cggagtgatc gttagacgcc agctggatgg tagagtgctg 540

ttgaacacta ctgtggcccc acttttcttc gctgaccagt ttctgcaact gtccacttcc 600

ctgccatccc agtacattac tggactcgcc gaacacctgt cgccactgat gctctcgacc 660

tcttggacta gaatcacttt gtggaacaga gacttggccc ctactccggg agcaaatctg 720

tacggaagcc acccttttta cctggcgctc gaagatggcg gatccgctca cggagtgttc 780

ctgctgaata gcaacgcaat ggacgtggtg ctgcaacctt cccctgcact cagttggaga 840

agtaccgggg gtattctgga cgtgtacatc ttcctcggac cagaacccaa gagcgtggtg 900

cagcaatatc tggacgtggt cggataccct tttatgcctc cttactgggg actgggattc 960

cacctttgcc gttggggcta ctcatccacc gccattacca gacaggtggt ggagaatatg 1020

accagagccc acttccctct cgacgtgcag tggaacgatc tggactatat ggactcccgg 1080

agagatttca ccttcaacaa ggacgggttc cgcgattttc ccgcgatggt tcaagagctc 1140

caccagggtg gtcgaagata tatgatgatc gtcgacccag ccatttcgag cagcggaccc 1200

gctggatctt atagacctta cgacgaaggc cttaggagag gagtgttcat cacaaacgag 1260

actggacagc ctttgatcgg taaagtgtgg cctggatcaa ccgcctttcc tgactttacc 1320

aatcccactg ccttggcttg gtgggaggac atggtggccg aattccacga ccaagtcccc 1380

tttgatggaa tgtggatcga tatgaacgaa ccaagcaatt ttatcagagg ttccgaagac 1440

ggttgcccca acaacgaact ggaaaaccct ccttatgtgc ccggagtcgt gggcggaaca 1500

ttacaggccg cgactatttg cgccagcagc caccaattcc tgtccactca ctacaacctc 1560

cacaaccttt atggattaac cgaagctatt gcaagtcaca gggctctggt gaaggctaga 1620

gggactaggc cctttgtgat ctcccgatcc acctttgccg gacacgggag atacgccggt 1680

cactggactg gtgacgtgtg gagctcatgg gaacaactgg cctcctccgt gccggaaatc 1740

ttacagttca accttctggg tgtccctctt gtcggagcag acgtgtgtgg gtttcttggt 1800

aacacctccg aggaactgtg tgtgcgctgg actcaactgg gtgcattcta cccattcatg 1860

agaaaccaca actccttgct gtccctgcca caagagccct actcgttcag cgagcctgca 1920

caacaggcta tgcggaaggc actgaccctg agatacgccc tgcttccaca cttatacact 1980

ctcttccatc aagcgcatgt ggcaggagaa accgttgcaa ggcctctttt ccttgaattc 2040

cccaaggatt cctcgacttg gacggtggat catcagctgc tgtggggaga agctctgctg 2100

attactccag tgttgcaagc cggaaaagct gaggtgaccg gatactttcc gctgggaacc 2160

tggtacgacc tccagactgt ccctgttgaa gcccttggat cactgcctcc gcctccggca 2220

gctccacgcg aaccagctat acattccgag ggacagtggg ttacattacc agctcctctg 2280

gacacaatca acgtccactt aagagctggc tacattatcc ctctgcaagg accaggactg 2340

actacgaccg agagcagaca gcagccaatg gcactggctg tggctctgac caagggaggg 2400

gaagctagag gagaactctt ctgggatgat ggggagtccc ttgaagtgct ggaaagaggc 2460

gcttacactc aagtcatttt ccttgcacgg aacaacacca ttgtgaacga attggtgcga 2520

gtgaccagcg aaggagctgg acttcaactg cagaaggtca ctgtgctcgg agtggctacc 2580

gctcctcagc aagtgctgtc gaatggagtc cccgtgtcaa actttaccta ctcccctgac 2640

actaaggtgc tcgacatttg cgtgtccctc ctgatgggag agcagttcct tgtgtcctgg 2700

tgttga 2706

<210> 42

<211> 2703

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7-hGAAwt-дельта-43

<400> 42

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggccacccc 60

gggcggccgc gagcagtgcc cacacagtgc gacgtccccc ccaacagccg cttcgattgc 120

gcccctgaca aggccatcac ccaggaacag tgcgaggccc gcggctgttg ctacatccct 180

gcaaagcagg ggctgcaggg agcccagatg gggcagccct ggtgcttctt cccacccagc 240

taccccagct acaagctgga gaacctgagc tcctctgaaa tgggctacac ggccaccctg 300

acccgtacca cccccacctt cttccccaag gacatcctga ccctgcggct ggacgtgatg 360

atggagactg agaaccgcct ccacttcacg atcaaagatc cagctaacag gcgctacgag 420

gtgcccttgg agaccccgca tgtccacagc cgggcaccgt ccccactcta cagcgtggag 480

ttctccgagg agcccttcgg ggtgatcgtg cgccggcagc tggacggccg cgtgctgctg 540

aacacgacgg tggcgcccct gttctttgcg gaccagttcc ttcagctgtc cacctcgctg 600

ccctcgcagt atatcacagg cctcgccgag cacctcagtc ccctgatgct cagcaccagc 660

tggaccagga tcaccctgtg gaaccgggac cttgcgccca cgcccggtgc gaacctctac 720

gggtctcacc ctttctacct ggcgctggag gacggcgggt cggcacacgg ggtgttcctg 780

ctaaacagca atgccatgga tgtggtcctg cagccgagcc ctgcccttag ctggaggtcg 840

acaggtggga tcctggatgt ctacatcttc ctgggcccag agcccaagag cgtggtgcag 900

cagtacctgg acgttgtggg atacccgttc atgccgccat actggggcct gggcttccac 960

ctgtgccgct ggggctactc ctccaccgct atcacccgcc aggtggtgga gaacatgacc 1020

agggcccact tccccctgga cgtccagtgg aacgacctgg actacatgga ctcccggagg 1080

gacttcacgt tcaacaagga tggcttccgg gacttcccgg ccatggtgca ggagctgcac 1140

cagggcggcc ggcgctacat gatgatcgtg gatcctgcca tcagcagctc gggccctgcc 1200

gggagctaca ggccctacga cgagggtctg cggagggggg ttttcatcac caacgagacc 1260

ggccagccgc tgattgggaa ggtatggccc gggtccactg ccttccccga cttcaccaac 1320

cccacagccc tggcctggtg ggaggacatg gtggctgagt tccatgacca ggtgcccttc 1380

gacggcatgt ggattgacat gaacgagcct tccaacttca tcaggggctc tgaggacggc 1440

tgccccaaca atgagctgga gaacccaccc tacgtgcctg gggtggttgg ggggaccctc 1500

caggcggcca ccatctgtgc ctccagccac cagtttctct ccacacacta caacctgcac 1560

aacctctacg gcctgaccga agccatcgcc tcccacaggg cgctggtgaa ggctcggggg 1620

acacgcccat ttgtgatctc ccgctcgacc tttgctggcc acggccgata cgccggccac 1680

tggacggggg acgtgtggag ctcctgggag cagctcgcct cctccgtgcc agaaatcctg 1740

cagtttaacc tgctgggggt gcctctggtc ggggccgacg tctgcggctt cctgggcaac 1800

acctcagagg agctgtgtgt gcgctggacc cagctggggg ccttctaccc cttcatgcgg 1860

aaccacaaca gcctgctcag tctgccccag gagccgtaca gcttcagcga gccggcccag 1920

caggccatga ggaaggccct caccctgcgc tacgcactcc tcccccacct ctacacactg 1980

ttccaccagg cccacgtcgc gggggagacc gtggcccggc ccctcttcct ggagttcccc 2040

aaggactcta gcacctggac tgtggaccac cagctcctgt ggggggaggc cctgctcatc 2100

accccagtgc tccaggccgg gaaggccgaa gtgactggct acttcccctt gggcacatgg 2160

tacgacctgc agacggtgcc agtagaggcc cttggcagcc tcccaccccc acctgcagct 2220

ccccgtgagc cagccatcca cagcgagggg cagtgggtga cgctgccggc ccccctggac 2280

accatcaacg tccacctccg ggctgggtac atcatccccc tgcagggccc tggcctcaca 2340

accacagagt cccgccagca gcccatggcc ctggctgtgg ccctgaccaa gggtggggag 2400

gcccgagggg agctgttctg ggacgatgga gagagcctgg aagtgctgga gcgaggggcc 2460

tacacacagg tcatcttcct ggccaggaat aacacgatcg tgaatgagct ggtacgtgtg 2520

accagtgagg gagctggcct gcagctgcag aaggtgactg tcctgggcgt ggccacggcg 2580

ccccagcagg tcctctccaa cggtgtccct gtctccaact tcacctacag ccccgacacc 2640

aaggtcctgg acatctgtgt ctcgctgttg atgggagagc agtttctcgt cagctggtgt 2700

tag 2703

<210> 43

<211> 2703

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAco1-дельта-43

<400> 43

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggccacccc 60

ggcagaccta gagctgtgcc tacccagtgt gacgtgcccc ccaacagcag attcgactgc 120

gcccctgaca aggccatcac ccaggaacag tgcgaggcca gaggctgctg ctacatccct 180

gccaagcagg gactgcaggg cgctcagatg ggacagccct ggtgcttctt cccaccctcc 240

taccccagct acaagctgga aaacctgagc agcagcgaga tgggctacac cgccaccctg 300

accagaacca cccccacatt cttcccaaag gacatcctga ccctgcggct ggacgtgatg 360

atggaaaccg agaaccggct gcacttcacc atcaaggacc ccgccaatcg gagatacgag 420

gtgcccctgg aaacccccca cgtgcactct agagccccca gccctctgta cagcgtggaa 480

ttcagcgagg aacccttcgg cgtgatcgtg cggagacagc tggatggcag agtgctgctg 540

aacaccaccg tggcccctct gttcttcgcc gaccagttcc tgcagctgag caccagcctg 600

cccagccagt acatcacagg actggccgag cacctgagcc ccctgatgct gagcacatcc 660

tggacccgga tcaccctgtg gaacagggat ctggccccta cccctggcgc caatctgtac 720

ggcagccacc ctttctacct ggccctggaa gatggcggat ctgcccacgg agtgtttctg 780

ctgaactcca acgccatgga cgtggtgctg cagcctagcc ctgccctgtc ttggagaagc 840

acaggcggca tcctggatgt gtacatcttt ctgggccccg agcccaagag cgtggtgcag 900

cagtatctgg atgtcgtggg ctaccccttc atgccccctt actggggcct gggattccac 960

ctgtgcagat ggggctactc cagcaccgcc atcaccagac aggtggtgga aaacatgacc 1020

agagcccact tcccactgga tgtgcagtgg aacgacctgg actacatgga cagcagacgg 1080

gacttcacct tcaacaagga cggcttccgg gacttccccg ccatggtgca ggaactgcat 1140

cagggcggca gacggtacat gatgatcgtg gatcccgcca tcagctcctc tggccctgcc 1200

ggctcttaca gaccctacga cgagggcctg cggagaggcg tgttcatcac caacgagaca 1260

ggccagcccc tgatcggcaa agtgtggcct ggcagcacag ccttccccga cttcaccaat 1320

cctaccgccc tggcttggtg ggaggacatg gtggccgagt tccacgacca ggtgcccttc 1380

gacggcatgt ggatcgacat gaacgagccc agcaacttca tccggggcag cgaggatggc 1440

tgccccaaca acgaactgga aaatccccct tacgtgcccg gcgtcgtggg cggaacactg 1500

caggccgcta caatctgtgc cagcagccac cagtttctga gcacccacta caacctgcac 1560

aacctgtacg gcctgaccga ggccattgcc agccaccgcg ctctcgtgaa agccagaggc 1620

acacggccct tcgtgatcag cagaagcacc tttgccggcc acggcagata cgccggacat 1680

tggactggcg acgtgtggtc ctcttgggag cagctggcct ctagcgtgcc cgagatcctg 1740

cagttcaatc tgctgggcgt gccactcgtg ggcgccgatg tgtgtggctt cctgggcaac 1800

acctccgagg aactgtgtgt gcggtggaca cagctgggcg ccttctaccc tttcatgaga 1860

aaccacaaca gcctgctgag cctgccccag gaaccctaca gctttagcga gcctgcacag 1920

caggccatgc ggaaggccct gacactgaga tacgctctgc tgccccacct gtacaccctg 1980

tttcaccagg cccatgtggc cggcgagaca gtggccagac ctctgtttct ggaattcccc 2040

aaggacagca gcacctggac cgtggaccat cagctgctgt ggggagaggc tctgctgatt 2100

accccagtgc tgcaggcagg caaggccgaa gtgaccggct actttcccct gggcacttgg 2160

tacgacctgc agaccgtgcc tgtggaagcc ctgggatctc tgcctccacc tcctgccgct 2220

cctagagagc ctgccattca ctctgagggc cagtgggtca cactgcctgc ccccctggat 2280

accatcaacg tgcacctgag ggccggctac atcataccac tgcagggacc tggcctgacc 2340

accaccgagt ctagacagca gccaatggcc ctggccgtgg ccctgaccaa aggcggagaa 2400

gctaggggcg agctgttctg ggacgatggc gagagcctgg aagtgctgga aagaggcgcc 2460

tatacccaag tgatcttcct ggcccggaac aacaccatcg tgaacgagct ggtgcgcgtg 2520

acctctgaag gcgctggact gcagctgcag aaagtgaccg tgctgggagt ggccacagcc 2580

cctcagcagg tgctgtctaa tggcgtgccc gtgtccaact tcacctacag ccccgacacc 2640

aaggtgctgg acatctgcgt gtcactgctg atgggagagc agtttctggt gtcctggtgc 2700

tga 2703

<210> 44

<211> 2703

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAco2-дельта-43

<400> 44

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggccatcct 60

ggtagaccaa gagctgtgcc tacccaatgc gacgtgccac ccaactcccg attcgactgc 120

gcgccagata aggctattac ccaagagcag tgtgaagcca gaggttgctg ctacatccca 180

gcgaagcaag gattgcaagg cgcccaaatg ggacaacctt ggtgtttctt ccccccttcg 240

tacccatcat ataaactcga aaacctgtcc tcttcggaaa tgggttatac tgccaccctc 300

accagaacta ctcctacttt cttcccgaaa gacatcttga ccttgaggct ggacgtgatg 360

atggagactg aaaaccggct gcatttcact atcaaagatc ctgccaatcg gcgatacgag 420

gtccctctgg aaacccctca cgtgcactca cgggctcctt ctccgcttta ctccgtcgaa 480

ttctctgagg aacccttcgg agtgatcgtt agacgccagc tggatggtag agtgctgttg 540

aacactactg tggccccact tttcttcgct gaccagtttc tgcaactgtc cacttccctg 600

ccatcccagt acattactgg actcgccgaa cacctgtcgc cactgatgct ctcgacctct 660

tggactagaa tcactttgtg gaacagagac ttggccccta ctccgggagc aaatctgtac 720

ggaagccacc ctttttacct ggcgctcgaa gatggcggat ccgctcacgg agtgttcctg 780

ctgaatagca acgcaatgga cgtggtgctg caaccttccc ctgcactcag ttggagaagt 840

accgggggta ttctggacgt gtacatcttc ctcggaccag aacccaagag cgtggtgcag 900

caatatctgg acgtggtcgg ataccctttt atgcctcctt actggggact gggattccac 960

ctttgccgtt ggggctactc atccaccgcc attaccagac aggtggtgga gaatatgacc 1020

agagcccact tccctctcga cgtgcagtgg aacgatctgg actatatgga ctcccggaga 1080

gatttcacct tcaacaagga cgggttccgc gattttcccg cgatggttca agagctccac 1140

cagggtggtc gaagatatat gatgatcgtc gacccagcca tttcgagcag cggacccgct 1200

ggatcttata gaccttacga cgaaggcctt aggagaggag tgttcatcac aaacgagact 1260

ggacagcctt tgatcggtaa agtgtggcct ggatcaaccg cctttcctga ctttaccaat 1320

cccactgcct tggcttggtg ggaggacatg gtggccgaat tccacgacca agtccccttt 1380

gatggaatgt ggatcgatat gaacgaacca agcaatttta tcagaggttc cgaagacggt 1440

tgccccaaca acgaactgga aaaccctcct tatgtgcccg gagtcgtggg cggaacatta 1500

caggccgcga ctatttgcgc cagcagccac caattcctgt ccactcacta caacctccac 1560

aacctttatg gattaaccga agctattgca agtcacaggg ctctggtgaa ggctagaggg 1620

actaggccct ttgtgatctc ccgatccacc tttgccggac acgggagata cgccggtcac 1680

tggactggtg acgtgtggag ctcatgggaa caactggcct cctccgtgcc ggaaatctta 1740

cagttcaacc ttctgggtgt ccctcttgtc ggagcagacg tgtgtgggtt tcttggtaac 1800

acctccgagg aactgtgtgt gcgctggact caactgggtg cattctaccc attcatgaga 1860

aaccacaact ccttgctgtc cctgccacaa gagccctact cgttcagcga gcctgcacaa 1920

caggctatgc ggaaggcact gaccctgaga tacgccctgc ttccacactt atacactctc 1980

ttccatcaag cgcatgtggc aggagaaacc gttgcaaggc ctcttttcct tgaattcccc 2040

aaggattcct cgacttggac ggtggatcat cagctgctgt ggggagaagc tctgctgatt 2100

actccagtgt tgcaagccgg aaaagctgag gtgaccggat actttccgct gggaacctgg 2160

tacgacctcc agactgtccc tgttgaagcc cttggatcac tgcctccgcc tccggcagct 2220

ccacgcgaac cagctataca ttccgaggga cagtgggtta cattaccagc tcctctggac 2280

acaatcaacg tccacttaag agctggctac attatccctc tgcaaggacc aggactgact 2340

acgaccgaga gcagacagca gccaatggca ctggctgtgg ctctgaccaa gggaggggaa 2400

gctagaggag aactcttctg ggatgatggg gagtcccttg aagtgctgga aagaggcgct 2460

tacactcaag tcattttcct tgcacggaac aacaccattg tgaacgaatt ggtgcgagtg 2520

accagcgaag gagctggact tcaactgcag aaggtcactg tgctcggagt ggctaccgct 2580

cctcagcaag tgctgtcgaa tggagtcccc gtgtcaaact ttacctactc ccctgacact 2640

aaggtgctcg acatttgcgt gtccctcctg atgggagagc agttccttgt gtcctggtgt 2700

tga 2703

<210> 45

<211> 2691

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAwt-дельта-47

<400> 45

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggcccgcga 60

gcagtgccca cacagtgcga cgtccccccc aacagccgct tcgattgcgc ccctgacaag 120

gccatcaccc aggaacagtg cgaggcccgc ggctgttgct acatccctgc aaagcagggg 180

ctgcagggag cccagatggg gcagccctgg tgcttcttcc cacccagcta ccccagctac 240

aagctggaga acctgagctc ctctgaaatg ggctacacgg ccaccctgac ccgtaccacc 300

cccaccttct tccccaagga catcctgacc ctgcggctgg acgtgatgat ggagactgag 360

aaccgcctcc acttcacgat caaagatcca gctaacaggc gctacgaggt gcccttggag 420

accccgcatg tccacagccg ggcaccgtcc ccactctaca gcgtggagtt ctccgaggag 480

cccttcgggg tgatcgtgcg ccggcagctg gacggccgcg tgctgctgaa cacgacggtg 540

gcgcccctgt tctttgcgga ccagttcctt cagctgtcca cctcgctgcc ctcgcagtat 600

atcacaggcc tcgccgagca cctcagtccc ctgatgctca gcaccagctg gaccaggatc 660

accctgtgga accgggacct tgcgcccacg cccggtgcga acctctacgg gtctcaccct 720

ttctacctgg cgctggagga cggcgggtcg gcacacgggg tgttcctgct aaacagcaat 780

gccatggatg tggtcctgca gccgagccct gcccttagct ggaggtcgac aggtgggatc 840

ctggatgtct acatcttcct gggcccagag cccaagagcg tggtgcagca gtacctggac 900

gttgtgggat acccgttcat gccgccatac tggggcctgg gcttccacct gtgccgctgg 960

ggctactcct ccaccgctat cacccgccag gtggtggaga acatgaccag ggcccacttc 1020

cccctggacg tccagtggaa cgacctggac tacatggact cccggaggga cttcacgttc 1080

aacaaggatg gcttccggga cttcccggcc atggtgcagg agctgcacca gggcggccgg 1140

cgctacatga tgatcgtgga tcctgccatc agcagctcgg gccctgccgg gagctacagg 1200

ccctacgacg agggtctgcg gaggggggtt ttcatcacca acgagaccgg ccagccgctg 1260

attgggaagg tatggcccgg gtccactgcc ttccccgact tcaccaaccc cacagccctg 1320

gcctggtggg aggacatggt ggctgagttc catgaccagg tgcccttcga cggcatgtgg 1380

attgacatga acgagccttc caacttcatc aggggctctg aggacggctg ccccaacaat 1440

gagctggaga acccacccta cgtgcctggg gtggttgggg ggaccctcca ggcggccacc 1500

atctgtgcct ccagccacca gtttctctcc acacactaca acctgcacaa cctctacggc 1560

ctgaccgaag ccatcgcctc ccacagggcg ctggtgaagg ctcgggggac acgcccattt 1620

gtgatctccc gctcgacctt tgctggccac ggccgatacg ccggccactg gacgggggac 1680

gtgtggagct cctgggagca gctcgcctcc tccgtgccag aaatcctgca gtttaacctg 1740

ctgggggtgc ctctggtcgg ggccgacgtc tgcggcttcc tgggcaacac ctcagaggag 1800

ctgtgtgtgc gctggaccca gctgggggcc ttctacccct tcatgcggaa ccacaacagc 1860

ctgctcagtc tgccccagga gccgtacagc ttcagcgagc cggcccagca ggccatgagg 1920

aaggccctca ccctgcgcta cgcactcctc ccccacctct acacactgtt ccaccaggcc 1980

cacgtcgcgg gggagaccgt ggcccggccc ctcttcctgg agttccccaa ggactctagc 2040

acctggactg tggaccacca gctcctgtgg ggggaggccc tgctcatcac cccagtgctc 2100

caggccggga aggccgaagt gactggctac ttccccttgg gcacatggta cgacctgcag 2160

acggtgccag tagaggccct tggcagcctc ccacccccac ctgcagctcc ccgtgagcca 2220

gccatccaca gcgaggggca gtgggtgacg ctgccggccc ccctggacac catcaacgtc 2280

cacctccggg ctgggtacat catccccctg cagggccctg gcctcacaac cacagagtcc 2340

cgccagcagc ccatggccct ggctgtggcc ctgaccaagg gtggggaggc ccgaggggag 2400

ctgttctggg acgatggaga gagcctggaa gtgctggagc gaggggccta cacacaggtc 2460

atcttcctgg ccaggaataa cacgatcgtg aatgagctgg tacgtgtgac cagtgaggga 2520

gctggcctgc agctgcagaa ggtgactgtc ctgggcgtgg ccacggcgcc ccagcaggtc 2580

ctctccaacg gtgtccctgt ctccaacttc acctacagcc ccgacaccaa ggtcctggac 2640

atctgtgtct cgctgttgat gggagagcag tttctcgtca gctggtgtta g 2691

<210> 46

<211> 2691

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAco1-дельта-47

<400> 46

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggccctaga 60

gctgtgccta cccagtgtga cgtgcccccc aacagcagat tcgactgcgc ccctgacaag 120

gccatcaccc aggaacagtg cgaggccaga ggctgctgct acatccctgc caagcaggga 180

ctgcagggcg ctcagatggg acagccctgg tgcttcttcc caccctccta ccccagctac 240

aagctggaaa acctgagcag cagcgagatg ggctacaccg ccaccctgac cagaaccacc 300

cccacattct tcccaaagga catcctgacc ctgcggctgg acgtgatgat ggaaaccgag 360

aaccggctgc acttcaccat caaggacccc gccaatcgga gatacgaggt gcccctggaa 420

accccccacg tgcactctag agcccccagc cctctgtaca gcgtggaatt cagcgaggaa 480

cccttcggcg tgatcgtgcg gagacagctg gatggcagag tgctgctgaa caccaccgtg 540

gcccctctgt tcttcgccga ccagttcctg cagctgagca ccagcctgcc cagccagtac 600

atcacaggac tggccgagca cctgagcccc ctgatgctga gcacatcctg gacccggatc 660

accctgtgga acagggatct ggcccctacc cctggcgcca atctgtacgg cagccaccct 720

ttctacctgg ccctggaaga tggcggatct gcccacggag tgtttctgct gaactccaac 780

gccatggacg tggtgctgca gcctagccct gccctgtctt ggagaagcac aggcggcatc 840

ctggatgtgt acatctttct gggccccgag cccaagagcg tggtgcagca gtatctggat 900

gtcgtgggct accccttcat gcccccttac tggggcctgg gattccacct gtgcagatgg 960

ggctactcca gcaccgccat caccagacag gtggtggaaa acatgaccag agcccacttc 1020

ccactggatg tgcagtggaa cgacctggac tacatggaca gcagacggga cttcaccttc 1080

aacaaggacg gcttccggga cttccccgcc atggtgcagg aactgcatca gggcggcaga 1140

cggtacatga tgatcgtgga tcccgccatc agctcctctg gccctgccgg ctcttacaga 1200

ccctacgacg agggcctgcg gagaggcgtg ttcatcacca acgagacagg ccagcccctg 1260

atcggcaaag tgtggcctgg cagcacagcc ttccccgact tcaccaatcc taccgccctg 1320

gcttggtggg aggacatggt ggccgagttc cacgaccagg tgcccttcga cggcatgtgg 1380

atcgacatga acgagcccag caacttcatc cggggcagcg aggatggctg ccccaacaac 1440

gaactggaaa atccccctta cgtgcccggc gtcgtgggcg gaacactgca ggccgctaca 1500

atctgtgcca gcagccacca gtttctgagc acccactaca acctgcacaa cctgtacggc 1560

ctgaccgagg ccattgccag ccaccgcgct ctcgtgaaag ccagaggcac acggcccttc 1620

gtgatcagca gaagcacctt tgccggccac ggcagatacg ccggacattg gactggcgac 1680

gtgtggtcct cttgggagca gctggcctct agcgtgcccg agatcctgca gttcaatctg 1740

ctgggcgtgc cactcgtggg cgccgatgtg tgtggcttcc tgggcaacac ctccgaggaa 1800

ctgtgtgtgc ggtggacaca gctgggcgcc ttctaccctt tcatgagaaa ccacaacagc 1860

ctgctgagcc tgccccagga accctacagc tttagcgagc ctgcacagca ggccatgcgg 1920

aaggccctga cactgagata cgctctgctg ccccacctgt acaccctgtt tcaccaggcc 1980

catgtggccg gcgagacagt ggccagacct ctgtttctgg aattccccaa ggacagcagc 2040

acctggaccg tggaccatca gctgctgtgg ggagaggctc tgctgattac cccagtgctg 2100

caggcaggca aggccgaagt gaccggctac tttcccctgg gcacttggta cgacctgcag 2160

accgtgcctg tggaagccct gggatctctg cctccacctc ctgccgctcc tagagagcct 2220

gccattcact ctgagggcca gtgggtcaca ctgcctgccc ccctggatac catcaacgtg 2280

cacctgaggg ccggctacat cataccactg cagggacctg gcctgaccac caccgagtct 2340

agacagcagc caatggccct ggccgtggcc ctgaccaaag gcggagaagc taggggcgag 2400

ctgttctggg acgatggcga gagcctggaa gtgctggaaa gaggcgccta tacccaagtg 2460

atcttcctgg cccggaacaa caccatcgtg aacgagctgg tgcgcgtgac ctctgaaggc 2520

gctggactgc agctgcagaa agtgaccgtg ctgggagtgg ccacagcccc tcagcaggtg 2580

ctgtctaatg gcgtgcccgt gtccaacttc acctacagcc ccgacaccaa ggtgctggac 2640

atctgcgtgt cactgctgat gggagagcag tttctggtgt cctggtgctg a 2691

<210> 47

<211> 2691

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> sp7+hGAAco2-дельта-47

<400> 47

atggcctttc tgtggctgct gagctgttgg gccctgctgg gcaccacctt cggcccaaga 60

gctgtgccta cccaatgcga cgtgccaccc aactcccgat tcgactgcgc gccagataag 120

gctattaccc aagagcagtg tgaagccaga ggttgctgct acatcccagc gaagcaagga 180

ttgcaaggcg cccaaatggg acaaccttgg tgtttcttcc ccccttcgta cccatcatat 240

aaactcgaaa acctgtcctc ttcggaaatg ggttatactg ccaccctcac cagaactact 300

cctactttct tcccgaaaga catcttgacc ttgaggctgg acgtgatgat ggagactgaa 360

aaccggctgc atttcactat caaagatcct gccaatcggc gatacgaggt ccctctggaa 420

acccctcacg tgcactcacg ggctccttct ccgctttact ccgtcgaatt ctctgaggaa 480

cccttcggag tgatcgttag acgccagctg gatggtagag tgctgttgaa cactactgtg 540

gccccacttt tcttcgctga ccagtttctg caactgtcca cttccctgcc atcccagtac 600

attactggac tcgccgaaca cctgtcgcca ctgatgctct cgacctcttg gactagaatc 660

actttgtgga acagagactt ggcccctact ccgggagcaa atctgtacgg aagccaccct 720

ttttacctgg cgctcgaaga tggcggatcc gctcacggag tgttcctgct gaatagcaac 780

gcaatggacg tggtgctgca accttcccct gcactcagtt ggagaagtac cgggggtatt 840

ctggacgtgt acatcttcct cggaccagaa cccaagagcg tggtgcagca atatctggac 900

gtggtcggat acccttttat gcctccttac tggggactgg gattccacct ttgccgttgg 960

ggctactcat ccaccgccat taccagacag gtggtggaga atatgaccag agcccacttc 1020

cctctcgacg tgcagtggaa cgatctggac tatatggact cccggagaga tttcaccttc 1080

aacaaggacg ggttccgcga ttttcccgcg atggttcaag agctccacca gggtggtcga 1140

agatatatga tgatcgtcga cccagccatt tcgagcagcg gacccgctgg atcttataga 1200

ccttacgacg aaggccttag gagaggagtg ttcatcacaa acgagactgg acagcctttg 1260

atcggtaaag tgtggcctgg atcaaccgcc tttcctgact ttaccaatcc cactgccttg 1320

gcttggtggg aggacatggt ggccgaattc cacgaccaag tcccctttga tggaatgtgg 1380

atcgatatga acgaaccaag caattttatc agaggttccg aagacggttg ccccaacaac 1440

gaactggaaa accctcctta tgtgcccgga gtcgtgggcg gaacattaca ggccgcgact 1500

atttgcgcca gcagccacca attcctgtcc actcactaca acctccacaa cctttatgga 1560

ttaaccgaag ctattgcaag tcacagggct ctggtgaagg ctagagggac taggcccttt 1620

gtgatctccc gatccacctt tgccggacac gggagatacg ccggtcactg gactggtgac 1680

gtgtggagct catgggaaca actggcctcc tccgtgccgg aaatcttaca gttcaacctt 1740

ctgggtgtcc ctcttgtcgg agcagacgtg tgtgggtttc ttggtaacac ctccgaggaa 1800

ctgtgtgtgc gctggactca actgggtgca ttctacccat tcatgagaaa ccacaactcc 1860

ttgctgtccc tgccacaaga gccctactcg ttcagcgagc ctgcacaaca ggctatgcgg 1920

aaggcactga ccctgagata cgccctgctt ccacacttat acactctctt ccatcaagcg 1980

catgtggcag gagaaaccgt tgcaaggcct cttttccttg aattccccaa ggattcctcg 2040

acttggacgg tggatcatca gctgctgtgg ggagaagctc tgctgattac tccagtgttg 2100

caagccggaa aagctgaggt gaccggatac tttccgctgg gaacctggta cgacctccag 2160

actgtccctg ttgaagccct tggatcactg cctccgcctc cggcagctcc acgcgaacca 2220

gctatacatt ccgagggaca gtgggttaca ttaccagctc ctctggacac aatcaacgtc 2280

cacttaagag ctggctacat tatccctctg caaggaccag gactgactac gaccgagagc 2340

agacagcagc caatggcact ggctgtggct ctgaccaagg gaggggaagc tagaggagaa 2400

ctcttctggg atgatgggga gtcccttgaa gtgctggaaa gaggcgctta cactcaagtc 2460

attttccttg cacggaacaa caccattgtg aacgaattgg tgcgagtgac cagcgaagga 2520

gctggacttc aactgcagaa ggtcactgtg ctcggagtgg ctaccgctcc tcagcaagtg 2580

ctgtcgaatg gagtccccgt gtcaaacttt acctactccc ctgacactaa ggtgctcgac 2640

atttgcgtgt ccctcctgat gggagagcag ttccttgtgt cctggtgttg a 2691

<210> 48

<211> 2652

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco1-дельта-42

<400> 48

gcccaccccg gcagacctag agctgtgcct acccagtgtg acgtgccccc caacagcaga 60

ttcgactgcg cccctgacaa ggccatcacc caggaacagt gcgaggccag aggctgctgc 120

tacatccctg ccaagcaggg actgcagggc gctcagatgg gacagccctg gtgcttcttc 180

ccaccctcct accccagcta caagctggaa aacctgagca gcagcgagat gggctacacc 240

gccaccctga ccagaaccac ccccacattc ttcccaaagg acatcctgac cctgcggctg 300

gacgtgatga tggaaaccga gaaccggctg cacttcacca tcaaggaccc cgccaatcgg 360

agatacgagg tgcccctgga aaccccccac gtgcactcta gagcccccag ccctctgtac 420

agcgtggaat tcagcgagga acccttcggc gtgatcgtgc ggagacagct ggatggcaga 480

gtgctgctga acaccaccgt ggcccctctg ttcttcgccg accagttcct gcagctgagc 540

accagcctgc ccagccagta catcacagga ctggccgagc acctgagccc cctgatgctg 600

agcacatcct ggacccggat caccctgtgg aacagggatc tggcccctac ccctggcgcc 660

aatctgtacg gcagccaccc tttctacctg gccctggaag atggcggatc tgcccacgga 720

gtgtttctgc tgaactccaa cgccatggac gtggtgctgc agcctagccc tgccctgtct 780

tggagaagca caggcggcat cctggatgtg tacatctttc tgggccccga gcccaagagc 840

gtggtgcagc agtatctgga tgtcgtgggc taccccttca tgccccctta ctggggcctg 900

ggattccacc tgtgcagatg gggctactcc agcaccgcca tcaccagaca ggtggtggaa 960

aacatgacca gagcccactt cccactggat gtgcagtgga acgacctgga ctacatggac 1020

agcagacggg acttcacctt caacaaggac ggcttccggg acttccccgc catggtgcag 1080

gaactgcatc agggcggcag acggtacatg atgatcgtgg atcccgccat cagctcctct 1140

ggccctgccg gctcttacag accctacgac gagggcctgc ggagaggcgt gttcatcacc 1200

aacgagacag gccagcccct gatcggcaaa gtgtggcctg gcagcacagc cttccccgac 1260

ttcaccaatc ctaccgccct ggcttggtgg gaggacatgg tggccgagtt ccacgaccag 1320

gtgcccttcg acggcatgtg gatcgacatg aacgagccca gcaacttcat ccggggcagc 1380

gaggatggct gccccaacaa cgaactggaa aatccccctt acgtgcccgg cgtcgtgggc 1440

ggaacactgc aggccgctac aatctgtgcc agcagccacc agtttctgag cacccactac 1500

aacctgcaca acctgtacgg cctgaccgag gccattgcca gccaccgcgc tctcgtgaaa 1560

gccagaggca cacggccctt cgtgatcagc agaagcacct ttgccggcca cggcagatac 1620

gccggacatt ggactggcga cgtgtggtcc tcttgggagc agctggcctc tagcgtgccc 1680

gagatcctgc agttcaatct gctgggcgtg ccactcgtgg gcgccgatgt gtgtggcttc 1740

ctgggcaaca cctccgagga actgtgtgtg cggtggacac agctgggcgc cttctaccct 1800

ttcatgagaa accacaacag cctgctgagc ctgccccagg aaccctacag ctttagcgag 1860

cctgcacagc aggccatgcg gaaggccctg acactgagat acgctctgct gccccacctg 1920

tacaccctgt ttcaccaggc ccatgtggcc ggcgagacag tggccagacc tctgtttctg 1980

gaattcccca aggacagcag cacctggacc gtggaccatc agctgctgtg gggagaggct 2040

ctgctgatta ccccagtgct gcaggcaggc aaggccgaag tgaccggcta ctttcccctg 2100

ggcacttggt acgacctgca gaccgtgcct gtggaagccc tgggatctct gcctccacct 2160

cctgccgctc ctagagagcc tgccattcac tctgagggcc agtgggtcac actgcctgcc 2220

cccctggata ccatcaacgt gcacctgagg gccggctaca tcataccact gcagggacct 2280

ggcctgacca ccaccgagtc tagacagcag ccaatggccc tggccgtggc cctgaccaaa 2340

ggcggagaag ctaggggcga gctgttctgg gacgatggcg agagcctgga agtgctggaa 2400

agaggcgcct atacccaagt gatcttcctg gcccggaaca acaccatcgt gaacgagctg 2460

gtgcgcgtga cctctgaagg cgctggactg cagctgcaga aagtgaccgt gctgggagtg 2520

gccacagccc ctcagcaggt gctgtctaat ggcgtgcccg tgtccaactt cacctacagc 2580

cccgacacca aggtgctgga catctgcgtg tcactgctga tgggagagca gtttctggtg 2640

tcctggtgct ga 2652

<210> 49

<211> 2652

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco2-дельта-42

<400> 49

gcccatcctg gtagaccaag agctgtgcct acccaatgcg acgtgccacc caactcccga 60

ttcgactgcg cgccagataa ggctattacc caagagcagt gtgaagccag aggttgctgc 120

tacatcccag cgaagcaagg attgcaaggc gcccaaatgg gacaaccttg gtgtttcttc 180

cccccttcgt acccatcata taaactcgaa aacctgtcct cttcggaaat gggttatact 240

gccaccctca ccagaactac tcctactttc ttcccgaaag acatcttgac cttgaggctg 300

gacgtgatga tggagactga aaaccggctg catttcacta tcaaagatcc tgccaatcgg 360

cgatacgagg tccctctgga aacccctcac gtgcactcac gggctccttc tccgctttac 420

tccgtcgaat tctctgagga acccttcgga gtgatcgtta gacgccagct ggatggtaga 480

gtgctgttga acactactgt ggccccactt ttcttcgctg accagtttct gcaactgtcc 540

acttccctgc catcccagta cattactgga ctcgccgaac acctgtcgcc actgatgctc 600

tcgacctctt ggactagaat cactttgtgg aacagagact tggcccctac tccgggagca 660

aatctgtacg gaagccaccc tttttacctg gcgctcgaag atggcggatc cgctcacgga 720

gtgttcctgc tgaatagcaa cgcaatggac gtggtgctgc aaccttcccc tgcactcagt 780

tggagaagta ccgggggtat tctggacgtg tacatcttcc tcggaccaga acccaagagc 840

gtggtgcagc aatatctgga cgtggtcgga taccctttta tgcctcctta ctggggactg 900

ggattccacc tttgccgttg gggctactca tccaccgcca ttaccagaca ggtggtggag 960

aatatgacca gagcccactt ccctctcgac gtgcagtgga acgatctgga ctatatggac 1020

tcccggagag atttcacctt caacaaggac gggttccgcg attttcccgc gatggttcaa 1080

gagctccacc agggtggtcg aagatatatg atgatcgtcg acccagccat ttcgagcagc 1140

ggacccgctg gatcttatag accttacgac gaaggcctta ggagaggagt gttcatcaca 1200

aacgagactg gacagccttt gatcggtaaa gtgtggcctg gatcaaccgc ctttcctgac 1260

tttaccaatc ccactgcctt ggcttggtgg gaggacatgg tggccgaatt ccacgaccaa 1320

gtcccctttg atggaatgtg gatcgatatg aacgaaccaa gcaattttat cagaggttcc 1380

gaagacggtt gccccaacaa cgaactggaa aaccctcctt atgtgcccgg agtcgtgggc 1440

ggaacattac aggccgcgac tatttgcgcc agcagccacc aattcctgtc cactcactac 1500

aacctccaca acctttatgg attaaccgaa gctattgcaa gtcacagggc tctggtgaag 1560

gctagaggga ctaggccctt tgtgatctcc cgatccacct ttgccggaca cgggagatac 1620

gccggtcact ggactggtga cgtgtggagc tcatgggaac aactggcctc ctccgtgccg 1680

gaaatcttac agttcaacct tctgggtgtc cctcttgtcg gagcagacgt gtgtgggttt 1740

cttggtaaca cctccgagga actgtgtgtg cgctggactc aactgggtgc attctaccca 1800

ttcatgagaa accacaactc cttgctgtcc ctgccacaag agccctactc gttcagcgag 1860

cctgcacaac aggctatgcg gaaggcactg accctgagat acgccctgct tccacactta 1920

tacactctct tccatcaagc gcatgtggca ggagaaaccg ttgcaaggcc tcttttcctt 1980

gaattcccca aggattcctc gacttggacg gtggatcatc agctgctgtg gggagaagct 2040

ctgctgatta ctccagtgtt gcaagccgga aaagctgagg tgaccggata ctttccgctg 2100

ggaacctggt acgacctcca gactgtccct gttgaagccc ttggatcact gcctccgcct 2160

ccggcagctc cacgcgaacc agctatacat tccgagggac agtgggttac attaccagct 2220

cctctggaca caatcaacgt ccacttaaga gctggctaca ttatccctct gcaaggacca 2280

ggactgacta cgaccgagag cagacagcag ccaatggcac tggctgtggc tctgaccaag 2340

ggaggggaag ctagaggaga actcttctgg gatgatgggg agtcccttga agtgctggaa 2400

agaggcgctt acactcaagt cattttcctt gcacggaaca acaccattgt gaacgaattg 2460

gtgcgagtga ccagcgaagg agctggactt caactgcaga aggtcactgt gctcggagtg 2520

gctaccgctc ctcagcaagt gctgtcgaat ggagtccccg tgtcaaactt tacctactcc 2580

cctgacacta aggtgctcga catttgcgtg tccctcctga tgggagagca gttccttgtg 2640

tcctggtgtt ga 2652

<210> 50

<211> 2649

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco1-дельта-43

<400> 50

caccccggca gacctagagc tgtgcctacc cagtgtgacg tgccccccaa cagcagattc 60

gactgcgccc ctgacaaggc catcacccag gaacagtgcg aggccagagg ctgctgctac 120

atccctgcca agcagggact gcagggcgct cagatgggac agccctggtg cttcttccca 180

ccctcctacc ccagctacaa gctggaaaac ctgagcagca gcgagatggg ctacaccgcc 240

accctgacca gaaccacccc cacattcttc ccaaaggaca tcctgaccct gcggctggac 300

gtgatgatgg aaaccgagaa ccggctgcac ttcaccatca aggaccccgc caatcggaga 360

tacgaggtgc ccctggaaac cccccacgtg cactctagag cccccagccc tctgtacagc 420

gtggaattca gcgaggaacc cttcggcgtg atcgtgcgga gacagctgga tggcagagtg 480

ctgctgaaca ccaccgtggc ccctctgttc ttcgccgacc agttcctgca gctgagcacc 540

agcctgccca gccagtacat cacaggactg gccgagcacc tgagccccct gatgctgagc 600

acatcctgga cccggatcac cctgtggaac agggatctgg cccctacccc tggcgccaat 660

ctgtacggca gccacccttt ctacctggcc ctggaagatg gcggatctgc ccacggagtg 720

tttctgctga actccaacgc catggacgtg gtgctgcagc ctagccctgc cctgtcttgg 780

agaagcacag gcggcatcct ggatgtgtac atctttctgg gccccgagcc caagagcgtg 840

gtgcagcagt atctggatgt cgtgggctac cccttcatgc ccccttactg gggcctggga 900

ttccacctgt gcagatgggg ctactccagc accgccatca ccagacaggt ggtggaaaac 960

atgaccagag cccacttccc actggatgtg cagtggaacg acctggacta catggacagc 1020

agacgggact tcaccttcaa caaggacggc ttccgggact tccccgccat ggtgcaggaa 1080

ctgcatcagg gcggcagacg gtacatgatg atcgtggatc ccgccatcag ctcctctggc 1140

cctgccggct cttacagacc ctacgacgag ggcctgcgga gaggcgtgtt catcaccaac 1200

gagacaggcc agcccctgat cggcaaagtg tggcctggca gcacagcctt ccccgacttc 1260

accaatccta ccgccctggc ttggtgggag gacatggtgg ccgagttcca cgaccaggtg 1320

cccttcgacg gcatgtggat cgacatgaac gagcccagca acttcatccg gggcagcgag 1380

gatggctgcc ccaacaacga actggaaaat cccccttacg tgcccggcgt cgtgggcgga 1440

acactgcagg ccgctacaat ctgtgccagc agccaccagt ttctgagcac ccactacaac 1500

ctgcacaacc tgtacggcct gaccgaggcc attgccagcc accgcgctct cgtgaaagcc 1560

agaggcacac ggcccttcgt gatcagcaga agcacctttg ccggccacgg cagatacgcc 1620

ggacattgga ctggcgacgt gtggtcctct tgggagcagc tggcctctag cgtgcccgag 1680

atcctgcagt tcaatctgct gggcgtgcca ctcgtgggcg ccgatgtgtg tggcttcctg 1740

ggcaacacct ccgaggaact gtgtgtgcgg tggacacagc tgggcgcctt ctaccctttc 1800

atgagaaacc acaacagcct gctgagcctg ccccaggaac cctacagctt tagcgagcct 1860

gcacagcagg ccatgcggaa ggccctgaca ctgagatacg ctctgctgcc ccacctgtac 1920

accctgtttc accaggccca tgtggccggc gagacagtgg ccagacctct gtttctggaa 1980

ttccccaagg acagcagcac ctggaccgtg gaccatcagc tgctgtgggg agaggctctg 2040

ctgattaccc cagtgctgca ggcaggcaag gccgaagtga ccggctactt tcccctgggc 2100

acttggtacg acctgcagac cgtgcctgtg gaagccctgg gatctctgcc tccacctcct 2160

gccgctccta gagagcctgc cattcactct gagggccagt gggtcacact gcctgccccc 2220

ctggatacca tcaacgtgca cctgagggcc ggctacatca taccactgca gggacctggc 2280

ctgaccacca ccgagtctag acagcagcca atggccctgg ccgtggccct gaccaaaggc 2340

ggagaagcta ggggcgagct gttctgggac gatggcgaga gcctggaagt gctggaaaga 2400

ggcgcctata cccaagtgat cttcctggcc cggaacaaca ccatcgtgaa cgagctggtg 2460

cgcgtgacct ctgaaggcgc tggactgcag ctgcagaaag tgaccgtgct gggagtggcc 2520

acagcccctc agcaggtgct gtctaatggc gtgcccgtgt ccaacttcac ctacagcccc 2580

gacaccaagg tgctggacat ctgcgtgtca ctgctgatgg gagagcagtt tctggtgtcc 2640

tggtgctga 2649

<210> 51

<211> 2649

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco2-дельта-43

<400> 51

catcctggta gaccaagagc tgtgcctacc caatgcgacg tgccacccaa ctcccgattc 60

gactgcgcgc cagataaggc tattacccaa gagcagtgtg aagccagagg ttgctgctac 120

atcccagcga agcaaggatt gcaaggcgcc caaatgggac aaccttggtg tttcttcccc 180

ccttcgtacc catcatataa actcgaaaac ctgtcctctt cggaaatggg ttatactgcc 240

accctcacca gaactactcc tactttcttc ccgaaagaca tcttgacctt gaggctggac 300

gtgatgatgg agactgaaaa ccggctgcat ttcactatca aagatcctgc caatcggcga 360

tacgaggtcc ctctggaaac ccctcacgtg cactcacggg ctccttctcc gctttactcc 420

gtcgaattct ctgaggaacc cttcggagtg atcgttagac gccagctgga tggtagagtg 480

ctgttgaaca ctactgtggc cccacttttc ttcgctgacc agtttctgca actgtccact 540

tccctgccat cccagtacat tactggactc gccgaacacc tgtcgccact gatgctctcg 600

acctcttgga ctagaatcac tttgtggaac agagacttgg cccctactcc gggagcaaat 660

ctgtacggaa gccacccttt ttacctggcg ctcgaagatg gcggatccgc tcacggagtg 720

ttcctgctga atagcaacgc aatggacgtg gtgctgcaac cttcccctgc actcagttgg 780

agaagtaccg ggggtattct ggacgtgtac atcttcctcg gaccagaacc caagagcgtg 840

gtgcagcaat atctggacgt ggtcggatac ccttttatgc ctccttactg gggactggga 900

ttccaccttt gccgttgggg ctactcatcc accgccatta ccagacaggt ggtggagaat 960

atgaccagag cccacttccc tctcgacgtg cagtggaacg atctggacta tatggactcc 1020

cggagagatt tcaccttcaa caaggacggg ttccgcgatt ttcccgcgat ggttcaagag 1080

ctccaccagg gtggtcgaag atatatgatg atcgtcgacc cagccatttc gagcagcgga 1140

cccgctggat cttatagacc ttacgacgaa ggccttagga gaggagtgtt catcacaaac 1200

gagactggac agcctttgat cggtaaagtg tggcctggat caaccgcctt tcctgacttt 1260

accaatccca ctgccttggc ttggtgggag gacatggtgg ccgaattcca cgaccaagtc 1320

ccctttgatg gaatgtggat cgatatgaac gaaccaagca attttatcag aggttccgaa 1380

gacggttgcc ccaacaacga actggaaaac cctccttatg tgcccggagt cgtgggcgga 1440

acattacagg ccgcgactat ttgcgccagc agccaccaat tcctgtccac tcactacaac 1500

ctccacaacc tttatggatt aaccgaagct attgcaagtc acagggctct ggtgaaggct 1560

agagggacta ggccctttgt gatctcccga tccacctttg ccggacacgg gagatacgcc 1620

ggtcactgga ctggtgacgt gtggagctca tgggaacaac tggcctcctc cgtgccggaa 1680

atcttacagt tcaaccttct gggtgtccct cttgtcggag cagacgtgtg tgggtttctt 1740

ggtaacacct ccgaggaact gtgtgtgcgc tggactcaac tgggtgcatt ctacccattc 1800

atgagaaacc acaactcctt gctgtccctg ccacaagagc cctactcgtt cagcgagcct 1860

gcacaacagg ctatgcggaa ggcactgacc ctgagatacg ccctgcttcc acacttatac 1920

actctcttcc atcaagcgca tgtggcagga gaaaccgttg caaggcctct tttccttgaa 1980

ttccccaagg attcctcgac ttggacggtg gatcatcagc tgctgtgggg agaagctctg 2040

ctgattactc cagtgttgca agccggaaaa gctgaggtga ccggatactt tccgctggga 2100

acctggtacg acctccagac tgtccctgtt gaagcccttg gatcactgcc tccgcctccg 2160

gcagctccac gcgaaccagc tatacattcc gagggacagt gggttacatt accagctcct 2220

ctggacacaa tcaacgtcca cttaagagct ggctacatta tccctctgca aggaccagga 2280

ctgactacga ccgagagcag acagcagcca atggcactgg ctgtggctct gaccaaggga 2340

ggggaagcta gaggagaact cttctgggat gatggggagt cccttgaagt gctggaaaga 2400

ggcgcttaca ctcaagtcat tttccttgca cggaacaaca ccattgtgaa cgaattggtg 2460

cgagtgacca gcgaaggagc tggacttcaa ctgcagaagg tcactgtgct cggagtggct 2520

accgctcctc agcaagtgct gtcgaatgga gtccccgtgt caaactttac ctactcccct 2580

gacactaagg tgctcgacat ttgcgtgtcc ctcctgatgg gagagcagtt ccttgtgtcc 2640

tggtgttga 2649

<210> 52

<211> 2637

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco1-дельта-47

<400> 52

cctagagctg tgcctaccca gtgtgacgtg ccccccaaca gcagattcga ctgcgcccct 60

gacaaggcca tcacccagga acagtgcgag gccagaggct gctgctacat ccctgccaag 120

cagggactgc agggcgctca gatgggacag ccctggtgct tcttcccacc ctcctacccc 180

agctacaagc tggaaaacct gagcagcagc gagatgggct acaccgccac cctgaccaga 240

accaccccca cattcttccc aaaggacatc ctgaccctgc ggctggacgt gatgatggaa 300

accgagaacc ggctgcactt caccatcaag gaccccgcca atcggagata cgaggtgccc 360

ctggaaaccc cccacgtgca ctctagagcc cccagccctc tgtacagcgt ggaattcagc 420

gaggaaccct tcggcgtgat cgtgcggaga cagctggatg gcagagtgct gctgaacacc 480

accgtggccc ctctgttctt cgccgaccag ttcctgcagc tgagcaccag cctgcccagc 540

cagtacatca caggactggc cgagcacctg agccccctga tgctgagcac atcctggacc 600

cggatcaccc tgtggaacag ggatctggcc cctacccctg gcgccaatct gtacggcagc 660

caccctttct acctggccct ggaagatggc ggatctgccc acggagtgtt tctgctgaac 720

tccaacgcca tggacgtggt gctgcagcct agccctgccc tgtcttggag aagcacaggc 780

ggcatcctgg atgtgtacat ctttctgggc cccgagccca agagcgtggt gcagcagtat 840

ctggatgtcg tgggctaccc cttcatgccc ccttactggg gcctgggatt ccacctgtgc 900

agatggggct actccagcac cgccatcacc agacaggtgg tggaaaacat gaccagagcc 960

cacttcccac tggatgtgca gtggaacgac ctggactaca tggacagcag acgggacttc 1020

accttcaaca aggacggctt ccgggacttc cccgccatgg tgcaggaact gcatcagggc 1080

ggcagacggt acatgatgat cgtggatccc gccatcagct cctctggccc tgccggctct 1140

tacagaccct acgacgaggg cctgcggaga ggcgtgttca tcaccaacga gacaggccag 1200

cccctgatcg gcaaagtgtg gcctggcagc acagccttcc ccgacttcac caatcctacc 1260

gccctggctt ggtgggagga catggtggcc gagttccacg accaggtgcc cttcgacggc 1320

atgtggatcg acatgaacga gcccagcaac ttcatccggg gcagcgagga tggctgcccc 1380

aacaacgaac tggaaaatcc cccttacgtg cccggcgtcg tgggcggaac actgcaggcc 1440

gctacaatct gtgccagcag ccaccagttt ctgagcaccc actacaacct gcacaacctg 1500

tacggcctga ccgaggccat tgccagccac cgcgctctcg tgaaagccag aggcacacgg 1560

cccttcgtga tcagcagaag cacctttgcc ggccacggca gatacgccgg acattggact 1620

ggcgacgtgt ggtcctcttg ggagcagctg gcctctagcg tgcccgagat cctgcagttc 1680

aatctgctgg gcgtgccact cgtgggcgcc gatgtgtgtg gcttcctggg caacacctcc 1740

gaggaactgt gtgtgcggtg gacacagctg ggcgccttct accctttcat gagaaaccac 1800

aacagcctgc tgagcctgcc ccaggaaccc tacagcttta gcgagcctgc acagcaggcc 1860

atgcggaagg ccctgacact gagatacgct ctgctgcccc acctgtacac cctgtttcac 1920

caggcccatg tggccggcga gacagtggcc agacctctgt ttctggaatt ccccaaggac 1980

agcagcacct ggaccgtgga ccatcagctg ctgtggggag aggctctgct gattacccca 2040

gtgctgcagg caggcaaggc cgaagtgacc ggctactttc ccctgggcac ttggtacgac 2100

ctgcagaccg tgcctgtgga agccctggga tctctgcctc cacctcctgc cgctcctaga 2160

gagcctgcca ttcactctga gggccagtgg gtcacactgc ctgcccccct ggataccatc 2220

aacgtgcacc tgagggccgg ctacatcata ccactgcagg gacctggcct gaccaccacc 2280

gagtctagac agcagccaat ggccctggcc gtggccctga ccaaaggcgg agaagctagg 2340

ggcgagctgt tctgggacga tggcgagagc ctggaagtgc tggaaagagg cgcctatacc 2400

caagtgatct tcctggcccg gaacaacacc atcgtgaacg agctggtgcg cgtgacctct 2460

gaaggcgctg gactgcagct gcagaaagtg accgtgctgg gagtggccac agcccctcag 2520

caggtgctgt ctaatggcgt gcccgtgtcc aacttcacct acagccccga caccaaggtg 2580

ctggacatct gcgtgtcact gctgatggga gagcagtttc tggtgtcctg gtgctga 2637

<210> 53

<211> 2637

<212> ДНК

<213> искусственная

<220>

<223> hGAAco2-дельта-47

<400> 53

ccaagagctg tgcctaccca atgcgacgtg ccacccaact cccgattcga ctgcgcgcca 60

gataaggcta ttacccaaga gcagtgtgaa gccagaggtt gctgctacat cccagcgaag 120

caaggattgc aaggcgccca aatgggacaa ccttggtgtt tcttcccccc ttcgtaccca 180

tcatataaac tcgaaaacct gtcctcttcg gaaatgggtt atactgccac cctcaccaga 240

actactccta ctttcttccc gaaagacatc ttgaccttga ggctggacgt gatgatggag 300

actgaaaacc ggctgcattt cactatcaaa gatcctgcca atcggcgata cgaggtccct 360

ctggaaaccc ctcacgtgca ctcacgggct ccttctccgc tttactccgt cgaattctct 420

gaggaaccct tcggagtgat cgttagacgc cagctggatg gtagagtgct gttgaacact 480

actgtggccc cacttttctt cgctgaccag tttctgcaac tgtccacttc cctgccatcc 540

cagtacatta ctggactcgc cgaacacctg tcgccactga tgctctcgac ctcttggact 600

agaatcactt tgtggaacag agacttggcc cctactccgg gagcaaatct gtacggaagc 660

cacccttttt acctggcgct cgaagatggc ggatccgctc acggagtgtt cctgctgaat 720

agcaacgcaa tggacgtggt gctgcaacct tcccctgcac tcagttggag aagtaccggg 780

ggtattctgg acgtgtacat cttcctcgga ccagaaccca agagcgtggt gcagcaatat 840

ctggacgtgg tcggataccc ttttatgcct ccttactggg gactgggatt ccacctttgc 900

cgttggggct actcatccac cgccattacc agacaggtgg tggagaatat gaccagagcc 960

cacttccctc tcgacgtgca gtggaacgat ctggactata tggactcccg gagagatttc 1020

accttcaaca aggacgggtt ccgcgatttt cccgcgatgg ttcaagagct ccaccagggt 1080

ggtcgaagat atatgatgat cgtcgaccca gccatttcga gcagcggacc cgctggatct 1140

tatagacctt acgacgaagg ccttaggaga ggagtgttca tcacaaacga gactggacag 1200

cctttgatcg gtaaagtgtg gcctggatca accgcctttc ctgactttac caatcccact 1260

gccttggctt ggtgggagga catggtggcc gaattccacg accaagtccc ctttgatgga 1320

atgtggatcg atatgaacga accaagcaat tttatcagag gttccgaaga cggttgcccc 1380

aacaacgaac tggaaaaccc tccttatgtg cccggagtcg tgggcggaac attacaggcc 1440

gcgactattt gcgccagcag ccaccaattc ctgtccactc actacaacct ccacaacctt 1500

tatggattaa ccgaagctat tgcaagtcac agggctctgg tgaaggctag agggactagg 1560

ccctttgtga tctcccgatc cacctttgcc ggacacggga gatacgccgg tcactggact 1620

ggtgacgtgt ggagctcatg ggaacaactg gcctcctccg tgccggaaat cttacagttc 1680

aaccttctgg gtgtccctct tgtcggagca gacgtgtgtg ggtttcttgg taacacctcc 1740

gaggaactgt gtgtgcgctg gactcaactg ggtgcattct acccattcat gagaaaccac 1800

aactccttgc tgtccctgcc acaagagccc tactcgttca gcgagcctgc acaacaggct 1860

atgcggaagg cactgaccct gagatacgcc ctgcttccac acttatacac tctcttccat 1920

caagcgcatg tggcaggaga aaccgttgca aggcctcttt tccttgaatt ccccaaggat 1980

tcctcgactt ggacggtgga tcatcagctg ctgtggggag aagctctgct gattactcca 2040

gtgttgcaag ccggaaaagc tgaggtgacc ggatactttc cgctgggaac ctggtacgac 2100

ctccagactg tccctgttga agcccttgga tcactgcctc cgcctccggc agctccacgc 2160

gaaccagcta tacattccga gggacagtgg gttacattac cagctcctct ggacacaatc 2220

aacgtccact taagagctgg ctacattatc cctctgcaag gaccaggact gactacgacc 2280

gagagcagac agcagccaat ggcactggct gtggctctga ccaagggagg ggaagctaga 2340

ggagaactct tctgggatga tggggagtcc cttgaagtgc tggaaagagg cgcttacact 2400

caagtcattt tccttgcacg gaacaacacc attgtgaacg aattggtgcg agtgaccagc 2460

gaaggagctg gacttcaact gcagaaggtc actgtgctcg gagtggctac cgctcctcag 2520

caagtgctgt cgaatggagt ccccgtgtca aactttacct actcccctga cactaaggtg 2580

ctcgacattt gcgtgtccct cctgatggga gagcagttcc ttgtgtcctg gtgttga 2637

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к терапевтическим векторам экспрессии, и может быть использовано в медицине для лечения болезни Помпе (GSDII) и болезни Кори (GSDIII). Предложен рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для экспрессии усеченного полипептида альфа-глюкозидазы (GAA). Изобретение обеспечивает экспрессию и секрецию вариантов GAA человека на более высоких уровнях по сравнению с белком GAA человека дикого типа, что обеспечивает усовершенствованную коррекцию патологического накопления гликогена по всему организму и индукцию иммунологической толерантности к GAA. 6 н. и 11 з.п. ф-лы, 1 табл., 10 ил., 1 пр.

1. Рекомбинантный вектор на основе аденоассоциированного вируса (AAV) для экспрессии усеченного полипептида альфа-глюкозидазы (GAA), содержащий экспрессирующую кассету для экспрессии полипептида GAA, при этом экспрессирующая кассета содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую усеченный полипептид GAA, содержащий делецию 1-43 последовательных аминокислот на его N-конце по сравнению с родительским полипептидом GAA, где указанный родительский полипептид соответствует форме предшественника полипептида GAA, свободной от ее сигнального пептида,

где указанный усеченный полипептид GAA дополнительно содержит сигнальный пептид, слитый с его N-концом, и

где указанный родительский полипептид GAA представляет собой полипептид GAA человека, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33.

2. Рекомбинантный AAV вектор по п. 1, где указанный усеченный полипептид GAA имеет 6, 7, 8, 9, 10, 40, 41, 42 или 43 последовательных аминокислот, удаленных на его N-конце, по сравнению с указанным родительским полипептидом GAA.

3. Рекомбинантный AAV вектор по п. 2, где указанный усеченный полипептид GAA имеет 8, 42 или 43 последовательных аминокислоты, удаленных на его N-конце, по сравнению с указанным родительским полипептидом GAA.

4. Рекомбинантный AAV вектор GAA по любому из пп. 1-3, где усеченный полипептид GAA имеет аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34 или SEQ ID NO: 35.

5. Рекомбинантный AAV вектор по любому из пп. 1-4, в котором указанный слитый сигнальный пептид выбирают из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3-7, в частности сигнальный пептид с SEQ ID NO: 3.

6. Рекомбинантный AAV вектор по любому из пп. 1-5, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая усеченный полипептид GAA, представляет собой нуклеотидную последовательность, оптимизированную для того, чтобы усовершенствовать экспрессию и/или иммунологическую толерантность для указанного усеченного полипептида GAA in vivo, при этом указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность нуклеиновой кислоты, приведенную в SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51.

7. Рекомбинантный AAV вектор по любому из пп. 1-6, где указанная молекула нуклеиновой кислоты функционально связана с промотором, в частности промотором, который представляет собой специфический промотор печени, предпочтительно выбранный из группы, состоящей из промотора α-1-антитрипсина (hAAT), промотора транстиретина, промотора альбумина и промотора тироксинсвязывающего глобулина (TBG), где указанная экспрессирующая кассета дополнительно необязательно содержит интрон, в частности интрон, выбранный из группы, состоящей из интрона β-глобина b2 человека (HBB2), интрона FIX, интрона β-глобина курицы и интрона SV40, где указанный интрон необязательно представляет собой модифицированный интрон, такой как модифицированный интрон HBB2 из SEQ ID NO: 17, модифицированный интрон FIX из SEQ ID NO: 19 или модифицированный интрон β-глобина курицы из SEQ ID NO: 21.

8. Рекомбинантный AAV вектор по п. 7, который содержит предпочтительно в этом порядке: энхансер; интрон; промотор, в частности специфический промотор печени; указанную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный усеченный полипептид GAA; и сигнал полиаденилирования, при этом экспрессирующая кассета содержит предпочтительно в этом порядке: управляющую область ApoE; интрон HBB2, в частности модифицированный интрон HBB2; промотор hAAT; указанную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую указанный усеченный полипептид GAA; и сигнал полиаденилирования бычьего гормона роста, при этом указанная экспрессирующая кассета более конкретно содержит нуклеотидную последовательность с любой из SEQ ID NO: 22-26.

9. Рекомбинантный AAV вектор по любому из пп. 1-8, который представляет собой одноцепочечный или двухцепочечный самокомплементарный AAV вектор, предпочтительно AAV вектор с происходящим из AAV капсидом, таким как капсид AAV1, AAV2, варианта AAV2, AAV3, варианта AAV3, AAV3B, варианта AAV3B, AAV4, AAV5, AAV6, варианта AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, например AAVcy10 и AAVrh10, AAVrh74, AAVdj, AAV-Anc80, AAV-LK03, AAV2i8 и AAV свиньи, например AAVpo4 и AAVpo6, или с химерным капсидом.

10. Рекомбинантный AAV вектор по п. 9, где AAV вектор имеет капсид AAV8, AAV9, AAVrh74 или AAV2i8, в частности капсид AAV8, AAV9 или AAVrh74, более конкретно капсид AAV8.

11. Рекомбинантный AAV вектор по п. 1, где указанная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный усеченный полипептид GAA, имеет около 70 процентов, около 80 процентов, около 90 процентов, около 95 процентов, около 97 процентов, около 98 процентов или около 99 процентов идентичности с нуклеотидами 82-2859 SEQ ID NO: 8; или имеет по меньшей мере 75 процентов, по меньшей мере 80 процентов или по меньшей мере 82 процента идентичности последовательности с соответствующей частью нуклеотидной последовательности, кодирующей SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 33; или имеет по меньшей мере 85 процентов, по меньшей мере 90 процентов, по меньшей мере 92 процента, по меньшей мере 95 процентов, по меньшей мере 98 процентов, по меньшей мере 99 процентов или 100 процентов идентичности с соответствующей частью нуклеотидной последовательности SEQ ID NO: 10 или SEQ ID NO: 11.

12. Рекомбинантный AAV вектор по п. 1, где указанный усеченный полипептид GAA имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 27, где указанный сигнальный пептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3 и где указанный рекомбинантный вектор AAV дополнительно содержит один или более из вариантов белков капсида VP, полученных из AAVrh74 или выбранных из группы, состоящей из RHM4-1, RHM15-1, RHM15-2, RHM15-3/RHM15-5, RHM15-4 и RHM15-6.

13. Клетка, трансформированная рекомбинантным AAV вектором по любому из пп. 1-12, для экспрессии усеченного полипептида GAA, где указанная клетка, в частности, представляет собой клетку печени или клетку мышцы.

14. Применение рекомбинантного AAV вектора по любому из пп. 1-12 или клетки по п. 13 в эффективном количестве в фармацевтической композиции с фармацевтически приемлемым носителем для лечения GSDII (болезни Помпе).

15. Применение рекомбинантного AAV вектора по любому из пп. 1-12 или клетки по п. 13 в эффективном количестве в фармацевтической композиции с фармацевтически приемлемым носителем для лечения GSDIII (болезни Кори).

16. Применение рекомбинантного AAV вектора по любому из пп. 1-12 или клетки по п. 13 для изготовления лекарственного средства для лечения GSDII (болезни Помпе).

17. Применение рекомбинантного AAV вектора по любому из пп. 1-12 или клетки по п. 13 для изготовления лекарственного средства для лечения GSDIII (болезни Кори).