Повышение тканеспецифической доставки генов путем модификации капсида Российский патент 2023 года по МПК C07K14/10 C12N15/86 A61K31/7088 A61K38/46 

Перекрестная ссылка на родственную заявку

Настоящая заявка в соответствии с 35 U.S.C. § 119 (e) претендует на приоритет по предварительной заявки на патент США № 62/644,317, поданной 16 марта 2018 г., содержание которой включено сюда посредством ссылки.

Заявление относительно правительственной поддержки

Данное изобретение было совершено при правительственной поддержке в рамках гранта № TR001068, предоставленного Национальным институтом здравоохранения. Правительство имеет определенные права на это изобретение.

Перечень последовательностей

Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и полностью включен сюда посредством ссылки. Данная ASCII-копия, созданная 26 февраля 2019 г., носит название 106887-7170_SL.txt и имеет размер 18 492 байта.

Уровень техники

Предпринимались попытки модифицировать капсиды AAV для улучшения доставки генов. Например, в WO 2017/165859A1 описана модификация вирусного капсида, при которой с капсидным белком вируса сливают или конъюгируют Cas9 для обеспечения настраиваемого редактирования генов. В других ссылках описаны перетасовки семейств ДНК (Grimm and Kay), замены лизина в AAVrh74 (US 2015/006556), мутации в положениях 195, 199, 201 или 202 AAVrh74 (US 9840719) и модификации AAVrh48 (EP 2359866). Еще в других ссылках подробно описаны библиотеки случайных пептидов, экспонированных на поверхности AAV (например, Muller (2003) Nat. Biotechnol.; Perabo (2003) Mol. Ther.; и 7,588,722 (Grimm and Kay))Методы генной терапии мышечных дистрофий требуют системной доставки генов к мышечным клеткам по всему организму. Наиболее эффективный способ доставки – использование системы кровообращения организма для распространения вируса в периферические мышечные клетки. Проблема системной доставки заключается в том, что большинство серотипов AAV имеют естественную склонность к инфицированию клеток печени [1]. В организме примерно в 20 раз больше клеток печени, чем мышечных клеток, через которые вирус должен пройти при системном введении [2]. Считается, что более 50% AAV-векторов остаются в печени после системного внутривенного введения.

В настоящее время более 50% вируса при системном введении теряется в печени, где терапевтический эффект обычно почти не реализуется [4]. При устранении попадания вектора в печень и повышении специфического связывания и трансдукции в мышцах можно значительно улучшить специфическую экспрессию генов в мышцах и терапевтическую пользу для пациентов при одновременном снижении потенциальных побочных эффектов. Сейчас при клинических испытаниях для лечения мышечной дистрофии Дюшена требуется введение высокого уровня вектора (>5E+12 векторных геномов на килограмм) для достижения терапевтического уровня экспрессии генов в мышцах. Для снижения “неприцельной” экспрессии генов применяются специфичные для мышц промоторы, но они практически не повышают общий уровень экспрессии генов. При повышении эффективности специфичной для мышц трансдукции может значительно снижаться общая доза, необходимая для достижения терапевтического эффекта.

Настоящее изобретение устраняет ограничения предшествующего уровня техники, а также обеспечивает связанные с этим преимущества.

Сущность изобретения

Заявителем предложен подход к увеличению системной доставки вектора в мышечные клетки, который заключается в уменьшении или устранении инфицирования клеток печени при циркуляции вируса. Заявитель предполагает, что модифицированные капсиды AAVrh74 будут нацелены на мышечные миобласты и сателлитные клетки более эффективно, чем немодифицированные векторы AAVrh74.

Настоящим изобретением предусмотрены модифицированные вирусные капсидные белки, которые включают или же в основном состоят или же состоят из капсидного белка вируса, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. Заявитель получил три мутанта. У одного из мутантов (AAVmut4, замена аспарагина на изолейцин в положении 502 капсида VP1) глобально повышается доставка генов во все исследованные ткани до в 56 раз большей (от 3 до 56 раз в зависимости от ткани) эффективности трансдукции. У другого мутанта (AAVmut5, замена триптофана на аргинин в положении 505 капсида VP1) повышается доставка гена в сердце почти в 50 раз по сравнению с AAVrh74. А третий мутант (AAV_YIG или AAV_YIGSR591) нацелен на рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, которые считаются мышечными стволовыми клетками, хотя тропизм сателлитных клеток еще не подтвержден по IHC-окрашиванию. В частности, исходя из знаний заявителя о кристаллических структурах AAV и α₇β₁-интегрина при создании AAV_YIG или AAV_YIGSR591, полагают, что он имеет большее сродство к скелетным мышцам и меньшее сродство к печени.

Не ограничиваясь теорией, заявителем предложены способы достижения терапевтического эффекта для пациента путем повышения эффективной дозы, достигающей целевой ткани типа сердца или мышц, без увеличения общей дозы для пациента. За счет снижения общей дозы, необходимой для достижения терапевтического эффекта, пациенту вводится меньше вирусных антигенов, что в идеале приводит к ослаблению иммунного ответа на вектор и повышению безопасности. Получение достаточного количества препарата для генной терапии при проведении клинических испытаний на поздних стадиях является серьезным препятствием для дальнейшей разработки. Снижение требуемой дозы для достижения терапевтического эффекта должно привести к снижению потребности в производстве, снижению затрат на производство, ускорению разработки клинических испытаний и увеличению возможности лечения большего количества пациентов.

Соответственно, настоящим изобретением предусмотрены модифицированные капсидные белки, выделенные полинуклеотиды, способы получения модифицированных капсидных белков, рекомбинантные вирусные частицы и рекомбинантные системы экспрессии для создания модифицированных вирусных частиц. В одном аспекте изобретения предусмотрены модифицированные вирусные капсидные белки, которые включают или же в основном состоят или же состоят из вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается на участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74.

Также предусмотрены выделенные полинуклеотиды, кодирующие модифицированные вирусные капсидные белки, которые включают или же в основном состоят или же состоят из вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74.

Предусмотрены и рекомбинантные вирусные частицы, которые включают или же в основном состоят или же состоят из модифицированного капсидного белка, который включает или же в основном состоит или же состоит из модифицированного вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74. В определенных аспектах рекомбинантные вирусные частицы содержат или же в основном состоят из 5 и более модифицированных капсидных белков на 1 вирусную частицу (и/или на каждый модифицированный вирусный капсид).

В других аспектах рекомбинантные вирусные частицы содержат или же в основном состоят из 1-5 модифицированных капсидных белков на 1 вирусную частицу (и/или на каждый модифицированный вирусный капсид). В следующих аспектах предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие вирусные капсидные белки, модифицированные путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот, описанных здесь. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74.

Также предусмотрены модифицированные капсиды, как изложено здесь, которые необязательно содержат трансген или систему CRISPR для модификации генов. Также предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие модифицированные капсиды, и векторы, кодирующие данные полинуклеотиды, а также комплементарные и эквивалентные им. В следующих аспектах предусмотрены клетки-хозяева, вырабатывающие вирусные частицы и/или содержащие приведенные здесь векторы. В следующих аспектах предусмотрены системы экспрессии для продукции приведенных здесь вирусных частиц.

Настоящим изобретением также предусмотрены композиции, содержащие носитель и одно или несколько из модифицированных капсидов, полинуклеотидов, векторов, плазмид, клеток-хозяев или систем экспрессии. Также предусмотрены наборы, содержащие одно или несколько из модифицированных капсидных белков, полинуклеотидов, векторов, плазмид, клеток-хозяев или систем экспрессии и инструкции по применению.

Также здесь предусмотрен способ лечения целевых заболеваний или дисфункциональных тканей у нуждающихся в этом субъектов, который включает или же в основном состоит или же состоит из введения субъектам эффективного количества рекомбинантных вирусных частиц, содержащих или же в основном состоящих или же состоящих из модифицированного капсидного белка, который содержит или же в основном состоит или же состоит из вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В других воплощениях эти вирусные частицы повышают эффективность доставки препарата от 3 до 56 раз для больной или дисфункциональной ткани по сравнению с AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В других воплощениях больная или дисфункциональная ткань представляет собой ткань сердца. В следующих воплощениях эти вирусные частицы повышают эффективность доставки препарата в ткани сердца в 50 и более раз по сравнению с AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74. В некоторых воплощениях вирусные частицы содержат эффективное количество препарата, подходящего для заболевания или дисфункциональной ткани. В некоторых воплощениях лечение представляет собой редактирование генов на основе CRISPR/Cas9.

Краткое описание фигур

На фиг. 1A-1E представлен структурный анализ капсидной библиотеки аденоассоциированного вируса серотипа 9 (AAV9). (a) Контурное изображение мономера субъединицы VP3 AAV9, полученное с помощью модели SWISS-MODEL, причем шаблоном служит кристаллическая структура AAV8 (pdb id: 2QA0). Петля GH, содержащая аминокислоты 390-627 (нумерация по VP1), выделена серым цветом. (b) Визуализация поверхности модели капсида AAV9 с 60 субъединицами VP3, созданная в системе координат икосаэдрической симметрии при T = 1 на VIPERdb. Участки петли GH из разных субъединиц VP3, окружающие икосаэдрическую пятеричную пору и пересекающиеся на оси симметрии третьего порядка, выделены серым цветом. (c) Эскиз тримера субъединицы VP3 AAV9, созданный на VIPERdb, с точечными мутациями 43 репрезентативных клонов из библиотеки AAV9, представленными серыми сферами. (d) Вид капсидного тримера сбоку (поворот на 90°), показывающий большинство точечных мутаций (серые сферы), сгруппированных на внешних петлях. (e) Сферическая проекция типа дорожной карты поверхностных остатков в области капсидного тримера. Выделенные красным цветом остатки представляют подмножество из десяти вариантов AAV9, содержащих измененные остатки, выступающие на поверхность капсида. Рисунок воспроизведен из Pulicherla et al. [7].

На фиг. 2 представлены FACS-сортируемые маркеры для выделения мышечных стволовых клеток. Рисунок воспроизведен из Wang et al. [13].

На фиг. 3 представлено биораспределение векторов мутантного AAVrh74. Самцам мышей CD-1 внутривенно вводили 10¹¹ Vg вируса AAVrh74 или двух мутантов капсида AAVrh74 с репортером lucEYFP, а через 3 недели отбирали ткани и анализировали на наличие геномных копий вектора методом кПЦР.

На фиг. 4 представлена визуализация люминесценции AAVmut4 и mut5 на живых животных. Взрослым мышам CD-1 через хвостовую вену вводили 10¹¹ Vg вируса AAVrh74 или AAVmut4, содержащего тот же люциферазный вектор. Через 3 недели после введения проводили визуализацию мышей на предмет экспрессии люциферазы. Проводили два отдельных эксперимента в одинаковых условиях. Exp. 1: одни и те же животные в A и B при количественной оценке фотонов по голове (A) либо при количественной оценке фотонов по ногам (B). Exp. 2 является повторением Exp. 1 с отдельными животными, проводившийся через 4 недели. Крайним слева животным в каждой группе из 4 вводили контрольный вирус AAVrh74, а следующим 3 животным из каждой группы вводили вирус AAVmut4.

На фиг. 5 представлена визуализация люминесценции AAV_YIG или AAV_YIGSR591 на живых животных. Взрослым мышам CD-1 через хвостовую вену вводили 10¹¹ Vg вируса AAV_YIG или AAV_YIGSR591, содержащего люциферазный вектор. Через 3 недели после введения проводили визуализацию мышей на предмет экспрессии люциферазы с подсчетом фотонов по всему телу, приведенным над каждой мышью в вентральном или дорзальном положении.

Раскрытие сущности изобретения

Далее будут более подробно описаны воплощения настоящего изобретения. Однако аспекты изобретения могут быть воплощены в различных формах и не должны рассматриваться как ограниченные изложенными здесь воплощениями. Скорее эти воплощения приводятся для того, чтобы данное описание было исчерпывающим и полным и полностью отражало объем изобретения для специалистов в данной области. Терминология, используемая в данном описании, предназначается только для описания конкретных воплощений, а не для ограничения.

Если не указано иначе, все используемые здесь термины (включая технические и научные термины) имеют такие же значения, которые обычно понятны специалистам в той области, к которой относится данное изобретение. Далее станет понятно, что термины типа тех, что определены в широко используемых словарях, следует интерпретировать как имеющие значения, которые согласуются с их значениями в контексте настоящей заявки и в соответствующей области, и не должны интерпретироваться в идеализированном или чрезмерно формальном смысле, если это прямо не определено здесь. Хотя эти термины и не определены прямо ниже, их следует толковать в соответствии с их общими значениями.

Терминология, используемая в данном описании, предназначается только для описания конкретных воплощений, а не для ограничения изобретения. Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, приведенные здесь, включены сюда путем ссылки во всей полноте.

При практическом применении настоящей технологии будут применяться, если не указано иначе, стандартные методы культивирования тканей, иммунологии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и рекомбинантной ДНК, которые находятся в компетенции специалистов в данной области.

Если из контекста не следует иное, в частности, предусматривается, что различные признаки изобретения, описанные здесь, могут применяться в любых комбинациях. Кроме того, изобретением также предусматривается, что в некоторых воплощениях могут быть исключены или опущены какие-либо особенности или комбинации признаков, изложенные здесь. Для примера, если в описании указано, что комплекс включает компоненты A, B и C, то конкретно подразумевается, что какие-либо из A, B или C либо их комбинации могут быть пропущены и исключены по отдельности или в любой комбинации.

Если прямо не указано иначе, все приведенные воплощения, признаки и термины должны охватывать как эти приведенные воплощения, признаки или термины, так и их биологические эквиваленты.

Все числовые обозначения, например, pH, температуры, времени, концентрации и молекулярной массы, включая диапазоны, являются приблизительными, они варьируются (+) или (-) с шагом 1,0 или 0,1, как наиболее целесообразно, или же варьируются на ± 15% или же на 10% или же на 5% или же на 2%. Следует иметь в виду, хотя это не всегда прямо указано, что всем числовым обозначениям предшествует термин “примерно”. Также следует иметь в виду, хотя это не всегда указано прямо, что описанные здесь реагенты приводятся просто для примера, а их эквиваленты известны в данной области.

По всему описанию различные публикации, патенты и опубликованные описания патентов приводятся по идентифицирующим ссылкам или по арабским цифрам. Полное цитирование публикаций, обозначенных арабскими цифрами, находится прямо перед формулой изобретения. Содержание этих публикаций, патентов и опубликованных описаний патентов настоящим включено путем ссылки в настоящее описание во всей полноте, чтобы более полно описать уровень техники в той области, к которой относится данное изобретение.

Определения

При практическом применении настоящей технологии будут применяться, если не указано иначе, стандартные методы органической химии, фармакологии, иммунологии, молекулярной биологии, микробиологии, клеточной биологии и рекомбинантной ДНК, которые находятся в компетенции специалистов в данной области. Например, см. Sambrook, Fritsch and Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd edition (1989); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., (1987)); серия Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.): PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames and G.R. Taylor, eds. (1995)); Harlow and Lane, eds. (1988) Antibodies, a Laboratory Manual; и Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1987)).

В описании изобретения и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа должны охватывать и формы множественного числа, если из контекста четко не следует иное.

В настоящем изобретении термин “включающий” означает то, что композиции и способы включают указанные элементы, но не исключают другие. В настоящем изобретении переходная фраза “состоящий в основном из” (и грамматические варианты) должна интерпретироваться как охватывающая указанные материалы или стадии, а также те, которые практически не влияют на основные и новые характеристики указанного воплощения. Таким образом, используемый здесь термин “состоящий в основном из” не следует интерпретировать как эквивалент “включающий”. “Состоящий из” должен означать исключение более чем следовых количеств других ингредиентов и существенных стадий способа введения приведенных здесь композиций. Аспекты, определенные каждым из этих переходных терминов, входят в объем настоящего изобретения.

Термин “примерно” в настоящем изобретении в отношении измеряемых величин типа количества или концентрации и т.п. должен охватывать вариации в 20%, 10%, 5%, 1%, 0,5% или даже 0,1% от указанного количества.

Термины “приемлемый”, “эффективный” или “достаточный” при использовании для описания выборки из любых компонентов, диапазонов, дозовых форм и т.п., приведенных здесь, означают, что указанный компонент, диапазон, дозовая форма и т.п. подходят для изложенной цели.

Также в настоящем изобретении “и/или” относится и охватывает любые и всевозможные комбинации одного или нескольких связанных перечисленных элементов, а также отсутствие комбинаций при интерпретации в виде альтернативы (“или”).

Термин “клетка” в настоящем изобретении может относиться к прокариотическим либо эукариотическим клеткам, необязательно полученным от субъекта или из коммерчески доступного источника.

“Эукариотические клетки” составляют все царства жизни, кроме Monera. Их легко отличить по ограниченному мембраной ядру. Животные, растения, грибы и простейшие – это эукариоты или организмы, клетки которых организованы в сложные структуры при помощи внутренних мембран и цитоскелета. Наиболее характерная ограниченная мембраной структура – ядро. Если не указано иначе, термин “хозяин” означает эукариотического хозяина, включая, к примеру, дрожжи, клетки высших растений, насекомых и млекопитающих. Неограничительные примеры эукариотических клеток или хозяев включают обезьян, быков, свиней, мышей, крыс, птиц, рептилий и человека, например, клетки HEK293 и клетки 293T.

“Прокариотические клетки”, которые обычно лишены ядра или каких-либо других ограниченных мембраной органелл, делятся на два домена: бактерии и археи. Помимо хромосомной ДНК, эти клетки также могут содержать генетическую информацию в виде кольцевой петли, называемой эписомой. Бактериальные клетки очень маленькие, размером примерно с митохондрию у животных (около 1-2 мкм в диаметре и 10 мкм в длину). Прокариотические клетки имеют три основные формы: палочковидные, сферические и спиральные. Вместо прохождения через сложные процессы репликации, как у эукариот, бактериальные клетки делятся путем бинарного деления. Примеры включают, без ограничения, бактерии Bacillus, бактерии E. coli и бактерии Salmonella.

Термин “кодировать” в применении к последовательностям нуклеиновой кислоты означает то, что полинуклеотид, как говорится, “кодирует” полипептид, если в своем естественном состоянии или при манипулировании методами, хорошо известными специалистам в данной области, он может транскрибироваться и/или транслироваться с образованием мРНК для полипептида и/или его фрагмента. Антисмысловая цепь комплементарна такой нуклеиновой кислоте и из неё может быть выведена кодирующая последовательность.

Термины “эквивалент” или “биологический эквивалент” применяются взаимозаменяемо в отношении определенных молекул, биологического или клеточного материала и означают, что таковые обладают минимальной гомологией, но при этом сохраняют требуемую структуру или функциональность. Неограничительные примеры эквивалентных полипептидов включают полипептиды, которые по меньшей мере на 60% или же на 65% или же на 70% или же на 75% или же на 80% или же на 85% или же на 90% или же на 95% идентичны им или полипептидным последовательностям или полипептидам, которые кодируются полинуклеотидом или его комплементом, гибридизующимся в условиях высокой жесткости с полинуклеотидом, кодирующим такие полипептидные последовательности. Условия высокой жесткости описаны здесь и включены сюда в качестве ссылки. С другой стороны, эквивалентным является полипептид, кодируемый таким полинуклеотидом или его комплементом, который по меньшей мере на 70% или же на 75% или же на 80% или же на 85% или же на 90% или же на 95% или же на 97% идентичен эталонному полинуклеотиду, например, полинуклеотиду дикого типа.

Неограничительные примеры эквивалентных полипептидов включают такие полинуклеотиды, которые по меньшей мере на 60% или же на 65% или же на 70% или же на 75% или же на 80% или же на 85% или же на 90% или же на 95% или же на 97% идентичны эталонному полинуклеотиду. Эквивалент также означает такой полинуклеотид или его комплемент, который гибридизуется в условиях высокой жесткости с эталонным полинуклеотидом.

Полинуклеотид или участок полинуклеотида (либо полипептид или участок полипептида) с определенной степенью (к примеру, на 80%, 85%, 90% или 95%) “идентичности последовательности” с другой последовательностью означает то, что при выравнивании этот процент оснований (или аминокислот) совпадает при сравнении двух последовательностей. Совмещение и степень гомологичности или идентичности последовательностей можно определить с помощью программ, известных в данной области, к примеру, описанных в Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1987), Supplement 30, section 7.7.18, table 7.7.1. В некоторых воплощениях для выравнивания используются параметры по умолчанию. Неограничительным примером программы для выравнивания является BLAST с параметрами по умолчанию. В частности, типичные программы включают BLASTN и BLASTP со следующими параметрами по умолчанию: генетический код = стандартный; фильтр = нет; цепь = обе; отсечка = 60; ожидание = 10; матрица = BLOSUM62; описания = 50 последовательностей; сортировать по = высокая оценка; базы данных = неизбыточные, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS-трансляции + SwissProtein + SPupdate + PIR. Подробную информацию об этих программах можно найти по следующему адресу в Интернете: ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST. Идентичность последовательностей и процент идентичности можно определить, отсылая их в clustalW (доступно по веб-адресу: genome.jp/tools/clustalw/, последний доступ 13 января 2017 г.).

“Гомология” или “идентичность” или “сходство” обозначает сходство последовательностей между двумя пептидами или между двумя молекулами нуклеиновых кислот. Гомологию можно определить путем сравнения положений в каждой последовательности, которые нужно выровнять в целях сравнения. Когда одно положение в сравниваемых последовательностях занято одним и тем же основанием или аминокислотой, то молекулы гомологичны в этом положении. Степень гомологичночти между последовательностями является функцией количества совпадающих или гомологичных положений, общих для этих последовательностей. “Неродственная” или “негомологичная” последовательность идентична менее чем на 40% или же менее чем на 25% с одной из последовательностей настоящего изобретения.

“Гомология”, “идентичность” или “сходство” также может относиться к двум молекулам нуклеиновой кислоты, которые гибридизуются в жестких условиях.

“Гибридизация” означает такую реакцию, в которой один или несколько полинуклеотидов реагируют с образованием комплекса, который стабилизируется за счет водородной связи между основаниями нуклеотидов. Водородная связь может возникать за счет спаривания оснований Уотсона-Крика, связывания по Hoogstein или любым другим специфичным для последовательности способом. Комплекс может включать две цепи, образующие дуплексную структуру, три и более цепей, образующих многоцепочечный комплекс, одну самогибридизирующуюся цепь или любые их комбинации. Реакция гибридизации может составлять стадию более обширного процесса типа инициации реакции ПЦР или ферментативного расщепления полинуклеотида рибозимом.

Примеры жестких условий гибридизации включают: температура инкубации от 25°C до 37°C; концентрация гибридизационного буфера от 6×SSC до 10×SSC; концентрация формамида от 0% до 25%; и промывочный раствор от 4×SSC до 8×SSC. Примеры умеренных условий гибридизации включают: температура инкубации от 40°C до 50°C; концентрация буфера от 9×SSC до 2×SSC; концентрация формамида от 30% до 50%; и промывочный раствор от 5×SSC до 2×SSC. Примеры условий высокой жесткости включают: температура инкубации от 55°C до 68°C; концентрация буфера от 1×SSC до 0,1×SSC; концентрация формамида от 55% до 75%; и промывочный раствор 1×SSC, 0,1×SSC или деионизированная вода. Как правило, время инкубации при гибридизации составляет от 5 мин до 24 часов с 1, 2 и более стадиями промывки, а время инкубации при промывании составляет 1, 2 или 15 мин. SSC = 0,15 М NaCl и 15 мМ цитратный буфер. Предполагается, что можно использовать эквиваленты SSC с другими буферными системами.

В настоящем изобретении термин “экспрессия” обозначает процесс, при котором полинуклеотиды транскрибируются в мРНК, и/или процесс, при котором транскрибированная мРНК впоследствии транслируется в пептиды, полипептиды или белки. Если полинуклеотид получен из геномной ДНК, то экспрессия может включать сплайсинг мРНК в эукариотических клетках.

Термин “выделенный” в настоящем изобретении относится к таким молекулам, биологическим или клеточным материалам, которые практически не содержат других материалов.

В настоящем изобретении термин “функциональный” может применяться при определении любых молекул, биологических или клеточных материалов для обозначения того, что они выполняют определенное конкретное действие.

В настоящем изобретении термины “последовательность нуклеиновой кислоты” и “полинуклеотид” применяются взаимозаменяемо для обозначения полимерных форм нуклеотидов любой длины, будь то рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. Так, этот термин включает, без ограничения, одно-, двух- или многоцепочечную ДНК или РНК, геномную ДНК, кДНК, гибриды ДНК-РНК или полимеры, содержащие пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически или биохимически модифицированные, неприродные или дериватизированные основания нуклеотидов.

Термины “белок”, “пептид” и “полипептид” применяются взаимозаменяемо и в самом широком смысле для обозначения соединений из двух или нескольких субъединиц из аминокислот, аналогов аминокислот или пептидомиметиков. Субъединицы могут соединяться пептидными связями. В другом аспекте субъединицы могут соединяться другими связями, например, сложноэфирными, эфирными и т.п. Белок или пептид должен содержать по крайней мере две аминокислоты, причем не налагается никаких ограничений на максимальное количество аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. В настоящем изобретении термин “аминокислота” относится к природным и/или неприродным либо к синтетическим аминокислотам, включая глицин и оптические D- и L-изомеры, аналоги аминокислот и пептидомиметики.

В настоящем изобретении термин “рекомбинантная система экспрессии” относится к генетической конструкции или конструкциям для экспрессии определенного генетического материала, образующегося при рекомбинации.

“Носитель для доставки генов” определяется как любая молекула, которая может нести встроенные полинуклеотиды в клетку-хозяина. Примерами носителей для доставки генов являются липосомы, мицеллы, биосовместимые полимеры, включая природные полимеры и синтетические полимеры; липопротеины; полипептиды; полисахариды; липополисахариды; искусственные вирусные оболочки; металлические частицы; и бактерии или вирусы, как-то бакуловирусы, аденовирусы и ретровирусы, бактериофаги, космиды, плазмиды, грибковые векторы и другие носители для рекомбинации, обычно используемые в данной области, которые были описаны для экспрессии в различных эукариотических и прокариотических хозяевах и могут применяться для генной терапии, а также просто для экспрессии белков.

Приведенные здесь полинуклеотиды могут быть доставлены в клетки или ткани с помощью носителя для доставки генов. Термины “доставка генов”, “перенос генов”, “трансдукция” и подобные в настоящем изобретении относятся к введению экзогенных полинуклеотидов (иногда называемых “трансгенами”) в клетки-хозяева, независимо от метода, используемого для введения. К таким методам относятся различные хорошо известные методы типа опосредованного вектором переноса генов (например, посредством вирусной инфекции/трансфекции или различных других комплексов доставки генов на основе белков или липидов), а также методы, способствующие введению “голых” полинуклеотидов (типа электропорации, метода “генной пушки” и различных других методов, используемых для введения полинуклеотидов). Введенные полинуклеотиды могут оставаться в клетка-хозяевах стабильно или кратковременно. Стабильное содержание обычно требует, чтобы введенный полинуклеотид либо содержал начало репликации, совместимое с клетками-хозяевами, либо встраивался в репликон клетки-хозяина типа внехромосомного репликона (например, плазмиды) либо ядерной или митохондриальной хромосомы. Известен целый ряд векторов, способных опосредовать перенос генов в клетки млекопитающих, как это известно в данной области и описано здесь.

“Плазмида” представляет собой молекулу внехромосомной ДНК, отдельную от хромосомной ДНК, которая способна реплицироваться независимо от хромосомной ДНК. Во многих случаях она бывает круглой и двухцепочечной. Плазмиды обеспечивают механизм горизонтального переноса генов в популяции микроорганизмов и обычно дают селективное преимущество при данном состоянии окружающей среды. Плазмиды могут нести гены, обеспечивающие устойчивость к природным антибиотикам в конкурентной экологической нише, или же продуцируемые белки могут действовать как токсины при аналогичных обстоятельствах.

“Плазмиды”, используемые в генной инженерии, называются “плазмидными векторами”. Многие плазмиды коммерчески доступны для такого применения. Реплицируемый ген вставляется в копии плазмиды, содержащей гены, которые делают клетки устойчивыми к определенным антибиотикам, и сайт множественного клонирования (MCS, или полилинкер), который представляет собой короткий участок, содержащий несколько широко используемых рестрикционных сайтов, позволяющих легко встраивать фрагменты ДНК в этом месте. Другое важное применение плазмид – получение белков в большом количестве. В этом случае исследователи выращивают бактерии, содержащие плазмиду, несущую представляющий интерес ген. Так же, как бактерии вырабатывают белки, придающие им устойчивость к антибиотикам, их можно заставить вырабатывать и большое количество белка из встроенного гена.

“Искусственная дрожжевая хромосома” или “YAC” означает вектор, который применяется для клонирования больших фрагментов ДНК (размером более 100 т.н. и до 3000 т.н.). Это искусственно созданная хромосома, которая содержит последовательности теломер, центромер и начала репликации, необходимые для репликации и сохранности в дрожжевых клетках. Построенные на основе исходной кольцевой плазмиды, они подвергаются линеаризации при помощи рестрикционных ферментов, а затем ДНК-лигаза вставляет нужную последовательность или ген в линейную молекулу по “липким” концам. Такие дрожжевые экспрессирующие векторы, как YACs, YIPs (дрожжевые встраивающиеся плазмиды) и YEPs (дрожжевые эписомальные плазмиды), чрезвычайно полезны, так как можно получить препараты эукариотических белков с посттрансляционными модификациями, поскольку дрожжи сами являются эукариотическими клетками, однако оказалось, что YACs менее стабильны, чем BACs, и дают эффект химеры.

“Вирусный вектор” определяется как полученный рекомбинантно вирус или вирусная частица, которая содержит полинуклеотид для доставки в клетки-хозяева in vivo, ex vivo или in vitro.

Примеры вирусных векторов включают ретровирусные векторы, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, альфавирусные векторы и др. Векторы на основе инфекционного вируса мозаики табака (TMV) могут применяться для получения белков и сообщалось, что они экспрессируют гриффитсин в листьях табака (O’Keefe et al. (2009) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 106(15):6099-6104). Также для применения в генной терапии и иммунотерапии были разработаны альфавирусные векторы типа векторов на основе вируса Semliki Forest и векторы на основе вируса Sindbis. См. Schlesinger & Dubensky (1999) Curr. Opin. Biotechnol. 5:434-439; и Ying et al. (1999) Nat. Med. 5(7):823-827. В тех аспектах, где перенос генов опосредуется ретровирусным вектором, векторная конструкция означает полинуклеотид, содержащий ретровирусный геном или его часть и терапевтический ген. Дополнительные подробности насчет современных способов применения векторов для переноса генов можно найти, к примеру, в Kotterman et al. (2015) Viral Vectors for Gene Therapy: Translational and Clinical Outlook, Annual Review of Biomedical Engineering, 17.

В настоящем изобретении “опосредованный ретровирусами перенос гена” или “ретровирусная трансдукция” имеют одно и то же значение и относятся к процессу, при котором последовательность гена или нуклеиновой кислоты стабильно переносится в клетки-хозяева за счет проникновения вируса в клетки и встраивания своего генома в геном клетки-хозяина. Вирус может проникать в клетки-хозяева по своему обычному механизму инфицирования или может быть модифицирован с тем, чтобы он связывался с другим рецептором или лигандом на поверхности клетки-хозяина для проникновения в клетки. В настоящем изобретении “ретровирусный вектор” обозначает вирусные частицы, способные вводить экзогенную нуклеиновую кислоту в клетки по вирусному или вирусоподобному механизму проникновения.

Ретровирусы несут свою генетическую информацию в виде РНК; однако, как только вирус инфицирует клетку, РНК подвергается обратной транскрипции в форму ДНК, которая встраивается в геномную ДНК инфицированной клетки. Встроенная форма ДНК называется провирусом.

В тех аспектах, где перенос генов опосредуется ДНК-вирусным вектором типа аденовируса (Ad) или аденоассоциированного вируса (AAV), векторная конструкция означает полинуклеотид, содержащий вирусный геном или его часть и трансген. Аденовирусы (Ads) – это относительно хорошо изученная однородная группа вирусов, включающая более 50 серотипов. Ads не требуется встраивание в геном клеток-хозяев. Также были созданы рекомбинантные векторы на основе Ads, в частности такие, у которых понижена способность к рекомбинации и образованию вируса дикого типа. Такие векторы коммерчески доступны из таких источников, как Takara Bio USA (Mountain View, CA), Vector Biolabs (Philadelphia, PA) и Creative Biogene (Shirley, NY). AAV дикого типа обладают высокой инфективностью и специфичностью при встраивании в геном клеток -хозяина. См. Wold and Toth (2013) Curr. Gene Ther. 13(6):421-433; Hermonat & Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; и Lebkowski et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:3988-3996.

Векторы, содержащие и промотор, и сайт клонирования, в который может функционально встраиваться полинуклеотид, хорошо известны в данной области. Такие векторы способны транскрибировать РНК in vitro или in vivo и коммерчески доступны из таких источников, как Agilent Technologies (Santa Clara, Calif.) и Promega Biotech (Madison, Wis.). Для оптимизации экспрессии и/или транскрипции in vitro может потребоваться удаление, добавление или изменение 5′- и/или 3′-нетранслируемых частей клонов с тем, чтобы удалить излишние, потенциально неподходящие альтернативные кодоны инициации трансляции или другие последовательности, которые могут помешать экспрессии или ослаблять её на уровне транскрипции или трансляции. С другой стороны, для усиления экспрессии можно вставлять консенсусные сайты связывания рибосом непосредственно 5′ от старт-кодона.

Носители для доставки генов также включают комплексы ДНК/липосомы, мицеллы и целевые комплексы вирусный белок-ДНК. Липосомы, которые также содержат наводящее антитело или его фрагмент, можно использовать в изложенных здесь способах. Наряду с доставкой полинуклеотидов в клетки или популяции клеток, может проводиться прямое введение описанных здесь белков в клетки или популяции клеток, без ограничения, методом трансфекции белков, альтернативно в условиях культивирования, которые могут усиливать экспрессию и/или способствовать активности описанных здесь белков, а также другими методами, без ограничения.

В настоящем изобретении термин “вирусный капсид” или “капсид” относится к белковой оболочке или покрытию вирусных частиц. Функции капсидов заключаются в инкапсидировании, защите, транспортировке и высвобождении вирусного генома в клетки-хозяева. Капсиды обычно состоят из олигомерных структурных субъединиц белка (“капсидных белков”). В настоящем изобретении термин “инкапсидированный” означает заключенный внутри вирусного капсида.

В настоящем изобретении термин “хелпер” по отношению к вирусам или плазмидам означает такие вирусы или плазмиды, которые обеспечивают дополнительные компоненты, необходимые для репликации и упаковки вирусных частиц или рекомбинантных вирусных частиц типа описанных здесь модифицированных AAV. Компоненты, кодируемые вирусом-хелпером, могут включать любые гены, необходимые для сборки, инкапсидации, репликации генома и/или упаковки вириона. Например, хелперный вирус может кодировать ферменты, необходимые для репликации вирусного генома. Неограничительные примеры хелперных вирусов и плазмид, подходящих для применения с AAV-конструкциями, включают pHELP (плазмиды), аденовирусы (вирусы) или герпесвирусы (вирусы).

В настоящем изобретении термин “AAV” представляет собой стандартное сокращение для аденоассоциированных вирусов. Аденоассоциированные вирусы – это парвовирусы с одноцепочечной ДНК, которые растут только в клетках, в которых определенные функции выполняются сопутствующим хелперным вирусом. Общая информация и обзоры по AAV приведены, к примеру, в Carter, 1989, Handbook of Parvoviruses, Vol. 1, pp. 169-228; и Berns, 1990, Virology, pp. 1743-1764, Raven Press (New York). Полностью ожидается, что те же принципы, описанные в этих обзорах, будут применимы к другим серотипам AAV, охарактеризованным после дат публикации обзоров, поскольку хорошо известно, что различные серотипы весьма близкородственны, как по структуре, так и по функции, даже на генетическом уровне (например, см. Blacklowe, 1988, pp. 165-174 in Parvoviruses and Human Disease, J. R. Pattison, ed.; и Rose, Comprehensive Virology 3: 1-61 (1974)). Например, все серотипы AAV явно проявляют очень близкие свойства репликации, опосредованные гомологичными генами rep; и все они несут три родственных капсидных белка типа экспрессируемых в AAV2. Степень родства также подтверждается гетеродуплексным анализом, который выявляет обширную кросс-гибридизацию между серотипами по всей длине генома; и наличие аналогичных сегментов самоотжига на концах, которые соответствуют “инвертированным концевым повторам” (ITR). Сходные профили инфективности также предполагают, что функции репликации у каждого серотипа находятся под аналогичным регуляторным контролем.

“AAV-вектор” в настоящем изобретении означает вектор, содержащий один или несколько представляющих интерес полинуклеотидов (или трансгенов), фланкированных последовательностями концевых повторов (ITR) AAV. Такие AAV-векторы могут реплицироваться и упаковываться в инфекционные вирусные частицы, если они находятся в клетках-хозяевах, которые были трансфецированы вектором, кодирующим и экспрессирующим продукты генов rep и cap.

“Вирионы AAV” или “вирусные частицы AAV” или “векторные частицы AAV” обозначают вирусные частицы, состоящие по меньшей мере из одного капсидного белка AAV и инкапсидированного полинуклеотидного AAV-вектора. Если частицы содержат гетерологичный полинуклеотид (т.е. полинуклеотид, отличный от генома AAV дикого типа, типа трансгена для введения в клетки млекопитающих), то их обычно называют “векторными частицами AAV” или просто “AAV-вектором”. Таким образом, получение векторных частиц AAV обязательно включает получение AAV-вектора, поскольку такой вектор содержится в векторных частицах AAV.

Аденоассоциированный вирус (AAV) представляет собой дефектный по репликации парвовирус, геном которого в виде одноцепочечной ДНК составляет около 4,7 т.н., включая два инвертированных концевых повтора (ITR) по 145 нуклеотидов. Существует несколько серотипов AAV. Известны нуклеотидные последовательности генома серотипов AAV. Например, полный геном AAV-1 представлен в GenBank Accession No. NC_002077; полный геном AAV-2 представлен в GenBank Accession No. NC_001401 и Srivastava et al., J. Virol., 45: 555-564 (1983); полный геном AAV-3 представлен в GenBank Accession No. NC_1829; полный геном AAV-4 представлен в GenBank Accession No. NC_001829; геном AAV-5 представлен в GenBank Accession No. AF085716; полный геном AAV-6 представлен в GenBank Accession No. NC_00 1862; по меньшей мере части геномов AAV-7 и AAV-8 представлены в GenBank Accession Nos. AX753246 и AX753249, соответственно; геном AAV-9 представлен в Gao et al., J. Virol., 78: 6381-6388 (2004); геном AAV-10 представлен в Mol. Ther., 13(1): 67-76 (2006); а геном AAV-11 представлен в Virology, 330 (2): 375-383 (2004). Последовательность генома AAV rh.74 представлена в патенте США № 9,434,928, включенном сюда путем ссылки. Цис-действующие последовательности, управляющие репликацией (rep) вирусной ДНК, инкапсидацией/упаковкой и встраиванием в хромосомы клеток-хозяев, содержатся в ITRs AAV. Три промотора AAV (названные p5, p19 и p40 по их относительному расположению на карте) управляют экспрессией двух внутренних открытых рамок считывания AAV, кодирующих гены rep и cap. Два промотора rep (p5 и p19) в сочетании с дифференциальным сплайсингом одного интрона AAV (по нуклеотидам 2107 и 2227) приводят к продукции четырех белков rep (78, rep 68, rep 52 и rep 40) из гена rep. Белки rep обладают несколькими ферментативными свойствами, которые в конечном итоге отвечают за репликацию вирусного генома. Ген cap экспрессируется из промотора p40 и кодирует три капсидных белка VP1, VP2 и VP3. Альтернативный сплайсинг и неконсенсусные сайты запуска трансляции отвечают за продукцию трех родственных капсидных белков. Единый консенсусный сайт полиаденилирования располагается в положении 95 на карте генома AAV. Жизненный цикл и генетика AAV описаны в Muzyczka, Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 97-129 (1992).

AAV обладает уникальными свойствами, которые делают его привлекательным в качестве вектора для доставки чужеродной ДНК в клетки, например, в генной терапии. Инфицирование AAV клеток в культуре не является цитопатическим, а естественное инфицирование людей и других животных протекает незаметно и бессимптомно. Кроме того, AAV инфицирует многие клетки млекопитающих, что дает возможность воздействовать на многие разные ткани in vivo. Более того, AAV трансдуцирует медленно делящиеся и неделящиеся клетки и может сохраняться практически в течение всей жизни этих клеток в виде транскрипционно активной ядерной эписомы (внехромосомного элемента). Провирусный геном AAV вставляется в плазмиды в виде клонированной ДНК, что делает возможным создание рекомбинантных геномов. Кроме того, поскольку сигналы, управляющие репликацией AAV и инкапсидацией генома, содержатся в ITR генома AAV, то часть или все примерно 4,3 т.н. внутреннего генома (кодирующие репликацию и структурные белки капсида, rep-cap) могут быть заменены на чужеродную ДНК. Для создания AAV-векторов белки rep и cap могут быть представлены in trans. Другая важная особенность AAV состоит в том, что это чрезвычайно стабильный и «крепкий» вирус. Он легко выдерживает условия, которые используются для инактивации аденовирусов (от 56° до 65°C в течение нескольких часов), что делает хранение AAV на холоде менее критичным. AAV даже можно лиофилизировать. Наконец, инфицированные AAV клетки не устойчивы к суперинфекции.

Многочисленные исследования продемонстрировали долгосрочную (>1,5 лет) опосредованную AAV экспрессию рекомбинантных белков в мышцах. См. Clark et al., Hum Gene Ther., 8: 659-669 (1997); Kessler et al., Proc Nat. Acad. Sci. USA, 93: 14082-14087 (1996); и Xiao et al., J Virol, 70: 8098-8108 (1996). Также см. Chao et al., Mol Ther., 2:619-623 (2000); и Chao et al., Mol Ther., 4:217-222 (2001). Кроме того, поскольку мышцы сильно васкуляризованы, то рекомбинантная трансдукция AAV приводила к появлению трансгенных продуктов в системном кровотоке после внутримышечного введения, как описано в Herzog et al., Proc Natl Acad Sci. USA, 94: 5804-5809 (1997); и Murphy et al., Proc Natl Acad Sci. USA, 94: 13921-13926 (1997). Более того, Lewis et al., J Virol, 76: 8769-8775 (2002) показали, что скелетные миофибриллы обладают необходимыми клеточными факторами для правильного гликозилирования, фолдинга и секреции антител, указывая на то, что мышцы способны к стабильной экспрессии секретируемых терапевтических белков. Рекомбинантные геномы AAV (rAAV) по изобретению содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую γ-саркогликан (например, SEQ ID NO: 1), и один или несколько ITR AAV, фланкирующих молекулу нуклеиновой кислоты. ДНК AAV в геномах rAAV может быть из любого серотипа AAV, из которого может быть получен рекомбинантный вирус, включая, без ограничения, серотипы AAV: AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, AAV-11, AAV-12, AAV-13 и AAV rh74. Получение псевдотипированного rAAV описано, к примеру, в WO 01/83692. Также предусмотрены и другие типы вариантов rAAV, к примеру, rAAV с мутациями капсида. Например, см. Marsic et al., Molecular Therapy, 22(11): 1900-1909 (2014). Нуклеотидные последовательности геномов различных серотипов AAV известны в данной области.

Термин “Cas9” относится к CRISPR-ассоциированной эндонуклеазе, известной под этим названием. Предусмотрены, без ограничения, типичные Cas9, например, Cas9, представленная в UniProtKB G3ECR1 (CAS9_STRTR), или Cas9 Staphylococcus aureus, а также Cas9 лишенный нуклеазной активности, ортологи и биологические эквиваленты каждой из них. Ортологи включают, без ограничения, Cas9 Streptococcus pyogenes (“spCas9”); Cas 9 из Streptococcus thermophiles, Legionella pneumophilia, Neisseria lactamica, Neisseria meningitides, Francisella novicida; и Cpf1 (которая выполняет функции разрезания, аналогичные Cas9) из различных видов бактерий, включая Acidaminococcus spp. и Francisella novicida U112.

В настоящем изобретении термин “CRISPR” обозначает методику специфичной к последовательности генетической манипуляции на основе пути коротких палиндромных повторов, регулярно расположенных группами. CRISPR может применяться для редактирования и/или регуляции генов, а также просто для наведения белков на определенное место в геноме. Редактирование генов означает такой тип генной инженерии, при котором нуклеотидная последовательность целевого полинуклеотида изменяется путем введения делеций, инсерций или замен оснований в последовательность полинуклеотида. В некоторых аспектах при опосредованном CRISPR редактировании генов используются пути негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологической рекомбинации для выполнения редактирования. Регуляция генов означает повышение или снижение продукции определенных генных продуктов типа белка или РНК.

Термин “гРНК” или “направляющаяРНК” в настоящем изобретении относится к последовательностям направляющей РНК, используемым для наведения на определенные гены для коррекции по методике CRISPR. Методы составления гРНК и терапевтических полинуклеотидов-доноров по специфичности к мишени хорошо известны в данной области. К примеру, Doench J. et al., Nature Biotechnology 2014, 32(12):1262-7; Mohr S. et al. (2016) FEBS Journal 283: 3232-38; и Graham D. et al., Genome Biol. 2015, 16:260. гРНК включает или же в основном состоит или же состоит из слитого полинуклеотида, содержащего РНК CRISPR (crRNA) и трансактивирующую РНК CRIPSPR (tracrRNA); или полинуклеотида, содержащего РНК CRISPR (crRNA) и трансактивирующую РНК CRIPSPR (tracrRNA). В некоторых аспектах гРНК является синтетической (Kelley M. et al. (2016) J of Biotechnology 233 (2016) 74-83). В настоящем изобретении биологические эквиваленты гРНК включают, без ограничения, полинуклеотиды или наводящие молекулы, которые могут направлять Cas9 или её эквивалент к определенной нуклеотидной последовательности типа конкретной области генома клетки.

“Композиция” служит для обозначения комбинации активного полипептида, полинуклеотида или антитела с другими соединениями или композициями, инертными (например, детектируемая метка) или активными (например, носитель для доставки генов).

“Фармацевтическая композиция” служит для обозначения комбинации активного полипептида, полинуклеотида или антитела с носителем, инертным или активным, типа твердой подложки, что делает композицию пригодной для диагностического или терапевтического применения in vitro, in vivo или ex vivo.

В настоящем изобретении термин “фармацевтически приемлемый носитель” охватывает любые стандартные фармацевтические носители, как-то физраствор с фосфатным буфером, вода и эмульсии типа эмульсий масло в воде или вода в масле, а также различные типы смачивающих веществ. Композиции также могут включать стабилизаторы и консерванты. Насчет примеров носителей, стабилизаторов и адъювантов см. Martin (1975) Remington’s Pharm. Sci., 15^th Ed. (Mack Publ. Co., Easton).

“Субъектами” диагностики или лечения являются клетки или животные типа млекопитающих или человека. Субъекты не ограничиваются конкретными видами и включают животных, помимо человека, подлежащих диагностике или лечению, а также животных, подверженных инфекциям, или модельных животных, к примеру, обезьян, крыс, мышей, шиншилл, собак, кроликов, домашний скот, спортивных животных и комнатных животных. Этот термин охватывает и больных людей.

Термин “ткань” применяется здесь для обозначения тканей живых или умерших организмов либо тканей, полученных из или предназначенных для имитации живых или умерших организмов. Ткань может быть здоровой, больной и/или иметь генетические мутации. Биологическая ткань может включать в себя любую отдельную ткань (например, совокупность клеток, которые могут быть связаны между собой) или группу тканей, составляющих орган, часть тела или отдел организма. Ткань может содержать однородный клеточный материал или может быть составной структурой типа тканей в отделах тела, включая грудную клетку, которая, к примеру, может включать в себя легочную ткань, скелетную ткань и/или мышечную ткань. Примеры тканей включают, без ограничения, ткани, происходящие из печени, легких, щитовидной железы, кожи, поджелудочной железы, кровеносных сосудов, мочевого пузыря, почек, мозга, желчных протоков, двенадцатиперстной кишки, брюшной аорты, подвздошной вены, сердца и кишечника, включая любые их комбинации.

В настоящем изобретении “лечить” или “лечение” заболевания у субъекта означает: (1) предотвращение появления симптомов или заболевания у субъекта, который предрасположен или еще не проявляет симптомов заболевания; (2) подавление заболевания или остановку его развития; либо (3) ослабление или регресс заболевания или симптомов заболевания. Как понимается в данной области, “лечение” представляет собой подход для получения полезных или требуемых результатов, в том числе клинических результатов. Для целей представленной технологии полезные или требуемые результаты могут включать одно или несколько, без ограничения: ослабление или улучшение одного или нескольких симптомов, уменьшение тяжести заболевания (в том числе болезни), стабилизацию (т.е. не ухудшение) заболевания (в том числе болезни), отсрочку или замедление прогрессирования заболевания (в том числе болезни), облегчение или временное ослабление заболевания (в том числе болезни) и состояние ремиссии (частичной или полной), явное или неявное.

Способы осуществления изобретения

Модифицированные вирусные капсиды и способы их получения

Доставка AAV-векторов в настоящее время основывается на выборе серотипа для наведения на ткани на основе естественного тропизма вируса или путем введения напрямую в ткани-мишени. Если для достижения максимального терапевтического эффекта требуется системная доставка, то выбор серотипа является единственным доступным вариантом для наведения на ткань в сочетании с тканеспецифическими промоторами. Как описано здесь, заявитель идентифицировал конкретные аминокислоты, ответственные за связывание с рецептором и проникновение, тем самым уменьшая потребность в тщательных исследованиях по мутагенезу для идентификации критических аминокислот в AAVrh74 [7-11] (фиг. 1). После выявления критических участков для устранения наводки на печень заявитель разработал модифицированные капсиды, которые усиливают специфическую для мышц трансдукцию вектора. Положительный эффект сочетания снижения потери вектора в печени со специфической доставкой нужного гена в мышечные клетки должен сильно повысить шансы достижения порога для клинической эффективности при системном лечении нервно-мышечных заболеваний.

Настоящим изобретением предусмотрены модифицированные капсидные белки, выделенные полинуклеотиды, способы получения модифицированных капсидных белков, рекомбинантные вирусные частицы и рекомбинантные системы экспрессии для создания модифицированных вирусных частиц. В одном аспекте изобретения предусмотрены модифицированные вирусные капсидные белки, которые включают или же в основном состоят или же состоят из вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается на участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74. Модифицированные капсиды могут входить и в другие вирусные системы доставки.

В следующем аспекте модифицированные вирусные частицы также содержат трансген для модификации генов и/или систему CRISPR для модификации генов.

Также предусмотрены выделенные полинуклеотиды, кодирующие модифицированные вирусные капсидные белки, которые включают или же в основном состоят или же состоят из вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74.

При этом предусмотрены рекомбинантные вирусные частицы, которые включают или же в основном состоят или же состоят из модифицированного капсидного белка, который включает или же в основном состоит или же состоит из модифицированного вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В других воплощениях эти вирусные частицы повышают эффективность доставки препарата от 3 до 56 раз для больной или дисфункциональной ткани по сравнению с AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В других воплощениях больная или дисфункциональная ткань представляет собой ткань сердца. В следующих воплощениях эти вирусные частицы повышают эффективность доставки препарата в ткани сердца в 50 и более раз по сравнению с AAVrh74. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74. В некоторых воплощениях вирусные частицы содержат эффективное количество препарата, подходящего для заболевания или дисфункциональной ткани. В некоторых воплощениях лечение представляет собой редактирование генов на основе CRISPR/Cas9.

Модифицированный вирус, например, AAV, может упаковываться с помощью вирусной системы упаковки типа ретровирусной, аденовирусной, герпесвирусной или бакуловирусной системы упаковки. В некоторых воплощениях упаковка достигается при помощи хелперного вируса или хелперной плазмиды и линии клеток. Хелперный вирус или хелперная плазмида содержит элементы и последовательности, которые облегчают доставку генетического материала в клетки. В другом аспекте хелперная плазмида или содержащий хелперную плазмиду полинуклеотид стабильно встроен в геном упаковывающей линии клеток, поэтому упаковывающая линия клеток не требует дополнительной трансфекции с хелперной плазмидой.

Хелперная плазмида может содержать, к примеру, по меньшей мере одну последовательность ДНК вируса-хелпера, полученную из неспособного к репликации вирусного генома, кодирующую in trans все белки вириона, необходимые для упаковки неспособного к репликации AAV и для выработки белков вириона, способных упаковывать неспособный к репликации AAV с высоким титром, без образования способных к репликации AAV. Последовательность ДНК вируса лишена области, кодирующей нативный энхансер и/или промотор в 5′-LTR вируса, а также лишена функциональной последовательности psi, отвечающей за упаковку генома хелпера, и 3′-LTR, но кодирует чужеродный сайт полиаденилирования, к примеру, сайт полиаденилирования SV40, и чужеродный энхансер и/или промотор, который направляет эффективную транскрипцию в тех клетках, где требуется продукция вируса. Вирус представляет собой вирус лейкемии типа вируса лейкемии мышей Moloney (MMLV), вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) или вируса лейкемии обезьяны гиббона (GALV). Чужеродным энхансером и промотором может быть самый ранний (IE) энхансер и промотор цитомегаловируса человека (HCMV), энхансер и промотор (область U3) вируса саркомы мышей Молони (MMSV), область U3 вируса саркомы Рауса (RSV), область U3 образующего очаги в селезенке вируса (SFFV) или энхансер IE HCMV, соединенный с нативным промотором вируса лейкемии мышей Молони (MMLV). Хелперная плазмида может состоять из двух последовательностей ДНК ретровирусного хелпера, кодируемых плазмидными экспрессирующими векторами, например, где первая последовательность хелпера содержит кДНК, кодирующую белки gag и pol экотропного MMLV или GALV, а вторая последовательность хелпера содержит кДНК, кодирующую белок env. Ген Env, который определяет круг хозяев, может происходить из генов, кодирующих ксенотропные, амфотропные, экотропные, политропные (образующие очаги у норки) белки env или белок env вируса лейкемии 10A1 мышей, белок env вируса лейкемии обезьяны гиббона (GALV) или белок env (gp160) вируса иммунодефицита человека, G-белок вируса везикулярного стоматита (VSV), продукты генов env Т-клеточной лейкемии человека I и II типа (HTLV), химерных генов оболочки, полученных из комбинаций одного или нескольких вышеупомянутых генов env, или химерных генов оболочки, кодирующих цитоплазматические и трансмембранные продукты вышеупомянутых генов env и моноклональные антитела против определенных поверхностных молекул на требуемых клетках мишени.

В процессе упаковки хелперные плазмиды и плазмиды, кодирующие вирусные белки AAV, подвергаются совместной краткосрочной трансфекции в первую популяцию клеток млекопитающих, способных вырабатывать вирус, типа эмбриональных почечных клеток человека, к примеру, клеток 293 (ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, MD) для получения супернатантов, содержащих рекомбинантный ретровирус с высоким титром. В другом способе по изобретению эту первую популяцию краткосрочно трансфецированных клеток затем культивируют вместе с целевыми клетками млекопитающих, к примеру, с лимфоцитами человека, чтобы трансдуцировать целевые клетки чужеродным геном с высокой эффективностью.

Композиции

Настоящим изобретением также предусмотрены композиции или наборы, содержащие один или несколько вирусных векторов, выделенные клетки, упаковочную систему, вирусные частицы, как описано здесь, и носитель. В одном аспекте носителем является фармацевтически приемлемый носитель. Эти композиции могут применяться в терапевтических целях, как описано здесь, а также в сочетании с другими известными способами лечения.

Способы введения модифицированных вирусных частиц

Предусмотрены трансгенные животные, кроме человека, содержащие модифицированные вирусные капсидные белки, модифицированные путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74.

Предусмотрен способ редактирования генов, включающий, в основном состоящий или же состоящий из контактирования клеток с рекомбинантными вирусными частицами, содержащими или же в основном состоящими из модифицированного капсида, причем модифицированный капсид содержит или в основном состоит из модифицированного вирусного капсидного белка, включающего или же в основном состоящего или же состоящего из модифицированного вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74. В некоторых воплощениях контакт осуществляется in vivo либо in vitro. В некоторых воплощениях вирусные частицы содержат один или несколько полинуклеотидов, причем по крайней мере один из полинуклеотидов включает или в основном состоит или же состоит из полинуклеотида, кодирующего направляющую РНК (гРНК). В некоторых аспектах по меньшей мере один из полинуклеотидов включает или же в основном состоит или же состоит из терапевтического полинуклеотида. В некоторых воплощениях вирусные частицы содержат Cas9 или его эквивалент.

Также предусмотрен способ редактирования генов у нуждающихся в этом субъектов, включающий введение субъектам эффективного количества рекомбинантных вирусных частиц, содержащих или же в основном состоящих из модифицированного капсида, причем модифицированный капсид содержит модифицированный вирусный капсидный белок, включающий или же в основном состоящий или же состоящий из модифицированного вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается на участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74. В некоторых воплощениях вирусные частицы содержат один или несколько полинуклеотидов, причем по крайней мере один из полинуклеотидов включает или в основном состоит или же состоит из полинуклеотида, кодирующего направляющую РНК (гРНК). В некоторых аспектах по меньшей мере один из полинуклеотидов включает или же в основном состоит или же состоит из терапевтического полинуклеотида. В некоторых воплощениях вирусные частицы содержат Cas9 или его эквивалент.

Предусмотрены и трансгенные животные, кроме человека, содержащие рекомбинантные вирусные частицы, содержащие или же в основном состоящие или же состоящие из рекомбинантного вирусного капсида, включающего или же в основном состоящего из модифицированного капсида, причем модифицированный капсид содержит модифицированный вирусный капсидный белок, включающий или же в основном состоящий или же состоящий из модифицированного вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74.

В некоторых аспектах полинуклеотид, кодирующий гРНК, включает или же в основном состоит или же состоит из слитого полинуклеотида, содержащего РНК CRISPR (crRNA) и трансактивирующую РНК CRIPSPR (tracrRNA); или полинуклеотида, содержащего РНК CRISPR (crRNA) и трансактивирующую РНК CRIPSPR (tracrRNA). В некоторых аспектах гРНК специфична для того участка ДНК, в котором требуется редактирование гена у нуждающегося в этом субъекта или клеток.

В некоторых аспектах рекомбинантные вирусные частицы дополнительно содержат терапевтический полинуклеотид. Терапевтический полинуклеотид представляет собой такой полинуклеотид, который может применяться для наведения на последовательность ДНК, которой требуется редактирование, получения матрицы для репарации последовательности ДНК, которой требуется редактирование, или обеспечения замены для последовательности ДНК, которой требуется редактирование. В других аспектах терапевтический полинуклеотид содержит последовательность гена дикого типа, которому требуется редактирование у нуждающегося в этом субъекта или клеток.

В следующих аспектах предусмотрены способы лечения субъектов, страдающих заболеваниями или нарушениями, которые включают введение субъектам предусмотренного здесь модифицированного AAV. В некоторых аспектах заболевание или нарушение выбрано из числа гемофилии, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, альфа-1-антитрипсина, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, спинальной мышечной атрофии, муковисцидоза, ВИЧ, талассемии, хориоидеремии, болезни Паркинсона, врожденного амавроза Лебера, дегенерации желтого пятна, недостаточности декарбоксилазы ароматических аминокислот, ахроматопсии, синдрома Криглера-Наджара, болезни Помпе, сцепленного с X-хромосомой ретиносхизиса, гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, болезни Баттена, дегенерации сетчатки, недостаточности орнитин-транскарбамилазы, мукополисахаридоза (I-IХ), гепатита B и гепатита C. В одном аспекте гемофилия характеризуется дефицитом одного или нескольких из числа фактора VIII и фактора IX. В некоторых аспектах мышечная дистрофия выбрана из мышечной дистрофии Беккера, врожденной мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Дюшена, дистальной мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, плече-лопаточно-лицевой миопатии, миопатии плечевого/тазового пояса, миотонической дистрофии и глазоглоточной миопатии.

В некоторых аспектах направляющая РНК и/или терапевтический полинуклеотид разработаны и/или выбраны для лечения заболевания или нарушения, выбранного из числа гемофилии, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, альфа-1-антитрипсина, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, спинальной мышечной атрофии, муковисцидоза, ВИЧ, талассемии, хориоидеремии, болезни Паркинсона, врожденного амавроза Лебера, дегенерации желтого пятна, недостаточности декарбоксилазы ароматических аминокислот, ахроматопсии, синдрома Криглера-Наджара, болезни Помпе, сцепленного с X-хромосомой ретиносхизиса, гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, болезни Баттена, дегенерации сетчатки, недостаточности орнитин-транскарбамилазы, мукополисахаридоза (I-IХ), гепатита B и гепатита C. В одном аспекте гемофилия характеризуется дефицитом одного или нескольких из числа фактора VIII и фактора IX. В некоторых аспектах мышечная дистрофия выбрана из мышечной дистрофии Беккера, врожденной мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Дюшенна, дистальной мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, плече-лопаточно-лицевой миопатии, миопатии плечевого/тазового пояса, миотонической дистрофии и глазоглоточной миопатии.

В некоторых аспектах направляющаяРНК и/или терапевтический полинуклеотид разработаны и/или выбраны для воздействия или репарации гена, выбранного из числа фактора VIII (F8, NM_000132, NM_019863), фактора IX (F9, NM_000133, NM_001313913), дистрофина (DMD, NM_000109, NM_004006, NM_004007, NM_004009, NM_004010), дисферлина (DYSF, NM_001130455, NM_001130976, NM_001130977, NM_001130978, NM_001130979), эмерина (EMD, NM_000117), ламина A/C (LMNA, NM_001257374, NM_001282624, NM_001282625, NM_001282626, NM_005572), двойного гомеобокса 4 (DUX4, NM_001205218, NM_001278056, NM_001293798, NM_001306068), протеинкиназы миотонина (MDPK, NM_001081560, NM_001081562, NM_001081563, NM_001288764, NM_001288765), связывающего нуклеиновые кислоты клеточного белка (CNBP, NM_003418, NM_001127192, NM_001127193, NM_001127194, NM_001127195), полиаденилат-связывающего белка-2 (PABP-2, NM_004643), альфа-1-антитрипсина, супероксиддисмутазы (SOD1, NM_000454), алсина (ALS2, NM_001135745, NM_020919), геликазы сенатаксина (SETX, NM_015046), спатаксина (SPG11, NM_001160227, NM_025137), РНК-связывающего белка FUS/TLS (FUS, NM_001010850, NM_001170634, NM_001170937, NM_004960), белка B/C, связанного с мембранным белком, связанным с везикулами (VAPB, NM_001195677, NM_004738), ангиогенина (ANG, NM_001145, NM_001097577), ДНК-связывающего белка TAR43 (TARDBP, NM_007375), полифосфоинозитидфосфатазы (FIG4, NM_014845), оптинейрина(OPTN, NM_001008211, NM_001008212, NM_001008213, NP_00121980), атаксина-2 (ATXN2, NP_001297050, NP_001297052, NP_002964), валозинсодержащего белка (VCP, NM_007126), убиквилина-2 (UBQLN2, NM_013444), рецептора сигма-1 (SIGMAR1, NM_001282205, NM_001282206, NM_001282207, NM_001282208, NM_001282209), заряженного белка 2b мультивезикулярных телец (CHMP2B, NM_001244644, NM_014043), профилина-1 (PFN1, NM_005022), рецепторной тирозиновой протеинкиназы erbB-4 (ERBB4, NM_001042599, NM_005235), гетерогенного ядерного рибонуклеопротеина A1 (HNRNPA1, NM_002136, NM_031157), матрина-3 (MATR3, NM_199189, NM_001194954, NM_001194955, NM_001194956, NM_001282278), цепочки альфа-4А тубулина (TUBA4A, NM_001278552, NM_006000), открытой рамки считывания 72 хромосомы 9 (C9orf72, NM_145005, NM_001256054, NM_018325), CHCD10, SQSTM1 (NM_001142298), TBK1, аполипопротеин E (NM_001302691, NM_000041, NM_001302688, NM_001302689, NM_001302690), SMN1 (NM_000344), SMN2 (NM_017411, NM_022875, NM_022876, NM_022877), CTFR (NM_000492), бета-глобина, HBB PDB, CHM, альфа-синуклеина (SNCA, NM_00034562), паркина (PRKN, NM_004562), киназы 2 с богатыми лейцином повторами (LRRK2 или дардарина, NM_198578), индуцируемой PTEN предполагаемой киназы 1 (PINK1, NM_032409), DJ-1 (NM_001123377), кислой мальтазы (NM_000152), UDP-глюкуронозилтрансферазы 1 (NM_000463), PPT-1 (NM_000310) и ATP13A2 (NM_001141973).

Дополнительные аспекты изобретения касаются композиций, содержащих носитель и модифицированный вирус, описанный здесь. Вкратце, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать модифицированные вирусные частицы, описанные здесь, в комбинации с одним или несколькими фармацевтически или физиологически приемлемыми носителями, разбавителями или наполнителями. Такие композиции могут содержать буферы, как-то физраствор с нейтральным буфером, физраствор с фосфатным буфером и т.п.; такие углеводы, как глюкоза, манноза, сахароза или декстраны, маннитол; белки; полипептиды или такие аминокислоты, как глицин; антиоксиданты; хелаторы типа EDTA или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия); и консерванты. Композиции по настоящему изобретению могут быть составлены для перорального, внутривенного, местного, энтерального и/или парентерального введения. В некоторых воплощениях композиции по настоящему изобретению составлены для внутривенного введения.

Специалистам в данной области понятно, что можно создавать гРНК для специфичности к мишени при воздействии на определенный ген, необязательно ген, связанный с заболеванием или нарушением. Так, в сочетании с Cas9 направляющая РНК способствует специфичности к мишени у системы CRISPR/Cas9. Другие аспекты типа выбора промотора, как обсуждалось выше, могут обеспечить дополнительные механизмы достижения специфичности к мишени – например, выбор промотора для полинуклеотида, кодирующего направляющую РНК, что способствует экспрессии в определенном органе или ткани. Соответственно, предусматривается выбор подходящей гРНК для конкретного заболевания или расстройства.

Введение модифицированного AAV или композиций может осуществляться в виде одной дозы, непрерывно или периодически на протяжении всего курса лечения. Введение может осуществляться любым подходящим способом, в том числе, без ограничения, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, внутрисердечно, интратекально, субвентрикулярно, эпидурально, интрацеребрально, интрацеребровентрикулярно, субретинально, интравитреально, внутрисуставно, внутриглазно, внутрибрюшинно, внутриматочно, интрадермально, подкожно, трансдермально, трансмукозально и ингаляционно.

Способы определения наиболее эффективных способов и дозировок при введении известны специалистам в данной области и будут варьироваться в зависимости от композиции, используемой для терапии, цели терапии и подлежащего лечению субъекта. Может проводиться однократное или многократное введение, при этом уровень дозы и профиль выбирается лечащим врачом. Отметим, что на дозировку может влиять способ введения. Подходящие дозовые формы и способы введения средств известны в данной области. Неограничительные примеры таких подходящих доз могут составлять от всего лишь 10⁹ векторных геномов вплоть до 10¹⁷ векторных геномов за одно введение.

В следующем аспекте модифицированные вирусные частицы и композиции по изобретению можно вводить в сочетании с другими видами лечения, например, теми апробированными методами лечения, которые подходят для данного конкретного заболевания или расстройства. Неограничительный пример включает лечение мышечной дистрофии с помощью комбинации модифицированных вирусных частиц и одного или нескольких стероидов. Установить, было ли лечение успешным, можно, наблюдая за клиническими или субклиническими признаками модификации гена, что определяется лечащим врачом.

Такое введение модифицированных вирусных частиц или композиций по изобретению может проводиться для создания животной модели требуемого заболевания или расстройства для экспериментального анализа и скрининга.

Модифицированные капсиды и частицы AAV

Настоящим изобретением также предусмотрены специальные воплощения, например, модифицированный аденоассоциированный вирус (AAV), включающий рекомбинантные вирусные частицы, содержащие или же в основном состоящие из модифицированного капсида, причем модифицированный капсид содержит модифицированный вирусный капсидный белок, включающий или же в основном состоящий или же состоящий из модифицированного вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках. В некоторых воплощениях модификация представляет собой вставку пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 или его эквивалента. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях этот пептид имеет высокое сродство к α₇β₁-интегрину и/или располагается в участке, который может изменять нормальное рецепторное связывание rh74.

Аденоассоциированные вирусные (AAV) векторы представляют собой дефектные по репликации вирусы, созданные для эффективной доставки генетического груза в клетки. Это безоболочечные вирусы, которые в своей векторной форме содержат только инвертированные концевые повторы (ITR) исходного вируса. Структурные и ферментные белки AAV поступают “in trans” при помощи дополнительных плазмид и вместе трансфецируются в клетки, образуя искусственные частицы для доставки генов. AAVs широко применяются для генетической терапии, в особенности с системами CRISPR/Cas9 – благодаря их безопасности и эффективности. AAV эффективно инфицируют различные клетки, а в процессе инфицирования капсид связывается и проникает в ядро, куда попадает и геном вектора.

Структурные частицы AAV состоят из 60 белковых молекул, состоящих из VP1, VP2 и VP3. Каждая частица содержит примерно 5 белков VP1, 5 белков VP2 и 50 белков VP3, организованных в икосаэдрическую структуру. Было показано, что частицы AAV2 могут поддерживать вставку пептидов и белков в различные участки в пределах структуры капсида. Возможность введения уникальных пептидов в капсид привела к разработке частиц AAV с измененным тропизмом, что позволяет вирусу связываться и инфицировать клетки и ткани, которые в норме могут быть невосприимчивыми к инфекции. Кроме того, в капсид векторов AAV2 вводили большие пептиды и даже функциональные белки с различной степенью успеха. Был создан функциональный зеленый флуоресцентный белок (GFP, м.в. 30 кДа), содержащий капсид AAV, который продуцировал инфекционный вирус, использовавшийся для отслеживания инфицированных клеток.

Одним из ограничений AAV-векторов для доставки генов является ограниченный размер генетической вставки, которая может быть эффективно упакована в частицы. Например, размер генома AAV2 дикого типа составляет 4679 оснований одноцепочечной ДНК. Упаковка даже одного из новых меньших вариантов Cas9 (Cas9 Staphylococcus aureus, SaCas9, м.в. 130 кДа) требует примерно 3255 п.н. только для кодирующей области. Добавление в конструкцию универсального или тканеспецифичного промотора может прибавить еще 500-800 п.н. Накинем еще 500 п.н. для вставки последовательности поли-A и ITRs, и вектор будет близок к упаковочной ёмкости частиц AAV. Для достижения функциональной коррекции гена с помощью CRISPR/Cas9 необходимо также включить направляющую РНК (гРНК) с целевой последовательностью. Для экспрессии этой РНК еще потребуется минимальный промотор polIII и последовательность терминации. Все вместе эти элементы слишком велики, чтобы их можно было вставить в AAV-вектор с эффективной упаковкой. Можно выбрать упаковку конструкции Cas9 и экспрессирующих кассет направляющих РНК в отдельные векторы, но для того, чтобы они были функциональными, оба вируса должны инфицировать одни и те же клетки-мишени.

Другие аспекты изобретения касаются рекомбинантной системы экспрессии для получения такого модифицированного AAV. В некоторых воплощениях рекомбинантная система экспрессии включает несколько плазмид, которые совместно кодируют все вирусные белки AAV – VP1, VP2 и VP3. В некоторых воплощениях каждый вирусный белок кодируется отдельной плазмидой. В некоторых воплощениях один или несколько вирусных белков кодируются одной и той же плазмидой. В некоторых воплощениях по меньшей мере один вирусный белок кодируется в виде слитого белка с Cas9.

Соответственно, приведенные здесь воплощения касаются рекомбинантной системы экспрессии для получения модифицированного AAV, содержащего модифицированный капсид, причем модифицированный капсид содержит модифицированный вирусный капсидный белок, включающий или же в основном состоящий или же состоящий из модифицированного вирусного капсидного белка, модифицированного путем замены или вставки от 1 до 7 аминокислот. В некоторых воплощениях вирусный капсидный белок представлен VP1, необязательно из AAVrh74. В других воплощениях модификация включает замену изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502 VP1 AAVrh74 или эквивалентную модификацию. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация включает замену триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74. В некоторых аспектах подвергаются модификации другие аминокислоты в пептиде, но эта замена сохраняется. В некоторых воплощениях модификация затрагивает рецептор, находящийся главным образом на сателлитных клетках, необязательно на мышечных стволовых клетках.

Некоторые аспекты касаются способов получения модифицированных AAV с помощью раскрытой здесь рекомбинантной системы экспрессии.

Следующие аспекты касаются способов лечения субъектов, страдающих заболеваниями или нарушениями, которые включают введение субъектам приведенного здесь модифицированного AAV. В некоторых воплощениях заболевание или нарушение выбрано из числа гемофилии, мышечной дистрофии, рассеянного склероза, альфа-1-антитрипсина, бокового амиотрофического склероза, болезни Альцгеймера, спинальной мышечной атрофии, муковисцидоза, ВИЧ, талассемии, хориоидеремии, болезни Паркинсона, врожденного амавроза Лебера, дегенерации желтого пятна, недостаточности декарбоксилазы ароматических аминокислот, ахроматопсии, синдрома Криглера-Наджара, болезни Помпе, сцепленного с X-хромосомой ретиносхизиса, гомозиготной семейной гиперхолестеринемии, болезни Баттена, дегенерации сетчатки, недостаточности орнитин-транскарбамилазы, мукополисахаридоза (I-IХ), гепатита B и гепатита C. В некоторых аспектах гемофилия характеризуется дефицитом одного или нескольких из числа фактора VIII и фактора IX. В некоторых аспектах мышечная дистрофия выбрана из мышечной дистрофии Беккера, врожденной мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Дюшена, дистальной мышечной дистрофии, мышечной дистрофии Эмери-Дрейфуса, плечелопаточно-лицевой миопатии, миопатии плечевого/тазового пояса, миотонической дистрофии и глазоглоточной миопатии.

Примеры

Следующие примеры не являются ограничительными и иллюстрируют процедуры, которые могут применяться в различных случаях при реализации изобретения. Кроме того, все ссылки, приведенные здесь, включены путем ссылки во всей полноте.

AAVrh74 – серотип AAV, идентифицированный исследователями из NCH, который широко применялся в клинических испытаниях для лечения нервно-мышечных заболеваний. Он эффективно инфицирует сердечные и скелетные мышцы человека, а среди населения наблюдается слабая распространенность предсуществующих нейтрализующих антител.

Пример 1. Определение оптимального модифицированного серотипа для максимального биораспределения в миобластах и сателлитных клетках при доставке по сосудам

Мышечных сателлитных клеток в скелетных мышцах в 60 раз больше, чем клеток мышечных волокон [2]. Они составляют самообновляющуюся популяцию стволовых клеток, которая содействует долгосрочной способности к регенерации скелетных мышц [12]. Недавно было идентифицировано несколько FACS-сортируемых маркеров для выделения мышечных стволовых клеток [13] (фиг. 2). В качестве маркера для положительного отбора мышечных стволовых клеток был установлен α₇β₁-интегрин, который также является первичным рецептором ламинина на скелетных миобластах и зрелых миофибриллах. Исследования по экспрессии показали, что α₇β₁-интегрин в большом количестве экспрессируется в ткани сердца и скелетных мышц, а в ткани печени встречается лишь на низком уровне. Заявитель модифицировал капсид AAVrh74 так, чтобы он экспрессировал пептид, который связывается с высоким сродством с белком α₇β₁-интегрина. Заявитель поместил этот пептид в участок, который может изменять нормальный мотив рецепторного связывания AAVrh74 с тем, чтобы использовать α₇β₁-интегрин в качестве связывающего рецептора. Также были идентифицированы две другие мутации по другим аминокислотам AAVrh74, которые предположительно необходимы для специфического связывания и проникновения в печень, и оказалось, что они обеспечивают повышенную общую и/или специфичную для мышц доставку репортерных генов после внутривенного введения вектора (фиг. 3-5).

Мышам C57BL/6J внутривенно вводили вновь созданные вирусы с модифицированными капсидами или контрольные AAVrh74 (AAVmut4, AAVmut5 и AAV_YIG или AAV_YIGSR591), экспрессирующие один и тот же слитый белок люцифераза-EYFP, как показано ранее, а через 3 недели мышей забивали с перфузией PBS/параформальдегидом, после чего проводили иммуногистохимическое окрашивание срезов мышц и органов для определения конкретных популяций трансдуцированных клеток. Сначала каждую неделю проводили визуализацию мышей на предмет экспрессии люциферазы с помощью системы визуализации IVIS для подтверждения экспрессии генов. Через 3 недели после инъекции мышей перфузировали, отбирали ткани и фиксировали в параформальдегиде, после чего делали срезы и проводили окрашивание на экспрессию GFP по иммунофлуоресценции и контрастное окрашивание на экспрессию специфичных к типам клеток антигенов для их идентификации. Этот подход позволил заявителю идентифицировать конкретные популяции клеток, трансдуцированных векторами с различными мутантными капсидами, и установить, какие из них могут принести наибольшую пользу при заданных мышечных заболеваниях.

AAVrh74 является текущим стандартом для экспрессии генов на высоком уровне в скелетных и сердечных мышцах и его использовали в качестве опорного для модификации капсида. Через 3 недели после введения контрольного и трех вирусов с модифицированными капсидами определяли биораспределение вектора после внутривенной инъекции мышам CD-1 методом кПЦР (фиг. 3). Вектор mut4 проявлял общее повышение глобального биораспределения вектора со значительным повышением в четырехглавой мышце, диафрагме и сердечной мышце. В то же время mut5 и YIG или YIGSR591 проявляли значительное повышение трансдукции вектора в сердце по сравнению с AAVrh74.

Таблица 1

Ткань Изменение у mut4 по сравнению
с AAVrh74 (разы) Кровь 18 Головной мозг 8 Легкие 5 Четырехглавая мышца 10 Диафрагма 17 Сердце 11 Селезенка 3 Почки 8 Печень 56

На фиг. 4 и 5 представлено повышение экспрессии in vivo гена люциферазы при доставке его mut4 и YIG или YIGSR591 по сравнению с исходным AAVrh74. На фиг. 4 в скобках представлено повышение счета фотонов в области головы либо в нижней части туловища, что свидетельствует об эффективности вируса mut4 в трансдукции и экспрессии генов в самых разных тканях.

Для подтверждения предыдущего профиля биораспределения у беспородных мышей CD-1 использовали инбредных мышей C57BL/6J (по 6 на вирусную группу, 3 самца и 3 самки). Готовили 4 вируса, которые можно вводить мышам по прибытии.

Эквиваленты

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют такие же значения, которые обычно понимаются рядовыми специалистами в той области, к которой относится данная технология.

Настоящая технология, иллюстративно описанная здесь, может должным образом применяться на практике и в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, не изложенных конкретно здесь. Так, например, термины “состоящий из”, “включающий”, “содержащий” и т.п. следует толковать расширительно и без ограничений. Кроме того, используемые здесь термины и выражения применялись как термины для описания, а не ограничения, поэтому при использовании таких терминов и выражений нет намерения исключить какие-либо эквиваленты представленных и описанных признаков либо их частей, но имеется в виду, что в рамках данной заявленной технологии возможны различные модификации.

Таким образом, следует понимать, что представленные здесь материалы, способы и примеры репрезентативны для предпочтительных аспектов, являются типичными и не предназначены для ограничения объема настоящей технологии.

Представленная технология была описана здесь широко и в общих чертах. Каждое из более узких видов и субродовых группировок, подпадающих под общее описание, также является частью данной технологии. Это включает в себя общее описание данной технологии с условием или отрицательным ограничением, исключающим какой-либо предмет из этого рода, независимо от того, упоминается ли вырезанный материал здесь специально.

Кроме того, если особенности или аспекты настоящей технологии описаны в терминах групп Маркуша, то специалисты в данной области должны понимать, что тем самым данная технология также описывается в терминах любого отдельного представителя или подгруппы представителей группы Маркуша.

Все публикации, патентные заявки, патенты и другие ссылки, приведенные здесь, явным образом включены сюда путем ссылки во всей полноте в той же степени, как если бы каждая была включена путем ссылки по отдельности. В случае конфликта должна возобладать настоящая спецификация, включая определения.

Другие аспекты изложены в последующей формуле изобретения.

Библиография

1. Fang H. et al. Comparison of adeno-associated virus serotypes and delivery methods for cardiac gene transfer. Hum Gene Ther Methods, 2012, 23(4): p. 234-41.

2. Bianconi E. et al. An estimation of the number of cells in the human body. Ann Hum Biol, 2013, 40(6): p. 463-71.

3. Tran T. et al. Laminin drives survival signals to promote a contractile smooth muscle phenotype and airway hyperreactivity. FASEB J, 2013, 27(10): p. 3991-4003.

4. Mori S. et al. Biodistribution of a low dose of intravenously administered AAV-2, 10, and 11 vectors to cynomolgus monkeys. Jpn J Infect Dis, 2006, 59(5): p. 285-93.

5. Grimm D. et al. In vitro and in vivo gene therapy vector evolution via multispecies interbreeding and retargeting of adeno-associated viruses. J Virol, 2008, 82(12): p. 5887-911.

6. Asokan A. et al. Reengineering a receptor footprint of adeno-associated virus enables selective and systemic gene transfer to muscle. Nat Biotechnol, 2010, 28(1): p. 79-82.

7. Pulicherla N. et al. Engineering liver-detargeted AAV9 vectors for cardiac and musculoskeletal gene transfer. Mol Ther, 2011, 19(6): p. 1070-8.

8. DiMattia M.A. et al. Structural insight into the unique properties of adeno-associated virus serotype 9. J Virol, 2012, 86(12): p. 6947-58.

9. Li C. et al. Single amino acid modification of adeno-associated virus capsid changes transduction and humoral immune profiles. J Virol, 2012, 86(15): p. 7752-9.

10. Raupp C. et al. The threefold protrusions of adeno-associated virus type 8 are involved in cell surface targeting as well as postattachment processing. J Virol, 2012, 86(17): p. 9396-408.

11. Govindasamy L. et al. Structural insights into adeno-associated virus serotype 5. J Virol, 2013, 87(20): p. 11187-99.

12. Bentzinger C.F. et al. Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche. EMBO Rep, 2013, 14(12): p. 1062-72.

13. Wang Y.X., N.A. Dumont, and M.A. Rudnicki. Muscle stem cells at a glance. J Cell Sci, 2014, 127(21): p. 4543-8.

14. Loiler S.A. et al. Targeting recombinant adeno-associated virus vectors to enhance gene transfer to pancreatic islets and liver. Gene Ther, 2003, 10(18): p. 1551-8.

Последовательности

SEQ ID NO:1 (NM_000231.2): Homo sapiens, γ-саркогликан (SGCG), мРНК

GAAACTCGTGAGAGCCCTTTCTCCAGGGACAGTTGCTGAAGCTTCATCCTTTGCTCTCATTCTGTAAGTCATAGAAAAGTTTGAAACATTCTGTCTGTGGTAGAGCTCGGGCCAGCTGTAGTTCATTCGCCAGTGTGCTTTTCTTAATATCTAAGATGGTGCGTGAGCAGTACACTACAGCCACAGAAGGCATCTGCATAGAGAGGCCAGAGAATCAGTATGTCTACAAAATTGGCATTTATGGCTGGAGAAAGCGCTGTCTCTACTTGTTTGTTCTTCTTTTACTCATCATCCTCGTTGTGAATTTAGCTCTTACAATTTGGATTCTTAAAGTGATGTGGTTTTCTCCAGCAGGAATGGGCCACTTGTGTGTAACAAAAGATGGACTGCGCTTGGAAGGGGAATCAGAATTTTTATTCCCATTGTATGCCAAAGAAATACACTCCAGAGTGGACTCATCTCTGCTTCTACAATCAACCCAGAATGTGACTGTAAATGCGCGCAACTCAGAAGGGGAGGTCACAGGCAGGTTAAAAGTCGGTCCCAAAATGGTAGAAGTCCAGAATCAACAGTTTCAGATCAACTCCAACGACGGCAAGCCACTATTTACTGTAGATGAGAAGGAAGTTGTGGTTGGTACAGATAAACTTCGAGTAACTGGGCCTGAAGGGGCTCTTTTTGAACATTCAGTGGAGACACCCCTTGTCAGAGCCGACCCGTTTCAAGACCTTAGATTAGAATCCCCCACTCGGAGTCTAAGCATGGATGCCCCAAGGGGTGTGCATATTCAAGCTCACGCTGGGAAAATTGAGGCGCTTTCTCAAATGGATATTCTTTTTCATAGTAGTGATGGAATGCTTGTGCTTGATGCTGAAACTGTGTGCTTACCCAAGCTGGTGCAGGGGACGTGGGGTCCCTCTGGCAGCTCACAGAGCCTCTACGAAATCTGTGTGTGTCCAGATGGGAAGCTGTACCTGTCTGTGGCCGGTGTGAGCACCACGTGCCAGGAGCACAGCCACATCTGCCTCTGAGCTGCCTGCGTCCTCTCGGTGAGCTGTGCAGTGCCGGCCCCAGATCCTCACACCCAGGGAGCAGCTGCACATCGTGAAAGACTGAGGCAGCGTGGATGGGAAGTAAACGCTTCCAGAGGAACTCAGAAAAAATTATGTGCCAGTGAAAGTGTTTGGACAAAAACTACATGATCTCAAAATGCACGTGGATGTGAGACACAAAAGTTGACAAAATGGAAAAGCAATGTGTTTTTCCACTGGATTAATTTTCACCGGAACAATTGCGAATTCTCTCTGCCTCGCCTCCCCCTATCTTGTCCGTGTGGGCACACACTGAGTGTTGAGTTGCCGTGTGGAGTTAATGTATGACGCTCCACTGTGGATATCTAATGCCCTGTTGAGAGTAGCCTTGCTCAGTACTAAAATGCCCCAAAGTTCTATACAGCATTTCCTTTATAGCATTCAAACCTCACATCCTCCCTTCAGTTTAATGCAAGTAAGTCAGGTTTCACAAGAAAATTTTCAAGTTTTGAAGGGAATTTGAGGTTGATCTGGTTTTCAAGATGTAGTTAAAGGAATAAATCACTCAAAATTAAACTTTCTGTATATAGTCAATAAGCAATAAAAACCTCATTTTTCAGAGTTAAAAAA

Нуклеотидная последовательность капсидного гена AAV rh74 дикого типа (SEQ ID NO: 3):

atggctgccgatggttatcttccagattggctcgaggacaacctctctgagggcattcgcgagtggtgggacctgaaacctggagccccgaaacccaaagccaaccagcaaaagcaggacaacggccggggtctggtgcttcctggctacaagtacctcggacccttcaacggactcgacaagggggagcccgtcaacgcggcggacgcagcggccctcgagcacgacaaggcctacgaccagcagctccaagcgggtgacaatccgtacctgcggtataatcacgccgacgccgagtttcaggagcgtctgcaagaagatacgtcttttgggggcaacctcgggcgcgcagtcttccaggccaaaaagcgggttctcgaacctctgggcctggttgaatcgccggttaagacggctcctggaaagaagagaccggtagagccatcaccccagcgctctccagactcctctacgggcatcggcaagaaaggccagcagcccgcaaaaaagagactcaattttgggcagactggcgactcagagtcagtccccgaccctcaaccaatcggagaaccaccagcaggcccctctggtctgggatctggtacaatggctgcaggcggtggcgctccaatggcagacaataacgaaggcgccgacggagtgggtagttcctcaggaaattggcattgcgattccacatggctgggcgacagagtcatcaccaccagcacccgcacctgggccctgcccacctacaacaaccacctctacaagcaaatctccaacgggacctcgggaggaagcaccaacgacaacacctacttcggctacagcaccccctgggggtattttgacttcaacagattccactgccacttttcaccacgtgactggcagcgactcatcaacaacaactggggattccggcccaagaggctcaacttcaagctcttcaacatccaagtcaaggaggtcacgcagaatgaaggcaccaagaccatcgccaataaccttaccagcacgattcaggtctttacggactcggaataccagctcccgtacgtgctcggctcggcgcaccagggctgcctgcctccgttcccggcggacgtcttcatgattcctcagtacgggtacctgactctgaacaatggcagtcaggctgtgggccggtcgtccttctactgcctggagtactttccttctcaaatgctgagaacgggcaacaactttgaattcagctacaacttcgaggacgtgcccttccacagcagctacgcgcacagccagagcctggaccggctgatgaaccctctcatcgaccagtacttgtactacctgtcccggactcaaagcacgggcggtactgcaggaactcagcagttgctattttctcaggccgggcctaacaacatgtcggctcaggccaagaactggctacccggtccctgctaccggcagcaacgcgtctccacgacactgtcgcagaacaacaacagcaactttgcctggacgggtgccaccaagtatcatctgaatggcagagactctctggtgaatcctggcgttgccatggctacccacaaggacgacgaagagcgattttttccatccagcggagtcttaatgtttgggaaacagggagctggaaaagacaacgtggactatagcagcgtgatgctaaccagcgaggaagaaataaagaccaccaacccagtggccacagaacagtacggcgtggtggccgataacctgcaacagcaaaacgccgctcctattgtaggggccgtcaatagtcaaggagccttacctggcatggtgtggcagaaccgggacgtgtacctgcagggtcccatctgggccaagattcctcatacggacggcaactttcatccctcgccgctgatgggaggctttggactgaagcatccgcctcctcagatcctgattaaaaacacacctgttcccgcggatcctccgaccaccttcaatcaggccaagctggcttctttcatcacgcagtacagtaccggccaggtcagcgtggagatcgagtgggagctgcagaaggagaacagcaaacgctggaacccagagattcagtacacttccaactactacaaatctacaaatgtggactttgctgtcaatactgagggtacttattccgagcctcgccccattggcacccgttacctcacccgtaatctgtaa

Аминокислотная последовательность AAV rh74 дикого типа (SEQ ID NO: 4):

Модифицированные капсиды – а.к. последовательности (SEQ ID NO: 5):

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен модифицированный капсидный белок VP1 AAVrh74 для повышенной доставки генов, содержащий одну или несколько модификаций, выбранных из числа замены изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502, замены триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74 и вставки пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 либо их эквивалентов. Также представлена рекомбинантная вирусная частица для повышенной доставки генов, содержащая модифицированный VP1 AAVrh74. Кроме того, описан полинуклеотид, кодирующий модифицированный VP1 AAVrh74 и вектор для доставки генов, содержащий указанный полинуклеотид. Описан полинуклеотид, кодирующий рекомбинантную вирусную частицу и вектор для доставки генов, содержащий описанный полинуклеотид, а также рекомбинантная система экспрессии, содержащая описанный полинуклеотид, рекомбинантная система экспрессии содержащая вектор. Также представлена клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид. Описан способ модификации полинуклеотида в клетке или у субъекта, включающий доставку в клетку эффективного количества рекомбинантной вирусной частицы. Представлен набор для модификации полинуклеотида, включающий рекомбинантную вирусную частицу. Изобретение расширяет арсенал средств для терапевтического применения. 12 н. и 7 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 1 пр.

1. Модифицированный капсидный белок VP1 AAVrh74 для повышенной доставки генов, содержащий одну или несколько модификаций, выбранных из числа замены изолейцина на аспарагин в положении аминокислоты 502, замены триптофана на аргинин в положении 505 VP1 AAVrh74 и вставки пептида YIG или YIGSR (SEQ ID NO: 2) в положение аминокислоты 591 VP1 AAVrh74 либо их эквивалентов.

2. Рекомбинантная вирусная частица для повышенной доставки генов, содержащая модифицированный VP1 AAVrh74 по п. 1.

3. Рекомбинантная вирусная частица по п. 2, при этом рекомбинантная вирусная частица представляют собой модифицированный AAVrh74.

4. Рекомбинантная вирусная частица по любому из пп. 1-3, дополнительно содержащая трансген или систему CRISPR.

5. Полинуклеотид, кодирующий модифицированный VP1 AAVrh74 по п. 1.

6. Вектор для доставки генов, содержащий полинуклеотид по п. 5.

7. Полинуклеотид, кодирующий рекомбинантную вирусную частицу по п. 3.

8. Вектор для доставки генов, содержащий полинуклеотид по п. 7.

9. Рекомбинантная система экспрессии, содержащая полинуклеотид по п. 7, для получения рекомбинантной вирусной частицы по п. 3.

10. Рекомбинантная система экспрессии, содержащая вектор по п. 8.

11. Клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид по п. 7, для получения рекомбинантной вирусной частицы по п. 3.

12. Способ модификации полинуклеотида в клетке, включающий доставку в клетку эффективного количества рекомбинантной вирусной частицы, по п. 2 или 4.

13. Способ по п. 12, при этом клетка представляет собой клетку млекопитающих.

14. Способ по п. 13, при этом клетка млекопитающих представляет собой клетку человека.

15. Способ модификации полинуклеотида у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества рекомбинантной вирусной частицы по п. 2 или 4.

16. Способ по п. 15, при этом субъектом является млекопитающее.

17. Способ по п. 16, при этом млекопитающее представлено человеком.

18. Способ по любому из пп. 15-17, при этом введение является местным или системным.

19. Набор для модификации полинуклеотида, включающий рекомбинантную вирусную частицу по п. 2 или 4.