РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущество по предварительной заявке на патент США №62/477335, поданной 27 марта 2017 года, и предварительной заявке на патент США №62/628774, поданной 9 февраля 2018 года. КАЖДАЯ из вышеперечисленных заявок включена в данный документ посредством ссылки в полном объеме.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ МАТЕРИАЛА В ТЕКСТОВОМ ФАЙЛЕ В ФОРМАТЕ ASCII
[0002] Настоящая заявка включает в себя посредством ссылки перечень последовательностей, содержащийся в следующем текстовом файле в формате ASCII, который представлен одновременно с данным документом:
а) Имя файла: 44591144002SequenceListing.txt; создан 27 марта 2018 года, размер 186 KB.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0003] Возникновение и персистенция многих заболеваний характеризуются недостаточным иммунным ответом на аномальные клетки, в том числе злокачественные и инфицированные вирусами клетки. Иммунотерапия заключается в использовании иммунной системы пациента и манипуляциях с ней для лечения различных заболеваний.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Иммунотерапия представляет собой новое технологическое достижение в лечении заболеваний, в рамках которой иммунные клетки конструируют таким образом, чтобы они экспрессировали определенные нацеливающие и/или эффекторные молекулы, которые специфично идентифицируют пораженные или поврежденные клетки и реагируют с ними. Она представляет собой многообещающее достижение по меньшей мере отчасти благодаря потенциальной способности к специфичному нацеливанию на пораженные или поврежденные клетки, в отличие от более традиционных подходов, таких как химиотерапия, где под воздействие попадают все клетки, и требуемый результат заключается в том, что выживание достаточного количества здоровых клеток позволяет пациенту выжить. Одним из иммунотерапевтических подходов является рекомбинантная экспрессия химерных рецепторов в иммунных клетках для осуществления целенаправленного распознавания и разрушения аномальных клеток, представляющих интерес.
[0005] Для удовлетворения данной потребности в специфичном нацеливании на пораженные или инфицированные клетки и их уничтожении, нейтрализации или приведении в состояние инертности иным образом в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, аминокислоты и векторы, которые кодируют химерные рецепторы, придающие усиленное нацеливание и цитотоксичность в отношении клеток, таких как естественные клетки-киллеры. Также предусмотрены способы получения клеток и способы применения клеток для нацеливания на пораженные или поврежденные клетки и их уничтожения. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен и эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен, при этом внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), при этом пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D.
[0006] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит один или оба из: (а) внеклеточного рецепторного домена и (b) эффекторного домена, содержащего трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D). В некоторых вариантах осуществления пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, например, фрагмент NKG2D, кодируемый полинуклеотидом, содержащим SEQ ID NO: 2. Как раскрыто в данном документе, также применяются дополнительные фрагменты NKG2D в зависимости от варианта осуществления. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета. В одном варианте осуществления CD3-дзета кодируется полинуклеотидом, содержащим SEQ ID NO: 13, хотя, как раскрыто в данном документе, в зависимости от варианта осуществления также можно применять последовательности, которые отличаются от CD3-дзета, но обладают аналогичной функцией.
[0007] В некоторых вариантах осуществления трансмембранная область эффекторного домена содержит трансмембранный домен CD8a. В одном варианте осуществления трансмембранная область эффекторного домена дополнительно содержит шарнирную область CD8a. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область CD8a кодируется полинуклеотидом, содержащим SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен дополнительно содержит 4-1ВВ. В одном варианте осуществления 4-1ВВ кодируется полинуклеотидом, содержащим SEQ ID NO: 12, хотя, как раскрыто в данном документе, в зависимости от варианта осуществления также можно применять последовательности, которые отличаются от 4-1ВВ, но обладают аналогичной функцией.
[0008] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с CD8a, 4-1ВВ и CD3z. В некоторых вариантах осуществления такой химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18. В дополнительных вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 108, хотя, как раскрыто в данном документе, в зависимости от варианта осуществления также можно применять последовательности, которые отличаются от SEQ ID NO: 108, но обладают аналогичной функцией. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.
[0009] В некоторых вариантах осуществления любой из химерных рецепторов, раскрытых в данном документе, также может экспрессироваться совместно с мембраносвязанным интерлейкином 15 (mbIL15). В определенных вариантах осуществления mbIL15 кодируется полинуклеотидом, содержащим SEQ ID NO: 16. В определенных вариантах осуществления mbIL15 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. В зависимости от варианта осуществления также можно применять другие последовательности для mbIL15. В определенных вариантах осуществления mbIL15 экспрессируется бицистронно на том же полинуклеотиде, что и химерный рецептор. В других вариантах осуществления mbIL15 совместно экспрессируется на отдельной конструкции. В некоторых вариантах осуществления активность внутриклеточного сигнального домена дополнительно усиливают путем сопряжения его экспрессии с экспрессией мембраносвязанного интерлейкина 15 (mbIL15).
[0010] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен дополнительно содержит домен ОХ-40. В некоторых вариантах осуществления домен ОХ-40 присутствует вместо mbIL15 либо в дополнение к нему. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, домен ОХ-40 и CD3-дзета. В определенных вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция способна к бицистронной совместной экспрессии mbIL15. В определенных таких вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция содержит один или несколько сайтов расщепления (например, сайты расщепления Т2А, Р2А, Е2А и/или F2A), которые распознаются и расщепляются, например, цитозольной протеазой. В определенных вариантах осуществления mbIL15 связан с химерным рецептором посредством сайта расщепления цитозольной протеазой. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 90 и связан с mbIL15, кодируемым SEQ ID NO: 16, посредством сайта расщепления цитозольной протеазой. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 109 и связан с mbIL15, кодируемым SEQ ID NO: 16, посредством сайта расщепления цитозольной протеазой. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 91 и совместно экспрессируется с mbIL15, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. Как раскрыто в данном документе, в зависимости от варианта осуществления также можно применять последовательности, которые отличаются от SEQ ID NO: 90, 91, 109, 16 и/или 16, но обладают аналогичной функцией.
[0011] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью IgG4, трансмембранный домен CD8a, домен ОХ-40 и CD3-дзета. В определенных вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция способна к бицистронной совместной экспрессии mbIL15 с химерным рецептором. В определенных таких вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция содержит один или несколько сайтов расщепления (например, сайты расщепления Т2А, Р2А, Е2А и/или F2A), которые распознаются и расщепляются цитозольной протеазой. В определенных вариантах осуществления mbIL15 связан с химерным рецептором посредством сайта расщепления цитозольной протеазой. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 100 и связан с mbIL15, кодируемым SEQ ID NO: 16, посредством сайта расщепления цитозольной протеазой. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 101 и совместно экспрессируется с mbIL15, содержащим аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. Как раскрыто в данном документе, в зависимости от варианта осуществления также можно применять последовательности, которые отличаются от SEQ ID NO: 100, 101 и/или 16, но обладают аналогичной функцией.
[0012] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы лечения рака, включающие введение субъекту, имеющему рак, композиции, содержащей естественную клетку-киллера (NK), экспрессирующую химерный рецептор, кодируемый полинуклеотидами, описанными выше или в других разделах данного документа.
[0013] В одном варианте осуществления NK-клетки являются аутологичными клетками, выделенными из организма пациента, имеющего рак или инфекционное заболевание. В дополнительных вариантах осуществления NK-клетки являются аллогенными клетками, выделенными из организма донора.
[0014] Также в данном документе предусмотрено применение полинуклеотида, описанного выше или в других разделах данного документа, в изготовлении лекарственного препарата для усиления цитотоксичности NK-клеток у млекопитающего, нуждающегося в этом. В некоторых вариантах осуществления предусмотрено применение полинуклеотида, описанного выше или в других разделах данного документа, в изготовлении лекарственного препарата для лечения или предупреждения рака или инфекционного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в этом.
[0015] Согласно некоторым вариантам осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, где химерный рецептор содержит внеклеточный рецепторный домен и эффекторный домен, который содержит трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен. Как более подробно обсуждается в данном документе, внеклеточный рецепторный домен служит для распознавания и связывания лигандов на клетке-мишени. Эффекторный домен служит для передачи сигналов (при связывании внеклеточного домена с клеткой-мишенью), которые запускают сигнальный каскад, приводящий к цитотоксической активности в отношении клетки-мишени. В соответствии с некоторыми вариантами осуществления полинуклеотид кодирует химерный рецептор, который обеспечивает неожиданно повышенную цитотоксичность по сравнению с несконструированными NK-клетками.
[0016] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D). Согласно некоторым вариантам осуществления пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой функциональный фрагмент NKG2D (например, усеченную форму, фрагмент или часть полноразмерного NKG2D). Используемые в данном документе термины "фрагмент", "усеченная форма" и "часть" будут иметь свои обычные значения, а также будут взаимозаменяемыми друг с другом. Например, в некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D кодируется полинуклеотидом, содержащим фрагмент последовательности под SEQ ID NO: 1. В некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D содержит последовательность под SEQ ID NO: 2, при этом в дополнительных вариантах осуществления фрагмент, кодирующий NKG2D, является кодон-оптимизированным и содержит, например, последовательность под SEQ ID NO: 3. В дополнительных вариантах осуществления фрагмент, кодирующий NKG2D, является кодон-оптимизированным и содержит, например, последовательность под SEQ ID NO: 68.
[0017] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит один или несколько из CD16, NCR1, NCR2, NCR3, 4-1ВВ, NKp80, CD3-дзета и 2В4. В некоторых вариантах осуществления эти эффекторные домены связаны с CD8-альфа.
[0018] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с CD16. Используемый в данном документе термин "связанный" будет иметь свое обычное значение и также будет относиться к прямому (например, за первым нуклеотидом непосредственно расположен второй нуклеотид) или опосредованному (например, последовательности находятся друг с другом в одной рамке считывания, но разделены промежуточными нуклеотидами) соединению нуклеотидных последовательностей таким образом, при котором обеспечивается возможность экспрессии нуклеотидных последовательностей, например, в системе транскрипции/трансляции in vitro, в клетке-хозяине (например, in vitro и/или in vivo). Используемые в данном документе термины "соединенный" и "связанный" используются взаимозаменяемо. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор NKG2D/CD16 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор NKG2D/CD16 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с NCR1. В некоторых вариантах осуществления такой химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28.
[0019] Как обсуждается выше, в некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D связан с NCR2, и полученный в результате химерный рецептор содержит по меньшей мере часть аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен химерный рецептор, содержащий фрагмент NKG2D, связанный с NCR3. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 29, и химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30.
[0020] Как более подробно обсуждается ниже, в некоторых вариантах осуществления применяются комбинации трансмембранного и внутриклеточного доменов, и они обеспечивают синергические взаимодействия между компонентами химерного рецептора и достижение усиленных цитотоксических эффектов. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с трансмембранным/внутриклеточным доменом CD16, и 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16 и 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления такой химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления полученный в результате химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26.
[0021] В некоторых вариантах осуществления NCR1 применяется совместно с фрагментом NKG2D. В некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D соединен только с NCR1. В дополнительных вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с NCR1, и 4-1ВВ. В определенных таких вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность NCR1 под SEQ ID NO: 20.
[0022] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с CD8a, 4-1ВВ и CD3z. В некоторых вариантах осуществления такой химерный рецептор NKG2D/CD8a/4-1bb/CD3z кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.
[0023] В некоторых вариантах осуществления в состав химерного рецептора включен NCR3. Например, в некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция NKG2D/NCR3. Полученный в результате химерный рецептор, следовательно, содержит аминокислотную последовательность NCR3 под SEQ ID NO: 22. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит конструкцию NKG2D/NCR2/4-1BB или конструкцию NKG2D/NCR3/4-1BB.
[0024] В некоторых вариантах осуществления в конструкциях химерных рецепторов предусмотрены линкеры, шарниры или другие "спейсерные" элементы. Например, в некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует GS-линкер между частями конструкции, как, например, между любыми из 4-1ВВ, CD16, NCR1, NCR3, 2В4 или NKp80. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены один или несколько GS-линкеров, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен химерный рецептор, содержащий шарнирную область. В зависимости от местоположения в конкретной конструкции шарнирная область может быть тождественна линкерной области и наоборот. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В определенных вариантах осуществления шарнирная область может быть усеченной до требуемой длины и, следовательно, кодироваться фрагментом последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления в качестве шарнира применяется мотив глицин-серин. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит повторяющийся мотив глицин-серин, имеющий аминокислотную последовательность (GGGGS)n (SEQ ID NO: 31), где n обозначает количество повторов. В некоторых вариантах осуществления применяется 9 повторов, что в результате дает шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33. В некоторых вариантах осуществления применяется 3 повтора, что в результате дает шарнирную область, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 34.
[0025] В некоторых вариантах осуществления в качестве шарнира или линкера можно применять две отдельные молекулы, такие как аминокислотная последовательность под SEQ ID NO: 32 (CD8a/GS3). В некоторых вариантах осуществления в качестве шарнира или линкера применяются части бета-адренергического рецептора. В некоторых вариантах осуществления применяются части бета-2-адренергического рецептора. В одном варианте осуществления применяется внеклеточный домен бета-2-адренергического рецептора, который кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 40. В определенных вариантах осуществления применяется первая трансмембранная спираль бета-2-адренергического рецептора, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 42. В зависимости от варианта осуществления эти две части бета-2-адренергического рецептора применяются совместно в химерном рецепторе. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит сигнальный пептид CD8a, при этом сигнальный пептид содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 4. В зависимости от варианта осуществления необязательно применяются другие сигнальные пептиды. Согласно определенным вариантам осуществления сигнальные пептиды можно использовать в мультимерном формате.
[0026] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит одну или несколько последовательностей полу-ITAM. В определенных таких вариантах осуществления полу-ITAM содержит аминокислотный мотив DGYXXL (где X представляет собой любую аминокислоту; SEQ ID NO: 14). В определенных вариантах осуществления применяется несколько полу-ITAM. В некоторых вариантах осуществления полу-ITAM содержит NKp80. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит одну или несколько последовательностей ITSM. В некоторых вариантах осуществления последовательности ITSM применяются совместно с мотивами полу-ITAM. В некоторых вариантах осуществления ITSM содержит аминокислотный мотив S/TXYXXL/I (где X представляет собой любую аминокислоту; SEQ ID NO: 15). В некоторых вариантах осуществления эффектор содержит домен 2В4.
[0027] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с линкером GS3, шарнирную область CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16 и 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с линкером GS3, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16 и 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с трансмембранным/внутриклеточным доменом CD16, и 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ и 2В4. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с внеклеточным доменом бета-адренергического рецептора, трансмембранный домен бета-адренергического рецептора, 4-1ВВ и 2В4. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ, 2В4, линкер GS3 и NKp80. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ, линкер GS3 и NKp80. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, при этом данный фрагмент кодируется последовательностью, которая является кодон-оптимизированной, и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, внеклеточный домен бета-адренергического рецептора, трансмембранный домен бета-адренергического рецептора, 4-1ВВ, дополнительный линкер GS3 и NKp80. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, транс мембранный домен CD8a, 4-1ВВ, дополнительный линкер GS3 и NKp80. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16 и 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16, 4-1ВВ и 2В4. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16, 4-1ВВ, линкер GS3 и NKp80. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который связан с шарнирной областью CD8a, и трансмембранный домен CD8a. В некоторых вариантах осуществления эффектор содержит 4-1ВВ. В определенных таких вариантах осуществления эффектор содержит 4-1ВВ, необязательно совместно с одним или несколькими из NKp80, 2В4, CD3-дзета, Dap10, Dap12, CD28 или других сигнальных доменов, предусмотренных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен дополнительно содержит CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит внутриклеточный домен 2В4. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен дополнительно содержит внутриклеточный домен DAP10.
[0028] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ, 2В4 и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 59.
[0029] В дополнение, любой из химерных рецепторов, раскрытых в данном документе, также может совместно экспрессироваться с мембраносвязанным интерлейкином 15 (mbIL15). Например, в некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, при этом внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, при этом пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, трансмембранную область, эффекторный домен, при этом такой полинуклеотид совместно экспрессируется с дополнительной конструкцией, кодирующей мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15). В некоторых вариантах осуществления химерные рецепторы, обсуждаемые в данном документе, совместно экспрессируются с mbIL-15. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ и CD3-дзета, а трансмембранная область содержит CD8a.
[0030] В некоторых вариантах осуществления химерные рецепторы сконструированы таким образом, чтобы они не содержали DNAX-активирующий белок 10 (DAP10). В дополнение, в некоторых вариантах осуществления химерные рецепторы сконструированы таким образом, чтобы они не содержали мотив ITAM.
[0031] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит один, два или все из: (а) внеклеточного рецепторного домена, содержащего фрагмент NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, (b) трансмембранной области, при этом трансмембранная область содержит CD8a, и (с) эффекторного домена, при этом эффекторный домен содержит 4-1ВВ и внутриклеточный домен 2В4 или DAP10. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 2В4, за которым расположен 4-1ВВ. В дополнительных вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ, за которым расположен 2В4. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит DAP10, за которым расположен 4-1ВВ. В дополнительных вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ, за которым расположен DAP10. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ и DAP10. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 60. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ, 2В4 и DAP10. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ, за которым расположен DAP10, за которым расположен 2В4. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ, за которым расположен 2В4, за которым расположен DAP10. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 65.
[0032] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит кодон-оптимизированный фрагмент NKG2D, связанный с внутриклеточным эффекторным доменом. В некоторых вариантах осуществления используется несколько фрагментов NKG2D, например, дополнительный фрагмент NKG2D (необязательно кодон-оптимизированный) связан с первым фрагментом, например, посредством линкера GS3. В некоторых вариантах осуществления такие химерные рецепторы дополнительно содержат шарнирную область CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 67. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид совместно экспрессируется с дополнительной конструкцией, кодирующей мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15).
[0033] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент NKG2D, который связывает нативный лиганд NKG2D и кодируется фрагментом из SEQ ID NO: 1, трансмембранную область, содержащую трансмембранную область CD3-дзета, и эффекторный домен. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент NKG2D, который связывает нативный лиганд NKG2D и кодируется SEQ ID NO: 2, трансмембранную область, содержащую транс мембранную область CD3-дзета, и эффекторный домен. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент NKG2D, который связывает нативный лиганд NKG2D и кодируется SEQ ID NO: 3, транс мембранную область, содержащую трансмембранную область CD3-дзета, и эффекторный домен. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент NKG2D, который связывает нативный лиганд NKG2D и кодируется SEQ ID NO: 68, трансмембранную область, содержащую транс мембранную область CD3-дзета, и эффекторный домен. В некоторых вариантах осуществления также можно применять фрагменты NKG2D, кодируемые любой из SEQ ID NO: 2, 3 или 68. В некоторых вариантах осуществления трансмембранная область CD3-дзета содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах осуществления также применяются фрагменты последовательности под SEQ ID NO: 69, при этом такие фрагменты сохраняют способность к передаче сигнала, составляющей по меньшей мере приблизительно 65%, приблизительно 75%, приблизительно 85% или приблизительно 95% от передачи сигнала, осуществляемой нативной субъединицей CD3-дзета (в том числе димерами). В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит дополнительные остатки, прилегающие к трансмембранной области CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления дополнительные аминокислоты являются внеклеточными остатками нативной последовательности CD3-дзета. В других вариантах осуществления дополнительные аминокислоты выбраны случайным образом. В некоторых вариантах осуществления присутствуют 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 или 20 дополнительных аминокислот. В некоторых вариантах осуществления домен химерного рецептора содержит шарнирную область, которая в некоторых вариантах осуществления представляет собой шарнирную область CD8a, кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область CD8a, кодируемую фрагментом последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В зависимости от варианта осуществления длина фрагмента составляет приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95% от длины последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В зависимости от варианта осуществления фрагмент является на приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 98% или приблизительно 99% гомологичным по отношению к последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит сигнальный пептид CD8a, который в зависимости от варианта осуществления может кодироваться последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит внутриклеточный домен CD16. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ и CD16 (при этом один из двух компонентов является "первым" в противоположность "второму" в данной конструкции). В некоторых вариантах осуществления применяются повторы одного или нескольких из 4-1ВВ и/или CD16.
[0034] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 79.
[0035] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16, за которым расположен 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 71. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 70.
[0036] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ, за которым расположен CD16, необязательно связанный посредством линкера GS3. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 85. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 84.
[0037] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16 и 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 73.
[0038] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит NKp80. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен представляет собой NKp80. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который связан с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16, 4-1ВВ и NKp80 и необязательно содержащий линкер GS3. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 74. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 75. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D (необязательно кодон-оптимизированный), шарнирную область CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16, 4-1ВВ и NKp80 и необязательно содержащий линкер GS3. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и NKp80 и необязательно содержащий линкер GS3. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 82. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 83.
[0039] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 80. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 81.
[0040] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит FcRγ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и FcRγ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 86. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 87.
[0041] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит CD28. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD28 и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 102. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 103.
[0042] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит GS-линкер.
[0043] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, совместно экспрессируются с мембраносвязанным интерлейкином 15 (mbIL15).
[0044] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент NKG2D, который способен связывать нативный лиганд NKG2D и кодируется фрагментом любой из последовательностей под SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 68, и эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент NKG2D, который способен связывать нативный лиганд NKG2D и кодируется (i) фрагментом последовательности под SEQ ID NO: 1, (ii) последовательностью под SEQ ID NO: 2, (iii) последовательностью под SEQ ID NO: 3 или (iv) последовательностью под SEQ ID NO: 68, и эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент NKG2D, который способен связывать нативный лиганд NKG2D и кодируется последовательностью под SEQ ID NO: 2, и эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент NKG2D, который способен связывать нативный лиганд NKG2D и кодируется последовательностью под SEQ ID NO: 3, и эффекторный домен, содержащий транс мембранную область и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент NKG2D, который способен связывать нативный лиганд NKG2D и кодируется фрагментом последовательности под SEQ ID NO: 68, и эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен содержит шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область CD8a, которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5 или необязательно фрагментом последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5 (например, фрагментом, на приблизительно 75%, приблизительно 85%, приблизительно 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область иммуноглобулина G4 (IgG4), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 104. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область иммуноглобулина G4 (IgG4), кодируемую фрагментом последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 104 (например, фрагментом, на приблизительно 75%, приблизительно 85%, приблизительно 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 104). В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит сигнальный пептид CD8a, при этом сигнальный пептид содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит по меньшей мере один сигнальный домен, выбранный из группы, состоящей из ОХ40 (CD134), CD3-дзета, 4-1BB, CD28 и DAP12. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен химерного рецептора содержит трансмембранный домен CD8. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит IL-15, соединенный (необязательно посредством линкера GS3) с фрагментом NKG2D, связанным с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ и CD3z. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 88. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 89.
[0045] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью IgG4, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 96. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 97.
[0046] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит ОХ40. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, ОХ40 и CD3z. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 90. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 109. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 91. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью IgG4, трансмембранный домен CD8a, ОХ40 и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 101.
[0047] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит трансмембранный/внутриклеточный домен CD28. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD28 и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 92. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 93.
[0048] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD28, 4-1ВВ и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 94. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 95.
[0049] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью IgG4, трансмембранный/внутриклеточный домен CD28 и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 98. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 99.
[0050] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит GS-линкер. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, способны совместно экспрессироваться (на том же самом полинуклеотиде либо на другом полинуклеотиде) с мембраносвязанным интерлейкином 15 (mbIL15).
[0051] Любой из химерных рецепторов необязательно может содержать внеклеточный рецепторный домен, который содержит второй пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D. В некоторых вариантах осуществления второй пептид является гомологичным по отношению к NKG2D, тогда как в других вариантах осуществления второй пептид является гетерологичным по отношению к NKG2D. Независимо от того, содержит ли химерный рецептор димеризованный внеклеточный рецепторный домен, внеклеточные рецепторные домены могут распознавать по меньшей мере следующие нативные лиганды NKG2D: MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 или ULBP6.
[0052] Как более подробно обсуждается ниже, в некоторых вариантах осуществления используются функциональные варианты доменов, связывающих лиганды NKG2D. Например, пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, в некоторых вариантах осуществления является на по меньшей мере 80% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 68.
[0053] В дополнение, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены векторы для экспрессии химерных рецепторов. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, предусмотренные в данном документе, представляют собой мРНК и могут содержать функциональную связь с по меньшей мере одним элементом, регулирующим экспрессию химерного рецептора. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды дополнительно содержат один или несколько участков внутренней посадки рибосомы (IRES). В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой ретровирус.
[0054] В некоторых вариантах осуществления также предусмотрены сконструированные естественные клетки-киллеры, которые экспрессируют любую из конструкций химерных рецепторов, раскрытых в данном документе, при этом сконструированные NK-клетки демонстрируют усиленные цитотоксические эффекты в отношении клеток-мишеней. Усиленные цитотоксические эффекты включают без ограничения более высокую аффинность к клеткам-мишеням (например, раковым) по сравнению с нормальными (например, нераковыми) клетками, более значительный эффект уничтожения, направленный на клетки-мишени, более слабые нецелевые эффекты, увеличенную длительность цитотоксических эффектов, более эффективную цитотоксичность и т.п. Такие усиленные эффекты можно идентифицировать посредством применения различных анализов цитотоксичности in vitro (например, измерения выработки цитокинов и т.д.), измерения гибели клеток-мишеней или по различным клиническим результатам (например, снижению опухолевой нагрузки). В некоторых вариантах осуществления сконструированные NK-клетки представляют собой аутологичные клетки, выделенные из организма пациента. В дополнительных вариантах осуществления сконструированные NK-клетки получены из аллогенных клеток, выделенных из организма донора. Такие сконструированные NK-клетки, раскрытые в данном документе, в некоторых вариантах осуществления применяются для усиления цитотоксичности NK-клеток у млекопитающего, нуждающегося в этом, путем введения таких NK-клеток. Эти сконструированные NK-клетки в некоторых вариантах осуществления применяются для лечения или предупреждения рака или инфекционного заболевания у млекопитающего. В некоторых вариантах осуществления также можно применять полинуклеотиды, кодирующие, векторы, несущие, и NK-клетки, экспрессирующие различные химерные рецепторы, раскрытые в данном документе, в изготовлении лекарственного препарата для усиления цитотоксичности NK-клеток (например, для лечения или предупреждения рака или инфекционного заболевания). В некоторых вариантах осуществления конструкции химерных рецепторов, раскрытые в данном документе, значительно не увеличивают цитотоксичность сконструированных NK-клеток в отношении нормальных клеток и, как описано в данном документе, являются преимущественно улучшенными по сравнению с несконструированными NK-клетками. В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, трансмембранную область и эффекторный домен. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), при этом пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D. Некоторые варианты осуществления относятся к полинуклеотид у, кодирующему химерный рецептор, содержащий: (а) внеклеточный рецепторный домен, при этом указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), при этом пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, при этом фрагмент NKG2D кодируется полинуклеотидом, содержащим: (i) фрагмент последовательности под SEQ ID NO: 1, (ii) последовательность под SEQ ID NO: 2, (iii) последовательность под SEQ ID NO: 3 или (iv) последовательность под SEQ ID NO: 68, (b) трансмембранную область и (с) эффекторный домен.
[0055] В некоторых вариантах осуществления предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит: (а) внеклеточный рецепторный домен, при этом указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), при этом пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, при этом фрагмент NKG2D кодируется полинуклеотидом, содержащим: (i) фрагмент последовательности под SEQ ID NO: 1, (ii) последовательность под SEQ ID NO: 2, (iii) последовательность под SEQ ID NO: 3 или (iv) последовательность под SEQ ID NO: 68; и (b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен.
[0056] В некоторых вариантах осуществления трансмембранная область содержит трансмембранную область CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления трансмембранная область CD3-дзета содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах осуществления трансмембранная область содержит CD8a. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ, внутриклеточный домен 2В4, NKp80, внутриклеточный домен CD16, рецептор 1, запускающий естественную цитотоксичность (NCR1), рецептор 2, запускающий естественную цитотоксичность (NCR2), рецептор 3, запускающий естественную цитотоксичность (NCR3), и/или внутриклеточный домен DAP10. В одном варианте осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ и CD16. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ и внутриклеточный домен 2В4 или DAP10. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 2В4, за которым расположен 4-1ВВ, тогда как в других вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ, за которым расположен 2В4. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит DAP10, за которым расположен 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ, за которым расположен DAP10. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен дополнительно содержит CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит по меньшей мере один сигнальный домен, выбранный из группы, состоящей из ОХ40 (CD134), CD3-дзета, 4-1ВВ, CD28 и DAP12. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит одну или несколько последовательностей полу-ITAM. В некоторых вариантах осуществления полу-ITAM содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления полу-ITAM содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 37. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит одну или несколько последовательностей ITSM. В некоторых вариантах осуществления ITSM содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15 или аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 35.
[0057] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ, 2В4 и CD3-дзета. В одном варианте осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 58. В одном варианте осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 59. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ и DAP10. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 60 и содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61.
[0058] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ, 2В4 и DAP10. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ, за которым расположен DAP10, за которым расположен 2В4. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 62, и химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит 4-1ВВ, за которым расположен 2В4, за которым расположен DAP10. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 64, и химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 65.
[0059] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ и CD3-дзета. В одном варианте осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 67.
[0060] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 78 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 79.
[0061] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16, за которым расположен 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 70 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 71.
[0062] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ, за которым расположен линкер GS3 и CD16. В одном варианте осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 85 и/или кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 84.
[0063] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16 и 4-1ВВ. В одном варианте осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 72 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 73.
[0064] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит IL-15, связанный посредством линкера GS3 с фрагментом NKG2D, связанным с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ и CD3-дзета, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 88 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 89.
[0065] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью IgG4, трансмембранный домен CD8a, 4-1BB и CD3-дзета, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 96 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 97.
[0066] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, ОХ40 и CD3z, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 90 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 91.
[0067] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью IgG4, трансмембранный домен CD8a, ОХ40 и CD3-дзета, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 100 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 101.
[0068] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD28 и CD3-дзета, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 92 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 93.
[0069] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD28, 4-1ВВ и CD3-дзета, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 94 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 95.
[0070] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью IgG4, трансмембранный/внутриклеточный домен CD28 и CD3-дзета, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 98 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 99.
[0071] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16, 4-1ВВ, линкер GS3 и NKp80. В одном варианте осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 74 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 75.
[0072] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16, 4-1ВВ, линкер GS3 и NKp80. В одном варианте осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 76 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 77. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ, линкер GS3 и NKp80. В одном варианте осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 82 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 83.
[0073] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и CD3-дзета. В одном варианте осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 80 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 81.
[0074] В зависимости от варианта осуществления эффекторный домен также может содержать FcRγ. Например, в некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и FcRγ. В одном варианте осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 86 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 87.
[0075] В зависимости от варианта осуществления эффекторный домен также может содержать CD28. Например, в некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD28 и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 102 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 103.
[0076] В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит GS-линкер.
[0077] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит сигнальный пептид CD8a, при этом сигнальный пептид содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 4. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит 2 внеклеточных остатка CD3-дзета, непосредственно прилегающих к трансмембранной области CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен содержит сигнальный пептид CD8a, при этом сигнальный пептид содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 4.
[0078] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит один или несколько линкеров GS3. В некоторых вариантах осуществления домен химерного рецептора содержит шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5, тогда как в других определенных вариантах осуществления шарнирная область кодируется фрагментом последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область CD8a. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит повторяющийся мотив глицин-серин, имеющий аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 31. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 32, а в определенных вариантах осуществления шарнирная область содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 33. В дополнительных вариантах осуществления шарнирная область кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит часть бета-адренергического рецептора. В определенных таких вариантах осуществления шарнирная область кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 40. В дополнительных вариантах осуществления шарнирная область кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 42. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область иммуноглобулина G4 (IgG4), кодируемую последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 104. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область представляет собой шарнирную область иммуноглобулина G4 (IgG4), кодируемую фрагментом последовательности нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 104. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, и трансмембранный домен CD8a.
[0079] В одном варианте осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с CD16, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 23 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24. В одном варианте осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с NCR1. В определенных таких вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 27 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит по меньшей мере часть аминокислотной последовательности под SEQ ID NO: 21. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с NCR3, в некоторых вариантах осуществления он кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 29 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 30.
[0080] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с трансмембранным/внутриклеточным доменом CD16, и 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16 и 4-1ВВ, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 25 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26.
[0081] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с NCR1, и 4-1ВВ, при этом химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность NCR1 под SEQ ID NO: 20.
[0082] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с CD8a, 4-1ВВ и CD3z, кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18 и/или содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19.
[0083] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с NCR3, и 4-1ВВ, и при этом NCR3 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 22. В одном варианте осуществления химерный рецептор содержит один или несколько из трансмембранного/внутриклеточного домена NCR1 под SEQ ID NO: 20 или трансмембранного/внутриклеточного домена NCR3 под SEQ ID NO: 22.
[0084] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с линкером GS3, шарнирную область CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16 и 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления химерные рецепторы содержат фрагмент NKG2D, связанный с линкером GS3, трансмембранный/внутриклеточный домен CD 16 и 4-1ВВ. В одном варианте осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 44.
[0085] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с трансмембранным/внутриклеточным доменом CD16, и 4-1ВВ и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 45.
[0086] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ и 2В4 и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 46.
[0087] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с внеклеточным доменом бета-адренергического рецептора, трансмембранный домен бета-адренергического рецептора, 4-1ВВ и 2В4 и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 47.
[0088] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ, 2В4, линкер GS3 и NKp80 и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 48.
[0089] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1BB, линкер GS3 и NKp80 и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 49.
[0090] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, внеклеточный домен бета-адренергического рецептора, трансмембранный домен бета-адренергического рецептора, 4-1ВВ, дополнительный линкер GS3 и NKp80 и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 50.
[0091] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранный домен CD8a, 4-1ВВ, дополнительный линкер GS3 и NKp80 и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 51.
[0092] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16 и 4-1ВВ и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 52.
[0093] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16, 4-1ВВ и 2В4 и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 53.
[0094] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD16, 4-1ВВ, линкер GS3 и NKp80 и кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 54.
[0095] В некоторых вариантах осуществления конструкции химерных рецепторов кодируются полинуклеотидом, который кодирует химерный рецептор, где внеклеточный рецепторный домен содержит второй пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D (например, один или несколько из MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 или ULBP6). В зависимости от варианта осуществления пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, является на по меньшей мере 80% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 3.
[0096] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид совместно экспрессируется с дополнительной конструкцией, кодирующей мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 19.
[0097] Согласно некоторым вариантам осуществления химерный рецептор не содержит DNAX-активирующий белок 10 (DAP10), и/или химерный рецептор не кодирует иммунорецепторный тирозиновый активирующий (ITAM) мотив.
[0098] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, представляют собой мРНК. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды, раскрытые в данном документе, функционально связаны с по меньшей мере одним элементом, регулирующим экспрессию химерного рецептора.
[0099] Также в данном документе предусмотрены векторы, которые содержат полинуклеотиды, раскрытые в данном документе. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид функционально связан с по меньшей мере одним элементом, регулирующим экспрессию химерного рецептора. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой ретровирус.
[00100] Также в данном документе предусмотрены сконструированные естественные клетки-киллеры, содержащие любые один или более из полинуклеотидов, раскрытых в данном документе. В некоторых вариантах осуществления естественные клетки-киллеры предназначены для аутологичного применения, тогда как в других определенных вариантах осуществления они предназначены для аллогенного применения.
[00101] Также в данном документе предусмотрены способы усиления цитотоксичности NK-клеток у млекопитающего, нуждающегося в этом, включающие введение млекопитающему NK-клеток, при этом указанные NK-клетки экспрессируют химерный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, раскрытым в данном документе.
[00102] В дополнение, в данном документе предусмотрены способы лечения или предупреждения рака или инфекционного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в этом, при этом указанный способ включает введение указанному млекопитающему терапевтически эффективного количества NK-клеток, при этом указанные NK-клетки экспрессируют химерный рецептор, кодируемый полинуклеотидом, раскрытым в данном документе. Как раскрыто выше, NK-клетки могут быть аллогенными или аутологичными.
[00103] В данном документе предусмотрено применение полинуклеотида, раскрытого в данном документе, в изготовлении лекарственного препарата для усиления цитотоксичности NK-клеток у млекопитающего, нуждающегося в этом. Дополнительно в данном документе предусмотрено применение полинуклеотида в изготовлении лекарственного препарата для лечения или предупреждения рака или инфекционного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в этом.
[00104] Также предусмотрено применение вектора, содержащего полинуклеотид, раскрытый в данном документе, в изготовлении лекарственного препарата для усиления цитотоксичности NK-клеток у млекопитающего, нуждающегося в этом. Также предусмотрено применение вектора, содержащего полинуклеотид, раскрытый в данном документе, в изготовлении лекарственного препарата для лечения или предупреждения рака или инфекционного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в этом.
[00105] Также предусмотрено применение выделенной естественной клетки-киллера, полученной методами генной инженерии, экспрессирующей химерный рецептор, раскрытый в данном документе, для усиления цитотоксичности NK-клеток у млекопитающего, нуждающегося в этом. Также предусмотрено применение выделенной естественной клетки-киллера, полученной методами генной инженерии, экспрессирующей химерный рецептор, раскрытый в данном документе, для лечения или предупреждения рака или инфекционного заболевания у млекопитающего, нуждающегося в этом.
[00106] Для композиций и связанных с ними способов, обобщенных выше и изложенных более подробно ниже, описаны определенные действия, осуществляемые практикующим специалистом; однако, следует понимать, что они также могут включать предоставление инструкций по выполнению этих действий другой стороной. Таким образом, такие действия, как "введение популяции NK-клеток, экспрессирующих химерный рецептор", включают "предоставление инструкций по введению популяции NK-клеток, экспрессирующих химерный рецептор".
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[00107] Представленные ниже описания фигур относятся к экспериментам и результатам, которые представляют неограничивающие варианты осуществления настоящего изобретения, раскрытые в данном документе.
[00108] На фиг. 1А-1С изображены схематические представления химерных рецепторов согласно некоторым вариантам осуществления, раскрытым в данном документе. На фиг. 1А изображен эндогенный NKG2D, на фиг. 1В изображен NKG2D-DAP10-CD3ζ, а на фиг. 1С изображен NKG2D-41BB-CD3ζ.
[00109] На фиг. 2А-2В изображены схематические представления химерных рецепторов согласно некоторым вариантам осуществления, раскрытым в данном документе. На фиг. 2А изображен NKG2D-CD16, а на фиг. 2В изображен NKG2D-CD16-41BB.
[00110] На фиг. 3А-3В изображены карты плазмид, на которых проиллюстрирована точка встраивания определенных конструкций согласно некоторым вариантам осуществления в плазмиды; проиллюстрирована плазмида на основе вируса стволовых клеток мышей (MSCV). На фиг. 3А показаны генные конструкции для NKG2D-DAP10-CD3ζ и NKG2D-41BB-CD3ζ, которые были встроены в сайты рестрикции EcoRI и NotI с удалением последовательности IRES-GFP в данном векторе. На фиг. 3В изображены плазмиды для NKG2D-CD16 и NKG2D-CD16-41BB, которые были встроены в сайты рестрикции EcoRI и XhoI, расположенные в сайте множественного клонирования (MCS). Последовательность IRES-GFP в данном векторе позволяет отслеживать эффективность трансдукции.
[00111] На фиг. 4А-4С изображены данные, относящиеся к экспрессии NKG2D-DAP10-CD3ζ и NKG2D-41BB-CD3ζ в NK-клетках. На фиг. 4А показаны данные проточной цитометрии, иллюстрирующие процентную долю NKG2D-положительных NK-клеток после трансдукции. На фиг. 4В показаны точечные диаграммы, на которых в обобщенном виде представлена процентная доля NKG2D-положительных NK-клеток. На фиг. 4С показаны данные, относящиеся к средней интенсивности флуоресценции (MFI) в различных группах NK-клеток после трансдукции.
[00112] На фиг. 5А-5С изображены данные, относящиеся к цитотоксичности различных конструкций, полученных из NK-клеток от донора 1, донора 2 и донора 3 (фиг. 5А, 5В и 5С соответственно), в отношении культивируемых клеток REH.
[00113] На фиг. 6А-6С изображены данные, относящиеся кцитотоксичности различных конструкций, полученных из NK-клеток от донора 1, донора 2 и донора 3 (фиг. 6А, 6В и 6С соответственно), в отношении культивируемых клеток U-2 OS.
[00114] На фиг. 7А-7В изображены данные, относящиеся к выработке интерферона-гамма NK-клетками, экспрессирующими различные конструкции NKG2D, при наличии и в отсутствие стимуляции клетками REH. На фиг. 7А изображено относительное количество IFNγ в различных группах NK-клеток со стимуляцией клетками REH или без нее. На фиг. 7В изображены уровни IFNγ среди различных групп NK-клеток после стимуляции (представлены медианные значения).
[00115] На фиг. 8А-8С изображены данные, относящиеся к экспрессии NKG2D-DAP10-CD3ζ и NKG2D-CD16 в NK-клетках. На фиг. 8А показаны данные проточной цитометрии, иллюстрирующие процентную долю NKG2D-положительных NK-клеток после трансдукции. На фиг. 8В показаны точечные диаграммы, на которых в обобщенном виде представлена процентная доля NKG2D-положительных NK-клеток. На фиг. 8С показаны данные, относящиеся к средней интенсивности флуоресценции (MFI) в различных группах NK-клеток после трансдукции.
[00116] На фиг. 9А-9С изображены данные, относящиеся к цитотоксичности различных конструкций, полученных из NK-клеток от 3 доноров (фиг. 9А, 9В и 9С соответственно), в отношении культивируемых клеток REH.
[00117] На фиг. 10А-10С изображены данные, относящиеся к цитотоксичности различных конструкций, полученных из NK-клеток от 3 доноров (фиг. 10А, 10В и 10С соответственно), в отношении культивируемых клеток U-2 OS.
[00118] На фиг. 11 изображены данные, относящиеся к выработке интерферона-гамма NK-клетками, экспрессирующими различные конструкции NKG2D, при наличии и в отсутствие стимуляции клетками REH.
[00119] На фиг. 12А-12В изображены данные, относящиеся к экспрессии NKG2D-DAP10-CD3ζ и NKG2D-CD16-41BB в NK-клетках. На фиг. 12А показаны данные проточной цитометрии, иллюстрирующие процентную долю NKG2D-положительных NK-клеток после трансдукции. На фиг. 12В показана гистограмма, относящаяся к относительной величине поверхностной экспрессии различных конструкций на NK-клетках.
[00120] На фиг. 13А-13В изображены данные, относящиеся к степени цитотоксичности различных конструкций NKG2d. На фиг. 13А изображена степень цитотоксичности в отношении культивируемых клеток REH. На фиг. 13В изображена степень цитотоксичности в отношении культивируемых клеток U-2 OS.
[00121] На фиг. 14 схематически изображены карты конструкций для некоторых конструкций NKG2D согласно определенным вариантам осуществления, раскрытым в данном документе.
[00122] На фиг. 15 схематически изображены карты конструкций для дополнительных конструкций NKG2D согласно определенным вариантам осуществления, раскрытым в данном документе.
[00123] На фиг. 16А-16С изображены данные, относящиеся к экспрессии различных конструкций NKG2D в NK-клетках. На фиг. 16А показаны данные, относящиеся к средней интенсивности флуоресценции (MFI) для различных конструкций NKG2D в NK-клетках. На фиг. 16В показаны данные проточной цитометрии, иллюстрирующие процентную долю NKG2D-положительных и CD56-положительных NK-клеток после трансдукции NK-клеток от двух доноров (505 и 870) различными конструкциями NKG2D. На фиг. 16С показаны данные, относящиеся к средней интенсивности флуоресценции (MFI) в NK-клетках от 2 доноров через семь дней после трансдукции.
[00124] На фиг. 17 изображены данные, относящиеся к цитотоксичности различных конструкций NKG2D через 14 дней после трансдукции NK-клеток при соотношении Е:Т 1:1.
[00125] На фиг. 18А-18В изображены данные, относящиеся к экспрессии различных конструкций NKG2D после трансдукции NK-клеток. На фиг. 18А показаны данные, относящиеся к средней интенсивности флуоресценции (MFI) в NK-клетках через семь дней после трансдукции. На фиг. 18В показаны данные, относящиеся к кратности изменения MFI для различных конструкций NKG2D по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками.
[00126] На фиг. 19А-19В изображены данные, относящиеся к цитотоксичности различных конструкций NKG2D. На фиг. 19А показаны данные, относящиеся к цитотоксичности различных конструкций NKG2D, введенных в NK-клетки путем трансдукции при соотношении Е:Т 1:1. На фиг. 19В показаны данные, относящиеся к процентному изменению цитотоксичности различных конструкций NKG2D по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками.
[00127] На фиг. 20 изображены данные, относящиеся к цитотоксичности различных конструкций NKG2D через 14 дней после трансдукции NK-клеток при соотношении Е:Т 1:1. Перед анализом NK-клетки культивировали в среде, дополненной 40 ME IL-2/мл.
[00128] На фиг. 21 изображены данные, относящиеся к цитотоксичности различных конструкций NKG2D через 10 дней после трансдукции NK-клеток от донора 238 (культивируемых в течение 4 дней в среде, дополняемой 40 ME IL-2/мл каждые два дня) в отношении культивируемых клеток REH при соотношениях Е:Т 1:1 и 1:2 в течение двух часов.
[00129] На фиг. 22 схематически изображены карты конструкций для дополнительных конструкций NKG2D согласно вариантам осуществления, раскрытым в данном документе.
[00130] На фиг. 23А-23В изображены данные, относящиеся к персистенции различных конструкций NKG2D, полученных из NK-клеток от двух различных доноров (донора 61 и донора 103 на фиг. 23А и 23В соответственно). NK-клетки культивировали в среде, дополненной 40 ME IL-2/мл.
[00131] На фиг. 24 изображены данные, относящиеся к экспрессии различных конструкций NKG2D. NK-клетки размножали из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) от 4 здоровых доноров (224, 225, 362 и 363) и трансдуцировали вирусами, управляющими экспрессией указанных конструкций. Через три дня после трансдукции NK-клетки окрашивали флуоресцентно меченным антителом к NKG2D и анализировали с помощью проточной цитометрии. Относительную экспрессию NKG2D оценивали по средней интенсивности флуоресценции (MFI) в меченых клетках.
[00132] На фиг. 25А-25В изображены данные, относящиеся к цитотоксичности NK-клеток, трансдуцированных различными конструкциями NKG2D. NK-клетки размножали из РВМС от 4 доноров; через восемь дней после трансдукции измеряли цитотоксичность NK в отношении культивируемых клеток REH и HL60 (фиг. 25А и 25В соответственно) при соотношении Е:Т 1:1. Перед анализом NK-клетки культивировали в среде, дополненной 40 ME IL-2/мл.
[00133] На фиг. 26А-26С изображены данные, относящиеся к выработке интерферона-гамма (IFNγ), фактора некроза опухоли-альфа (TNFα) и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) NK-клетками, экспрессирующими различные конструкции NKG2D, после стимуляции опухолевыми клетками REH в течение ночи. Через восемь дней после трансдукции указанными конструкциями 1×105 NK-клеток стимулировали с помощью 1×105 клеток REH в отдельных лунках 96-луночного круглодонного планшета; после инкубирования в течение ночи собирали образцы надосадочной жидкости, и с помощью устройства Meso Scale Discovery измеряли уровни цитокинов относительно соответствующих стандартов. На фиг. 26А изображены суммарные уровни IFNγ, на фиг. 26В изображены уровни TNFα, а на фиг. 26С изображены уровни GM-CSF в различных группах NK-клеток после стимуляции. Перед анализом NK-клетки культивировали в среде, дополненной 40 ME IL-2/мл.
[00134] На фиг. 27А-27В изображены данные, относящиеся к персистенции NK-клеток от двух доноров (доноров 224 и 225 на фиг. 27А и 27В соответственно), экспрессирующих различные конструкции NKG2D, через 7, 14 и 21 день после трансдукции. Перед анализом NK-клетки культивировали в среде, дополненной 40 ME IL-2/мл.
[00135] На фиг. 28А-28В изображены данные, относящиеся к цитотоксичности NK-клеток, трансдуцированных указанными конструкциями NKG2D. Цитотоксичность NK измеряли в отношении клеток U-2 OS, стабильно трансдуцированных таким образом, что они экспрессировали красный флуоресцентный белок; клетки U-2 OS культивировали с NK-клетками при соотношениях Е:Т 1:4 и 1:2 (фиг. 28А и 28В соответственно). Живые клетки U-2 OS подсчитывали каждые 60 минут в течение 72 часов с помощью системы для анализа живых клеток IncuCyte S3. Перед анализом NK-клетки культивировали в среде, дополненной 40 ME IL-2/мл.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Общая информация
[00136] Возникновение и персистенция аномальных клеток (в том числе инфицированных вирусами и злокачественных клеток), которые лежат в основе многих заболеваний, становятся возможными из-за недостаточного иммунного ответа на указанные аномальные клетки. Целью иммунотерапии является инициирование или усиление ответа иммунной системы пациента, например, повышение способности иммунных клеток, таких как естественные клетки-киллеры (NK), повреждать, уничтожать или иным образом ингибировать поврежденные или пораженные клетки. Одним из иммунотерапевтических подходов является рекомбинантная экспрессия химерных рецепторов в иммунных клетках для целенаправленного распознавания и разрушения аномальных клеток. Как правило, химерные рецепторы содержат внеклеточный рецепторный домен, который распознает лиганды на клетках-мишенях, заякоривающий трансмембранный домен и эффекторный домен, который при связывании с лигандом передает активирующие сигналы. В определенных вариантах осуществления, раскрытых в данном документе, используются химерные рецепторы, имеющие такую общую структуру или имеющие изменения в такой общей структуре. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления транс мембранный домен и эффекторный домен являются отдельными пептидами, которые слиты друг с другом. В некоторых других вариантах осуществления трансмембранный и эффекторный домены происходят из одного и того же пептида. В определенных таких вариантах осуществления трансмембранный и эффекторный домены образуют один пептид (например, один пептид, который пересекает мембрану, а также готов инициировать сигнальный каскад). Как более подробно обсуждается ниже, усечения, мутации, дополнительные линкерные/спейсерные элементы, димеры и т.п. применяются для получения конструкций химерных рецепторов, которые демонстрируют требуемую степень экспрессии в иммунной клетке (например, NK-клетке), индуцируют цитотоксическую активность NK-клетки, соразмерную со степенью авидности к мишени, что позволяет избежать неблагоприятных эффектов в отношении клеток, не являющихся мишенями. Рекомбинантная экспрессия химерных рецепторов, раскрытых в данном документе, на поверхности иммунных клеток может перенаправлять нацеливание иммунных клеток на аномальные клетки, представляющие интерес, а также усиливать активацию иммунной системы после вовлечения.
NK-клетки для иммунотерапии
[00137] Один иммунотерапевтический подход предусматривает введение пациентам Т-клеток, сконструированных таким образом, что они экспрессируют химерные рецепторы, чтобы вызвать положительный иммунный ответ. Однако, недостаток этого подхода заключается в том, что для него необходимо применение аутологичных клеток для предупреждения индуцирования у пациента реакции "трансплантат против хозяина". Как представлено в некоторых вариантах осуществления, раскрытых в данном документе, композиции, содержащие сконструированные NK-клетки, обладают несколькими преимуществами. Например, в подходе с NK-клетками можно использовать аутологичные либо полученные от донора аллогенные клетки. Кроме того, согласно некоторым вариантам осуществления сконструированные NK-клетки, предусмотренные в данном документе, не характеризуются значительным увеличением цитотоксичности в отношении нормальных клеток. В дополнение, NK-клетки после активации оказывают значительный цитотоксический эффект. Ввиду этого неожиданно, что сконструированные NK-клетки, предусмотренные в данном документе, способны дополнительно повышать такой цитотоксический эффект, таким образом представляя собой еще более эффективное средство избирательного уничтожения пораженных клеток-мишеней. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен способ лечения или предупреждения рака или инфекционного заболевания, включающий введение терапевтически эффективного количества NK-клеток, экспрессирующих химерные рецепторы, описанные в данном документе. В одном варианте осуществления вводимые NK-клетки являются аутологичными клетками. В дополнительном варианте осуществления вводимые NK-клетки являются полученными от донора (аллогенными) клетками.
[00138] В некоторых вариантах осуществления привлечение и активация рекомбинантной NK-клетки (например, посредством связывания с лигандом на клетке-мишени), экспрессирующей химерный рецептор, приводит к прямому уничтожению подвергнутой стрессу и/или аномальной клетки (например, опухолевых клеток, инфицированных вирусами клеток и т.д.) посредством цитолиза. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрен способ усиления цитотоксичности NK-клеток, включающий введение NK-клеток, сконструированных таким образом, что они экспрессируют химерные рецепторы, описанные в данном документе. В одном варианте осуществления вводимые NK-клетки являются аутологичными клетками. В дополнительном варианте осуществления NK-клетки являются полученными от донора (аллогенными) клетками. В некоторых вариантах осуществления сконструированные NK-клетки приводят к непрямому разрушению или ингибированию подвергнутой стрессу и/или аномальной клетки (например, опухолевых клеток, инфицированных вирусами клеток и т.д.).
Лигандсвязывающие домены
[00139] Как упомянуто выше, в некоторых вариантах осуществления NK-клетки распознают и уничтожают аномальные клетки, в том числе опухолевые клетки и инфицированные вирусами клетки. Цитотоксическая активность этих клеток врожденной иммунной системы регулируется балансом передачи сигналов соответственно от ингибирующих и активирующих рецепторов, которые находятся на поверхности клетки. Первые из них связывают "свои" молекулы, экспрессируемые на поверхности здоровых клеток, тогда как последние из них связывают лиганды, экспрессируемые на аномальных клетках. Увеличение вовлечения активирующих рецепторов по сравнению с ингибирующими рецепторами приводит к активации NK-клеток и лизису клеток-мишеней. Член D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D) является важным рецептором, активирующим NK-клетки, который распознает ряд лигандов, экспрессируемых на подвергнутых стрессу и аномальных клетках. Поверхностная экспрессия различных лигандов NKG2D в здоровых клетках обычно является низкой, но повышается при злокачественной трансформации или инфицировании вирусом. Неограничивающие примеры лигандов, распознаваемых NKG2D, включают без ограничения MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 и ULBP6, а также другие молекулы, экспрессируемые на клетках-мишенях, которые контролируют цитолитическую или цитотоксическую функцию NK-клеток.
[00140] Способность NKG2D распознавать множество поверхностных маркеров клеточного стресса и инфекции делает его потенциально полезным компонентом иммунотерапевтического подхода, основанного на использовании химерных рецепторов. Однако, взаимосвязь NKG2D со своим партнером DAP10 осложняет его применение в качестве химерного рецептора. NKG2D представляет собой транс мембранный гликопротеин II типа, который образует гомодимеры и подвергается сборке вместе с двумя гомодимерами DNAX-активирующего белка 10 (DAP10) с образованием гексамерных комплексов на поверхности мембраны. Данное связывание NKG2D-DAP10 необходимо как для экспрессии эндогенного NKG2D на поверхности мембраны, так и для передачи активирующего сигнала при связывании с лигандом. В некоторых вариантах осуществления применяется полноразмерный NKG2D. В одном варианте осуществления полноразмерный NKG2D характеризуется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 1. Согласно некоторым вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерные рецепторы, где внеклеточный рецепторный домен представляет собой фрагмент NKG2D, у которого отсутствуют его нативные трансмембранный или внутриклеточный домены, но в то же время преимущественно сохраняется его способность связывать нативные лиганды NKG2D, а также передавать активирующие сигналы при связывании с лигандом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления химерный рецептор, кодируемый полипептидами, раскрытыми в данном документе, не содержит DAP10. В некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D кодируется SEQ ID NO: 2. В некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к полноразмерному NKG2D дикого типа. В некоторых вариантах осуществления фрагмент может иметь одну или несколько дополнительных мутаций в SEQ ID NO: 2, но сохраняет или в определенных вариантах осуществления имеет усиленную лигандсвязывающую функцию. В некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D предусмотрен в формате димера, тримера или другого конкатемера, при этом такие варианты осуществления обеспечивают усиленную лигандсвязывающую активность. В некоторых вариантах осуществления последовательность, кодирующая фрагмент NKG2D, необязательно является полностью или частично кодон-оптимизированной. В одном варианте осуществления последовательность, кодирующая кодон-оптимизированный фрагмент NKG2D, содержит последовательность под SEQ ID NO: 3. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления применяются сигнальные пептиды. Вид или последовательность сигнального пептида могут варьироваться в зависимости от конструкции. Однако, в некоторых вариантах осуществления применяется сигнальный пептид, полученный из CD8. В одном варианте осуществления сигнальный пептид получен из CD8a и имеет последовательность под SEQ ID NO: 4. В одном варианте осуществления последовательность, кодирующая кодон-оптимизированный фрагмент NKG2D, содержит последовательность под SEQ ID NO: 68. В некоторых вариантах осуществления фрагмент может иметь одну или несколько дополнительных мутаций в SEQ ID NO: 68, но сохраняет лигандсвязывающую функцию. В некоторых вариантах осуществления фрагмент может иметь одну или несколько дополнительных мутаций в SEQ ID NO: 68, но имеет улучшенную лигандсвязывающую функцию.
Трансмембранные, сигнальные и комбинированные домены
[00141] Как упомянуто выше, общая структура химерного антигенного рецептора содержит по меньшей мере один трансмембранный домен, соединяющий лигандсвязывающий домен с сигнальным(сигнальными) доменом(доменами). В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен, однако, также может служить для обеспечения функции передачи сигнала.
[00142] В некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D сохраняет по меньшей мере часть своего нормального трансмембранного домена. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит по меньшей мере часть CD8, который представляет собой транс мембранный гликопротеин, в обычных условиях экспрессируемый как на Т-клетках, так и на NK-клетках. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит CD8α, тогда как в других определенных вариантах осуществления применяется CD8β. В некоторых вариантах осуществления "шарнирная область" CD8α имеет последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления CD8α может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к CD8α, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 5. В некоторых вариантах осуществления CD8β имеет последовательность под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления CD8β может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к CD8β, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 6. В некоторых вариантах осуществления применяются димеры CD8α и CD8β.
[00143] В некоторых вариантах осуществления транс мембранный домен содержит CD16, который также служит в качестве сигнального домена. CD16 существует в двух изоформах а и b (также известных как соответственно Fc-гамма-рецептор IIIa и IIIb). Эти рецепторы в обычных условиях связываются с Fc-частью антител IgG, которая, в свою очередь, активирует NK-клетки. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит CD16a, тогда как в других определенных вариантах осуществления применяется CD16b. В некоторых вариантах осуществления CD16a имеет последовательность под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления CD16a может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к CD16a, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 7. В некоторых вариантах осуществления CD16b имеет последовательность под SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления CD16b может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к CD16b, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 8. В некоторых вариантах осуществления применяются димеры CD16a и CD16b. В некоторых вариантах осуществления модификации трансмембранного домена CD16 включают дополнительные остатки нуклеиновой кислоты для увеличения длины домена. В качестве альтернативы, CD16 может быть укорочен. Модификации длины CD16 преимущественно могут способствовать усилению лиганд-рецепторных взаимодействий.
[00144] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит домен рецептора 2В4 естественных киллеров (называемого в данном документе "2В4", а также известного как CD244), который также служит в качестве сигнального домена. 2В4 экспрессируется на NK-клетках и регулирует уничтожение, не рестриктированное по антигенам главного комплекса гистосовместимости (МНС), посредством взаимодействий между данным рецептором и его лигандами на клетках-мишенях. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит 2В4, тогда как в некоторых других вариантах осуществления домен 2В4 является внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления 2В4 имеет последовательность под SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления 2В4 может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к 2В4, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 9. В некоторых вариантах осуществления 2В4 применяется в качестве единственного трансмембранного/сигнального домена в конструкции, однако, в некоторых вариантах осуществления 2В4 можно применять вместе с одним или несколькими другими доменами. Например, в определенных вариантах осуществления применяются комбинации CD16, 4-1ВВ и/или 2В4.
[00145] В определенных вариантах осуществления передача сигнала осуществляется посредством DAP10, как упомянуто выше. В некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D связывается с DAP10, передавая процитотоксические сигналы в NK-клетку. В некоторых вариантах осуществления применяются димеры DAP10. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит DAP10. В некоторых вариантах осуществления DAP10 имеет последовательность под SEQ ID NO: 10. В некоторых вариантах осуществления DAP10 может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к DAP10, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 10. Аналогично, в определенных вариантах осуществления можно применять DAP12, поскольку он также может передавать такие сигналы. В некоторых вариантах осуществления DAP12 имеет последовательность под SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления DAP12 может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к DAP12, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 11. В некоторых вариантах осуществления применяются гетеродимеры DAP10 и DAP12.
[00146] В некоторых вариантах осуществления передача сигналов обеспечивается посредством 4-1ВВ (также известного как CD137 и член 9 суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли (TNFRSF 9)). 4-1ВВ является костимулирующей молекулой, представляющей собой контрольную точку иммунного ответа, обычно функционирующей в качестве стимулирующей молекулы для активированных Т-клеток (например, перекрестное связывание 4-1ВВ усиливает пролиферацию и цитолитическую активность Т-клеток). Однако, в некоторых вариантах осуществления функция 4-1ВВ преимущественно используется совместно с NK-клетками. В некоторых вариантах осуществления 4-1ВВ имеет последовательность под SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления 4-1ВВ может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к 4-1ВВ, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 12. В некоторых вариантах осуществления 4-1ВВ является единственным сигнальным доменом, но, как обсуждается выше, в некоторых вариантах осуществления 4-1ВВ неожиданно эффективно функционирует в комбинации с одним или несколькими из других трансмембранных/сигнальных доменов, раскрытых в данном документе. Например, в некоторых вариантах осуществления CD16 совместно с 4-1ВВ обеспечивает синергические стимулирующие эффекты, что в результате приводит к получению особенно эффективных (например, цитотоксических) NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления DAP10 совместно с 4-1ВВ обеспечивает синергические стимулирующие эффекты, что в результате приводит к получению особенно эффективных (например, цитотоксических) NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления DAP10 совместно с 4-1ВВ и/или 2В4 обеспечивает синергические стимулирующие эффекты, что в результате приводит к получению особенно эффективных (например, цитотоксических) NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления в результате получаются другие улучшенные характеристики, например, улучшенная экспрессия, улучшенная персистенция и т.п.
[00147] В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен содержит по меньшей мере часть Т-клеточного рецепторного комплекса CD3. Т-клеточный рецепторный комплекс содержит несколько субъединиц, в том числе субъединицы дзета, альфа, бета, гамма, дельта и эпсилон. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки, сконструированные согласно некоторым вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, содержат по меньшей мере одну из этих субъединиц (или ее фрагмент). В некоторых вариантах осуществления сигнальный домен содержит субъединицу CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления CD3-дзета имеет последовательность под SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления CD3-дзета может быть усеченной или модифицированной, так что она является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к CD3-дзета, имеющей последовательность под SEQ ID NO: 13. В некоторых вариантах осуществления CD3-дзета является мутантной (например, с аминокислотными мутациями, вставками или делециями), так что данный домен больше не совместим с каноническим иммунорецепторным тирозиновым активирующим мотивом или мотивом ITAM. Так, в некоторых вариантах осуществления NK-клетки содержат сконструированный рецептор, который не содержит мотив ITAM. В определенных вариантах осуществления полученные в результате сконструированные NK-клетки демонстрируют особенно усиленную цитотоксичность в отношении клеток-мишеней с ограниченными или более слабыми неблагоприятными побочными эффектами. В некоторых вариантах осуществления это происходит в результате синергических взаимодействий различных частей химерного рецептора, которые применяются в таком указанном варианте осуществления. В некоторых вариантах осуществления CD3-дзета совместно с 4-1ВВ обеспечивает синергические стимулирующие эффекты, что в результате приводит к получению особенно эффективных (например, цитотоксических) NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления CD3-дзета совместно с 2В4 обеспечивает синергические стимулирующие эффекты, что в результате приводит к получению особенно эффективных (например, цитотоксических) NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления CD3-дзета в комбинации с 2В4 и/или 4-1ВВ обеспечивает синергические стимулирующие эффекты, что в результате приводит к получению особенно эффективных (например, цитотоксических) NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления химерные рецепторы оказывают влияние на димеризацию CD3-дзета посредством их трансмембранного домена. Так, в некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит трансмембранный домен CD3-дзета (или его фрагмент). В определенных вариантах осуществления 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше остатков внеклеточной части CD3-дзета ("околомембранной части") непосредственно прилегают к трансмембранному домену CD3-дзета. В определенных вариантах осуществления трансмембранный домен CD3-дзета имеет последовательность под SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD3-дзета может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к трансмембранному домену CD3-дзета, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 69. В некоторых вариантах осуществления модификации трансмембранного домена CD3-дзета включают дополнительные остатки нуклеиновой кислоты для увеличения длины домена. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD3-дзета и околомембранная часть CD3-дзета рекрутируют полноразмерную молекулу CD3-дзета в синапс. В некоторых вариантах осуществления рекрутирование нативного CD3-дзета к сконструированному рецептору (по сравнению с рецептором без трансмембранного домена CD3-дзета) увеличивается на приблизительно 20%, на приблизительно 30%, на приблизительно 40%, на приблизительно 50% или больше в зависимости от варианта осуществления. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD3-дзета связан с эффекторным доменом, содержащим один или несколько из CD16, NCR1, NCR2, NCR3, 4-1ВВ, NKp80, FcRγ, CD3-дзета и 2В4.
[00148] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит домен CD28. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит CD28, тогда как в некоторых других вариантах осуществления домен CD28 является внутриклеточным сигнальным доменом, тогда как еще в некоторых других вариантах осуществления домен CD28 является трансмембранным/внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD28 имеет последовательность под SEQ ID NO: 105. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD28 может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к CD28, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 105. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CD28 имеет последовательность под SEQ ID NO: 106. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CD28 может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к CD28, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 106. В некоторых вариантах осуществления CD28 применяется в качестве единственного трансмембранного/сигнального домена в конструкции, однако, в некоторых вариантах осуществления CD28 можно применять вместе с одним или несколькими другими доменами. Например, в определенных вариантах осуществления применяются комбинации CD28, ОХ40, 4-1ВВ и/или CD3-дзета.
[00149] В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит домен ОХ40. В некоторых вариантах осуществления домен ОХ40 является внутриклеточным сигнальным доменом. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен ОХ40 имеет последовательность под SEQ ID NO: 107. В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен ОХ40 может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к ОХ40, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 107. В некоторых вариантах осуществления ОХ40 применяется в качестве единственного трансмембранного/сигнального домена в конструкции, однако, в некоторых вариантах осуществления ОХ40 можно применять вместе с одним или несколькими другими доменами. Например, в определенных вариантах осуществления применяются комбинации CD28, ОХ40, 4-1ВВ и/или CD3-дзета.
[00150] В еще нескольких дополнительных вариантах осуществления сигнальная часть химерного рецептора содержит часть ITAM, например, полу-ITAM. В некоторых вариантах осуществления эти части не составляют каноническую последовательность ITAM, а скорее образуют часть, которая все еще может передавать сигнал, необходимый для цитотоксичности NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления полу-ITAM имеет последовательность под SEQ ID NO: 14 (где X может быть любым остатком). В некоторых вариантах осуществления полу-ITAM может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к полу-ITAM, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления конструкция химерного рецептора содержит полу-ITAM под SEQ ID NO: 14. В некоторых вариантах осуществления можно применять несколько полу-ITAM, например, в конфигурации "голова к хвосту", "хвост к голове", "голова к голове" или "хвост к хвосту". В некоторых вариантах осуществления наличие по меньшей мере одного полу-ITAM придает усиленную способность к передаче сигнала и цитотоксичность NK-клеткам, содержащим химерный рецептор, в котором используется по меньшей мере один полу-ITAM. Как более подробно обсуждается ниже, в некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит NKp80, который является одним неограничивающим примером полу-ITAM.
[00151] В некоторых вариантах осуществления применяются дополнительные сигнальные области, в том числе, например, сигнальные области, полученные из рецепторов семейства сигнальных молекул, активирующих лимфоциты (SLAM). Эти рецепторы включают без ограничения 2В4 (обсуждается выше). Рецепторы семейства SLAM в своих цитоплазматических хвостах имеют общий консенсусный тирозиновый мотив. Такой мотив представляет собой S/TxYxxL/I, который называют иммунорецепторным тирозиновым переключающим мотивом (ITSM) (SEQ ID NO: 15). Такие рецепторы передают активирующие сигналы посредством SLAM-ассоциированного белка (SAP, кодируемого геном SH2D1A), который рекрутирует тирозинкиназу Fyn. Таким образом, согласно некоторым вариантам осуществления сигнальная область содержит полипептидную последовательность (или нуклеиновую кислоту, которая ее кодирует), содержащую мотив ITSM. В некоторых вариантах осуществления мотив ITSM не обязательно должен кодироваться полностью, но сигнальная область должна быть способна передавать активирующий сигнал посредством SAP (или другого аналогичного сигнального пути). В некоторых вариантах осуществления мотив ITSM имеет последовательность под SEQ ID NO: 15 (где X может быть любым аминокислотным остатком). В некоторых вариантах осуществления мотив ITSM может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к мотиву ITSM, имеющему последовательность под SEQ ID NO: 15. В некоторых вариантах осуществления мотив ITSM содержит последовательность под SEQ ID NO: 15.
[00152] Помимо этих изменений в рецепторе NKG2D, трансмембранном домене и сигнальном домене (и комбинированных трансмембранных/сигнальных доменах), в некоторых вариантах осуществления могут быть предусмотрены дополнительные коактивирующие молекулы. Например, в некоторых вариантах осуществления NK-клетки сконструированы таким образом, что они экспрессируют мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15). В таких вариантах осуществления mbIL15, присутствующий на NK-клетках, функционирует таким образом, чтобы дополнительно усиливались цитотоксические эффекты NK-клеток, посредством синергического усиления пролиферации и жизнестойкости NK-клеток. В некоторых вариантах осуществления mbIL15 характеризуется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления mbIL15 может быть усеченным или модифицированным, так что он является на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к последовательности под SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления mbIL15 имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 17. Совместно с химерными рецепторами, раскрытыми в данном документе, такие варианты осуществления обеспечивают особенно эффективные композиции на основе NK-клеток для нацеливания на конкретные клетки-мишени и их уничтожения.
Конструкции химерных рецепторов
[00153] В свете представленного в данном документе раскрытия в данном документе предусмотрены разнообразные химерные рецепторы, которые можно получать и которые могут экспрессироваться в NK-клетках для нацеливания на конкретные клетки-мишени, такие как пораженные или раковые клетки, и их уничтожения. Неограничивающие примеры таких химерных рецепторов более подробно обсуждаются ниже.
[00154] Как обсуждается выше, части Т-клеточного рецепторного комплекса, в частности CD3-дзета, служат в качестве действенных активаторов сигнальных каскадов иммунной системы. Аналогично, рецептор 4-1ВВ, член суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли, при связывании с лигандом активирует NK-клетки. В некоторых вариантах осуществления эти два сигнальных компонента действуют синергическим образом, активируя NK-клетки при связывании лиганда с химерным рецептором. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3-дзета, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, трансмембранную область CD8 и эффекторный домен, содержащий сигнальные домены 4-1ВВ и CD3-дзета. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 18. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 108. В еще одном варианте осуществления химерный рецептор NKG2D-CD8a-4-1BB-CD3-дзета содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 19. В некоторых вариантах осуществления данная конструкция является особенно эффективной, если NK-клетки одновременно экспрессируют mbIL15; mbIL15 обеспечивает дополнительный синергический эффект в том, что касается активации и цитотоксической природы NK-клеток. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 18 (как, например, представлять собой SEQ ID NO: 108), но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 18 (как, например, представлять собой SEQ ID NO: 108), химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток.
[00155] Рецептор 2В4 имеет несколько иммунорецепторных тирозиновых переключающих мотивов (ITSM) и потенциально способен передавать активирующие сигналы. Аналогично, передача сигнала посредством рецептора 4-1ВВ, члена суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли, при связывании с лигандом также активирует NK-клетки. Таким образом, исходя из способности этих сигнальных молекул к кооперации с образованием неожиданно эффективных цитотоксических NK-клеток, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD8a/2B4/4-1BB, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, трансмембранную область CD8a и эффекторный домен, содержащий сигнальные домены 4-1ВВ и 2В4. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00156] В некоторых вариантах осуществления в NK-клетках применяются комбинации 2В4 и CD3-дзета для получения усиленной цитотоксичности в отношении клеток-мишеней. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD8a/2B4/CD3-дзета, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, трансмембранную область CD8a и эффекторный домен, содержащий сигнальные домены CD3-дзета и 2В4. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15. Как обсуждается выше, 4-1ВВ, как и CD3-дзета и 2В4, может функционировать в качестве действенного активатора сигнальных каскадов иммунной системы. В некоторых вариантах осуществления эти три сигнальных компонента действуют синергическим образом, активируя NK-клетки при связывании лиганда с химерным рецептором. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD8a/4-1ВВ/2В4/CD3-дзета, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, трансмембранную область CD8 и эффекторный домен, содержащий сигнальные домены 4-1ВВ, 2В4 и CD3-дзета. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 58. В еще одном варианте осуществления химерный рецептор NKG2D-CD8a-4-1ВВ-CD3-дзета содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 59. В некоторых вариантах осуществления данная конструкция является особенно эффективной, если NK-клетки одновременно экспрессируют mbIL15; mbIL15 обеспечивает дополнительный синергический эффект в том, что касается активации и/или цитотоксической природы NK-клеток. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 58, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 58, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток.
[00157] В нескольких альтернативных вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD8a/DAP10/4-1BB, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, трансмембранную область CD8a и эффекторный домен, содержащий сигнальные домены 4-1ВВ и DAP10. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 60. В еще одном варианте осуществления химерный рецептор NKG2D-CD8a-4-1BB-DAP10 содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 61. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15. В некоторых вариантах осуществления данная конструкция является особенно эффективной, если NK-клетки одновременно экспрессируют mbIL15; mbIL15 обеспечивает дополнительный синергический эффект в том, что касается активации и цитотоксической природы NK-клеток. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 60, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 60. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 60, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, как обсуждается выше, 2В4, как и DAP10 и 4-1ВВ, является действенным активатором сигнальных каскадов иммунной системы. В некоторых вариантах осуществления эти три сигнальных компонента действуют синергическим образом, активируя NK-клетки при связывании лиганда с химерным рецептором. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD8a/4-1BB/DAP10/2B4, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, трансмембранную область CD8 и эффекторный домен, содержащий сигнальные домены 4-1ВВ, 2В4 и DAP10, при этом за 4-1ВВ расположен DAP10, а за DAP10 расположен 2В4. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 62. В еще одном варианте осуществления химерный рецептор NKG2D-CD8a-4-1ВВ-CD3-дзета содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 63. В некоторых вариантах осуществления данная конструкция является особенно эффективной, если NK-клетки одновременно экспрессируют mbIL15; mbIL15 обеспечивает дополнительный синергический эффект в том, что касается активации и цитотоксической природы NK-клеток. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 62, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 62. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 62, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В некоторых других вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD8a/4-1BB/2B4/DAP10, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, трансмембранную область CD8 и эффекторный домен, содержащий сигнальные домены 4-1ВВ, 2В4 и DAP10, при этом за 4-1ВВ расположен 2В4, а за 2В4 расположен DAP10. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 64. В еще одном варианте осуществления химерный рецептор NKG2D-CD8a-4-1ВВ-CD3-дзета содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 65. В некоторых вариантах осуществления данная конструкция является особенно эффективной, если NK-клетки одновременно экспрессируют mbIL15; mbIL15 обеспечивает дополнительный синергический эффект в том, что касается активации и цитотоксической природы NK-клеток. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 64, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 64. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 64, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток.
[00158] В некоторых дополнительных вариантах осуществления трансмембранный и эффекторный домены (и соответствующая функция) химерного рецептора происходят из одного и того же пептида. CD16 является действенным активирующим рецептором, экспрессируемым на поверхности NK-клеток. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD16, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, и пептид CD16, содержащий как трансмембранную область, так и внутриклеточный эффекторный домен. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 23. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 24. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 23, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 23. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 23, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00159] В некоторых дополнительных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD16/4-1ВВ, где сигнальный домен 4-1ВВ выступает в качестве второго передатчика активирующих сигналов в эффекторном домене. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00160] CD3-дзета димеризуется посредством своего трансмембранного домена. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, где трансмембранный домен CD3-дзета рекрутирует полноразмерную молекулу CD3-дзета в синапс. В некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор, который содержит фрагмент NKG2D, который связывается с нативными лигандами NKG2D, шарнирную область CD8a, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 или больше остатков внеклеточной части CD3-дзета ("околомембранной части"), непосредственно прилегающих к транс мембранному домену CD3-дзета, и эффекторный домен, содержащий один или несколько из CD16, NCR1, NCR2, NCR3, 4-1ВВ, NKp80, FcRγ, CD3-дзета и 2В4.
[00161] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, где трансмембранный домен CD3-дзета связан с эффекторным доменом, содержащим один или оба из 4-1ВВ и CD16. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD3-дзета-TM/4-1BB, который содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 78. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 79. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 78, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 78. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 78, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00162] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD3-дзета-TM/CD16/4-1ВВ, который содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16, за которым расположен 4-1ВВ. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 70. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 71. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 70, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 70. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 70, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD3-дзета-ТМ/4-1ВВ/CD16, который содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ, за которым расположен CD16. В определенных вариантах осуществления эффекторный домен дополнительно содержит линкер GS3. В определенных вариантах осуществления линкер GS3 расположен между 4-1ВВ и CD16. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 84. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 85. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 84, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 84. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 84, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2Dx2/CD3-дзета-TM/CD16/4-1BB, который содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16 и 4-1ВВ. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 72. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 73. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 72, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 72. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 72, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00163] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, где трансмембранный домен CD3-дзета связан с эффекторным доменом, содержащим NKp80. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD3-дзета-TM/CD16/4-1BB/NKp80, при этом такой химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16, 4-1ВВ и NKp80. В определенных вариантах осуществления эффекторный домен дополнительно содержит линкер GS3. В определенных вариантах осуществления линкер GS3 расположен между 4-1ВВ и NKp80. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 74. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 75. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 74, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 74. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 74, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор 2xNKG2D/CD3-дзета-TM/CD16/4-1BB/NKp80, который содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий CD16, 4-1ВВ и NKp80. В определенных вариантах осуществления эффекторный домен дополнительно содержит линкер GS3. В определенных вариантах осуществления линкер GS3 расположен между 4-1ВВ и NKp80. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 76. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 77. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 76, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 76. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 76, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD3-дзета-TM/4-1BB/NKp80, который содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и NKp80. В определенных вариантах осуществления эффекторный домен дополнительно содержит линкер GS3. В определенных вариантах осуществления линкер GS3 расположен между 4-1ВВ и NKp80. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 82. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 83. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 82, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 82. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 82, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00164] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, где трансмембранный домен CD3-дзета связан с эффекторным доменом, содержащим CD3-дзета. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD3-дзета-ТМ/4-1ВВ/CD3-дзета, который содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с шарнирной областью CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и CD3-дзета. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 80. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 81. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 80, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 80. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 80, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00165] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, где трансмембранный домен CD3-дзета связан с эффекторным доменом, содержащим FcRγ. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD3-дзета-ТМ/4-1BB/FcRγ, который содержит фрагмент NKG2D, связанный с шарнирной областью CD8a, транс мембранную область CD3-дзета и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и FcRγ. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 86. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 87. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 86, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 86. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 86, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00166] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, где трансмембранный домен CD3-дзета связан с эффекторным доменом, содержащим CD28. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD3-дзета-ТМ/CD28/CD3-дзета, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранную область CD3-дзета и внутриклеточный эффекторный домен, содержащий CD28 и CD3-дзета. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 102. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 103. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 102, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 102. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 102, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00167] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, где внеклеточный домен содержит фрагмент NKG2D, связанный с IL15. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор IL15/NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3-дзета, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, связанный с IL-15, шарнирную область CD8a, трансмембранный домен CD8a и внутриклеточный эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и CD3z. В определенных вариантах осуществления внеклеточный домен дополнительно содержит линкер GS3. В определенных вариантах осуществления линкер GS3 расположен между IL15 и внеклеточным рецепторным доменом, являющимся фрагментом NKG2D. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 88. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 89. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 88, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 88. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 88, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток.
[00168] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, где внеклеточный домен содержит фрагмент NKG2D, связанный с короткой шарнирной областью IgG4. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/IgG4/CD8a/4-1BB/CD3-дзета, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, короткую шарнирную область IgG4, трансмембранный домен CD8a и внутриклеточный эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и CD3-дзета. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 96. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 97. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 96, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 96. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 96, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00169] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, где эффекторный домен содержит OX40. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD8a/OX40/CD3z, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранный домен CD8a и внутриклеточный эффекторный домен, содержащий OX40 и CD3z. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 90. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 91. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 90, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 90. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 90, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/IgG4/CD8a/OX40/CD3-дзета, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, шарнирную область IgG4, транс мембранный домен CD8a и внутриклеточный эффекторный домен, содержащий OX40 и CD3-дзета. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 100. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 101. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 100, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 100. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 100, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00170] В некоторых вариантах осуществления предусмотрены химерные рецепторы, содержащие пептид CD28, содержащий как трансмембранную область, так и внутриклеточный эффекторный домен. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD28/CD3-дзета, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD28 и CD3-дзета. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 92. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 93. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 92, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 92. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 92, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/CD28/CD3-дзета/4-1BB, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранный/внутриклеточный домен CD28, а также 4-1ВВ и CD3-дзета. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 94. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 95. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 94, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 94. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 94, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15. В дополнительных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/IgG4/CD28/CD3-дзета, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, шарнирную область IgG4, трансмембранный/внутриклеточный домен CD28 и CD3-дзета. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 98. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 99. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 98, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 98. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 98, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00171] NCR1 (NKp46), NCR2 (NKp44) и NCR3 (NKp30) представляют собой рецепторы на NK-клетках, которые передают активирующие сигналы при связывании с лигандом. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/NCR1, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, и пептид NCR1, содержащий как трансмембранную область, так и внутриклеточный эффекторный домен. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 27. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 28. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 30, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 27. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 27, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00172] В некоторых дополнительных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/NCR1/4-1BB, где сигнальный домен 4-1ВВ выступает в качестве второго передатчика активирующих сигналов в эффекторном домене, что приводит к синергическому усилению активации и цитотоксичности NK-клеток. В некоторых дополнительных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/NCR2, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, и пептид NCR2, содержащий как трансмембранную область, так и внутриклеточный эффекторный домен. Как и в случае с NCR1, в некоторых вариантах осуществления эти конструкции являются особенно пригодными для применения при создании NK-клеток, экспрессирующих химерный рецептор, благодаря их относительно малому размеру и простоте последовательности. Однако, в некоторых вариантах осуществления они сохраняют способность обеспечивать получение высокоэффективных NK-клеток, несмотря на очевидную простоту конструкции. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления эти конструкции необязательно могут совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00173] В некоторых дополнительных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/NCR3, который содержит внеклеточный рецепторный домен, являющийся фрагментом NKG2D, который связывает нативные лиганды NKG2D, и пептид NCR3, содержащий как трансмембранную область, так и внутриклеточный эффекторный домен. Как и в случае с NCR1 и/или NCR2, в некоторых вариантах осуществления эти конструкции являются особенно пригодными для применения при создании NK-клеток, экспрессирующих химерный рецептор, благодаря их относительно малому размеру и простоте последовательности. Однако, в некоторых вариантах осуществления они сохраняют способность обеспечивать получение высокоэффективных NK-клеток, несмотря на очевидную простоту конструкции. В одном варианте осуществления данный химерный рецептор содержит последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 29. В еще одном варианте осуществления данный химерный рецептор кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 30. В определенных вариантах осуществления последовательность химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 29, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 29. В некоторых вариантах осуществления, хотя химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 29, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00174] В некоторых дополнительных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/NCR2/4-1BB, где сигнальный домен 4-1ВВ выступает в качестве второго передатчика активирующих сигналов в эффекторном домене, что тем самым приводит к эффекту синергизма между сигнальными доменами и получению неожиданно эффективных цитотоксических NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00175] В некоторых дополнительных вариантах осуществления предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерный рецептор NKG2D/NCR3/4-1BB, где сигнальный домен 4-1ВВ выступает в качестве второго передатчика активирующих сигналов в эффекторном домене, что тем самым приводит к эффекту синергизма между сигнальными доменами и получению неожиданно эффективных цитотоксических NK-клеток. В дополнение, в некоторых вариантах осуществления данная конструкция необязательно может совместно экспрессироваться с mbIL15.
[00176] В определенных вариантах осуществления поверхностная экспрессия и эффективность химерных рецепторов, раскрытых в данном документе, усилена в результате изменений в спейсерной (шарнирной) области, которая в некоторых вариантах осуществления расположена во внеклеточном домене между фрагментом NKG2D и трансмембранным доменом. В определенных вариантах осуществления шарнирные области могут быть включены между другими частями химерного рецептора (например, между внутриклеточным и трансмембранным доменами или между несколькими внутриклеточными доменами). В определенных вариантах осуществления домены, которые выполняют определенные назначения, раскрытые в других разделах данного документа, могут выполнять дополнительные функции. Например, в некоторых вариантах осуществления у CD8a назначение изменено так, что он служит в качестве шарнирной области (кодируемой в некоторых вариантах осуществления последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5). В еще одном варианте осуществления шарнирная область содержит усеченную на N-конце форму CD8a и/или усеченную на С-конце форму CD8a. В зависимости от варианта осуществления данные усеченные формы могут быть на по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80% или по меньшей мере приблизительно 90% гомологичными по отношению к шарнирной области, кодируемой SEQ ID NO: 5. В некоторых дополнительных вариантах осуществления шарнирная область содержит участки из глициновых и сериновых остатков (в данном документе называемые "GS-линкерами"), где GSn представляет собой последовательность (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n (SEQ ID NO: 42). В одном варианте осуществления шарнирная область содержит как CD8a, так и GS3 и кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 32, например, где n=3. В дополнительных вариантах осуществления значение п может равняться 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 или больше в зависимости от варианта осуществления. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область также может иметь структуру GSn/CD8a. В качестве альтернативы, GS-линкер может содержать всю шарнирную область. В одном таком варианте осуществления шарнирная область кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 33. В другом таком варианте осуществления шарнирная область кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления у IgG4 назначение изменено на шарнирную область (кодируемую в некоторых вариантах осуществления последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 104). В еще одном варианте осуществления шарнирная область содержит усеченную на N-конце форму IgG4 и/или усеченную на С-конце форму IgG4. В зависимости от варианта осуществления данные усеченные формы могут быть на по меньшей мере приблизительно 50%, по меньшей мере приблизительно 60%, по меньшей мере приблизительно 70%, по меньшей мере приблизительно 80% или по меньшей мере приблизительно 90% гомологичными по отношению к шарнирной области, кодируемой SEQ ID NO: 104.
[00177] В некоторых вариантах осуществления в конструкциях химерных рецепторов используется внутриклеточный сигнальный домен 2В4. В некоторых вариантах осуществления данный домен кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 35. В определенных вариантах осуществления домен 2В4 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 36. В определенных вариантах осуществления последовательность внутриклеточного домена 2В4, применяемого в химерном рецепторе, может отличаться от SEQ ID NO: 36, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 36. В некоторых вариантах осуществления, хотя сигнальный домен химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 36, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток. Аналогично, в некоторых вариантах осуществления применяется внутриклеточный домен NKp80. В определенных вариантах осуществления домен NKp80 является единственным внутриклеточным сигнальным доменом, тогда как в других определенных вариантах осуществления такой домен применяется совместно с одним или несколькими дополнительными доменами. В некоторых вариантах осуществления NKp80 кодируется аминокислотной последовательностью под SEQ ID NO: 37. В определенных вариантах осуществления домен NKp80 кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 38. В определенных вариантах осуществления последовательность внутриклеточного домена NKp80, применяемого в химерном рецепторе, может отличаться от SEQ ID NO: 38, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления, хотя сигнальный домен химерного рецептора может отличаться от SEQ ID NO: 38, химерный рецептор сохраняет или, в определенных вариантах осуществления, имеет усиленную функцию активации и/или обеспечения цитотоксичности NK-клеток.
[00178] В некоторых вариантах осуществления в химерном рецепторе в качестве трансмембранного домена применяется часть бета-адренергического рецептора. В некоторых вариантах осуществления часть включает в себя часть внеклеточного домена бета-адренергического рецептора. В некоторых вариантах осуществления часть представляет собой часть трансмембранного домена бета-адренергического рецептора. В некоторых вариантах осуществления применяется комбинация внеклеточного домена и транс мембранного домена бета-адренергического рецептора. В зависимости от варианта осуществления части получены из бета-1- и/или бета-2-адренергического рецептора. В некоторых вариантах осуществления применяется часть N-концевой внеклеточной области бета-2-адренергического рецептора. В некоторых вариантах осуществления такая часть имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 39. В определенных вариантах осуществления внеклеточный домен бета-2-адренергического рецептора кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 40. В определенных вариантах осуществления последовательность внеклеточного домена бета-2-адренергического рецептора, применяемого в химерном рецепторе, может отличаться от SEQ ID NO: 39, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 39. В некоторых вариантах осуществления применяется первая трансмембранная спираль бета-2-адренергического рецептора, необязательно совместно с внеклеточным доменом бета-2-адренергического рецептора. В некоторых вариантах осуществления первая трансмембранная спираль бета-2-адренергического рецептора имеет аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 41. В определенных вариантах осуществления первая трансмембранная спираль бета-2-адренергического рецептора кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 42. В определенных вариантах осуществления последовательность первой трансмембранной спирали бета-2-адренергического рецептора, применяемая в химерном рецепторе, может отличаться от SEQ ID NO: 41, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 41.
[00179] В одном варианте осуществления химерный рецептор содержит CD8, усеченный NKG2D, CD8a, трансмембранный домен, внутриклеточный домен CD16 и 4-1ВВ в качестве костимулирующей молекулы. В некоторых вариантах осуществления такая конструкция кодируется SEQ ID NO: 25. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 25, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 25. В некоторых вариантах осуществления шарнирные области, окружающие CD8, увеличены путем добавления GS-линкеров (раскрытых в данном документе), таких как, в качестве неограничивающего примера, GS3. В таких вариантах осуществления конструкция кодируется нуклеиновой кислотой под SEQ ID NO: 43. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 43, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 43. В некоторых вариантах осуществления шарнирные области, окружающие CD8, увеличены путем добавления более длинных GS-линкеров, таких как GS12, или другого линкера. В некоторых вариантах осуществления шарнирные области уменьшены путем усечения CD8. Например, в некоторых вариантах осуществления N-концевая область CD8a усечена на по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40% или по меньшей мере 50%. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область CD8 заменена GS-линкером. Например, в некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит линкер GS3, и конструкция, таким образом, содержит NKG2D-GS3-CD16-4-1BB. В одном варианте осуществления такая конструкция кодируется нуклеиновой кислотой под SEQ ID NO: 44. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 44, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 44. В некоторых вариантах осуществления не применяется ни CD8, ни GSn. В одном варианте осуществления такая конструкция кодируется нуклеиновой кислотой под SEQ ID NO: 45. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 45, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 45.
[00180] Как обсуждается выше, в некоторых вариантах осуществления используются кодон-оптимизированные последовательности. Например, в некоторых вариантах осуществления оптимизация кодонов (полная или частичная) производится в домене NKG2D химерного рецептора. Однако, в некоторых вариантах осуществления оптимизация кодонов не производится. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, шарнирной областью CD8a и сигнальным доменом 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, шарнирной областью и трансмембранным доменом CD8a и сигнальным доменом 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, шарнирной областью и трансмембранным доменом CD8a, сигнальным доменом 4-1ВВ и сигнальным доменом 2В4. В некоторых вариантах осуществления такая конструкция имеет последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 46. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 46, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 46.
[00181] В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, трансмембранным доменом, полученным из бета-адренергического рецептора, и сигнальным доменом 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, трансмембранным доменом, полученным из бета-адренергического рецептора, состоящим из внеклеточной области бета-2-адренергического рецептора и первой трансмембранной спирали бета-2-адренергического рецептора, и сигнальным доменом 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, трансмембранным доменом, полученным из бета-адренергического рецептора, состоящим из внеклеточной области бета-2-адренергического рецептора и первой трансмембранной спирали бета-2-адренергического рецептора, сигнальным доменом 4-1ВВ и сигнальным доменом 2В4. В некоторых вариантах осуществления такая конструкция имеет последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 47. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 47, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 47.
[00182] В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, шарнирной областью CD8a и сигнальным доменом 2В4. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, шарнирной областью и трансмембранным доменом CD8a, а также как сигнальным доменом 2В4, так и сигнальным доменом 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, шарнирной областью и трансмембранным доменом CD8a, сигнальным доменом 4-1ВВ и сигнальным доменом 2В4, а также доменом NKp80. В некоторых вариантах осуществления домены 2В4 и NKp80 соединяет GS-линкер, такой как линкер GS3. В некоторых вариантах осуществления такая конструкция имеет последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 48. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 48, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 48.
[00183] В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, шарнирной областью CD8a и сигнальным доменом NKp80. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, шарнирной областью и транс мембранным доменом CD8a и сигнальным доменом NKp80. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена конструкция химерного рецептора с внеклеточным доменом NKG2D, который не является оптимизированным, шарнирной областью и трансмембранным доменом CD8a, сигнальным доменом 4-1ВВ и доменом NKp80. В некоторых вариантах осуществления домены 4-1ВВ и NKp80 соединяет GS-линкер, такой как линкер GS3. В некоторых вариантах осуществления такая конструкция имеет последовательность нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 49. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 49, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 49.
[00184] В некоторых вариантах осуществления транс мембранный домен CD8 связан с внутриклеточным доменом 2В4. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD8 заменен доменом 2В4, который является транс мембранным и внутриклеточным. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен CD8 заменен 2В4, а 4-1ВВ экспрессируется в проксимальной конфигурации.
[00185] В некоторых вариантах осуществления внутриклеточный сигнальный домен CD16 связан с субъединицей CD3-дзета или -гамма, которые экзогенно экспрессируются в транс-конфигурации относительно описанных в данном документе химерных рецепторов. Как обсуждается выше, такие конструкции могут приводить к неожиданному усилению передачи сигнала и, следовательно, неожиданному увеличению цитотоксических эффектов NK-клеток.
[00186] В некоторых вариантах осуществления химерные рецепторы способны к димеризации, как более подробно обсуждается в данном документе. В некоторых вариантах осуществления усеченный рецептор NKG2D согласно некоторым вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, необязательно является димеризованным. Димеризация может предусматривать гомодимеры или гетеродимеры в зависимости от варианта осуществления. В некоторых вариантах осуществления димеризация приводит к сдвигу авидности химерного рецептора (а следовательно, и NK-клеток, экспрессирующих данный рецептор) в сторону лучшего распознавания лигандов со скоординированным балансом ослабления (или отсутствием) неблагоприятных токсических эффектов. В еще нескольких дополнительных вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит сигнальный пептид CD8a. В некоторых вариантах осуществления в химерных рецепторах используются внутренние димеры или повторы одной или нескольких составляющих субъединиц. Например, в некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит внеклеточный домен NKG2D, связанный со вторым внеклеточным доменом NKG2D, и трансмембранную/сигнальную область (или отдельную трансмембранную область вместе с отдельной сигнальной областью). В некоторых вариантах осуществления один или несколько внеклеточных доменов NKG2D являются кодон-оптимизированными. В некоторых вариантах осуществления два внеклеточных домена NKG2D разделены линкером, например, линкером GSn. В одном варианте осуществления применяется линкер GS3. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит внеклеточную область бета-адренергического рецептора. В некоторых вариантах осуществления трансмембранный домен содержит внеклеточную область бета-2-адренергического рецептора и дополнительно содержит первый трансмембранный домен бета-2-адренергического рецептора. В некоторых вариантах осуществления сигнальная область содержит 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления сигнальная область содержит NKp80. В некоторых вариантах осуществления сигнальная область содержит трансмембранный/внутриклеточный домен CD16. В некоторых вариантах осуществления сигнальная область содержит 4-1ВВ совместно с NKp80 или трансмембранным/внутриклеточным доменом CD16. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор характеризуется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 50. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 50, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор характеризуется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 51. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 51, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 51. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор характеризуется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 52. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 52, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 52. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления у CD8a назначение изменено так, что он служит в качестве шарнирной области (кодируемой в некоторых вариантах осуществления последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 5). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит трансмембранный домен CD8a. В некоторых вариантах осуществления сигнальная область содержит 4-1ВВ совместно с 2В4 и CD3-дзета. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор содержит фрагмент NKG2D, который является кодон-оптимизированным и связан с линкером GS3, дополнительный фрагмент NKG2D, шарнирную область CD8a, трансмембранный домен CD8a и эффекторный домен, содержащий 4-1ВВ и CD3-дзета. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор характеризуется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 66. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 66, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 67. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 66, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 50.
[00187] В некоторых вариантах осуществления химерные рецепторы могут быть биспецифическими, как более подробно обсуждается в данном документе. В некоторых вариантах осуществления усеченный рецептор NKG2D согласно некоторым вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, является биспецифическим благодаря второму пептиду, который связывает, например, лиганды, отличные от NKG2D. В некоторых вариантах осуществления биспецифичность приводит к сдвигу нацеливания химерного рецептора (а следовательно, и NK-клеток, экспрессирующих данный рецептор) в сторону лучшего распознавания клеток-мишеней со скоординированным балансом ослабления (или отсутствием) неблагоприятных токсических эффектов. В еще нескольких дополнительных вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит сигнальный пептид CD8a. Например, в некоторых вариантах осуществления химерный рецептор содержит внеклеточный домен NKG2D, связанный со вторым внеклеточным доменом, который связывает другие (отличные от NKG2D) лиганды, и трансмембранную/сигнальную область (или отдельную трансмембранную область вместе с отдельной сигнальной областью). В некоторых вариантах осуществления два внеклеточных домена разделены линкером, например, линкером GSn. В одном варианте осуществления применяется линкер GS3.
[00188] Согласно некоторым вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, предусмотрены дополнительные химерные рецепторы, в которых используются кодон-оптимизированные домены NKG2D (данные конструкции необязательно также могут реплицироваться с неоптимизированными или частично оптимизированными доменами). Например, в некоторых вариантах осуществления кодон-оптимизированный внеклеточный домен связан с шарнирной областью и по меньшей мере двумя трансмембранными/сигнальными доменами. В некоторых вариантах осуществления несколько сигнальных доменов обеспечивают повышенную цитотоксическую эффективность NK-клеток, поскольку запускается несколько неизбыточных сигнальных каскадов. Хотя в определенных вариантах осуществления эти несколько сигнальных путей могут сходиться на одной сигнальной молекуле (например, IFNγ), общий цитотоксический эффект неожиданно увеличивается ввиду общей интенсивности действия сигнальных молекул, управляющих конечной точкой цитотоксичности. В качестве неограничивающего примера, в некоторых вариантах осуществления NKG2D связан с шарнирной областью CD8a, за которой расположены трансмембранный/внутриклеточный сигнальный домен CD16 и сигнальный домен 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления данная конструкция дополнительно содержит сигнальные домены 2В4. В некоторых вариантах осуществления такой химерный рецептор характеризуется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 53. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 53, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 53. В дополнительных вариантах осуществления конструкция NKG2D-CD8a-CD16IC/TM дополнительно содержит сигнальный домен NKp80. В некоторых вариантах осуществления такая конструкция дополнительно содержит линкер GS3 между доменами 4-1ВВ и NKp80. В некоторых вариантах осуществления такой химерный рецептор характеризуется последовательностью нуклеиновой кислоты под SEQ ID NO: 54. В определенных вариантах осуществления химерный рецептор может отличаться от SEQ ID NO: 54, но остается, в зависимости от варианта осуществления, на по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90% или по меньшей мере 95% гомологичным по отношению к SEQ ID NO: 54.
[00189] В еще нескольких дополнительных вариантах осуществления определенные компоненты химерного рецептора могут быть заменены одной или несколькими дополнительными субъединицами, что приводит к усиленной эффективности (например, активации или цитотоксичности NK-клеток). Например, в одном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен CD16 может быть заменен четырехкратным повтором DAP10 (например, 4xDAP10). В дополнительном варианте осуществления внутриклеточный сигнальный домен CD16 может быть заменен субъединицей Zap70. Определенные такие варианты осуществления приводят к неожиданному усилению цитотоксичности NK-клеток.
[00190] В некоторых дополнительных вариантах осуществления эффекторный домен содержит одну или несколько консенсусных последовательностей полу-ITAM для усиления передачи активирующих сигналов при связывании с лигандом. В дополнительных вариантах осуществления включение GS-линкера между сигнальными доменами 4-1ВВ, CD16, NCR1, NCR2 и/или NCR3 усиливает передачу сигнала. Более того, в некоторых вариантах осуществления дополнительно экспрессируются один или оба из CD3ζ, и FcRγ вместе с химерными рецепторами, описанными в данном документе (на той же самой либо на отдельной конструкции), что приводит к неожиданному усилению передачи сигнала и, следовательно, неожиданному увеличению цитотоксических эффектов NK-клеток. В зависимости от варианта осуществления сконструированная экспрессия одного или нескольких из CD3ζ, и FcRγ дополняет эндогенную экспрессию этих молекул в NK-клетках, что тем самым дополнительно усиливает передачу сигнала в NK-клетках и в конечном счете их цитотоксическую действенность.
[00191] Необязательно, в зависимости от варианта осуществления любой из полинуклеотидов, раскрытых в данном документе, также может кодировать усеченные формы и/или варианты одной или нескольких составляющих субъединиц химерного рецептора, которые в то же время сохраняют свою способность направлять NK-клетки на клетки-мишени, а в некоторых вариантах осуществления неожиданно усиливают цитотоксичность при связывании. В дополнение, любой из полинуклеотидов, раскрытых в данном документе, также может необязательно содержать кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности, кодирующие различные составляющие субъединицы химерного рецептора. Используемым в данном документе терминам "фрагмент" и "усеченный" будут даваться их обычные значения, и они будут также включать варианты белков с N- и С-концевыми делециями.
[00192] Полинуклеотиды, кодирующие химерные рецепторы, описанные в данном документе, могут быть встроены в векторы для достижения рекомбинантной экспрессии белка в NK-клетках. В одном варианте осуществления полинуклеотид функционально связан с по меньшей мере одним элементом, регулирующим экспрессию химерного рецептора. В конкретных вариантах осуществления для управления транскрипцией химерного рецептора используются элементы, регулирующие транскрипцию, такие как, например, участок внутренней посадки рибосомы (IRES) или энхансерный элемент, которые являются гетерологичными по отношению к пептидам, раскрытым в данном документе. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид содержит один или несколько сайтов расщепления цитозольной протеазой. В определенных вариантах осуществления сайт расщепления распознается и расщепляется цитозольной протеазой. В определенных вариантах осуществления данный сайт расщепления выбран из группы, содержащей сайт расщепления Т2А, сайт расщепления Р2А, сайт расщепления Е2А и сайт расщепления F2A. В зависимости от варианта осуществления различные составляющие части химерного рецептора могут доставляться в NK-клетку в одном векторе или, в качестве альтернативы, в нескольких векторах. В определенных вариантах осуществления конструкция химерного рецептора доставляется в одном векторе, тогда как другой фактор, который усиливает эффективность химерного рецептора, такой как mbIL15, доставляется в отдельном векторе. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор и фактор, который усиливает эффективность химерного рецептора (например, mbIL15), доставляются в одном векторе. Независимо от количества применяемых векторов, любой полинуклеотид необязательно может содержать последовательность метки, обеспечивающую возможность идентификации наличия NK-клеток, экспрессирующих конструкцию. Например, в некоторых вариантах осуществления применяется FLAG-метка (DYKDDDDK, SEQ ID NO: 55). Также доступны и другие последовательности меток, такие как полигистидиновая метка (His-метка) (НННННН, SEQ ID NO: 56), НА-метка или myc-метка (EQKLISEEDL; SEQ ID NO: 57). В качестве альтернативы применяется зеленый флуоресцентный белок или другой флуоресцентный компонент. Также можно применять комбинации типов меток для индивидуального распознавания субкомпонентов химерного рецептора.
[00193] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, представляет собой мРНК, которую можно вводить в NK-клетки посредством электропорации. В другом варианте осуществления вектор представляет собой вирус, предпочтительно ретровирус, который можно вводить в NK-клетки посредством трансдукции. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой вирус стволовых клеток мышей (MSCV). В дополнительных вариантах осуществления можно применять другие векторы, например, лентивирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус и т.п. В некоторых вариантах осуществления применяются ретровирусы, не происходящие из ВИЧ. Выбор вектора будет зависеть от разнообразных факторов, в том числе без ограничения от силы элементов, регулирующих транскрипцию, и клетки, которая должна применяться для экспрессии белка. Вектор может представлять собой плазмиду, фагмиду, космиду, вирусный вектор, фаг, искусственную хромосому и т.п. В дополнительных вариантах осуществления векторы могут быть эписомными, негомологично или гомологично интегрирующими векторами, которые можно вводить в соответствующие клетки любыми подходящими способами (посредством трансформации, трансфекции, конъюгации, слияния протопластов, электропорации, осаждения фосфатом кальция, прямой микроинъекции и т.д.) для их трансформации. В некоторых вариантах осуществления применяются другие подходы для индуцирования экспрессии химерных рецепторов в NK-клетках, в том числе, например, ранняя промоторная область SV40, промотор, содержащийся в 3'-длинном концевом повторе вируса саркомы Рауса, промотор гена тимидинкиназы вируса герпеса, регуляторные последовательности генов металлотионеинов, промотор аденовируса (ADV), промотор цитомегаловируса (CMV), промотор вируса папилломы крупного рогатого скота (BPV), промотор парвовируса В19р6, промотор гена бета-лактамазы, промотор tac, промоторная область гена нопалинсинтазы или промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты, промотор гена рибулозобисфосфаткарбоксилазы, промотор гена Gal4, промотор гена ADC (алкогольдегидрогеназы), промотор гена PGK (фосфоглицераткиназы), синтетический промотор MND, содержащий область U3 модифицированного LTR MoMuLV с энхансером миелопролиферативного вируса саркомы, и промотор гена щелочной фосфатазы.
[00194] Естественные клетки-киллеры могут быть сконструированы таким образом, чтобы они экспрессировали химерные рецепторы, раскрытые в данном документе. Конструкции для экспрессии химерных рецепторов можно вводить в NK-клетки с помощью любой из методик, известных специалисту в данной области. В одном варианте осуществления химерные рецепторы транзиентно экспрессируются в NK-клетках. В другом варианте осуществления химерные рецепторы стабильно экспрессируются в NK-клетках. В дополнительном варианте осуществления NK-клетки являются аутологичными клетками. В еще одном варианте осуществления NK-клетки являются полученными от донора (алло генными) клетками.
[00195] Дополнительно в данном документе предусмотрены способы лечения субъекта, имеющего рак или инфекционное заболевание, включающие введение субъекту композиции, содержащей NK-клетки, сконструированные таким образом, что они экспрессируют химерный рецептор, раскрытый в данном документе, при этом химерный рецептор предназначен для нацеливания на маркер или лиганд, который дифференциально экспрессируется в поврежденных или пораженных клетках или ткани (например, характеризуется другой степенью экспрессии по сравнению с нормальной клеткой или тканью). Используемым в данном документе терминам "экспрессировать", "экспрессируется" и "экспрессия" даются их обычные значения, и они будут относиться к обеспечению или обуславливанию проявления информации в последовательности гена или полинуклеотидной последовательности, например, выработке белка путем активации клеточных функций, вовлеченных в транскрипцию и трансляцию соответствующей последовательности гена или ДНК. Также можно сказать, что сам продукт экспрессии, например, получаемый в результате белок, "экспрессируется" клеткой. Продукт экспрессии можно охарактеризовать как внутриклеточный, внеклеточный или трансмембранный. Термину "внутриклеточный" будет даваться его обычное значение, и он будет относиться к имеющему место внутри клетки. Термину "внеклеточный" будет даваться его обычное значение, и он будет относиться к имеющему место снаружи клетки. Термину "трансмембранный" будет даваться его обычное значение, и он будет относиться к по меньшей мере части полипептида, погруженной в клеточную мембрану. Термину "цитоплазматический" будет даваться его обычное значение, и он будет относиться к находящемуся в границах клеточной мембраны снаружи ядра. Используемым в данном документе терминам "лечить", "производить лечение" и "лечение" применительно к назначению терапии субъекту будет даваться их обычное значение, и они будут относиться к благоприятным эффектам, которые субъект получает от терапии. В определенных вариантах осуществления в результате лечения субъекта с помощью клетки(клеток), полученной(полученных) методами генной инженерии, описанной(описанных) в данном документе, достигаются один, два, три, четыре или больше из следующих эффектов, в том числе, например: (i) снижение или облегчение тяжести заболевания или симптома, ассоциированного с ним; (ii) снижение продолжительности проявления симптома, ассоциированного с заболеванием; (iii) защита от прогрессирования заболевания или симптома, ассоциированного с ним; (iv) регрессия заболевания или симптома, ассоциированного с ним; (v) защита от развития или появления симптома, ассоциированного с заболеванием; (vi) защита от рецидива симптома, ассоциированного с заболеванием; (vii) снижение частоты госпитализации субъекта; (viii) снижение продолжительности госпитализации; (ix) увеличение выживаемости субъекта с заболеванием; (х) снижение количества симптомов, ассоциированных с заболеванием; (xi) усиление, улучшение, поддержка, дополнение или увеличение профилактического(профилактических) или терапевтического(терапевтических) эффекта(эффектов) другого вида терапии. Введение можно осуществлять разнообразными путями, включая без ограничения внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутримышечную, внутрипеченочную, внутрибрюшинную и/или местную доставку в пораженную ткань. Дозы NK-клеток могут быть легко определены для данного субъекта, исходя из его массы тела, типа и статуса заболевания и требуемой агрессивности лечения, но в зависимости от вариантов осуществления находятся в диапазоне от приблизительно 105 клеток на кг до приблизительно 1012 клеток на кг (например, в диапазонах 105 - 107, 107 - 1010, 1010 - 1012 и перекрывающихся диапазонах в пределах этих значений). В одном варианте осуществления применяют режим с повышением дозы. В некоторых вариантах осуществления NK-клетки вводят в диапазоне, например, от приблизительно 1×106 клеток/кг до приблизительно 1×108 клеток/кг. В зависимости от варианта осуществления можно лечить различные типы рака или инфекционного заболевания. Различные варианты осуществления, предусмотренные в данном документе, включают лечение или предупреждение следующих неограничивающих примеров рака, в том числе без ограничения острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелоидного лейкоза (AML), адренокортикальной карциномы, саркомы Капоши, лимфомы, рака желудочно-кишечного тракта, рака аппендикса, рака центральной нервной системы, базальноклеточной карциномы, рака желчных протоков, рака мочевого пузыря, рака костей, опухолей головного мозга (в том числе без ограничения форм астроцитомы, опухоли спинного мозга, глиомы ствола головного мозга, краниофарингиомы, эпендимобластомы, эпендимомы, медуллобластомы, медуллоэпителиомы), рака молочной железы, бронхиальных опухолей, лимфомы Беркитта, рака шейки матки, рака толстой кишки, хронического лимфоцитарного лейкоза (CLL), хронического миелогенного лейкоза (CML), хронических миелопролиферативных нарушений, внутрипротоковой карциномы, рака эндометрия, рака пищевода, рака желудка, лимфомы Ходжкина, неходжкинской лимфомы, волосатоклеточного лейкоза, почечноклеточного рака, лейкоза, рака ротовой полости, рака носоглотки, рака печени, рака легкого (в том числе немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) и мелкоклеточного рака легкого), рака поджелудочной железы, рака кишечника, лимфомы, меланомы, рака глаза, рака яичника, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака гипофиза, рака матки и рака влагалища.
[00196] В дополнение, различные варианты осуществления, предусмотренные в данном документе, включают лечение или предупреждение следующих неограничивающих примеров инфекционных заболеваний, в том числе без ограничения инфекций бактериального происхождения, которые могут включать, например, инфекции, вызываемые бактериями из одного или нескольких следующих родов: Bordetella, Borrelia, Brucella, Campylobacter, Chlamydia и Chlamydophila, Clostridium, Corynebacterium, Enterococcus, Escherichia, Francisella, Haemophilus, Helicobacter, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycoplasma, Neisseria, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Vibrio и Yersinia, а также их мутантными формами или комбинациями. В некоторых вариантах осуществления предусмотрены способы лечения разнообразных вирусных инфекций, таких как инфекции, вызываемые одним или несколькими вирусами, такими как аденовирус, вирус Коксаки, вирус Эпштейна-Барр, вирус гепатита А, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус простого герпеса 1 типа, вирус простого герпеса 2 типа, цитомегаловирус, вирус Эбола, вирус герпеса человека 8 типа, ВИЧ, вирус гриппа, вирус кори, вирус эпидемического паротита, вирус папилломы человека, вирус парагриппа, вирус полиомиелита, вирус бешенства, респираторно-синцитиальный вирус, вирус краснухи и вирус ветряной оспы.
[00197] В определенных вариантах осуществления в данном документе также предусмотрены последовательности нуклеиновых кислот и аминокислотные последовательности, которые являются на по меньшей мере 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% (включая диапазоны в пределах этих значений) гомологичными по сравнению с соответствующими последовательностями нуклеиновых кислот или аминокислотными последовательностями под SEQ ID NO: 1-68 и которые также демонстрируют одну или несколько функций по сравнению с соответствующими SEQ ID NO: 1-68, в том числе без ограничения (i) усиление пролиферации, (ii) усиление активации, (iii) усиление цитотоксической активности в отношении клеток, на которых представлены лиганды, с которыми связываются NK-клетки, несущие рецепторы, кодируемые последовательностями нуклеиновых кислот и аминокислотными последовательностями, (iv) усиление хоминга в очаги опухоли или инфекции, (v) ослабление нецелевых цитотоксических эффектов, (vi) усиление секреции иммуностимулирующих цитокинов и хемокинов (в том числе без ограничения IFNg, TNFa, IL-22, CCL3, CCL4 и CCL5), (vii) усиление способности к стимуляции дальнейших врожденных и адаптивных иммунных ответов и (viii) их комбинации.
[00198] В дополнение, в некоторых вариантах осуществления в данном документе предусмотрены аминокислотные последовательности, которые соответствуют любой из нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе, с учетом вырожденности кода нуклеиновых кислот. Более того, те последовательности (либо нуклеиновых кислот, либо аминокислотные), которые отличаются от явно раскрытых в данном документе, но характеризуются функциональным сходством или эквивалентностью, также подразумеваются как находящиеся в пределах объема настоящего изобретения. Вышеизложенное включает мутантные формы, усечения, замены или другие типы модификаций.
[00199] Согласно некоторым вариантам осуществления в данном документе предусмотрены полинуклеотиды, кодирующие химерные рецепторы, содержащие внеклеточный рецепторный домен, при этом внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), при этом пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, при этом эффекторный домен содержит трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен. В некоторых вариантах осуществления фрагмент NKG2D кодируется полинуклеотидом, содержащим последовательность под SEQ ID NO: 2, или 3, или 68, или его функциональным эквивалентом. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует эффекторный домен, содержащий CD16. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует эффекторный домен, содержащий NCR1. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует эффекторный домен, содержащий NCR2. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует эффекторный домен, содержащий NCR3. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид кодирует дополнительную часть эффекторного домена, содержащую 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует химерный рецептор, состоящий из NKG2D и CD16. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует химерный рецептор, состоящий из NKG2D и NCR1. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид кодирует химерный рецептор, состоящий из NKG2D и NCR2. В дополнительных вариантах осуществления полинуклеотид кодирует химерный рецептор, состоящий из NKG2D, связанного с CD16, и необязательно 4-1ВВ. В некоторых вариантах осуществления CD16 заменен NCR1, а в других определенных вариантах осуществления NCR2 или даже NCR3, в зависимости от варианта осуществления. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен дополнительно содержит GS-линкер между, например, 4-1ВВ и одним из CD16, NCR1, NCR2 или NCR3.
[00200] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит шарнирную область. В некоторых вариантах осуществления шарнирная область содержит CD8a. Однако, в дополнительных вариантах осуществления шарнирная область дополнительно содержит один или несколько линкеров, которые в определенных вариантах осуществления содержат GS9, CD8a/GS3, усеченный CD8a, GS3 и т.п.
[00201] В некоторых вариантах осуществления внеклеточный рецепторный домен дополнительно содержит сигнальный пептид CD8a. В некоторых вариантах осуществления эффекторный домен содержит одну или несколько последовательностей полу-ITAM. В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор не содержит DNAX-активирующий белок 10 (DAP10). В некоторых вариантах осуществления химерный рецептор не содержит мотив ITAM, а вместо этого в нем используется альтернативная сигнальная область, такая как ITSM, полу-ITAM или другая костимулирующая область.
[00202] В одном варианте осуществления в данном документе предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, при этом внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), при этом пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, трансмембранную область, при этом транс мембранная область содержит CD8a, и эффекторный домен, при этом эффекторный домен содержит 4-1ВВ и CD3-дзета, при этом полинуклеотид совместно экспрессируется с дополнительной конструкцией, кодирующей мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15).
[00203] В некоторых вариантах осуществления также предусмотрен полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, который содержит внеклеточный рецепторный домен, при этом внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), при этом пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, трансмембранную область, при этом трансмембранная область содержит CD8a, и эффекторный домен, при этом эффекторный домен содержит 4-1ВВ и внутриклеточный домен 2В4 или DAP10. Полинуклеотид, кодирующий химерный рецептор, описанный в данном документе, содержит второй пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D. В некоторых вариантах осуществления нативные лиганды NKG2D включают без ограничения MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ULBP4, ULBP5 или ULBP6. В некоторых вариантах осуществления часть химерного рецептора, которая связывает нативные лиганды NKG2D, является на по меньшей мере 80% гомологичной по отношению к SEQ ID NO: 1, 2, 3 или 68.
[00204] В некоторых вариантах осуществления предусмотренный полинуклеотид представляет собой мРНК. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид функционально связан с по меньшей мере одним элементом, регулирующим экспрессию химерного рецептора. Используемым в данном документе терминами "нуклеиновая кислота", "нуклеотид" и "полинуклеотид" будут даваться их обычные значения, и они будут включать дезоксирибонуклеотиды, дезоксирибонуклеиновые кислоты, рибонуклеотиды и рибонуклеиновые кислоты и их полимерные формы и включают одно- либо двухцепочечные формы. Нуклеиновые кислоты включают встречающиеся в природе нуклеиновые кислоты, такие как дезоксирибонуклеиновая кислота ("ДНК") и рибонуклеиновая кислота ("РНК"), а также аналоги нуклеиновых кислот. Аналоги нуклеиновых кислот включают такие аналоги, которые содержат не встречающиеся в природе основания, нуклеотиды, которые образуют связи с другими нуклеотидами, отличные от встречающейся в природе фосфодиэфирной связи, или которые содержат основания, соединенные посредством связей, отличных от фосфодиэфирных связей. Таким образом, аналоги нуклеиновых кислот включают, в качестве примера и без ограничения, фосфотиоаты, фосфодитиоаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, боранофосфаты, метилфосфонаты, хиральные метилфосфонаты, 2-O-метилрибонуклеотиды, пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), закрытые нуклеиновые кислоты (LNA) и т.п. Используемому в данном документе термину "функционально связанный", например, применительно к регуляторной последовательности нуклеиновой кислоты, являющейся "функционально связанной" с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, будет даваться его обычное значение, и он будет обозначать, что регуляторная последовательность нуклеиновой кислоты размещена в функциональной связи с гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты. Применительно к IRES "функционально связанный с" относится к функциональной связи между последовательностью нуклеиновой кислоты, содержащей участок внутренней посадки рибосомы, и сайтом инициации трансляции гетерологичной кодирующей последовательности в середине последовательности мРНК, которая приводит к трансляции гетерологичной кодирующей последовательности. Используемому в данном документе термину "вектор" будет даваться его обычное значение, и он будет относиться к носителю, посредством которого последовательность ДНК или РНК (например, чужеродный ген) можно вводить в клетку, полученную методами генной инженерии, в целях трансформации клетки, полученной методами генной инженерии, и обеспечения экспрессии (например, транскрипции и/или трансляции) введенной последовательности. Векторы включают вирусы, плазмиды, фаги и т.д. Используемому в данном документе термину "химерный рецептор" будет даваться его обычное значение, и он будет относиться к рецептору клеточной поверхности, содержащему по меньшей мере два полипептидных домена, которые в природе не обнаруживаются вместе в одном белке. Используемый в данном документе термин "химерный рецепторный комплекс" относится к первому полипептиду, который может содержать по меньшей мере два полипептидных домена в комбинации, которые в природе не обнаруживаются вместе в одном белке, при этом первый полипептид связан со вторым полипептидом, например, адаптерным полипептидом, сигнальной молекулой или стимулирующей молекулой. Дополнительные термины, относящиеся к получению и применению химерных рецепторов, раскрытых в данном документе, легко понятны среднему специалисту в данной области, а также их можно найти в международной публикации WO 2014/117121 и в патенте США №7994298, каждый из которых включен в данный документе посредством ссылки во всей своей полноте.
[00205] Согласно некоторым вариантам осуществления дополнительно предусмотрен вектор, содержащий полинуклеотид, кодирующий любой из полинуклеотидов, предусмотренных в данном документе, при этом полинуклеотиды необязательно являются функционально связанными с по меньшей мере одним элементом, регулирующим экспрессию химерного рецептора. В некоторых вариантах осуществления вектор представляет собой ретровирус.
[00206] В данном документе дополнительно предусмотрены сконструированные естественные клетки-киллеры, содержащие полинуклеотид, вектор или химерные рецепторы, раскрытые в данном документе. В некоторых вариантах осуществления данные NK-клетки подходят для применения при лечении или предупреждении заболевания, такого как, например, рак и/или инфекционное заболевание.
ПРИМЕРЫ
Способы
[00207] В неограничивающих экспериментальных примерах, раскрытых ниже, использовались следующие экспериментальные способы и материалы.
Линии клеток и условия культивирования
[00208] Линия клеток REH острого лимфобластного лейкоза человека, линия клеток U-2 OS остеосаркомы человека и клетки-фибробласты эмбриональной почки человека 293Т (HEK 293Т) были получены из Американской коллекции типовых культур (АТСС; Манассас, Виргиния). Клетки REH поддерживали и выращивали в среде Мемориального института Розуэлла Парка серии 1640 (RPMI-1640; Gibco, Карлсбад, Калифорния), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS; Hyclone, Логан, Юта) и 1% смесью пенициллина и стрептомицина. Как клетки HEK 293Т, так и клетки U-2 OS поддерживали и выращивали в среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM; Hyclone), дополненной 10% FBS и 1% смесью пенициллина и стрептомицина. Все клетки млекопитающих инкубировали при 37°C с 5% CO2.
ДНК-плазмиды
[00209] ДНК-плазмиду, содержащую ДНК химерного рецептора NKG2D-DAP10-CD3ζ, получали так, как описано ранее (см. Chang et al. Cancer Research, Vol. 73(6): 2013). Использовали сплайсинг посредством полимеразной цепной реакции с достройкой перекрывающихся фрагментов (SOE-PCR) для слияния отдельных доменов с получением конструкции NKG2D-41BB-CD3ζ. Затем такую конструкцию встраивали в ретровирусный вектор на основе вируса стволовых клеток мышей (MSCV) (фигура 3А). Конструкции для NKG2D-CD16 и NKG2D-CD16-41BB подвергали оптимизации кодонов и встраивали в вектор на основе MSCV (фигура 3В) с помощью GenScript (Нанкин, Китай). Последовательности конструкций проверяли с помощью секвенирования ДНК. Размножение NK-клеток человека
[00210] Мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) получали путем центрифугирования в градиенте плотности фиколла образцов крови от здоровых взрослых доноров. Для размножения NK-клеток РВМС культивировали с клетками K562, экспрессирующими в результате генной модификации мембраносвязанный IL-15 и лиганд 4-1ВВ (K562-mb15-41BBL). Клетки культивировали в среде для роста стволовых клеток (SCGM; CellGenix, Фрайбург, Германии), дополняемой 40 ME IL-2/мл каждые два дня.
[00211] Спустя 7 дней культивирования среди NK-клеток проводили истощение популяции Т-клеток с помощью Dynabeads, покрытых антителами к CD3 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния). Затем NK-клетки культивировали в SCGM, дополняемой 40-200 ME IL-2/мл каждые два дня.
Получение ретровируса и трансдукция NK-клеток
[00212] Получение ретровируса осуществляли путем транзиентной трансфекции клеток HEK 293Т плазмидами для упаковки ретровирусов. Клетки HEK 293Т сначала высевали до концентрации 2,5×106 клеток в 12 мл DMEM за 18 часов до трансфекции. Затем клетки трансфицировали с помощью 3,5 мкг вектора на основе MSCV, содержащего ДНК соответствующих химерных рецепторов NKG2D (неограничивающие конструкции схематически проиллюстрированы на фигурах 1В-1C и 2А-2В), 3,5 мкг pEQ-РАМ3 и 3,0 мкг pRDF. Для контроля использовали пустой вектор на основе MSCV, содержащий ген GFP. Для трансфекции использовали реагент для трансфекции ДНК X-tremeGENE 9 (Roche, Базель, Швейцария). Через 24 часа после трансфекции DMEM заменяли кондиционированной средой RPMI-1640.
[00213] Через 18 часов после замены среды производили трансдукцию NK-клеток трансгеном химерного рецептора NKG2D. Сначала NK-клетки суспендировали при концентрации 0,25×106 клеток в 2 мл кондиционированной среды RPMI-1640. Затем клетки высевали в пробирки, покрытые RetroNectin (Takara, Оцу, Япония). RPMI-1640, содержащую ретровирус (надосадочную жидкость с ретровирусом), собирали из культур клеток HEK 293Т, и в культуры снова добавляли свежую кондиционированную среду. Надосадочную жидкость с вирусом дополняли 200 ME IL-2/мл, и в каждую пробирку, покрытую RetroNectin (содержащую высеянные NK-клетки), вносили 3 мл надосадочной жидкости с вирусом. В соответствии с определенными вариантами осуществления получения NK-клеток высеянные NK-клетки трансдуцировали шесть раз один раз в каждые 12 часов свежей средой, содержащей вирус. Трансдуцированные NK-клетки затем собирали через 48 часов после последней трансдукции и культивировали в SCGM, дополняемой 200 ME IL-2/мл каждые два дня. Через 14-28 дней после размножения трансдуцированные NK-клетки использовали для экспериментов.
Выявление экспрессии химерного рецептора с помощью проточной цитометрии
[00214] Трансдуцированные NK-клетки промывали один раз фосфатно-солевым буферным раствором, содержащим альбумин, и добавляли 2 мкл кроличьей сыворотки крови. Затем клетки окрашивали антителом к NKG2D человека, конъюгированным с комплексом перидинин/хлорофилл/белок (PerCP) (клон 149810; R&D Systems, Миннеаполис, США), в течение 10 минут в темноте. Для контролей трансдуцированные NK-клетки окрашивали соответствующим антителом изотипа IgG, конъюгированным с PerCP. Все NK-клетки снова промывали и фиксировали с помощью 300 мкл 0,5% формальдегида перед анализом с помощью проточного цитометра Accuri C6 (BD, Франклин-Лейке, Нью-Джерси). Данные анализировали с помощью парного t-критерия.
Анализы цитотоксичности
[00215] Клетки REH окрашивали кальцеином-АМ красно-оранжевым (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Клетки REH высевали в 96-луночный круглодонный планшет (Costar, Корнинг, Нью-Йорк). Затем добавляли трансдуцированные NK-клетки в различных соотношениях эффектор : мишень (Е:Т). Культуры клеток инкубировали в течение четырех часов при 37°С и 5% CO2. Окрашенные жизнеспособные клетки-мишени подсчитывали с помощью проточного цитометра Accuri С6. Клетки U-2 OS высевали в 96-луночный плоскодонный белый планшет (Costar) и инкубировали в течение четырех часов. Затем добавляли трансдуцированные NK-клетки в соответствии с различными соотношениями Е:Т. Культуры клеток затем инкубировали в течение еще четырех часов. Перед анализом к клеткам добавляли субстрат Bright-Glo (Promega, Мэдисон, Висконсин). Интенсивность люминесценции в жизнеспособных клетках-мишенях измеряли с помощью флуоресцентного ридера FLx800 (BioTek, Уинуски, Вермонт). Разницы между интенсивностью люминесценции и контролем преобразовывали в процентное значение цитотоксичности.
Анализ выработки интерферона-гамма (IFNγ)
[00216] Для определения количества IFNγ, вырабатываемого NK-клетками, эффекторные клетки и клетки-мишени сначала культивировали в присутствии (Е:Т 1:1) или в отсутствие REH в 96-луночном круглодонном планшете. Клетки инкубировали в течение одного часа перед добавлением GolgiPlug (брефельдина A; BD Biosciences). Спустя еще 5 часов культивирования клетки метили антителом к CD56 человека, конъюгированным с фикоэритрином (РЕ) (клон MY31, BD Biosciences). Клетки пермеабилизировали с помощью собственного реагента для пермеабилизации и инкубировали в течение 40 минут в темноте. Затем клетки промывали собственным промывочным буфером. Внутриклеточный IFNγ выявляли с помощью антитела к IFNγ, конъюгированного с аллофикоцианином (АРС) (клон 25723.11; BD Biosciences) в течение 45 минут. Затем клетки фиксировали и анализировали с помощью проточного цитометра Accuri С6.
Пример 1 - конструкции NKG2D, содержащие CD3-дзета
[00217] Как раскрыто в данном документе, предусмотрены различные конструкции, содержащие NKG2D и/или варианты NKG2D, связанные с различными трансмембранными и/или сигнальными доменами. Настоящий эксперимент проводили для оценивания экспрессии и цитотоксической активности конструкций, содержащих сигнальные домены CD3-дзета. Две конструкции с CD3-дзета получали и тестировали в соответствии с описанными выше способами и материалами. В зависимости от конструкции применяемые способы можно было легко скорректировать для учета изменений, необходимых для получения, экспрессии и тестирования конструкции. Данными двумя конструкциями были NKG2D-DAP10-CD3ζ, и NKG2D-41BB-CD3ζ. Для сравнения на фигуре 1А схематически изображен эндогенный NKG2D. В NK-клетках ионные взаимодействия с участием трансмембранной области NKG2D обеспечивают возможность связывания с его адаптерным белком DAP10 (Wu et al., 1999). При связывании с лигандом сигналы от NKG2D передаются посредством сигнального мотива YxNM, который находится в DAP10. CD3ζ передают сигналы посредством своего иммунорецепторного тирозинового активирующего мотива (ITAM; Lanier, 2008). На фигурах 1В и 1С соответственно схематически проиллюстрированы две экспериментальные конструкции. На фигуре 1В показан NKG2D-DAP10-CD3ζ, при этом передача сигналов происходит посредством как мотива YxNM, так и мотива ITAM. На фигуре 1С показана конструкция NKG2D-41BB-CD3ζ, в которой используется шарнирная область CD8a в качестве трансмембранного домена и 4-1ВВ и CD3ζ в качестве сигнальных доменов.
[00218] Сначала оценивали способность NK-клеток эффективно экспрессировать эти конструкции. NK-клетки, размноженные из РВМС от здоровых взрослых доноров, трансдуцировали одним из двух химерных рецепторов. Ложнотрансдуцированные NK-клетки (трансдуцированные пустым вектором на основе MSCV, содержащим только ген GFP) использовали в качестве контроля. Наличие и относительное обилие химерных рецепторов определяли путем окрашивания NK-клеток антителом к NKG2D, конъюгированным с Per-СР. На фигуре 4А изображены репрезентативные данные проточной цитометрии, относящиеся к процентной доле NKG2D-положительных NK-клеток после ложной трансдукции (левая панель), трансдукции конструкциями NKG2D-DAP10-CD3ζ (центральная панель) или NKG2D-41BB-CD3ζ, (правая панель). Ложнотрансдуцированные NK-клетки не демонстрировали экспрессию NKG2D с используемым антителом (которое не демонстрировало окрашивание выше уровня для изотипически сходного нереактивного антитела, несмотря на высокую экспрессию NKG2D на активированных NK-клетках в естественных условиях), тогда как экспрессию NKG2D выше уровня для изотипически сходного нереактивного контрольного антитела демонстрировали чуть менее 60% клеток, трансдуцированных конструкцией NKG2D-DAP10-CD3ζ, и более 80% NK-клеток, трансдуцированных посредством NKG2D-41BB-CD3ζ. Объединенные данные о процентной доле NKG2D-положительных NK-клеток от всех доноров показаны на фигуре 4В. Обе сконструированные конструкции NKG2D приводили к существенному увеличению экспрессии NKG2D по сравнению с контролем с ложной трансдукцией, хотя значительного различия между процентными значениями экспрессии для данных двух конструкций не было. На фигуре 4С изображены данные об экспрессии на основании средней интенсивности флуоресценции (MFI), которая в популяции, экспрессирующей конструкцию NKG2D, представляет степень, в которой клетки экспрессируют конструкцию (например, несколько копий конструкции на клетку будут давать большее значение MFI). По такому показателю экспрессия NKG2D-41BB-CD3ζ была значительно большей, чем экспрессия конструкции NKG2D-DAP10-CD3ζ.
[00219] В совокупности эти данные демонстрируют, что, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, раскрытыми в данном документе, сконструированные конструкции могут успешно экспрессироваться на NK-клетках. В некоторых вариантах осуществления усиленная экспрессия конструкции может быть достигнута путем повторной трансдукции NK-клеток конкретной конструкцией. В некоторых вариантах осуществления компоненты конструкций могут доставляться в клетку в одном векторе или, в качестве альтернативы, с использованием нескольких векторов. В зависимости от варианта осуществления конструкция сама по себе может приводить к усилению экспрессии, например, линейная конструкция или конструкция в конфигурации "голова к хвосту" может обеспечивать достижение увеличенной экспрессии благодаря меньшей степени внутриклеточной сборки, которая необходима для конструкции из нескольких субъединиц.
[00220] В дополнение к успешной экспрессии конструкций NKG2D на NK-клетках, для воздействия на клетки-мишени необходима эффективная передача сигнала в NK-клетках. Для оценивания действенности двух популяций трансдуцированных NK-клеток проводили анализы цитотоксичности с использованием линий клеток, восприимчивых к активности NK-клеток - REH (клетки в суспензионной культуре) и U-2 OS (клетки в адгезивной культуре). Данные, обобщающие процентное значение цитотоксичности в различных группах NK-клеток в отношении клеток REH и среди независимых доноров при двух соотношениях Е:Т, показаны на фигурах 5А-5С (планки погрешностей представляют стандартное отклонение; все эксперименты выполнены в трех повторностях; n=3 (Р<0,001)). Как изображено на фигурах 5А-5С, NK-клетки, экспрессирующие любой из двух химерных рецепторов NKG2D (NKG2D-DAP10-CD3ζ - показанные стрелкой, помеченной как (а), и NKG2D-41BB-CD3ζ - показанные стрелкой, помеченной как (b)), характеризовались значительно более высокой цитотоксичностью в отношении REH у всех трех доноров по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками (показанными стрелкой, помеченной как (с)). Среднее процентное значение цитотоксичности NK-клеток, экспрессирующих NKG2D-DAP10-CD3ζ, составляло 91,8%±5,8% (соотношение Е:Т 1:1) и 83,9%±5,6% (соотношение Е:Т 1:2). Те NK-клетки, которые были трансдуцированы посредством NKG2D-41BB-CD3ζ, демонстрировали сходные значения действенности: 87,4%±6,1% при соотношении Е:Т 1:1 и 76,2%±4,8% при соотношении Е:Т 1:2. NK-клетки, экспрессирующие химерный рецептор, также демонстрировали повышенную цитотоксичность в отношении U-2 OS по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками (см. фигуры 6А-6С, на фигуре 6А изображены клетки с NKG2D-DAP10-CD3ζ, показанные стрелкой, помеченной как (а), на фигуре 6В изображены клетки с NKG2D-41BB-CD3ζ, показанные стрелкой, помеченной как (b), и на фигуре 6С изображены ложнотрансдуцированные NK-клетки, показанные стрелкой, помеченной как (с)).
[00221] Эти данные подтверждают, что NK-клетки не только могут быть сконструированы таким образом, чтобы они экспрессировали конструкции химерных рецепторов, но такие клетки, которые экспрессируют химерные рецепторы, способны активироваться и успешно формировать усиленные цитотоксические эффекты в отношении клеток-мишеней. Важно отметить, что эти данные также демонстрируют, что происходит лишь незначительное уменьшение действенности клеток при наличии большего количества клеток-мишеней (удвоенного в данном эксперименте). Это свидетельствует о том, что требуемые цитотоксические эффекты сконструированных NK-клеток по-прежнему могут реализовываться, даже если NK-клетки присутствуют в меньших количествах по сравнению с клетками-мишенями, что, вероятно, может иметь место при клиническом применении. Более того, эти данные указывают на то, что согласно определенным вариантам осуществления меньшая плотность или степень экспрессии химерных рецепторов на данной NK-клетке не обязательно приводит к скоординированному ослаблению цитотоксических эффектов и может быть ассоциирована с неожиданной эффективностью NK-клеток с учетом их меньшей экспрессии конструкции. В дополнение, эти данные воплощают неожиданно усиленную цитотоксичность, которая достигается согласно некоторым вариантам осуществления. Хотя несконструированные NK-клетки являются цитотоксичными и экспрессируют значительное количество NKG2D при активации, было неожиданным, что сконструированные клетки, раскрытые в данном документе, могут выводить свои цитотоксические эффекты значительно дальше за рамки того, что уже можно считать повышенным пределом (например, цитотоксичности нативных NK-клеток).
[00222] В дополнение к данным о цитотоксичности изучали механизм, посредством которого NK-клетки проявляют эти эффекты, путем оценивания выработки интерферона-гамма (IFNγ) NK-клетками, экспрессирующими различные конструкции NKG2D. IFNγ является ключевым цитокином, вырабатываемым и высвобождаемым NK-клетками (обычно в ходе врожденного иммунного ответа), который рекрутирует макрофаги и оказывает иммуностимулирующие эффекты. На фигуре 7А показана относительная величина выработки IFNγ (измеренная по MFI) в ложнотрансдуцированных (левая панель), экспрессирующих NKG2D-DAP10-CD3ζ, NK-клетках (центральная панель) и экспрессирующих NKG2D-41BB-CD3ζ NK-клетках (правая панель) со стимуляцией клетками REH или без нее. NK-клетки окрашивали на внутриклеточный IFNγ с помощью антитела к IFNγ, конъюгированного с АРС. Данные анализировали с помощью парного t-критерия. Эти данные демонстрируют, что в каждой из трех групп NK-клеток наблюдался сходный уровень выработки IFNγ без стимуляции, при этом после стимуляции клетками REH наблюдалось его увеличение. Как предусмотрено в некоторых вариантах осуществления, экспрессия конструкций NKG2D в сконструированных NK-клетках может приводить к устойчивой выработке ими цитокинов. Наличие клеток-мишеней (в данном случае клеток REH), на которые отвечают сконструированные NK-клетки, запускает биохимический каскад, который приводит к выработке IFNγ и в конечном счете к цитотоксическим эффектам. Как показано на фигуре 7А, NK-клетки, экспрессирующие NKG2D-41BB-CD3ζ, демонстрируют устойчивую выработку IFNγ в присутствии стимулирующих клеток REH. Интересно, что NK-клетки, экспрессирующие NKG2D-DAP10-CD3ζ, были неспособны демонстрировать сходную степень ответа. Это дополнительно продемонстрировано на фигуре 7В, где оцениваются уровни IFNγ среди различных групп NK-клеток после стимуляции клетками REH (были представлены медианные значения; данные анализировали с помощью непарного t-критерия). Все эксперименты с IFNγ проводили в трех повторностях с тремя независимыми донорами, n=9. На фигуре 7В показано, что выработка IFNγ NK-клетками, экспрессирующими NKG2D-DAP10-CD3ζ, значительно не отличалась от выработки ложнотрансдуцированными NK-клетками. В отличие от этого, NK-клетки, экспрессирующие NKG2D-41BB-CD3ζ, демонстрировали значительное увеличение выработки IFNγ по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками. Эти данные интересны потому, что они демонстрируют, что, как обсуждается в данном документе, передача сигнала от химерного рецептора в ответ на связывание с лигандом является важным этапом в формировании цитотоксических эффектов в отношении клетки-мишени, представляющей интерес. Однако, не существует единственного сигнального пути, посредством которого различные конструкции передают сигнал, поскольку NK-клетки, трансдуцированные двумя разными химерными рецепторами, в обоих случаях демонстрируют относительно сходную цитотоксичность, но не аналогичные уровни выработки IFNγ. Таким образом, согласно определенным вариантам осуществления предусмотрены конструкции, которые обеспечивают достижение цитотоксических эффектов посредством повышенной выработки IFNγ или другого иммуностимулирующего цитокина по сравнению с нормальными NK-клетками. Однако, в некоторых вариантах осуществления не обязательно достигается или выявляется увеличенная выработка IFNγ, а вместо этого для достижения повышенных цитотоксических эффектов с помощью данной химерной конструкции может использоваться другой иммуностимулирующий сигнальный путь.
Пример 2 - конструкции NKG2D, содержащие CD16 и CD16-4-1BB
[00223] Были получены дополнительные конструкции для оценивании экспрессии, цитотоксичности и выработки цитокинов. Как предусмотрено в данном документе, некоторые варианты осуществления относятся к конструкциям, содержащим усеченный NKG2D (в определенных вариантах осуществления кодон-оптимизированный), в которых используется трансмембранный и/или сигнальный домен CD16. Конструкции, полученные для оценивания в данном эксперименте, схематически показаны на фигурах 2А-2В, на которых показана структура химерных рецепторов A) NKG2D-CD16 и В) NKG2D-CD16-41ВВ. В основе обоих химерных рецепторов лежит трансмембранная область CD16 для связывания с CD3ζ либо FcRγ. Плазмиды, используемые для получения этих конструкций, показаны на фигуре 3В. Как обсуждается выше, в некоторых вариантах осуществления при использовании конструкций полагались на эндогенную экспрессию CD3ζ или FcRγ, однако, в некоторых вариантах осуществления плазмида, кодирующая химерный рецептор (или отдельная плазмида), способна повышать экспрессию CD3ζ и/или FcRγ в NK-клетке, тем самым усиливая действенность таких клеток.
[00224] Как описано выше, оценивали уровни экспрессии конструкций. На фигуре 8А изображены репрезентативные данные проточной цитометрии для ложнотрансдуцированных (левая панель), экспрессирующих NKG2D-DAP10-CD3ζ NK-клеток (центральная панель) и экспрессирующих NKG2D-CD16 NK-клеток (эксперименты проводили с использованием клеток от трех независимых доноров, представленных разными символами. Данные анализировали с помощью парного t-критерия). На фигуре 8В показаны обобщенные данные, относящиеся к процентной доле клеток, которые экспрессируют NKG2D (а следовательно, и конструкции). Как и ожидалось, ложнотрансфицированные NK-клетки демонстрировали низкие уровни экспрессии NKG2D с используемым антителом. В отличие от этого, обе сконструированные конструкции демонстрировали значительно усиленную экспрессию, при этом NK-клетки, трансдуцированные посредством NKG2D-CD16, проявляли на 35,8%±6,9% большую экспрессию по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками. В дополнение, согласно оцениванию по MFI (фигура 8С) NK-клетки, трансдуцированные посредством NKG2D-CD16, также демонстрировали увеличенную экспрессию конструкции. Эти данные важны для демонстрации того, что конструкции можно эффективно вводить в NK-клетки, и они могут в них эффективно экспрессироваться.
[00225] После достижения экспрессии конструкций оценивали их способность демонстрировать цитотоксические эффекты. Как обсуждается выше, у NK-клеток от трех доноров тестировали цитотоксические эффекты в отношении клеток REH и клеток U-2 OS, в каждом случае при трех соотношениях Е:Т (все эксперименты выполняли в трех повторностях, n=3). Интересно, что усиленная экспрессия конструкции NKG2D-CD16 по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками не приводила в результате к увеличению цитотоксичности (см. фигуры 9А-9С, планки погрешностей представляют стандартные отклонения). Как и в предыдущем примере, NK-клетки, экспрессирующие NKG2D-DAP10-CD3ζ (показанные стрелкой, помеченной как (а)), действительно демонстрировали увеличенную цитотоксичность. Что касается цитотоксичности в отношении клеток U-2 OS, то клетки с NKG2D-CD16 (показанные стрелкой, помеченной как (b)) действительно демонстрировали увеличенную цитотоксичность по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками (показанными стрелкой, помеченной как (с)) (см. фигуры 10А-10С). Эти данные указывают на то, что степень цитотоксического воздействия на данный конкретный тип клеток-мишеней может варьироваться в зависимости от используемой конструкции в NK. В определенных вариантах осуществления конкретная конструкция может не быть настолько же эффективной, однако, в некоторых вариантах осуществления можно использовать комбинации популяций NK-клеток, которые демонстрируют синергические эффекты. Другими словами, популяция NK-клеток, часть которой экспрессирует NKG2D-CD16, а еще одна часть экспрессирует NKG2D-DAP10-CD3ζ (или другая комбинация любых из конструкций, раскрытых в данном документе), может демонстрировать неожиданно усиленную цитотоксичность по сравнению с любой взятой в отдельности субпопуляцией.
[00226] Затем измеряли выработку интерферона-γ для подтверждения механизма действия трансфицированных NK-клеток. NK-клетки, экспрессирующие различные конструкции, стимулировали либо не стимулировали клетками REH, и измеряли выработку IFNγ. Эти данные показаны на фигуре 11 (данные анализировали с помощью парного t-критерия). Все группы NK-клеток характеризовались сходным уровнем IFNγ без стимуляции и увеличением после инкубирования с клетками REH. NK-клетки, экспрессирующие NKG2D-CD16, демонстрировали увеличение выработки IFNγ, составляющее 634±211 единиц MFI, что превышало увеличение, демонстрируемое ложнотрансдуцированными NK-клетками (423±70 единиц MFI). Однако, данное увеличение было меньшим, чем наблюдаемое для NK-клеток, экспрессирующих NKG2D-DAP10-CD3ζ, у которых происходило увеличение на 2041±411 единиц MFI. В соответствии с этими данными согласно некоторым вариантам осуществления выработка IFNγ коррелирует с цитотоксическими эффектами, которые демонстрируют NK-клетки, экспрессирующие определенные конструкции.
[00227] В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, раскрытыми в данном документе, можно использовать несколько сигнальных областей. Проводили дополнительные эксперименты для оценивания экспрессии NKG2D-CD16-41BB в размноженных NK-клетках (эксперименты проводили с использованием клеток от одного донора). Данные об экспрессии показаны на фигурах 12А-12В. На фигуре 12А показаны необработанные данные проточной цитометрии, которые демонстрируют, что добавление сигнальной области 4-1ВВ значительно не ухудшало экспрессию конструкции NK-клетками по сравнению с конструкцией NKG2D-CD16. Это также отражено в сводной гистограмме на фигуре 12В, на которой показано относительное количество рецепторов NKG2D на поверхности NK-клеток в каждой из тестируемых групп. NKG2D-CD16-41BB демонстрировал слегка сниженную MFI по сравнению с NKG2D-CD16, но обе конструкции демонстрировали повышенную экспрессию по сравнению с контролем с ложной трансдукцией.
[00228] Цитотоксические эффекты оценивали так, как описано выше, с использованием в качестве мишеней как клеток REH, так и клеток U-2 OS. На фигурах 13А-13В изображены полученные в результате данные (планки погрешностей представляют стандартные отклонения; все эксперименты проводили в трех повторностях, n=3). На фигуре 13А показаны цитотоксические эффекты конструкций в отношении клеток REH. Аналогично описанному выше эксперименту, клетки, экспрессирующие NKG2D-CD16, показанные стрелкой, помеченной как (b), не демонстрировали значительно повышенных цитотоксических эффектов по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками, показанными стрелкой, помеченной как (а). В отличие от этого, NK-клетки, экспрессирующие NKG2D-CD16-41BB (показанные стрелкой, помеченной как (с)), демонстрировали усиленную цитотоксичность в отношении клеток REH. Что касается эффективности в отношении клеток U-2 OS, то клетки, экспрессирующие как NKG2D-CD16, так и NKG2D-CD16-41BB, демонстрировали усиленную цитотоксичность, при этом клетки, экспрессирующие NKG2D-CD16-41BB, демонстрировали более устойчивый цитотоксический эффект. Это демонстрирует, что, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, использование комбинации сигнальных доменов может приводить в результате к неожиданным усилениям эффективности трансдуцированной NK-клетки. Таким образом, как описано выше, в некоторых вариантах осуществления используются два или более трансмембранных/сигнальных домена, которые функционируют синергично друг с другом, обеспечивая достижение усиленной цитотоксичности в отношении клеток-мишеней.
Пример 3 - дополнительные конструкции NKG2D
[00229] Были получены дополнительные конструкции с различными внеклеточными доменами, трансмембранными доменами и внутриклеточными эффекторными доменами для оценивания их экспрессии и цитотоксичности. 12 конструкций, которые были получены для оценивания в данном эксперименте, схематически показаны на фигуре 14. В основе некоторых из этих вариантов химерных рецепторов лежит трансмембранная область CD16 для связывания с CD3ζ либо FcRγ. Как обсуждается выше, в некоторых вариантах осуществления при использовании конструкций полагались на эндогенную экспрессию CD3ζ или FcRγ, однако, в некоторых вариантах осуществления плазмида, кодирующая химерный рецептор (или отдельная плазмида), способна повышать экспрессию CD3ζ, и/или FcRγ в NK-клетке, тем самым усиливая действенность таких клеток. Как описано выше, оценивали уровни экспрессии конструкций. Ложнотрансфицированные NK-клетки демонстрировали низкие уровни экспрессии NKG2D согласно оцениванию по MFI (фигура 16А). В отличие от этого, NK-клетки, трансдуцированные вариантами конструкций NKG2D, описанными выше, демонстрировали различные уровни экспрессии NKG2D, при этом сконструированные варианты 4 и 9 конструкций демонстрировали значительно усиленную экспрессию в NK-клетках. На фигуре 16В изображены репрезентативные данные проточной цитометрии для вариантов 1, 4, 8, 9 конструкций NKG2D после трансдукции ими NK-клеток от двух доноров. По сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками NK-клетки, трансдуцированные вариантами 8 и 9, демонстрировали особенно сильную экспрессию химерного рецептора. Экспрессия вариантов конструкций сохранялась в NK-клетках от двух доноров через 7 дней после трансдукции, при этом варианты 8 и 9 демонстрировали особенно повышенные уровни согласно оцениванию по MFI (фигура 16С). Эти данные важны для демонстрации того, что конструкции можно эффективно вводить в NK-клетки, и они могут в них эффективно экспрессироваться. После достижения экспрессии конструкций также оценивали их способность придавать цитотоксические эффекты трансдуцированным NK-клеткам. Цитотоксичность вариантов 4, 8 и 9 конструкций NKG2D оценивали через 14 дней после трансдукции ими NK-клеток при соотношении Е:Т 1:1 (фигура 17).
[00230] Были получены дополнительные варианты конструкций, и они схематически показаны на фигуре 15, на которой показана структура химерных рецепторов, содержащих различные внеклеточные домены, трансмембранные домены и внутриклеточные эффекторные домены. В основе некоторых из этих вариантов химерных рецепторов лежит эффекторный домен, содержащий CD3-дзета и/или другой сигнальный домен для передачи сигналов при связывании с лигандом, тогда как другие варианты химерных рецепторов содержат трансмембранный домен CD3-дзета, который рекрутирует полноразмерную молекулу CD3-дзета в синапс посредством димеризации. Как описано выше, оценивали уровни экспрессии конструкций. Согласно оцениванию по MFI (фигуры 18А-В) NK-клетки, трансдуцированные сконструированными конструкциями, демонстрировали увеличенную экспрессию химерного рецептора по сравнению с ложнотрансдуцированными клетками. Цитотоксические эффекты оценивали так, как описано выше, с использованием соотношения эффектор : мишень 1:1. Как изображено на фигурах 19А-В, NK-клетки, трансдуцированные сконструированными конструкциями (особенно вариантом 18), обладали усиленной цитотоксичностью по сравнению с ложнотрансдуцированным контролем.
[00231] Поскольку вариант 18 демонстрировал устойчивую экспрессию в NK-клетках, которая сопровождалась усиленными цитотоксическими эффектами, была получена серия вариантов конструкций NKG2D, содержащих трансмембранный домен CD3-дзета. Данным вариантам было дано название "NK39", и они схематически показаны на фигуре 15. Через четырнадцать дней после трансфекции донорских NK-клеток (с культивированием в течение 4 дней при низких концентрациях IL-2) оценивали цитотоксичность трансдуцированных NK-клеток. На фигуре 21 показаны цитотоксические эффекты конструкций в отношении культивируемых клеток REH при соотношениях Е:Т 1:1 и 1:2. Все NK-клетки, экспрессирующие сконструированные конструкции NK39, демонстрировали значительно повышенные цитотоксические эффекты по сравнению с контрольными NK-клетками при соотношении Е:Т 1:1. При оценивании в соотношении Е:Т 1:2 каждая из химерных конструкций 16-7, 39-1, 39-2, 39-3 и 39-5 усиливала цитотоксические эффекты соответствующих трансдуцированных ими NK-клеток по сравнению с ложнотрансдуцированным контролем. Поскольку экзогенная экспрессия активирующих рецепторов может приводить к анергии и гибели NK-клеток, сконструированные конструкции вводили в NK-клетки от двух доноров путем трансдукции, и через 21 день оценивали выживаемость. Как изображено на фигурах 23А-В, клетки, трансдуцированные посредством NK39-5 и NK39-10, демонстрировали лучшую выживаемость, чем трансдуцированные NK16, у двух тестируемых доноров.
Пример 4 - оценивание конструкций NKG2D NK45
[00232] Дополнительные конструкции с различными внеклеточными доменами, шарнирными областями, трансмембранными доменами и внутриклеточными эффекторными доменами согласно вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, схематически показаны на фигуре 22. В данном примере оценивали экспрессию, цитотоксичность, персистенцию и выработку цитокинов, опосредованную данными 7 конструкциями, по сравнению с тремя описанными в примере 3 конструкциями NK39 (NK39-5, NK39-6, NK39-10), а также версии NK16, в которой бицистронно экспрессируется мембраносвязанный интерлейкин 15 (NK26-8). В соответствии с некоторыми вариантами осуществления, раскрытыми в данном документе, можно использовать несколько сигнальных областей. В основе некоторых из этих вариантов химерных рецепторов лежит эффекторный домен, содержащий CD3-дзета и/или другой сигнальный домен (например, костимулирующие домены ОХ40, CD28 и/или 4-1ВВ) для передачи сигналов при связывании с лигандом, тогда как другие варианты химерных рецепторов содержат транс мембранный домен CD3-дзета, который рекрутирует полноразмерную молекулу CD3-дзета в синапс посредством димеризации. Как раскрыто в данном документе, эти конструкции дополнительно способны к совместной экспрессии мембраносвязанного IL15.
[00233] Как описано выше, сначала оценивали способность NK-клеток эффективно экспрессировать эти конструкции. NK-клетки, размноженные из РВМС от четырех доноров, трансдуцировали вариантами конструкций (или пустым контрольным вектором на основе MSCV, содержащим только ген GFP), и через 3 дня оценивали экспрессию NKG2D по MFI. Как изображено на фиг. 24, ложнотрансфицированные NK-клетки демонстрировали относительно низкие уровни экспрессии NKG2D. В отличие от этого, сконструированные варианты конструкции демонстрировали значительно усиленную экспрессию, при этом NK45-4 (NKG2D-OX40-CD3ζ демонстрировал удивительно устойчивую экспрессию у всех доноров. ОХ40 экспрессируется в активированных NK-клетках, но его роль была недостаточно хорошо изучена. Вариант химерного рецептора с эффекторным доменом, содержащим ко стимулирующий домен CD28 (NK45-2; NKG2D-CD28-CD3ζ), также демонстрировал устойчивую экспрессию через 3 дня после трансдукции.
[00234] После достижения экспрессии вариантов конструкций их способность проявлять цитотоксические эффекты оценивали так, как описано выше, с использованием клеток REH и HL60 в качестве мишеней. Через 14 дней после трансдукции изучали действенность NK-клеток от четырех доноров в отношении клеток REH (фиг. 25А) и клеток HL60 (фиг. 25В) при соотношении Е:Т 1:1. Как изображено на фиг. 25А-В, сконструированные конструкции проявляли усиленную цитотоксичность в отношении как клеток REH, так и клеток HL60 у всех четырех доноров по сравнению с ложнотрансдуцированными NK-клетками. В дополнение к их выраженному профилю экспрессии, клетки, экспрессирующие NK45-4 (NKG2D-OX40-CD3ζ), также демонстрировали удивительно повышенную цитотоксичность по сравнению с ложнотрансдуцированным контролем и другими тестируемыми конструкциями. NK-клетки, экспрессирующие NK45-1 и NK45-2, также демонстрировали выраженную цитотоксичность в этих анализах. Эти данные демонстрируют, что, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, использование комбинации сигнальных доменов (в частности, костимулирующего домена ОХ40) может приводить в результате к неожиданным усилениям эффективности трансдуцированной NK-клетки. На фиг. 28А-В изображена цитотоксическая активность в отношении клеток U-2 OS у NK-клеток, трансдуцированных некоторыми вариантами конструкций при различных соотношениях Е:Т (1:2 и 1:4) и оцениваемых на протяжении более продолжительного периода времени. На удивление, NK-клетки, трансдуцированные конструкцией 45-4, по-видимому, сохраняли цитотоксическую активность в течение данного периода времени. Данные эксперименты преимущественно указывают на то, что, согласно некоторым вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, варианты конструкций NKG2D обеспечивают неожиданно усиленную цитотоксичность на протяжении продолжительного периода времени, который, в зависимости от варианта осуществления, может находиться в диапазоне 2-3 дней, 3-5 дней, 5-7 дней, 7-8 дней, 8-10 дней, 10-14 дней, 14-21 дня или 21-50 дней (и в любом диапазоне между перечисленными значениями, включая конечные точки). В некоторых вариантах осуществления достигались даже еще более длительные продолжительности цитотоксических эффектов.
[00235] В дополнение к данным о цитотоксичности изучали механизм, посредством которого NK-клетки проявляют эти эффекты, путем оценивания выработки ими IFNγ, TNFα и GM-CSF после стимуляции клетками REH. Как изображено на фиг. 26А-С, экспрессия каждого из данных вариантов конструкций приводила к усиленной секреции цитокинов по сравнению с выработкой IFNγ, TNFα и GM-CSF, демонстрируемой контрольными NK-клетками, экспрессирующими GFP. Химерный рецептор NK45-1 неизменно опосредовал высокую выработку цитокинов, что было неожиданным, поскольку данная конструкция экспрессируется на существенно более низких уровнях, чем NK26-8 (от которой она отличается только в том, что касается шарнирной области). Таким образом, эти данные демонстрируют неожиданную важность шарнирных областей, раскрытых в данном документе, для опосредования устойчивой выработки цитокинов в ответ на стимуляцию. В дополнение, NK-клетки, экспрессирующие NKG2D-OX40-CD3ζ, также демонстрировали повышенную выработку IFNγ, TNFα и GM-CSF.
[00236] Поскольку экзогенная экспрессия активирующих рецепторов может приводить к анергии и гибели NK-клеток, сконструированные конструкции вводили в NK-клетки от двух доноров путем трансдукции, и через 7, 14 и 21 день после трансдукции оценивали общее число клеток. На удивление, неожиданно устойчивая экспрессия NK45-4 достигалась не за счет снижения персистенции NK-клеток в культуре, поскольку общее число клеток оставалось на уровнях, сравнимых с уровнями контрольных клеток, экспрессирующих GFP (фиг. 27А и 27В). Аналогично, другие NK-клетки, экспрессирующие варианты конструкций на высоких уровнях, продолжали пролиферировать у 2 доноров в течение по меньшей мере 3 недель после трансдукции. В совокупности эти данные демонстрируют, что, в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, раскрытыми в данном документе, сконструированные конструкции могут успешно экспрессироваться на высоких уровнях в NK-клетках и опосредовать цитотоксические эффекты, и, кроме того, что такая усиленная экспрессия достигается не в ущерб пролиферации и/или выживаемости NK-клеток с их снижением.
[00237] Подразумевается, что можно реализовать различные комбинации или подкомбинации конкретных признаков и аспектов вариантов осуществления, раскрытых выше, и они по-прежнему находятся в пределах объема одного или нескольких изобретений. В дополнение, раскрытие в данном документе любого конкретного признака, аспекта, способа, свойства, характеристики, качества, атрибута, элемента или тому подобного в связи с вариантом осуществления может использоваться во всех других вариантах осуществления, изложенных в данном документе. Соответственно, следует понимать, что различные признаки и аспекты раскрытых вариантов осуществления можно комбинировать друг с другом или заменять друг другом для формирования различных принципов раскрытых изобретений. Таким образом, подразумевается, что объем настоящего изобретения, раскрытого в данном документе, не должен ограничиваться конкретными раскрытыми вариантами осуществления, описанными выше. Более того, несмотря на то, что в настоящем изобретении допускаются различные модификации и альтернативные формы, его конкретные примеры были показаны в графических материалах и подробно описаны в данном документе. Тем не менее, следует понимать, что настоящее изобретение не должно быть ограничено конкретными раскрытыми формами или способами, а, наоборот, настоящее изобретение должно охватывать все модификации, эквиваленты и альтернативы, находящиеся в пределах сущности и объема различных описанных вариантов осуществления и прилагаемой формулы изобретения. Любые раскрытые в данном документе способы не обязательно необходимо выполнять в указанном порядке. Раскрытые в данном документе способы включают определенные действия, осуществляемые практикующим специалистом; тем не менее, они также могут включать любое прямое или косвенное предоставление инструкций по выполнению таких действий третьей стороной. Например, такие действия, как "введение популяции размноженных NK-клеток", включают "предоставление инструкций по введению популяции размноженных NK-клеток". Кроме того, если признаки или аспекты настоящего изобретения описаны в категориях групп Маркуша, специалисты в данной области поймут, что настоящее изобретение также таким образом описано в категориях любого отдельного члена или подгруппы членов группы Маркуша.
[00238] Раскрытые в данном документе диапазоны также охватывают все без ограничения перекрывания, поддиапазоны и их комбинации. Такие выражения, как "до", "по меньшей мере", "более", "менее", "от … до" и т.п., включают указанное число. Числа, которым предшествует такой термин, как "приблизительно" или "примерно", включают указанные числа. Например, "приблизительно 90%" включает "90%". В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 95% гомология включает 96%, 97%, 98%, 99% и 100% гомологию по отношению к эталонной последовательности. Кроме того, если последовательность раскрыта как "содержащая" нуклеотидную или аминокислотную последовательность, такое указание также должно включать, если не указано иное, что последовательность "содержит" указанную последовательность, "состоит из" или "фактически состоит из" нее.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> National University of Singapore; Nkarta, Inc
<120> УСЕЧЕННЫЕ ХИМЕРНЫЕ РЕЦЕПТОРЫ NKG2D И ПУТИ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В
ИММУНОТЕРАПИИ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЕСТЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК-КИЛЛЕРОВ
<130> 4459.1144002
<150> 62/477335
<151> 2017-03-27
<150> 62/628774
<151> 2018-02-09
<160> 109
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 645
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Полноразмерный NKG2D
<400> 1
gggtggattc gtggtcggag gtctcgacac agctgggaga tgagtgaatt tcataattat 60
aacttggatc tgaagaagag tgatttttca acacgatggc aaaagcaaag atgtccagta 120
gtcaaaagca aatgtagaga aaatgcatct ccattttttt tctgctgctt catcgctgta 180
gccatgggaa tccgtttcat tattatggta acaatatgga gtgctgtatt cctaaactca 240
ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 300
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 360
gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 420
gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 480
acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 540
attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 600
aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 645
<210> 2
<211> 405
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Усеченный NKG2D
<400> 2
ttattcaacc aagaagttca aattcccttg accgaaagtt actgtggccc atgtcctaaa 60
aactggatat gttacaaaaa taactgctac caattttttg atgagagtaa aaactggtat 120
gagagccagg cttcttgtat gtctcaaaat gccagccttc tgaaagtata cagcaaagag 180
gaccaggatt tacttaaact ggtgaagtca tatcattgga tgggactagt acacattcca 240
acaaatggat cttggcagtg ggaagatggc tccattctct cacccaacct actaacaata 300
attgaaatgc agaagggaga ctgtgcactc tatgcctcga gctttaaagg ctatatagaa 360
aactgttcaa ctccaaatac gtacatctgc atgcaaagga ctgtg 405
<210> 3
<211> 405
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Кодон-оптимизированный усеченный NKG2D
<400> 3
ctgttcaatc aggaagtcca gatccccctg acagagtctt actgcggccc atgtcccaag 60
aactggatct gctacaagaa caattgttat cagttctttg acgagagcaa gaactggtat 120
gagtcccagg cctcttgcat gagccagaat gcctctctgc tgaaggtgta cagcaaggag 180
gaccaggatc tgctgaagct ggtgaagtcc tatcactgga tgggcctggt gcacatccct 240
acaaacggct cttggcagtg ggaggacggc tccatcctgt ctccaaatct gctgaccatc 300
atcgagatgc agaagggcga ttgcgccctg tacgccagct ccttcaaggg ctatatcgag 360
aactgctcca cacccaatac ctacatctgt atgcagagga ccgtg 405
<210> 4
<211> 63
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Сигнальная последовательность CD8
<400> 4
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
cca 63
<210> 5
<211> 135
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Шарнирная область CD8-альфа
<400> 5
accacaaccc ctgcaccacg cccccctaca ccagcaccta ccatcgcaag ccagcctctg 60
tccctgcggc cagaggcatg tagaccagca gcaggaggag cagtgcacac aagaggcctg 120
gacttcgcct gcgat 135
<210> 6
<211> 1722
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> CD8 бета
<220>
<221> другой_признак
<222> (674)..(773)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (859)..(958)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<400> 6
atctaggtct tgctgcaccc gcacaaccta caaacagcgt cggggccttc tctgcacctc 60
cagttcccag ctcacctccc tcagtgtcac agccggttac ctttccttcc tccctggggg 120
agggcaagac ttggggcttg ctgactccag gcccagccca gcccggggca cccaggagcc 180
cctcaattgc tactcaaaca gacaagaagc ggcccgagtt agtggccagc tccaccatgc 240
actacacatc ctgacctctc tgagcctcta ctgtcactcg gggtcacaac cctttcctga 300
gcacctcccg gggcaggggg cgatgacaca catgcagctg cctgggggag gccggcggtg 360
tcccctcctt tctggaacgc ggagggtcct ggtgggctct ggaaacgcag cccagacctt 420
tgcaatgcta ggaggatgag ggcggagacc tcgcggtccc caacaccaga ctcccgcagc 480
caccgcgccc ggtcccgccc tccccactgc ccccccagct ccccgaccca ggcgccccgc 540
ccggccagct cctcacccac cccagccgcg actgtctccg ccgagccccc ggggccaggt 600
gtcccgggcg cgccacgatg cggccgcggc tgtggctcct cctggccgcg cagctgacag 660
gtaaggcggc ggcnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 720
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnttgcttt 780
cctcttccag gccggcggag gagagcccgg cttcgtttca tgaaacagta agtgtataac 840
ctgggtgtgg ccttgggann nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 900
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnct 960
tgctgttgtt ttcagatttt acaaatgagc agagaatacg gttttggtgt cctgctacaa
1020
aaagacatcg gtcagtaacg agcacgatgt ggaaaaatga gagaagggac acattcaacc
1080
ctggagagtt caatggctgc tgaagctgcc tgcttttcac tgctgcaagg cctttctgtg
1140
tgtgacgtgc atgggagcaa cttgttcgtg ggtcatcggg aatactaggg agaaggtttc
1200
attgccccca gggcacttca cagagtgtgc tggaggactg agtaagaaat gctgcccatg
1260
ccaccgcttc cggctcctgt gctttccctg aactgggacc tttagtggtg gccatttagc
1320
caccatcttt gcaggttgct ttgccctggt agggcagtaa cattgggtcc tgggtctttc
1380
atggggtgat gctgggctgg ctccctgttg gtcttcccag gctggggctg accttcctcg
1440
cagagaggcc aggtgcaggt tgggaatgag gcttgctgag aggggctgtc cagttcccag
1500
aaggcatatc agtctctgag ggcttccttt ggggccggga acttgcgggt ttgaggatag
1560
gagttcactt catcttctca gctcccattt ctactcttaa gtttctcagc tcccatttct
1620
actctcccat ggcttaatgc ttctttcatt ttctgtttgt tttatacaaa tgtcttagtt
1680
gtaaaaataa agtcccaggt taaagataac aaacgggtcc tg 1722
<210> 7
<211> 2415
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> CD16 альфа
<400> 7
attcttggtg ctgggtggat ccaaatccag gagatggggc aagcatcctg ggatggctga 60
gggcacactc tggcagattc tgtgtgtgtc ctcagatgct cagccacaga cctttgaggg 120
agtaaagggg gcagacccac ccaccttgcc tccaggctct ttccttcctg gtcctgttct 180
atggtggggc tcccttgcca gacttcagac tgagaagtca gatgaagttt caagaaaagg 240
aaattggtgg gtgacagaga tgggtggagg ggctggggaa aggctgttta cttcctcctg 300
tctagtcggt ttggtccctt tagggctccg gatatctttg gtgacttgtc cactccagtg 360
tggcatcatg tggcagctgc tcctcccaac tgctctgcta cttctagttt cagctggcat 420
gcggactgaa gatctcccaa aggctgtggt gttcctggag cctcaatggt acagggtgct 480
cgagaaggac agtgtgactc tgaagtgcca gggagcctac tcccctgagg acaattccac 540
acagtggttt cacaatgaga gcctcatctc aagccaggcc tcgagctact tcattgacgc 600
tgccacagtc gacgacagtg gagagtacag gtgccagaca aacctctcca ccctcagtga 660
cccggtgcag ctagaagtcc atatcggctg gctgttgctc caggcccctc ggtgggtgtt 720
caaggaggaa gaccctattc acctgaggtg tcacagctgg aagaacactg ctctgcataa 780
ggtcacatat ttacagaatg gcaaaggcag gaagtatttt catcataatt ctgacttcta 840
cattccaaaa gccacactca aagacagcgg ctcctacttc tgcagggggc tttttgggag 900
taaaaatgtg tcttcagaga ctgtgaacat caccatcact caaggtttgg cagtgtcaac 960
catctcatca ttctttccac ctgggtacca agtctctttc tgcttggtga tggtactcct
1020
ttttgcagtg gacacaggac tatatttctc tgtgaagaca aacattcgaa gctcaacaag
1080
agactggaag gaccataaat ttaaatggag aaaggaccct caagacaaat gacccccatc
1140
ccatgggggt aataagagca gtagcagcag catctctgaa catttctctg gatttgcaac
1200
cccatcatcc tcaggcctct ctacaagcag caggaaacat agaactcaga gccagatccc
1260
ttatccaact ctcgactttt ccttggtctc cagtggaagg gaaaagccca tgatcttcaa
1320
gcagggaagc cccagtgagt agctgcattc ctagaaattg aagtttcaga gctacacaaa
1380
cactttttct gtcccaaccg ttccctcaca gcaaagcaac aatacaggct agggatggta
1440
atcctttaaa catacaaaaa ttgctcgtgt tataaattac ccagtttaga ggggaaaaaa
1500
aaacaattat tcctaaataa atggataagt agaattaatg gttgaggcag gaccatacag
1560
agtgtgggaa ctgctgggga tctagggaat tcagtgggac caatgaaagc atggctgaga
1620
aatagcaggt agtccaggat agtctaaggg aggtgttccc atctgagccc agagataagg
1680
gtgtcttcct agaacattag ccgtagtgga attaacagga aatcatgagg gtgacgtaga
1740
attgagtctt ccaggggact ctatcagaac tggaccatct ccaagtatat aacgatgagt
1800
cctcttaatg ctaggagtag aaaatggtcc taggaagggg actgaggatt gcggtggggg
1860
gtggggtgga aaagaaagta cagaacaaac cctgtgtcac tgtcccaagt tgctaagtga
1920
acagaactat ctcagcatca gaatgagaaa gcctgagaag aaagaaccaa ccacaagcac
1980
acaggaagga aagcgcagga ggtgaaaatg ctttcttggc cagggtagta agaattagag
2040
gttaatgcag ggactgtaaa accacctttt ctgcttcaat atctaattcc tgtgtagctt
2100
tgttcattgc atttattaaa caaatgttgt ataaccaata ctaaatgtac tactgagctt
2160
cgctgagtta agttatgaaa ctttcaaatc cttcatcatg tcagttccaa tgaggtgggg
2220
atggagaaga caattgttgc ttatgaaaga aagctttagc tgtctctgtt ttgtaagctt
2280
taagcgcaac atttcttggt tccaataaag cattttacaa gatcttgcat gctactctta
2340
gatagaagat gggaaaacca tggtaataaa atatgaatga taaaaaaaaa aaaaaaaaaa
2400
aaaaaaaaaa aaaaa 2415
<210> 8
<211> 2473
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> CD16 бета
<220>
<221> другой_признак
<222> (211)..(310)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (537)..(636)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<220>
<221> другой_признак
<222> (968)..(1067)
<223> n представляет собой a, c, g или t
<400> 8
aaagatgggt ggagggactg gggaaaggct gtttactccc tcctgtctag tcggcttggt 60
ccctttaggg gtccggatat ctttggtgac ttgtccactc cagtgtggca tcatgtggca 120
gctgctcctc ccaactgctc tgctacttct aggtaagtag gatctccctg gttgagggag 180
aagtttgaga tgccttgggt tcagcagaga nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 240
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 300
nnnnnnnnnn aagaggcatg aacagtggaa gaccagagag caggtagcaa ggtttccacc 360
agaaacatcc tgattcttgg gaaaattggg ctcctggggc agaggagggc aggggagttt 420
taaactcact ctatgttcta atcactctga tctctgcccc tactcaatat ttgatttact 480
cttttttctt gcagtttcag ctggcatgcg gactggtgag tcagcttcat ggtcttnnnn 540
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 600
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnncact gagagctgag ctcccgggcc 660
tggggtgtct ctgtgtcttt caggctggct gttgctccag gcccctcggt gggtgttcaa 720
ggaggaagac cctattcacc tgaggtgtca cagctggaag aacactgctc tgcataaggt 780
cacatattta cagaatggca aagacaggaa gtattttcat cataattctg acttccacat 840
tccaaaagcc acactcaaag atagcggctc ctacttctgc agggggcttg ttgggagtaa 900
aaatgtgtct tcagagactg tgaacatcac catcactcaa ggtgagacat gtgccaccct 960
ggaatgcnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn
1020
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnttt ttcatctctc
1080
cacttctcct aataggtttg gcagtgtcaa ccatctcatc attctctcca cctgggtacc
1140
aagtctcttt ctgcttggtg atggtactcc tttttgcagt ggacacagga ctatatttct
1200
ctgtgaagac aaacatttga agctcaacaa gagactggaa ggaccataaa cttaaatgga
1260
gaaaggaccc tcaagacaaa tgacccccat cccatgggag taataagagc agtggcagca
1320
gcatctctga acatttctct ggatttgcaa ccccatcatc ctcaggcctc tctacaagca
1380
gcaggaaaca tagaactcag agccagatcc tttatccaac tctcgatttt tccttggtct
1440
ccagtggaag ggaaaagccc atgatcttca agcagggaag ccccagtgag tagctgcatt
1500
cctagaaatt gaagtttcag agctacacaa acactttttc tgtcccaacc attccctcac
1560
agtaaaacaa caatacaggc tagggatggt aatcctttaa acatacaaaa attgctcgta
1620
ttataaatta cccagtttag accggaaaaa agaaaataat tattcctaaa caaatggata
1680
agtagaatta atgattgagg caggacccta cagagtgtgg gaactgctgg ggatctagag
1740
aattcagtgg gaccaatgaa agcatggctg agaaatagca gggtagtcca ggagagtcta
1800
agggaggtgt tcccatctga gcccagagat aagggtgtct tcctagaaca ttagccgtag
1860
tggaattaac aggaaatcat gagggtgacg tagaattgag tcttccaggg gactctatca
1920
gaactggacc atttccaagt atataacgat gagccctcta atgctaggag tagcaaatgg
1980
tcctaggaag gggactgagg attggggtgg gggtggggtg gaaaagaaag tacagaacaa
2040
accctgtgtc actgtcccaa gttaagctaa gtgaacagaa ctatctcagc atcagaatga
2100
gaaagcctga gaagaaagaa ccaaccacaa gcacacagga aggaaagcgc aggaggtgaa
2160
aatgctttct tggccagggt agtaagaatt agaggttaat gcagggactg taaaaccacc
2220
ttttctgctt caatgtctag ttcctgtata gctttgttca ttgcatttat taaacaaatg
2280
ttgtataacc aatactaaat gtactactga gcttcactga gttacgctgt gaaactttca
2340
aatccttctt catgtcagtt ccaatgaggt ggggatggag aagacaattg ttgcttatga
2400
aaaaaagctt tagctgtctc tgttttgtaa gctttcagtg caacatttct tggttccaat
2460
aaagcatttt aca 2473
<210> 9
<211> 370
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 2B4
<400> 9
Met Leu Gly Gln Val Val Thr Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Lys Val
1 5 10 15
Tyr Gln Gly Lys Gly Cys Gln Gly Ser Ala Asp His Val Val Ser Ile
20 25 30
Ser Gly Val Pro Leu Gln Leu Gln Pro Asn Ser Ile Gln Thr Lys Val
35 40 45
Asp Ser Ile Ala Trp Lys Lys Leu Leu Pro Ser Gln Asn Gly Phe His
50 55 60
His Ile Leu Lys Trp Glu Asn Gly Ser Leu Pro Ser Asn Thr Ser Asn
65 70 75 80
Asp Arg Phe Ser Phe Ile Val Lys Asn Leu Ser Leu Leu Ile Lys Ala
85 90 95
Ala Gln Gln Gln Asp Ser Gly Leu Tyr Cys Leu Glu Val Thr Ser Ile
100 105 110
Ser Gly Lys Val Gln Thr Ala Thr Phe Gln Val Phe Val Phe Glu Ser
115 120 125
Leu Leu Pro Asp Lys Val Glu Lys Pro Arg Leu Gln Gly Gln Gly Lys
130 135 140
Ile Leu Asp Arg Gly Arg Cys Gln Val Ala Leu Ser Cys Leu Val Ser
145 150 155 160
Arg Asp Gly Asn Val Ser Tyr Ala Trp Tyr Arg Gly Ser Lys Leu Ile
165 170 175
Gln Thr Ala Gly Asn Leu Thr Tyr Leu Asp Glu Glu Val Asp Ile Asn
180 185 190
Gly Thr His Thr Tyr Thr Cys Asn Val Ser Asn Pro Val Ser Trp Glu
195 200 205
Ser His Thr Leu Asn Leu Thr Gln Asp Cys Gln Asn Ala His Gln Glu
210 215 220
Phe Arg Phe Trp Pro Phe Leu Val Ile Ile Val Ile Leu Ser Ala Leu
225 230 235 240
Phe Leu Gly Thr Leu Ala Cys Phe Cys Val Trp Arg Arg Lys Arg Lys
245 250 255
Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu
260 265 270
Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr
275 280 285
Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser
290 295 300
Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile
305 310 315 320
Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser
325 330 335
Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala
340 345 350
Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val
355 360 365
Tyr Ser
370
<210> 10
<211> 279
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> DAP10
<400> 10
atgatccatc tgggtcacat cctcttcctg cttttgctcc cagtggctgc agctcagacg 60
actccaggag agagatcatc actccctgcc ttttaccctg gcacttcagg ctcttgttcc 120
ggatgtgggt ccctctctct gccgctcctg gcaggcctcg tggctgctga tgcggtggca 180
tcgctgctca tcgtgggggc ggtgttcctg tgcgcacgcc cacgccgcag ccccgcccaa 240
gatggcaaag tctacatcaa catgccaggc aggggctga 279
<210> 11
<211> 575
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> DAP12
<400> 11
agacttcctc cttcacttgc ctggacgctg cgccacatcc caccggccct tacactgtgg 60
tgtccagcag catccggctt catgggggga cttgaaccct gcagcaggct cctgctcctg 120
cctctcctgc tggctgtaag tgattgcagt tgctctacgg tgagcccggg cgtgctggca 180
gggatcgtga tgggagacct ggtgctgaca gtgctcattg ccctggccgt gtacttcctg 240
ggccggctgg tccctcgggg gcgaggggct gcggaggcag cgacccggaa acagcgtatc 300
actgagaccg agtcgcctta tcaggagctc cagggtcaga ggtcggatgt ctacagcgac 360
ctcaacacac agaggccgta ttacaaatga gcccgaatca tgacagtcag caacatgata 420
cctggatcca gccattcctg aagcccaccc tgcacctcat tccaactcct accgcgatac 480
agacccacag agtgccatcc ctgagagacc agaccgctcc ccaatactct cctaaaataa 540
acatgaagca caaaaacaaa aaaaaaaaaa aaaaa 575
<210> 12
<211> 126
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> 4-1BB
<400> 12
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 13
<211> 339
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> CD3-дзета
<400> 13
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339
<210> 14
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Канонический полу-ITAM
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> X = любая аминокислота
<400> 14
Asp Gly Tyr Xaa Xaa Leu
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Мотив ITSM
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> N = S или T
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> X = любая аминокислота
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(5)
<223> X = любая аминокислота
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> N = L или R
<400> 15
Asn Xaa Tyr Xaa Xaa Asn
1 5
<210> 16
<211> 614
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Мембраносвязанный IL15
<400> 16
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgaactggg tgaatgtaat aagtgatttg aaaaaaattg aagatcttat tcaatctatg 120
catattgatg ctactttata tacggaaagt gatgttcacc ccagttgcaa agtaacagca 180
atgaagtgct ttctcttgga gttacaagtt atttcacttg agtccggaga tgcaagtatt 240
catgatacag tagaaaatct gatcatccta gcaaacaaca gtttgtcttc taatgggaat 300
gtaacagaat ctggatgcaa agaatgtgag gaactggagg aaaaaaatat taaagaattt 360
ttgcagagtt ttgtacatat tgtccaaatg ttcatcaaca cttctaccac gacgccagcg 420
ccgcgaccac caacaccggc gcccaccatc gcgtcgcagc ccctgtccct gcgcccagag 480
gcgtgccggc cagcggcggg gggcgcagtg cacacgaggg ggctggactt cgcctgtgat 540
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggtatca 600
ccctttactg ctaa 614
<210> 17
<211> 204
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Мембраносвязанный IL15
<400> 17
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
20 25 30
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
35 40 45
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
50 55 60
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
65 70 75 80
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
85 90 95
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
100 105 110
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
115 120 125
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
130 135 140
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
145 150 155 160
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
165 170 175
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
180 185 190
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
195 200
<210> 18
<211> 1140
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3z
<220>
<221> другой_признак
<223> NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3z (также известный как NK16)
<400> 18
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacatacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780
gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 840
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 900
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 960
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag
1020
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc
1080
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa
1140
<210> 19
<211> 379
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3z
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NKG2D/CD8a/4-1BB/CD3z (также
известного как
NK16)
<400> 19
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
225 230 235 240
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
245 250 255
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
260 265 270
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
275 280 285
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
290 295 300
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
305 310 315 320
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
325 330 335
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
340 345 350
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
355 360 365
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375
<210> 20
<211> 46
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность TM/IC NCR1
<400> 20
Met Gly Leu Ala Phe Leu Val Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu Val
1 5 10 15
Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg Ala
20 25 30
Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu
35 40 45
<210> 21
<211> 276
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Полноразмерный NCR2
<400> 21
Met Ala Trp Arg Ala Leu His Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe
1 5 10 15
Pro Gly Ser Gln Ala Gln Ser Lys Ala Gln Val Leu Gln Ser Val Ala
20 25 30
Gly Gln Thr Leu Thr Val Arg Cys Gln Tyr Pro Pro Thr Gly Ser Leu
35 40 45
Tyr Glu Lys Lys Gly Trp Cys Lys Glu Ala Ser Ala Leu Val Cys Ile
50 55 60
Arg Leu Val Thr Ser Ser Lys Pro Arg Thr Met Ala Trp Thr Ser Arg
65 70 75 80
Phe Thr Ile Trp Asp Asp Pro Asp Ala Gly Phe Phe Thr Val Thr Met
85 90 95
Thr Asp Leu Arg Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Trp Cys Arg Ile Tyr
100 105 110
Arg Pro Ser Asp Asn Ser Val Ser Lys Ser Val Arg Phe Tyr Leu Val
115 120 125
Val Ser Pro Ala Ser Ala Ser Thr Gln Thr Ser Trp Thr Pro Arg Asp
130 135 140
Leu Val Ser Ser Gln Thr Gln Thr Gln Ser Cys Val Pro Pro Thr Ala
145 150 155 160
Gly Ala Arg Gln Ala Pro Glu Ser Pro Ser Thr Ile Pro Val Pro Ser
165 170 175
Gln Pro Gln Asn Ser Thr Leu Arg Pro Gly Pro Ala Ala Pro Ile Ala
180 185 190
Leu Val Pro Val Phe Cys Gly Leu Leu Val Ala Lys Ser Leu Val Leu
195 200 205
Ser Ala Leu Leu Val Trp Trp Gly Asp Ile Trp Trp Lys Thr Met Met
210 215 220
Glu Leu Arg Ser Leu Asp Thr Gln Lys Ala Thr Cys His Leu Gln Gln
225 230 235 240
Val Thr Asp Leu Pro Trp Thr Ser Val Ser Ser Pro Val Glu Arg Glu
245 250 255
Ile Leu Tyr His Thr Val Ala Arg Thr Lys Ile Ser Asp Asp Asp Asp
260 265 270
Glu His Thr Leu
275
<210> 22
<211> 66
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TM/IC-домены NCR3
<400> 22
Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu Arg Ala Gly Phe Tyr Ala Val Ser Phe
1 5 10 15
Leu Ser Val Ala Val Gly Ser Thr Val Tyr Tyr Gln Gly Lys Cys Leu
20 25 30
Thr Trp Lys Gly Pro Arg Arg Gln Leu Pro Ala Val Val Pro Ala Pro
35 40 45
Leu Pro Pro Pro Cys Gly Ser Ser Ala His Leu Leu Pro Pro Val Pro
50 55 60
Gly Gly
65
<210> 23
<211> 741
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NKG2D/CD16
<400> 23
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgcccgc 60
cccctgttca accaggaagt gcagatcccc ctgaccgagt cctattgtgg cccttgccct 120
aagaattgga tttgctataa aaacaactgc taccagttct ttgacgagtc taagaattgg 180
tatgagtccc aggcctcttg tatgagccag aacgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cccacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctcctaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgca gcacacccaa tacctacatc tgtatgcagc ggacagtgac cacaacccca 480
gcacccaggc cccctacacc tgcaccaacc atcgcaagcc agccactgtc cctgaggcct 540
gaggcatgta ggccagcagc aggaggagca gtgcacacac ggggcctgga cttcgcctgc 600
gatgtgagct tttgtctggt catggtgctg ctgttcgccg tggataccgg cctgtatttt 660
tccgtgaaga caaatatccg gtctagcacc agagactgga aggatcacaa gttcaaatgg 720
aggaaggacc cacaggacaa g 741
<210> 24
<211> 247
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NKG2D/CD16
<400> 24
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Val Ser Phe Cys Leu Val Met
195 200 205
Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr
210 215 220
Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp
225 230 235 240
Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys
245
<210> 25
<211> 870
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> CD8/NKG2DOpt/CD8a/CD16-TM/IC/4-1BB
<400> 25
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
ccactgttca atcaggaagt ccagatcccc ctgacagagt cttactgcgg cccatgtccc 120
aagaactgga tctgctacaa gaacaattgt tatcagttct ttgacgagag caagaactgg 180
tatgagtccc aggcctcttg catgagccag aatgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctccaaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgct ccacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggaccgtgac cacaacccct 480
gcaccacgcc cccctacacc agcacctacc atcgcaagcc agcctctgtc cctgcggcca 540
gaggcatgta gaccagcagc aggaggagca gtgcacacaa gaggcctgga cttcgcctgc 600
gatgtgagct tttgtctggt catggtgctg ctgttcgccg tggataccgg cctgtacttt 660
tccgtgaaga caaatatcag gtctagcacc cgcgactgga aggatcacaa gtttaagtgg 720
cggaaggacc ctcaggataa gaagcggggc agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag 780
cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct 840
gaagaagaag aagggggctg tgaactgtaa 870
<210> 26
<211> 289
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> CD8/NKG2DOpt/CD8a/CD16-TM/IC/4-1BB
<400> 26
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Val Ser Phe Cys Leu Val Met
195 200 205
Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr
210 215 220
Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp
225 230 235 240
Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
245 250 255
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
260 265 270
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
275 280 285
Leu
<210> 27
<211> 741
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NKG2D/NCR1
<400> 27
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgcccgc 60
cctctgttca accaggaagt gcagatccct ctgaccgaaa gctattgcgg accttgccct 120
aagaattgga tttgctataa aaacaactgc taccagttct ttgacgagtc taagaattgg 180
tatgagtctc aggccagctg tatgtcccag aacgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cccacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctctatcc tgagccctaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgca gcacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggacagtgac cacaacccca 480
gcaccccgcc cccctacacc tgcaccaacc atcgcaagcc agccactgtc cctgcggcct 540
gaggcctgca gaccagcagc aggaggagca gtgcacaccc ggggcctgga cttcgcctgt 600
gatatgggcc tggcctttct ggtgctggtg gccctggtgt ggtttctggt ggaggattgg 660
ctgtcccgga agagaacaag ggagagggcc tcccgggcct ctacctggga aggaagaagg 720
agactgaaca cccagacact g 741
<210> 28
<211> 247
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NKG2D/NCR1
<400> 28
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Met Gly Leu Ala Phe Leu Val
195 200 205
Leu Val Ala Leu Val Trp Phe Leu Val Glu Asp Trp Leu Ser Arg Lys
210 215 220
Arg Thr Arg Glu Arg Ala Ser Arg Ala Ser Thr Trp Glu Gly Arg Arg
225 230 235 240
Arg Leu Asn Thr Gln Thr Leu
245
<210> 29
<211> 801
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NKG2D/NCR3
<400> 29
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccaga 60
cccctgttca accaggaggt gcagattccc ctgacagaaa gctattgtgg cccttgccct 120
aaaaattgga tttgctataa aaacaactgc taccagttct ttgacgagtc taagaattgg 180
tatgagtctc aggccagctg tatgtcccag aacgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctctatcc tgagcccaaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgca gcacacccaa tacctacatc tgtatgcagc ggacagtgac cacaacccca 480
gcacccagac cccctacacc tgcaccaacc atcgccagcc agccactgtc cctgaggccc 540
gaggcatgca ggcctgcagc aggaggcgcc gtgcacacaa ggggcctgga ctttgcctgt 600
gatgcaggaa ccgtgctgct gctgagagca ggcttctatg ccgtgtcctt tctgtctgtg 660
gccgtgggct ccacagtgta ctatcagggc aagtgcctga cctggaaggg cccacggaga 720
cagctgcccg ccgtggtgcc cgcccctctg ccaccccctt gtggcagtag cgcccacctg 780
ctgccacccg tgcccggagg a 801
<210> 30
<211> 267
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NKG2D/NCR3
<400> 30
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ala Gly Thr Val Leu Leu Leu
195 200 205
Arg Ala Gly Phe Tyr Ala Val Ser Phe Leu Ser Val Ala Val Gly Ser
210 215 220
Thr Val Tyr Tyr Gln Gly Lys Cys Leu Thr Trp Lys Gly Pro Arg Arg
225 230 235 240
Gln Leu Pro Ala Val Val Pro Ala Pro Leu Pro Pro Pro Cys Gly Ser
245 250 255
Ser Ala His Leu Leu Pro Pro Val Pro Gly Gly
260 265
<210> 31
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> N представляет собой целое число, указывающее на количество
повторов
<400> 31
Gly Gly Gly Gly Ser Asn
1 5
<210> 32
<211> 60
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> GS3/CD8a
<400> 32
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr
1 5 10 15
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
20 25 30
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
35 40 45
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55 60
<210> 33
<211> 45
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> GS9
<400> 33
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
35 40 45
<210> 34
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> GS3
<400> 34
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 35
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> ICR 2B4
<400> 35
Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu
1 5 10 15
Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn
20 25 30
His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser
35 40 45
Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr
50 55 60
Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys
65 70 75 80
Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly
85 90 95
Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu
100 105 110
Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
115 120
<210> 36
<211> 360
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> ICR 2B4
<400> 36
tggaggagga aaaggaagga gaaacagagc gagacctccc ctaaggagtt cctgaccatc 60
tacgaggacg tgaaggacct gaagaccagg aggaaccacg agcaggaaca gacctttcct 120
ggcggaggca gcaccatcta cagcatgatc cagagccaga gcagcgcccc taccagccaa 180
gagcctgcct acaccctgta cagcctgatc cagcccagca ggaaaagcgg ctccaggaag 240
aggaaccaca gccccagctt caacagcacc atctatgagg tgatcggcaa gagccagccc 300
aaggcccaga accctgccag gctgtccagg aaggagctgg agaacttcga cgtgtacagc 360
<210> 37
<211> 38
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> ICR NKp80
<400> 37
Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Met Thr Leu Asn Val Gln Ser Lys Lys
1 5 10 15
Arg Ser Ser Ala Gln Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys Asp Tyr Ser Val
20 25 30
Thr Leu His Trp Tyr Lys
35
<210> 38
<211> 114
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> ICR NKp80
<400> 38
atgcaggatg aggacggcta tatgaccctg aacgtccagt ccaagaagag gtccagcgct 60
cagaccagcc agctgacctt caaggactac tccgtgaccc tgcactggta caag 114
<210> 39
<211> 30
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> N-концевой ECD B2Ad
<400> 39
Met Gly Gln Pro Gly Asn Gly Ser Ala Phe Leu Leu Ala Pro Asn Arg
1 5 10 15
Ser His Ala Pro Asp His Asp Val Thr Gln Gln Arg Asp Glu
20 25 30
<210> 40
<211> 90
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> N-концевой ECD B2 AdR
<400> 40
atggggcaac ccgggaacgg cagcgccttc ttgctggcac ccaatagaag ccatgcgccg 60
gaccacgacg tcacgcagca aagggacgag 90
<210> 41
<211> 33
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> TM-спираль B2 AdR
<400> 41
Val Trp Val Val Gly Met Gly Ile Val Met Ser Leu Ile Val Leu Ala
1 5 10 15
Ile Val Phe Gly Asn Val Leu Val Ile Thr Ala Ile Ala Lys Phe Glu
20 25 30
Arg
<210> 42
<211> 99
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> TM-спираль B2AdR
<400> 42
gtgtgggtgg tgggcatggg catcgtcatg tctctcatcg tcctggccat cgtgtttggc 60
aatgtgctgg tcatcacagc cattgccaag ttcgagcgt 99
<210> 43
<211> 924
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_1
<400> 43
gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgca ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gccgcacgac cactgttcaa tcaggaagtc cagatccccc tgacagagtc ttactgcggc 120
ccatgtccca agaactggat ctgctacaag aacaattgtt atcagttctt tgacgagagc 180
aagaactggt atgagtccca ggcctcttgc atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg 240
tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag ctggtgaagt cctatcactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ctacaaacgg ctcttggcag tgggaggacg gctccatcct gtctccaaat 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag 420
ggctatatcg agaactgctc cacacccaat acctacatct gtatgcagag gaccgtgggt 480
ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt ggcggcggat ctaccacaac ccctgcacca 540
cgccccccta caccagcacc taccatcgca agccagcctc tgtccctgcg gccagaggca 600
tgtagaccag cagcaggagg agcagtgcac acaagaggcc tggacttcgc ctgcgatgtg 660
agcttttgtc tggtcatggt gctgctgttc gccgtggata ccggcctgta cttttccgtg 720
aagacaaata tcaggtctag cacccgcgac tggaaggatc acaagtttaa gtggcggaag 780
gaccctcagg ataagaagcg gggcagaaag aagctgctgt atatcttcaa gcagcccttc 840
atgcggcccg tgcagacaac ccaggaggaa gacggctgct catgtagatt tcctgaagaa 900
gaagaagggg gctgtgaact gtaa 924
<210> 44
<211> 789
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_2
<400> 44
gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgca ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gccgcacgac cactgttcaa tcaggaagtc cagatccccc tgacagagtc ttactgcggc 120
ccatgtccca agaactggat ctgctacaag aacaattgtt atcagttctt tgacgagagc 180
aagaactggt atgagtccca ggcctcttgc atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg 240
tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag ctggtgaagt cctatcactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ctacaaacgg ctcttggcag tgggaggacg gctccatcct gtctccaaat 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag 420
ggctatatcg agaactgctc cacacccaat acctacatct gtatgcagag gaccgtgggt 480
ggcggtggct cgggcggtgg tgggtcgggt ggcggcggat ctgtgagctt ttgtctggtc 540
atggtgctgc tgttcgccgt ggataccggc ctgtactttt ccgtgaagac aaatatcagg 600
tctagcaccc gcgactggaa ggatcacaag tttaagtggc ggaaggaccc tcaggataag 660
aagcggggca gaaagaagct gctgtatatc ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag 720
acaacccagg aggaagacgg ctgctcatgt agatttcctg aagaagaaga agggggctgt 780
gaactgtaa 789
<210> 45
<211> 744
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_3
<400> 45
gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgca ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gccgcacgac cactgttcaa tcaggaagtc cagatccccc tgacagagtc ttactgcggc 120
ccatgtccca agaactggat ctgctacaag aacaattgtt atcagttctt tgacgagagc 180
aagaactggt atgagtccca ggcctcttgc atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg 240
tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag ctggtgaagt cctatcactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ctacaaacgg ctcttggcag tgggaggacg gctccatcct gtctccaaat 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag 420
ggctatatcg agaactgctc cacacccaat acctacatct gtatgcagag gaccgtggtg 480
agcttttgtc tggtcatggt gctgctgttc gccgtggata ccggcctgta cttttccgtg 540
aagacaaata tcaggtctag cacccgcgac tggaaggatc acaagtttaa gtggcggaag 600
gaccctcagg ataagaagcg gggcagaaag aagctgctgt atatcttcaa gcagcccttc 660
atgcggcccg tgcagacaac ccaggaggaa gacggctgct catgtagatt tcctgaagaa 720
gaagaagggg gctgtgaact gtaa 744
<210> 46
<211> 1164
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_4
<400> 46
gccgccacca tggccctgcc tgtgacagcc ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gctgccagac ccttattcaa ccaagaagtt caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc 120
ccatgtccta aaaactggat atgttacaaa aataactgct accaattttt tgatgagagt 180
aaaaactggt atgagagcca ggcttcttgt atgtctcaaa atgccagcct tctgaaagta 240
tacagcaaag aggaccagga tttacttaaa ctggtgaagt catatcattg gatgggacta 300
gtacacattc caacaaatgg atcttggcag tgggaagatg gctccattct ctcacccaac 360
ctactaacaa taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcctc gagctttaaa 420
ggctatatag aaaactgttc aactccaaat acgtacatct gcatgcaaag gactgtgacc 480
acaacccccg ctcccagacc tcctacccct gcccctacaa tcgccagcca gcccctgagc 540
ctgagacccg aagcctgtag acctgctgcc ggaggcgctg tgcacacaag aggcctggac 600
ttcgcctgcg atatctatat ctgggcccct ctggctggaa cctgtggcgt gctgctgctg 660
agcctggtga ttaccaagag gggcaggaag aagctgctgt acatcttcaa gcagcctttc 720
atgaggcccg tgcaaaccac ccaggaggag gacggctgca gctgcagatt ccctgaggag 780
gaggagggcg gatgcgagct gtggaggagg aaaaggaagg agaaacagag cgagacctcc 840
cctaaggagt tcctgaccat ctacgaggac gtgaaggacc tgaagaccag gaggaaccac 900
gagcaggaac agacctttcc tggcggaggc agcaccatct acagcatgat ccagagccag 960
agcagcgccc ctaccagcca agagcctgcc tacaccctgt acagcctgat ccagcccagc
1020
aggaaaagcg gctccaggaa gaggaaccac agccccagct tcaacagcac catctatgag
1080
gtgatcggca agagccagcc caaggcccag aaccctgcca ggctgtccag gaaggagctg
1140
gagaacttcg acgtgtacag ctga 1164
<210> 47
<211> 1155
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_5
<400> 47
gccgccacca tggccctgcc tgtgacagcc ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gctgccagac ccttattcaa ccaagaagtt caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc 120
ccatgtccta aaaactggat atgttacaaa aataactgct accaattttt tgatgagagt 180
aaaaactggt atgagagcca ggcttcttgt atgtctcaaa atgccagcct tctgaaagta 240
tacagcaaag aggaccagga tttacttaaa ctggtgaagt catatcattg gatgggacta 300
gtacacattc caacaaatgg atcttggcag tgggaagatg gctccattct ctcacccaac 360
ctactaacaa taattgaaat gcagaaggga gactgtgcac tctatgcctc gagctttaaa 420
ggctatatag aaaactgttc aactccaaat acgtacatct gcatgcaaag gactgtgatg 480
ggacagcctg gaaacggcag cgccttcctg ctggccccta acagaagcca cgcccccgat 540
cacgatgtga cccagcagag ggacgaggtg tgggtggtgg gcatgggcat cgtgatgagc 600
ctgatcgtgc tggctatcgt gttcggcaac gtgctggtga tcaccgccat cgccaagttc 660
gagaggaaga ggggcaggaa aaagctgctc tacatcttca agcagccctt catgaggccc 720
gtgcagacca cccaggaaga ggatggctgc tcctgtaggt ttcccgagga ggaggagggc 780
ggctgtgagc tgtggaggag aaaaaggaag gagaagcaga gcgagaccag ccccaaggag 840
ttcctgacca tctacgagga cgtgaaggac ctgaagacca ggaggaacca cgagcaggaa 900
cagaccttcc ccggcggagg cagcaccatc tacagcatga tccagagcca gtccagcgcc 960
cccacaagcc aggaacccgc ctacacactg tatagcctga tccagccctc caggaagagc
1020
ggcagcagga agaggaacca cagccccagc ttcaacagca ccatttacga ggtgatcgga
1080
aagagccagc ccaaggctca gaaccccgcc aggctgagca ggaaggagct cgaaaacttc
1140
gacgtgtaca gctga 1155
<210> 48
<211> 1349
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_6
<400> 48
ggatccgaat tcgccgccac catggccctg cctgtgacag ccctgctgct gcctctggct 60
ctgctgctgc acgctgccag acccttattc aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa 120
agttactgtg gcccatgtcc taaaaactgg atatgttaca aaaataactg ctaccaattt 180
tttgatgaga gtaaaaactg gtatgagagc caggcttctt gtatgtctca aaatgccagc 240
cttctgaaag tatacagcaa agaggaccag gatttactta aactggtgaa gtcatatcat 300
tggatgggac tagtacacat tccaacaaat ggatcttggc agtgggaaga tggctccatt 360
ctctcaccca acctactaac aataattgaa atgcagaagg gagactgtgc actctatgcc 420
tcgagcttta aaggctatat agaaaactgt tcaactccaa atacgtacat ctgcatgcaa 480
aggactgtga ccacaacccc tgctcccaga cctcccacac ccgcccctac aatcgcctcc 540
cagcctctga gcctgagacc cgaagcctgt agacctgccg ccggcggagc tgtgcataca 600
agaggcctgg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ctctggctgg cacatgcgga 660
gtcctgctgc tgagcctggt gatcaccaag aggggcagga agaagctgct gtacatcttc 720
aagcagccct tcatgaggcc tgtgcagacc acacaggagg aggacggctg ctcctgcagg 780
ttccctgagg aggaggaggg aggctgcgag ctgtggagga ggaagagaaa ggagaagcag 840
tccgagacct cccccaagga gttcctcacc atttacgagg acgtgaagga cctgaagacc 900
aggagaaacc acgagcagga acaaaccttc cccggcggcg gcagcaccat ctacagcatg 960
atccagagcc agtcctccgc ccctacaagc caggagcctg cctacaccct gtacagcctg
1020
atccagccta gcaggaagag cggctccagg aagaggaacc actcccccag cttcaacagc
1080
accatttatg aggtgatcgg caagtcccag cccaaggccc agaaccctgc cagactgtcc
1140
aggaaggagc tggagaactt cgacgtctac tccggcggcg gcggcagcgg cggaggaggc
1200
tccggaggag gcggcagcat gcaggatgag gacggctata tgaccctgaa cgtccagtcc
1260
aagaagaggt ccagcgctca gaccagccag ctgaccttca aggactactc cgtgaccctg
1320
cactggtaca agtgagcggc cgcgtcgac 1349
<210> 49
<211> 989
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_7
<400> 49
ggatccgaat tcgccgccac catggccctg cctgtgacag ccctgctgct gcctctggct 60
ctgctgctgc atgccgccag acccttattc aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa 120
agttactgtg gcccatgtcc taaaaactgg atatgttaca aaaataactg ctaccaattt 180
tttgatgaga gtaaaaactg gtatgagagc caggcttctt gtatgtctca aaatgccagc 240
cttctgaaag tatacagcaa agaggaccag gatttactta aactggtgaa gtcatatcat 300
tggatgggac tagtacacat tccaacaaat ggatcttggc agtgggaaga tggctccatt 360
ctctcaccca acctactaac aataattgaa atgcagaagg gagactgtgc actctatgcc 420
tcgagcttta aaggctatat agaaaactgt tcaactccaa atacgtacat ctgcatgcaa 480
aggactgtga ccaccacccc tgctcccaga ccccctacac ctgcccctac aatcgccagc 540
cagcccctga gcctgagacc tgaggcctgc agacctgctg ctggaggcgc tgtgcacaca 600
aggggcctcg acttcgcctg cgacatctac atctgggccc ctctggccgg cacatgtgga 660
gtgctgctgc tgtccctggt gatcaccaag aggggcagga agaagctgct gtacatcttc 720
aagcagccct tcatgaggcc cgtgcagacc acccaggagg aggacggctg ctcctgcaga 780
ttccccgagg aggaggaggg cggatgtgaa ctgggcggag gaggcagcgg cggcggcggc 840
agcggcggcg gcggcagcat gcaggatgag gacggctaca tgaccctgaa cgtgcagagc 900
aagaagagga gcagcgccca gaccagccag ctgaccttca aggactacag cgtgaccctg 960
cactggtaca agtgagcggc cgcgtcgac 989
<210> 50
<211> 1430
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_8
<400> 50
ggatccgaat tcgccgccac catggccctg cccgtgacag ctctgctgct gcctctggcc 60
ctgctgctgc atgccgctag acccctgttc aaccaggagg tgcagatccc cctgaccgaa 120
agctactgcg gcccctgccc caagaactgg atctgttaca agaacaactg ctatcagttc 180
ttcgacgaga gcaagaactg gtacgagagc caggccagct gtatgagcca gaacgccagc 240
ctgctgaaag tgtatagcaa ggaggaccag gacctgctga agctggtgaa gagctaccac 300
tggatgggcc tggtgcacat ccccaccaac ggaagctggc agtgggagga cggcagcatc 360
ctgagcccca acctgctgac catcatcgag atgcagaagg gcgactgcgc cctgtatgcc 420
agcagcttca agggctacat cgagaactgt agcaccccca acacctacat ctgcatgcag 480
aggaccgtgg gcggcggcgg cagcggcgga ggcggctccg gcggcggcgg cagcttattc 540
aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa agttactgtg gcccatgtcc taaaaactgg 600
atatgttaca aaaataactg ctaccaattt tttgatgaga gtaaaaactg gtatgagagc 660
caggcttctt gtatgtctca aaatgccagc cttctgaaag tatacagcaa agaggaccag 720
gatttactta aactggtgaa gtcatatcat tggatgggac tagtacacat tccaacaaat 780
ggatcttggc agtgggaaga tggctccatt ctctcaccca acctactaac aataattgaa 840
atgcagaagg gagactgtgc actctatgcc tcgagcttta aaggctatat agaaaactgt 900
tcaactccaa atacgtacat ctgcatgcaa aggactgtga tgggccagcc tggcaacggc 960
agcgcctttc tgctggcccc caacaggagc catgcccctg accacgacgt gacccagcag
1020
agggacgagg tgtgggtggt gggcatgggc atcgtgatga gcctgatcgt gctggccatc
1080
gtgttcggca acgtgctggt gatcaccgcc atcgccaagt tcgagaggaa gaggggcagg
1140
aagaagctgc tgtacatctt caagcagccc ttcatgagac ccgtgcaaac cacccaggag
1200
gaggacggct gcagctgcag gtttcccgag gaggaggagg gcggatgcga actgggaggc
1260
ggaggaagcg gaggaggagg atccggagga ggcggaagca tgcaggacga ggacggctac
1320
atgaccctga acgtccagag caagaagagg agcagcgccc agacctccca gctgaccttc
1380
aaggactact ccgtgaccct gcactggtac aagtgagcgg ccgcgtcgac 1430
<210> 51
<211> 1439
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_9
<400> 51
ggatccgaat tcgccgccac catggccctg cccgtgacag ctctgctgct gcctctggcc 60
ctgctgctgc atgccgctag acccctgttc aaccaggagg tgcagatccc cctgaccgaa 120
agctactgcg gcccctgccc caagaactgg atctgttaca agaacaactg ctatcagttc 180
ttcgacgaga gcaagaactg gtacgagagc caggccagct gtatgagcca gaacgccagc 240
ctgctgaaag tgtatagcaa ggaggaccag gacctgctga agctggtgaa gagctaccac 300
tggatgggcc tggtgcacat ccccaccaac ggaagctggc agtgggagga cggcagcatc 360
ctgagcccca acctgctgac catcatcgag atgcagaagg gcgactgcgc cctgtatgcc 420
agcagcttca agggctacat cgagaactgt agcaccccca acacctacat ctgcatgcag 480
aggaccgtgg gcggcggcgg cagcggcgga ggcggctccg gcggcggcgg cagcttattc 540
aaccaagaag ttcaaattcc cttgaccgaa agttactgtg gcccatgtcc taaaaactgg 600
atatgttaca aaaataactg ctaccaattt tttgatgaga gtaaaaactg gtatgagagc 660
caggcttctt gtatgtctca aaatgccagc cttctgaaag tatacagcaa agaggaccag 720
gatttactta aactggtgaa gtcatatcat tggatgggac tagtacacat tccaacaaat 780
ggatcttggc agtgggaaga tggctccatt ctctcaccca acctactaac aataattgaa 840
atgcagaagg gagactgtgc actctatgcc tcgagcttta aaggctatat agaaaactgt 900
tcaactccaa atacgtacat ctgcatgcaa aggactgtga ccaccacccc tgctcccaga 960
ccccctacac ctgcccctac aatcgccagc cagcccctga gcctgagacc tgaggcctgc
1020
agacctgctg ctggaggcgc tgtgcacaca aggggcctcg acttcgcctg cgacatctac
1080
atctgggccc ctctggccgg cacatgtgga gtgctgctgc tgtccctggt gatcaccaag
1140
aggggcagga agaagctgct gtacatcttc aagcagccct tcatgaggcc cgtgcagacc
1200
acccaggagg aggacggctg ctcctgcaga ttccccgagg aggaggaggg cggatgtgaa
1260
ctgggcggag gaggcagcgg cggcggcggc agcggcggcg gcggcagcat gcaggatgag
1320
gacggctaca tgaccctgaa cgtgcagagc aagaagagga gcagcgccca gaccagccag
1380
ctgaccttca aggactacag cgtgaccctg cactggtaca agtgagcggc cgcgtcgac 1439
<210> 52
<211> 1329
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_10
<400> 52
gccgccacaa tggccctgcc tgtgacagcc ctgctgctgc ctctggccct gctgctgcat 60
gctgccaggc ctctgttcaa ccaggaggtg cagatccctc tgaccgagag ctactgcggc 120
ccctgcccca agaactggat ctgctacaag aacaactgct accagttctt cgacgagagc 180
aagaactggt acgagagcca ggccagctgc atgtcccaga acgctagcct gctgaaggtg 240
tatagcaagg aggaccagga cctgctgaag ctggtgaaga gctaccactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ccaccaacgg ctcctggcag tgggaggacg gcagcatcct gagccctaac 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaaggga gactgcgccc tgtacgccag ctcctttaag 420
ggctacatcg agaactgcag cacccccaac acctacatct gtatgcagag gaccgtggga 480
ggcggcggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcttattcaa ccaagaagtt 540
caaattccct tgaccgaaag ttactgtggc ccatgtccta aaaactggat atgttacaaa 600
aataactgct accaattttt tgatgagagt aaaaactggt atgagagcca ggcttcttgt 660
atgtctcaaa atgccagcct tctgaaagta tacagcaaag aggaccagga tttacttaaa 720
ctggtgaagt catatcattg gatgggacta gtacacattc caacaaatgg atcttggcag 780
tgggaagatg gctccattct ctcacccaac ctactaacaa taattgaaat gcagaaggga 840
gactgtgcac tctatgcctc gagctttaaa ggctatatag aaaactgttc aactccaaat 900
acgtacatct gcatgcaaag gactgtgacc accacccctg cccctagacc ccctacacct 960
gcccctacca tcgccagcca gcctctgagc ctgagacccg aggcctgtag acctgctgcc
1020
ggaggagccg tgcacacaag aggcctggac ttcgcctgcg acgtgagctt ctgcctggtg
1080
atggtgctgc tgttcgccgt ggacaccggc ctgtacttca gcgtgaagac caacatcagg
1140
agcagcacca gggactggaa ggaccacaaa ttcaagtgga ggaaggaccc ccaggacaag
1200
aagaggggca ggaagaagct gctgtacatc ttcaagcagc ccttcatgag gcctgtgcag
1260
accacccagg aggaggacgg ctgcagctgc aggttccctg aggaggaaga gggcggctgc
1320
gagctgtga 1329
<210> 53
<211> 1239
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_11
<400> 53
gccgccacca tggctctgcc cgtcaccgca ctgctgctgc ctctggctct gctgctgcac 60
gccgcacgac cactgttcaa tcaggaagtc cagatccccc tgacagagtc ttactgcggc 120
ccatgtccca agaactggat ctgctacaag aacaattgtt atcagttctt tgacgagagc 180
aagaactggt atgagtccca ggcctcttgc atgagccaga atgcctctct gctgaaggtg 240
tacagcaagg aggaccagga tctgctgaag ctggtgaagt cctatcactg gatgggcctg 300
gtgcacatcc ctacaaacgg ctcttggcag tgggaggacg gctccatcct gtctccaaat 360
ctgctgacca tcatcgagat gcagaagggc gattgcgccc tgtacgccag ctccttcaag 420
ggctatatcg agaactgctc cacacccaat acctacatct gtatgcagag gaccgtgacc 480
acaacccctg caccacgccc ccctacacca gcacctacca tcgcaagcca gcctctgtcc 540
ctgcggccag aggcatgtag accagcagca ggaggagcag tgcacacaag aggcctggac 600
ttcgcctgcg atgtgagctt ttgtctggtc atggtgctgc tgttcgccgt ggataccggc 660
ctgtactttt ccgtgaagac aaatatcagg tctagcaccc gcgactggaa ggatcacaag 720
tttaagtggc ggaaggaccc tcaggataag aagcggggca gaaagaagct gctgtatatc 780
ttcaagcagc ccttcatgcg gcccgtgcag acaacccagg aggaagacgg ctgctcatgt 840
agatttcctg aagaagaaga agggggctgt gaactgtgga ggaggaaaag gaaggagaaa 900
cagagcgaga cctcccctaa ggagttcctg accatctacg aggacgtgaa ggacctgaag 960
accaggagga accacgagca ggaacagacc tttcctggcg gaggcagcac catctacagc
1020
atgatccaga gccagagcag cgcccctacc agccaagagc ctgcctacac cctgtacagc
1080
ctgatccagc ccagcaggaa aagcggctcc aggaagagga accacagccc cagcttcaac
1140
agcaccatct atgaggtgat cggcaagagc cagcccaagg cccagaaccc tgccaggctg
1200
tccaggaagg agctggagaa cttcgacgtg tacagctga 1239
<210> 54
<211> 1064
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NK15_12
<400> 54
ggatccgaat tcgccgccac catggctctg cccgtcaccg cactgctgct gcctctggct 60
ctgctgctgc acgccgcacg accactgttc aatcaggaag tccagatccc cctgacagag 120
tcttactgcg gcccatgtcc caagaactgg atctgctaca agaacaattg ttatcagttc 180
tttgacgaga gcaagaactg gtatgagtcc caggcctctt gcatgagcca gaatgcctct 240
ctgctgaagg tgtacagcaa ggaggaccag gatctgctga agctggtgaa gtcctatcac 300
tggatgggcc tggtgcacat ccctacaaac ggctcttggc agtgggagga cggctccatc 360
ctgtctccaa atctgctgac catcatcgag atgcagaagg gcgattgcgc cctgtacgcc 420
agctccttca agggctatat cgagaactgc tccacaccca atacctacat ctgtatgcag 480
aggaccgtga ccacaacccc tgcaccacgc ccccctacac cagcacctac catcgcaagc 540
cagcctctgt ccctgcggcc agaggcatgt agaccagcag caggaggagc agtgcacaca 600
agaggcctgg acttcgcctg cgatgtgagc ttttgtctgg tcatggtgct gctgttcgcc 660
gtggataccg gcctgtactt ttccgtgaag acaaatatca ggtctagcac ccgcgactgg 720
aaggatcaca agtttaagtg gcggaaggac cctcaggata agaagcgggg cagaaagaag 780
ctgctgtata tcttcaagca gcccttcatg cggcccgtgc agacaaccca ggaggaagac 840
ggctgctcat gtagatttcc tgaagaagaa gaagggggct gtgaactggg cggaggaggc 900
agcggcggcg gcggcagcgg cggcggcggc agcatgcagg atgaggacgg ctacatgacc 960
ctgaacgtgc agagcaagaa gaggagcagc gcccagacca gccagctgac cttcaaggac
1020
tacagcgtga ccctgcactg gtacaagtga gcggccgcgt cgac 1064
<210> 55
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> FLAG-метка
<400> 55
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
1 5
<210> 56
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> His-метка
<400> 56
His His His His His His
1 5
<210> 57
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Myc-метка
<400> 57
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 58
<211> 1499
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариант 13
<400> 58
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780
gaagaaggag gatgtgaact gtggaggagg aaaaggaagg agaaacagag cgagacctcc 840
cctaaggagt tcctgaccat ctacgaggac gtgaaggacc tgaagaccag gaggaaccac 900
gagcaggaac agacctttcc tggcggaggc agcaccatct acagcatgat ccagagccag 960
agcagcgccc ctaccagcca agagcctgcc tacaccctgt acagcctgat ccagcccagc
1020
aggaaaagcg gctccaggaa gaggaaccac agccccagct tcaacagcac catctatgag
1080
gtgatcggca agagccagcc caaggcccag aaccctgcca ggctgtccag gaaggagctg
1140
gagaacttcg acgtgtacag cagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac
1200
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat
1260
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac
1320
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag
1380
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc
1440
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgcta 1499
<210> 59
<211> 499
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность варианта 13
<400> 59
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
225 230 235 240
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
245 250 255
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Trp Arg Arg Lys Arg
260 265 270
Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr
275 280 285
Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln
290 295 300
Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln
305 310 315 320
Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu
325 330 335
Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro
340 345 350
Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys
355 360 365
Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp
370 375 380
Val Tyr Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr
385 390 395 400
Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg
405 410 415
Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met
420 425 430
Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu
435 440 445
Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys
450 455 460
Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu
465 470 475 480
Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu
485 490 495
Pro Pro Arg
<210> 60
<211> 870
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариант 14
<400> 60
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780
gaagaaggag gatgtgaact gctgtgcgca cgcccacgcc gcagccccgc ccaagatggc 840
aaagtctaca tcaacatgcc aggcaggggc 870
<210> 61
<211> 290
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность варианта 14
<400> 61
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
225 230 235 240
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
245 250 255
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Leu Cys Ala Arg Pro
260 265 270
Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly
275 280 285
Arg Gly
290
<210> 62
<211> 1230
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариант 15
<400> 62
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780
gaagaaggag gatgtgaact gctgtgcgca cgcccacgcc gcagccccgc ccaagatggc 840
aaagtctaca tcaacatgcc aggcaggggc tggaggagga aaaggaagga gaaacagagc 900
gagacctccc ctaaggagtt cctgaccatc tacgaggacg tgaaggacct gaagaccagg 960
aggaaccacg agcaggaaca gacctttcct ggcggaggca gcaccatcta cagcatgatc
1020
cagagccaga gcagcgcccc taccagccaa gagcctgcct acaccctgta cagcctgatc
1080
cagcccagca ggaaaagcgg ctccaggaag aggaaccaca gccccagctt caacagcacc
1140
atctatgagg tgatcggcaa gagccagccc aaggcccaga accctgccag gctgtccagg
1200
aaggagctgg agaacttcga cgtgtacagc 1230
<210> 63
<211> 410
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность варианта 15
<400> 63
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
225 230 235 240
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
245 250 255
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Leu Cys Ala Arg Pro
260 265 270
Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly
275 280 285
Arg Gly Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro
290 295 300
Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg
305 310 315 320
Arg Asn His Glu Gln Glu Gln Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile
325 330 335
Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro
340 345 350
Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser
355 360 365
Arg Lys Arg Asn His Ser Pro Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val
370 375 380
Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg
385 390 395 400
Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp Val Tyr Ser
405 410
<210> 64
<211> 1232
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариант 16
<400> 64
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780
gaagaaggag gatgtgaact gtggaggagg aaaaggaagg agaaacagag cgagacctcc 840
cctaaggagt tcctgaccat ctacgaggac gtgaaggacc tgaagaccag gaggaaccac 900
gagcaggaac agacctttcc tggcggaggc agcaccatct acagcatgat ccagagccag 960
agcagcgccc ctaccagcca agagcctgcc tacaccctgt acagcctgat ccagcccagc
1020
aggaaaagcg gctccaggaa gaggaaccac agccccagct tcaacagcac catctatgag
1080
gtgatcggca agagccagcc caaggcccag aaccctgcca ggctgtccag gaaggagctg
1140
gagaacttcg acgtgtacag cctgtgcgca cgcccacgcc gcagccccgc ccaagatggc
1200
aaagtctaca tcaacatgcc aggcaggggc tg 1232
<210> 65
<211> 410
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность варианта 16
<400> 65
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
225 230 235 240
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
245 250 255
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Trp Arg Arg Lys Arg
260 265 270
Lys Glu Lys Gln Ser Glu Thr Ser Pro Lys Glu Phe Leu Thr Ile Tyr
275 280 285
Glu Asp Val Lys Asp Leu Lys Thr Arg Arg Asn His Glu Gln Glu Gln
290 295 300
Thr Phe Pro Gly Gly Gly Ser Thr Ile Tyr Ser Met Ile Gln Ser Gln
305 310 315 320
Ser Ser Ala Pro Thr Ser Gln Glu Pro Ala Tyr Thr Leu Tyr Ser Leu
325 330 335
Ile Gln Pro Ser Arg Lys Ser Gly Ser Arg Lys Arg Asn His Ser Pro
340 345 350
Ser Phe Asn Ser Thr Ile Tyr Glu Val Ile Gly Lys Ser Gln Pro Lys
355 360 365
Ala Gln Asn Pro Ala Arg Leu Ser Arg Lys Glu Leu Glu Asn Phe Asp
370 375 380
Val Tyr Ser Leu Cys Ala Arg Pro Arg Arg Ser Pro Ala Gln Asp Gly
385 390 395 400
Lys Val Tyr Ile Asn Met Pro Gly Arg Gly
405 410
<210> 66
<211> 1587
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариант 17
<400> 66
atggccctgc ccgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccctgttca accaggaggt gcagatcccc ctgaccgaaa gctactgcgg cccctgcccc 120
aagaactgga tctgttacaa gaacaactgc tatcagttct tcgacgagag caagaactgg 180
tacgagagcc aggccagctg tatgagccag aacgccagcc tgctgaaagt gtatagcaag 240
gaggaccagg acctgctgaa gctggtgaag agctaccact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cccaccaacg gaagctggca gtgggaggac ggcagcatcc tgagccccaa cctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgactgcgcc ctgtatgcca gcagcttcaa gggctacatc 420
gagaactgta gcacccccaa cacctacatc tgcatgcaga ggaccgtggg cggcggcggc 480
agcggcggag gcggctccgg cggcggcggc agcttattca accaagaagt tcaaattccc 540
ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc 600
taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa 660
aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa gaggaccagg atttacttaa actggtgaag 720
tcatatcatt ggatgggact agtacacatt ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat 780
ggctccattc tctcacccaa cctactaaca ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca 840
ctctatgcct cgagctttaa aggctatata gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc 900
tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 960
atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca
1020
gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg
1080
acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag
1140
aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa
1200
gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag
1260
ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag
1320
ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct
1380
gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag
1440
aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc
1500
aaggggcacg atggccttta ccagggtctc agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc
1560
cttcacatgc aggccctgcc ccctcgc 1587
<210> 67
<211> 529
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность варианта 17
<400> 67
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Phe Asn Gln Glu
165 170 175
Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn
180 185 190
Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys
195 200 205
Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu
210 215 220
Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp
245 250 255
Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile
260 265 270
Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly
275 280 285
Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg
290 295 300
Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
305 310 315 320
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
325 330 335
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
340 345 350
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
355 360 365
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr
370 375 380
Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu
385 390 395 400
Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu
405 410 415
Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln
420 425 430
Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu
435 440 445
Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly
450 455 460
Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln
465 470 475 480
Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu
485 490 495
Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr
500 505 510
Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro
515 520 525
Arg
<210> 68
<211> 405
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая альтернативный
кодон-оптимизированный
внеклеточный домен NKG2D
<400> 68
ctgttcaacc aggaggtgca gatccccctg accgaaagct actgcggccc ctgccccaag 60
aactggatct gttacaagaa caactgctat cagttcttcg acgagagcaa gaactggtac 120
gagagccagg ccagctgtat gagccagaac gccagcctgc tgaaagtgta tagcaaggag 180
gaccaggacc tgctgaagct ggtgaagagc taccactgga tgggcctggt gcacatcccc 240
accaacggaa gctggcagtg ggaggacggc agcatcctga gccccaacct gctgaccatc 300
atcgagatgc agaagggcga ctgcgccctg tatgccagca gcttcaaggg ctacatcgag 360
aactgtagca cccccaacac ctacatctgc atgcagagga ccgtg 405
<210> 69
<211> 21
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность трансмембранной области
CD3-дзета
<400> 69
Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu
1 5 10 15
Thr Ala Leu Phe Leu
20
<210> 70
<211> 876
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая вариант 18 (NK39)
<400> 70
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
ccactgttca atcaggaagt ccagatcccc ctgacagagt cttactgcgg cccatgtccc 120
aagaactgga tctgctacaa gaacaattgt tatcagttct ttgacgagag caagaactgg 180
tatgagtccc aggcctcttg catgagccag aatgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctccaaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgct ccacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggaccgtgac cacaacccct 480
gcaccacgcc cccctacacc agcacctacc atcgcaagcc agcctctgtc cctgcggcca 540
gaggcatgta gaccagcagc aggaggagca gtgcacacaa gaggcctgga cttcgcctgc 600
gatcccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660
gccttgttcc tgaagacaaa tatcaggtct agcacccgcg actggaagga tcacaagttt 720
aagtggcgga aggaccctca ggataagaag cggggcagaa agaagctgct gtatatcttc 780
aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagaca acccaggagg aagacggctg ctcatgtaga 840
tttcctgaag aagaagaagg gggctgtgaa ctgtaa 876
<210> 71
<211> 291
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность варианта 18 (NK39)
<400> 71
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
195 200 205
Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
210 215 220
Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe
225 230 235 240
Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
245 250 255
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
260 265 270
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
275 280 285
Cys Glu Leu
290
<210> 72
<211> 1323
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NK39_1
<400> 72
atggccctgc ccgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccctgttca accaggaggt gcagatcccc ctgaccgaaa gctactgcgg cccctgcccc 120
aagaactgga tctgttacaa gaacaactgc tatcagttct tcgacgagag caagaactgg 180
tacgagagcc aggccagctg tatgagccag aacgccagcc tgctgaaagt gtatagcaag 240
gaggaccagg acctgctgaa gctggtgaag agctaccact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cccaccaacg gaagctggca gtgggaggac ggcagcatcc tgagccccaa cctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgactgcgcc ctgtatgcca gcagcttcaa gggctacatc 420
gagaactgta gcacccccaa cacctacatc tgcatgcaga ggaccgtggg cggcggcggc 480
agcggcggag gcggctccgg cggcggcggc agcttattca accaagaagt tcaaattccc 540
ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc 600
taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa 660
aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa gaggaccagg atttacttaa actggtgaag 720
tcatatcatt ggatgggact agtacacatt ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat 780
ggctccattc tctcacccaa cctactaaca ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca 840
ctctatgcct cgagctttaa aggctatata gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc 900
tgcatgcaaa ggactgtgac caccacccct gctcccagac cccctacacc tgcccctaca 960
atcgccagcc agcccctgag cctgagacct gaggcctgca gacctgctgc tggaggcgct
1020
gtgcacacaa ggggcctcga cttcgcctgc gaccccaaac tctgctacct gctggatgga
1080
atcctcttca tctatggtgt cattctcact gccttgttcc tgaagacaaa tatcaggtct
1140
agcacccgcg actggaagga tcacaagttt aagtggcgga aggaccctca ggataagaag
1200
cggggcagaa agaagctgct gtatatcttc aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagaca
1260
acccaggagg aagacggctg ctcatgtaga tttcctgaag aagaagaagg gggctgtgaa
1320
ctg 1323
<210> 73
<211> 441
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NK39_1
<400> 73
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Phe Asn Gln Glu
165 170 175
Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn
180 185 190
Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys
195 200 205
Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu
210 215 220
Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp
245 250 255
Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile
260 265 270
Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly
275 280 285
Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg
290 295 300
Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
305 310 315 320
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
325 330 335
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro
340 345 350
Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile
355 360 365
Leu Thr Ala Leu Phe Leu Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp
370 375 380
Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Lys
385 390 395 400
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
405 410 415
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
420 425 430
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
435 440
<210> 74
<211> 1032
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NK39_2
<400> 74
atggccctgc ccgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac caccacccct 480
gctcccagac cccctacacc tgcccctaca atcgccagcc agcccctgag cctgagacct 540
gaggcctgca gacctgctgc tggaggcgct gtgcacacaa ggggcctcga cttcgcctgc 600
gaccccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660
gccttgttcc tgaagacaaa tatcaggtct agcacccgcg actggaagga tcacaagttt 720
aagtggcgga aggaccctca ggataagaag cggggcagaa agaagctgct gtatatcttc 780
aagcagccct tcatgcggcc cgtgcagaca acccaggagg aagacggctg ctcatgtaga 840
tttcctgaag aagaagaagg gggctgtgaa ctgggcggag gaggcagcgg cggcggcggc 900
agcggcggcg gcggcagcat gcaggatgag gacggctaca tgaccctgaa cgtgcagagc 960
aagaagagga gcagcgccca gaccagccag ctgaccttca aggactacag cgtgaccctg
1020
cactggtaca ag 1032
<210> 75
<211> 344
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NK39_2
<400> 75
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
195 200 205
Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
210 215 220
Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe
225 230 235 240
Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
245 250 255
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
260 265 270
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
275 280 285
Cys Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
290 295 300
Gly Ser Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Met Thr Leu Asn Val Gln Ser
305 310 315 320
Lys Lys Arg Ser Ser Ala Gln Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys Asp Tyr
325 330 335
Ser Val Thr Leu His Trp Tyr Lys
340
<210> 76
<211> 1416
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NK39_3
<400> 76
atggccctgc ccgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccctgttca accaggaggt gcagatcccc ctgaccgaaa gctactgcgg cccctgcccc 120
aagaactgga tctgttacaa gaacaactgc tatcagttct tcgacgagag caagaactgg 180
tacgagagcc aggccagctg tatgagccag aacgccagcc tgctgaaagt gtatagcaag 240
gaggaccagg acctgctgaa gctggtgaag agctaccact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cccaccaacg gaagctggca gtgggaggac ggcagcatcc tgagccccaa cctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgactgcgcc ctgtatgcca gcagcttcaa gggctacatc 420
gagaactgta gcacccccaa cacctacatc tgcatgcaga ggaccgtggg cggcggcggc 480
agcggcggag gcggctccgg cggcggcggc agcttattca accaagaagt tcaaattccc 540
ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc 600
taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa 660
aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa gaggaccagg atttacttaa actggtgaag 720
tcatatcatt ggatgggact agtacacatt ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat 780
ggctccattc tctcacccaa cctactaaca ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca 840
ctctatgcct cgagctttaa aggctatata gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc 900
tgcatgcaaa ggactgtgac caccacccct gctcccagac cccctacacc tgcccctaca 960
atcgccagcc agcccctgag cctgagacct gaggcctgca gacctgctgc tggaggcgct
1020
gtgcacacaa ggggcctcga cttcgcctgc gaccccaaac tctgctacct gctggatgga
1080
atcctcttca tctatggtgt cattctcact gccttgttcc tgctttactg caagcggggc
1140
agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag
1200
gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct gaagaagaag aagggggctg tgaactgggc
1260
ggaggaggca gcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcatgcagga tgaggacggc
1320
tacatgaccc tgaacgtgca gagcaagaag aggagcagcg cccagaccag ccagctgacc
1380
ttcaaggact acagcgtgac cctgcactgg tacaag 1416
<210> 77
<211> 472
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NK39_3
<400> 77
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Leu Phe Asn Gln Glu
165 170 175
Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn
180 185 190
Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys
195 200 205
Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu
210 215 220
Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys
225 230 235 240
Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp
245 250 255
Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile
260 265 270
Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly
275 280 285
Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg
290 295 300
Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
305 310 315 320
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
325 330 335
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro
340 345 350
Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile
355 360 365
Leu Thr Ala Leu Phe Leu Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu
370 375 380
Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln
385 390 395 400
Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly
405 410 415
Cys Glu Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
420 425 430
Gly Ser Met Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Met Thr Leu Asn Val Gln Ser
435 440 445
Lys Lys Arg Ser Ser Ala Gln Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys Asp Tyr
450 455 460
Ser Val Thr Leu His Trp Tyr Lys
465 470
<210> 78
<211> 807
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NK39_4
<400> 78
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
ccactgttca atcaggaagt ccagatcccc ctgacagagt cttactgcgg cccatgtccc 120
aagaactgga tctgctacaa gaacaattgt tatcagttct ttgacgagag caagaactgg 180
tatgagtccc aggcctcttg catgagccag aatgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctccaaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgct ccacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggaccgtgac cacaacccct 480
gcaccacgcc cccctacacc agcacctacc atcgcaagcc agcctctgtc cctgcggcca 540
gaggcatgta gaccagcagc aggaggagca gtgcacacaa gaggcctgga cttcgcctgc 600
gatcccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660
gccttgttcc tgctttactg caagcggggc agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag 720
cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct 780
gaagaagaag aagggggctg tgaactg 807
<210> 79
<211> 269
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NK39_4
<400> 79
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
195 200 205
Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
210 215 220
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
225 230 235 240
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
245 250 255
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
260 265
<210> 80
<211> 1143
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NK39_5
<400> 80
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
ccactgttca atcaggaagt ccagatcccc ctgacagagt cttactgcgg cccatgtccc 120
aagaactgga tctgctacaa gaacaattgt tatcagttct ttgacgagag caagaactgg 180
tatgagtccc aggcctcttg catgagccag aatgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctccaaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgct ccacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggaccgtgac cacaacccct 480
gcaccacgcc cccctacacc agcacctacc atcgcaagcc agcctctgtc cctgcggcca 540
gaggcatgta gaccagcagc aggaggagca gtgcacacaa gaggcctgga cttcgcctgc 600
gatcccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660
gccttgttcc tgctttactg caagcggggc agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag 720
cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct 780
gaagaagaag aagggggctg tgaactgaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 840
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 900
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 960
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac
1020
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag
1080
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
1140
cgc 1143
<210> 81
<211> 381
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NK39_5
<400> 81
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
195 200 205
Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
210 215 220
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
225 230 235 240
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
245 250 255
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
260 265 270
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
275 280 285
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
290 295 300
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
305 310 315 320
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
325 330 335
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
340 345 350
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
355 360 365
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
<210> 82
<211> 965
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NK39_6
<400> 82
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
ccactgttca atcaggaagt ccagatcccc ctgacagagt cttactgcgg cccatgtccc 120
aagaactgga tctgctacaa gaacaattgt tatcagttct ttgacgagag caagaactgg 180
tatgagtccc aggcctcttg catgagccag aatgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctccaaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgct ccacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggaccgtgac cacaacccct 480
gcaccacgcc cccctacacc agcacctacc atcgcaagcc agcctctgtc cctgcggcca 540
gaggcatgta gaccagcagc aggaggagca gtgcacacaa gaggcctgga cttcgcctgc 600
gatcccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660
gccttgttcc tgctttactg caagcggggc agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag 720
cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct 780
gaagaagaag aagggggctg tgaactgggc ggaggaggca gcggcggcgg cggcagcggc 840
ggcggcggca gcatgcagga tgaggacggc tacatgaccc tgaacgtgca gagcaagaag 900
aggagcagcg cccagaccag ccagctgacc ttcaaggact acagcgtgac cctgcactgg 960
tacaa 965
<210> 83
<211> 322
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NK39_6
<400> 83
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
195 200 205
Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
210 215 220
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
225 230 235 240
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
245 250 255
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Gln Asp Glu
275 280 285
Asp Gly Tyr Met Thr Leu Asn Val Gln Ser Lys Lys Arg Ser Ser Ala
290 295 300
Gln Thr Ser Gln Leu Thr Phe Lys Asp Tyr Ser Val Thr Leu His Trp
305 310 315 320
Tyr Lys
<210> 84
<211> 927
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NK39_7
<400> 84
atggctctgc ccgtcaccgc actgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgcacga 60
ccactgttca atcaggaagt ccagatcccc ctgacagagt cttactgcgg cccatgtccc 120
aagaactgga tctgctacaa gaacaattgt tatcagttct ttgacgagag caagaactgg 180
tatgagtccc aggcctcttg catgagccag aatgcctctc tgctgaaggt gtacagcaag 240
gaggaccagg atctgctgaa gctggtgaag tcctatcact ggatgggcct ggtgcacatc 300
cctacaaacg gctcttggca gtgggaggac ggctccatcc tgtctccaaa tctgctgacc 360
atcatcgaga tgcagaaggg cgattgcgcc ctgtacgcca gctccttcaa gggctatatc 420
gagaactgct ccacacccaa tacctacatc tgtatgcaga ggaccgtgac cacaacccct 480
gcaccacgcc cccctacacc agcacctacc atcgcaagcc agcctctgtc cctgcggcca 540
gaggcatgta gaccagcagc aggaggagca gtgcacacaa gaggcctgga cttcgcctgc 600
gatcccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660
gccttgttcc tgctttactg caagcggggc agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag 720
cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct 780
gaagaagaag aagggggctg tgaactgggc ggaggaggca gcggcggcgg cggcagcggc 840
ggcggcggca gcaagacaaa tatcaggtct agcacccgcg actggaagga tcacaagttt 900
aagtggcgga aggaccctca ggataag 927
<210> 85
<211> 309
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NK39_7
<400> 85
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
195 200 205
Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
210 215 220
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
225 230 235 240
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
245 250 255
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Gly Gly Gly
260 265 270
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Lys Thr Asn Ile
275 280 285
Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys
290 295 300
Asp Pro Gln Asp Lys
305
<210> 86
<211> 933
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NK39_8
<400> 86
atggccctgc ccgtgacagc tctgctgctg cctctggccc tgctgctgca tgccgctaga 60
cccttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac caccacccct 480
gctcccagac cccctacacc tgcccctaca atcgccagcc agcccctgag cctgagacct 540
gaggcctgca gacctgctgc tggaggcgct gtgcacacaa ggggcctcga cttcgcctgc 600
gaccccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660
gccttgttcc tgctttactg caagcggggc agaaagaagc tgctgtatat cttcaagcag 720
cccttcatgc ggcccgtgca gacaacccag gaggaagacg gctgctcatg tagatttcct 780
gaagaagaag aagggggctg tgaactgcga ctgaagatcc aagtgcgaaa ggcagctata 840
accagctatg agaaatcaga tggtgtttac acgggcctga gcaccaggaa ccaggagact 900
tacgagactc tgaagcatga gaaaccacca cag 933
<210> 87
<211> 311
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NK39_8
<400> 87
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
195 200 205
Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
210 215 220
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
225 230 235 240
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
245 250 255
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Leu Lys
260 265 270
Ile Gln Val Arg Lys Ala Ala Ile Thr Ser Tyr Glu Lys Ser Asp Gly
275 280 285
Val Tyr Thr Gly Leu Ser Thr Arg Asn Gln Glu Thr Tyr Glu Thr Leu
290 295 300
Lys His Glu Lys Pro Pro Gln
305 310
<210> 88
<211> 1605
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NK39_9
<400> 88
atgagaattt cgaaaccaca tttgagaagt atttccatcc agtgctactt gtgtttactt 60
ctaaacagtc attttctaac tgaagctggc attcatgtct tcattttggg ctgtttcagt 120
gcagggcttc ctaaaacaga agccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 180
gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 240
ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 300
gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 360
tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 420
gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 480
acgtccggcg gaggaggcag cggcggcggc ggcagcggcg gcggcggcag cttattcaac 540
caagaagttc aaattccctt gaccgaaagt tactgtggcc catgtcctaa aaactggata 600
tgttacaaaa ataactgcta ccaatttttt gatgagagta aaaactggta tgagagccag 660
gcttcttgta tgtctcaaaa tgccagcctt ctgaaagtat acagcaaaga ggaccaggat 720
ttacttaaac tggtgaagtc atatcattgg atgggactag tacacattcc aacaaatgga 780
tcttggcagt gggaagatgg ctccattctc tcacccaacc tactaacaat aattgaaatg 840
cagaagggag actgtgcact ctatgcctcg agctttaaag gctatataga aaactgttca 900
actccaaata cgtacatctg catgcaaagg actgtgacca cgacgccagc gccgcgacca 960
ccaacaccgg cgcccaccat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg
1020
ccagcggcgg ggggcgcagt gcacacgagg gggctggact tcgcctgtga tatctacatc
1080
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac
1140
tgcaaacggg gcagaaagaa actcctgtat atattcaaac aaccatttat gagaccagta
1200
caaactactc aagaggaaga tggctgtagc tgccgatttc cagaagaaga agaaggagga
1260
tgtgaactga gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag
1320
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag
1380
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc
1440
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa
1500
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc
1560
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1605
<210> 89
<211> 535
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NK39_9
<400> 89
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
165 170 175
Ser Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr Glu Ser Tyr Cys
180 185 190
Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn Asn Cys Tyr Gln
195 200 205
Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln Ala Ser Cys Met
210 215 220
Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys Glu Asp Gln Asp
225 230 235 240
Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly Leu Val His Ile
245 250 255
Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser Ile Leu Ser Pro
260 265 270
Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp Cys Ala Leu Tyr
275 280 285
Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser Thr Pro Asn Thr
290 295 300
Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
305 310 315 320
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
325 330 335
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
340 345 350
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
355 360 365
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
370 375 380
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
385 390 395 400
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
405 410 415
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
420 425 430
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
435 440 445
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
450 455 460
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
465 470 475 480
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
485 490 495
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
500 505 510
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
515 520 525
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
530 535
<210> 90
<211> 1122
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NKG2D-Ox40-CD3z
<400> 90
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 720
ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 780
aagatcagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 840
cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900
cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 960
tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc
1020
gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag
1080
gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gc 1122
<210> 91
<211> 341
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NKG2D-OX40-CD3z
<400> 91
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Ser Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
165 170 175
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
180 185 190
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
195 200 205
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
210 215 220
Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
225 230 235 240
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
245 250 255
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
260 265 270
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
275 280 285
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
290 295 300
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
305 310 315 320
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
325 330 335
Ala Leu Pro Pro Arg
340
<210> 92
<211> 1143
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NKG2D-CD28-CD3z
<400> 92
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 660
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 720
atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 780
ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 840
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 900
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 960
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac
1020
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag
1080
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
1140
cgc 1143
<210> 93
<211> 381
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NKG2D-CD28-CD3z
<400> 93
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val
195 200 205
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
210 215 220
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
225 230 235 240
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
245 250 255
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys
260 265 270
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
275 280 285
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
290 295 300
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
305 310 315 320
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
325 330 335
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
340 345 350
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
355 360 365
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375 380
<210> 94
<211> 1269
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NKG2D-CD28-41BB-CD3z
<400> 94
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatttttggg tgctggtggt ggttggtgga gtcctggctt gctatagctt gctagtaaca 660
gtggccttta ttattttctg ggtgaggagt aagaggagca ggctcctgca cagtgactac 720
atgaacatga ctccccgccg ccccgggccc acccgcaagc attaccagcc ctatgcccca 780
ccacgcgact tcgcagccta tcgctccaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 840
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 900
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 960
gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga
1020
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg
1080
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag
1140
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt
1200
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg
1260
ccccctcgc 1269
<210> 95
<211> 423
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NKG2D-CD28-41BB-CD3z
<400> 95
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val
195 200 205
Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile
210 215 220
Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr
225 230 235 240
Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln
245 250 255
Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Lys Arg Gly
260 265 270
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
275 280 285
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
290 295 300
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
305 310 315 320
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
325 330 335
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
340 345 350
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
355 360 365
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
370 375 380
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
385 390 395 400
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
405 410 415
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
420
<210> 96
<211> 1038
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NKG2D(короткая шарнирная
область)-41BBCD3z
<400> 96
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgga gtccaaatat 480
ggtcccccat gcccatcatg cccaatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 540
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 600
tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 660
agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 720
agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 780
ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 840
ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 900
atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 960
gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg
1020
caggccctgc cccctcgc 1038
<210> 97
<211> 346
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NKG2D(короткая шарнирная
область)-41BBCD3z
<400> 97
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Ser Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
165 170 175
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
180 185 190
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
195 200 205
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
210 215 220
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
260 265 270
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
275 280 285
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
290 295 300
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
305 310 315 320
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345
<210> 98
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NKG2D(SH)-CD28-CD3z
<400> 98
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgga gtccaaatat 480
ggtcccccat gcccatcatg cccattttgg gtgctggtgg tggttggtgg agtcctggct 540
tgctatagct tgctagtaac agtggccttt attattttct gggtgaggag taagaggagc 600
aggctcctgc acagtgacta catgaacatg actccccgcc gccccgggcc cacccgcaag 660
cattaccagc cctatgcccc accacgcgac ttcgcagcct atcgctccag agtgaagttc 720
agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag cagggccaga accagctcta taacgagctc 780
aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag 840
atggggggaa agccgagaag gaagaaccct caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa 900
gataagatgg cggaggccta cagtgagatt gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag 960
gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt acagccacca aggacaccta cgacgccctt
1020
cacatgcagg ccctgccccc tcgc 1044
<210> 99
<211> 348
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NKG2D(SH)-CD28-CD3z
<400> 99
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Ser Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
165 170 175
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
180 185 190
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
195 200 205
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
210 215 220
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe
225 230 235 240
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
245 250 255
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
260 265 270
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
275 280 285
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
290 295 300
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
305 310 315 320
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
325 330 335
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345
<210> 100
<211> 1023
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NKG2D(SH)-OX40-CD3z
<400> 100
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgga gtccaaatat 480
ggtcccccat gcccatcatg cccaatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 540
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgccgga gggaccagag gctgcccccc 600
gatgcccaca agccccctgg gggaggcagt ttccggaccc ccatccaaga ggagcaggcc 660
gacgcccact ccaccctggc caagatcaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 720
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 780
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 840
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 900
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 960
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct
1020
cgc 1023
<210> 101
<211> 346
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NKG2D(SH)-OX40-CD3z
<400> 101
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Glu Ser Lys Tyr
145 150 155 160
Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
165 170 175
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
180 185 190
Phe Trp Val Arg Ser Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His
195 200 205
Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln
210 215 220
Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg
225 230 235 240
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
245 250 255
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
260 265 270
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
275 280 285
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
290 295 300
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
305 310 315 320
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
325 330 335
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345
<210> 102
<211> 1125
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая NKG2D-CD3TM-CD28-CD3z
<400> 102
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatcccaaac tctgctacct gctggatgga atcctcttca tctatggtgt cattctcact 660
gccttgttcc tgaagaggag caggctcctg cacagtgact acatgaacat gactccccgc 720
cgccccgggc ccacccgcaa gcattaccag ccctatgccc caccacgcga cttcgcagcc 780
tatcgctcca gagtgaagtt cagcaggagc gcagacgccc ccgcgtacca gcagggccag 840
aaccagctct ataacgagct caatctagga cgaagagagg agtacgatgt tttggacaag 900
agacgtggcc gggaccctga gatgggggga aagccgagaa ggaagaaccc tcaggaaggc 960
ctgtacaatg aactgcagaa agataagatg gcggaggcct acagtgagat tgggatgaaa
1020
ggcgagcgcc ggaggggcaa ggggcacgat ggcctttacc agggtctcag tacagccacc
1080
aaggacacct acgacgccct tcacatgcag gccctgcccc ctcgc 1125
<210> 103
<211> 375
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность NKG2D-CD3TM-CD28-CD3z
<400> 103
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu
195 200 205
Asp Gly Ile Leu Phe Ile Tyr Gly Val Ile Leu Thr Ala Leu Phe Leu
210 215 220
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
225 230 235 240
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
245 250 255
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
260 265 270
Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
275 280 285
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
290 295 300
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
305 310 315 320
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
325 330 335
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
340 345 350
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
355 360 365
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370 375
<210> 104
<211> 36
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> Последовательность ДНК, кодирующая шарнирную область IgG4
<400> 104
gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgccca 36
<210> 105
<211> 29
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность трансмембранного домена CD28
<400> 105
Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu
1 5 10 15
Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser
20 25
<210> 106
<211> 39
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность IC-домена CD28
<400> 106
Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg
1 5 10 15
Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg
20 25 30
Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35
<210> 107
<211> 37
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> Аминокислотная последовательность IC-домена OX40
<400> 107
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
20 25 30
Thr Leu Ala Lys Ile
35
<210> 108
<211> 1140
<212> ДНК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> другой_признак
<223> NKG2D-P-фрагмент/CD8a/4-1BB/CD3z
<400> 108
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120
aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180
tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240
gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300
ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360
ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420
gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480
gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540
gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600
gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660
atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag aaactcctgt atatattcaa acaaccattt 720
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 780
gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac 840
cagcagggcc agaaccagct ctataacgag ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat 900
gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac 960
cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag aaagataaga tggcggaggc ctacagtgag
1020
attgggatga aaggcgagcg ccggaggggc aaggggcacg atggccttta ccagggtctc
1080
agtacagcca ccaaggacac ctacgacgcc cttcacatgc aggccctgcc ccctcgctaa
1140
<210> 109
<211> 374
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> NKG2D-V2-OX40-CD3z
<400> 109
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr
20 25 30
Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn
35 40 45
Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln
50 55 60
Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys
65 70 75 80
Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly
85 90 95
Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser
100 105 110
Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp
115 120 125
Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser
130 135 140
Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
180 185 190
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
195 200 205
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
210 215 220
Cys Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His
245 250 255
Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
260 265 270
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
275 280 285
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
290 295 300
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu
305 310 315 320
Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile
325 330 335
Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr
340 345 350
Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met
355 360 365
Gln Ala Leu Pro Pro Arg
370
<---
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к сконструированным естественным клеткам-киллерам (NK), экспрессирующим химерный рецептор, и может быть использовано в медицине для лечения рака, экспрессирующего лиганд члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D). Предложен химерный рецептор, который связывает NKG2D и содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109, в состав которой входит фрагмент NKG2D, связывающий нативные лиганды NKG2D, в качестве внеклеточного рецепторного домена, а также эффекторный домен, содержащий трансмембранный домен CD8a, домен OX40 и CD3-дзета. Указанный химерный рецептор может вхолить в состав полипептида, предложенного для усиления цитотоксичности NK-клеток, который также содержит мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15) с SEQ ID NO: 17. Изобретение позволяет получить химерный рецептор, способный к передаче стимулирующего сигнала в NK-клетке после его связывания с нативными лигандами NKG2D, что обеспечивает неожиданно повышенную цитотоксичность по сравнению с несконструированными NK-клетками. 11 н. и 8 з.п. ф-лы, 28 ил., 4 пр.
1. Химерный рецептор, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), где химерный рецептор содержит:
(a) внеклеточный рецепторный домен,
где указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D),
где пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D; и
(b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен,
где трансмембранная область содержит трансмембранный домен CD8a,
где эффекторный домен содержит домен OX40 и
где внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета,
где химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109.
2. Полипептид для усиления цитотоксичности естественной клетки-киллера (NK), где полипетид содержит:
(i) химерный рецептор, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), где химерный рецептор содержит:
(a) внеклеточный рецепторный домен,
где указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D),
где пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D; и
(b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен,
где трансмембранная область содержит трансмембранный домен CD8a;
где эффекторный домен содержит домен OX40 и
где внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета,
где химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109; и
(ii) мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.
3. Химерный рецептор по п.1 или полипептид по п. 2, где CD3-дзета кодируется полинуклеотидом, содержащим последовательность SEQ ID NO: 13.
4. Химерный рецептор по п. 1 или 3 или полипептид по п. 2 или 3, где трансмембранный домен CD8a кодируется полинуклеотидом, содержащим последовательность SEQ ID NO: 5.
5. Химерный рецептор по любому из пп.1, 3 и 4 или полипептид по любому из пп. 2-4, где mbIL15 кодируется полинуклеотидом, содержащим последовательность SEQ ID NO: 16.
6. Химерный рецептор по любому из пп.1 и 3-5 или полипептид по любому из пп. 2-5, где химерный рецептор и mbIL15 кодируются полинуклеотидом, содержащим последовательность SEQ ID NO: 90.
7. Естественная клетка-киллер (NK-клетка), экспрессирующая химерный рецептор, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), где химерный рецептор содержит:
(а) внеклеточный рецепторный домен, содержащий фрагмент рецептора NKG2D; и
(b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен,
где трансмембранная область содержит трансмембранный домен CD8a;
где внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета;
где эффекторный домен дополнительно содержит домен OX-40;
где химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 109; и
где клетка экспрессирует мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15), содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17.
8. Естественная клетка-киллер по п. 7, где CD3-дзета кодируется полинуклеотидом, содержащим последовательность SEQ ID NO: 13.
9. Естественная клетка-киллер по п. 7 или 8, где трансмембанный домен CD8a кодируется полинуклеотидом, содержащим последовательность SEQ ID NO: 5.
10. Естественная клетка-киллер по любому из пп. 7-9, где mbIL15 кодируется полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 16.
11. Естественная клетка-киллер по любому из пп. 7-10, где химерный рецептор кодируется полинуклеотидом, имеющим последовательность SEQ ID NO: 90.
12. Применение химерного рецептора по любому из пп. 1 и 3-6, полипептида по любому из пп. 2-6 или естественной клетки-киллера по любому из пп. 7-11 в производстве лекарственного средстсва для лечения рака, экспрессирующего лиганд NKG2D.
13. Применение химерного рецептора по любому из пп. 1 и 3-6, полипептида по любому из пп. 2-6 или естественной клетки-киллера по любому из пп. 7-11 для лечения рака, экспрессирующего лиганд NKG2D.
14. Применение химерного рецептора в изготовлении лекарственного препарата для лечения рака, экспрессирующего лиганд NKG2D, где химерный рецептор содержит:
(а) внеклеточный рецепторный домен,
где указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D); и
(b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен,
где трансмембранная область содержит трансмембранный домен CD8a,
где эффекторный домен содержит домен OX40 и
где внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета,
где химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109.
15. Применение полипептида в изготовлении лекарственного препарата для лечения рака, экспрессирующего лиганд члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), где полипептид содержит:
(i) химерный рецептор, который связывает нативные лиганды NKG2D, где химерный рецептор содержит:
(a) внеклеточный рецепторный домен,
где указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D,
где пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D; и
(b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен,
где трансмембранная область содержит трансмембранный домен CD8a,
где эффекторный домен содержит домен OX40 и
где внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета,
где химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109; и
(ii) мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.
16. Применение популяции естественных клеток-киллеров (NK), которые экспрессируют химерный рецептор, для лечения рака, экспрессирующего лиганд члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D),где химерный рецептор содержит:
(а) внеклеточный рецепторный домен,
где указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D,
где пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, и
(b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен,
где трансмембранная область содержит трансмембранный домен CD8a,
гдеэффекторный домен содержит домен OX40 и
где внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета,
где химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109.
17. Применение популяции естественных клеток-киллеров (NK), которые экспрессируют химерный рецептор, в изготовлении лекарственного препарата для лечения рака, экспрессирующего лиганд члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), где химерный рецептор содержит:
(а) внеклеточный рецепторный домен,
где указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D,
где пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, и
(b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен,
где трансмембранная область содержит трансмембранный домен CD8a,
где эффекторный домен содержит домен OX40, и
где внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета, и
где химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109.
18. Применение популяции естественных клеток-киллеров (NK), которые экспрессируют полипетид для лечения рака, экспрессирующего лиганд члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), где полипетид содержит:
(i) химерный рецептор, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), где химерный рецептор содержит:
(а) внеклеточный рецепторный домен,
где указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D),
где пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, и
(b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен,
где трансмембранная область содержит трансмембранный домен CD8a,
где эффекторный домен содержит домен OX40, и
где внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета, и
где химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109, и
(ii) мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.
19. Применение популяции естественных клеток-киллеров (NK), которые экспрессируют полипетид, в изготовлении лекарственного препарата для лечения рака, экспрессирующего лиганд члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), где полипетид содержит:
(i) химерный рецептор, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D), где химерный рецептор содержит:
(а) внеклеточный рецепторный домен,
где указанный внеклеточный рецепторный домен содержит пептид, который связывает нативные лиганды члена D группы 2 рецепторов естественных киллеров (NKG2D),
где пептид, который связывает нативные лиганды NKG2D, представляет собой фрагмент NKG2D, и
(b) эффекторный домен, содержащий трансмембранную область и внутриклеточный сигнальный домен,
где трансмембранная область содержит трансмембранный домен CD8a,
где эффекторный домен содержит домен OX40, и
где внутриклеточный сигнальный домен содержит CD3-дзета, и
где химерный рецептор содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 109, и
(ii) мембраносвязанный интерлейкин 15 (mbIL15), содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 17.
| WO 2014117121 A1, 31.07.2014 | |||
| HURTON L | |||
| V | |||
| et al., Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells, Proceedings of the National Academy of Sciences, 2016, v | |||
| Способ обработки грубых шерстей на различных аппаратах для мериносовой шерсти | 1920 |
|
SU113A1 |
| Приспособление для автоматической односторонней разгрузки железнодорожных платформ | 1921 |
|
SU48A1 |
| de FELIPE P, Polycistronic Viral Vectors, Current gene therapy, 2002, v | |||
| Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов | 1917 |
|
SU2A1 |
| Переносная печь для варки пищи и отопления в окопах, походных помещениях и т.п. | 1921 |
|
SU3A1 |
| PAKULA | |||
