ГЛИКАНЗАВИСИМЫЕ ИММУНОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ МОЛЕКУЛЫ Российский патент 2021 года по МПК A61K38/17 A61P35/00 

Перекрестные ссылки на родственные заявки

Эта заявка испрашивает приоритет предварительной патентной заявки США №62/155,61, поданной 1 мая 2015 года, содержание которой включено в данный документе посредством ссылки в полном объеме.

Уровень техники

Наряду с классическим подходом химиотерапии и лучевой терапии были разработаны моноклональные антитела как перспективные лекарственные препараты для лечения рака. Моноклональные антитела, нацеленные на белки, которые сверхэкспрессируются на опухолевых клетках, могут быть конъюгированы с химиотерапевтическими лекарственными препаратами или радиоизотопами, чтобы вызывать гибель их партнеров связывания, преимущественно злокачественных клеток. Кроме того, голые моноклональные антитела могут использовать собственную иммунную систему пациента для опосредования уничтожения их партнеров связывания через иммунный механизм антителозависимой клеточной цитотоксичности (antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC). Иммунные эффекторные клетки, такие как клетки натуральные киллеры (natural killer, NK), макрофаги и нейтрофилы, обладают Fc-рецепторами, которые распознают Fc-цепь (от англ. crystallizable fragment - кристаллизующийся фрагмент) терапевтического антитела, тем самым приводя к разрушению клеток-мишеней. Антитела привлекают эффекторные клетки иммунной системы, экспрессирующие эти Fc рецепторы, тем не менее, эти клетки составляют лишь меньшую часть эффекторной популяции. Это ограничивает их клиническую эффективность.

Самыми мощными и распространенными эффекторами являются Т-клетки. Тем не менее, Т-клетки не имеют Fc-рецепторов. Для использования эффекторной функции Т-клеток был разработан класс биспецифических антител, которые обладают возможностью связываться как с Т-клетками, так и с раковыми клетками. Концепция использования биспецифических антител для привлечения Т-клеток для уничтожения раковых клеток была представлена в 1985 году (Staerz et al., 1985, Nature, 314: 628-631). С тех пор были созданы различные форматы/структуры биспецифических антител. Последним и наиболее успешным биспецифическим антителом является биспецифическое антитело-проводник Т-клеток (bispecific T-cell engager, BiTE). В 2014 году управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (Food and Drug Administration, FDA) одобрило BiTE-антитело, блинатумомаб (Blincyto), которое связывает CD3 на Т-клетках и CD19 на В-клетках, для лечения редкой формы острой лимфобластной лейкемии (ALL, acute lymphoblastic leukemia) предшественника В-клеток (B-cell ALL), отрицательной по филадельфийской хромосоме. BiTE-антитело представляет собой биспецифический одноцепочечный полипептид, состоящий из двух связывающих ветвей, соединенных короткой последовательностью пептида. Каждую ветвь или одноцепочечный вариабельный фрагмент (single-chain variable fragment, scFv) получают из вариабельных тяжелых и легких цепей моноклонального антитела. Например, Blincyto получают путем соединения связывающих доменов антител против человеческого CD3 и против человеческого CD19.

Существует несколько проблем в использовании моноклинальных или BiTE-антител для нацеливания на раковые антигены. Во-первых, для того, чтобы создать моноклональное антитело, нацеленное на рак, в раковой клетке сначала нужно идентифицирован специфический антиген. Действительно, к 2012 году в Управлении по контролю за продуктами и лекарствами США (FDA) было одобрено только 12 моноклональных антител для лечения определенных типов рака (Scott et al., 2012, Nat Rev Cancer, 12: 278-287). Кроме того, отсутствие общих белковых антигенов среди различных типов рака значительно ограничивает число раковых образований, на которые может быть нацелен один химерный BiTE-белок. Таким образом, многие уникальные BiTE-белки должны быть созданы для отдельных типов рака, что значительно увеличивает затраты на разработку. Наконец, опухолеспецифические антигены часто также экспрессируются в нормальной ткани, но на более низких уровнях. Таким образом, нормальная ткань может также быть мишенью уничтожения. Все эти проблемы можно видеть на примере Blincyto, поскольку: 1) он нацелен на единичный и редкий вид рака, не поддающийся лечению, который встречается только в 1000 случаях в год в США, и 2) он нацелен на CD19, который экспрессируется в нормальных В-клетках, что приводит к истощению нормальных В-клеток в дополнение к уничтожению раковых клеток. Лучший подход будет нацелен на антиген, присутствующий на многих распространенных раковых опухолях, который имеет ограниченную экспрессию или не экспрессируется в нормальной ткани.

Таким образом, в данной области существует потребность в улучшенных композициях и способах лечения рака. Данное изобретение удовлетворяет эту неудовлетворенную потребность.

Сущность изобретения

В одном аспекте данное изобретение предусматривает композицию для лечения рака, содержащую пептид, содержащий домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (tumor-associated carbohydrate antigen, ТАСА) полученный из лектина, где ТАСА-связывающий домен специфически связывается с ТАСА опухолевой клетки. В одном воплощении лектин выбран из группы, состоящей из: лектина млекопитающего, человеческого лектина, растительного лектина, бактериального лектина, вирусного лектина, лектина грибов и лектина простейших.

В одном воплощении лектин выбран из группы, состоящей из следующих: галектин, сиглек, селектин; лектин С-типа; CD301, лейкоагглютинин Phaseolus vulgaris (L-PHA); эритроагглютинин Phaseolus vulgaris (E-PHA); лектин томата (лектин Lycopersicon esculentum, LEA); лектин арахиса (агглютинин Arachis hypogaea; PNA); картофельный лектин (лектин Solanum tuberosum), митоген фитолакки американской (лектин Phytolacca American), агглютинин зародышей пшеницы (лектин Triticum Vulgaris); лектин Artocarpus polyphemus (лектин джакалин); агглютинин Vicia villosa (WA); агглютинин Helix pomatia (НРА); агглютинин Wisteria floribunda (WFA); агглютинин Sambucus nigra (SNA), лектин из грамотрицательных бактерий Burkholderia cenocepacia (BC2LCM), лейкоагглютинин Maackia amurensis (MAL), Psathyrella velutina (PVL), лектин Sclerotium rolfsii (SRL), агглютинин Eucheuma serra (ESA), CLEC17A (Пролектин), лектин Aleuria aurantia, лектин Sambucus sieboldiana (SSA), лектин Glechoma hederacea (Gleheda), агглютинин Morus nigra (Morniga G), лектин Salvia sclarea, лектин Salvia bogotensis, лектин Salvia horminum, лектин Clerodendrum trichotomum, лектин Moluccella laevis, Griffonia simplicifolia (GsLA4), Psophocarpus tetragonolobus (кислотный WBAI), лектин Abrus precatorius, лектин Moluccella laevis (MLL), лектин Amaranthus caudatus, лектин Amaranthus leucocarpus, лектин Laelia autumnalis, лектин Artocarpus integrifolia, лектин Madura pomifera, лектин Artocarpus lakoocha, агглютинин Dolichos biflorus, лектин Dolichos biflorus, лектин Glycine max и лектин Agaricus bisporus.

В одном воплощении галектин выбран из группы, состоящей из: галектина-1, галектина-2, галектина-3, галектина-4, галектина-5, галектина-6, галектина-7, галектина-8, галектина-9, галектина-10, галектина-11, галектина-12, галектина-13, галектина-14 и галектина-15.

В одном воплощении сиглек выбран из группы, состоящей из: сиглека-1 (сиалоадгезия), сиглека-2 (CD22), сиглека-3 (CD33), сиглека-4 (ассоциированный с миелином гликопротеин), сиглека-5, сиглека-6, сиглека-7, сиглека-8, сиглека-9, сиглека-10, сиглека-11, сиглека-12, сиглека-13, сиглека-14, сиглека-15, сиглека-16, сиглека-17, сиглека Е, сиглека F, сиглека G и сиглека Н.

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с ТАСА, выбранным из группы, состоящей из: β1,6-разветвления, Т-антигена, сиалил-Т-эпитопов, Tn-эпитопов, сиалил-Tn-эпитопов, α2,6-сиалилирования, сиалилирования, сиалил-Льюис^х/а, дисиалил-Льюис^х/а, сиалил-6-сульфо-Льюисх, Globo Н, GD2, GD3, GM3 и фукозил-GM1. В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с β1,6GlcNAc-разветвленными N-гликанами опухолевой клетки. В одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 1, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, аминокислотную последовательность, обладающую более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 7.

В одном воплощении указанный пептид представляет собой Fc-гибридный пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, связанный с Fc-доменом.

В одном воплощении указанный пептид дополнительно содержит домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой. В одном воплощении иммунная эффекторная клетка выбрана из группы, состоящей из следующих: Т-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), Т-клетки натуральные киллеры (NKT, natural killer T-cell), макрофаги, моноциты, дендритные клетки и нейтрофилы.

В одном воплощении домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий Т-клетку, где домен, связывающий Т-клетку, специфически связывается с Т-клеткой. В одном воплощении домен, связывающий Т-клетку, связывается по меньшей мере с одной молекулой из группы, содержащей CD3, Т-клеточный рецептор, CD2, CD28 и CD25. В одном воплощении домен, связывающий Т-клетку, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO 9 и аминокислотной последовательности, обладающей более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 9. В одном воплощении пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 11, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 17.

В одном воплощении домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий NK-клетку, где домен, связывающий NK-клетку, специфически связывается с NK-клеткой. В одном воплощении домен, связывающий NK-клетку, связывается по меньшей мере с одной молекулой из группы, состоящей из: CD16 и NKG2D.

В одном воплощении пептид содержит химерный антигенный рецептор (chimeric antigen receptor, CAR), содержащий ТАСА-связывающий домен.

В одном аспекте данное изобретение предусматривает композицию для лечения рака, содержащую изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, содержащий домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (ТАСА), полученный из лектина, где ТАСА-связывающий домен специфически связывается с ТАСА опухолевой клетки. В одном воплощении лектин выбран из группы, состоящей из: лектина млекопитающего, человеческого лектина, растительного лектина, бактериального лектина, вирусного лектина, лектина грибов и лектина простейших.

В одном воплощении лектин выбран из группы, состоящей из следующих: галектин, сиглек, селектин; лектин С-типа; CD301, L-PHA (лейкоагглютинин Phaseolus vulgaris); Е-РНА (эритроагглютинин Phaseolus vulgaris); лектин томата (лектин Lycopersicon esculentum, LEA); лектин арахиса (агглютинин Arachis hypogaea; PNA); картофельный лектин (лектин Solanum tuberosum), митоген фитолакки американской (лектин Phytolacca American), агглютинин зародышей пшеницы (лектин Triticum Vulgaris); лектин Artocarpus polyphemus (лектин джакалин); агглютинин Vicia villosa (WA); агглютинин Helix pomatia (НРА); агглютинин Wisteria floribunda (WFA); агглютинин Sambucus nigra (SNA), BC2LCM (лектин из грамотрицательных бактерий Burkholderia cenocepacia), лейкоагглютинин Maackia amurensis (MAL), Psathyrella velutina (PVL), лектин Sclerotium rolfsii (SRL), агглютинин Eucheuma serra (ESA), CLEC17A (Пролектин), лектин Aleuria aurantia, лектин Sambucus sieboldiana (SSA), лектин Glechoma hederacea (Gleheda), агглютинин Morus nigra (Morniga G), лектин Salvia sclarea, лектин Salvia bogotensis, лектин Salvia horminum, лектин Clerodendrum trichotomum, лектин Moluccella laevis, Griffonia simplicifolia (GsLA4), Psophocarpus tetragonolobus (кислотный WBAI), лектин Abrus precatorius, лектин Moluccella laevis (MLL), лектин Amaranthus caudatus, лектин Amaranthus leucocarpus, лектин Laelia autumnalis, лектин Artocarpus integrifolia, лектин Madura pomifera, лектин Artocarpus lakoocha, агглютинин Dolichos biflorus, лектин Dolichos biflorus, лектин Glycine max и лектин Agaricus bisporus.

В одном воплощении галектин выбран из группы, состоящей из: галектина-1, галектина-2, галектина-3, галектина-4, галектина-5, галектина-6, галектина-7, галектина-8, галектина-9, галектина-10, галектина-11, галектина-12, галектина-13, галектина-14 и галектина-15.

В одном воплощении сиглек выбран из группы, состоящей из: сиглека-1 (сиалоадгезия), сиглека-2 (CD22), сиглека-3 (CD33), сиглека-4 (ассоциированный с миелином гликопротеин), сиглека-5, сиглека-6, сиглека-7, сиглека-8, сиглека-9, сиглека-10, сиглека-11, сиглека-12, сиглека-13, сиглека-14, сиглека-15, сиглека-16, сиглека-17, сиглека Е, сиглека F, сиглека G и сиглека Н.

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с ТАСА, выбранным из группы, состоящей из следующих: β1,6-разветвление, Т-антиген, сиалил-Т-эпитопы, Tn-эпитопы, сиалил-Tn-эпитопы, α2,6-сиалилирование, сиалилирование, сиалил-Льюис^х/а, дисиалил-Льюис^х/а, сиалил-6-сульфо-Льюис^х, Globo Н, GD2, GD3, GM3 и фукозил-GM1. В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с β1,6GlcNAc-разветвленными N-гликанами опухолевой клетки. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую ТАСА-связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 1, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, аминокислотную последовательность, обладающую более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 7.

В одном воплощении пептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, представляет собой Fc-гибридный пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, связанный с Fc-доменом.

В одном воплощении пептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, дополнительно содержит домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой. В одном воплощении иммунная эффекторная клетка выбрана из группы, состоящей из следующих: Т-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), Т-клетки натуральные киллеры (NKT), макрофаги, моноциты, дендритные клетки и нейтрофилы.

В одном воплощении домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий Т-клетку, где домен, связывающий Т-клетку, специфически связывается с Т-клеткой. В одном воплощении домен, связывающий Т-клетку, связывается по меньшей мере с одной молекулой из группы, состоящей из: CD3, Т-клеточного рецептора, CD2, CD28 и CD25. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен, связывающий Т-клетку, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO 9 и аминокислотной последовательности, обладающей более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 9. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 11, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 17.

В одном воплощении домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий NK-клетку, где домен, связывающий NK-клетку, специфически связывается с NK-клеткой. В одном воплощении домен, связывающий NK-клетку, связывается по меньшей мере с одной молекулой из группы, состоящей из: CD16 и NKG2D.

В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты кодирует химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий домен распознавания антигена и внутриклеточный домен, где домен распознавания антигена содержит ТАСА-связывающий домен. В одном воплощении домен распознавания антигена CAR, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, содержит ТАСА-связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 1, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, аминокислотную последовательность, обладающую более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 7. В одном воплощении внутриклеточный домен CAR, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, содержит домен сигналинга CD3 дзета и костимулирующий домен.

В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит экспрессионный вектор. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты включает транскрибированную in vitro РНК.

В одном аспекте данное изобретение предусматривает композицию для лечения рака, содержащую агент, который связывается с пептидом, содержащим домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (ТАСА), полученный из лектина, где ТАСА-связывающий домен специфически связывается с ТАСА опухолевой клетки. В одном воплощении агент включает лектинсвязывающий домен.

В одном аспекте данное изобретение предусматривает композицию, содержащую изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, который связывается с пептидом, содержащим домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (ТАСА), полученный из лектина, где ТАСА-связывающий домен специфически связывается с ТАСА опухолевой клетки. В одном воплощении пептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, включает лектинсвязывающий домен. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты кодирует CAR, содержащий антигенсвязывающий домен и внутриклеточный домен, где антигенсвязывающий домен содержит лектинсвязывающий домен.

В одном аспекте данное изобретение предусматривает клетку, модифицированную для экспрессии пептида, содержащего домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (ТАСА), полученный из лектина, где ТАСА-связывающий домен специфически связывается с ТАСА опухолевой клетки. В одном аспекте клетка модифицирована для экспрессии CAR, содержащего домен распознавания антигена и внутриклеточный домен, где домен распознавания антигена содержит ТАСА-связывающий домен. В одном аспекте клетка выбрана из группы, состоящей из следующих: Т-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), цитотоксические Т-лимфоциты (CTL, cytotoxic Т lymphocyte) и регуляторные Т-клетки.

В одном аспекте данное изобретение предусматривает способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту композиции, содержащей пептид, содержащий домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (ТАСА), полученный из лектина, где ТАСА-связывающий домен специфически связывается с ТАСА опухолевой клетки. В одном воплощении лектин выбран из группы, состоящей из следующих: лектин млекопитающего, человеческий лектин, растительный лектин, бактериальный лектин, вирусный лектин, лектин грибов и лектин простейших.

В одном воплощении лектин выбран из группы, состоящей из следующих: галектин, сиглек, селектин; лектин С-типа; CD301, L-PHA (лейкоагглютинин Phaseolus vulgaris); Е-РНА (эритроагглютинин Phaseolus vulgaris); лектин томата (лектин Lycopersicon esculentum, LEA); лектин арахиса (агглютинин Arachis hypogaea; PNA); картофельный лектин (лектин Solanum tuberosum), митоген фитолакки американской (лектин Phytolacca American), агглютинин зародышей пшеницы (лектин Triticum Vulgaris); лектин Artocarpus polyphemus (лектин джакалин); агглютинин Vicia villosa (WA); агглютинин Helix pomatia (НРА); агглютинин Wisteria floribunda (WFA); агглютинин Sambucus nigra (SNA), BC2LCM (лектин из грамотрицательных бактерий Burkholderia cenocepacia), лейкоагглютинин Maackia amurensis (MAL), Psathyrella velutina (PVL), лектин Sclerotium rolfsii (SRL), агглютинин Eucheuma serra (ESA), CLEC17A (Пролектин), лектин Aleuria aurantia, лектин Sambucus sieboldiana (SSA), лектин Glechoma hederacea (Gleheda), агглютинин Morus nigra (Morniga G), лектин Salvia sclarea, лектин Salvia bogotensis, лектин Salvia horminum, лектин Clerodendrum trichotomum, лектин Moluccella laevis, Griffonia simplicifolia (GsLA4), Psophocarpus tetragonolobus (кислотный WBAI), лектин Abrus precatorius, лектин Moluccella laevis (MLL), лектин Amaranthus caudatus, лектин Amaranthus leucocarpus, лектин Laelia autumnalis, лектин Artocarpus integrifolia, лектин Madura pomifera, лектин Artocarpus lakoocha, агглютинин Dolichos biflorus, лектин Dolichos biflorus, лектин Glycine max и лектин Agaricus bisporus.

В одном воплощении галектин выбран из группы, состоящей из: галектина-1, галектина-2, галектина-3, галектина-4, галектина-5, галектина-6, галектина-7, галектина-8, галектина-9, галектина-10, галектина-11, галектина-12, галектина-13, галектина-14 и галектина-15.

В одном воплощении сиглек выбран из группы, состоящей из: сиглека-1 (сиалоадгезия), сиглека-2 (CD22), сиглека-3 (CD33), сиглека-4 (ассоциированный с миелином гликопротеин), сиглека-5, сиглека-6, сиглека-7, сиглека-8, сиглека-9, сиглека-10, сиглека-11, сиглека-12, сиглека-13, сиглека-14, сиглека-15, сиглека-16, сиглека-17, сиглека Е, сиглека F, сиглека G и сиглека Н.

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с ТАСА, выбранным из группы, состоящей из следующих: β1,6-разветвление, Т-антиген, сиалил-Т-эпитопы, Tn-эпитопы, сиалил-Tn-эпитопы, α2,6-сиалилирование, сиалилирование, сиалил-Льюис^х/а, дисиалил-Льюис^х/а, сиалил-6-сульфо-Льюис^х, Globo Н, GD2, GD3, GM3 и фукозил-GM1. В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с β1,6GlcNAc-разветвленными N-гликанами опухолевой клетки. В одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 1, аминокислотную последовательность, обладающую более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, аминокислотную последовательность, обладающую более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 7.

В одном воплощении указанный пептид представляет собой Fc-гибридный пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, связанный с Fc-доменом.

В одном воплощении указанный пептид дополнительно содержит домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой. В одном воплощении иммунная эффекторная клетка выбрана из группы, состоящей из следующих: Т-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), Т-клетки натуральные киллеры (NKT), макрофаги, моноциты, дендритные клетки и нейтрофилы.

В одном воплощении домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий Т-клетку, где домен, связывающий Т-клетку, специфически связывается с Т-клеткой. В одном воплощении домен, связывающий Т-клетку, связывается по меньшей мере с одной молекулой из группы, состоящей из: CD3, Т-клеточного рецептора, CD2, CD28 и CD25. В одном воплощении домен, связывающий Т-клетку, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO 9 и аминокислотной последовательности, обладающей более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 9. В одном воплощении пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 11, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 17.

В одном воплощении домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий NK-клетку, где домен, связывающий NK-клетку, специфически связывается с NK-клеткой. В одном воплощении домен, связывающий NK-клетку, связывается по меньшей мере с одной молекулой из группы, состоящей из: CD16 и NKG2D.

В одном воплощении пептид содержит химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий ТАСА-связывающий домен.

В одном воплощении субъект имеет солидную опухоль, которая экспрессирует ТАСА.

В одном аспекте данное изобретение предусматривает способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекту, включающий введение субъекту композиции, содержащей изолированную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, содержащий домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (ТАСА), полученный из лектина, где ТАСА-связывающий домен специфически связывается с ТАСА опухолевой клетки. В одном воплощении лектин выбран из группы, состоящей из следующих: лектин млекопитающего, человеческий лектин, растительный лектин, бактериальный лектин, вирусный лектин, лектин грибов и лектин простейших.

В одном воплощении лектин выбран из группы, состоящей из следующих: галектин, сиглек, селектин; лектин С-типа; CD301, L-PHA (лейкоагглютинин Phaseolus vulgaris); Е-РНА (эритроагглютинин Phaseolus vulgaris); лектин томата (лектин Lycopersicon esculentum, LEA); лектин арахиса (агглютинин Arachis hypogaea; PNA); картофельный лектин (лектин Solarium tuberosum), митоген фитолакки американской (лектин Phytolacca American), агглютинин зародышей пшеницы (лектин Triticum Vulgaris); лектин Artocarpus polyphemus (лектин джакалин); агглютинин Vicia villosa (WA); агглютинин Helix pomatia (НРА); агглютинин Wisteria floribunda (WFA); агглютинин Sambucus nigra (SNA), BC2LCM (лектин из грамотрицательных бактерий Burkholderia cenocepacia), лейкоагглютинин Maackia amurensis (MAL), Psathyrella velutina (PVL), лектин Sclerotium rolfsii (SRL), агглютинин Eucheuma serra (ESA), CLEC17A (Пролектин), лектин Aleuria aurantia, лектин Sambucus sieboldiana (SSA), лектин Glechoma hederacea (Gleheda), агглютинин Morus nigra (Morniga G), лектин Salvia sclarea, лектин Salvia bogotensis, лектин Salvia horminum, лектин Clerodendrum trichotomum, лектин Moluccella laevis, Griffonia simplicifolia (GsLA4), Psophocarpus tetragonolobus (кислотный WBAI), лектин Abrus precatorius, лектин Moluccella laevis (MLL), лектин Amaranthus caudatus, лектин Amaranthus leucocarpus, лектин Laelia autumnalis, лектин Artocarpus integrifolia, лектин Madura pomifera, лектин Artocarpus lakoocha, агглютинин Dolichos biflorus, лектин Dolichos biflorus, лектин Glycine max и лектин Agaricus bisporus.

В одном воплощении галектин выбран из группы, состоящей из: галектина-1, галектина-2, галектина-3, галектина-4, галектина-5, галектина-6, галектина-7, галектина-8, галектина-9, галектина-10, галектина-11, галектина-12, галектина-13, галектина-14 и галектина-15.

В одном воплощении сиглек выбран из группы, состоящей из: сиглека-1 (сиалоадгезия), сиглека-2 (CD22), сиглека-3 (CD33), сиглека-4 (ассоциированный с миелином гликопротеин), сиглека-5, сиглека-6, сиглека-7, сиглека-8, сиглека-9, сиглека-10, сиглека-11, сиглека-12, сиглека-13, сиглека-14, сиглека-15, сиглека-16, сиглека-17, сиглека Е, сиглека F, сиглека G и сиглека Н.

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с ТАСА, выбранным из группы, состоящей из следующих: β1,6-разветвление, Т-антиген, сиалил-Т-эпитопы, Tn-эпитопы, сиалил-Tn-эпитопы, α2,6-сиалилирование, сиалилирование, сиалил-Льюис^х/а, дисиалил-Льюис^х/а, сиалил-6-сульфо-Льюис^х, Globo Н, GD2, GD3, GM3 и фукозил-GM1. В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с β1,6GlcNAc-разветвленными N-гликанами опухолевой клетки. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую ТАСА-связывающий домен, содержащий содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 1, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, аминокислотную последовательность, обладающую более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 7.

В одном воплощении пептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, представляет собой Fc-гибридный пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, связанный с Fc-доменом.

В одном воплощении пептид, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, дополнительно содержит домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой. В одном воплощении иммунная эффекторная клетка выбрана из группы, состоящей из следующих: Т-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), Т-клетки натуральные киллеры (NKT), макрофаги, моноциты, дендритные клетки и нейтрофилы.

В одном воплощении домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий Т-клетку, где домен, связывающий Т-клетку, специфически связывается с Т-клеткой. В одном воплощении домен, связывающий Т-клетку, связывается по меньшей мере с одной молекулой из группы, состоящей из: CD3, Т-клеточного рецептора, CD2, CD28 и CD25. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую домен, связывающий Т-клетку, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO 9 и аминокислотной последовательности, обладающей более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 9. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую пептид, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 11, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 17.

В одном воплощении домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий NK-клетку, где домен, связывающий NK-клетку, специфически связывается с NK-клеткой. В одном воплощении домен, связывающий NK-клетку, связывается по меньшей мере с одной молекулой из группы, состоящей из: CD16 и NKG2D.

В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты кодирует химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий домен распознавания антигена и внутриклеточный домен, где домен распознавания антигена содержит ТАСА-связывающий домен. В одном воплощении домен распознавания антигена CAR, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, содержит ТАСА-связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из следующих: SEQ ID NO 1, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, аминокислотную последовательность, обладающую более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 и аминокислотную последовательность, обладающую более чем примерно 90% гомологией с SEQ ID NO 7. В одном воплощении внутриклеточный домен CAR, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, содержит домен сигналинга CD3 дзета и костимулирующий домен.

В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит экспрессионный вектор. В одном воплощении изолированная молекула нуклеиновой кислоты содержит транскрибированную РНК in vitro.

В одном воплощении субъект имеет солидную опухоль, которая экспрессирует ТАСА.

В одном аспекте данное изобретение предусматривает способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту клетки, модифицированной для экспрессии пептида, содержащего домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (ТАСА), полученный из лектина, где ТАСА-связывающий домен специфически связывается с ТАСА опухолевой клетки.

В одном воплощении клетка модифицирована для экспрессии CAR, содержащего домен распознавания антигена и внутриклеточный домен, где домен распознавания антигена содержит ТАСА-связывающий домен. В одном воплощении клетка выбрана из группы, состоящей из следующих: Т-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) и регуляторные Т-клетки. В одном воплощении клетка является аутологичной.

В одном аспекте данное изобретение предусматривает способ лечения рака у нуждающегося в этом субъекта, включающий: а) введение субъекту клетки, модифицированной для экспрессии CAR, содержащего антигенсвязывающий домен, который связывается с пептидом, содержащим домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (ТАСА), полученный из лектина, и b) введение субъекту композиции, содержащей пептид, содержащий ТАСА связывающий домен. В одном воплощении антигенсвязывающий домен CAR содержит лектинсвязывающий домен, где лектинсвязывающий домен связывается с пептидом, содержащим ТАСА-связывающий домен.

Краткое описание графических материалов

Следующее далее подробное описание предпочтительных воплощений изобретения будет более понятым при чтении его в сочетании с прилагаемыми графическими материалами. В целях иллюстрации данного изобретения в графических материалах показаны воплощения, которые в данном случае являются предпочтительными. Тем не менее, следует понимать, что данное изобретение не ограничивается точными мероприятиями и инструментами воплощений, показанных в графических материалах.

Фиг. 1 представляет собой иллюстрацию, изображающую путь ветвления N-гликозилирования. Олигосахарилтрансфераза переносит предварительно собранный гликан, Glc₃Man₉glcNAc₂, в мотивы NxS/T гликопротеинов в эндоплазматическом ретикулуме. По мере прохождения гликопротеинов через аппарат Гольджи ферменты N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (Mgat1, Mgat2, Mgat4 и Mgat5) последовательно действуют для образования разветвленных N-гликанов, которые демонстрируют возрастающую аффинность к галектинам. Галактозилтрансфераза 3 удлиняет ветви, добавляя галактозу к GlcNAc, создавая N-ацетиллактозамин, который может быть связан галектинами. Показаны сайты связывания L-PHA. GI - глюкозидаза I; GII - глюкозидаза II; MI - маннозидаза I; MII - маннозидаза II; GalT3 - галактозилтрансфераза 3.

Фиг. 2 представляет собой иллюстрацию, изображающую принцип химерного белка L-PHA × CD3. Химерный белок представляет собой одну полипептидную цепь, содержащую вариабельные тяжелые и легкие цепи моноклонального антитела против CD3 и растительного лектина L-PHA. Он может взаимодействовать с Т-клеткой и раковой клеткой с β1,6GlcNAc-разветвленным N-гликаном. Это взаимодействие может активировать Т-клетку и индуцировать цитотоксическое уничтожение раковой клетки.

На фиг. 3 показаны результаты иллюстративного эксперимента, демонстрирующие, что GlyTR L-PHA × CD3 связывает как CD3, так и четырехантенный разветвленный N-гликан. Анализ связывания L-PHA × CD3 клеточной поверхности на клетках Юркат (слева) и K562 (справа) путем проточной цитометрии с предварительной обработкой (или без нее) в течение 3 дней 10 мкМ кифуненсином (Kifunensine, Kif). На клетках Юркат (слева) L-PHA × CD3 был способен связывать как CD3, так и четырехантенный разветвленный N-гликан, и связывание уменьшалось, если клетки предварительно обрабатывали Kif, который отменял разветвление, но оставлял CD3 на поверхности клетки для связывания. Связывание было обнаружено на СD3-отрицательной раковой клетке хронической миелогенной лейкемии, K562 (справа), но не на Kif-обработанных клетках K562.

На фиг. 4, включающей фигуры с 4А по 4J, показаны результаты иллюстративного эксперимента, демонстрирующие, что GlyTR L-PHA × CD3 опосредует уничтожение раковых клеток. CFSE-меченные K562 (фиг. 4А-4С), обработанные кифуненсином K562 (фиг. 4В), Раджи (фиг. 4D), RPMI 8226 (фиг. 4Е), RS411 (фиг. 4F), MCF7 (фиг. 4G), НТ-29 (фиг. 4Н), Hep G2 (фиг. 4I) или HeLa (фиг. 4J) высевали в 96-луночные планшеты. Человеческие неактивированные РВМС и последовательные разведения GlyTR L-PHA × CD3 добавляли в планшет и инкубировали в течение 4 часов при 37°С в 5% CO₂-инкубаторе. Цитотоксичность обнаруживали путем окрашивания пропидиумом йода (propidium iodine, PI) (фиг. 4А-4С, фиг. 4J) или 7AAD (фиг. 4D-4I) и анализировали путем проточной цитометрии. Специфическая цитотоксичность % = CFSE⁺PI⁺%_GlyTR - CFSE⁺PI⁺% _{без обработки} (фиг. 4А-4С, фиг. 4J) или = CFSE⁺7-AAD⁺%_GlyTR - CFSE⁺7-AAD⁺% _{без обработки} (фиг. 4D-4I), и клетки CFSE^-PI⁺ гейтировали для анализа цитотоксичности по РВМС (фиг. 4С).

Фиг. 5 представляет собой схематическое изображение иллюстративного воплощения данного изобретения, где Т-клетка модифицирована для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего пептид, полученный из лектина, который содержит ТАСА-связывающий домен, который связывается с ТАСА, экспрессированным на опухолевой клетке.

Фиг. 6 представляет собой схематическое изображение иллюстративного воплощения данного изобретения, где Т-клетка модифицирована для экспрессии химерного антигенного рецептора (CAR), содержащего лектинсвязывающий домен. Лектинсвязывающий домен может связываться с пептидом, полученным из лектина, который содержит ТАСА-связывающий домен, который связывается с ТАСА, экспрессированным на опухолевой клетке.

Подробное описание

Данное изобретение относится к композициям и способам лечения рака. В одном аспекте данное изобретение предусматривает композицию, содержащую пептид, содержащий первый домен, который специфически связывается с ассоциированным с опухолью углеводным антигеном (ТАСА). В некоторых воплощениях пептид содержит второй домен, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой. В некоторых воплощениях второй домен связывается с Т-клеткой. Например, в некоторых воплощениях указанный белок связывается с ТАСА, присутствующим на опухолевой клетке, и с биомолекулой (например, поверхностным белком), присутствующей на Т-клетке, тем самым привлекая Т-клетку к опухолевой клетке. В некоторых случаях пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий Т-клетку, упоминается в данном документе как гликан-зависимый рекрутер Т-клеток (GlyTR). В одном воплощении указанная композиция содержит химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий ТАСА-связывающий домен. В одном воплощении указанная композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую описанный в данном документе гибридный пептид. В одном воплощении указанная композиция содержит клетку, генетически модифицированную для экспрессии описанного в данном документе гибридного пептида.

Данное изобретение предусматривает способ лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом. В некоторых воплощениях указанный способ включает введение субъекту эффективного количества композиции, описанной в данном документе. Например, в одном воплощении указанный способ включает введение субъекту гибридного пептида, содержащего первый домен, который связывает ТАСА, и второй домен, который связывает иммунную эффекторную клетку, например, Т-клетку. В одном воплощении указанный способ включает введение субъекту композиции, содержащей молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую описанный в данном документе гибридный пептид. В одном воплощении указанный способ включает введение субъекту композиции, содержащей клетку, модифицированную для экспрессии описанного в данном документе гибридного пептида.

Определения

Если не указано иное, то все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области, к которому относится данное изобретение. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, могут быть использованы в осуществлении на практике или в испытаниях данного изобретения, описаны предпочтительные способы и материалы.

Каждый из следующих терминов, используемых в данном документе, имеет значение, связанное с ним в этом разделе.

Понятия в единственном числе используются в данном документе для обозначения одного или более чем одного (т.е. по меньшей мере одного) грамматического объекта статьи. В качестве примера "элемент" означает один элемент или более чем один элемент.

Понятие "примерно", используемое в данном документе касательно измеримого значения, такого как количество, временная продолжительность и т.п., предназначено для охвата вариаций плюс/минус 20%, плюс/минус 10%, плюс/минус 5%, плюс/минус 1% или плюс/минус 0,1% от указанного значения, поскольку такие вариации подходят для выполнения раскрытых способов.

Понятие "активация", используемое в данном документе, относится к состоянию Т-клетки, которая была в достаточной степени стимулирована для индукции обнаруживаемой клеточной пролиферации. Активация также может быть связана с индуцированной продукцией цитокинов и обнаруживаемыми эффекторными функциями. Термин "активированные Т-клетки" относится, среди прочего, к Т-клеткам, которые подвергаются клеточному делению.

Используемый в данном документе термин "антитело" относится к молекуле иммуноглобулина, которая специфически связывается с антигеном. Антитела могут быть интактными иммуноглобулинами, полученными из природных источников или из рекомбинантных источников, и могут быть иммунореактивными частями интактных иммуноглобулинов. Антитела, как правило, представляют собой тетрамеры молекул иммуноглобулинов. Антитела согласно данному изобретению могут существовать в самых разных формах, включая, например, поликлональные антитела, моноклональные антитела, Fv, Fab и F(ab)₂, а также одноцепочечные антитела и гуманизированные антитела (Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).

Термин "фрагмент антитела" относится к части интактного антитела и относится к антигенным определяющим вариабельным областям интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваясь ими, Fab-, Fab'-, F(ab)₂^- и Fv-фрагменты, линейные антитела, scFv-антитела и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Понятие "тяжелая цепь антитела", используемое в данном документе, относится к большей из двух полипептидных цепей, присутствующих во всех молекулах антител в их природных конформациях.

Понятие "легкая цепь антитела", используемое в данном документе, относится к меньшей из двух полипептидных цепей, присутствующих во всех молекулах антител в их природных конформациях. Легкие цепи κ и λ относятся к двум основным изотипам легких цепей антител.

Термин "синтетическое антитело", используемый в данном документе, означает антитело, которое получают с использованием технологии рекомбинантной ДНК, например, антитело, экспрессированное бактериофагом, как описано в данном документе. Этот термин также следует понимать как антитело, которое было получено путем синтеза молекулы ДНК, кодирующей антитело, где такая молекула ДНК экспрессирует белок антитела, или синтеза аминокислотной последовательности, определяющей антитело, где ДНК или аминокислотная последовательность были получены с использованием методики синтетеза ДНК или аминокислотной последовательности, которая доступна и хорошо известна в данной области.

Используемый в данном документе термин "противоопухолевый эффект" относится к биологическому эффекту, который может проявляться уменьшением объема опухоли, уменьшением числа опухолевых клеток, уменьшением числа метастазов, увеличением продолжительности жизни или улучшением различных физиологических симптомов, связанных с раковым состоянием. "Противоопухолевый эффект" также может проявляться способностью пептидов, полинуклеотидов, клеток и антител согласно данному изобретению предотвращать появление опухоли в изначальном месте.

Используемый в данном документе термин "аутологичный" означает отношение к любому материалу, полученному от того же человека, которому он впоследствии должен быть повторно введен.

Термин "аллогенный" относится к трансплантату, полученному от другого животного того же вида.

Термин "ксеногенный" относится к трансплантату, полученному от животного другого вида.

Используемый в данном документе термин "рак" определяется как заболевание, характеризующееся быстрым и неконтролируемым ростом аберрантных клеток. Раковые клетки могут распространяться локально или через кровоток и лимфатическую систему в другие части тела. Примеры различных видов рака включают, но не ограничиваясь ими, рак молочной железы, рак предстательной железы, рак яичников, рак шейки матки, рак кожи, рак поджелудочной железы, колоректальный рак, рак почки, рак печени, рак мозга, лимфому, лейкемию, рак легких и т.п.

Понятие "заболевание" означает состояние здоровья животного, где животное не может поддерживать гомеостаз, и где, если заболевание не ослабляется, то здоровье животного продолжает ухудшаться. В отличие от этого, понятие "нарушение" у животного означает состояние здоровья, при котором животное может поддерживать гомеостаз, но при котором состояние здоровья животного является менее благоприятным, чем при отсутствии нарушения. При отсутствии лечения нарушение не обязательно приводит к дальнейшему ухудшению состояния здоровья животного.

Понятие "эффективное количество", используемое в данном документе, означает количество, которое дает терапевтическую или профилактическую пользу.

Понятие "кодирование" относится к присущему свойству специфических последовательностей нуклеотидов в полинуклеотиде, таком как ген, кДНК или мРНК, который выступает в качестве матрицы для синтеза других полимеров и макромолекул в биологических процессах, имеющих либо определенную последовательность нуклеотидов (т.е. рРНК, тРНК и мРНК), либо определенную последовательности аминокислот и вытекающие из нее биологические свойства. Таким образом, ген кодирует белок, если транскрипция и трансляция мРНК, соответствующей этому гену, дает белок в клетке или другой биологической системе. И кодирующая цепь, нуклеотидная последовательность которой идентична последовательности мРНК и обычно предоставляется в списках последовательностей, и некодирующая цепь, используемая в качестве матрицы для транскрипции гена или кДНК, может упоминаться как кодирующая белок или другой продукт этого гена или кДНК.

Используемый в данном документе термин "эндогенный" относится к любому материалу, полученному или произведенному внутри организма, клетки, ткани или системы.

Используемый в данном документе термин "экзогенный" относится к любому материалу, введенному из или произведенному вне организма, клетки, ткани или системы.

Используемый в данном документе термин "экспрессия" определяется как транскрипция и/или трансляция конкретной нуклеотидной последовательности, возникающая под действием ее промотора.

Понятие "экспрессионный вектор" относится к вектору, содержащему рекомбинантный полинуклеотид, содержащий последовательности контроля экспрессии, функционально связанные с нуклеотидной последовательностью, которая должна быть экспрессирована. Экспрессионный вектор содержит достаточные цис-действующие элементы для экспрессии; другие элементы для экспрессии могут быть предоставлены клеткой-хозяином или системой экспрессии in vitro. Экспрессионные векторы включают все известные в данной области, такие как космиды, плазмиды (например, голые или содержащиеся в липосомах) и вирусы (например, лентивирусы, ретровирусы, аденовирусы и аденоассоциированные вирусы), которые встраивают рекомбинантный полинуклеотид.

Понятие "гомологичные" относится к сходству последовательностей или идентичности последовательностей между двумя полипептидами или между двумя молекулами нуклеиновой кислотны. Когда позиция в обеих из двух сравниваемых последовательностей занята одним и тем же основанием или аминокислотной мономерной субъединицей, например, если позиция в каждой из двух молекул ДНК занята аденином, то молекулы гомологичны в этой позиции. Процент гомологии двух последовательностей является функцией числа совпадающих или гомологичных позиций, имеющихся у двух последовательностей, деленного на число сравниваемых позиций × 100. Например, если 6 из 10 позиций в двух последовательностях совпадают или гомологичны, то две последовательности гомологичны на 60%. В качестве примера, ДНК-последовательности ATTGCC и TATGGC имеют 50% гомологию. Как правило, сравнение проводится, когда две последовательности выровнены, чтобы обеспечить максимальную гомологию.

Используемый в данном документе термин "иммуноглобулин" или "Ig" определен как класс белков, которые функционируют как антитела. Антитела, экспрессируемые В-клетками, иногда упоминаются как BCR (В cell receptor, В-клеточный рецептор) или антигенный рецептор. Пять членов, включенных в этот класс белков, представляют собой IgA, IgG, IgM, IgD и IgE. IgA является основным антителом, которое присутствует в секретах организма, таких как слюна, слезы, грудное молоко, желудочно-кишечные секреты и секреты слизистых оболочек дыхательного и мочеполового трактов. IgG является наиболее распространенным антителом в кровотоке. IgM является основным иммуноглобулином, продуцируемым при первичном иммунном ответе у большинства субъектов. Это наиболее эффективный иммуноглобулин в агглютинации, фиксации комплемента и других ответах антител, и он имеет большое значение для защиты от бактерий и вирусов. IgD представляет собой иммуноглобулин, который не обладает известными функциями антител, но может выступать в качестве антигенного рецептора. IgE является иммуноглобулином, который опосредует гиперчувствительность немедленного типа, вызывая высвобождение медиаторов из тучных клеток и базофилов при воздействии аллергена.

Используемый в данном документе термин "инструктивный материал" включает публикацию, запись, диаграмму или любое другое средство выражения, которое может использоваться для сообщения о пригодности композиций и способов данного изобретения. Инструктивный материал набора согласно данному изобретению может быть, например, прикреплен к контейнеру, который содержит нуклеиновую кислоту, пептид и/или композицию согласно данному изобретению, или может поставляться вместе с контейнером, который содержит нуклеиновую кислоту, пептид и/или композицию. Альтернативно, инструктивный материал может поставляться отдельно от контейнера с намерением о том, чтобы инструктивный материал и соединение были использованы получателем совместно.

Понятие "изолированный" означает измененный или удаленный из природного состояния. Например, нуклеиновая кислота или пептид, в природе присутствующие в живом животном, не "изолированы", но та же нуклеиновая кислота или пептид, частично или полностью отделенные от материалов, присутствующих рядом с ними в его природном состоянии, являются "изолированными". Изолированная нуклеиновая кислота или белок могут существовать в практически очищенной форме или могут существовать в неприродной среде, такой как, например, клетка-хозяин.

В контексте данного изобретения используются следующие сокращения для общеизвестных оснований нуклеиновых кислот."А" относится к аденозину, "С" относится к цитозину, "G" относится к гуанозину, "Т" относится к тимидину, a "U" относится к уридину.

Если не указано иное, то "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Фраза "нуклеотидная последовательность, которая кодирует белок или РНК", может также включать интроны в той степени, в которой нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, может в некоторых версиях содержать интрон(ы).

Используемый в данном документе термин "лектин" относится к белку или пептиду, который связывает углеводные структуры. Специалист в данной области поймет, что лектин представляет собой белок или пептид, который является высокоспецифичным в связывании с сахарными группировками.

Термин "ассоциированный с опухолью углеводный антиген", или "ТАСА", используемый в данном документе, относится к углеводной структуре, обнаруженной в раковой опухоли. Специалист в данной области поймет, что углеводные структуры состоят из одного или более чем одного связанного сахара или моносахарида. Специалист в данной области поймет, что углеводные структуры могут оставаться свободными и/или могут присоединяться к белкам или липидам, образуя гликопротеины и гликолипиды. Специалист в данной области поймет, что эти структуры углеводов связываются с лектином.

Используемое в данном документе понятие "лентивирус" относится к роду вирусов семейства Retroviridae. Лентивирусы уникальны среди ретровирусов своей способностью инфицировать неделящиеся клетки; они могут доставлять значительное количество генетической информации в ДНК клетки-хозяина, поэтому они являются одним из наиболее эффективных способов векторной доставки гена. HIV (ВИЧ), SIV и FIV являются примерами лентивирусов. Векторы, полученные из лентивирусов, предлагают средства для достижения значительных уровней переноса генов in vivo.

Под термином "модулирование", используемым в данном документе, подразумевается опосредование обнаружимого увеличения или уменьшения уровня ответа у субъекта по сравнению с уровнем ответа у субъекта в отсутствие лечения или соединения и/или по сравнению с уровнем ответа у идентичного, но нелеченого субъекта. Этот термин охватывает возмущение и/или воздействие нативного сигнала или ответа, тем самым опосредуя полезный терапевтический ответ у субъекта, предпочтительно человека.

Если не указано иное, то понятие "нуклеотидная последовательность, кодирующая аминокислотную последовательность" включает все нуклеотидные последовательности, которые являются вырожденными вариантами друг друга и которые кодируют одну и ту же аминокислотную последовательность. Нуклеотидные последовательности, которые кодируют белки и РНК, могут включать интроны.

Термин "функционально связанный" относится к функциональной связи между регуляторной последовательностью и гетерологичной последовательностью нуклеиновой кислоты, что приводит к экспрессии последней. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты функционально связана со второй последовательностью нуклеиновой кислоты, когда первая последовательность нуклеиновой кислоты помещается в функциональную связь со второй последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, если промотор влияет на транскрипцию или экспрессию кодирующей последовательности. Как правило, функционально связанные ДНК-последовательности являются смежными и, при необходимости объединения двух кодирующих белок областей, в одной рамке считывания.

Термин "сверхэкспрессированный" опухолевый антиген или "сверхэкспрессия" опухолевого антигена предназначен для указания на аномальный уровень экспрессии опухолевого антигена в клетке, взятой из области заболевания, такой как солидная опухоль в конкретной ткани или органе пациента, относительно уровня экспрессии в нормальной клетке из этой ткани или органа. Пациенты, имеющие солидные опухоли или гематологическую злокачественность, которые характеризуются сверхэкспрессией опухолевого антигена, можно определить стандартными анализами, известными в данной области.

"Парентеральное" введение иммуногенной композиции включает, например, методики подкожной (subcutaneous, s.c.), внутривенной (intravenous, i.v.), внутримышечной (intramuscular, i.m.) или интрастернальной инъекции или инфузии.

Термины "пациент", "субъект", "индивидуум" и т.п. используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к любому животному или его клеткам in vitro или in situ, применимым к способам, описанным в данном документе. В некоторых неограничивающих воплощениях пациент, субъект или индивидуум является человеком.

Используемый в данном документе термин "полинуклеотид" определяется как цепь нуклеотидов. Кроме того, нуклеиновые кислоты представляют собой полимеры нуклеотидов. Таким образом, термин "нуклеиновые кислоты" и "полинуклеотиды", используемые в данном документе, являются взаимозаменяемыми. Специалист в данной области имеет общее представление о том, что нуклеиновые кислоты являются полинуклеотидами, которые могут быть гидролизованы до мономерных "нуклеотидов". Мономерные нуклеотиды могут быть гидролизованы до нуклеозидов. Используемые в данном документе полинуклеотиды включают, но не ограничиваясь ими, все последовательности нуклеиновых кислот, которые получены любыми способами, доступными в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, рекомбинантные средства, т.е. клонирование последовательностей нуклеиновых кислот из рекомбинантной библиотеки или клеточного генома с использованием обычной методики клонирования и PCR™ и т.п., а также синтетические средства.

Используемые в данном документе термины "пептид", "полипептид" и "белок" используются взаимозаменяемо и относятся к соединению, состоящему из аминокислотных остатков, ковалентно связанных пептидными связями. Белок или пептид должен содержать по меньшей мере две аминокислоты, и никакое ограничение не установлено на максимальное число аминокислот, которые может содержать последовательность белка или пептида. Полипептиды включают любой пептид или белок, содержащий две или более двух аминокислот, соединенных друг с другом пептидными связями. Используемый в данном документе термин относится как к коротким цепям, которые также обычно упоминаются в данной области как пептиды, олигопептиды и олигомеры, например, так и к более длинным цепям, которые обычно упоминаются в данной области как белки, среди которых есть много типов. "Полипептиды" включают, например, биологически активные фрагменты, по существу гомологичные полипептиды, олигопептиды, гомодимеры, гетеродимеры, варианты полипептидов, модифицированные полипептиды, производные, аналоги, гибридные белки и другие. Полипептиды включают природные пептиды, рекомбинантные пептиды, синтетические пептиды или их комбинацию.

Используемый в данном документе термин "промотор" определяется как последовательность ДНК, распознаваемая синтетическим механизмом клетки, или введенный синтетический механизм, необходимый для инициирования специфической транскрипции полинуклеотидной последовательности.

Используемый в данном документе термин "промоторная/регуляторная последовательность" означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая требуется для экспрессии продукта гена, функционально связанного с промоторной/регуляторной последовательностью. В некоторых случаях эта последовательность может быть основной промоторной последовательностью, а в других случаях эта последовательность может также включать энхансерную последовательность и другие регуляторные элементы, которые необходимы для экспрессии продукта гена. Промоторная/регуляторная последовательность может быть, например, такой, которая экспрессирует продукт гена тканеспецифическим образом.

"Конститутивный" промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая при функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет генный продукт, вызывает продукцию гена в клетке в большинстве или во всех физиологических условиях клетки.

"Индуцируемый" промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая при функциональной связи с полинуклеотидом, который кодирует или определяет генный продукт, вызывает продукцию гена в клетке по существу только тогда, когда индуктор, который соответствует промотору, присутствует в клетке.

"Тканеспецифический" промотор представляет собой нуклеотидную последовательность, которая при функциональной связи с полинуклеотидом, который кодируетсяили определяется геном, вызывает продукцию гена в клетке по существу только в том случае, если клетка является клеткой такого типа ткани, который соответствует промотору.

Под термином "специфически связывается", используемым в данном документе в отношении антитела, понимают антитело, которое распознает специфический антиген, но по существу не распознает или не связывает другие молекулы в образце. Например, антитело, которое специфически связывается с антигеном от одного вида, также может связываться с этим антигеном от одного или более чем одного вида. Но такая перекрестная реакционная способность сама по себе не изменяет классификацию антитела как специфического. В другом примере антитело, которое специфически связывается с антигеном, также может связываться с различными аллельными формами антигена. Тем не менее, такая перекрестная реакционная способность сама по себе не изменяет классификацию антитела как специфического. В некоторых случаях термины "специфическое связывание" или "специфически связывающийся" могут быть использованы в отношении взаимодействия антитела, белка или пептида со второй химической формой, что означает, что взаимодействие зависит от присутствия конкретной структуры (например, антигенной детерминанты или эпитопа) на химических образцах; например, антитело распознает и связывается со специфической структурой белка, а не с белками в целом. Если антитело является специфическим для эпитопа "А", то присутствие молекулы, содержащей эпитоп А (или свободного немеченого А), в реакции, содержащей меченый "А" и антитело, уменьшит количество меченого А, связанного с антителом.

Используемое в данном документе понятие "по существу очищенная" клетка означает клетку, которая по существу не содержит других типов клеток. Понятие "по существу очищенная" клетка также относится к клетке, которая была отделена от других типов клеток, с которыми она обычно связана в ее природном состоянии. В некоторых случаях популяция по существу очищенных клеток относится к гомогенной популяции клеток. В других случаях этот термин относится просто к клетке, которая была отделена от клеток, с которыми она естественным образом связана в ее природном состоянии. В некоторых воплощениях клетки культивируют in vitro. В других воплощениях клетки не культивируют in vitro.

Используемый в данном документе термин "терапевтический" означает лечение и/или профилактику. Терапевтический эффект достигается путем подавления, ремиссии или искоренения болезненного состояния.

Термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству целевого соединения, которое будет вызывать биологический или медицинский ответ ткани, системы или субъекта, который запрашивается исследователем, ветеринаром, врачом или другим клиницистом. Термин "терапевтически эффективное количество" включает такое количество соединения, которое при введении является достаточным для профилактики развития или для ослабления в некоторой степени одного или более чем одного из признаков или симптомов нарушения или заболевания, подлежащего лечению. Терапевтически эффективное количество будет варьировать в зависимости от соединения, заболевания и его тяжести, а также от возраста, веса и т.д. субъекта, подлежащего лечению.

Используемый в данном документе термин "лечение" заболевания означает уменьшение частоты или тяжести по меньшей мере одного признака или симптома заболевания или нарушения, испытываемого субъектом.

Используемый в данном документе термин "трансфицированный" или "трансформированный" или "трансдуцированный" относится к способу, посредством которого экзогенную нуклеиновую кислоту переносят или вводят в клетку-хозяина. "Трансфицированная" или "трансформированная" или "трансдуцированная" клетка представляет собой клетку, которая была трансфицирована, трансформирована или трансдуцирована экзогенной нуклеиновой кислотой. Клетка включает основную клетку-субъект и ее потомство.

Используемая в данном документе фраза "под контролем транскрипции" или "функционально связан" означает, что промотор находится в правильном месте и ориентации по отношению к полинуклеотиду для контроля инициации транскрипции с помощью РНК-полимеразы и экспрессии полинуклеотида.

"Вектор" представляет собой структуру, которая содержит изолированную нуклеиновую кислоту и которая может быть использована для доставки изолированной нуклеиновой кислоты внутрь клетки. В данной области известны многочисленные векторы, включая, но не ограничиваясь ими, линейные полинуклеотиды, полинуклеотиды, связанные с ионными или амфифильными соединениями, плазмиды и вирусы. Таким образом, термин "вектор" включает автономно реплицирующуюся плазмиду или вирус. Этот термин также должен быть истолкован как включающий неплазмидные и невирусные соединения, которые облегчают перенос нуклеиновой кислоты в клетки, такие как, например, полилизиновые соединения, липосомы и т.п. Примеры вирусных векторов включают, но не ограничиваясь ими, аденовирусные векторы, аденоассоциированные вирусные векторы, ретровирусные векторы и т.п.

Диапазоны: на всем протяжении этого документа различные аспекты данного изобретения могут быть представлены в формате диапазонов. Следует понимать, что описание в формате диапазонов дано только для удобства и краткости и не должно истолковываться как негибкое ограничение объема данного изобретения. Соответственно, описание диапазона следует рассматривать как конкретно раскрывающее все возможные поддиапазоны, а также отдельные числовые значения в этом диапазоне. Например, описание диапазона, такое как от 1 до 6, следует рассматривать как конкретно раскрывающее такие поддиапазоны как от 1 до 3, от 1 до 4, от 1 до 5, от 2 до 4, от 2 до 6, от 3 до 6 и т.д., а также отдельные значения в пределах этого диапазона, например, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 и 6. Это условие применимо независимо от ширины диапазона.

Описание

Данное изобретение предусматривает композиции и способы лечения рака, а также других заболеваний. Рак может представлять собой гематологическую злокачественную опухоль, солидную опухоль, первичную или метастазирующую опухоль. Композиции согласно данному изобретению включают пептиды, содержащие ТАСА-связывающий домен, молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, клетку, модифицированную для экспрессии пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен, и субстрат, содержащий пептид, нуклеиновую кислоту, клетку или их комбинацию.

Пептид

В одном воплощении данное изобретение предусматривает композицию, содержащую гибридный пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен. ТАСА-связывающий домен может содержать любой пептид, белок, лектин, фрагмент лектина, антитело, фрагмент антитела, малую молекулу, нуклеиновую кислоту и т.п., которые могут специфически связываться с ТАСА. Иллюстративные ТАСА и их партнеры по связыванию перечислены в таблице 1.

Иллюстративные ТАСА включают, но не ограничиваясь ими, β1,6-разветвление, Т-антиген, сиалил-Т-эпитопы, Tn-эпитопы, сиалил-Tn-эпитопы, α2,6-сиалилирование, сиалилирование, сиалил-Льюис^х/а, дисиалил-Льюис^х/а, сиалил-6-сульфо-Льюис^х, Globo Н, GD2, GD3, GM3 и фукозил-GM1.

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с N-гликаном. В некоторых воплощениях ТАСА-связывающий домен связывается с трех- и четырехантенным олигосахаридом. В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с β1,6GlcNAc-разветвленными N-гликанами. В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с Тn-эпитопами.

В некоторых воплощениях ТАСА-связывающий домен представляет собой пептидную последовательность, полученную из белка лектина. В некоторых воплощениях лектин выбран из группы, состоящей из следующих: лектин млекопитающего, человеческий лектин, растительный лектин, бактериальный лектин, вирусный лектин, лектин грибов и лектин простейших.

Например, в некоторых воплощениях ТАСА-связывающий домен получают из галектина, такого как галектин-1, галектин-2, галектин-3, галектин-4, галектин-5, галектин-6, галектин-7, галектин-8, галектин-9, галектин-10, галектин-11, галектин-12, галектин-13, галектин-14 и галектин-15; сиглека, такого как сиглек-1 (сиалоадгезия), сиглек-2 (CD22), сиглек-3 (CD33), сиглек-4 (миелин-ассоциированный гликопротеин), сиглек-5, сиглек-6, сиглек-7, сиглек-8, сиглек-9, сиглек-10, сиглек-11, сиглек-12, сиглек-13, сиглек-14, сиглек-15, сиглек-16, сиглек-17, сиглек Е, сиглек F, сиглек G и сиглек Н; селектина; лектина С-типа; CD301, L-PHA (лейкоагглютинина Phaseolus vulgaris leukoagglutinin); Е-РНА (эритроагглютинина Phaseolus vulgaris); лектина томата (лектин Lycopersicon esculentum, LEA); лектина арахиса (агглютинин Arachis hypogaea; PNA); картофельного лектина (лектина Solanum tuberosum), митогена фитолакки американской (лектина Phytolacca American), агглютинина зародышей пшеницы (лектина Triticum Vulgaris); лектина Artocarpus polyphemus (лектин джакалин); агглютинина Vicia villosa (WA); агглютинина Helix pomatia (НРА); агглютинина Wisteria floribunda (WFA); агглютинина Sambucus nigra (SNA), BC2LCM (лектина из грамотрицательных бактерий Burkholderia cenocepacia), лейкоагглютинина Maackia amurensis (MAL), лектина Psathyrella velutina (PVL), лектина Sclerotium rolfsii (SRL), агглютинина Eucheuma serra (ESA), CLEC17A (Пролектин), лектина Aleuria aurantia, лектина Sambucus sieboldiana (SSA), лектина Glechoma hederacea (Gleheda), агглютинина Morus nigra (Morniga G), лектина Salvia sclarea, лектина Salvia bogotensis, лектина Salvia horminum, лектина Clerodendrum trichotomum, лектина Molucella laevis, Griffonia simplicifolia (GsLA4), Psophocarpus tetragonolobus (кислотный WBAI), лектина Abrus precatorius, лектина Molucella laevis (MLL), лектина Amaranthus caudatus, лектина Amaranthus leucocarpus, лектина Laelia autumnalis, лектина Artocarpus integrifolia, лектина Madura pomifera, лектина Artocarpus lakoocha, агглютинина Dolichos biflorus, лектина Dolichos biflorus, лектина Glycine max и лектина Agaricus bisporus.

В некоторых воплощениях ТАСА-связывающий домен получен из фрагмента лектина. Например, в одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит фрагмент лектина, который сохраняет способность связываться с ТАСА.

В некоторых воплощениях ТАСА-связывающий домен содержит мутационный вариант лектина или его фрагмент. Например, в некоторых воплощениях мутационный вариант проявляет большую специфичность, повышенную аффинность связывания или уменьшенную олигомеризацию.

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен получен из L-PHA. Например, в одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 1, изображенную ниже:

SNDIYFNFQRFNETNLILQRDASVSSSGQLRLTNLNGNGEPRVGSLGRAFYSAPI QIWDNTTGTVASFATSFTFNIQVPNNAGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNS NFHTVAVEFDTLYNKDWDPTERHIGIDVNSIRSIKTTRWDFVNGENAEVLITYDSSTNLLV ASLVYPSQKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVSVGFSATTGINKGNVETNDVLSWSFASKLSDG TTSEGLNLANLVLNKIL (SEQ ID-NO 1).

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит мутантный L-PHA, где L-PHA усечен на остатках 1-5 для мономеризации молекулы. Например, в одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 2, показанную ниже:

FNFQRFNETNLILQRDASVSSSGQLRLTNLNGNGEPRVGSLGRAFYSAPIQIWDN TTGTVASFATSFTFNIQVPNNAGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTV AVEFDTLYNKDWDPTERHIGIDVNSIRSIKTTRWDFVNGENAEVLITYDSSTNLLVASLVY PSQKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVSVGFSATTGINKGNVETNDVLSWSFASKLSDGTTSEG LNLANLVLNKIL (SEQ ID NO 2)

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит мутантный L-PHA, где L-PHA мутирован для увеличения аффинности связывания. Например, в одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 3, показанную ниже:

ASQTSFSFQRFNETNLILQRDATVSSKGQLRLTNVNDNGEPTLSSLGRAFYSAPI QIWDNTTGAVAASPTSFTFNIDVPNNSGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNS NFHTVAVEFDTLYNKDWDPKPRHIGIDVNSIKSIKTTTWDFVKGENAEVLITYDSSTKLLVA SLVYPSLKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVIVGFTATTGITKGNVETNDILSWSFASKLSDGTTS EALNLANFALNQIL (SEQ ID NO 3)

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит мутантный L-PHA, где L-PHA мутирован для мономеризации молекулы и повышения аффинности связывания. Например, в одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 4, показанную ниже:

FSFQRFNETNLILQRDATVSSKGQLRLTNVNDNGEPTLSSLGRAFYSAPIQIWDN TTGAVAASPTSFTFNIDVPNNSGPADGLAFALVPVGSQPKDKGGFLGLFDGSNSNFHTV AVEFDTLYNKDWDPKPRHIGIDVNSIKSIKTTTWDFVKGENAEVLITYDSSTKLLVASLVYP SLKTSFIVSDTVDLKSVLPEWVIVGFTATTGITKGNVETNDILSWSFASKLSDGTTSEALNL ANFALNQIL (SEQ ID NO 4).

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с Тп-эпитопом и получен из VVA (изолектин В от Vicia villosa). Например, в одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 5, показанную ниже:

TESTSFSFTNFNPNQNNLILQEDALVNSAGTLELTAVAAGAPVPDSLGRALYAAPI HIHDNTTLASFTTSFSFVMAAPAAAAVADGLAFFLAPPDTQPQARGGFLGLFADRAHDAS YQTVAVEFDTYSNAWDPNYTHIGIDTNGIESKKTTPFDMVYGEKANIVITYQASTKALAAS LVFPVSQTSYAVSARVDLRDILPEYVRVGFSATTGLNAGWETHDIVSWSFAVSLA (SEQ ID NO 5).

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с Тп-эпитопом и содержит мутантный VVA (изолектин В от Vicia villosa), где VVA усечен на остатках 1-5 для мономеризации молекулы. Например, в одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 6, показанную ниже:

FSFTNFNPNQNNLILQEDALVNSAGTLELTAVAAGAPVPDSLGRALYAAPIHIHDN TTLASFTTSFSFVMAAPAAAAVADGLAFFLAPPDTQPQARGGFLGLFADRAHDASYQTV AVEFDTYSNAWDPNYTHIGIDTNGIESKKTTPFDMVYGEKANIVITYQASTKALAASLVFP VSQTSYAVSARVDLRDILPEYVRVG FSATTGLNAG WETH DIVSWSFAVSLA (SEQ ID NO 6).

В одном воплощении ТАСА-связывающий домен связывается с Тп-эпитопом и получен из CD301 (CLEC10A). Например, в одном воплощении ТАСА-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 7, показанную ниже:

QNSKFQRDLVTLRTDFSNFTSNTVAEIQALTSQGSSLEETIASLKAEVEGFKQER QAGVSELQEHTTQKAHLGHCPHCPSVCVPVHSEMLLRVQQLVQDLKKLTCQVATLNNN ASTEGTCCPVNWVEHQDSCYWFSHSGMSWAEAEKYCQLKNAHLWINSREEQNFVQK YLGSAYTWMGLSDPEGAWKWVDGTDYATGFQNWKPGQPDDWQGHGLGGGEDCAHF HPDGRWNDDVCQRPYHWVCEAGLGQTSQESH (SEQ ID NO 7).

В некоторых воплощениях указанный пептид содержит лидерную последовательность. Лидерная последовательность может функционировать для усиления трансляции пептида, нацеливания пептида на конкретную клеточную или внеклеточную локализацию или для направления секреции пептида. В одном воплощении указанный пептид содержит лидерную последовательность с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO 8, показанной ниже:

MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO 8).

В некоторых воплощениях указанная композиция содержит пептид, который связывается с ТАСА-связывающим доменом, описанным в данном документе. Например, в некоторых воплощениях указанная композиция содержит пептид, который связывается с полученным из лектина ТАСА-связывающим пептидом. Например, в одном воплощении указанная композиция содержит лектинсвязывающий домен, где лектинсвязывающий домен связывается с лектином или полученным из лектина пептидом, который связывается с ТАСА. Например, пептид, который связывается с ТАСА-связывающим доменом, представляет собой антитело или фрагмент антитела, который специфически связывается с ТАСА-связывающим доменом. В другом воплощении пептид, который связывается с ТАСА-связывающим доменом, может быть получен из ассоциированного ТАСА самого по себе.

В некоторых воплощениях указанная композиция содержит гибридный белок, содержащий один или более чем один ТАСА-связывающий домен, описанный в данном документе. Например, в одном воплощении гибридный белок содержит один или более чем один из ТАСА-связывающих доменов и один или более чем один из нацеливающих доменов, где нацеливающие домены могут направлять гибридный белок в конкретную клетку или область ткани. В одном воплощении гибридный белок содержит Fc-гибридный белок, содержащий один или более чем один из ТАСА-связывающих доменов, связанных с Fc-доменом антитела. В одном воплощении гибридный белок содержит биспецифическое антитело, содержащее один или более чем один из ТАСА-связывающих доменов. В одном воплощении гибридный белок содержит химерный рецептор антигена (CAR), содержащий один или более чем один из ТАСА-связывающих доменов.

В некоторых воплощениях указанная композиция содержит гибридный белок, содержащий один или более чем один из пептидов, которые связываются с ТАСА-связывающим доменом, описанным в данном документе. Например, в одном воплощении указанная композиция содержит гибридный белок, содержащий один или более чем один из лектинсвязывающих доменов, где лектинсвязывающие домены связываются с лектином, или полученный из лектина пептид, который связывается с ТАСА. Например, в одном воплощении указанный гибридный белок содержит один или более чем один из лектинсвязывающих доменов и один или более чем один из нацеливающих доменов, где нацеливающие домены могут направлять гибридный белок в конкретную клетку или область ткани. В одном воплощении указанный гибридный белок содержит Fc-гибридный белок, содержащий один или более чем один из лектинсвязывающих доменов, связанных с Fc-доменом антитела. В одном воплощении указанный гибридный белок содержит биспецифическое антитело, содержащее один или более чем один из лектинсвязывающих доменов. В одном воплощении указанный гибридный белок содержит химерный рецептор антигена (CAR), содержащий один или более чем один из лектинсвязывающих доменов.

В одном аспекте указанная композиция содержит пептид, обладающий двумя различными специфичностями связывания, и таким образом связывается с двумя различными антигенами. В одном воплощении пептид содержит первый домен распознавания антигена, который связывается с первым антигеном, и второй домен распознавания антигена, который связывается со вторым антигеном. В одном воплощении первый домен распознавания антигена представляет собой ТАСА-связывающий домен. Примеры ТАСА описаны в данном документе, все они могут быть мишенями пептида согласно данному изобретению.

В некоторых воплощениях второй домен распознавания антигена связывается с иммунной эффекторной клеткой. Иллюстративные иммунные эффекторные клетки включают, но не ограничиваясь ими, Т-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), Т-клетки натуральные киллеры (NKT), макрофаги, моноциты, дендритные клетки и нейтрофилы.

В одном воплощении второй домен распознавания антигена связывается с антигеном NK-клетки и упоминается в данном документе как домен, связывающий NK-клетку.

В одном воплощении второй домен распознавания антигена связывается с Т-клеточным антигеном и упоминается в данном документе как домен, связывающий Т-клетку.

В некоторых воплощениях указанный пептид содержит биспецифический пептид, имеющий ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий иммунную эффекторную клетку. В одном воплощении указанный пептид содержит биспецифический пептид, имеющий ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий NK-клетку. В одном воплощении указанный пептид содержит биспецифический пептид, имеющий ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий Т-клетку. В одном воплощении указанный биспецифический пептид содержит человеческое антитело, гуманизированное антитело или его фрагменты. В некоторых воплощениях указанный биспецифический пептид содержит лектин, фрагмент лектина или его мутант.

В некоторых воплощениях указанный пептид содержит домен, связывающий иммунную эффекторную клетку. Например, в одном воплощении указанный домен, связывающий иммунную эффекторную клетку, содержит пептид, белок, антитело или фрагмент антитела, который связывается с биомолекулой, присутствующей на иммунной эффекторной клетке.

В некоторых воплощениях указанный пептид содержит домен, связывающий NK-клетку. Например, в одном воплощении указанный домен, связывающий NK-клетку, содержит пептид, белок, антитело или фрагмент антитела, который связывается с биомолекулой, присутствующей на NK-клетке. Иллюстративные молекулы NK-клеток, с которыми может связываться домен, связывающий NK-клетку, включают, но не ограничиваясь ими, CD16 и NKG2D.

В некоторых воплощениях указанный пептид содержит домен, связывающий Т-клетку. Например, в одном воплощении домен, связывающий Т-клетку, содержит пептид, белок, антитело или фрагмент антитела, который связывается с биомолекулой, присутствующей на Т-клетке. Иллюстративные молекулы Т-клеток, с которыми может связываться домен, связывающий Т-клетку, включают, но не ограничиваясь ими, CD3, Т-клеточный рецептор, CD2, CD28 и CD25. В одном воплощении указанный домен, связывающий Т-клетку, содержит пептид, белок, антитело или фрагмент антитела, который связывается с CD3 на Т-клетке.

В одном воплощении указанный домен, связывающий Т-клетку, содержит фрагмент антитела, который специфически связывается с CD3. Например, в одном воплощении указанный домен, связывающий Т-клетку, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 9, показанную ниже:

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPS RGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQG TTLTVSSVEGGSGGSGGSGGSGGVDDIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMN WYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWS SNPLTFGAGTKLELK (SEQ ID NO 9).

В одном воплощении указанный пептид содержит ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий Т-клетку. В некоторых случаях указанный пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий Т-клетку, упоминается как гликанозависимый рекрутер Т-клеток (GlyTR).

В некоторых воплощениях указанный пептид содержит линкерный домен между ТАСА-связывающим доменом и доменом, связывающим иммунную эффекторную клетку. Линкерный домен может иметь любой подходящий размер или последовательность. Например, в одном воплощении линкерный домен содержит аминокислотную последовательность GGGGS (SEQ ID NO 10).

В одном воплощении указанный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 или SEQ ID NO 17 (изображенную в примере 2). В некоторых воплощениях указанный пептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 или SEQ ID NO 17 без С-концевой His-метки, содержащейся в нем. Другие иллюстративные пептиды включают те, которые перечислены в таблице 2. Тем не менее, данное изобретение не ограничено каким-либо конкретным ТАСА-связывающим доменом, доменом, связывающим иммунную эффекторную клетку, доменом, связывающим NK-клетку, или доменом, связывающим Т-клетку. Скорее, может быть использован любой ТАСА-связывающий домен, домен, связывающий иммунную эффекторную клетку, домен, связывающий NK-клетку, домен, связывающий Т-клетку, или их комбинация.

В одном воплощении указанный пептид композиции представляет собой химерный антигенный рецептор (CAR), содержащий ТАСА-связывающий домен, описанный в данном документе. В некоторых воплощениях CAR также содержит один или более чем один из шарнирного домена, трансмембранного домена, цитоплазматического домена, костимулирующего домена или дзета-цепи. CAR, включая их трансмембранные и цитоплазматические домены, подробно описаны, например, в публикациях патентных заявок США №№US 2013/0287748, US 2014/0370017, US 2014/0099309 и US 2014/0271635, которые включены посредством ссылки во всей их полноте. Например, в некоторых воплощениях CAR содержит цитоплазматический домен, содержащий костимулирующий домен. Указанный костимулирующий домен включает внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующие молекулы являются молекулами клеточной поверхности, отличающимися от рецепторов антигенов или их лигандов, которые необходимы для эффективного ответа лимфоцитов на антиген.

Предпочтительные примеры внутриклеточных сигнальных доменов для использования в CAR согласно данному изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторы, которые действуют сообща, чтобы инициировать трансдукцию сигнала после взаимодействия рецептора с антигеном, а также с любым производным или вариантом этих последовательностей и любой синтетической последовательностью, которая имеет такую же функциональную способность.

Известно, что сигналы, образующиеся через один TCR, недостаточны для полной активации Т-клетки, и что необходим вторичный или костимулирующий сигнал. Таким образом, активация Т-клеток может быть опосредована двумя различными классами цитоплазматической сигнальной последовательности: теми, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и теми, которые действуют антигеннезависимым образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности).

Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности регулируют первичную активацию комплекса TCR либо стимулирующим образом, либо ингибирующим образом. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как активирующие мотивы иммунорецепторов на основе тирозина, или ITAM (immunoreceptor tyrosine-based activation motif).

Примеры ITAM, содержащие первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые, в частности, могут быть использованы в данном изобретении, включают те, которые получены из TCR дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. Особенно предпочтительно, чтобы цитоплазматическая сигнальная молекула в CAR согласно данному изобретению содержала цитоплазматическую сигнальную последовательность, полученную из CD3-дзета.

В предпочтительном воплощении цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован так, чтобы содержать сигнальный домен CD3-дзета сам по себе или в сочетании с любым другим нужным цитоплазматическим доменом (доменами), полезным в контексте CAR согласно данному изобретению. Например, цитоплазматический домен CAR может содержать часть дзета-цепи CD3 и костимулирующую сигнальную область. Костимулирующая сигнальная область относится к части CAR, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от рецептора антигена или его лигандов, которая необходима для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают CD27, CD28, 4-1 ВВ (CD137), ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, ассоциированный с лимфоцитами антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3 и лиганд, который специфически связывается с CD83 и т.п.

Пептид согласно данному изобретению может быть получен с использованием химических способов. Например, пептиды можно синтезировать твердофазными методиками (Roberge J Y et al., 1995) Science 269: 202-204), отщепить из смолы и очистить путем препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Автоматический синтез может быть проведен, например, с использованием пептидного синтезатора ABI 431 A (Perkin Elmer) в соответствии с инструкциями производителя.

Данное изобретение также должно быть истолковано как включающее любую форму пептида, имеющего существенную гомологию с описанным в данном документе пептидом. Предпочтительно, пептид, который является "по существу гомологичным", является примерно на 50% гомологичным, более предпочтительно примерно на 70% гомологичным, еще более предпочтительно примерно на 80% гомологичным, более предпочтительно примерно на 90% гомологичным, еще более предпочтительно примерно на 95% гомологичным и даже более предпочтительно примерно на 99% гомологичным аминокислотной последовательности пептида, описанного в данном документе пептида.

В некоторых воплощениях данное изобретение содержит пептид, который является примерно на 50% гомологичным, примерно на 70% гомологичным, примерно на 80% гомологичным, примерно на 90% гомологичным, примерно на 95% гомологичным или примерно на 99% гомологичным любой из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO 1-17.

Альтернативно, пептид может быть получен рекомбинантным путем или путем расщепления более длинного полипептида. Состав пептида может быть подтвержден аминокислотным анализом или секвенированием.

Варианты пептидов согласно данному изобретению могут быть (i) такими, в которых один или более чем один из аминокислотных остатков замещен консервативным или неконсервативным аминокислотным остатком (предпочтительно консервативным аминокислотным остатком), и такой замещенный аминокислотный остаток может быть или не быть таким, который закодирован генетическим кодом, (ii) такими, в которых есть один или более чем один из модифицированных аминокислотных остатков, например, остатков, модифицированных присоединением групп заместителей, (iii) такими, в которых пептид представляет собой вариант альтернативного сплайсинга пептида согласно данному изобретению, (iv) фрагментами пептидов и/или (v) такими, в которых пептид слит с другим пептидом, таким как лидерная или секреторная последовательность или последовательность, которая используется для очистки (например, His-метка) или для обнаружения (например, Sv5-эпитопная метка). Указанные фрагменты включают пептиды, полученные путем протеолитического расщепления (включая многосайтовый протеолиз) исходной последовательности. Варианты могут быть посттрансляционно или химически модифицированными. Считается, что такие варианты находятся в пределах компетенции специалистов в данной области.

Как известно в данной области, "сходство" двух пептидов определяют путем сравнения аминокислотной последовательности и ее консервативных аминокислотных заместителей одного полипептида с последовательностью второго полипептида. Варианты определяют как включающие пептидные последовательности, отличающиеся от исходной последовательности, предпочтительно отличающиеся от исходной последовательности менее чем на 40% остатков в интересующем сегменте, более предпочтительно отличающиеся от исходной последовательности менее чем на 25% остатков в интересующем сегменте, более предпочтительно отличающиеся менее чем на 10% остатков в интересующем сегменте, наиболее предпочтительно отличающиеся от исходной последовательности белка лишь несколькими остатками в интересующем сегменте, и в то же время обладающие гомологией с исходной последовательностью, достаточной для сохранения функциональности исходной последовательности и/или способности связываться с ТАСА. Данное изобретение включает аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 60%, 65%, 70%, 72%, 74%, 76%, 78%, 80%, 90% или 95% аналогичны или идентичны исходной аминокислотной последовательности. Степень идентичности двух пептидов определяют с использованием компьютерных алгоритмов и способов, которые широко известны специалистам в данной области. Идентичность двух аминокислотных последовательностей предпочтительно определяют с использованием алгоритма BLASTP [BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990)].

Пептиды согласно данному изобретению могут подвергаться посттрансляционной модификации. Например, посттрансляционные модификации, подпадающие под объем данного изобретения, включают отщепление сигнального пептида, гликозилирование, ацетилирование, изопренилирование, протеолиз, миристоилирование, фолдинг белка и протеолитическую обработку и т.д. Некоторые модификации или события процессинга требуют введения дополнительного биологического оборудования. Например, такие события процессинга, как отщепление сигнального пептида и гликозилирование ядра, исследуют путем добавления собачьих микросомальных мембран или яичных экстрактов Xenopus (патент США №6103889) к стандартной реакции трансляции.

Пептиды согласно данному изобретению могут включать неприродные аминокислоты, образованные путем посттрансляционной модификации или путем введения неприродных аминокислот в ходе трансляции. Существует множество подходов для введения неприродных аминокислот в ходе трансляции белка.

Пептид или белок согласно данному изобретению может быть конъюгирован с другими молекулами, такими как белки, с образованием гибридных белков. Это может быть достигнуто, например, путем синтеза N-концевых или С-концевых гибридных белков при условии, что полученный гибридный белок сохраняет функциональность указанного пептида.

Пептид или белок согласно данному изобретению могут быть фосфорилированы с использованием стандартных способов, таких как способ, описанный в Reedijk et al. (The EMBO Journal 11 (4): 1365, 1992).

Циклические производные пептидов согласно данному изобретению также являются частью данного изобретения. Циклизация может позволить пептиду принимать конформацию, более благоприятную для связывания с другими молекулами. Циклизация может быть достигнута с помощью методик, известных в данной области. Например, могут формироваться дисульфидные связи между двумя соответствующими разделенными компонентами, имеющими свободные сульфгидрильные группы, или может быть образована амидная связь между аминогруппой одного компонента и карбоксильной группой другого компонента. Циклизация также может быть достигнута с помощью азобензолсодержащей аминокислоты, как описано в Ulysse, L, et al., J. Am. Chem. Soc. 1995, 117, 8466-8467. Компоненты, которые формируют связи, могут быть боковыми цепями аминокислот, неаминокислотными компонентами или их комбинацией. В одном воплощении данного изобретения циклические пептиды могут содержать бета-изгиб в правой позиции. Бета-изгибы могут быть введены в пептиды согласно данному изобретению путем добавления аминокислот Pro-Gly в правой позиции.

Может быть желательным получить циклический пептид, который является более гибким, чем циклические пептиды, содержащие пептидные связи, описанные выше. Более гибкий пептид может быть получен путем введения цистеинов в правой и левой позиции пептида и формирования дисульфидного мостика между двумя цистеинами. Два цистеина располагают таким образом, чтобы не деформировать бета-складчатость и изгиб. Пептид является более гибким в результате длины дисульфидной связи и меньшего числа водородных связей в бета-складчатой части. Относительная гибкость циклического пептида может быть определена с помощью моделирования молекулярной динамики.

Данное изобретение также относится к пептидам, слитым или интегрированным в белок-мишень и/или нацеливающий домен, способный направлять химерный белок к нужному клеточному компоненту или типу клеток или ткани. Химерные белки также могут содержать дополнительные аминокислотные последовательности или домены. Химерные белки являются рекомбинантными в том смысле, что различные компоненты получены из разных источников и как таковые не встречаются вместе в природе (т.е. гетерологичны).

В одном воплощении нацеливающий домен может быть доменом, который охватывает мембрану, доменом, который связывает мембрану, или последовательностью, направляющей белок для связывания, например, с везикулами или с ядром. В одном воплощении нацеливающий домен может нацеливать пептид в конкретный тип клетки или ткань. Например, нацеливающий домен может быть клеточным поверхностным лигандом или антителом против клеточных поверхностных антигенов ткани-мишени (например, кости, регенерирующей кости, дегенерирующей кости, хряща). Нацеливающий домен может нацеливать пептид согласно данному изобретению на клеточный компонент.

Пептид согласно данному изобретению может быть синтезирован с помощью стандартных методик. Например, пептиды или химерные белки могут быть синтезированы путем химического синтеза с использованием твердофазного пептидного синтеза. Эти способы используют способы твердофазного синтеза или синтеза в растворе (см., например, J. М. Stewart, and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2^nd Ed., Pierce Chemical Co., Rockford III. (1984), и G. Barany and R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis Synthesis, Biology editors E. Gross and J. Meienhofer Vol. 2 Academic Press, New York, 1980, pp. 3-254 для методик твердофазного синтеза; и М Bodansky, Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin 1984, и E. Gross and J. Meienhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, suprs, Vol 1, для классического синтеза в растворе). В качестве примера пептид согласно данному изобретению может быть синтезирован путем твердофазной химической реакции с использованием 9-флуоренилметоксикарбонила (Fmoc) с прямым встраиванием фосфотреонина в виде производного N-флуоренилметоксикарбонил-O-бензил-L-фосфотреонина.

Слитые на N-конце или С-конце гибридные белки, содержащие пептид или химерный белок согласно данному изобретению, конъюгированные с другими молекулами, могут быть получены путем слияния с помощью рекомбинантных методик N-конца или С-конца пептида или химерного белка и последовательности выбранного белка или селективного маркера с требуемой биологической функцией. Полученные гибридные белки содержат пептид согласно данному изобретению, слитый с выбранным белком или маркерным белком, описанным в данном документе. Примеры белков, которые могут быть использованы для получения гибридных белков, включают иммуноглобулины, глутатион-S-трансферазу (GST), гемагглютинин (НА) и усеченный myc.

Пептиды согласно данному изобретению могут быть разработаны с использованием системы биологической экспрессии. Использование этих систем позволяет создавать большие библиотеки случайных пептидных последовательностей и проводить скрининг этих библиотек на пептидные последовательности, которые связываются с конкретными белками. Библиотеки могут быть получены путем клонирования синтетической ДНК, которая кодирует случайные пептидные последовательности в соответствующие экспрессионные векторы (см. Christian et al 1992, J. Mol. Biol. 227:711; Devlin et al, 1990 Science 249:404; Cwirla et al 1990, Proc. Natl. Acad, Sci. USA, 87:6378). Библиотеки также могут быть созданы путем одновременного синтеза перекрывающихся пептидов (см. патент США №4708871).

Пептиды и химерные белки согласно данному изобретению могут быть превращены в фармацевтические соли путем взаимодействия с неорганическими кислотами, такими как хлористоводородная кислота, серная кислота, бромистоводородная кислота, фосфорная кислота и т.д., или с органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, янтарная кислота, яблочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, бензойная кислота, салициловая кислота, бензенсульфоновая кислота и толуолсульфоновые кислоты.

Нуклеиновая кислота

В одном воплощении данное изобретение предусматривает композицию, содержащую изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, описанный в данном документе.

В одном воплощении изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует ТАСА-связывающий домен. В некоторых воплощениях изолированная нуклеиновая кислота включает последовательность, кодирующую пептид, полученный из лектина, включая, например, галектин, такой как галектин-1, галектин-2, галектин-3, галектин-4, галектин-5, галектин-6, галектин-7, галектин-8, галектин-9, галектин-10, галектин-11, галектин-12, галектин-13, галектин-14 и галектин-15; сиглек, такой как сиглек-1 (сиалоадгезия), сиглек-2 (CD22), сиглек-3 (CD33), сиглек-4 (миелин-ассоциированный гликопротеин), сиглек-5, сиглек-6, сиглек-7, сиглек-8, сиглек-9, сиглек-10, сиглек-11, сиглек-12, сиглек-13, сиглек-14, сиглек-15, сиглек-16, сиглек-17, сиглек Е, сиглек F, сиглек G и сиглек Н; селектин; лектин С-типа; CD301, L-PHA (лейкоагглютинин Phaseolus vulgaris); Е-РНА (эритроагглютинин Phaseolus vulgaris); лектин томата (лектин Lycopersicon esculentum, LEA); лектин арахиса (агглютинин Arachis hypogaea; PNA); картофельный лектин (лектин Solanum tuberosum), митоген фитолакки американской (лектин Phytolacca American), агглютинин зародышей пшеницы (лектин Triticum Vulgaris); лектин Artocarpus polyphemus (лектин джакалин); агглютинин Vicia villosa (WA); агглютинин Helix pomatia (НРА); агглютинин Wisteria floribunda (WFA); агглютинин Sambucus nigra (SNA), BC2LCM (лектин из грамотрицательных бактерий Burkholderia cenocepacia), лейкоагглютинин Maackia amurensis (MAL), Psathyrella velutina (PVL), лектин Sclerotium rolfsii (SRL), агглютинин Eucheuma serra (ESA), CLEC17A (Пролектин), лектин Aleuria aurantia, лектин Sambucus sieboldiana (SSA), лектин Glechoma hederacea (Gleheda), агглютинин Morus nigra (Morniga G), лектин Salvia sclarea, лектин Salvia bogotensis, лектин Salvia horminum, лектин Clerodendrum trichotomum, лектин Moluccella laevis, Griffonia simplicifolia (GsLA4), Psophocarpus tetragonolobus (кислотный WBAI), лектин Abrus precatorius, лектин Moluccella laevis (MLL), лектин Amaranthus caudatus, лектин Amaranthus leucocarpus, лектин Laelia autumnalis, лектин Artocarpus integrifolia, лектин Madura pomifera, лектин Artocarpus lakoocha, агглютинин Dolichos biflorus, лектин Dolichos biflorus, лектин Glycine max и лектин Agaricus bisporus.

Например, в различных воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует ТАСА-связывающий домен, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 или SEQ ID NO 7.

В некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует лидерную последовательность. Например, в некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует лидерную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO 8.

В некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует домен, связывающий Т-клетку. Например, в некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует домен, связывающий Т-клетку, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO 9.

В некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий Т-клетку. Например, в некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 или SEQ ID NO 17. В некоторых воплощениях изолированная нуклеиновая кислота кодирует пептид, содержащий аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16 или SEQ ID NO 17 без С-концевой His-метки, содержащейся в ней.

В одном воплощении изолированная последовательность нуклеиновой кислоты включает нуклеотидную последовательность SEQ ID NO 18.

В некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует CAR, содержащий ТАСА-связывающий домен. В некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует CAR, содержащий ТАСА-связывающий домен и один или более чем один домен из трансмембранного домена и цитоплазматического домена.

Кроме того, данное изобретение охватывает изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, имеющий существенную гомологию с описанным в данном документе пептидом. В некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты кодирует пептид, обладающий по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологией последовательности с аминокислотной последовательностью, выбранной среди SEQ ID NO 1-17.

Кроме того, данное изобретение охватывает изолированную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, обладающий существенной гомологией с описанной в данном документе нуклеотидной последовательностью. В некоторых воплощениях изолированная последовательность нуклеиновой кислоты обладает по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% гомологией последовательности с SEQ ID NO 18.

Изолированная последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид согласно данному изобретению, может быть получена с использованием любого из множества рекомбинантных способов, известных в данной области, например, путем скрининга библиотек на предмет клеток, экспрессирующих указанный ген, путем получения указанного гена из вектора, о котором известно, что он его включает, или путем выделения его непосредственно из клеток и тканей, содержащих его, с использованием стандартных методик. Альтернативно, представляющий интерес ген может быть получен синтетически, а не клонирован.

Изолированная нуклеиновая кислота может содержать любой тип нуклеиновой кислоты, включая, но не ограничиваясь ими, ДНК и РНК. Например, в одном воплощении указанная композиция содержит изолированную молекулу ДНК, включая, например, изолированную молекулу кДНК, кодирующую пептид согласно данному изобретению или его функциональный фрагмент. В одном воплощении композиция содержит изолированную молекулу РНК, кодирующую пептид согласно данному изобретению или его функциональный фрагмент.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно данному изобретению могут быть модифицированы для улучшения стабильности в сыворотке или в среде для роста клеточных культур. Могут быть добавлены модификации для повышения стабильности, функциональности и/или специфичности и для минимизации иммуностимулирующих свойств молекулы нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению. Например, для повышения стабильности 3'-остатки могут быть стабилизированы против деградации, например, они могут быть выбраны так, чтобы они состояли из пуриновых нуклеотидов, в частности, аденозиновых или гуанозиновых нуклеотидов. Альтернативно, замещение пиримидиновых нуклеотидов модифицированными аналогами, например, замещение уридина 2'-дезокситимидином, допускается и не влияет на функцию молекулы.

В одном воплощении данного изобретения указанная молекула нуклеиновой кислоты может содержать по меньшей мере один модифицированный нуклеотидный аналог. Например, концы могут быть стабилизированы путем введения модифицированных нуклеотидных аналогов.

Неограничивающие примеры нуклеотидных аналогов включают рибонуклеотиды, модифицированные сахаром и/или модифицированные в каркасе (т.е. включают модификации фосфатно-сахарного каркаса). Например, фосфодиэфирные связи природной РНК могут быть модифицированы таким образом, чтобы включать по меньшей мере один из гетероатомов азота или серы. В предпочтительных модифицированных в каркасе рибонуклеотидах фосфоэфирная группа, соединяющаяся соседние рибонуклеотиды, замещена модифицированной группой, например, фосфотиоатной группой. В предпочтительных модифицированных сахаром рибонуклеотидах 2'-ОН-группа заменена группой, выбранной среди Н, OR, R, галогена, SH, SR, NH₂, NHR, NR₂ или ON, где R представляет собой С₁-С₆-алкил, -алкенил или -алкинил, а галоген представляют собой F, Cl, Br или I.

Другими примерами модификаций являются рибонуклеотиды, модифицированные по нуклеотидным основаниям, т.е. рибонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одно неприродное нуклеотидное основание вместо природного нуклеотидного основания. Основания могут быть модифицированы для блокирования активности аденозиндезаминазы. Иллюстративные модифицированные нуклеотидные основания включают, но не ограничиваясь ими, уридин и/или цитидин, модифицированный в 5-позиции, например 5-(2-амино)пропилуридин, 5-бромуридин; аденозин и/или гуанозины, модифицированные в позиции 8, например, 8-бромгуанозин; деаза-нуклеотиды, например, 7-дезаза-аденозин; О- и N-алкилированные нуклеотиды, например N6-метиладенозин. Следует отметить, что вышеуказанные модификации могут быть объединены.

В некоторых случаях молекула нуклеиновой кислоты содержит по меньшей мере одну из следующих химических модификаций: модификацию 2'-Н, 2'-O-метил или 2'-ОН одного или более чем одного из нуклеотидов. В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению может иметь повышенную устойчивость к нуклеазам. Для повышения устойчивости к нуклеазам молекула нуклеиновой кислоты может включать, например, 2'-модифицированные рибозные звенья и/или фосфоротиоатные связи. Например, 2'-гидроксильная группа (ОН) может быть модифицирована или заменена рядом различных "окси"- или "дезокси"-заместителями. Для повышения устойчивости к нуклеазам молекулы нуклеиновых кислот согласно данному изобретению могут включать 2'-O-метил, 2'-фтор, 2'-O-метоксиэтил, 2'-O-аминопропил, 2'-амино и/или фосфоротиоатные связи. Включение закрытых нуклеиновых кислот (locked nucleic acid, LNA), этиленовых нуклеиновых кислот (ethylene nucleic acids, ENA), например, нуклеиновых кислот с 2'-4'-этилен-мостиковой связью, и некоторых модификаций нуклеотидных оснований, таких как 2-амино-А, 2-тио (например, 2-тио-U), модификации G-зажима, также могут увеличить аффинность связывания с мишенью.

В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты включает 2'-модифицированный нуклеотид, например 2'-дезокси, 2'-дезокси-2'-фтор, 2'-O-метил, 2'-O-метоксиэтил (2'-O-МОЕ), 2'-O-аминопропил (2'-O-АР), 2'-O-диметиламиноэтил (2'-O-DMAOE), 2'-O-диметиламинопропил (2'-O-DMAP), 2'-O-диметиламиноэтилоксиэтил (2'-O-DMAEOE) или 2'-ON-метилацетамидо (2'-O-NMA). В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты включает по меньшей мере один 2'-O-метил-модифицированный нуклеотид, и в некоторых воплощениях все нуклеотиды в молекуле нуклеиновой кислоты включают 2'-O-метильную модификацию.

В некоторых воплощениях молекула нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению предпочтительно имеет одно или более чем одно из следующих свойств:

Нуклеиновокислотные агенты, обсуждаемые в данном документе, включают немодифицированную РНК и ДНК, а также РНК и ДНК, которые были модифицированы, например, для улучшения эффективности, и полимеры нуклеозидных суррогатов. Немодифицированная РНК относится к молекуле, в которой компоненты нуклеиновой кислоты, а именно сахара, основания и фосфатные группировки, являются такими же или по существу такими же, как те, которые находятся в природе, предпочтительно такими же, как природные в организме человека. Данная область относится к редким или необычным, но встречающимся в природе РНК, таким как модифицированные РНК, см., например, Limbach et al. (Nucleic Acids Res., 1994, 22: 2183-2196). Такие редкие или необычные РНК, часто называемые модифицированными РНК, как правило, являются результатом посттранскрипционной модификации и входят в термин "немодифицированная РНК", используемый в данном документе. Термин "модифицированная РНК", используемый в данном документе, относится к молекуле, в которой один или более чем один из компонентов нуклеиновой кислоты, а именно из сахаров, оснований и фосфатных группировок, отличается от того, который встречается в природе, предпочтительно отличается от того, который встречается в организме человека. Хотя они называются "модифицированными РНК", они, конечно, будут из-за модификации включать молекулы, которые, строго говоря, не являются РНК. Нуклеозидные суррогаты представляют собой молекулы, в которых рибофосфатный каркас заменен нерибофосфатной конструкцией, которая позволяет вводить основания, которые должны присутствовать, в правильной пространственной связи, так что гибридизация по существу аналогична той, которая наблюдается с рибофосфатным каркасом, например, незаряженные аналоги основной цепи рибофосфата.

Модификации нуклеиновой кислоты согласно данному изобретению могут присутствовать в одном или более чем одном звене, выбранном среди фосфатной группы, сахарной группы, каркаса, N-конца, С-конца или нуклеотидного основания.

Данное изобретение также включает вектор, в который введена изолированная нуклеиновая кислота согласно данному изобретению. Данная область изобилует подходящими векторами, которые могут быть использованы в данном изобретении.

Вкратце, экспрессия природных или синтетических нуклеиновых кислот, кодирующих пептид согласно данному изобретению, обычно достигается путем функционального связывания нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или его части, с промотором и путем включения конструкции в экспрессионный вектор. Используемые векторы пригодны для репликации и, возможно, для интеграции в эукариотические клетки. Типичные векторы содержат терминаторы транскрипции и трансляции, последовательности инициации и промоторы, которые могут быть использованы для регуляции экспрессии нужной последовательности нуклеиновой кислоты.

Векторы согласно данному изобретению также могут быть использованы для иммунизации нуклеиновыми кислотами и генной терапии с использованием стандартных протоколов доставки генов. Способы доставки генов известны в данной области. См., например, патенты США №№5399346, 5580859, 5589466, включенные в данный документ посредством ссылки в полном объеме. В другом воплощении данное изобретение предусматривает вектор для генной терапии.

Изолированную нуклеиновую кислоту согласно данному изобретению можно клонировать в несколько типов векторов. Например, нуклеиновую кислоту можно клонировать в вектор, включающий, но не ограничиваясь ими, плазмиду, фагмиду, производное фага, вирус животного и космиду. Векторы, представляющие особый интерес, включают экспрессионные векторы, векторы репликации, векторы для создания зондов и векторы для секвенирования.

Кроме того, указанный вектор может быть предоставлен клетке в форме вирусного вектора. Технология вирусных векторов хорошо известна в данной области и описана, например, в Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), а также в других руководствах по вирусологии и молекулярной биологии. Вирусы, которые могут быть использованы в качестве векторов, включают, но не ограничиваясь ими, ретровирусы, аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса и лентивирусы. В целом, подходящий вектор содержит сайт начала репликации, функционирующий по меньшей мере в одном организме, промоторную последовательность, удобные рестрикционные сайты эндонуклеаз и один или более чем один из селектируемых маркеров (например, WO 01/96584, WO 01/29058 и патент США №6326193).

Был разработан ряд систем на основе вирусов для переноса генов в клетки млекопитающих. Например, ретровирусы предоставляют удобную платформу для систем доставки генов. Селектируемый ген может быть вставлен в вектор и упакован в ретровирусные частицы с использованием методик, известных в данной области. Рекомбинантный вирус затем может быть выделен и доставлен в клетки субъекта in vivo или ex vivo. В данной области известен ряд ретровирусных систем. В некоторых воплощениях используются аденовирусные векторы. В данной области известен ряд аденовирусных векторов. В одном воплощении используются лентивирусные векторы.

Например, векторы, полученные из ретровирусов, таких как лентивирус, являются подходящими инструментами для достижения долгосрочного переноса генов, поскольку они делают возможной долговременную стабильную интеграцию трансгена и его размножение в дочерних клетках. Лентивирусные векторы обладают дополнительным преимуществом по сравнению с векторами, полученными из онкоретровирусов, таких как вирусы лейкемии мыши, в том, что они могут трансдуцировать непролиферирующие клетки, такие как гепатоциты. Они также обладают дополнительным преимуществом низкой иммуногенности. В одном воплощении указанная композиция включает вектор, полученный из аденоассоциированного вируса (AAV). Векторы на основе аденоассоциированных вирусов (AAV) стали мощными инструментами доставки генов для лечения различных нарушений. AAV-векторы обладают рядом особенностей, которые делают их идеально подходящими для генной терапии, включая отсутствие патогенности, минимальную иммуногенность и способность трансформировать постмитотические клетки стабильным и эффективным образом. Экспрессия конкретного гена, содержащегося в AAV-векторе, может быть специфически нацелена на один или более чем один тип клеток за счет выбора подходящей комбинации серотипа AAV, промотора и способа доставки.

В некоторых воплощениях вектор дополнительно включает стандартные контрольные элементы, которые функционально связаны с трансгеном способом, который позволяет его транскрибировать, трансформировать и/или экспрессировать в клетке, трансфицированной плазмидным вектором или инфицированной вирусом, полученным согласно данному изобретению. Используемые в данном документе "функционально связанные" последовательности включают как последовательности контроля экспрессии, смежные с геном, представляющим интерес, так и последовательности контроля экспрессии, которые действуют в трансрасположении или на расстоянии от контролируемого гена, представляющего интерес. Последовательности контроля экспрессии включают соответствующие последовательности инициации транскрипции, терминации, промотора и энхансера; эффективные сигналы процессинга РНК, такие как сигналы сплайсинга и полиаденилирования (polyA); последовательности, которые стабилизируют цитоплазматическую мРНК; последовательности, которые повышают эффективность трансляции (т.е. консенсусная последовательность Козака); последовательности, которые повышают стабильность белка; и, при необходимости, последовательности, которые усиливают секрецию закодированного продукта. В данной области известно и может быть использовано множество последовательностей контроля экспрессии, включая промоторы, которые являются нативными, конститутивными, индуцируемыми и/или тканеспецифическими.

Дополнительные промоторные элементы, например энхансеры, регулируют частоту инициации транскрипции. Как правило, они расположены в области 30-110 п.о. вверх от старт-кодона, хотя недавно было показано, что ряд промоторов содержит функциональные элементы ниже старт-кодона. Расстояние между промоторными элементами часто является гибким, так что функция промотора сохраняется, когда элементы инвертируются или перемещаются относительно друг друга. В промоторе тимидинкиназы (thymidine kinase, tk) расстояние между промоторными элементами может быть увеличено до 50 п.о., прежде чем активность начнет снижаться. В зависимости от промотора, по-видимому, отдельные элементы могут функционировать либо совместно, либо независимо для активации транскрипции.

Одним из примеров подходящего промотора является последовательность немедленного раннего промотора цитомегаловируса (cytomegalovirus, CMV). Эта промоторная последовательность представляет собой сильную конститутивную промоторную последовательность, способную стимулировать высокие уровни экспрессии любой полинуклеотидной последовательности, функционально связанной с ней. Другим примером подходящего промотора является фактор элонгации 1α (EF-1α). Тем не менее, также могут быть использованы другие конститутивные промоторные последовательности, включая, но не ограничиваясь ими, ранний промотор обезьяньего вируса 40 (simian virus 40, SV40), вирус мышиной опухоли молочной железы (mouse mammary tumor virus, MMTV), промотор длинного концевого повтора (long terminal repeat, LTR) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ, human immunodeficiency virus, HIV), промотор MoMuLV, промотор вируса птичьего лейкоза, немедленный ранний промотор вируса Эпштейна-Барр, промотор вируса саркомы Рауса, а также промоторы человеческих генов, такие как промотор актина, промотор миозина, промотор гемоглобина и промотор креатинкиназы. Кроме того, данное изобретение не следует ограничивать использованием конститутивных промоторов. Индуцируемые промоторы также рассматриваются как часть данного изобретения. Использование индуцибельного промотора предусматривает молекулярный переключатель, позволяющий включать экспрессию полинуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, когда такая экспрессия желательна, или выключать экспрессию, когда экспрессия нежелательна. Примеры индуцируемых промоторов включают, но не ограничиваясь ими, промотор металлотионина, промотор глюкокортикоидов, промотор прогестерона и промотор тетрациклина.

Энхансерные последовательности, находящиеся в векторе, также регулируют экспрессию содержащегося в нем гена. Как правило, энхансеры связаны с белковыми факторами для усиления транскрипции гена. Энхансеры могут располагаться выше или ниже регулируемого ими гена. Энхансеры также могут быть тканеспецифичными для усиления транскрипции в определенном типе клеток или ткани. В одном воплощении вектор согласно данному изобретению содержит один или более чем один энхансер для усиления транскрипции гена, присутствующего в векторе.

Для оценки экспрессии пептида экспрессионный вектор, который должен быть введен в клетку, также может содержать либо селектируемый маркерный ген, либо репортерный ген, либо оба, чтобы облегчить идентификацию и выбор экспрессирующих клеток из популяции клеток, которые были подвергнуты трансфекции или инфицированы вирусными векторами. В других аспектах селектируемый маркер может быть перенесен на отдельный фрагмент ДНК и использован в процедуре совместной трансфекции. Как селектируемый маркер, так и репортерные гены могут быть фланкированы соответствующими регуляторными последовательностями для обеспечения экспрессии в клетках-хозяевах. Селектируемые маркеры, которые могут быть использованы, включают, например, гены устойчивости к антибиотикам, такие как нео и т.п.

Репортерные гены используются для идентификации потенциально трансфицированных клеток и для оценки функциональности регуляторных последовательностей. В целом, репортерный ген представляет собой ген, который отсутствует или экспрессирован организмом или тканями реципиента, и который кодирует полипептид, экспрессия которого проявляется с помощью некоего легко обнаружимого свойства, например, ферментативной активности. Экспрессию репортерного гена анализируют в подходящий момент времени после того, как ДНК была введена в клетки-реципиенты. Подходящие репортерные гены могут включать гены, кодирующие люциферазу, бета-галактозидазу, хлорамфениколацетилтрансферазу, секретируемую щелочную фосфатазу или ген зеленого флуоресцентного белка (например, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). Подходящие экспрессионные системы хорошо известны и могут быть получены с использованием известных методик или получены коммерчески. Как правило, конструкция с минимальной 5'-фланкирующей областью, показывающая наивысший уровень экспрессии репортерного гена, идентифицируется как промотор. Такие промоторные области могут быть связаны с репортерным геном и использованы для оценки агентов по способности модулировать транскрипцию, инициированную промотором.

Способы введения и экспрессии генов в клетке известны в данной области. В контексте экспрессионного вектора указанный вектор может быть легко введен в клетку-хозяина, например, клетку млекопитающего, бактериальную, дрожжевую или клетку насекомого любым способом, известным в данной области. Например, экспрессионный вектор можно перенести в клетку-хозяина физическими, химическими или биологическими способами.

Физические способы введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают осаждение фосфатом кальция, липофекцию, бомбардировку частицами, микроинъекцию, электропорацию и т.п. Способы получения клеток, содержащих векторы и/или экзогенные нуклеиновые кислоты, хорошо известны в данной области. См., например, Sambrook et al. (2012, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Предпочтительным способом введения полинуклеотида в клетку-хозяина является трансфекция с помощью фосфата кальция.

Биологические способы введения в клетку-хозяина полинуклеотида, представляющего интерес, включают использование ДНК- и РНК-векторов. Вирусные векторы, и особенно ретровирусные векторы, стали наиболее широко используемым способом введения генов в клетки млекопитающих, например, в человеческие клетки. Другие вирусные векторы могут быть получены из лентивирусов, поксвирусов, вируса простого герпеса I, аденовирусов и аденоассоциированных вирусов и т.п. См., например, патенты США №№5350674 и 5585362.

Химические средства для введения полинуклеотида в клетку-хозяина включают коллоидные дисперсионные системы, такие как комплексы макромолекул, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии типа "масло-в-воде", мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы. Иллюстративная коллоидная система для использования в качестве носителя для доставки in vitro и in vivo представляет собой липосому (например, везикулу с искусственной оболочкой).

В случае, когда используется невирусная система доставки, иллюстративным средством доставки является липосома. Предполагается применение липидных составов для введения нуклеиновых кислот в клетку-хозяина (in vitro, ex vivo или in vivo). В другом аспекте нуклеиновая кислота может быть связана с липидом. Нуклеиновая кислота, связанная с липидом, может быть инкапсулирована в водную внутреннюю часть липосомы, встроена в липидный бислой липосомы, присоединена к липосоме через связывающую молекулу, которая связана как с липосомой, так и с олигонуклеотидом, захвачена в липосому, введена в комплекс с липосомой, диспергирована в растворе, содержащем липид, смешана с липидом, объединена с липидом, может содержаться в виде суспензии в липиде, содержаться или образовывать комплекс с мицеллой или иным образом быть связана с липидом. Композиции, связанные с липидом, липидом/ДНК или липидом/экспрессионным вектором, не ограничиваются какой-либо конкретной структурой в растворе. Например, они могут присутствовать в двухслойной структуре, в виде мицелл, или с "разрушенной" структурой. Они также могут просто находиться в растворе, возможно, образуя агрегаты, которые не являются однородными по размеру или форме. Липиды представляют собой жирные вещества, которые могут быть природными или синтетическими липидами. Например, липиды включают жирные капли, которые в природе находятся в цитоплазме, а также класс соединений, которые содержат длинноцепочечные алифатические углеводороды и их производные, такие как жирные кислоты, спирты, амины, аминоспирты и альдегиды.

Липиды, пригодные для использования, могут быть получены из коммерческих источников. Например, димиристилфосфатидилхолин (dimyristyl phosphatidylcholine, "DMPC") можно получить от Sigma, Сент-Луис, Миссури; дицетилфосфат (dicetyl phosphate, "DCP") можно получить от K&K Laboratories (Плейнвью, Нью-Йорк); холестерин (cholesterol, "Choi") можно получить от Calbiochem-Behring; димиристилфосфатидилглицерин (dimyristyl phosphatidylglycerol, "DMPG") и другие липиды можно получить от Avanti Polar Lipids, Inc. (Бирбингем, Алабама). Стоковые растворов липидов в хлороформе или в хлороформе/метаноле можно хранить при температуре примерно -20°С. Хлороформ используется в качестве единственного растворителя, поскольку он испаряется легче, чем метанол. "Липосома" представляет собой общий термин, охватывающий различные одно- и многослойные липидные носители, сформированные путем образования закрытых липидных бислоев или агрегатов. Липосомы можно охарактеризовать как везикулярные структуры с фосфолипидной двухслойной мембраной и внутренней водной средой. Многослойные липосомы имеют несколько липидных слоев, разделенных водной средой. Они формируются спонтанно, когда фосфолипиды суспендированы в избытке водного раствора. Липидные компоненты подвергаются самоперестраиванию перед формированием закрытых структур и захватывают воду и растворенные вещества между липидными бислоями (Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). Тем не менее, также охватываются композиции, которые имеют структуры в растворе, отличающиеся от нормальной везикулярной структуры. Например, липиды могут приобретать мицеллярную структуру или просто существовать как неоднородные агрегаты липидных молекул. Также рассматриваются комплексы "липофектамин - нуклеиновая кислота".

Независимо от способа, используемого для введения экзогенных нуклеиновых кислот в клетку-хозяина, для подтверждения наличия рекомбинантной ДНК-последовательности в клетке-хозяине может быть проведен ряд анализов. Такие анализы включают, например, "молекулярно-биологические" анализы, хорошо известные специалистам в данной области, такие как саузерн- и нозерн-блоттинг, ОТ-ПЦР и ПЦР; "биохимические" анализы, такие как обнаружение наличия или отсутствия конкретного пептида, например, иммунологическими средствами (ELISA и вестерн-блоттинг), или анализы, описанные в данном документе для идентификации агентов, входящих в объем данного изобретения.

В одном воплощении изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая пептид согласно данному изобретению, содержит РНК, транскрибированную in vitro (in vitro transcribed, IVT). РНК продуцируется путем транскрипции in vitro с помощью матрицы, образованной при полимеразной цепной реакции (ПЦР, polymerase chain reaction, PCR). Представляющая интерес ДНК из любого источника может быть напрямую преобразована путем ПЦР в матрицу для синтеза мРНК in vitro с использованием подходящих праймеров и РНК-полимеразы. Источником ДНК может быть, например, последовательность геномной ДНК, плазмидной ДНК, фаговой ДНК, кДНК, синтетической ДНК или любой другой подходящий источник ДНК.

В одном воплощении ДНК, которая должна использоваться для ПЦР, содержит открытую рамку считывания. ДНК может быть природной последовательностью ДНК из генома организма. В одном воплощении ДНК представляет собой полноразмерный ген, представляющий интерес, или часть гена. Ген может включать некоторые или все 5'- и/или 3'-нетранслируемые области (untranslated region, UTR). Ген может включать экзоны и интроны. В одном воплощении ДНК, которая будет использоваться для ПЦР, представляет собой человеческий ген. В другом воплощении ДНК, которая будет использоваться для ПЦР, представляет собой человеческий ген, включающий 5'- и 3'-UTR. Альтернативно, ДНК может быть искусственной последовательностью ДНК, которая обычно не экспрессируется в организме в природе. Иллюстративная искусственная последовательность ДНК представляет собой последовательность, которая содержит части генов, которые лигированы вместе, формируя открытую рамку считывания, которая кодирует гибридный белок. Части ДНК, которые лигированы вместе, могут быть получены из одного организма или из более чем одного организма.

Гены, которые могут использоваться в качестве источников ДНК для ПЦР, включают гены, которые кодируют полипептиды, которые оказывают терапевтическое или профилактическое действие на организм или могут быть использованы для диагностики заболевания или нарушения в организме. Предпочтительными генами являются гены, которые могут использоваться для краткосрочного лечения, или когда существуют проблемы безопасности касательно дозировки или экспрессированного гена. Например, для лечения рака, аутоиммунных заболеваний, паразитарных, вирусных, бактериальных, грибковых или других инфекций трансген(ы), который должен экспрессироваться, может кодировать полипептид, который функционирует как лиганд или рецептор для клеток иммунной системы, или может функционировать так, чтобы стимулировать или ингибировать иммунную систему организма. В некоторых воплощениях нежелательно иметь длительную непрерывную стимуляцию иммунной системы и не обязательно производить изменения, которые сохраняются после успешного лечения, поскольку это может вызвать новую проблему. Для лечения аутоиммунного нарушения может быть желательным ингибирование или подавление иммунной системы во время внезапного обострения, но не в течение длительного времени, которое может привести к тому, что пациент станет чрезмерно чувствительным к инфекции.

ПЦР используется для создания матрицы для транскрипции in vitro мРНК, которая используется для трансфекции. Способы проведения ПЦР хорошо известны в данной области. Праймеры для использования в ПЦР конструируют для получения областей, которые по существу комплементарны областям ДНК, которые будут использоваться в качестве матрицы для ПЦР. Понятие "по существу комплементарны", используемое в данном документе, относится к последовательностям нуклеотидов, в которых большинство или все основания в последовательности праймера являются комплементарными, или одно или более чем одно из оснований является некомплементарным или несовпадающим. По существу комплементарные последовательности способны отжигаться или гибридизоваться с целевой мишенью ДНК в условиях отжига, используемых для ПЦР. Праймеры могут быть сконструированы так, чтобы быть по существу комплементарными любой части ДНК-матрицы. Например, праймеры могут быть сконструированы для амплификации части гена, которая обычно транскрибируется в клетках (открытая рамка считывания), включая 5'- и 3'-UTR. Праймеры также могут быть сконструированы для амплификации части гена, которая кодирует конкретный домен, представляющий интерес. В одном воплощении праймеры сконструированы для амплификации кодирующей области человеческой кДНК, включая все или части 5'- и 3'-UTR. Праймеры, которые могут быть использованы для ПЦР, получают синтетическими способами, которые хорошо известны в данной области. "Прямые праймеры" представляют собой праймеры, которые содержат область нуклеотидов, которые по существу комплементарны нуклеотидам на ДНК-матрице, которые находятся выше последовательности ДНК, которая должна быть амплифицирована. Понятие "выше" используется в данном документе для обозначения 5'-локализации для последовательности ДНК, которая должна быть амплифицирована, относительно кодирующей цепи. "Обратные праймеры" представляют собой праймеры, которые содержат область нуклеотидов, которые по существу комплементарны двухцепочечной матрице ДНК, которые находятся ниже последовательности ДНК, которая должна быть амплифицирована. Понятие "ниже" используется в данном документе для обозначения 3'-локализации для последовательности ДНК, которая должна быть амплифицирована, относительно кодирующей цепи.

Любая ДНК-полимераза, пригодная для ПЦР, может быть использована в описанных в данном документе способах. Реагенты и полимераза коммерчески доступны из ряда источников.

Также могут быть использованы химические структуры, способные повышать стабильность и/или эффективность трансляции. РНК предпочтительно имеет 5'- и 3'-UTR. В одном воплощении 5'-UTR составляет от 0 до 3000 нуклеотидов в длину. Длина 5'- и 3'-UTR последовательностей, которые должны быть добавлены в кодирующую область, могут быть изменены различными способами, включая, но не ограничиваясь ими, разработку праймеров для ПЦР, которые отжигаются на разных областях UTR. Используя этот подход, специалист в данной области сможет модифицировать длины 5'- и 3'-UTR, необходимые для достижения оптимальной эффективности трансляции после трансфекции транскрибируемой РНК.

5'- и 3'-UTR могут быть природными, эндогенными 5'- и 3'-UTR для представляющего интерес гена. Альтернативно, последовательности UTR, которые не являются эндогенными для представляющего интерес гена, могут быть добавлены путем встраивания последовательностей UTR в прямой и обратный праймеры или с помощью любых других модификаций матрицы. Использование последовательностей UTR, которые не являются эндогенными для представляющего интерес гена, может быть проведено для модификации стабильности и/или эффективности трансляции РНК. Например, известно, что AU-богатые элементы в 3'-UTR-последовательностях могут снижать стабильность мРНК. Таким образом, 3'-UTR могут быть выбраны или сконструированы для повышения стабильности транскрибируемой РНК на основании свойств UTR, которые хорошо известны в данной области.

В одном воплощении 5'-UTR может содержать последовательность Козака эндогенного гена. Альтернативно, когда 5'-UTR, которая не является эндогенной для представляющего интерес гена, добавляется посредством ПЦР, как описано выше, консенсусная последовательность Козака может быть переконструирована путем добавления 5'-UTR-последовательности. Последовательности Козака могут повышать эффективность трансляции некоторых транскриптов РНК, но, по-видимому, не требуется, чтобы все РНК обеспечивали эффективную трансляцию. Необходимость последовательностей Козака для многих мРНК известна в данной области. В других воплощениях 5'-UTR может быть получена из РНК-вируса, РНК-геном которого является стабильным в клетках. В других воплощениях различные нуклеотидные аналоги могут быть использованы в 3'- или 5'-UTR, чтобы препятствовать экзонуклеазной деградации мРНК.

Чтобы обеспечить синтез РНК на ДНК-матрице без необходимости клонирования гена, промотор транскрипции должен быть присоединен к ДНК-матрице выше последовательности, подлежащей транскрибированию. Когда последовательность, которая функционирует в качестве промотора для РНК-полимеразы, добавляется к 5'-концу прямого праймера, промотор РНК-полимеразы становится встроенным в ПЦР-продукт выше открытой рамки считывания, которая подлежит транскрибированию. В одном предпочтительном воплощении указанный промотор представляет собой промотор полимеразы Т7, описанный в данном документе. Другие используемые промоторы включают, но не ограничиваясь ими, промоторы РНК-полимераз Т3 и SP6. Консенсусные нуклеотидные последовательности для промоторов Т7, Т3 и SP6 известны в данной области.

В предпочтительном воплощении мРНК имеет как кэп-структуру на 5'-конце, так и 3'-поли(А)-хвост, которые определяют связывание рибосомы, инициирование трансляции и стабильность мРНК в клетке. На кольцевой ДНК-матрице, например, плазмидной ДНК, РНК-полимераза продуцирует длинный конкатемерный продукт, который не подходит для экспрессии в эукариотических клетках. Транскрипция плазмидной ДНК, линеаризованной на конце 3'-UTR, приводит к образованию мРНК нормального размера, которая не эффективна при трансфекции эукариот, даже если она имеет место после транскрипции.

На линейной ДНК-матрице РНК-полимераза фага Т7 может удлинять 3'-конец транскрипта за последним основанием матрицы (Schenbom and Mierendorf, Nuc Acids Res., 13:6223-36 (1985); Nacheva and Berzal-Herranz, Eur. J. Biochem., 270:1485-65 (2003).

Традиционным способом интеграции полиА/T-удлинений в ДНК-матрицу является молекулярное клонирование. Тем не менее, последовательность полиА/Т, интегрированная в плазмидную ДНК, может вызвать нестабильность плазмиды, поэтому плазмидные ДНК-матрицы, полученные из бактериальных клеток, часто сильно контаминированы делециями и другими аберрациями. Это делает процедуры клонирования не только трудоемкими и длительными, но зачастую ненадежными. Поэтому способ, который позволит конструировать ДНК-матрицы с полиА/Т-3'-удлинением без клонирования, является очень желательным.

Сегмент полиА/Т транскрипционной ДНК-матрицы может быть получен в ходе ПЦР с использованием обратного праймера, содержащего полиТ-хвост, такой как 100Т-хвост (размер может составлять 50-5000 Т), или после ПЦР любым другим способом, включая, но не ограничиваясь ими, лигирование ДНК или рекомбинацию in vitro. Поли(А)-хвосты также обеспечивают стабильность РНК и уменьшают их деградацию. Как правило, длина поли(А)-хвоста положительно коррелирует со стабильностью транскрибируемой РНК. В одном воплощении поли(А)-хвост содержит от 100 до 5000 аденозинов.

Поли(А)-хвосты РНК также могут быть удлинены после транскрипции in vitro с использованием поли(А)-полимеразы, такой как полиА-полимераза Е. coli (Е-РАР). В одном воплощении увеличение длины поли(А)-хвоста от 100 нуклеотидов до 300-400 нуклеотидов приводит примерно к двукратному увеличению эффективности трансляции РНК. Кроме того, присоединение различных химических групп к 3'-концу может повысить стабильность мРНК. Такое присоединение может содержать модифицированные/искусственные нуклеотиды, аптамеры и другие соединения. Например, аналоги АТФ (аденозинтрифосфатов, adenosine triphosphate, ATP) могут быть встроены в поли(А)-хвост с использованием поли(А)-полимеразы. Аналоги АТФ могут также повышать стабильность РНК.

5'-кэп-структуры также обеспечивают стабильность молекул РНК. В предпочтительном воплощении РНК, полученные описанными в данном документе способами, включают 5'-кэп-структуру. 5'-кэп-структуру получают с использованием методик, известных в данной области и описанных в данном документе (Cougot, et al., Trends in Biochem. Sci., 29:436-444 (2001); Stepinski, et al., RNA, 7:1468-95 (2001); Elango, et al., Biochim. Biophys. Res. Commun., 330:958-966 (2005)).

РНК, полученные описанными в данном документе способами, также могут содержать последовательность внутреннего сайта посадки рибосомы (internal ribosome entry site, IRES). Последовательность IRES может представлять собой любую вирусную, хромосомную или искусственно разработанную последовательность, которая инициирует кэп-зависимое связывание рибосомы с мРНК и облегчает начало трансляции. Могут быть включены любые растворимые вещества, подходящие для электропорации клеток, которые могут содержать факторы, способствующие клеточной проницаемости и жизнеспособности, такие как сахара, пептиды, липиды, белки, антиоксиданты и поверхностно-активные вещества.

РНК может быть введена в клетки-мишени с использованием любого из ряда различных способов, например, коммерчески доступных способов, которые включают, но не ограничиваясь ими, электропорацию (Amaxa Nucleofector-II (Атаха Biosystems, Кельн, Германия)), ЕСМ 830 (ВТХ) (Harvard Instruments, Бостон, Массачусетс) или Gene Pulser II (BioRad, Денвер, Колорадо), Multiporator (Eppendort, Гамбург, Германия)), опосредованную катионными липосомами трансфекцию с использованием липофекции, полимерную инкапсуляцию, опосредованную пептидами трансфекцию или биолистические системы доставки частиц, такие как "генные пушки" (см., например, Nishikawa и др. Hum Gene Then, 12 (8): 861-70 (2001).

В другом аспекте РНК-конструкция может быть доставлена в клетки путем электропорации. См., например, составы и методики электропорации нуклеиновокислотных конструкций в клетки млекопитающих, описанные в US 2004/0014645, US 2005/0052630 А1, US 2005/0070841 А1, US 2004/0059285 A1, US 2004/0092907 A1. Различные параметры, в том числе напряжение электрического поля, необходимые для электропорации любого известного типа клеток, широко доступны в соответствующей исследовательской литературе, а также в многочисленных патентах и инструкциях в данной области. См., например, патент США №6678556, патент США №7171264 и патент США №7173116. Аппараты для терапевтического применения электропорации доступны коммерчески, например, MedPulser™ DNA Electroporation Therapy System (Inovio/Genetronics, Сан-Диего, Калифорния), и описаны в патентах, таких как патент США №6567694; патент США №6516223, патент США №5993344, патент США №6181964, патент США №6241701 и патент США №6,233,482; электропорация также может быть использована для трансфекции клеток in vitro, как описано, например, в US 20070128708 А1. Электропорацию можно также использовать для доставки нуклеиновых кислот в клетки in vitro. Соответственно, опосредованное электропорацией введение в клетки нуклеиновых кислот, включая экспрессирующие конструкции, с использованием любого из многих доступных устройств и систем электропорации, известных специалистам в данной области, представляет собой захватывающее новое средство для доставки представляющей интерес РНК в клетку-мишень.

Химерный антигенный рецептор

Данное изобретение предусматривает композицию, содержащую химерный антигенный рецептор (CAR) или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, где CAR содержит ТАСА-связывающий домен. В одном воплощении CAR содержит внеклеточный и внутриклеточный домен. Внеклеточный домен содержит специфический для мишени связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающей группировкой. Внутриклеточный домен, или иначе цитоплазматический домен, содержит область костимулирующей сигнализации и участок дзета-цепи. Костимулирующая сигнальная область относится к части CAR, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующие молекулы являются молекулами клеточной поверхности, отличными от рецепторов антигенов или их лигандов, которые необходимы для эффективного ответа лимфоцитов на антиген.

Между внеклеточным доменом и трансмембранным доменом CAR или между цитоплазматическим доменом и трансмембранным доменом CAR может быть включен спейсерный домен. Используемый в данном документе термин "спейсерный домен", как правило, означает любой олиго- или полипептид, который функционирует для связывания трансмембранного домена с внеклеточным доменом или с цитоплазматическим доменом в полипептидной цепи. Спейсерный домен может содержать до 300 аминокислот, предпочтительно от 10 до 100 аминокислот и наиболее предпочтительно от 25 до 50 аминокислот.

Антигенсвязывающая группировка

В одном воплощении CAR согласно данному изобретению содержит специфический для мишени связывающий элемент, иначе называемый антигенсвязывающей группировкой.

В одном воплощении антигенсвязывающая группировка CAR согласно данному изобретению содержит один или более чем один из ТАСА-связывающих доменов, описанных в данном документе. Например, в одном воплощении антигенсвязывающая группировка содержит один или более чем один из ТАСА-связывающих доменов любой из последовательностей SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 или их гомологичных пептидов.

В одном воплощении указанная композиция содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую CAR, где молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует любую из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 или их гомологичных пептидов.

В одном воплощении антигенсвязывающая группировка CAR содержит пептид, который связывается с ТАСА-связывающим доменом, описанным в данном документе. Например, в одном воплощении антигенсвязывающая группировка CAR включает лектинсвязывающий домен, где лектинсвязывающий домен связывается с лектином или пептидом, полученным из лектина, который связывается с ТАСА.

Трансмембранный домен

Что касается трансмембранного домена, CAR может быть сконструирован таким образом, чтобы содержать трансмембранный домен, который слит с внеклеточным доменом CAR. В одном воплощении используется трансмембранный домен, который в природе связан с одним из доменов в CAR. В некоторых случаях трансмембранный домен может быть выбран или модифицирован путем аминокислотной замены, чтобы избежать связывания таких доменов с трансмембранными доменами одного и того же или разных белков поверхностной мембраны, чтобы минимизировать взаимодействие с другими членами рецепторного комплекса.

Трансмембранный домен может быть получен либо из природного, либо из синтетического источника. Если источник является природным, то домен может быть получен из любого связанного с мембраной или трансмембранного белка. Трансмембранные области конкретного использования в данном изобретении могут быть получены из (т.е. включают по меньшей мере трансмембранную область (области) их) альфа-, бета- или дзета-цепи Т-клеточного рецептора, CD28, CD3-эпсилон, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Альтернативно, трансмембранный домен может быть синтетическим, и в этом случае он будет содержать преимущественно гидрофобные остатки, такие как лейцин и валин. Предпочтительно триплет фенилаланина, триптофана и валина будет находиться на каждом конце синтетического трансмембранного домена. Возможно, короткий олиго- или полипептидный линкер, предпочтительно длиной от 2 до 10 аминокислот, может формировать связь между трансмембранным доменом и цитоплазматическим сигнальным доменом CAR. Глицин-сериновый дублет образует особенно подходящий линкер.

Предпочтительно, трансмембранный домен в CAR согласно данному изобретению представляет собой трансмембранный домен CD8. В некоторых случаях трансмембранный домен CAR согласно данному изобретению содержит шарнирный домен CD8α.

Цитоплазматический домен

Цитоплазматический домен, или иначе внутриклеточный сигнальный домен, CAR согласно данному изобретению отвечает за активацию по меньшей мере одной из нормальных эффекторных функций иммунной клетки, в которую помещен CAR. Термин "эффекторная функция" относится к специализированной функции клетки. Эффекторной функцией Т-клетки, например, может быть цитолитическая активность или вспомогательная активность, включая секрецию цитокинов. Таким образом, термин "внутриклеточный сигнальный домен" относится к части белка, которая трансформирует сигнал эффекторной функции и направляет клетку для выполнения специализированной функции. Хотя обычно можно использовать весь внутриклеточный сигнальный домен, во многих случаях нет необходимости использовать всю цепь. В той степени, в которой используется усеченная часть внутриклеточного сигнального домена, такая усеченная часть может использоваться вместо интактной цепи до тех пор, пока она трансдуцирует сигнал эффекторной функции. Таким образом, термин "внутриклеточный сигнальный домен" включает любую усеченную часть внутриклеточного сигнального домена, достаточную для трансдукции сигнала эффекторной функции.

Предпочтительные примеры внутриклеточных сигнальных доменов для использования в CAR согласно данному изобретению включают цитоплазматические последовательности Т-клеточного рецептора (TCR) и корецепторы, которые действуют сообща, чтобы инициировать трансдукцию сигнала после взаимодействия антигенного рецептора, а также любые производные или варианты этих последовательностей и любую синтетическую последовательность, которая имеет такую же функциональную способность.

Известно, что сигналы, образующиеся через один TCR, недостаточны для полной активации Т-клетки, и что необходим вторичный или костимулирующий сигнал. Таким образом, активация Т-клеток может быть опосредована двумя различными классами цитоплазматической сигнальной последовательности: теми, которые инициируют антигензависимую первичную активацию через TCR (первичные цитоплазматические сигнальные последовательности), и теми, которые действуют антигеннезависимым образом, обеспечивая вторичный или костимулирующий сигнал (вторичные цитоплазматические сигнальные последовательности).

Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности регулируют первичную активацию комплекса TCR либо стимулирующим образом, либо ингибирующим образом. Первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые действуют стимулирующим образом, могут содержать сигнальные мотивы, которые известны как активирующие мотивы иммунорецепторов на основе тирозина, или ITAM.

Примеры ITAM, содержащие первичные цитоплазматические сигнальные последовательности, которые, в частности, могут быть использованы в данном изобретении, включают те, которые получены из TCR дзета, FcR-гамма, FcR-бета, CD3-гамма, CD3-дельта, CD3-эпсилон, CD5, CD22, CD79a, CD79b и CD66d. Особенно предпочтительно, чтобы цитоплазматическая сигнальная молекула в CAR согласно данному изобретению содержала цитоплазматическую сигнальную последовательность, полученную из CD3-дзета.

В предпочтительном воплощении цитоплазматический домен CAR может быть сконструирован таким образом, чтобы содержать сигнальный домен CD3-дзета сам по себе или в сочетании с любым другим нужным цитоплазматическим доменом(ами), используемым в контексте CAR согласно данному изобретению. Например, цитоплазматический домен CAR может содержать часть дзета-цепи CD3 и костимулирующую сигнальную область. Костимулирующая сигнальная область относится к части CAR, содержащей внутриклеточный домен костимулирующей молекулы. Костимулирующая молекула представляет собой молекулу клеточной поверхности, отличную от рецептора антигена или его лигандов, которая необходима для эффективного ответа лимфоцитов на антиген. Примеры таких молекул включают CD27, CD28, 4-1ВВ (CD137), ОХ40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, ассоциированный с лимфоцитарной функцией антиген-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, В7-Н3 и лиганд, который специфически связывается с CD83 и т.п. Таким образом, хотя данное изобретение проиллюстрировано в первую очередь с 4-1ВВ в качестве костимулирующего сигнального элемента, в рамках данного изобретения находятся и другие костимулирующие элементы.

Цитоплазматические сигнальные последовательности в цитоплазматической сигнальной части CAR согласно данному изобретению могут быть связаны друг с другом в произвольном или определенном порядке. Возможно, короткий олиго- или полипептидный линкер, предпочтительно длиной от 2 до 10 аминокислот, может формировать связь. Глицин-сериновый дублет образует особенно подходящий линкер.

В одном воплощении цитоплазматический домен сконструирован таким образом, чтобы содержать сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28. В другом воплощении цитоплазматический домен сконструирован таким образом, чтобы содержать сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен 4-1ВВ. В еще одном воплощении цитоплазматический домен сконструирован таким образом, чтобы содержать сигнальный домен CD3-дзета и сигнальный домен CD28 и 4-1ВВ.

Векторы

Данное изобретение охватывает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую последовательности, кодирующие CAR, где последовательность содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающую группировку, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей внутриклеточный домен. Например, в одном воплощении указанная молекула, кодирующая CAR, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую антигенсвязывающую группировку, содержащую один или более чем один любой ТАСА-связывающий домен из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 или их гомологичных пептидов. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, содержит последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую нуклеотидную последовательность, которая кодирует любую из SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 7 или их гомологичных пептидов. В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, содержит нуклеотидную последовательность, которая кодирует пептид, который связывается с ТАСА-связывающим доменом. Например, в одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, содержит нуклеотидную последовательность, которая связывается с лектинсвязывающим доменом, где лектинсвязывающий домен связывается с лектином и пептидом, полученным из лектина, который связывается с ТАСА.

Молекула нуклеиновой кислоты может представлять собой любую ДНК- или РНК-конструкцию, вектор или плазмиду, описанную в данном документе.

Генетически модифицированные клетки

В некоторых воплощениях композиция согласно данному изобретению содержит клетку, модифицированную для экспрессии пептида согласно данному изобретению. Например, в некоторых воплощениях клетка модифицирована для экспрессии пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен. В некоторых воплощениях клетка модифицирована для экспрессии пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий Т-клетку. В некоторых воплощениях клетка модифицирована для экспрессии CAR, содержащего ТАСА-связывающий домен.

В некоторых воплощениях клетка генетически модифицирована путем контактирования клетки с изолированной нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид согласно данному изобретению.

В некоторых воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты доставляется в клетки с использованием ретровирусного или лентивирусного вектора. Например, ретровирусные и лентивирусные векторы, экспрессирующие пептид согласно данному изобретению, могут быть доставлены в различные типы эукариотических клеток, а также в ткани и целые организмы, с использованием трансдуцированных клеток в качестве носителей или путем бесклеточной локальной или системной доставки инкапсулированных, связанных или голых векторов. Используемый способ может быть применен для любых целей, где требуется или достаточна стабильная экспрессия.

В других воплощениях последовательность нуклеиновой кислоты доставляется в клетки с использованием транскрибированной in vitro мРНК. Транскрибированная in vitro мРНК может быть доставлена в различные типы эукариотических клеток, а также в ткани и целые организмы, с использованием трансфицированных клеток в качестве носителей или путем бесклеточной локальной или системной доставки инкапсулированной, связанной или голой мРНК. Используемый способ может быть применен для любых целей, где требуется или достаточна стабильная экспрессия.

В некоторых воплощениях клетка может относиться к любому подходящему типу клеток, который может экспрессировать нужный пептид. В некоторых воплощениях модифицированная клетка используется в способе, в котором клетка вводится реципиенту. В некоторых воплощениях клетка является аутологичной, аллогенной, сингенной или ксеногенной по отношению к реципиенту.

В одном воплощении клетка представляет собой Т-клетку. Раскрытые композиции и способы могут быть применены для модуляции Т-клеточной активности в фундаментальных исследованиях и терапии, в области рака, стволовых клеток, острых и хронических инфекций и аутоиммунных заболеваний, включая оценку способности генетически модифицированной Т-клетки уничтожать раковую клетку-мишени.

Перед размножением и генетической модификацией Т-клеток согласно данному изобретению от субъекта получают источник Т-клеток. Т-клетки могут быть получены из ряда источников, включая мононуклеарные клетки периферической крови, костный мозг, ткань лимфатических узлов, пуповинную кровь, ткань тимуса, ткань из места инфекции, асцит, плевральный выпот, ткань селезенки и опухоли. В некоторых воплощениях данного изобретения может использоваться любое число Т-клеточных линий, доступных в данной области. В некоторых воплощениях данного изобретения Т-клетки могут быть получены из крови, собранной у субъекта, с использованием любого числа методик, известных специалистам в данной области, таких как разделение на Ficoll™. В одном предпочтительном воплощении клетки из циркулирующей крови индивидуума получают путем афереза. Продукт афереза, как правило, содержит лимфоциты, включая Т-клетки, моноциты, гранулоциты, В-клетки, другие ядерные лейкоциты, эритроциты и тромбоциты. В одном воплощении клетки, собранные путем афереза, могут быть промыты, чтобы удалить плазменную фракцию и поместить клетки в соответствующий буфер или среду для последующих этапов обработки. В одном воплощении данного изобретения клетки промывают натрий-фосфатным буфером (phosphate buffered saline, PBS). В альтернативном воплощении в промывочном растворе отсутствует кальций и может отсутствовать магний, либо могут отсутствовать многие, если не все, двухвалентные катионы. Опять же, неожиданно, начальные этапы активации в отсутствие кальция приводят к усиленной активации. Специалисты в данной области легко поймут, что этап промывания может быть выполнен способами, известными специалистам в данной области, такими как использование полуавтоматической "проточной" центрифуги (например, аппарат Cobe 2991 cell processor, Baxter CytoMate, или Haemonetics Cell Saver 5) в соответствии с инструкциями производителя. После промывания клетки могут быть ресуспендированы в различных биосовместимых буферах, таких как, например, PBS без Са²⁺, без Mg²⁺, PlasmaLyte А, или другом физиологическом растворе с буфером или без него. Альтернативно, нежелательные компоненты образца афереза могут быть удалены и клетки непосредственно ресуспендированы в культуральных средах.

В другом воплощении Т-клетки выделяют из лимфоцитов периферической крови путем лизиса эритроцитов и истощения моноцитов, например, путем центрифугирования через градиент PERCOLL™ или путем противоточного центробежного отстаивания. Конкретная субпопуляция Т-клеток, таких как клетки CD3⁺, CD28⁺, CD4⁺, CD8⁺, CD45RA⁺ и CD45RO⁺T, может быть дополнительно изолирована с помощью методик положительной или отрицательной селекции. Например, в одном воплощении Т-клетки выделяют путем инкубации с анти-CD3/анти-CD28 (т.е. 3×28)-конъюгированными гранулами, такими как DYNABEADS® М-450 CD3/CD28 Т, в течение периода времени, достаточного для положительной селекции нужных Т-клеток. В одном воплощении период времени составляет примерно 30 минут. В другом воплощении период времени составляет от 30 минут до 36 часов или дольше, включая все целые значения между ними. В другом воплощении период времени составляет по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5 или 6 часов. В еще одном предпочтительном воплощении период времени составляет от 10 до 24 часов. В одном предпочтительном воплощении период инкубации составляет 24 часа. Для выделения Т-клеток у пациентов с лейкемией использование более длительных инкубационных периодов, таких как 24 часа, может увеличить выход клеток. Более длительный период времени инкубации может быть использован для выделения Т-клеток в любой ситуации, когда имеется несколько Т-клеток по сравнению с другими типами клеток, например, для выделения опухолевых инфильтрирующих лимфоцитов (tumor infiltrating lymphocytes, TIL) из опухолевой ткани или у людей с компрометированной иммунной системой. Кроме того, использование более длительных периодов инкубации может повысить эффективность захвата CD8+ Т-клеток. Таким образом, путем простого укорачивания или удлинения периода времени, в течение которого Т-клетки оставляют связываться с CD3/CD28-гранулами, и/или путем увеличения или уменьшения соотношения гранул и Т-клеток (как описано далее в данном документе), субпопуляции Т-клеток могут быть предпочтительно выбраны или не выбраны в начале культивирования или в другие моменты времени в ходе этого процесса. Кроме того, путем увеличения или уменьшения соотношения анти-CD3-и/или анти-CD28-антител и гранул или другой поверхности субпопуляции Т-клеток могут быть предпочтительно выбраны или не выбраны в начале культивирования или в другие желаемые моменты времени. Специалист в данной области поймет, что в контексте данного изобретения можно также использовать несколько циклов селекции. В некоторых воплощениях может быть желательным выполнить процедуру селекции и использовать "невыбранные" клетки в процессе активации и размножения. "Невыбранные" клетки также можно подвергнуть дальнейшим циклам селекции.

Обогащение популяции Т-клеток путем отрицательной селекции можно выполнить с помощью комбинации антител, направленных на поверхностные маркеры, уникальные для отрицательно селектируемых клеток. Одним из способов является сортировка и/или селекция клеток с помощью отрицательной магнитной иммуноадгезии или проточной цитометрии, которая использует коктейль из моноклональных антител, направленных на маркеры клеточной поверхности, присутствующие на отрицательно отобранных клетках. Например, чтобы обогатить CD4⁺-клетки путем отрицательной селекции, коктейль с моноклональным антителом, как правило, включает антитела к CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR и CD8. В некоторых воплощениях может быть желательным обогащать или позитивно выбирать регуляторные Т-клетки, которые обычно экспрессируют CD4⁺, CD25⁺, CD62L^hi, GITR⁺ и FoxP3⁺. Альтернативно, в некоторых воплощениях Т-регуляторные клетки истощаются с помощью анти-С25-конъюгированных гранул или других подобных способов селекции.

Для выделения нужной популяции клеток путем положительной или отрицательной селекции можно варьировать концентрацию клеток и поверхности (например, частиц, таких как гранулы). В некоторых воплощениях может быть желательно значительно уменьшить объем, в котором гранулы и клетки смешиваются (т.е. увеличить концентрацию клеток), чтобы обеспечить максимальное контактирование клеток и гранул. Например, в одном воплощении используется концентрация 2 млрд клеток/мл. В одном воплощении используется концентрация 1 миллиард клеток/мл. В следующем воплощении используется концентрация более 100 миллионов клеток/мл. В следующем воплощении используется концентрация 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В еще одном воплощении используется концентрация 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В других воплощениях могут быть использованы концентрации 125 или 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может привести к увеличению выхода клеток, активации клеток и размножения клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут слабо экспрессировать целевые антигены, представляющие интерес, такие как CD28-отрицательные Т-клетки, или из образцов, в которых присутствует много опухолевых клеток (т.е. из лейкемической крови, опухолевой ткани и т.д.). Такие популяции клеток могут иметь терапевтическую ценность и были бы желательны для получения. Например, использование высокой концентрации клеток позволяет более эффективно выбирать CD8⁺ Т-клетки, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.

В соответствующем воплощении может быть желательно использовать более низкие концентрации клеток. При значительном разведении смеси Т-клеток и поверхностей (например, частиц, таких как гранулы) взаимодействие между частицами и клетками минимизируется. Это позволяет выбирать клетки, которые экспрессируют большое число нужных антигенов, которые будут связываться с частицами. Например, CD4⁺ Т-клетки экспрессируют более высокие уровни CD28 и более эффективно захватываются, чем CD8⁺ Т-клетки в разведенных концентрациях. В одном воплощении концентрация используемых клеток составляет 5×10⁶/мл. В других воплощениях используемая концентрация может составлять от примерно 1×10⁵/мл до 1×10⁶/мл и любое целое значение между ними.

В других воплощениях указанные клетки можно инкубировать на ротаторе в течение различных периодов времени с изменяющимися скоростями при 2-10°С или при комнатной температуре.

Т-клетки для стимуляции также могут быть заморожены после этапа промывания. Без ограничения теорией, этапы замораживания и последующего размораживания обеспечивают более однородный продукт за счет удаления гранулоцитов и в некоторой степени моноцитов в популяции клеток. После этапа промывания, который удаляет плазму и тромбоциты, клетки можно суспендировать в замороженном растворе. Хотя многие растворы и параметры замораживания известны в данной области и могут быть использованы в этом контексте, один из способов включает использование PBS, содержащего 20% диметилсульфоксид (ДМСО) и 8% человеческого сывороточного альбумина, или культуральной среды, содержащей 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% человеческого сывороточного альбумина и 7,5% ДМСО, или 31,25% плазмалита-А, 31,25% декстрозы 5%, 0,45% NaCl, 10% декстрана 40 и 5% декстрозы, 20% человеческого сывороточного альбумина и 7,5% ДМСО, или другой подходящей замораживающей клетки среды, например, Hespan и PlasmaLyte А, затем клетки замораживают до -80°С со скоростью 1° в минуту и хранят в паровой фазе резервуара для хранения жидкого азота. Могут использоваться другие способы контролируемого замораживания, а также неконтролируемое замораживание сразу при -20°С или в жидком азоте.

В некоторых воплощениях криоконсервированные клетки размораживают и промывают, как описано в данном документе, и оставляют на один час при комнатной температуре до активации с использованием способов согласно данному изобретению.

В контексте данного изобретения также рассматривается сбор образцов крови или продукта афереза у субъекта за период времени перед тем, когда могут понадобиться размноженные клетки, описанные в данном документе. Таким образом, источник клеток, подлежащих размножению, можно собрать в любой необходимый момент времени, и нужные клетки, такие как Т-клетки, выделить и заморозить для последующего использования в Т-клеточной терапии для любого числа заболеваний или состояний, при которых будет полезной Т-клеточная терапия, такая как описана в данном документе. В одном воплощении образец крови или аферез берут от в целом здорового субъекта. В некоторых воплощениях образец крови или аферез берут от в целом здорового субъекта, который подвержен риску развития заболевания, но у которого еще не развилось заболевание, и клетки, представляющие интерес, изолируют и замораживают для последующего использования. В некоторых воплощениях Т-клетки могут быть размножены, заморожены и использованы позднее. В некоторых воплощениях образцы собирают от пациента вскоре после диагностики конкретного заболевания, как описано в данном документе, но до какого-либо лечения. В другом воплощении клетки выделяют из образца крови или афереза от субъекта перед любым числом соответствующих способов лечения, включая, но не ограничиваясь ими, лечение такими агентами, как натализумаб, эфализумаб, противовирусные агенты, химиотерапию, радиацию, иммуносупрессивные агенты, такие как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антитела или другие иммуноаблативные агенты, такие как САМРАТН, анти-CD3-антитела, цитоксан, флударабин, циклоспорин, FK506, рапамицин, микофенольную кислоту, стероиды, FR901228 и облучение. Эти лекарственные препараты либо ингибируют кальцийзависимую фосфатазу кальциневрин (циклоспорин и FK506), либо ингибируют киназу p70S6, что важно для передачи сигналов, индуцированных фактором роста (рапамицин) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). В еще одном воплощении клетки изолируют из организма пациента и замораживают для последующего использования в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга или стволовых клеток, направленной на Т-клетки аблативной терапией с использованием либо химиотерапевтических агентов, таких как флударабин, наружной дистанционной лучевой терапии (external-beam radiation therapy, XRT), циклофосфамида, либо антител, таких как OKT3 или САМРАТН. В другом воплощении клетки изолируют до и могут заморозить для последующего использования для лечения после направленной на В-клетки аблативной терапии такими агентами, которые реагируют с CD20, например, ритуксаном.

В другом воплощении данного изобретения Т-клетки получают от пациента непосредственно после лечения. В связи с этим было обнаружено, что после некоторых подходов к лечению рака, в частности, после лечения лекарственными препаратами, которые повреждают иммунную систему, вскоре после лечения в период, когда пациенты обычно восстанавливаются после лечения, качество полученных Т-клеток может быть оптимальным или улучшенным в отношении их способности размножать ex vivo. Аналогично, следуя манипуляциям ex vivo, использующим способы, описанные в данном документе, эти клетки могут находиться в предпочтительном состоянии для улучшенного приживления и размножения in vivo. Таким образом, в контексте данного изобретения предполагается собирать клетки крови, включая Т-клетки, дендритные клетки или другие клетки гематопоэтической линии, во время этой фазы восстановления. Кроме того, в некоторых воплощениях схемы мобилизации (например, мобилизации с GM-CSF) и кондиционирования могут быть использованы для создания у субъекта состояния, при котором предпочтение отдается репопуляции, рециркуляции, регенерации и/или размножению конкретных типов клеток, особенно в определенном временном окне после лечения. Иллюстративные типы клеток включают Т-клетки, В-клетки, дендритные клетки и другие клетки иммунной системы.

До или после генетической модификации Т-клеток для экспрессии пептида согласно данному изобретению Т-клетки могут быть активированы и размножены, как правило, с использованием способов, описанных, например, в патентах США 6352694; 6534055; 6905680; 6692964; 5858358; 6887466; 6905681; 7144575; 7067318; 7172869; 7232566; 7175843; 5883223; 6905874; 6797514; 6867041; и публикациях заявок на патент США №20060121005.

Как правило, Т-клетки согласно данному изобретению размножают путем контактирования с поверхностью, имеющей прикрепленный к ней агент, который стимулирует ассоциированный с CD3/TCR-комплексом сигнал, и лиганд, который стимулирует костимулирующую молекулу на поверхности Т-клеток. В частности, популяции Т-клеток можно стимулировать, как описано в данном документе, например, путем контактирования с анти-CD3-антителом или его антигенсвязывающим фрагментом или с анти-CD2-антителом, иммобилизованным на поверхности, или путем контактирования с активатором протеинкиназы С (например, бриостатином) в сочетании с ионофором кальция. Для костимуляции дополнительной молекулы на поверхности Т-клеток используется лиганд, который связывает дополнительную молекулу. Например, популяция Т-клеток может контактировать с анти-CD3-антителом и анти-CD28-антителом в условиях, подходящих для стимуляции пролиферации Т-клеток. Для стимуляции пролиферации либо CD4⁺ Т-клеток, либо CD8⁺ Т-клеток используется анти-CD3-антитело и анти-CD28-антитело. Примеры анти-CD28-антитела включают 9.3, В-Т3, XR-CD28 (Diaclone, , Франция) и могут быть использованы, как и другие известные в данной области способы (Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999).

В некоторых воплощениях первичный стимулирующий сигнал и костимулирующий сигнал для Т-клетки могут быть получены согласно различным протоколам. Например, агенты, обеспечивающие каждый сигнал, могут находиться в растворе или могут быть соединены с поверхностью. При соединении с поверхностью агенты могут быть соединены с одной и той же поверхностью (т.е. находиться в форме "цис") или с разными поверхностями (т.е. находиться в форме "транс"). Альтернативно, один агент может быть связан с поверхностью и другим агентом в растворе. В одном воплощении агент, обеспечивающий костимулирующий сигнал, связан с поверхностью клетки, а агент, обеспечивающий первичный сигнал активации, находится в растворе или соединен с поверхностью. В некоторых воплощениях оба агента могут находиться в растворе. В другом воплощении указанные агенты могут находиться в растворенной форме и затем могут быть сшиты с поверхностью, такой как клетка, экспрессирующая Fc-рецепторы или антитело или другой связывающий агент, который будет связываться с агентами. В связи с этим см., например, публикации патентных заявок США №№20040101519 и 20060034810 для клеток, представляющих искусственные антигены (artificial antigen presenting cell, аАРС), которые предназначены для использования в активированных и размножающихся Т-клетках согласно данному изобретению.

В одном воплощении два агента иммобилизованы на гранулах, либо на одной и той же грануле, т.е. в положении "цис", либо на отдельных гранулах, т.е. в положении "транс". В качестве примера агент, обеспечивающий первичный сигнал активации, представляет собой анти-CD3-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, а агент, обеспечивающий костимулирующий сигнал, представляет собой анти-CD28-антитело или его антигенсвязывающий фрагмент; и оба агента совместно иммобилизованы на одной и той же грануле в эквивалентных молекулярных количествах. В одном воплощении используют соотношение 1:1 каждого антитела, связанного с гранулами, для размножения Т-клеток CD4⁺ и роста Т-клеток. В некоторых аспектах данного изобретения используется такое соотношение анти-CD3:CD28-антител, связанных с гранулами, что наблюдается увеличение размножения Т-клеток по сравнению с размножением, наблюдаемым при использовании соотношения 1:1. В одном конкретном воплощении наблюдается увеличение примерно в 1-3 раза по сравнению с размножением, наблюдаемым при использовании соотношения 1:1. В одном воплощении соотношение анти-CD3:CD28-антител, связанных с гранулами, варьирует от 100:1 до 1:100, включая все целочисленные значения между ними. В одном аспекте данного изобретения анти-CD28-антитело связано с гранулами больше, чем анти-CD3-антитело, т.е. соотношение CD3:CD28 составляет меньше единицы. В некоторых воплощениях данного изобретения соотношение анти-CD28-антитела и анти-CD3-антитела, связанных с гранулами, составляет больше 2:1. В одном конкретном воплощении используется соотношение анти-CD3:CD28-антител, связанных с гранулами, равное 1:100. В другом воплощении используется соотношение анти-CD3:CD28-антител, связанных с гранулами, равное 1:75. В еще одном воплощении используется соотношение анти-CD3:CD28-антител, связанных с гранулами, равное 1:50. В другом воплощении используется соотношение анти-CD3:CD28-антител, связанных с гранулами, равное 1:30. В одном предпочтительном воплощении используется соотношение анти-CD3:CD28-антител, связанных с гранулами, равное 1:10. В другом воплощении используется соотношение анти-CD3:CD28-антител, связанных с гранулами, равное 1:3. В еще одном воплощении используется соотношение анти-CD3:CD28-антител, связанных с гранулами, равное 3:1.

Соотношения частиц и клеток от 1:500 до 500:1, включая целочисленные значения между ними, могут использоваться для стимуляции Т-клеток или других клеток-мишеней. Как легко поймет специалист в данной области, соотношение частиц и клеток может зависеть от размера частиц относительно клетки-мишени. Например, гранулы небольшого размера могут связывать только несколько клеток, в то время как большие гранулы могут связывать много клеток. В некоторых воплощениях соотношение клеток и частиц составляет от 1:100 до 100:1, включая любые целочисленные значения между ними, а в дополнительных воплощениях для стимуляции Т-клеток также может быть использовано соотношение, которое составляет от 1:9 до 9:1, включая любые целочисленные значения между ними. Соотношение анти-CD3- и анти-CD28-связанных частиц и Т-клеток, которое приводит к стимуляции Т-клеток, может варьировать, как указано выше, тем не менее, некоторые предпочтительные значения включают 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 и 15:1, причем одно предпочтительное соотношение частиц и Т-клеток составляет по меньшей мере 1:1. В одном воплощении используется соотношение частиц и клеток 1:1 или менее. В одном конкретном воплощении предпочтительное соотношение частиц и клеток составляет 1:5. В других воплощениях соотношение частиц и клеток может варьировать в зависимости от дня стимуляции. Например, в одном воплощении соотношение частиц и клеток в первый день составляет от 1:1 до 10:1, и дополнительные частицы добавляют в клеткам каждый день или через день в течение 10 дней до конечного соотношения от 1:1 до 1:10 (в зависимости от числа клеток в день добавления). В одном конкретном воплощении соотношение частиц и клеток составляет 1:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:5 в третий и пятый дни стимуляции. В другом воплощении частицы добавляют ежедневно или через день на основании конечного соотношения 1:1 в первый день и 1:5 в третий и пятый дни стимуляции. В другом воплощении соотношение частиц и клеток составляет 2:1 в первый день стимуляции и доводится до 1:10 в третий и пятый дни стимуляции. В другом воплощении частицы добавляются ежедневно или через день до конечного соотношения 1:1 в первый день и 1:10 в третий и пятый дни стимуляции. Специалисту в данной области будет понятно, что для использования в данном изобретении может быть пригодным множество других соотношений. В частности, соотношения будут варьировать в зависимости от размера частиц и размера и типа клеток.

В других воплощениях данного изобретения клетки, такие как Т-клетки, объединяют с гранулами, покрытыми агентом, затем гранулы и клетки разделяют, и затем клетки культивируют. В альтернативном воплощении перед культивированием гранулы и клетки, покрытые агентом, не разделяют, а культивируют вместе. В еще одном воплощении гранулы и клетки сначала концентрируют путем применения такой силы как магнитная, что приводит к усиленному лигированию маркеров клеточной поверхности, тем самым индуцируя клеточную стимуляцию.

В качестве примера белки клеточной поверхности можно лигировать путем контактирования парамагнитных гранул, к которым прикреплены анти-CD3 и анти-CD28 (гранулы 3×28), с Т-клетками. В одном воплощении клетки (например, от 10⁴ до 10⁹ Т-клеток) и гранулы (например, парамагнитные гранулы DYNABEADS® М-450 CD3/CD28 Т в соотношении 1:1) объединяют в буфере, предпочтительно PBS (без двухвалентных катионов, таких как кальций и магний). Опять же, специалисты в данной области смогут легко оценить, какая концентрация клеток может быть использована. Например, клетка-мишень может быть очень редкой в образце и может составлять только 0,01% образца, либо весь образец (т.е. 100%) может состоять из клетки-мишени, представляющей интерес. Соответственно, любое число клеток входит в контекст данного изобретения. В некоторых воплощениях может быть желательным значительно уменьшить объем, в котором частицы и клетки смешивают вместе (т.е. увеличить концентрацию клеток), чтобы обеспечить максимальный контакт клеток и частиц. Например, в одном воплощении используется концентрация примерно 2 миллиарда клеток/мл. В другом воплощении используется более 100 миллионов клеток/мл. В другом воплощении используется концентрация клеток 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50 миллионов клеток/мл. В еще одном воплощении используется концентрация клеток 75, 80, 85, 90, 95 или 100 миллионов клеток/мл. В других воплощениях могут быть использованы концентрации 125 или 150 миллионов клеток/мл. Использование высоких концентраций может привести к увеличенному выходу клеток, активации клеток и размножению клеток. Кроме того, использование высоких концентраций клеток позволяет более эффективно захватывать клетки, которые могут слабо экспрессировать целевые антигены, представляющие интерес, такие как CD28-отрицательные Т-клетки. Такие популяции клеток могут иметь терапевтическое значение и в некоторых воплощениях желательны для получения. Например, использование высокой концентрации клеток позволяет более эффективно выбирать CD8+ Т-клетки, которые обычно имеют более слабую экспрессию CD28.

В одном воплощении данного изобретения смесь можно культивировать в течение периода от нескольких часов (примерно 3 часов) до примерно 14 дней или любого почасового целого значения между ними. В другом воплощении смесь можно культивировать в течение 21 дня. В одном воплощении данного изобретения гранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение примерно восьми дней. В другом воплощении гранулы и Т-клетки культивируют вместе в течение 2-3 дней. Также могут потребоваться несколько циклов стимуляции, так что время культивирования Т-клеток может составлять 60 дней или более. Условия, подходящие для культивирования Т-клеток, включают подходящие среды (например, Minimal Essential Media или RPMI Media 1640 или X-vivo 15 (Lonza)), которые могут содержать факторы, необходимые для пролиферации и жизнеспособности, включая сыворотку (например, эмбриональную бычью или человеческую сыворотку), интерлейкин-2 (IL-2), инсулин, интерферон-γ (ИФ-γ), IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ и фактор некроза опухоли альфа (ФНО-α) и любые другие добавки для роста клеток, известные специалистам в данной области. Другие добавки для роста клеток включают, но не ограничиваясь ими, поверхностно-активное вещество, плазманат и восстанавливающие агенты, такие как N-ацетилцистеин и 2-меркаптоэтанол. Среды могут включать RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-МЕМ, F-12, X-Vivo 15 и X-Vivo 20, Optimizer с добавленными аминокислотами, пируватом натрия и витаминами, либо без сыворотки, либо с добавлением соответствующего количества сыворотки (или плазмы) или определенного набора гормонов и/или ряда цитокинов, достаточных для роста и размножения Т-клеток. Антибиотики, например, пенициллин и стрептомицин, включены только в экспериментальные культуры, но не в культуры клеток, которые будут вводиться субъекту. Клетки-мишени содержат в условиях, необходимых для поддержания роста, например, в подходящей температуре (например, 37°С) и атмосфере (например, воздух с 5% CO₂).

Т-клетки, подвергшиеся воздействию в течение различных периодов стимуляции, могут иметь разные характеристики. Например, типичные продукты мононуклеарных клеток периферической крови или афереза имеют популяцию хелперных Т-клеток (T_H, CD4⁺), которая больше, чем популяция цитотоксических или супрессорных Т-клеток (T_C, CD8⁺). Ex vivo размножение Т-клеток путем стимуляции рецепторов CD3 и CD28 приводит к образованию популяции Т-клеток, которые примерно до 8-9-го дня состоят преимущественно из клеток T_H, тогда как примерно через 8-9 дней указанная популяция Т-клеток включает все более многочисленную популяцию клеток T_C. Соответственно, в зависимости от цели лечения может быть предпочтительным введение субъекту популяции Т-клеток, включающей преимущественно клетки T_H. Аналогично, если выделено антигенспецифическая подгруппа T_C-клеток, может быть полезным размножение этой подгруппа в большей степени.

Кроме того, в дополнение к маркерам CD4 и CD8 другие фенотипические маркеры значительно различаются, но в значительной степени воспроизводимы во время процесса размножения клеток. Таким образом, такая воспроизводимость дает возможность адаптировать активированный Т-клеточный продукт для конкретных целей.

Матрицы

В данном изобретении предусмотрена матричная или субстратная композиция, содержащая пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, клетку, модифицированную для экспрессии пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен, или их комбинацию. Например, в одном воплощении пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, клетка, модифицированная для экспрессии пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен, или их комбинация находятся в матрице. В другом воплощении пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, клетку, модифицированную для экспрессии пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен, или их комбинацию наносят на поверхность матрицы. Матрица согласно данному изобретению может быть любого типа, известного в данной области. Неограничивающие примеры таких матриц включают гидрогель, электроформованную матрицу, пену, сетку, лист, пластырь и губку.

Фармацевтические композиции

Данное изобретение также предуматривает фармацевтические композиции, содержащим одну или более чем одну из композиций, описанных в данном документе. Составы могут быть использованы в смесях с обычными эксципиентами, т.е. с фармацевтически приемлемыми органическими или неорганическими веществами-носителями, подходящими для введения в рану или на место лечения. Фармацевтические композиции можно стерилизовать и, если нужно, смешивать со вспомогательными агентами, например, смазывающими агентами, консервантами, стабилизаторами, смачивающими агентами, эмульгаторами, солями для воздействия на буферы осмотического давления, красителями и/или ароматическими веществами и т.п. Их также можно комбинировать, если нужно, с другими активными агентами, например, с другими анальгетиками.

Введение композиций согласно данному изобретению можно осуществлять, например, путем парентеральной, внутривенной, внутриопухолевой, подкожной, внутримышечной или внутрибрюшинной инъекции или путем инфузии или любым другим приемлемым системным способом.

Используемые в данном документе "дополнительные ингредиенты" включают, но не ограничиваясь ими, один или более чем один из следующих агентов: эксципиенты; поверхностно-активные агенты; диспергирующие агенты; инертные разбавители; гранулирующие и дезинтегрирующие агенты; связывающие агенты; смазочные агенты; красители; консерванты; физиологически разлагаемые композиции, такие как желатин; водные носители и растворители; масляные носители и растворители; суспендирующие агенты; диспергирующие или смачивающие агенты; эмульгирующие агенты, смягчающие агенты; буферы; соли; загустители; наполнители; эмульгаторы; антиоксиданты; антибиотики; противогрибковые агенты; стабилизирующие агенты; и фармацевтически приемлемые полимерные или гидрофобные материалы. Другие "дополнительные ингредиенты", которые могут быть включены в фармацевтические композиции согласно данному изобретению, известны в данной области и описаны, например, в публикации Genaro, ed. (1985, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack PublishingCo., Easton, PA), которая включена в данный документ посредством ссылки.

Композиция согласно данному изобретению может содержать консервант в количестве примерно от 0,005% до 2,0% от общей массы композиции. Консервант используется для предотвращения порчи в случае воздействия загрязняющих веществ из окружающей среды. Примеры консервантов, которые могут быть использованы в соответствии с изобретением, включают, но не ограничиваясь ими, такие, которые выбраны из группы, состоящей из бензилового спирта, сорбиновой кислоты, парабенов, имидуреи и их комбинаций. Особенно предпочтительным консервантом является комбинация примерно от 0,5 до 2,0% бензилового спирта и от 0,05 до 0,5% сорбиновой кислоты.

В одном воплощении указанная композиция включает антиоксидант и хелатирующий агент, который ингибирует деградацию одного или более чем одного из компонентов композиции. Предпочтительными антиоксидантами для некоторых соединений являются бутилгидрокситолуол (ВНТ), бутилгидроксианизол (ВНА), альфа-токоферол и аскорбиновая кислота в предпочтительном диапазоне от примерно 0,01% до 0,3%, и более предпочтительно ВНТ в диапазоне от 0,03 до 0,1% по массе от общей массы композиции. Предпочтительно, хелатирующий агент присутствует в количестве от 0,01 до 0,5% по массе от общей массы композиции. Особенно предпочтительные хелатирующие агенты включают соли эдетата (например, динатриевый эдетат) и лимонную кислоту в диапазоне примерно от 0,01% до 0,20%, и более предпочтительно в диапазоне от 0,02% до 0,10% по массе от общей массы композиции. Хелатирующий агент используется для хелатирования ионов металлов в композиции, которые могут быть вредными для срока годности состава. Хотя ВНТ и динатриевый эдетат для некоторых соединений являются особенно предпочтительным антиоксидантом и хелатирующим агентом, соответственно, они могут быть заменены другими подходящими и эквивалентными антиоксидантами и хелатирующими агентами, которые известны специалистам в данной области.

Жидкие суспензии могут быть получены обычными способами для получения суспензии пептида или другой композиции согласно данному изобретению в водном или масляном носителе. Водные носители включают, например, воду и изотонический солевой раствор. Масляные носители включают, например, миндальное масло, масляные сложные эфиры, этиловый спирт, растительные масла, такие как арахисовое, оливковое, кунжутное или кокосовое масло, фракционированные растительные масла и минеральные масла, такие как жидкий парафин. Жидкие суспензии могут также содержать один или более чем один из дополнительных ингредиентов, включая, но не ограничиваясь ими, суспендирующие агенты, диспергирующие или смачивающие агенты, эмульгирующие агенты, смягчающие агенты, консерванты, буферы, соли, ароматизаторы, красители и подсластители. Масляные суспензии могут также содержать загуститель. Известные суспендирующие агенты включают, но не ограничиваясь ими, сироп сорбита, гидрогенированные пищевые жиры, альгинат натрия, поливинилпирролидон, трагакант камеди, аравийскую камедь и производные целлюлозы, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, метилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза. Известные диспергирующие или смачивающие агенты включают, но не ограничиваясь ими, природные фосфатиды, такие как лецитин, продукты конденсации алкиленоксида с жирной кислотой, с длинноцепочечным алифатическим спиртом, с неполным эфиром, полученным из жирной кислоты и гекситола, или с неполным эфиром, полученным из жирной кислоты и ангидрида гекситола (например, полиоксиэтиленстеарата, гептадекаэтиленоксицетанола, моноолеата полиоксиэтиленсорбита и моноолеата полиоксиэтиленсорбитана, соответственно). Известные эмульгаторы включают, но не ограничиваясь ими, лецитин и аравийскую камедь. Известные консерванты включают, но не ограничиваясь ими, метил-, этил- или н-пропил-пара-гидроксибензоаты, аскорбиновую кислоту и сорбиновую кислоту.

Терапевтическое применение

Данное изобретение предусматривает способ лечения или профилактики рака у субъекта, нуждающегося в этом. Этот способ может быть использован для лечения любого рака, включая гематологическую злокачественность, солидную опухоль, первичную или метастазирующую опухоль.

В одном воплощении указанный способ включает контактирование субъекта с композицией согласно данному изобретению. Например, в некоторых воплощениях указанный способ включает контактирование субъекта с композицией, содержащей пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, клетку, модифицированную для экспрессии пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен, или их комбинацию. В одном воплощении указанный способ включает контактирование субъекта с композицией, содержащей пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий Т-клетку, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий Т-клетку, клетку, модифицированную для экспрессии пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен и домен, связывающий Т-клетку, или их комбинацию.

Данное изобретение предусматривает применение пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен, для специфического связывания с опухолевой клеткой посредством связывания с ТАСА, присутствующим на опухолевой клетке. В некоторых воплощениях указанный пептид используют для привлечения Т-клетки к опухолевой клетке, экспрессирующей ТАСА, путем связывания домена, связывающего Т-клетку, с Т-клеткой. Таким образом, данное изобретение также предусматривает способ стимуляции иммунного ответа, опосредуемого Т-клеткой, в отношении целевой популяции клеток или ткани у млекопитающего, включающий этап введения млекопитающему композиции, описанной в данном документе.

В некоторых воплощениях указанный способ включает контактирование субъекта с композицией, содержащей пептид, который связывается с ТАСА-связывающим доменом, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, который связывается с ТАСА-связывающим доменом, или клетку, модифицированную для экспрессии пептида, который связывается с ТАСА-связывающим доменом. Например, в одном воплощении указанный способ включает контактирование субъекта с композицией, содержащей пептид, содержащий лектинсвязывающий домен, нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид, содержащий лектинсвязывающий домен, или клетку, модифицированную для экспрессии пептида, содержащего лектинсвязывающий домен, где лектинсвязывающий домен связывается с лектином или с пептидом, полученным из лектина, который связывается с ТАСА.

В одном воплощении указанный способ включает (1) введение композиции, содержащей пептид, который связывается с ТАСА-связывающим доменом, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, который связывается с ТАСА-связывающим доменом, или клетку, модифицированную для экспрессии пептида, который связывается с ТАСА-связывающим доменом; и (2) введение композиции, содержащей ТАСА-связывающий домен или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен. Например, в одном воплощении указанный способ включает введение композиции, содержащей лектин или пептид, полученный из лектина, который связывает ТАСА, и введение биспецифического антитела, которое связывается с пептидом, полученным из лектина или пептида, полученного из лектина. В одном воплощении указанный способ включает введение клетки, генетически модифицированной для экспрессии CAR, где CAR содержит антигенсвязывающую группировку, содержащую лектинсвязывающий домен, и введение композиции, содержащей лектин или пептид, полученный из лектина, который связывается с ТАСА, так что CAR связывается с лектином или пептидом, полученным из лектина, который связывается с ТАСА. В некоторых случаях может быть выгодным введение ТАСА-связывающего лектина и лектинсвязывающей композиции (например, Т-клеток, сконструированных для экспрессии антилектинового CAR). Во-первых, этот способ может иметь возможность ограничивать время ответа Т-клеток, поскольку период полужизни лектина намного короче, чем у сконструированной Т-клетки. Сконструированные Т-клетки могут оставаться в течение многих лет, но без лектина Т-клетки были бы неактивными, что позволяло бы легче нацеливаться на солидный рак, ограничивая стойкость ответа.

В одном воплощении данное изобретение включает тип клеточной терапии, при котором Т-клетки генетически модифицируют для экспрессии пептида согласно данному изобретению, и клетку вводят реципиенту, нуждающемуся в этом. В некоторых воплощениях введенная клетка способна уничтожать опухолевые клетки у реципиента. В отличие от терапии антителами модифицированные клетки способны реплицироваться in vivo, что приводит к длительной персистенции, которая может привести к устойчивому контролю над опухолью.

В одном воплощении модифицированные Т-клетки согласно данному изобретению могут подвергаться интенсивному размножению Т-клеток in vivo и персистировать в течение длительного времени. В другом воплощении модифицированные Т-клетки согласно данному изобретению эволюционируют в специфические Т-клетки памяти, которые могут реактивироваться для ингибирования любого дополнительного формирования или роста опухоли. Например, модифицированные Т-клетки согласно данному изобретению могут подвергаться интенсивному размножению Т-клеток in vivo и персистировать на высоких уровнях в течение длительного времени в кровотоке и костном мозге и формировать специфические Т-клетки памяти.

Раковые опухоли, которые можно лечить, включают опухоли, которые не васкуляризированы или еще не полностью васкуляризированы, а также васкуляризированные опухоли. Раковые опухоли могут включать несолидные опухоли (такие как гематологические опухоли, например лейкемии и лимфомы) или могут включать солидные опухоли. Типы рака, подлежащие лечению с помощью CAR согласно данному изобретению, включают, но не ограничиваясь ими, карциному, бластому и саркому, а также определенные лейкемии или лимфоидные злокачественные образования, доброкачественные и злокачественные опухоли и злокачественные образования, например саркомы, карциномы и меланомы. Также включены опухоли/раки взрослых и педиатрические опухоли/раки.

Гематологические раковые опухоли представляют собой рак крови или костного мозга. Примеры гематологических (или гематогенных) раковых опухолей включают лейкемии, включая острые лейкемии (такие как острая лимфоцитарная лейкемия, острая миелоцитарная лейкемия, острая миелогенная лейкемия и миелобластная, промиелоцитарнаая, миеломоноцитарная, моноцитарная и эритролейкемия), хронические лейкемии (такие как хроническая миелоцитарная (гранулоцитарная) лейкемия, хроническая миелогенная лейкемия и хроническая лимфоцитарная лейкемия), истинную полицитемию, лимфому, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому (индолентную и высокой степени злокачественности), множественную миелому, макроглобулинемию Вальденстрема, болезнь тяжелой цепи, миелодиспластический синдром, волосатолкеточную лейкемию и миелодисплазию.

Солидные опухоли представляют собой аномальные массы ткани, которые обычно не содержат кисты или жидкие области. Солидные опухоли могут быть доброкачественными или злокачественными. Различные типы солидных опухолей называются по типу клеток, которые их образуют (например, саркомы, карциномы и лимфомы). Примеры солидных опухолей, таких как саркомы и карциномы, включают фибросаркому, миксосаркому, липосаркому, хондросаркому, остеосаркому и другие саркомы, синовиому, мезотелиому, опухоль Юинга, лейомиосаркому, рабдомиосаркому, карциному толстой кишки, лимфоидную злокачественность, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак легкого, рак яичника, рак предстательной железы, гепатоцеллюлярную карциному, плоскоклеточную карциному, базальноклеточную карциному, аденокарциному, карциному потовой железы, карциному щитовидной железы, папиллярную карциному щитовидной железы, феохромоцитомы, карциному сальной железы, папиллярную карциному, папиллярную аденокарциному, медуллярную карциному, бронхогенную карциному, почечно-клеточную карциному, гепатому, карциному желчных протоков, хориокарциному, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, семиному, карциному мочевого пузыря, меланому и опухоли ЦНС (такие как глиому (такую как глиома головного мозга и смешанные глиомы), глиобластому (также известную как мультиформная глиобластома), астроцитому, лимфому ЦНС, герминому, медуллобластому, шванному, краниофарингиому, эпендимому, пиналому, гемангиобластому, акустическую неврому, олигодендроглиому, менангиому, нейробластому, ретинобластому и метастазы в мозг).

Композиции согласно данному изобретению можно вводить либо отдельно, либо в виде фармацевтической композиции в комбинации с разбавителями и/или с другими компонентами, такими как IL-2 или другие цитокины или популяции клеток. Вкратце, фармацевтические композиции согласно данному изобретению могут содержать композицию, описанную в данном документе, в комбинации с одним или более чем одним из фармацевтически или физиологически приемлемых носителей, разбавителей или эксципиентов. Такие композиции могут содержать буферы, такие как нейтральный забуференный физиологический раствор, забуференный фосфатом физиологический раствор и т.п.; углеводы, такие как глюкозу, маннозу, сахарозу или декстраны, маннит; белки; полипептиды или аминокислоты, такие как глицин; антиоксиданты; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) или глутатион; адъюванты (например, гидроксид алюминия); и консерванты.

Фармацевтические композиции согласно данному изобретению можно' вводить способом, соответствующим заболеванию, подлежащему лечению (или профилактике). Количество и частота введения будут определяться такими факторами как состояние пациента, тип и тяжесть заболевания пациента, хотя соответствующие дозы могут определяться клиническими испытаниями.

Когда указывается "иммунологически эффективное количество", "противоопухолевое эффективное количество", "эффективное количество, ингибирующее опухоль" или "терапевтическое количество", точное количество композиций согласно данному изобретению, подлежащих введению, может определить врач с учетом индивидуальных различий в возрасте, весе, размере опухоли, степени инфицирования или метастазирования и состоянии пациента (субъекта).

Введение указанных композиций может осуществляться любым удобным способом, в том числе путем аэрозольной ингаляции, инъекции, приема внутрь, трансфузии, имплантации или трансплантации. Композиции, описанные в данном документе, могут вводиться пациенту подкожно, внутрикожно, внутрь опухоли, в лимфатический узел, в костный мозг, внутримышечно, путем внутривенной инъекции (i.v.) или внутрибрюшинно. В одном воплощении композиции согласно данному изобретению вводят пациенту путем внутрикожной или подкожной инъекции. В другом воплощении композиции согласно данному изобретению вводят путем внутривенной инъекции. В некоторых воплощениях композиции будут вводиться непосредственно в опухоль или лимфатический узел.

В некоторых воплощениях композиции вводят пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) любым числом релевантных способов лечения, включая, но не ограничиваясь ими, лечение путем химиотерапии, лучевой терапии, иммунодепрессантами, такими как циклоспорин, азатиоприн, метотрексат, микофенолат и FK506, антителами или другими иммуноаблативными агентами, такими как САМРАТН, анти-CD3-антителами или другими антителами, цитоксином, флударибином, циклоспорином, FK506, рапамицином, микофенольной кислотой, стероидами, FR901228, цитокинами и облучением. Эти лекарственные препараты либо ингибируют кальцийзависимую фосфатазу кальциневрин (циклоспорин и FK506), либо ингибируют киназу p70S6, которая важна для передачи сигналов, индуцированных фактором роста (рапамицин) (Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). В другом воплощении композиции согласно данному изобретению вводят пациенту в сочетании с (например, до, одновременно или после) трансплантацией костного мозга, направленной на Т-клетки аблативной терапией с использованием либо химиотерапевтических агентов, таких как флударабин, наружной дистанционной лучевой терапии (external-beam radiation therapy, XRT), циклофосфамида или антител, таких как OKT3 или САМРАТН. В другом воплощении композиции согласно данному изобретению вводят после направленной на В-клетки аблативной терапии, такой как агентами, которые реагируют с CD20, например, ритуксаном. Например, в одном воплощении субъекты могут пройти стандартное лечение с помощью высокодозовой химиотерапии, за которой следует трансплантация стволовых клеток периферической крови. В некоторых воплощениях после трансплантации субъекты получают инфузию размноженных иммунных клеток согласно данному изобретению. В дополнительном воплощении размноженные клетки вводят до или после операции.

В некоторых воплощениях указанную композицию согласно данному изобретению вводят во время хирургической резекции или циторедуктивной операции на опухоли или пораженной ткани. Например, у субъектов, подвергающихся хирургическому лечению пораженной ткани или опухоли, композицию можно вводить в место для дальнейшего лечения опухоли.

В одном воплощении указанный способ включает введение субъекту матрицы, содержащей пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид, содержащий ТАСА-связывающий домен, клетку, модифицированную для экспрессии пептида, содержащего ТАСА-связывающий домен, или их комбинацию.

Субъекты, к которым относится введение композиций и фармацевтических композиций согласно данному изобретению, включают, но не ограничиваясь ими, людей и приматов, млекопитающих, включая коммерчески значимых млекопитающих, таких как приматы, крупный рогатый скот, свиньи, лошади, овцы, кошки и собаки.

Дозы вышеуказанного лечения, которые должны вводиться пациенту, будут варьировать в зависимости от точной природы состояния, которое лечат, и от реципиента, получающего лечение. Масштабирование дозировок для введения человеку может осуществляться в соответствии с принятой в данной области практикой. Стратегии Т-клеточного дозирования и введения обсуждались в Ertl et al, 2011, Cancer Res, 71:3175-81; Junghans, 2010, Journal of Translational Medicine, 8:55.

Экспериментальные примеры

Далее данное изобретение подробно описано со ссылкой на следующие экспериментальные примеры. Эти примеры приведены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения, если не указано иное. Таким образом, данное изобретение никоим образом не должно истолковываться как ограниченное следующими примерами, а скорее должно толковаться как охватывающее любые и все варианты, которые становятся очевидными в результате приведенного в данном документе объяснения.

Без дальнейшего описания считается, что специалист в данной области сможет с использованием предыдущего описания и последующих иллюстративных примеров сделать и использовать данное изобретение и применять заявленные способы. Поэтому следующие рабочие примеры конкретно указывают на предпочтительные воплощения данного изобретения и не должны истолковываться как ограничивающие каким-либо образом оставшуюся часть описания.

Пример 1: Гликан-зависимый рекрутер Т-клеток (GlyTR)

Злокачественная трансформация клеток почти повсеместно сопровождается аберрантными изменениями гликозилирования на клеточной поверхности (Kim and Varki, 1997, Glycoconj J, 14: 569-576). Действительно, изменение гликозилирования клеточной поверхности наблюдалось во всех типах экспериментальных и человеческих раковых заболеваний (Hakomori, 2002, PNAS USA, 99: 10231-10233), и эти измененные сахарные структуры называются углеводными антигенами, ассоциированными с опухолью (ТАСА) (таблица 1). Это специфичное для опухоли свойство делает ТАСА на поверхности клеток превосходным антигеном-мишенью для производства моноклональных антител, нацеленных на многие распространенные раковые образования. Тем не менее, несмотря на десятилетия усилий специфические антитела с высокой аффинностью к ТАСА еще недоступны из-за трудностей создания антител, направленных против углеводных антигенов.

Один из способов решения этой проблемы заключается в использовании лектинов, белков, которые связывают углеводы. Эволюция создала сотни различных углеводсвязывающих белков, которые являются высокоспецифичными для многих различных углеводных группировок. Кроме того, лектины как от растений, так и от животных широко использовались в течение десятилетий, и их связывающие свойства хорошо известны.

В данном документе описан класс химерных белков, которые состоят из углеводсвязывающего домена из лектина, связанного с доменом антитела, который связывает Т-клетки и/или другие клетки, уничтожающие раковые клетки. Этот класс химерных белков упоминается в данном документе как гликан-зависимый Т-клеточный рекрутер (GlyTR). Химерные GlyTR-белки разработаны для нацеливания на раковые специфические углеводные антигены и приводят к их гибели, опосредованной Т-клетками. Примеры новых GlyTR-молекул приведены в таблице 2.

Чтобы продемонстрировать использование GlyTR-молекул, был разработан и получен GlyTR, который нацелен на CD3 на Т-клетках и β1,6-GlcNAc-разветвленные Asn(N)-связанные гликаны, углеводную структуру, которая часто сверхэкспрессирована на многих различных типах раковых клеток, включая эпителиальные и гемопоэтические раковые заболевания.

β1,6GlcNac-разветвленные N-гликаны представляют собой трех- и четырехантеннарные олигосахариды, которые составляют подмножество N-гликанов комплексного типа (фиг. 1). Для измерения уровня β1,6GlcNAc-разветвления на клетках использовали высокоспецифический растительный лектин L-PHA (Phaseolus vulgaris, лейкоагглютинин). Чтобы использовать свойство L-PHA высокоспецифического связывания с β1,6GlcNac-разветвленными N-гликанами и технологию биспецифического антитела, был создан новый биспецифический химерный белок путем образования одноцепочечного полипептида, состоящего как из лектина L-PHA, так и из анти-CD3-scFv (L-PHA×CD3, фиг. 2).

Проточный цитометрический анализ подтвердил, что GlyTR L-PHA×CD3 специфически связывает β1,6GlcNac-разветвленные N-гликаны, о чем свидетельствует полная отмена связывания с K562, клеточной линией хронической миелогенной лейкемии, когда клетки предварительно обрабатывали ингибитором разветвления из аппарата Гольджи кифуненсином (фиг. 3). Связывание с CD3 также подтверждалось анализом Т-клеток Юркат, экспрессирующих CD3 и обработанных кифуненсином, где обработка устраняла связывание с β1,6GlcNac-разветвленными N-гликанами (фиг. 3).

GlyTR L-PHA×CD3 анализировали на его способность направлять Т-клеточное уничтожение против K562, В-клеточной лимфомы (Раджи), множественной миеломы (RPMI 8226), острой лимфобластной лейкемии (RS411), аденокарциномы молочной железы (MCF7), колоректальной аденокарциномы (НТ-29), клеток гепатоцеллюлярной карциномы печени (Hep G2) и цервикальной опухоли (HeLa) с использованием неактивированных человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) в качестве эффекторных клеток в анализе антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) (фиг. 4A-4J). Результаты показывают, что GlyTR L-РНА×CD3 дозозависимо индуцирует Т-клеточное уничтожение раковых клеток. Важно отметить, что уничтожение раковых клеток, которые были предварительно обработаны ингибитором β1,6GlcNac-разветвления из аппарата Гольджи кифуненсином, было сильно подавлено (фиг. 4В), демонстрируя, что уничтожение, вызванное GlyTR L-PHA×CD3, зависит от наличия углеводного антигена. Более того, уничтожение РВМС "мимо мишеней" (нераковых РВМС) было крайне низким, демонстрируя специфичность в отношении рака (фиг. 4С).

Таким образом, химерные GlyTR-белки дают возможность разработать новый класс терапевтических препаратов для иммунотерапии рака с существенными преимуществами по сравнению с существующими технологиями. Основываясь на концепции GlyTR и на наличии множества различных лектинов, специфических для многих разных ТАСА, многие GlyTR могут быть разработаны путем замены L-PHA на другие лектины; или химерные белки, которые мы можем получить, состоят из лектинов и scFv, которые могут привлекать другие иммунные эффекторные клетки.

Функциональность лектинового домена может быть улучшена посредством мутации. Например, GlyTR L-PHA×CD3 может быть дополнительно улучшен путем замены углеводного связывающего домена Е-РНА на L-PHA, что увеличивает связывание примерно в 20-30 раз (Kaneda et al., 2002, J Biol Chem, 277: 16928-16935). GlyTR L-PHA×CD3, по-видимому, является димером, и если это окажется проблематичным, то первые пять N-концевых аминокислот домена L-PHA, которые опосредуют формирование димера, могут быть удалены в белке GlyTR L-PHA×CD3 для предотвращения димеризации. Наконец, помимо создания биспецифического химерного белка, лектины могут быть использованы в терапии на основе химерных антигенных рецепторов для лечения рака (Barrett et al., 2014, Ann Rev Med, 65: 333-347).

Пример 2. Аминокислотные и нуклеотидные последовательности

GlyTR L-PHA×CD3

Лидерная последовательность - L-PHA - Линкер - анти-CD3-scFv - His-метка

Последовательность белка: 525 аминокислот

Мутантный GlyTR L-PHA×CD3 для мономеризации молекулы.

Лидерная последовательность - L-PHA_(Δ1-5) - Линкер - анти-CD3-scFv - His-метка

Последовательность белка: 520 аминокислот

Мутантный GlyTR L-PHA×CD3 для увеличения аффинности связывания.

Лидерная последовательность - Мутантный L-PHA - Линкер - анти-CD3-scFv - His-метка

Последовательность белка

Мутантный GlyTR L-PHA×CD3 для мономеризации молекулы и для увеличения аффинности связывания.

Лидерная последовательность - Мутантный L-PHA- Линкер - анти-CD3-scFv - His-метка

Последовательность белка

Изолектин В от Vicia villosa×CD3 scFv (VVAb×CD3)

VVA - Линкер - анти-CD3-scFV - His-метка

Последовательность белка

VVAb×CD3 (VVAb_Δ1-5×CD3 scFV)

VVAb_Δ1-5 - Линкер - анти-CD3-scFV - His-метка

Последовательность белка

Внеклеточный домен CD301×CD3 scFv (CD301_EC×CD3)

CD301_EC - Линкер - анти-CD3-scFV - His-метка

Последовательность белка

GlyTR L-PHA×CD3

Последовательность гена: 1604 п.о. (оптимизация по кодонам для 293 и СНО)

EcoRI - Последовательность Козака - Лидерная последовательность - L-РНА - Линкер - анти-CD3-scFv - His-метка - Xbal

Последовательности EcoRI и Xbal подчеркнуты. Последовательность Козака выделена жирным

Раскрытие информации о каждом патенте, заявке на патент и публикации, цитируемой в данном документе, настоящим включено в данный документ посредством ссылки во всей их полноте. Хотя данное изобретение раскрыто со ссылкой на конкретные воплощения, очевидно, что другие воплощения и варианты этого изобретения могут быть разработаны специалистами в данной области без отхода от истинной сущности и объема данного изобретения. Приложенная формула изобретения должна быть истолкована как включающая все такие воплощения и эквивалентные варианты.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> The Regents of the University of California

Demetriou, Michael

Zhou, Raymond Wenhou

<120> Glycan-dependent Immunotherapeutic Molecules

<130> 206101-0004-00-WO.605180

<150> US 62/155,761

<151> 2015-05-01

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 252

<212> PRT

<213> Phaseolus vulgaris

<400> 1

Ser Asn Asp Ile Tyr Phe Asn Phe Gln Arg Phe Asn Glu Thr Asn Leu

1 5 10 15

Ile Leu Gln Arg Asp Ala Ser Val Ser Ser Ser Gly Gln Leu Arg Leu

20 25 30

Thr Asn Leu Asn Gly Asn Gly Glu Pro Arg Val Gly Ser Leu Gly Arg

35 40 45

Ala Phe Tyr Ser Ala Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr Thr Gly Thr

50 55 60

Val Ala Ser Phe Ala Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Gln Val Pro Asn

65 70 75 80

Asn Ala Gly Pro Ala Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val Pro Val Gly

85 90 95

Ser Gln Pro Lys Asp Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Asp Gly Ser

100 105 110

Asn Ser Asn Phe His Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Leu Tyr Asn

115 120 125

Lys Asp Trp Asp Pro Thr Glu Arg His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser

130 135 140

Ile Arg Ser Ile Lys Thr Thr Arg Trp Asp Phe Val Asn Gly Glu Asn

145 150 155 160

Ala Glu Val Leu Ile Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Asn Leu Leu Val Ala

165 170 175

Ser Leu Val Tyr Pro Ser Gln Lys Thr Ser Phe Ile Val Ser Asp Thr

180 185 190

Val Asp Leu Lys Ser Val Leu Pro Glu Trp Val Ser Val Gly Phe Ser

195 200 205

Ala Thr Thr Gly Ile Asn Lys Gly Asn Val Glu Thr Asn Asp Val Leu

210 215 220

Ser Trp Ser Phe Ala Ser Lys Leu Ser Asp Gly Thr Thr Ser Glu Gly

225 230 235 240

Leu Asn Leu Ala Asn Leu Val Leu Asn Lys Ile Leu

245 250

<210> 2

<211> 247

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 2

Phe Asn Phe Gln Arg Phe Asn Glu Thr Asn Leu Ile Leu Gln Arg Asp

1 5 10 15

Ala Ser Val Ser Ser Ser Gly Gln Leu Arg Leu Thr Asn Leu Asn Gly

20 25 30

Asn Gly Glu Pro Arg Val Gly Ser Leu Gly Arg Ala Phe Tyr Ser Ala

35 40 45

Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr Thr Gly Thr Val Ala Ser Phe Ala

50 55 60

Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Gln Val Pro Asn Asn Ala Gly Pro Ala

65 70 75 80

Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val Pro Val Gly Ser Gln Pro Lys Asp

85 90 95

Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Asp Gly Ser Asn Ser Asn Phe His

100 105 110

Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Leu Tyr Asn Lys Asp Trp Asp Pro

115 120 125

Thr Glu Arg His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser Ile Arg Ser Ile Lys

130 135 140

Thr Thr Arg Trp Asp Phe Val Asn Gly Glu Asn Ala Glu Val Leu Ile

145 150 155 160

Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Asn Leu Leu Val Ala Ser Leu Val Tyr Pro

165 170 175

Ser Gln Lys Thr Ser Phe Ile Val Ser Asp Thr Val Asp Leu Lys Ser

180 185 190

Val Leu Pro Glu Trp Val Ser Val Gly Phe Ser Ala Thr Thr Gly Ile

195 200 205

Asn Lys Gly Asn Val Glu Thr Asn Asp Val Leu Ser Trp Ser Phe Ala

210 215 220

Ser Lys Leu Ser Asp Gly Thr Thr Ser Glu Gly Leu Asn Leu Ala Asn

225 230 235 240

Leu Val Leu Asn Lys Ile Leu

245

<210> 3

<211> 252

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 3

Ala Ser Gln Thr Ser Phe Ser Phe Gln Arg Phe Asn Glu Thr Asn Leu

1 5 10 15

Ile Leu Gln Arg Asp Ala Thr Val Ser Ser Lys Gly Gln Leu Arg Leu

20 25 30

Thr Asn Val Asn Asp Asn Gly Glu Pro Thr Leu Ser Ser Leu Gly Arg

35 40 45

Ala Phe Tyr Ser Ala Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr Thr Gly Ala

50 55 60

Val Ala Ala Ser Pro Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Asp Val Pro Asn

65 70 75 80

Asn Ser Gly Pro Ala Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val Pro Val Gly

85 90 95

Ser Gln Pro Lys Asp Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Asp Gly Ser

100 105 110

Asn Ser Asn Phe His Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Leu Tyr Asn

115 120 125

Lys Asp Trp Asp Pro Lys Pro Arg His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser

130 135 140

Ile Lys Ser Ile Lys Thr Thr Thr Trp Asp Phe Val Lys Gly Glu Asn

145 150 155 160

Ala Glu Val Leu Ile Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Lys Leu Leu Val Ala

165 170 175

Ser Leu Val Tyr Pro Ser Leu Lys Thr Ser Phe Ile Val Ser Asp Thr

180 185 190

Val Asp Leu Lys Ser Val Leu Pro Glu Trp Val Ile Val Gly Phe Thr

195 200 205

Ala Thr Thr Gly Ile Thr Lys Gly Asn Val Glu Thr Asn Asp Ile Leu

210 215 220

Ser Trp Ser Phe Ala Ser Lys Leu Ser Asp Gly Thr Thr Ser Glu Ala

225 230 235 240

Leu Asn Leu Ala Asn Phe Ala Leu Asn Gln Ile Leu

245 250

<210> 4

<211> 247

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 4

Phe Ser Phe Gln Arg Phe Asn Glu Thr Asn Leu Ile Leu Gln Arg Asp

1 5 10 15

Ala Thr Val Ser Ser Lys Gly Gln Leu Arg Leu Thr Asn Val Asn Asp

20 25 30

Asn Gly Glu Pro Thr Leu Ser Ser Leu Gly Arg Ala Phe Tyr Ser Ala

35 40 45

Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr Thr Gly Ala Val Ala Ala Ser Pro

50 55 60

Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Asp Val Pro Asn Asn Ser Gly Pro Ala

65 70 75 80

Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val Pro Val Gly Ser Gln Pro Lys Asp

85 90 95

Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Asp Gly Ser Asn Ser Asn Phe His

100 105 110

Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Leu Tyr Asn Lys Asp Trp Asp Pro

115 120 125

Lys Pro Arg His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser Ile Lys Ser Ile Lys

130 135 140

Thr Thr Thr Trp Asp Phe Val Lys Gly Glu Asn Ala Glu Val Leu Ile

145 150 155 160

Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Lys Leu Leu Val Ala Ser Leu Val Tyr Pro

165 170 175

Ser Leu Lys Thr Ser Phe Ile Val Ser Asp Thr Val Asp Leu Lys Ser

180 185 190

Val Leu Pro Glu Trp Val Ile Val Gly Phe Thr Ala Thr Thr Gly Ile

195 200 205

Thr Lys Gly Asn Val Glu Thr Asn Asp Ile Leu Ser Trp Ser Phe Ala

210 215 220

Ser Lys Leu Ser Asp Gly Thr Thr Ser Glu Ala Leu Asn Leu Ala Asn

225 230 235 240

Phe Ala Leu Asn Gln Ile Leu

245

<210> 5

<211> 233

<212> PRT

<213> Vicia villosa

<400> 5

Thr Glu Ser Thr Ser Phe Ser Phe Thr Asn Phe Asn Pro Asn Gln Asn

1 5 10 15

Asn Leu Ile Leu Gln Glu Asp Ala Leu Val Asn Ser Ala Gly Thr Leu

20 25 30

Glu Leu Thr Ala Val Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Asp Ser Leu Gly

35 40 45

Arg Ala Leu Tyr Ala Ala Pro Ile His Ile His Asp Asn Thr Thr Leu

50 55 60

Ala Ser Phe Thr Thr Ser Phe Ser Phe Val Met Ala Ala Pro Ala Ala

65 70 75 80

Ala Ala Val Ala Asp Gly Leu Ala Phe Phe Leu Ala Pro Pro Asp Thr

85 90 95

Gln Pro Gln Ala Arg Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Ala Asp Arg Ala

100 105 110

His Asp Ala Ser Tyr Gln Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Tyr Ser

115 120 125

Asn Ala Trp Asp Pro Asn Tyr Thr His Ile Gly Ile Asp Thr Asn Gly

130 135 140

Ile Glu Ser Lys Lys Thr Thr Pro Phe Asp Met Val Tyr Gly Glu Lys

145 150 155 160

Ala Asn Ile Val Ile Thr Tyr Gln Ala Ser Thr Lys Ala Leu Ala Ala

165 170 175

Ser Leu Val Phe Pro Val Ser Gln Thr Ser Tyr Ala Val Ser Ala Arg

180 185 190

Val Asp Leu Arg Asp Ile Leu Pro Glu Tyr Val Arg Val Gly Phe Ser

195 200 205

Ala Thr Thr Gly Leu Asn Ala Gly Val Val Glu Thr His Asp Ile Val

210 215 220

Ser Trp Ser Phe Ala Val Ser Leu Ala

225 230

<210> 6

<211> 228

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically synthesized

<400> 6

Phe Ser Phe Thr Asn Phe Asn Pro Asn Gln Asn Asn Leu Ile Leu Gln

1 5 10 15

Glu Asp Ala Leu Val Asn Ser Ala Gly Thr Leu Glu Leu Thr Ala Val

20 25 30

Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Asp Ser Leu Gly Arg Ala Leu Tyr Ala

35 40 45

Ala Pro Ile His Ile His Asp Asn Thr Thr Leu Ala Ser Phe Thr Thr

50 55 60

Ser Phe Ser Phe Val Met Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Val Ala Asp

65 70 75 80

Gly Leu Ala Phe Phe Leu Ala Pro Pro Asp Thr Gln Pro Gln Ala Arg

85 90 95

Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Ala Asp Arg Ala His Asp Ala Ser Tyr

100 105 110

Gln Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Tyr Ser Asn Ala Trp Asp Pro

115 120 125

Asn Tyr Thr His Ile Gly Ile Asp Thr Asn Gly Ile Glu Ser Lys Lys

130 135 140

Thr Thr Pro Phe Asp Met Val Tyr Gly Glu Lys Ala Asn Ile Val Ile

145 150 155 160

Thr Tyr Gln Ala Ser Thr Lys Ala Leu Ala Ala Ser Leu Val Phe Pro

165 170 175

Val Ser Gln Thr Ser Tyr Ala Val Ser Ala Arg Val Asp Leu Arg Asp

180 185 190

Ile Leu Pro Glu Tyr Val Arg Val Gly Phe Ser Ala Thr Thr Gly Leu

195 200 205

Asn Ala Gly Val Val Glu Thr His Asp Ile Val Ser Trp Ser Phe Ala

210 215 220

Val Ser Leu Ala

225

<210> 7

<211> 256

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 7

Gln Asn Ser Lys Phe Gln Arg Asp Leu Val Thr Leu Arg Thr Asp Phe

1 5 10 15

Ser Asn Phe Thr Ser Asn Thr Val Ala Glu Ile Gln Ala Leu Thr Ser

20 25 30

Gln Gly Ser Ser Leu Glu Glu Thr Ile Ala Ser Leu Lys Ala Glu Val

35 40 45

Glu Gly Phe Lys Gln Glu Arg Gln Ala Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu

50 55 60

His Thr Thr Gln Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser

65 70 75 80

Val Cys Val Pro Val His Ser Glu Met Leu Leu Arg Val Gln Gln Leu

85 90 95

Val Gln Asp Leu Lys Lys Leu Thr Cys Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn

100 105 110

Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His

115 120 125

Gln Asp Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly Met Ser Trp Ala Glu

130 135 140

Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Lys Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn

145 150 155 160

Ser Arg Glu Glu Gln Asn Phe Val Gln Lys Tyr Leu Gly Ser Ala Tyr

165 170 175

Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp Pro Glu Gly Ala Trp Lys Trp Val Asp

180 185 190

Gly Thr Asp Tyr Ala Thr Gly Phe Gln Asn Trp Lys Pro Gly Gln Pro

195 200 205

Asp Asp Trp Gln Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His

210 215 220

Phe His Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro Tyr

225 230 235 240

His Trp Val Cys Glu Ala Gly Leu Gly Gln Thr Ser Gln Glu Ser His

245 250 255

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 8

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 9

<211> 243

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 9

Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys

145 150 155 160

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser

165 170 175

Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser

180 185 190

Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser

195 200 205

Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys

210 215 220

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

225 230 235 240

Glu Leu Lys

<210> 10

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 10

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 11

<211> 525

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 11

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Ser Asn Asp Ile Tyr Phe Asn Phe Gln Arg Phe Asn Glu

20 25 30

Thr Asn Leu Ile Leu Gln Arg Asp Ala Ser Val Ser Ser Ser Gly Gln

35 40 45

Leu Arg Leu Thr Asn Leu Asn Gly Asn Gly Glu Pro Arg Val Gly Ser

50 55 60

Leu Gly Arg Ala Phe Tyr Ser Ala Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr

65 70 75 80

Thr Gly Thr Val Ala Ser Phe Ala Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Gln

85 90 95

Val Pro Asn Asn Ala Gly Pro Ala Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val

100 105 110

Pro Val Gly Ser Gln Pro Lys Asp Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe

115 120 125

Asp Gly Ser Asn Ser Asn Phe His Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr

130 135 140

Leu Tyr Asn Lys Asp Trp Asp Pro Thr Glu Arg His Ile Gly Ile Asp

145 150 155 160

Val Asn Ser Ile Arg Ser Ile Lys Thr Thr Arg Trp Asp Phe Val Asn

165 170 175

Gly Glu Asn Ala Glu Val Leu Ile Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Asn Leu

180 185 190

Leu Val Ala Ser Leu Val Tyr Pro Ser Gln Lys Thr Ser Phe Ile Val

195 200 205

Ser Asp Thr Val Asp Leu Lys Ser Val Leu Pro Glu Trp Val Ser Val

210 215 220

Gly Phe Ser Ala Thr Thr Gly Ile Asn Lys Gly Asn Val Glu Thr Asn

225 230 235 240

Asp Val Leu Ser Trp Ser Phe Ala Ser Lys Leu Ser Asp Gly Thr Thr

245 250 255

Ser Glu Gly Leu Asn Leu Ala Asn Leu Val Leu Asn Lys Ile Leu Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala

275 280 285

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr

290 295 300

Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly

305 310 315 320

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr

325 330 335

Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser

340 345 350

Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

355 360 365

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

370 375 380

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln

405 410 415

Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val

420 425 430

Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr

435 440 445

Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser

450 455 460

Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

465 470 475 480

Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala

485 490 495

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala

500 505 510

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His

515 520 525

<210> 12

<211> 520

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 12

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Phe Asn Phe Gln Arg Phe Asn Glu Thr Asn Leu Ile Leu

20 25 30

Gln Arg Asp Ala Ser Val Ser Ser Ser Gly Gln Leu Arg Leu Thr Asn

35 40 45

Leu Asn Gly Asn Gly Glu Pro Arg Val Gly Ser Leu Gly Arg Ala Phe

50 55 60

Tyr Ser Ala Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr Thr Gly Thr Val Ala

65 70 75 80

Ser Phe Ala Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Gln Val Pro Asn Asn Ala

85 90 95

Gly Pro Ala Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val Pro Val Gly Ser Gln

100 105 110

Pro Lys Asp Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Asp Gly Ser Asn Ser

115 120 125

Asn Phe His Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Leu Tyr Asn Lys Asp

130 135 140

Trp Asp Pro Thr Glu Arg His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser Ile Arg

145 150 155 160

Ser Ile Lys Thr Thr Arg Trp Asp Phe Val Asn Gly Glu Asn Ala Glu

165 170 175

Val Leu Ile Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Asn Leu Leu Val Ala Ser Leu

180 185 190

Val Tyr Pro Ser Gln Lys Thr Ser Phe Ile Val Ser Asp Thr Val Asp

195 200 205

Leu Lys Ser Val Leu Pro Glu Trp Val Ser Val Gly Phe Ser Ala Thr

210 215 220

Thr Gly Ile Asn Lys Gly Asn Val Glu Thr Asn Asp Val Leu Ser Trp

225 230 235 240

Ser Phe Ala Ser Lys Leu Ser Asp Gly Thr Thr Ser Glu Gly Leu Asn

245 250 255

Leu Ala Asn Leu Val Leu Asn Lys Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Asp

260 265 270

Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

275 280 285

Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

290 295 300

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

305 310 315 320

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

325 330 335

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

340 345 350

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

355 360 365

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

370 375 380

Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro

405 410 415

Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg

420 425 430

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

435 440 445

Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly

450 455 460

Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

465 470 475 480

Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

485 490 495

Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

500 505 510

Leu Lys His His His His His His

515 520

<210> 13

<211> 525

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 13

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Ala Ser Gln Thr Ser Phe Ser Phe Gln Arg Phe Asn Glu

20 25 30

Thr Asn Leu Ile Leu Gln Arg Asp Ala Thr Val Ser Ser Lys Gly Gln

35 40 45

Leu Arg Leu Thr Asn Val Asn Asp Asn Gly Glu Pro Thr Leu Ser Ser

50 55 60

Leu Gly Arg Ala Phe Tyr Ser Ala Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr

65 70 75 80

Thr Gly Ala Val Ala Ala Ser Pro Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Asp

85 90 95

Val Pro Asn Asn Ser Gly Pro Ala Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val

100 105 110

Pro Val Gly Ser Gln Pro Lys Asp Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe

115 120 125

Asp Gly Ser Asn Ser Asn Phe His Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr

130 135 140

Leu Tyr Asn Lys Asp Trp Asp Pro Lys Pro Arg His Ile Gly Ile Asp

145 150 155 160

Val Asn Ser Ile Lys Ser Ile Lys Thr Thr Thr Trp Asp Phe Val Lys

165 170 175

Gly Glu Asn Ala Glu Val Leu Ile Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Lys Leu

180 185 190

Leu Val Ala Ser Leu Val Tyr Pro Ser Leu Lys Thr Ser Phe Ile Val

195 200 205

Ser Asp Thr Val Asp Leu Lys Ser Val Leu Pro Glu Trp Val Ile Val

210 215 220

Gly Phe Thr Ala Thr Thr Gly Ile Thr Lys Gly Asn Val Glu Thr Asn

225 230 235 240

Asp Ile Leu Ser Trp Ser Phe Ala Ser Lys Leu Ser Asp Gly Thr Thr

245 250 255

Ser Glu Ala Leu Asn Leu Ala Asn Phe Ala Leu Asn Gln Ile Leu Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala

275 280 285

Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr

290 295 300

Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly

305 310 315 320

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr

325 330 335

Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser

340 345 350

Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala

355 360 365

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

370 375 380

Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser

385 390 395 400

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln

405 410 415

Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val

420 425 430

Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr

435 440 445

Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser

450 455 460

Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

465 470 475 480

Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala

485 490 495

Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala

500 505 510

Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His

515 520 525

<210> 14

<211> 520

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 14

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Phe Ser Phe Gln Arg Phe Asn Glu Thr Asn Leu Ile Leu

20 25 30

Gln Arg Asp Ala Thr Val Ser Ser Lys Gly Gln Leu Arg Leu Thr Asn

35 40 45

Val Asn Asp Asn Gly Glu Pro Thr Leu Ser Ser Leu Gly Arg Ala Phe

50 55 60

Tyr Ser Ala Pro Ile Gln Ile Trp Asp Asn Thr Thr Gly Ala Val Ala

65 70 75 80

Ala Ser Pro Thr Ser Phe Thr Phe Asn Ile Asp Val Pro Asn Asn Ser

85 90 95

Gly Pro Ala Asp Gly Leu Ala Phe Ala Leu Val Pro Val Gly Ser Gln

100 105 110

Pro Lys Asp Lys Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Asp Gly Ser Asn Ser

115 120 125

Asn Phe His Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Leu Tyr Asn Lys Asp

130 135 140

Trp Asp Pro Lys Pro Arg His Ile Gly Ile Asp Val Asn Ser Ile Lys

145 150 155 160

Ser Ile Lys Thr Thr Thr Trp Asp Phe Val Lys Gly Glu Asn Ala Glu

165 170 175

Val Leu Ile Thr Tyr Asp Ser Ser Thr Lys Leu Leu Val Ala Ser Leu

180 185 190

Val Tyr Pro Ser Leu Lys Thr Ser Phe Ile Val Ser Asp Thr Val Asp

195 200 205

Leu Lys Ser Val Leu Pro Glu Trp Val Ile Val Gly Phe Thr Ala Thr

210 215 220

Thr Gly Ile Thr Lys Gly Asn Val Glu Thr Asn Asp Ile Leu Ser Trp

225 230 235 240

Ser Phe Ala Ser Lys Leu Ser Asp Gly Thr Thr Ser Glu Ala Leu Asn

245 250 255

Leu Ala Asn Phe Ala Leu Asn Gln Ile Leu Gly Gly Gly Gly Ser Asp

260 265 270

Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser

275 280 285

Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

290 295 300

Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly

305 310 315 320

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

325 330 335

Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met

340 345 350

Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

355 360 365

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

370 375 380

Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

385 390 395 400

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro

405 410 415

Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg

420 425 430

Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly

435 440 445

Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly

450 455 460

Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu

465 470 475 480

Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln

485 490 495

Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu

500 505 510

Leu Lys His His His His His His

515 520

<210> 15

<211> 487

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 15

Thr Glu Ser Thr Ser Phe Ser Phe Thr Asn Phe Asn Pro Asn Gln Asn

1 5 10 15

Asn Leu Ile Leu Gln Glu Asp Ala Leu Val Asn Ser Ala Gly Thr Leu

20 25 30

Glu Leu Thr Ala Val Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Asp Ser Leu Gly

35 40 45

Arg Ala Leu Tyr Ala Ala Pro Ile His Ile His Asp Asn Thr Thr Leu

50 55 60

Ala Ser Phe Thr Thr Ser Phe Ser Phe Val Met Ala Ala Pro Ala Ala

65 70 75 80

Ala Ala Val Ala Asp Gly Leu Ala Phe Phe Leu Ala Pro Pro Asp Thr

85 90 95

Gln Pro Gln Ala Arg Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Ala Asp Arg Ala

100 105 110

His Asp Ala Ser Tyr Gln Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Tyr Ser

115 120 125

Asn Ala Trp Asp Pro Asn Tyr Thr His Ile Gly Ile Asp Thr Asn Gly

130 135 140

Ile Glu Ser Lys Lys Thr Thr Pro Phe Asp Met Val Tyr Gly Glu Lys

145 150 155 160

Ala Asn Ile Val Ile Thr Tyr Gln Ala Ser Thr Lys Ala Leu Ala Ala

165 170 175

Ser Leu Val Phe Pro Val Ser Gln Thr Ser Tyr Ala Val Ser Ala Arg

180 185 190

Val Asp Leu Arg Asp Ile Leu Pro Glu Tyr Val Arg Val Gly Phe Ser

195 200 205

Ala Thr Thr Gly Leu Asn Ala Gly Val Val Glu Thr His Asp Ile Val

210 215 220

Ser Trp Ser Phe Ala Val Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile

225 230 235 240

Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val

245 250 255

Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met

260 265 270

His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

275 280 285

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp

290 295 300

Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln

305 310 315 320

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

325 330 335

Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr

340 345 350

Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

355 360 365

Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala

370 375 380

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala

385 390 395 400

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

405 410 415

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val

420 425 430

Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

435 440 445

Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

450 455 460

Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu

465 470 475 480

Lys His His His His His His

485

<210> 16

<211> 482

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 16

Phe Ser Phe Thr Asn Phe Asn Pro Asn Gln Asn Asn Leu Ile Leu Gln

1 5 10 15

Glu Asp Ala Leu Val Asn Ser Ala Gly Thr Leu Glu Leu Thr Ala Val

20 25 30

Ala Ala Gly Ala Pro Val Pro Asp Ser Leu Gly Arg Ala Leu Tyr Ala

35 40 45

Ala Pro Ile His Ile His Asp Asn Thr Thr Leu Ala Ser Phe Thr Thr

50 55 60

Ser Phe Ser Phe Val Met Ala Ala Pro Ala Ala Ala Ala Val Ala Asp

65 70 75 80

Gly Leu Ala Phe Phe Leu Ala Pro Pro Asp Thr Gln Pro Gln Ala Arg

85 90 95

Gly Gly Phe Leu Gly Leu Phe Ala Asp Arg Ala His Asp Ala Ser Tyr

100 105 110

Gln Thr Val Ala Val Glu Phe Asp Thr Tyr Ser Asn Ala Trp Asp Pro

115 120 125

Asn Tyr Thr His Ile Gly Ile Asp Thr Asn Gly Ile Glu Ser Lys Lys

130 135 140

Thr Thr Pro Phe Asp Met Val Tyr Gly Glu Lys Ala Asn Ile Val Ile

145 150 155 160

Thr Tyr Gln Ala Ser Thr Lys Ala Leu Ala Ala Ser Leu Val Phe Pro

165 170 175

Val Ser Gln Thr Ser Tyr Ala Val Ser Ala Arg Val Asp Leu Arg Asp

180 185 190

Ile Leu Pro Glu Tyr Val Arg Val Gly Phe Ser Ala Thr Thr Gly Leu

195 200 205

Asn Ala Gly Val Val Glu Thr His Asp Ile Val Ser Trp Ser Phe Ala

210 215 220

Val Ser Leu Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser

225 230 235 240

Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys

245 250 255

Thr Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln

260 265 270

Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg

275 280 285

Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr

290 295 300

Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr

305 310 315 320

Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His

325 330 335

Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

340 345 350

Val Glu Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

355 360 365

Val Asp Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser

370 375 380

Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser

385 390 395 400

Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp

405 410 415

Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser

420 425 430

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu

435 440 445

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro

450 455 460

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His

465 470 475 480

His His

<210> 17

<211> 510

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 17

Gln Asn Ser Lys Phe Gln Arg Asp Leu Val Thr Leu Arg Thr Asp Phe

1 5 10 15

Ser Asn Phe Thr Ser Asn Thr Val Ala Glu Ile Gln Ala Leu Thr Ser

20 25 30

Gln Gly Ser Ser Leu Glu Glu Thr Ile Ala Ser Leu Lys Ala Glu Val

35 40 45

Glu Gly Phe Lys Gln Glu Arg Gln Ala Gly Val Ser Glu Leu Gln Glu

50 55 60

His Thr Thr Gln Lys Ala His Leu Gly His Cys Pro His Cys Pro Ser

65 70 75 80

Val Cys Val Pro Val His Ser Glu Met Leu Leu Arg Val Gln Gln Leu

85 90 95

Val Gln Asp Leu Lys Lys Leu Thr Cys Gln Val Ala Thr Leu Asn Asn

100 105 110

Asn Ala Ser Thr Glu Gly Thr Cys Cys Pro Val Asn Trp Val Glu His

115 120 125

Gln Asp Ser Cys Tyr Trp Phe Ser His Ser Gly Met Ser Trp Ala Glu

130 135 140

Ala Glu Lys Tyr Cys Gln Leu Lys Asn Ala His Leu Val Val Ile Asn

145 150 155 160

Ser Arg Glu Glu Gln Asn Phe Val Gln Lys Tyr Leu Gly Ser Ala Tyr

165 170 175

Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp Pro Glu Gly Ala Trp Lys Trp Val Asp

180 185 190

Gly Thr Asp Tyr Ala Thr Gly Phe Gln Asn Trp Lys Pro Gly Gln Pro

195 200 205

Asp Asp Trp Gln Gly His Gly Leu Gly Gly Gly Glu Asp Cys Ala His

210 215 220

Phe His Pro Asp Gly Arg Trp Asn Asp Asp Val Cys Gln Arg Pro Tyr

225 230 235 240

His Trp Val Cys Glu Ala Gly Leu Gly Gln Thr Ser Gln Glu Ser His

245 250 255

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu

260 265 270

Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Thr Ser Gly Tyr

275 280 285

Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln

290 295 300

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn

305 310 315 320

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser

325 330 335

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

340 345 350

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp

355 360 365

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Val Glu Gly Gly

370 375 380

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Val Asp Asp Ile

385 390 395 400

Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys

405 410 415

Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp

420 425 430

Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr

435 440 445

Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Tyr Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser

450 455 460

Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala

465 470 475 480

Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly

485 490 495

Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys His His His His His His

500 505 510

<210> 18

<211> 1604

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Chemically Synthesized

<400> 18

gaattcccgc cgccaccatg ggttggtctt gcatcatcct gttcctggtc gccactgcta 60

ctggggtcca ctcttctaac gacatctact ttaactttca gcgtttcaat gagacaaacc 120

tgatcctgca gagggacgcc agcgtgtcca gctctggcca gctgcggctg accaacctga 180

atggcaacgg agagccaagg gtgggctccc tgggacgggc cttctattcc gcccccatcc 240

agatctggga caataccaca ggcacagtgg cctccttcgc cacctccttc accttcaaca 300

tccaagtgcc caacaatgcc ggccctgctg atggcctggc cttcgctctg gtgccagtgg 360

gctctcagcc caaggacaag ggcggcttcc tgggcctctt tgatggcagc aattctaact 420

tccacaccgt ggctgtggag tttgacacac tgtacaataa ggactgggac cccaccgaga 480

ggcatatcgg catcgacgtg aactccatca gaagcatcaa gaccacaaga tgggattttg 540

tgaatggcga gaacgccgag gtcctgatca cctatgattc cagcacaaac ctgctggtgg 600

ctagcctggt gtacccctct cagaagacct ccttcatcgt gagcgataca gtggatctga 660

agtctgtgct gcctgagtgg gtgtctgtgg gcttttccgc caccaccggc atcaataagg 720

gcaacgtgga gaccaatgac gtgctgtcct ggagctttgc ctctaagctg tccgatggca 780

ccacatctga gggcctgaat ctggctaacc tggtgctgaa caagatcctg ggcggcggcg 840

gctctgacat caagctgcag cagtccggag ctgagctggc taggcctgga gctagcgtga 900

agatgtcttg caagacctcc ggctacacct tcacaaggta tacaatgcac tgggtcaagc 960

agagacccgg ccagggcctg gagtggatcg gctatatcaa tccttcccgg ggctatacca 1020

attataacca gaagtttaag gacaaggcca ccctgaccac cgataagtct tccagcacag 1080

cttatatgca gctgtcttcc ctgaccagcg aggactctgc cgtgtactat tgcgctaggt 1140

actatgacga tcattactgt ctggattatt ggggccaagg caccacactg acagtgagct 1200

ctgtggaggg aggctccgga ggcagcggag gctctggagg ctccggagga gtggacgaca 1260

tccagctgac ccagtcccct gccatcatgt ctgcttcccc cggcgagaag gtcaccatga 1320

catgcagggc ctccagctct gtgagctaca tgaactggta tcagcagaag agcggcacat 1380

ctcctaagag atggatctac gacaccagca aggtggcctc tggcgtgcca tataggttca 1440

gcggctctgg ctccggcacc agctactctc tgacaatctc cagcatggag gctgaggatg 1500

ccgctaccta ctattgtcag cagtggtctt ccaatcctct gacatttggg gctgggacta 1560

aactggaact gaaacaccac caccaccacc actgataatc taga 1604

<---

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к онкологии, и предназначена для лечения рака. Композиция для лечения рака включает (I) по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из: а) пептида, содержащего домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (TACA), полученный из лектина, и домен распознавания иммунной клетки, который специфически связывается с рецептором на иммунной эффекторной клетке; и b) изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, содержащий TACA-связывающий домен, полученный из лектина, и домен распознавания иммунной клетки, который специфически связывается с рецептором на иммунной эффекторной клетке.; и (II) фармацевтически приемлемый носитель. TACA-связывающий домен специфически связывается с TACA опухолевой клетки и TACA-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% гомологией с SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7. Лектин и иммунная эффекторная клетка выбраны из заявленных групп. Также представлены слитый пептид для лечения и изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный слитый пептид. Использование группы изобретений позволяет повысить эффективность лечения рака. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 6 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Композиция для лечения рака, включающая:

(I) по меньшей мере одно, выбранное из группы, состоящей из:

а) пептида, содержащего домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (TACA), полученный из лектина, и домен распознавания иммунной клетки, который специфически связывается с рецептором на иммунной эффекторной клетке; и

b) изолированной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид, содержащий TACA-связывающий домен, полученный из лектина, и домен распознавания иммунной клетки, который специфически связывается с рецептором на иммунной эффекторной клетке,

где TACA-связывающий домен специфически связывается с TACA опухолевой клетки и TACA-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% гомологией с SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7;

где лектин выбран из группы, состоящей из следующих: галектин, сиглек, селектин; лектин С-типа; CD301, лейкоагглютинин Phaseolus vulgaris (L-PHA); эритроагглютинин Phaseolus vulgaris (E-PHA); лектин томата (лектин Lycopersicon esculentum, LEA); лектин арахиса (агглютинин Arachis hypogaea; PNA); картофельный лектин (лектин Solanum tuberosum), митоген фитолакки американской (лектин Phytolacca American), агглютинин зародышей пшеницы (лектин Triticum Vulgaris); лектин Artocarpus polyphemus (лектин джакалин); агглютинин Vicia villosa (VVA); агглютинин Helix pomatia (HPA); агглютинин Wisteria floribunda (WFA); агглютинин Sambucus nigra (SNA), лектин из грамотрицательных бактерий Burkholderia cenocepacia (BC2L-CNt), лейкоагглютинин Maackia amurensis (MAL), Psathyrella velutina (PVL), лектин Sclerotium rolfsii (SRL), агглютинин Eucheuma serra (ESA), CLEC17A (Пролектин), лектин Aleuria aurantia, лектин Sambucus sieboldiana (SSA), лектин Glechoma hederacea (Gleheda), агглютинин Morus nigra (Morniga G), лектин Salvia sclarea, лектин Salvia bogotensis, лектин Salvia horminum, лектин Clerodendrum trichotomum, лектин Moluccella laevis, Griffonia simplicifolia (GsLA4), Psophocarpus tetragonolobus (кислотный WBAI), лектин Abrus precatorius, лектин Amaranthus caudatus, лектин Amaranthus leucocarpus, лектин Laelia autumnalis, лектин Artocarpus integrifolia, лектин Maclura pomifera, лектин Artocarpus lakoocha, агглютинин Dolichos biflorus, лектин Dolichos biflorus, лектин Glycine max и лектин Agaricus bisporus; и

где иммунная эффекторная клетка выбрана из группы, состоящей из следующих: Т-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), Т-клетки натуральные киллеры (NKT), макрофаги, моноциты, дендритные клетки и нейтрофилы; и

(II) фармацевтически приемлемый носитель.

2. Композиция по п. 1, где галектин выбран из группы, состоящей из: галектина-1, галектина-2, галектина-3, галектина-4, галектина-5, галектина-6, галектина-7, галектина-8, галектина-9, галектина-10, галектина-11, галектина-12, галектина-13, галектина-14 и галектина-15.

3. Композиция по п. 1, где сиглек выбран из группы, состоящей из: сиглека-1 (сиалоадгезия), сиглека-2 (CD22), сиглека-3 (CD33), сиглека-4 (ассоциированный с миелином гликопротеин), сиглека-5, сиглека-6, сиглека-7, сиглека-8, сиглека-9, сиглека-10, сиглека-11, сиглека-12, сиглека-13, сиглека-14, сиглека-15, сиглека-16, сиглека-17, сиглека E, сиглека F, сиглека G и сиглека H.

4. Композиция по п. 1, где TACA-связывающий домен связывается с β1,6GlcNAc-разветвленными N-гликанами опухолевой клетки.

5. Композиция по п. 1, где TACA-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO 1, SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6 и SEQ ID NO 7.

6. Композиция по п. 1, где пептид представляет собой Fc-гибридный пептид, содержащий TACA-связывающий домен, связанный с Fc-доменом.

7. Композиция по п. 1, где домен распознавания иммунной клетки, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий Т-клетку, где домен, связывающий Т-клетку, специфически связывается с Т-клеткой.

8. Композиция по п. 7, где домен, связывающий Т-клетку, связывается по меньшей мере с одним из группы, состоящей из: CD3, Т-клеточного рецептора, CD2, CD28 и CD25.

9. Композиция по п. 7, где домен, связывающий Т-клетку, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO 9 и аминокислотной последовательности, обладающей более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 9.

10. Композиция по п. 7, где пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из: SEQ ID NO 11, аминокислотной последовательности, обладающей более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 12, аминокислотной последовательности, обладающей более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, аминокислотной последовательности, обладающей более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 14, аминокислотной последовательности, обладающей более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 15, аминокислотной последовательности, обладающей более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 16, аминокислотной последовательности, обладающей более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 17 и аминокислотной последовательности, обладающей более чем 90% гомологией с SEQ ID NO 17.

11. Композиция по п. 1, где домен распознавания иммунной клетки, который специфически связывается с иммунной эффекторной клеткой, содержит домен, связывающий NK-клетку, где домен, связывающий NK-клетку, специфически связывается с NK-клеткой.

12. Композиция по п. 11, где домен, связывающий NK-клетку, связывается по меньшей мере с одним из группы, состоящей из: CD16 и NKG2D.

13. Слитый пептид для лечения рака, содержащий домен, связывающий ассоциированный с опухолью углеводный антиген (TACA), полученный из лектина, и домен распознавания иммунной клетки, который специфически связывается с рецептором на иммунной эффекторной клетке,

где TACA-связывающий домен специфически связывается с TACA опухолевой клетки и TACA-связывающий домен содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7, или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% гомологией с SEQ ID NO 1, 2, 3, 4, 5, 6 или 7;

где лектин выбран из группы, состоящей из следующих: галектин, сиглек, селектин; лектин С-типа; CD301, лейкоагглютинин Phaseolus vulgaris (L-PHA); эритроагглютинин Phaseolus vulgaris (E-PHA); лектин томата (лектин Lycopersicon esculentum, LEA); лектин арахиса (агглютинин Arachis hypogaea; PNA); картофельный лектин (лектин Solanum tuberosum), митоген фитолакки

американской (лектин Phytolacca American), агглютинин зародышей пшеницы (лектин Triticum Vulgaris); лектин Artocarpus polyphemus (лектин джакалин); агглютинин Vicia villosa (VVA); агглютинин Helix pomatia (HPA); агглютинин Wisteria floribunda (WFA); агглютинин Sambucus nigra (SNA), лектин из грамотрицательных бактерий Burkholderia cenocepacia (BC2L-CNt), лейкоагглютинин Maackia amurensis (MAL), Psathyrella velutina (PVL), лектин Sclerotium rolfsii (SRL), агглютинин Eucheuma serra (ESA), CLEC17A (Пролектин), лектин Aleuria aurantia, лектин Sambucus sieboldiana (SSA), лектин Glechoma hederacea (Gleheda), агглютинин Morus nigra (Morniga G), лектин Salvia sclarea, лектин Salvia bogotensis, лектин Salvia horminum, лектин Clerodendrum trichotomum, лектин Moluccella laevis, Griffonia simplicifolia (GsLA4), Psophocarpus tetragonolobus (кислотный WBAI), лектин Abrus precatorius, лектин Amaranthus caudatus, лектин Amaranthus leucocarpus, лектин Laelia autumnalis, лектин Artocarpus integrifolia, лектин Maclura pomifera, лектин Artocarpus lakoocha, агглютинин Dolichos biflorus, лектин Dolichos biflorus, лектин Glycine max и лектин Agaricus bisporus; и

где иммунная эффекторная клетка выбрана из группы, состоящей из следующих: Т-клетки, клетки натуральные киллеры (NK), Т-клетки натуральные киллеры (NKT), макрофаги, моноциты, дендритные клетки и нейтрофилы.

14. Слитый пептид по п. 13, где лектин представляет собой L-PHA.

15. Слитый пептид по п. 13 или 14, где домен распознавания иммунной клетки представляет собой CD3.

16. Слитый пептид по любому из пп. 13-15, где пептид содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17, или аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 90% гомологией с SEQ ID NO 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17.

17. Слитый пептид по п. 13 или 14, где пептид представляет собой Fc-гибридный пептид, содержащий TACA-связывающий домен, связанный с Fc-доменом.

18. Изолированная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый пептид, обладающий по меньшей мере 90% гомологией с аминокислотной последовательностью, выбранной из SEQ ID NO 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17.