В этой заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №62/796575, поданной 24 января 2019 г., которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[1] Данное раскрытие относится к композициям и способам стимуляции естественных клеток-киллеров (NK).
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[2] Терапия естественными клетками-киллерами (NK) развивается как подход к лечению рака и, возможно, других заболеваний. Проблемы, связанные с полной реализацией клинического потенциала терапии NK-клетками, включают получение большого количества надежных, здоровых NK-клеток, которые проявляют высокую цитотоксичность по отношению к опухолевым клеткам; способность нацеливать NK-клетки на выбранную болезнь; и сохранение NK-клеток in vivo после введения пациенту, для достижения терапевтического эффекта. Эти проблемы частично объясняются тем фактом, что активность NK-клеток жестко регулируется балансом активирующих и ингибирующих рецепторов, включая иммунные контрольные точки. Например, лиганды для активации рецепторов NK-клеток экспрессируются только на клетках в состоянии стресса, трансформированных или инфицированных вирусом клетках, так что цитотоксическая активность NK-клеток нацелена на такие клетки для сохранения нормальной здоровой ткани. Цитотоксическая активность NK-клеток дополнительно ограничивается ингибирующими лигандами, экспрессируемыми на «собственных» клетках. В то же время ингибирующие регуляторные механизмы, контролирующие цитотоксичность NK-клеток, могут быть путем для атаки опухолевыми клетками, которые задействуют различные иммуносупрессивные взаимодействия для предотвращения иммунной атаки. Примером того, как NK-клетки противостоят иммуносупрессии опухоли, является вовлечение клеток-мишеней, меченных антителами, в индукцию NK-клетками антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC). В результате успех многих новых противоопухолевых антител зависит от наличия у пациента большого количества здоровых NK-клеток для поддержания противоопухолевой активности. В целом, в области терапии NK-клетками остается потребность в подходах к получению количества здоровых NK-клеток и стимуляции NK-клеток для достижения более высокой цитотоксичности и/или улучшения функциональности ADCC.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[3] Среди различных аспектов данного раскрытия - композиция фидерных клеток, содержащая по меньшей мере одну фидерную клетку, содержащую фрагмент кристаллизующегося (Fc) домена, который связан с внешней поверхностью фидерной клетки. В некоторых аспектах по меньшей мере одна фидерная клетка дополнительно содержит один или несколько эффекторных агентов NK-клеток. В некоторых аспектах по меньшей мере одна фидерная клетка содержит по меньшей мере один эффекторный агент NK-клеток, причем эффекторный агент NK-клетки представляет собой IL-21. В некоторых аспектах по меньшей мере одна фидерная клетка дополнительно содержит по меньшей мере два эффекторных агента NK-клеток, причем один из по меньшей мере двух эффекторных агентов NK-клетки представляет собой IL-21.
[4] Также раскрыты композиции для увеличения числа NK-клеток, не содержащие фидерных клеток, включающие сконструированную частицу, включающую Fc-домен, связанный с внешней поверхностью сконструированной частицы по любому предшествующему аспекту. В некоторых аспектах сконструированная частица дополнительно содержит один или несколько эффекторных агентов NK-клеток. В некоторых аспектах сконструированная частица дополнительно содержит по меньшей мере один эффекторный агент NK-клетки, причем эффекторный агент NK-клетки представляет собой IL-21. В некоторых аспектах сконструированная частица дополнительно содержит по меньшей мере два эффекторных агента NK-клеток, причем один из по меньшей мере двух эффекторных агентов NK-клеток представляет собой IL-21.
[5] В одном аспекте данного раскрытия представлена терапевтическая доза NK-клеток, содержащая множество NK-клеток, размноженных in vitro, в сочетании с композицией для увеличения числа NK-клеток, причем композиция не содержит фидерных клеток и включает по меньшей мере одну сконструированную частицу, которая включает Fc-домен, связанный с внешней поверхностью сконструированной частицы. В некоторых аспектах сконструированная частица дополнительно содержит один или несколько эффекторных агентов NK-клеток. В некоторых аспектах сконструированная частица дополнительно содержит по меньшей мере один эффекторный агент NK-клетки, причем эффекторный агент NK-клетки представляет собой IL-21. В некоторых аспектах сконструированная частица дополнительно содержит по меньшей мере два эффекторных агента NK-клеток, причем один из по меньшей мере двух эффекторных агентов NK-клеток представляет собой IL-21.
[6] В одном аспекте данного раскрытия представлена размноженная популяция NK-клеток, подвергнутых in vitro воздействию композиции для увеличения числа NK-клеток, причем композиция не содержит фидерных клеток и включает по меньшей мере одну сконструированную частицу плазматической мембраны (PM), как раскрыто в данном документе. В другом аспекте данного раскрытия представлена размноженная популяция NK-клеток, подвергнутых in vitro воздействию композиции для увеличения числа NK-клеток, причем композиция содержит по меньшей мере одну фидерную клетку, содержащую Fc-домен, связанный с внешней поверхностью фидерной клетки, как раскрыто в данном документе. Такие способы необязательно дополнительно включают воздействие на NK-клетки одного или нескольких эффекторных агентов NK-клеток. Один или несколько клеточных эффекторных агентов могут находиться в растворе клеточной среды и/или быть связанными с поверхностью Fc-связанной фидерной клетки или сконструированных частиц PM, как раскрыто в данном документе.
[7] В данном документе также раскрыты способы «лечения, облегчения, уменьшения и/или ингибирования рака, метастазов или инфекционного заболевания», включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества любой из описанных композиций для увеличения числа NK-клеток или инфузионного состава для увеличения числа NK-клеток, по любому из предыдущих аспектов. В одном аспекте композиции для увеличения числа NK-клеток, или инфузионный состав для увеличения числа NK-клеток, могут быть объединены или одновременно введены с терапевтическим агентом, таким как, например, противораковый терапевтический агент или противовирусный или антибиотический агент.
[8] В одном аспекте данного раскрытия раскрыты способы лечения, облегчения, уменьшения и/или ингибирования рака или метастазов до или после трансплантации стволовых клеток, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества любой из раскрытых размноженных популяций NK-клеток, которые были подвергнуты in vitro воздействию композиции для увеличения числа NK-клеток, или композиций, стимулирующих NK-клетки, или любого раскрытого инфузионного состава для стимуляции или размножения NK-клеток. Любую из описанных композиций или составов для стимуляции или размножения NK-клеток, можно вводить в сочетании с трансплантацией стволовых клеток или отдельно.
[9] В одном аспекте данного раскрытия представлен способ модулирования репертуара Т-клеток включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества любой из раскрытых размноженных популяций NK-клеток, которые были подвергнуты in vitro воздействию композиции для увеличения числа NK-клеток, или любого раскрытого инфузионного состава для увеличения числа NK-клеток.
[10] В одном аспекте данного раскрытия представлен способ предотвращения, ингибирования, уменьшения или облегчения острой или хронической реакции «трансплантат против хозяина» включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества любой из раскрытых размноженных популяций NK-клеток, которые были подвергнуты in vitro воздействию композиции для увеличения числа NK-клеток, или любого раскрытого инфузионного состава для увеличения числа NK-клеток.
[11] Другие аспекты и особенности раскрытия подробно описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[12] Фиг. 1A и 1B демонстрируют конструкт связанного с мембраной лиганда нацеливания иммунных клеток, содержащего нерасщепленный сигнальный якорь. На Фиг. 1А показана структура интегральных мембранных белков типа I и типа II, которые различаются ориентацией по отношению к их N- и C-концам. На Фиг. 1B показана структура химерного белка NA-Fc, используемого в качестве связанного с мембраной лиганда нацеливания на иммунных клетках, состоящего из трансмембранного домена нейраминидазы, который служит в качестве мембранного якоря, участка стебля и участка Fc IgG' человека.
[13] На Фиг. 2 показаны альтернативные конструкты связанных с мембраной лигандов нацеливания иммунных клеток, включающих домен Fc, содержащий сигнальный якорь нейраминидазы (NA), и увеличивающийся в длину стебль NA.
[14] На Фиг. 3 показан пример последовательности связанного с мембраной лиганда нацеливания иммунных клеток (SEQID NO: 13), с сигнальным якорем NA, слитым с доменом Fc IgG посредством RS-линкера.
[15] Фиг. 4 представляет собой схематическую диаграмму Fc стимуляции NK-клетки.
[16] На Фиг.5 показано вовлечение CD16 через участок Fc в увеличение скорости пролиферации в течение 14 дней. NK-клетки размножали из PBMC, полученных от двух доноров [L54 (круги) или L44 (квадраты), используя либо клеточные линии CSTX002 (светлые символы), либо клеточные линии CSTX002-Fc (темные символы) в качестве фидерных клеток. Вовлечение CD16 способствует увеличению пролиферации NK-клеток. NK-клетки от обоих доноров множились с одинаковой скоростью при стимуляции одним IL21 (CSTX2) или IL21 и Fc (CSTX2-Fc) до 14 дня, по достижению которого культуры стимулированные Fc делились с большей скоростью по сравнению со стимулированными только IL-21.
[17] На Фиг.6 представлены два графика, каждый из которых показывает цитотоксичность NK-клеток, размноженных из исходной популяции PBMC, полученных от другого донора. NK-клетки размножали из PBMC, используя либо клеточные линии CSTX002 (●), либо CSTX002-Fc (■) в качестве фидерных клеток. Было обнаружено, что NK-клетки, размноженные от двух разных доноров с помощью CSTX002-Fc, обладают повышенной цитотоксичностью к клеткам SKOV3.
[18] На Фиг. 7 показано, что NK-клетки от донора со слабым реагированием, размноженные с помощью Fc-связанных фидерных клеток, обладают повышенной цитотоксичностью по отношению к опухолевым мишеням, которые экспрессируют связанный с мембраной Fc для имитации покрытых антителами опухолевых клеток, которые будут провоцировать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). NK-клетки размножали из PBMC, используя либо клеточные линии CSTX002 (●), либо CSTX002-Fc (■) в качестве фидерных клеток. Было обнаружено, что NK-клетки, размноженные с помощью CSTX002-Fc, обладают повышенной цитотоксичностью к клеткам SKOV3-Fc.
[19] Фиг. 8 представляет собой серию из шести (6) графиков, каждый из которых показывает сравнительную экспрессию рецептора NK-клетками, размноженными фидерными клетками CSTX002 с (CSTX002-Fc) и без (CSTX-002) связанного с мембраной Fc. NK-клетки размножали из PBMC полученных от двух доноров L43 (●), либо L44 (■), используя либо клеточные линии CSTX002, либо CSTX002-Fc в качестве фидерных клеток. Размноженные NK-клетки анализировали на предмет экспрессии рецепторов, которые считаются важными для цитотоксической функции и хоуминга. NK-клетки, размноженные с помощью CSTX002-Fc, имеют более высокую экспрессию CD16, NKp46 и CD62L.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[20] В данном раскрытии представлены композиции и составы, содержащие агенты, стимулирующие NK-клетки, и связанные способы их применения для стимуляции NK-клеток и в различных вариантах лечения, как более подробно описано ниже
[20] Вовлечение рецептора CD16 (рецептора FcγRIIIa (CD16a) и рецептора FcγRIIIb (CD16b)) на NK-клетках потенциально является очень мощным механизмом стимуляции NK-клеток. Домен Fc (фрагмент кристаллизующегося участка) антитела распознается CD16, и связывание домена Fc с CD16 вызывает антителозависимую клеточную цитотоксичность (ADCC). В данном раскрытии описывается сконструированная стимуляция NK-клеток посредством вовлечения CD16 для улучшения размножения NK-клеток и повышения цитотоксичности NK-клеток. Иными словами, данное раскрытие предполагает стимуляцию NK-клеток с использованием Fc-домена антитела, причем Fc-домен является подходящим агонистом CD16 на NK-клетках и представлен NK-клеткам с Fc-доменом, связанным с фидерной клеткой, частицей плазматической мембраны (PM), экзосомой (EX) или твердым носителем. Fc-связанные фидерные клетки, частицы PM, экзосомы и твердые носители могут дополнительно содержать или объединяться с другими факторами, стимулирующими NK-клетки в различных формах, такими как связанный с мембраной или растворимый IL-15, IL-21, 4-1BBL, другие цитокины или другие химические составляющие, которые одновременно взаимодействуют с другими стимулирующими или ингибирующими рецепторами и соответствующими сигнальными путями. NK-клетки, размноженные в соответствии со способами и с использованием описанных здесь композиций, могут проявлять более высокую цитотоксичность, более высокую экспрессию CD16 и/или улучшенную активность ADCC. Такие NK-клетки применимы в терапевтических композициях и способах лечения заболеваний и состояний человека, включая множественные типы рака.
Определения
[22] Если не указано иное, научные и технические термины, используемые применительно к данной заявке, будут иметь значения, общепринятые для специалистов в области техники, к которой относится данное изобретение. Следующие отсылки предоставляют специалисту в области техники общее определение многих терминов, используемых в этом изобретении: Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2е изд. 1994); The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988); The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991); and Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991). В контексте данной заявки следующие термины имеют приписываемые им значения, если не указано иное.
[23] При представлении элементов данного раскрытия или его предпочтительных вариантов реализации, артикли «а», «an», «the» и «упомянутый» предназначены для обозначения существования одного или нескольких элементов. Термины «содержащий», «включающий» и «имеющий» предназначены для включения и означают, что могут быть дополнительные элементы, отличные от перечисленных.
[24] В данном документе диапазоны могут быть выражены как от «около» одного конкретного значения и/или до «около» другого конкретного значения. Когда включен такой диапазон, другой вариант реализации включает от одного конкретного значения и/или до другого конкретного значения. Точно так же, когда значения выражаются как приближения, с использованием предшествующего «около», следует понимать, что конкретное значение образует другой вариант реализации. Далее следует понимать, что конечные точки каждого из диапазонов значимы как по отношению к другой конечной точке, так и независимо от другой конечной точки. Также понятно, что существует ряд значений, раскрытых в данном документе, и что каждое значение также раскрывается здесь как «около» этого конкретного значения в дополнение к самому значению. Например, если раскрыто значение «10», то также раскрыто «около 10». Также понятно, что, когда раскрыто значение, также раскрываются «меньше или равно» значению, «больше или равно» значению и возможные диапазоны между значениями, как надлежащим образом поймет специалист в области техники. Например, если раскрыто значение «10», также раскрыто «меньше или равно 10», а также «больше или равно 10». Также понятно, что в заявке данные предоставлены в нескольких различных форматах и что эти данные представляют конечные и начальные точки, а также диапазоны для любой комбинации точек данных. Например, если раскрыты конкретная точка данных «10» и конкретная точка данных 15, подразумевается, что раскрыты значения больше, больше или равно, меньше, меньше или равно, и равно 10 и 15, а также диапазон между 10 и 15. Следует также понимать, что каждая единица между двумя конкретными единицами также является раскрытой. Например, если раскрыты 10 и 15, то также раскрываются 11, 12, 13 и 14.
[25] Используемые здесь термины «необязательный» или «необязательно» означают, что описанное далее событие или обстоятельство может или может не произойти, и что описание включает случаи, когда указанное событие или обстоятельство происходит, и случаи, когда это не происходит.
[26] Используемые здесь термины «сторона N-конца» или «аминоконцевой конец» подразумевают направление пептида, полипептида или белка и могут не означать N-конец. В некоторых аспектах, где описывается химерный или гибридный пептид, полипептид или белок, сторона N-конца может относиться только к компоненту химерного или гибридного пептида, полипептида или белка, а не ко всей структуре. Например, если обсуждается домен Fc, и домен Fc описывается как слитый со своим аминоконцевым концом или стороной N-конца, направленной внутрь клетки, в данном документе рассматриваются химерные или гибридные пептиды, полипептиды или белки, в которых сигнальный якорь находится на N-конце химерной или гибридной конструкции фактически охватывая клеточную мембрану. Таким образом, в такой химере трансмембранный якорь прикреплен к аминоконцевой стороне домена Fc, причем направленность домена Fc имеет сторону N-конца, направленного к клетке, которая перевернута относительно домена Fc на типичной B-клетке, у которой карбокси-конец обычно охватывает клеточную мембрану, а аминоконцевой конец простирается до внеклеточного матрикса.
[27] Термины «пептид», «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо для обозначения полимера из аминокислотных остатков.
[28] Используемый в данном документе термин «идентичность последовательностей» указывает количественную меру степени идентичности между двумя последовательностями по существу равной длины. Процент идентичности двух последовательностей, будь то последовательности нуклеиновых кислот или аминокислот, представляет собой количество точных совпадений между двумя выровненными последовательностями, деленное на длину более короткой последовательности и умноженное на 100. Приблизительное выравнивание последовательностей нуклеиновых кислот обеспечивается алгоритмом локальной гомологии Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981). Этот алгоритм может быть применен к аминокислотным последовательностям с помощью оценочной матрицы, разработанной Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, и нормализирован за Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986). Типичная реализация этого алгоритма для определения процента идентичности последовательности предоставлена the Genetics Computer Group (Madison, Wis.) в программном приложении “BestFit”. Другие подходящие программы для вычисления процента идентичности или сходства между последовательностями общеизвестны в данной области, например, другая программа выравнивания - это BLAST, используемая с параметрами по умолчанию. Например, BLASTN и BLASTP можно использовать со следующими параметрами по умолчанию: genetic code=standard; filter=none; strand=both; cutoff=60; expect=10; Matrix=BLOSUM62; Descriptions=50 sequences; sort by=HIGH SCORE; Databases=non-redundant, GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+Swiss protein+Spupdate+PIR. Подробности этих программ можно найти на сайте GenBank. В общем, замены представляют собой консервативные аминокислотные замены: ограничены заменами внутри членов группы 1: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группы 2: серин, цистеин, треонин и метионин; группы3: пролин; группы 4: фенилаланин, тирозин и триптофан; группы 5: аспартат, глутамат, аспарагин и глутамин.
[29] Методы определения идентичности нуклеиновой кислоты и аминокислотной последовательности общеизвестны в данной области техники. Как правило, такие методы включают определение нуклеотидной последовательности мРНК для гена и/или определение кодируемой им аминокислотной последовательности и сравнение этих последовательностей со второй нуклеотидной или аминокислотной последовательностью. Подобным образом можно определить и сравнить геномные последовательности. В целом, идентичность относится к точному соответствию нуклеотид-нуклеотид или аминокислота-аминокислота двух полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно. Две или более последовательности (полинуклеотидные или аминокислотные) можно сравнить, определив их процентную идентичность.
[30] Поскольку различные изменения могут быть внесены в описанные выше клетки и способы без отклонения от объема изобретения, предполагается, что весь материал, содержащийся в приведенном выше описании и в примерах, приведенных ниже, должны интерпретироваться как иллюстративные, а не ограничивающие.
[31] «Увеличение» может относиться к любому изменению, которое приводит к усилению симптома, заболевания, композиции, состояния или активности. Увеличение может быть любым индивидуальным, средним или средним увеличением состояния, симптома, активности, композиции в статистически значимой величине. Таким образом, увеличение может быть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% увеличением, если это увеличение статистически значимо.
[32] «Снижение» может относиться к любому изменению, которое приводит к снижению симптома, заболевания, композиции, состояния или активности. Также считается, что вещество снижает генетический выход гена, когда генетический выход продукта гена с веществом меньше по сравнению с выходом продукта гена без вещества. Также, например, снижение может представлять собой изменение симптомов расстройства таким образом, что симптомы становятся меньше, чем наблюдались ранее. Снижение может быть любым индивидуальным, средним или средним снижением состояния, симптома, активности, композиции в статистически значимой величине. Таким образом, снижение может быть 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100% снижением, если это снижение статистически значимо.
[33] «Ингибировать», «ингибирует» и «ингибиция» означают снижение активности, ответа, состояния, заболевания или другого биологического параметра. Это может включать, не ограничиваясь, полное устранение активности, реакции, состояния или заболевания. Это также может включать, например, уменьшение активности, реакции, состояния или заболевания на 10% по сравнению с нативным или контрольным уровнем. Таким образом, уменьшение может составлять 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% или любое промежуточное уменьшение по сравнению с нативным или контрольным уровнями.
[34] Под «уменьшать» или другими формами слова, такими как «уменьшает» или «уменьшение», подразумевается уменьшение события или характеристики (например, роста опухоли). Понятно, что это обычно относится к некоторому стандартному или ожидаемому значению, другими словами, это относительное значение, но не является необходимым всегда ссылаться на стандартное или относительное значение. Например, «уменьшает рост опухоли» означает уменьшение скорости роста опухоли по сравнению со стандартом или контролем.
[35] Под «предотвращать» или другими формами слова, такими как «предотвращает» или «предотвращение», подразумевается остановка конкретного события или характеристики, стабилизировать или задержать развитие или прогрессирование определенного события или характеристики или минимизировать вероятность того, что произойдет определенное событие или характеристика. Предотвращение не требует сравнения с контролем, потому что оно, как правило, более абсолютное, чем, например, уменьшение. В данном контексте что-то может быть уменьшено, но не предотвращено, а также то, что уменьшено, может быть предотвращено. Точно так же что-то может быть предотвращено, но не уменьшено, а также то, что предотвращено, может быть уменьшено. Следует понимать, что если используется уменьшение или предотвращение, если специально не указано иное, использование другого слова также является раскрытием.
[36] Термин «субъект» относится к любому индивидууму, который является мишенью введения или лечения. Субъект может быть позвоночным, например, млекопитающим. В одном аспекте субъект может быть человеком, не человекообразным приматом, коровой, лошадью, свиньей, собакой или кошкой. Субъектом также может быть морская свинка, крыса, хомяк, кролик, мышь или крот. Таким образом, субъект может быть человеком или пациентом ветеринара. Термин «пациент» относится к субъекту, находящемуся на лечении у клинициста, например, врача.
[37] Термин «терапевтически эффективный» относится к количеству используемой композиции, достаточное для послабления одной или нескольких причин или симптомов заболевания или расстройства. Такое послабление подразумевает только уменьшение или изменение, но не обязательно устранение.
[38] Термин «лечение» относится к медицинскому ведению пациенту с намерением вылечить, облегчить, стабилизировать или предотвратить заболевание, патологическое состояние или расстройство. Этот термин включает активное лечение, то есть лечение, направленное конкретно на улучшение заболевания, патологического состояния или расстройства, а также включает лечение причины, то есть лечение, направленное на устранение причины связанного заболевания, патологического состояния или расстройства. Дополнительно, этот термин включает паллиативное лечение, то есть лечение, предназначенное для облегчения симптомов, а не лечения заболевания, патологического состояния или расстройства; профилактическое лечение, то есть лечение, направленное на минимизацию или частичное или полное подавление развития ассоциированного заболевания, патологического состояния или расстройства; и поддерживающее лечение, то есть лечение, используемое в дополнение к другой специфической терапии, направленной на улучшение связанного заболевания, патологического состояния или расстройства.
[39] «Введение» субъекту включает любой путь введения или доставки агента субъекту. Введение может осуществляться любым подходящим путем, включая пероральный, местный, внутривенный, подкожный, чрескожный, трансдермальный, внутримышечный, внутрисуставной, парентеральный, внутриартериольный, внутрикожный, внутрижелудочковый, внутричерепной, внутрибрюшинный, внутриочаговый, интраназальный, ректальный, вагинальный, путем ингаляции, через имплантированный резервуар, парентерально (например, подкожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, внутрисиновиальной, внутригрудинной, интратекальной, внутрибрюшинной, внутрипеченочной, внутриочаговой и внутричерепной инъекцией или методами инфузии) и тому подобное. «Одновременное введение», «комбинированное введение», «одновременное введение» или «вводимые одновременно» в контексте данного документа означают, что соединения вводят в один и тот же момент времени или, по существу, сразу после друг друга. В последнем случае два соединения вводят в достаточно близкое время, чтобы наблюдаемые результаты были неотличимы от результатов, достигнутых при введении соединений в один и тот же момент времени. «Системное введение» относится к введению или доставке субъекту агента посредством пути, который вводит или доставляет агент в обширные области тела субъекта (например, более чем 50% тела), например, через вход в кровеносную или лимфатические системы. Напротив, «местное введение» относится к введению или доставке агента субъекту таким путем, который вводит или доставляет агент в область или область, непосредственно примыкающую к месту введения, и не вводит агент системно в терапевтически эффективном количестве. Например, агенты, вводимые местно, легко обнаруживаются в непосредственной близости от места введения, но не обнаруживаются или обнаруживаются в незначительных количествах в дистальных частях тела субъекта. Введение включает самостаятельное введение и введение другим лицом.
[40] Термины «лечить», «лечение» и их грамматические вариации, используемые в данном документе, включают введение композиции с намерением или целью частичного или полного предотвращения, отсрочки, лечения, исцеления, облегчения, уменьшения, изменения, лечения, улучшение, послабления, стабилизации, смягчение и/или снижение интенсивности или частоты одного или нескольких заболеваний или состояний, симптома заболевания или состояния или основной причины заболевания или состояния. Лечебные процедуры по изобретению можно применять превентивно, профилактически, палиативно или с лечебной целью. Профилактическое лечение назначают субъекту до начала (например, до появления явных признаков рака), во время раннего начала (например, при начальных признаках и симптомах рака) или после установленного развития рака. Профилактическое введение может происходить за день (дни) или за годы до проявления симптомов заболевания или инфекции.
(I) Fc-слитые пептиды
[41] В одном аспекте данного изобретения раскрыты сконструированные фидерные клетки, сконструированные частицы плазматической мембраны (PM), сконструированные экзосомы, сконструированные тромбоциты (включая, но не ограничиваясь ими, Fc-связанные тромбоциты) и сконструированные лимфоциты (такие как, например, лимфоциты (такие как, T клетки), сконструированные для экспрессии доменов Fc для стимуляции NK-клеток), и твердые носители, содержащие связанный с мембраной Fc-слитый пептид (называемый здесь Fc-связанными фидерными клетками, Fc-связанными PM-частицами, Fc-связанными экзосомами, Fc-связанными тромбоцитами, и Fc-связанными лимфоцитами, соответственно), причем Fc-слитый пептид содержит трансмембранный пептидный домен, связанный с аминоконцом домена Fc. В одном аспекте трансмембранный домен Fc-слитого пептида может содержать расщепленную или нерасщепленную сигнальную якорную последовательность, такую как трансмембранный домен нейраминидазы, сигнальный якорь гемагглютинин-нейраминидазы вируса парагриппа, сигнальный якорь рецептора трансферрина, сигнальный якорь от инвариантной цепи MHC класса II, сигнальный якорь от гликопротеина P, сигнальный якорь от рецептора асиалогликопротеина или сигнальный якорь от нейтральной эндопептидазы. В одном примере трансмембранный домен содержит пептидную последовательность гемагглютинин-нейраминидазы (NA) вируса парагриппа. Как схематично показано на Фиг. 1, трансмембранный пептидный домен нейраминидазы (NA) используется для соединения или связывания домена Fc с внешней поверхностью фидерной клетки. В других аспектах трансмембранный пептидный домен нейраминидазы (NA) используется для соединения или связывания домена Fc с внешней поверхностью наночастицы PM, экзосомы или твердого носителя. Пептидный домен NA состоит из N-концевого цитоплазматического хвоста, нерасщепленного сигнального якоря, который служит трансмембранным доменом, и участка стебля, который простирается от плазматической мембраны. Следует понимать, что длина участка стебля может варьироваться.
[42] Используемый в этом документе термин «пептидный домен NA» относится к пептидной последовательности, содержащей по меньшей мере пятьдесят (50) аминокислот последовательности SEQ ID NO: 1 MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICN, или последовательности имеющей по меньшей мере около 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, or 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 1.
[43] Домен Fc является лигандом, с которым связывается поверхностный рецептор NK CD16 (FcγRIII). CD16 является одним из первичных рецепторов на NK-клетках, и когда CD16 связывается с Fc-частью антитела (например, с Fc-доменом IgG1, IgG2, IgG3 и/или IgG4), это активирует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) опосредованную NK-клетками. В другом аспекте домен Fc (IgG1, IgG2, IgG3 и/или IgG4 также может связывать рецептор CD16 на других иммунных клетках, таких как тучные клетки, макрофаги, гамма-дельта Т-клетки; и, таким образом, будет аналогичным образом стимулировать размножение и повышать цитотоксичность таких клеток. В другом аспекте другие типы клеток могут быть сконструированы так, чтобы быть Fc-связанными. Таким образом, данное раскрытие также включает, например, сконструированные тромбоциты, связанные с Fc, образцы первичной опухоли, связанные с Fc, которые можно использовать для противоопухолевых вакцин, и сконструированные ИПСК, экспрессирующие Fc.
[44] В другом аспекте другие изотипы иммуноглобулина Fc (IgA, IgE, IgM), отличные от IgG, могут быть использованы для стимуляции соответствующих различных рецепторов Fc для стимуляции других типов иммунных клеток. Например, домен FcαRI (CD89) специфически связывается с IgA на макрофагах, нейтрофилах, эозинофилах; FcγRI (CD64) специфически связывается с IgG на моноцитах и макрофагах; а FcεRII (CD23) специфически связывается с IgE на В-клетках. Fc связывается с CD64 на моноцитах или макрофагах и стимулирует их таким образом. Таким образом, слитые пептиды, Fc-связанные фидерные клетки (FC), Fc-связанные лимфоциты, Fc-связанные сконструированные частицы плазматической мембраны (PM), Fc-связанные сконструированные экзосомы и композиции, содержащие их, также могут быть использованы для увеличения числа тучных клеток и/или макрофагов, по существу в соответствии со способами, описанными в данном документе, для увеличения числа NK-клеток.
[45] В одном аспекте в этом документе раскрыты слитые пептиды, содержащие домен Fc иммуноглобулина (например, домен Fc IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и/или IgE), слитый с трансмембранным доменом, например пептидным доменом NA, как описано выше. Домен(ы) Fc может быть представлен в виде мономерного, димерного или мультимерного конструкта. В одном аспекте домен(ы) Fc можно дополнительно модифицировать для оптимизации или усиления опосредованного антителами киллинга, распознавания NK-клеток и контроля распространения активирующих рецепторов Fc. Например, домен(ы) Fc можно модифицировать для увеличения аффинности к CD16. Таким образом, например, домен(ы) Fc может содержать одну или несколько мутаций, таких как, например, T256A, K290A, S298A, E333A, K334A, L235V, F243L, R292P, Y300L и/или P396L. Точно так же домен(ы) Fc можно дополнительно модифицировать для увеличения селективности связывания с активирующим Fc (IIIa) по сравнению с ингибирующим (IIb) рецептором. Таким образом, например, домен(ы) Fc может содержать одну, две, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь или более мутаций или альтернативных форм, таких как, например, S239D, I332E, A330L, F243L, R292P, V305I и/или P396L. Например, в одном аспекте домен Fc может быть модифицирован для включения R292L, Y300L, V305I и P396L. В другом примере домен Fc может быть модифицирован для включения S239D, I332E и A330L. В другом аспекте сконструированные мутанты Fc-доменов, имеющие более низкую аффинность, могут быть использованы для получения более высокой экспрессии CD16 на NK-клетках.
[46] Трансмембранный домен, например пептидный домен NA, может быть связан непосредственно с доменом Fc через химическую связь или косвенно, с помощью линкера. Прямая химическая связь представляет собой, например, ковалентную связь (например, пептидную связь, сложноэфирную связь и т.п.) или, альтернативно, нековалентную связь (например, ионную, электростатическую, водородную, гидрофобную, Ван-дер-Ваальские взаимодействия или π-эффекты). Непрямая связь может быть достигнута с использованием линкера, то есть химической группы, которая связывает одну или несколько других химических групп посредством по меньшей мере одной ковалентной связи. Подходящие линкеры включают аминокислоты, пептиды, нуклеотиды, нуклеиновые кислоты, димерный шарнирный Fc, молекулы органических линкеров (например, производные малеимида, N-этоксибензилимидазол, бифенил-3,4',5-трикарбоновую кислоту, пара-аминобензилоксикарбонил и т.п.), дисульфидные линкеры и полимерные линкеры (например, PEG). Линкер может включать одну или несколько промежуточных групп, включая, но не ограничиваясь ими, алкилен, алкенилен, алкинилен, алкил, алкенил, алкинил, алкокси, арил, гетероарил, аралкил, аралкенил, аралкинил и тому подобное. Линкер может быть нейтральным или нести положительный или отрицательный заряд. Кроме того, линкер может быть расщепляемым, так что ковалентная связь линкера, которая соединяет линкер с другой химической группой, может быть разорвана или расщеплена при определенных условиях, включая pH, температуру, концентрацию соли, свет, катализатор или фермент. В одном аспекте пептидный домен NA может представлять собой NA4-Fc Siadel (S239D/I332E/A330L).
[47] В одном аспекте линкер может представлять собой пептидный линкер. Примеры подходящих пептидных линкеров хорошо известны в данной области техники, а программы для создания линкеров легко доступны (см., например, Crasto et al., Protein Eng., 2000, 13(5):309-312). Пептидный линкер может быть линкером сайта рестрикции, таким как короткая последовательность RS, или гибким аминокислотным линкером (например, содержащим небольшие, неполярные или полярные аминокислоты). Неограничивающие примеры гибких линкеров включают LEGGGS (SEQ ID NO: 2), TGSG (SEQ ID NO: 3), GGSGGGSG (SEQ ID NO: 4), (GGGGS)1-4 (SEQ ID NO: 5), GGGS (SEQ ID NO: 6) 1-4, GSGGGG (SEQ ID NO: 7) 1-4, и (Gly)6-8. Альтернативно, пептидный линкер может представлять собой жесткий аминокислотный линкер. Такие линкеры включают (EAAAK)1-4 (SEQ ID NO: 8), A(EAAAK)2-5A (SEQ ID NO: 9), PAPAP (SEQ ID NO: 10), и (AP)6-8. Домен Fc может быть связан с N-концом, C-концом и/или с внутренней частью пептида NA.
[48] В некоторых аспектах слитый пептид Fc имеет аминокислотную последовательность, имеющую, по меньшей мере, около 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NOS:13. Для целевого размещение Fc-домена на плазматической мембране может быть использован мембранный нацеливающий домен из хорошо охарактеризованного белка нейраминидазы (NA) вируса гриппа, который состоит из N-концевого цитоплазматического хвоста, нерасщепленного сигнального якоря, который служит трансмембранным доменом, и участка стебля, который простирается от плазматической мембраны. Фиг. 1A и 1B схематически демонстрируют конструкт связанного с мембраной лиганда нацеливания иммунных клеток, содержащего нерасщепленный сигнальный якорь. На Фиг. 1А показана структура интегральных мембранных белков типа I и типа II и сигнальных якорей для каждого из них. На Фиг. 1В показана структура нерасщепленного сигнального якоря интегрального мембранного белка типа II, используемого в связанном с мембраной лиганде нацеливания иммунных клеток. Как показано на Фиг. 1B, типичная, но не ограничивающая конструкция согласно данному раскрытию состоит из химеры NA-Fc, в которой домен Fc (IgG1) связан с нерасщепленным участком стебля NA с помощью короткого линкера. Примечательно, что химера NA-Fc может быть вставлена в рекомбинантный вирус P/V/F для создания нового онколитического вируса, который специфичен для опухолевых клеток по сравнению с нормальными клетками (из-за мутаций P/V) и может усиливать ADCC опосредованную NK-клетками. На Фиг. 2 показаны альтернативные конструкты химеры NA-Fc с увеличением длины стебля NA.
[49] Фиг. 3 демонстрирует один пример последовательности химеры NA-Fc с доменом Fc (IgG1), связанный короткой связывающей последовательностью RS с последовательностью NA из 50 аминокислот, для получения неограничивающего примера конструкции NA-Fc, имеющего последовательность из 279 аминокислот, которая представлена ниже и показана на Фиг. 3:
[50] MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICNRSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 13). Как отмечено на Фиг. 2, конструкция NA-Fc может содержать нацеливающий домен NA (SEQ ID NO: 1), линкер (например, линкер RS), шарнирный участок DKTHTCPPCPAPELL (SEQ ID NO: 11) или TCPPCPAPELL (SEQ ID NO: 12), и Fc участок GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14) включающий домен CH2 GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 15) и домен CH3 GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 16) или секвенцию имеющую по меньшей мере около 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, или 99% идентичности последовательности с SEQ ID NO: 14, 15, или 16. Является очевидным и как предполагается в данном документе, химера NA-Fc может включать в себя нацеливающий мембранный домен любой длины из хорошо охарактеризованного белка нейраминидазы (NA) вируса гриппа, включая MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICNQNIITYKNSTWVKDTTSVILTGNSSLCPIRGWAIYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLT (SEQ ID NO: 17), или последовательности имеющей по меньшей мере около 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98, or 99% идентичности с последовательностью SEQ ID NO: 17. В одном аспекте слияние NA-Fc может содержать MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICNQNIITYKNSTWVKDTTSVILTGNSSLCPIRGWAIYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 18), которая кодируется последовательностью нуклеиновой кислоты ATGAATCCAAATCAGAAAATAACAACCATTGGATCAATCTGTCTGGTAGTCGGACTAATTAGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATAATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGCACCTGGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAATTCATCTCTTTGTCCCATCCGTGGGTGGGCTATATACAGCAAAGACAATAGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAGACGTTTTTGTCATAAGAGAGCCCTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACCTTTTTTCTGACCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAA (SEQ ID NO: 19).
[51] Как отмечено выше, участок Fc может содержать одну или несколько мутаций, таких как, например, L234Y, L235V, L235Q, G236W, S239D, S239M, F243L, T256A, K290A, R292P, N297Q, S298A, Y300L, V305I, A330L, I332E, E333A, K334A, и/или P396L. Таким образом, в этом документе конкретно описаны участки Fc, содержащие лейцин (L) или тирозин (Y) в остатке 234, лейцин (L), глутамин или валин (V) в остатке 235, глутамин (G) или триптофан (W) в остатке 236 серин (S), метионин (M) или аспартат (D) в остатке 239 и фенилаланин (F) или лейцин (L) в остатке 243, треонин (T) или аланин (A) в остатке 256, гистидин (H) или аспартат (D) в остатке 268, аспартат (D) или глутамат (E) в остатке 270, лизин (K) или аланин (A) в остатке 290, аргинин (R) или пролин (P) в остатке 292, серин (S) или аланин (A) в остатке 298, аспарагин или глутамин в остатке 297, тирозин (Y) или лейцин (L) в остатке 300, валин (V) или изолейцин (I) в остатке 305, лизин (K) или аспартат (D) в остатке 326, аланин (A), метионин (M) или лейцин (L) в остатке 330 и изолейцин (I) или глутамат (E) в остатке 332, глутамат (E) или аланин (A) в остатке 333, лизин (K), глутамат (E) или аланин (A) в остатке 334 и/или пролин (P) или лейцин (L) в остатке 396. В частности, подразумевается, что ни одна замена, любая замена или комбинация двух, трьох, четырех, пяти, шести, семи, восми, девяти, десяти, одиннадцати, двенадцати, тринадцати, четырнадцати, пятнадцати, шестнадцати или семнадцати замен, упомянутых здесь, могут присутствовать в участке Fc. Соответственно, в одном аспекте, описанном в данном документе, представленны слитые белки, содержащие замену участка Fc на F243L, R292P, Y300L, V305I и P396L, в котором последовательность Na4-Fc включает MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICNQNIITYKNSTWVKDTTSVILTGNSSLCPIRGWAIYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSILTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 20); который содержит домен Fc с последовательностью GGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSILTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 25) который включает домен CH2 с последовательностью GGPSVFLLPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPPEEQYNSTLRVVSILTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAK (SEQ ID NO: 26) и домен CH3 с последовательностью GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPLVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 27).
[52] В одном аспекте слияние Na4-Fc включает замены S239D, I332E и A330L, имеющие домен Fc с последовательностью GGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 21) который включает домен CH2 с последовательностью GGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAK (SEQ ID NO: 22) и домен CH2 с последовательностью GQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO: 24) и полную последовательность MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICNQNIITYKNSTWVKDTTSVILTGNSSLCPIRGWAIYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTDKTHTCPPCPAPELLGGPDVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPLPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 23).
[53] В одном аспекте слитый белок Na4-Fc может содержать 2 домена Fc, связанных через шарнирный участок. Например, слияние Na-Fc может содержать последовательность MNPNQKITTIGSICLVVGLISLILQIGNIISIWISHSIQTGSQNHTGICNQNIITYKNSTWVKDTTSVILTGNSSLCPIRGWAIYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 28).
[54] В другом аспекте домены Fc могут быть ассиметричными вариантами, например, один домен Fc тяжелой цепи может включать L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A, в то время как другой домен Fc включает D270E/K326D/A330M/K334E.
[55] В общем, любые аминокислотные замены являются консервативными: например, ограничены заменами внутри членов группы 1: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; группы 2: серин, цистеин, треонин и метионин; группы 3: пролин; группы 4: фенилаланин, тирозин и триптофан; и группы 5: аспартат, глутамат, аспарагин и глутамин.
[56] Данное раскрытие также предполагает нуклеиновую кислоту, кодирующую любой слитый белок, описанную в данном документе, такую как, например, SEQ ID NO: 19 кодирующую слияние Na-Fc, как указано в SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 29 кодирующую слияние Na-Fc, как указано в SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 30 кодирующую слияние Na-Fc, как указано в SEQ ID NO: 23; и SEQ ID NO: 31 кодирующую слияние Na-2xFc, как указано в SEQ ID NO: 28. Дополнительно в данном документе рассматриваются векторы, содержащие такую нуклеиновую кислоту по пункту формулы изобретения, и клетку, содержащую такой вектор. Векторы и клетки, содержащие такие векторы, могут быть получены с использованием способов, известных в данной области техники.
(II) Сконструированные фидерные клетки, сконструированные частицы плазматической мембраны и сконструированные экзосомы, содержащие связанный с мембраной Fc.
[57] Композиции согласно денному описанию включают композиции, содержащие Fc-связанные фидерные клетки (FC), композиции, содержащие Fc-связанные частицы сконструированной плазматической мембраны (PM), и композиции, содержащие Fc-связанные сконструированные экзосомы. Fc-связанные частицы сконструированной плазматической мембраны включают наночастицы PM, полученные из Fc-связанных фидерных клеток. Fc-связанные сконструированные экзосомы включали экзосомы или другие внеклеточные везикулы, полученные из Fc-связанных фидерных клеток, как также более подробно описано ниже. Альтернативно экзосомы могут быть получены из других источников, таких как тромбоциты и мегакариоциты.
[58] Используемый в этом документе термин «Fc-связанный» следует понимать как относящийся к связыванию домена Fc в перевернутой ориентации (то есть, аминоконцевой конец обращен внутрь клетки) с внешней поверхностью фидерной клетки или сконструированной частицы через трансмембранный пептид. Это может быть достигнуто с использованием описанных в данном документе слитых пептидов Fc. Таким образом, один аспект данного раскрытия обеспечивает композицию фидерных клеток, содержащую по меньшей мере одну Fc-связанную фидерную клетку, т.е. фидерную клетку, содержащую Fc-домен, связанный с внешней поверхностью фидерной клетки, как более подробно описано ниже. Например, фидерная клетка может быть генетически модифицирована для экспрессии Fc-домена, связанного с внешней поверхностью фидерной клетки, то есть для экспрессии слитого пептида Fc, как дополнительно описано ниже. Другой аспект раскрытия обеспечивает композицию для увеличения числа NK-клеток, не содержащую фидерных клеток, которая включает по меньшей мере одну Fc-связанную сконструированную частицу, то есть сконструированную частицу, содержащую домен Fc, связанный в перевернутой ориентации с внешней поверхностью фидерной клетки. В некоторых аспектах фидерные клетки могут быть сконструированы для экспрессии лиганда, который может быть помечен гуманизированным антителом (таким как, например, CD20).
[59] В композиции фидерных клеток по меньшей мере одна Fc-связанная фидерная клетка необязательно содержит по меньшей мере один клеточный эффекторный агент NK-клетки. В одном примере, Fc-связанная фидерная клетка содержит один клеточный эффектор NK-клетки, которым является IL-15 или IL-21. Fc-связанные питающие клетки могут содержать по меньшей мере два или более различных эффекторных агента NK-клеток.
[60] В композиции для увеличения числа NK-клеток, не содержащей фидерных клеток, Fc-связанные сконструированные частицы PM необязательно содержат по меньшей мере один клеточный эффекторный агент NK-клетки. В одном примере, Fc-связанная сконструированная частица содержит один клеточный эффектор NK-клетки, которым является IL-15 или IL-21. Fc-связанные сконструированные PM частицы могут содержать по меньшей мере два или более различных эффекторных агента NK-клеток.
[61] Либо в композиции фидерных клеток, либо в композиции, не содержащей фидерных клеток, в которой присутствуют по меньшей мере два эффекторных агента NK-клеток, вторым эффекторным агентом NK-клеток может быть, например, 41BBL. Либо в композиции фидерных клеток, либо в композиции для увеличения числа NK-клеток, не содержащей фидерных клеток, в которой фидерные клетки или сконструированные частицы PM содержат один или несколько эффекторных агентов NK-клеток, эффекторные агенты NK-клеток могут быть выбраны из 41BBL, IL-15, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, MICA, UBLP, 2sB4, LFA-1, лиганд Notch, лиганды для NKp46 или BCM1/SLAMF2, лиганды TLR и лиганды NKG2D, или цитокин. В такой типичной композиции по меньшей мере одним дополнительным эффекторным агентом NK-клеток является IL-15 или IL-21.
(a) Fc-связанные фидерные клетки
[62] В данном описании представлены фидерные клетки, содержащие слитый пептид Fc, как подробно описано выше. Фидерные клетки для NK-клеток, для использования в способах, раскрытых в данном документе, и для использования в создании частиц PM и экзосом, раскрытых в данном документе, могут быть либо облученными аутологичными или аллогенными мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC), либо необлученными аутологичными или аллогенными PBMC, RPMI8866, HFWT, 721.221 или K562, а также EBV-LCL, другими линиями клеток, не экспрессирующими HLA или с низким HLA, или первичными опухолями, полученными от пациентов, которые можно использовать в качестве противоопухолевой вакцины. Fc-связанные фидерные клетки могут быть получены путем трансфекции или трансдукции фидерных клеток любым слитым пептидом Fc, как описано в данном документе, с использованием стандартных методов трансдукции или трансфекции, хорошо известных в данной области техники. Например, векторы кДНК для слитых пептидов Fc, описанные в данном документе, могут быть лигированы в экспрессионную плазмиду, которая обеспечивает экспрессию в клетках бактерий (E. coli), насекомых или млекопитающих. Вектор кДНК может быть помечен FLAG- или HIS-меткой. Подходящие методы трансфекции включают нуклеофекцию (или электропорацию), трансфекцию, опосредованную фосфатом кальция, трансфекцию катионного полимера (например, DEAE-декстран или полиэтиленимин), вирусную трансдукцию, трансфекцию вирусом, трансфекцию вирионов, трансфекцию липосом, трансфекцию катионных липосом, трансфекцию иммунолипосом, нелипосомную трансфекцию, трансфекция дендримеров, трансфекцию тепловым шоком, магнитофекцию, липофекцию, доставку генной пушкой, импалефекцию, сонопорацию, оптическую трансфекцию и усиленное патентованным агентом поглощение нуклеиновых кислот. Способы трансфекции хорошо известны в данной области (см., например, “Current Protocols in Molecular Biology” Ausubel et al., John Wiley & Sons, New York, 2003 или “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” Sambrook & Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 3е издание, 2001). В качестве альтернативы молекулы можно вводить в клетку с помощью микроинъекции. Например, молекулы можно вводить в цитоплазму или ядра интересующих клеток. Количество каждой молекулы, вводимой в клетку, может варьироваться, но специалисты в данной области техники знакомы с методами определения подходящего количества.
[63] Понятно, что различные молекулы можно вводить в клетку одновременно или последовательно. Например, слитый пептид Fc и один или несколько «эффекторных агентов NK-клеток связанных с мембраной» могут быть одновременно введены в фидерную клетку. В качестве альтернативы, сначала может быть введена одна молекула, а затем другая(ие) молекула(ы) может быть введена в клетку. Например, фидерные клетки, сразу после трансфицирования или трансдуцирования слитым пептидом Fc, могут быть дополнительно трансфицированы эффекторными агентами NK-клеток связанными с мембранами, такими как IL-15, и/или IL-21, и/или 41BBL, и/или инфицированы как EBV-LCL и/или другие эффекторные агент(ы) NK-клеток. Альтернативно, фидерные клетки могут быть одновременно трансфицированы или трансдуцированы слитым пептидом Fc и эффекторными агентами NK-клеток связанными с мембраной, такими как IL-15, и/или IL-21, и/или 41BBL, и/или инфицированы как EBV-LCL и/или другие эффекторные агент(ы) NK-клеток. Альтернативно, фидерные клетки предварительно трансфицированные или трансдуцированные и экспрессирующие эффекторные агенты NK-клеток связанных с мембраной, такие как IL-15, и/или IL-21, и/или 41BBL, и/или инфицированы как EBV-LCL и/или другие эффекторные агент(ы) NK-клеток, могут быть трансфицированы или трансдуцированы слитым пептидом Fc. Также будет понятно, что другие средства, такие как методы химической конъюгации, известные в данной области техники, могут быть использованы для получения Fc связанного с мембраной.
[64] Как правило, клетка культивируется в условиях, подходящих для роста и/или поддержания клеток. Подходящие условия культивирования клеток хорошо известны в данной области техники и описаны, например, в in Santiago et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, 105:5809-5814; Moehle et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2007, 104:3055-3060; Urnov et al., Nature, 2005, 435:646-651; и Lombardo et al., Nat. Biotechnol., 2007, 25:1298-1306. Специалисты в данной области техники понимают, что методы культивирования клеток известны в данной области и могут и будут варьироваться в зависимости от типа клеток. Во всех случаях может использоваться обычная оптимизация для определения наилучших методов для конкретного типа клеток.
[65] Fc-связанные фидерные клетки можно использовать в культуре клеток для непосредственной стимуляции NK-клеток или можно использовать для получения частиц PM или экзосом, полученных из фидерных клеток.
(b) Fc-связанные частицы PM
[66] Fc-связанные сконструированные частицы PM включают Fc-связанные частицы PM, которые могут быть получены из Fc-связанных фидерных клеток для NK-клеток с использованием общеизвестных методов. Частицы PM представляют собой везикулы, сделанные из плазматической мембраны клетки или искусственно созданные (например, липосомы). Частица PM может содержать липидный бислой или просто один слой липидов. Частицы PM могут быть получены в однослойной, многослойной или перевернутой форме.Частицы PM могут быть получены из Fc-связанных фидерных клеток, как описано в данном документе, с использованием известных протоколов получения плазматической мембраны или протоколов получения липосом, таких как описанные в патенте США №9,623,082,полное описание которого включено в данный документ посредством ссылки. В некоторых аспектах раскрытые здесь частицы PM имеют средний диаметр от около 170 до около 300 нм.
(b) Fc-связанные экзосомы
[67] Fc-связанные экзосомы, как описано в данном документе, могут быть получены из секретирующих экзосомы клеток, которые могут быть получены из Fc-связанных фидерных клеток NK-клеток с использованием хорошо известных способов, причем экзосома является внеклеточным продуктом секретирующих экзосомы клеток, как описано в патенте США App. Pub. №20170333479,полное описание которого включено в данный документ посредством ссылки.Экзосомы содержат липиды и белки, а идентичность белков, обнаруженных в конкретной экзосоме, зависит от клеток, которые их продуцируют. Раскрытые в данном документе экзосомы содержат слитый пептид Fc, как описано в данном документе (т.е. являются Fc-связанными), и, необязательно, один или несколько стимулирующих пептидов (эффекторных агентов NK-клеток), присутствующих в мембране экзосомы. Экзосомы могут быть получены, например, из клеточных линий, сконструированных для улучшенного образования или высвобождения экзосом. Такие клеточные линии включают, но не ограничиваются ими, Fc-связанные клеточные линии, как описано выше в Разделе II(а). Не ограничиваясь, клеточные линии представлены Fc-связанная K562-mb15-41BBL и Fc-связанная K562. В некоторых аспектах раскрытые здесь экзосомы имеют средний диаметр от около 30 до около 100 нм, или до около 160 нм. В одном аспекте средний диаметр экзосом составляет около 60-80 нм. Способность экзосом достигать размеров частиц меньше, чем это легко достигается частицами PM, означает, что экзосомы могут быть более легко адаптированы для применений, где предпочтительным является меньший размер. Например, экзосомы могут быть предпочтительными в применениях, требующих диффузии через физиологические барьеры, усиленного биораспределения через тканевые компартменты или внутривенных инъекций.
(III) Композиции
[68] В данном раскрытии представлены различные композиции для увеличения числа NK-клеток, содержащих Fc-связанные фидерные клетки, как описано выше, а в других аспектах композиции для увеличения числа NK-клеток, не содержащие фидерных клеток, включающие одну или несколько Fc-связанных сконструированных частиц, таких как частицы PM или экзосомы, как описано выше. Любые из Fc-связанных фидерных клеток или Fc-связанных сконструированных частиц PM, используемых в композициях, необязательно дополнительно содержат по меньшей мере один, два или несколько различных эффекторных агентов NK-клеток. В одном аспекте один эффекторный агент NK-клетки представляет собой IL-21, а в некоторых аспектах один эффекторный агент NK-клетки представляет собой IL-21, а второй - 41BBL. Fc-связанные фидерные клетки или Fc-связанные сконструированные частицы PM необязательно содержат один или несколько дополнительных эффекторных агентов NK-клеток, как описано выше.
[69] Композиция для увеличения числа NK-клеток, которая содержит частицу PM, содержащую плазматическую мембрану, может дополнительно содержать множество микрочастиц/наночастиц, причем плазматическая мембрана покрывает множество микрочастиц и/или наночастиц. Микрочастицы/наночастицы могут включать магнитные микрочастицы, гранулы диоксида кремния, гранулы полистирола, латексные гранулы, контрастный агент в виде частиц, терапевтический агент в виде частиц или любую их комбинацию.
[70] В данной заявке также рассматривается инфузионный состав для увеличения числа NK-клеток, содержащий любую из раскрытых здесь композиций для увеличения числа NK-клеток в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем.
[71] Терапевтические фармацевтические композиции могут быть получены путем объединения Fc-связанных фидерных клеток или сконструированных частиц PM с фармацевтически приемлемым носителем, известным в данной области техники, как описано, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, Pa. 1995. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, но не ограничиваются ими: стерильную воду, физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и забуференные растворы при физиологическом pH. Например, pH раствора предпочтительно составляет от около 5 до около 8, а более предпочтительно от около 7 до около 7,5.
[72] Фармацевтические композиции могут включать носители, загустители, разбавители, буферы, консерванты, поверхностно-активные агенты и т.п. в дополнение к выбранной молекуле. Фармацевтические композиции также могут включать один или несколько активных ингредиентов, таких как противомикробные средства, противовоспалительные средства, анестетики и тому подобное.
[73] Специалистам в данной области техники будет очевидно, что некоторые носители могут быть более предпочтительными в зависимости, например, от пути введения и концентрации вводимой композиции. Фармацевтическая композиция может быть подходящим образом приготовлена для введения путем любого из ряда известных способов введения млекопитающим, особенно людям, в зависимости от того, требуется ли местное или системное лечение, и от области, подлежащей лечению. Введение может быть местным (включая офтальмологическое, вагинальное, ректальное, интраназальное), пероральным, путем ингаляции или парентеральным, например, внутривенным капельным путем или инъекцией, или подкожным, внутрибрюшинным, внутримышечным, внутриполостным или трансдермальным введением.
[74] Препараты для парентерального введения включают стерильные водные или неводные растворы, суспензии и эмульсии. Примерами неводных растворителей являются пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и органические сложные эфиры для инъекций, такие как этилолеат. Водные носители включают воду, спиртовые/водные растворы, эмульсии или суспензии, включая физиологический раствор и забуференные среды. Парентеральные носители включают раствор хлорида натрия, декстрозу Рингера, декстрозу и хлорид натрия, лактат Рингера или жирные масла. Внутривенные носители включают пополнители жидкости и питательных веществ, пополнители электролитов (например, на основе декстрозы Рингера) и т.п. Также могут присутствовать консерванты и другие добавки, такие как, например, противомикробные средства, антиоксиданты, хелатирующие агенты и инертные газы и тому подобное.
[75] Составы для местного применения могут включать мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Обычные фармацевтические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимыми или желательными.
[76] Композиции для перорального введения включают порошки или гранулы, суспензии или растворы в воде или неводной среде, капсулы, саше или таблетки. Могут быть желательны загустители, ароматизаторы, разбавители, эмульгаторы, диспергирующие добавки или связующие.
[77] Некоторые из композиций потенциально можно вводить в виде фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей или основно-аддитивных солей, образованных реакцией с неорганическими кислотами, такими как соляная кислота, бромистоводородная кислота, хлорная кислота, азотная кислота, тиоциановая кислота, серная кислота и фосфорная кислота, и органическими кислотами, такими как муравьиная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, гликолевая кислота, молочная кислота, пировиноградная кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота и фумаровая кислота, или путем реакции с неорганическим основанием, таким как гидроксид натрия, гидроксид аммония, гидроксид калия, и органическими основаниями, такими как моно-, ди-, триалкиламины и ариламины, и замещенные этаноламины.
[78] Таким образом, инфузионный состав для увеличения числа NK-клеток, может быть составлен для составления рецептуры для парентеральной инфузии, артериальной инфузии, венозной инфузии, инфузии, опосредованной искусственным катетером, внутривенной, внутрибрюшинной, подкожной инъекции, пероральной или местной доставки.
[79] В одном аспекте данное раскрытие предполагает любую композицию для увеличения числа NK-клеток, полученную in vitro или ex vivo, как описано в данном документе, вводимую или инфузируемую субъекту, нуждающемуся в размножении NK-клеток. Очевидно и как предполагается в данном документе, инфузия может происходить in vitro с коммерческим источником NK-клеток или ex vivo из донорского источника (такого как, например, аллогенный донор или источник аутологичного донора (т.е. субъект-реципиент, получающий размноженные NK-клетки)).
[80] В другом аспекте данное раскрытие рассматривает композицию NK-клеток, содержащую популяцию NK-клеток in vitro, контактирующую с композицией Fc-связанных фидерных клеток, как раскрыто в данном документе, или композицию, увеличивающую количество Fc-связанных NK-клеток, не содержащую фидерных клеток, как раскрыто в данном документе.
[81] В другом аспекте данное раскрытие рассматривает источники NK-клеток, которые включают, но не ограничиваются ими, периферическую кровь, NK-клетки, полученные из iPSC, NK-клетки, полученные из ESC, NK-клетки, имеющие полиморфизм высокоаффинного Fc-рецептора Phe или Val в 158, и генетически модифицированные NK-клетки.
[82] В другом аспекте данное раскрытие предполагает размноженную популяцию NK-клеток, подвергнутых in vitro воздействию композиции для увеличения числа NK-клеток, причем композиция не содержит фидерных клеток и содержит по меньшей мере одну Fc-связанную сконструированную частицу, как раскрыто в данном документе, содержащую по меньшей мере два эффекторных агента NK-клеток, причем один из по меньшей мере двух эффекторных агентов NK-клеток представляет собой IL-21 или IL-15. Размноженная популяция NK может проявлять повышенную цитотоксичность по сравнению с неразмноженными NK-клетками. В различных аспектах размноженная популяция NK может проявлять цитотоксичность, по меньшей мере, около 2, 5 или 10 раз больше, чем у неразмноженных NK-клеток.
[83] В другом аспекте данное раскрытие обеспечивает композицию, содержащую терапевтическую дозу NK-клеток, включающую размноженную популяцию NK-клеток, как раскрыто в данном документе, необязательно в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Размноженная популяция NK-клеток может проявлять более высокий уровень CD16 и другие выгодные свойства, такие как более высокая цитотоксичность и функциональность ADCC. Количество NK-клеток, обеспечивающее терапевтическую дозу, будет варьироваться в зависимости от ряда факторов, которые оценены специалистами в данной области техники и обсуждаются, например, в патентах США №9.623,082. Факторы включают возраст, пол и диагноз субъекта, а также путь введения, который может быть, не ограничиваясь, пероральным, трансбуккальным, слизистым и внутривенным путями. Например, терапевтическая доза может составлять от 1×104/кг до 1×108/кг на дозу, которая может быть включена в разовую дозу или разделена на несколько доз. Следует понимать, что эквивалент терапевтической дозы, как указано выше, может быть альтернативно выражен в количестве, приходящемся на общую площадь поверхности тела.
[84] В другом аспекте данное раскрытие также обеспечивает составы сред для увеличения числа NK-клеток, содержащие любую композицию для увеличения числа NK-клеток, как раскрыто в данном документе, в сочетании с раствором клеточной среды, содержащим по меньшей мере один компонент растворимой среды, такой как цитокин, IL-2, IL-12, ИЛ-15, IL-18, IL-21, NAM, аскорбат или любая их комбинация.
(IV) Способы
(а) Методы повышения цитотоксичности NK-клеток
[85] В одном аспекте данное раскрытие обеспечивает способ увеличения цитотоксичности NK-клеток путем размножения исходной популяции NK-клеток с использованием композиции или состава для увеличения числа NK-клеток, как раскрыто в данном документе. Раскрытые способы обеспечивают простую платформу для размножения, которая позволяет избежать сложного альтернативного процесса размножения, включающего, например, покрытие твердого носителя моноклональным антителом и использование растворимого цитокина(ов) в растворе. Вместо этого в способах, раскрытых в данном документе, исходная популяция NK-клеток получается от донора и подвергается воздействию композиции для увеличения числа NK-клеток, как раскрыто в данном документе. Воздействие может происходить in vitro или in vivo. Фиг. 4 представляет собой схематическую диаграмму Fc стимуляции NK-клетки в соответствие с данным раскрытием. NK-клетки контактируют с одной или несколькими Fc-связанными фидерными клетками, Fc-связанными PM-частицами или Fc-связанными экзосомами или любой их комбинацией. Обнаруженный Fc-домен связывается с CD16 на поверхности NK-клеток, что приводит к стимуляции NK-клеток к более быстрому и/или более эффективному размножению и образованию NK-клеток с более высокой противоопухолевой токсичностью и NK-клеток с более желательным общим фенотипом.
[86] Как показано на Фиг. 4, композиция, контактирующая с NK-клетками, может включать любые из Fc-связанных фидерных клеток или Fc-связанных сконструированных частиц PM или Fc-связанных сконструированных экзосом, раскрытых в данном документе. Сконструированные частицы PM могут быть Fc-связанными частицами PM. В одном аспекте необязательным присутствующим эффекторным агентом NK-клеток является IL-21 или IL-15. Необязательный присутствующий второй эффекторный агент NK-клеток может быть выбран из 41BBL, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, MICA, UBLP, 2B4, LFA-1, лиганда Notch, лигандов для NKp46 или BCM1/SLAMF2, лигандов TLR и лигандов NKG2D. В одном аспекте необязательным присутствующим эффекторным агентом NK-клеток является 41BBL. Композиция может дополнительно содержать по меньшей мере один дополнительный (то есть третий, четвертый, пятый и т.д.) эффекторный агент NK-клеток выбранный из IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, MICA, UBLP, 2B4, LFA-1, лиганда Notch, лигандов для NKp46 или BCM1/SLAMF2, лигандов TLR и лигандов NKG2D. Размножение NK-клеток, выполненное таким образом, может достигать гораздо больше чем в несколько раз (около в 3-4 раза) за 10 дней. Напротив, экспансия NK-клеток в соответствии с данными способами может достигать по меньшей мере около 100-кратного, около 200-кратного, около 300-кратного, около 400-кратного, около 500-кратного, около 600-кратного, около 700-кратного, около 800-кратного, около 900-кратного, около 1100 раз, около 1200 раз, около 1300 раз, около 1400 раз, около 1500 раз, около 1600 раз, около 1700 раз, около 1800 раз, около 1900 раз, около до 2000-кратного увеличения количества NK-клеток за 16 дней или больше в более длительном промежутке времени. Таким образом, раскрытые способы полезны для крупномасштабного получения NK-клеток. Источниками NK-клеток могут быть периферическая кровь, NK-клетки селезенки, препараты лимфоцитов, такие как лейкоцитарная пленка, NK-клетки, полученные из iPSC, NK-клетки, полученные из ESC, и генетически модифицированные/сконструированные NK-клетки, или любые генетически модифицированные NK-клетки, включая, не ограничиваясь, NK-клетки, происходящие из полиморфизмов рецептора Fc, таких как Phe или Val в положении 158, таких как клетки, известные в данной области и описанные, например, в Blood (1997) 90:1109-14, and J Clin Invest. (1997) 100:1059-70. Такие генетически модифицированные источники NK-клеток могут быть сконструированы с использованием способов, известных в данной области техники. Альтернативно, NK-клетки могут быть получены от донора клеток, который несет желаемый полиморфизм, и донорские клетки могут использоваться в качестве исходной популяции NK-клеток, которые наножаются описанными здесь способами и с использованием композиции. Таким образом, в данном контексте «генетически модифицированные» включают встречающиеся в природе NK-клетки, несущие полиморфизм. Способ может быть применен к NK-клеткам человека или других животных.
[87] Кроме того, раскрытые способы обладают дополнительным преимуществом, так как обеспечивают клетки более высокой цитотоксичностью и функциональностью ADCC. Исходная популяция NK-клеток, размноженная согласно раскрытым способам, дает увеличенную популяцию NK-клеток, которая проявляет по меньшей мере около двукратную цитотоксичность от исходной популяции NK-клеток, по меньшей мере, около 4-х кратную цитотоксичность от исходной популяции NK-клеток, при по меньшей мере, около 5-ти кратную, чем у исходной популяции NK-клеток, по меньшей мере, около 8-кратную цитотоксичность от исходной популяции NK-клеток, или, по меньшей мере, около 10-ти кратную цитотоксичность от исходной популяции NK-клеток. Более того, NK-клетки, размноженные согласно раскрытым способам, проявляют более высокую цитотоксичность для мишени, которая может быть ADCC-компетентной. Более высокая экспрессия белков, ассоциированных с ADCC, таких как, в неограничивающем примере, CD16; или другие лиганды NK-клеток, такие как, в неограничивающем примере, NKG2D, NKp46, CD62L, можно использовать для оценки относительной цитотоксичности размноженных NK-клеток по сравнению с неразмноженными NK-клетками или NK-клетками, размноженными в других условиях. Такие маркеры, как NKG2D, NKp46 и т.п. являются индикаторами NK-клеток в активированном состоянии. В сочетании маркеры могут служить сигналом повышенной цитотоксичности, даже если цитотоксичность невозможно оценить напрямую. Например, размноженная популяция NK-клеток, как раскрыто в данном документе, может демонстрировать повышенный киллинг опухолевых мишеней или секретировать более высокие количества противоопухолевых цитокинов (IFN, TNF) по сравнению с неразмноженными NK-клетками. В другом аспекте размноженная популяция NK-клеток, как раскрыто в данном документе, может демонстрировать повышенную экспрессию NKG2D, NKp46 и CD16 по сравнению с неразмноженными NK-клетками. В данной области техники известны различные средства определения количества определенного белка для оценки состояния активации NK-клеток, включая методы спектрометрии, такие как проточная цитометрия или методы иммунодетекции, такие как вестерн-блоттинг, иммуноферментный анализ (ELISA), иммунопреципитация белков; иммуноэлектрофорез или иммуноокрашивание.
[88] Кроме того, размноженная популяция NK-клеток, как раскрыто в данном документе, может проявлять улучшенную способность переносить криоконсервацию, сохраняя жизнеспособность и цитотоксичность, а также последущую заморозку и разморозку.
[89] Композиция NK-клеток, размноженных с помощью фидерных клетокэкспрессирующих Fc, проявляет более высокую цитотоксичность по отношению к клеткам-мишеням рака яичников SKOV3, как показано на Фиг. 2 и Фиг. 3. Композиции NK-клеток, размноженных фидерными клетками, экспрессирующими домен Fc, обладают усиленным фенотипом с повышенным уровнем CD16, NKp46 и CD62L. Такие NK-клетки с усиленным фенотипом могут иметь повышенную терапевтическую эффективность. Увеличенный уровень CD16 может позволить увеличить способность взаимодействовать с клетками-мишенями, покрытыми антителами. Увеличенный NKp46 может иметь большую способность связывать активирующие лиганды. Увеличенный уровень CD62L в качестве лиганда L-селектина может усиливать доставку NK-клеток в лимфатические или костные компартменты.
(b) Терапевтические способы
[90] Раскрытые здесь композиции и способы могут использоваться в различных терапевтических, диагностических, промышленных и исследовательских целях. В некоторых аспектах данное раскрытие можно использовать для лечения рака. Соответственно, в одном аспекте раскрытом в данном документе представлены способы «лечения, ингибирования, уменьшение и/или предотвращение рака, рецидива рака, метастазов или инфекционного заболевания, такого как вирусная инфекция или бактериальная инфекция, у субъекта, включающее введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции или размноженной популяции NK-клеток, как описано в этом документе.
[91] Рак может быть выбран из, помимо прочего, гематологического рака, лимфомы, колоректального рака, рака толстой кишки, рака легких, рака головы и шеи, рака яичников, рака простаты, рака яичек, рака почек, рака кожи, рака шейки матки, рака поджелудочной железы и рака груди. В одном аспекте рак включает плотную опухоль. В другом аспекте рак выбран из острого миелоидного лейкоза, миелодиспластического синдрома, хронического миелоидного лейкоза, острого лимфобластного лейкоза, миелофиброза, множественной миеломы. В другом аспекте рак выбран из лейкемии, лимфомы, саркомы, карциномы и может возникать в костном мозге, головном мозге, легком, груди, поджелудочной железе, печени, голове и шее, коже, репродуктивном тракте, простате, толстой кишке, печени, почке, внутрибрюшинном пространстве, кости, суставе, глазе.
[92] В другом аспекте способы лечения включают: способ предотвращения, ингибирования, уменьшения или облегчения рецидива или метастазирования рака после трансплантации стволовых клеток; способ модуляции репертуара Т-клеток после трансплантации стволовых клеток; общий способ модуляции иммунного репертуара, способ предотвращения, ингибирования, уменьшения или облегчения острой или хронической реакции «трансплантат против хозяина»; и способ «предотвращения, ингибирования, снижения или облегчения» вирусной реактивации, такой как реактивация вируса простого герпеса - 1 (HSV-1), вируса простого герпеса - 2 (HSV-2), цитомегаловируса (CMV), ветряной оспы. вируса опоясывающего лишая (VZV), вируса Эпштейна-Барра (EBV), аденовируса, аденоассоциированного вируса, парвовируса, вируса JC и/или вируса BK; причем каждый способ включает введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции или размноженной популяции NK-клеток, как описано в данном документе.
[93] Любой из раскрытых способов лечения может дополнительно включать введение субъекту (последовательно, одновременно или в виде единого препарата) дополнительного терапевтического агента или схему в комбинации с эффективным количеством композиции или размноженной популяции NK-клеток, как описано в данном документе. Дополнительный терапевтический агент может представлять собой препаративную схему на основе лекарственного средства, такую как Cy-Flu, Bu-Flu, Flu-Mel или аналогичный, с корректировкой дозировки или дозирования. Альтернативно, дополнительное терапевтическое средство может представлять собой профилактическое средство против реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD), такое как, но не ограничиваясь этим, циклофосфамид. Альтернативно, дополнительные терапевтические агенты или схемы могут быть выбраны из химиотерапевтических агентов и схем, таких как, в неограничивающем примере, те, которые известны под аббревиатурами CHOP, FLAG (включая FLAG-Ida или FLAG-IDA или IDA-FLAG или Ida-FLAG; и FLAG-Mito, или FLAG-MITO, или Mito-FLAG, или MITO-FLAG, или FLANG), IA или IAC, или +3. Например, в этом документе подразумевается, что раскрытые способы ингибирования, уменьшения и/или предотвращения метастазирования и/или рецидива рака могут включать введение любого противоракового агента, известного в данной области, включая, но не ограничиваясь, Abemaciclib, Abiraterone Ацетат, Abitrexate (Methotrexate), Abraxane (композиция наночастиц, стабилизированных конъюгатом альбумина и паклитаксела), ABVD, ABVE, ABVE-PC, AC, AC-T, Adcetris (Brentuximab Vedotin), ADE, Ado-Trastuzumab Emtansine, Adriamycin (Doxorubicin Гидрохлорид), Afatinib Дималеат, Afinitor (Everolimus), Akynzeo (Netupitant и Palonosetron Гидрохлорид), Aldara (Imiquimod), Aldesleukin, Alecensa (Alectinib), Alectinib, Alemtuzumab, Alimta (Pemetrexed Динатрий), Aliqopa (Copanlisib Гидрохлорид), Alkeran для инъекций (Melphalan Гидрохлорид), Alkeran таблетки(Melphalan), Aloxi (Palonosetron Гидрохлорид), Alunbrig (Brigatinib), Ambochlorin (Chlorambucil), Amboclorin Chlorambucil), Amifostine, Aminolevulinic Кислота, Anastrozole, Aprepitant, Aredia (Pamidronate Динатрий), Arimidex (Anastrozole), Aromasin (Exemestane),Arranon (Nelarabine), триоксид мышьяка, Arzerra (Ofatumumab), Аспарагиназа Erwinia chrysanthemi, Atezolizumab, Avastin (Bevacizumab), Avelumab, Axitinib, Azacitidine, Bavencio (Avelumab), BEACOPP, Becenum (Carmustine), Beleodaq (Belinostat), Belinostat, Bendamustine Гидрохлорид, BEP, Besponsa (Inotuzumab Ozogamicin) , Bevacizumab, Bexarotene, Bexxar (Tositumomab и Йод I 131 Tositumomab), Bicalutamide, BiCNU (Carmustine), Bleomycin, Blinatumomab, Blincyto (Blinatumomab), Bortezomib, Bosulif (Bosutinib), Bosutinib, Brentuximab Vedotin, Brigatinib, BuMel, Busulfan, Busulfex (Busulfan), Cabazitaxel, Cabometyx (Cabozantinib-S-Малат), Cabozantinib-S-Малат, CAF, Campath (Alemtuzumab), Camptosar , (Irinotecan Гидрохлорид), Capecitabine, CAPOX, Carac (Фторурацил--Для местного применения, Carboplatin, CARBOPLATIN-TAXOL, Carfilzomib, Carmubris (Carmustine), Carmustine, Carmustine имплант, Casodex (Bicalutamide), CEM, Ceritinib, Cerubidine (Daunorubicin Гидрохлорид), Cervarix (Рекомбинантная бивалентная вакцина против ВПЧ), Cetuximab, CEV, Chlorambucil, CHLORAMBUCIL-PREDNISONE, CHOP, Cisplatin, Cladribine, Clafen (Циклофосфамид), Clofarabine, Clofarex (Clofarabine), Clolar (Clofarabine), CMF, Cobimetinib, Cometriq (Cabozantinib-S-Малат), Copanlisib Гидрохлорид, COPDAC, COPP, COPP-ABV, Cosmegen (Dactinomycin), Cotellic (Cobimetinib), Crizotinib, CVP, Циклофосфамид, Cyfos (Ifosfamide), Cyramza (Ramucirumab), Cytarabine, Cytarabine Липосомы, Cytosar-U (Cytarabine), Cytoxan (Циклофосфамид), Dabrafenib, Dacarbazine, Dacogen (Decitabine), Dactinomycin, Daratumumab, Darzalex (Daratumumab), Dasatinib, Daunorubicin Гидрохлорид, Daunorubicin Гидрохлорид и Липосомы CytarabineDecitabine, Defibrotide Натрия, Defitelio (Defibrotide Натрия), Degarelix, Denileukin Diftitox, Denosumab, DepoCyt (Липосомы Cytarabine), Dexamethasone, Dexrazoxane Гидрохлорид, Dinutuximab, Docetaxel, Doxil (Doxorubicin Гидрохлорид Липосомы), Doxorubicin Гидрохлорид, Липосомы Doxorubicin Гидрохлорида, Dox-SL (Липосомы Doxorubicin Гидрохлорида), DTIC-Dome (Dacarbazine), Durvalumab, Efudex (Фторурацил--Для местного применения, Elitek (Rasburicase), Ellence (Epirubicin Гидрохлорид), Elotuzumab, Eloxatin (Oxaliplatin), Eltrombopag Olamine, Emend (Aprepitant), Empliciti (Elotuzumab), Enasidenib Мезилат, Enzalutamide, Epirubicin Гидрохлорид , EPOCH, Erbitux (Cetuximab), Eribulin Мезилат, Erivedge (Vismodegib), Erlotinib Гидрохлорид, Erwinaze (Аспарагиназа Erwinia chrysanthemi) , Ethyol (Amifostine), Etopophos (Etoposide Фосфат), Etoposide, Etoposide Фосфат, Evacet (Липосомы Doxorubicin Гидрохлорида), Everolimus, Evista , (Raloxifene Гидрохлорид), Evomela (Melphalan Гидрохлорид), Exemestane, 5-FU (фторурацил для инъекций), 5-FU (Фторурацил--Для местного применения, Fareston (Toremifene), Farydak (Panobinostat), Faslodex (Fulvestrant), FEC, Femara (Letrozole), Filgrastim, Fludara (Fludarabine Фосфат), Fludarabine Фосфат, Fluoroplex (Фторурацил--Для местного применения, фторурацил для инъекций, Фторурацил--Для местного применения, Flutamide, Folex (Methotrexate), Folex PFS (Methotrexate), FOLFIRI, FOLFIRI-BEVACIZUMAB, FOLFIRI-CETUXIMAB, FOLFIRINOX, FOLFOX, Folotyn (Pralatrexate), FU-LV, Fulvestrant, Gardasil (Рекомбинантная четырехвалентная вакцина против ВПЧ), Gardasil 9 (Рекомбинантная невалентная вакцина против ВПЧ), Gazyva (Obinutuzumab), Gefitinib, Gemcitabine Гидрохлорид, GEMCITABINE-CISPLATIN, GEMCITABINE-OXALIPLATIN, Gemtuzumab Ozogamicin, Gemzar (Gemcitabine Гидрохлорид), Gilotrif (Afatinib Дималеат), Gleevec (Imatinib Мезилат), Gliadel (Carmustine имплант), Gliadel wafer (Carmustine имплант), Glucarpidase, Goserelin Ацетат, Halaven (Eribulin Мезилат), Hemangeol (Propranolol Гидрохлорид), Herceptin (Trastuzumab), Рекомбинантная Бивалентная вакцина против ВПЧ, Рекомбинантная Неавалентная вакцина против ВПЧ, Рекомбинантная Четырехвалентная вакцина против ВПЧ, Hycamtin (Topotecan Гидрохлорид), Hydrea (Hydroxyurea), Hydroxyurea, Hyper-CVAD, Ibrance (Palbociclib), Ibritumomab Tiuxetan, Ibrutinib, ICE, Iclusig (Ponatinib Гидрохлорид), Idamycin (Idarubicin Гидрохлорид), Idarubicin Гидрохлорид, Idelalisib, Idhifa (Enasidenib Мезилат), Ifex (Ifosfamide), Ifosfamide, Ifosfamidum (Ifosfamide), IL-2 (Aldesleukin), Imatinib Мезилат, Imbruvica (Ibrutinib), Imfinzi (Durvalumab), Imiquimod, Imlygic (Talimogene Laherparepvec), Inlyta (Axitinib), Inotuzumab Ozogamicin, Рекомбинантный Интерферон Альфа-2b, Интерлейкин-2 (Aldesleukin), Intron A (Рекомбинантный интерферон альфа-2b), Йод I 131 Tositumomab и Tositumomab, Ipilimumab, Iressa (Gefitinib), Irinotecan Гидрохлорид, Липосомы Irinotecan Гидрохлорида, Istodax (Romidepsin), Ixabepilone, Ixazomib Цитрат, Ixempra (Ixabepilone), Jakafi (Ruxolitinib Фосфат), JEB, Jevtana (Cabazitaxel), Kadcyla (Ado-Trastuzumab Emtansine), Keoxifene (Raloxifene Гидрохлорид), Kepivance (Palifermin), Keytruda (Pembrolizumab), Kisqali (Ribociclib), Kymriah (Tisagenlecleucel), Kyprolis (Carfilzomib), Lanreotide Ацетат, Lapatinib Дитозилат, Lartruvo (Olaratumab), Lenalidomide, Lenvatinib Мезилат, Lenvima (Lenvatinib Мезилат), Letrozole, Leucovorin Кальция, Leukeran (Chlorambucil), Leuprolide Ацетат, Leustatin (Cladribine), Levulan (Aminolevulinic Кислота), Linfolizin (Chlorambucil), LipoDox (Липосомы Doxorubicin Гидрохлорида), Lomustine, Lonsurf (Trifluridine и Tipiracil Гидрохлорид), Lupron (Leuprolide Ацетат), Lupron Depot (Leuprolide Ацетат), Lupron Depot-Ped (Leuprolide Ацетат), Lynparza (Olaparib), Marqibo (Липосомы Vincristine Сульфата), Matulane (Procarbazine Гидрохлорид), Mechlorethamine Гидрохлорид, Megestrol Ацетат, Mekinist (Trametinib), Melphalan, Melphalan Гидрохлорид, Mercaptopurine, Mesna, Mesnex (Mesna), Methazolastone (Temozolomide), Methotrexate, Methotrexate LPF (Methotrexate), Methylnaltrexone Бромид, Mexate (Methotrexate), Mexate-AQ (Methotrexate), Midostaurin, Mitomycin C, Mitoxantrone Гидрохлорид, Mitozytrex (Mitomycin C), MOPP, Mozobil (Plerixafor), Mustargen (Mechlorethamine Гидрохлорид) , Mutamycin (Mitomycin C), Myleran (Busulfan), Mylosar (Azacitidine), Mylotarg (Gemtuzumab Ozogamicin), Nanoparticle Paclitaxel (Композиция наночастиц, стабилизированных конъюгатом альбумина и паклитаксела), Navelbine (Vinorelbine Tartrate), Necitumumab, Nelarabine, Neosar (Циклофосфамид), Neratinib Малеат, Nerlynx (Neratinib Малеат), Netupitant и Palonosetron Гидрохлорид, Neulasta (Pegfilgrastim), Neupogen (Filgrastim), Nexavar (Sorafenib Тозилат), Nilandron (Nilutamide), Nilotinib, Nilutamide, Ninlaro (Ixazomib Цитрат), Niraparib Tosylate Monohydrate, Nivolumab, Nolvadex (Tamoxifen Цитрат), Nplate (Romiplostim), Obinutuzumab, Odomzo (Sonidegib), OEPA, Ofatumumab, OFF, Olaparib, Olaratumab, Omacetaxine Мепесукцинат, Oncaspar (Pegaspargase), Ondansetron Гидрохлорид, Onivyde (Липосомы Irinotecan Гидрохлорида), Ontak (Denileukin Diftitox), Opdivo (Nivolumab), OPPA, Osimertinib, Oxaliplatin, Paclitaxel, Композиция наночастиц, стабилизированных конъюгатом альбумина и паклитаксела, PAD, Palbociclib, Palifermin, Palonosetron Гидрохлорид, Palonosetron Гидрохлорид и Netupitant, Pamidronate Динатрий, Panitumumab, Panobinostat, Paraplat (Carboplatin), Paraplatin (Carboplatin), Pazopanib Гидрохлорид, PCV, PEB, Pegaspargase, Pegfilgrastim, Peg-интерферон альфа-2b, PEG-Intron (Peg-интерферон альфа-2b), Pembrolizumab, Pemetrexed Динатрий, Perjeta (Pertuzumab), Pertuzumab, Platinol (Cisplatin), Platinol-AQ (Cisplatin), Plerixafor, Pomalidomide, Pomalyst (Pomalidomide), Ponatinib Гидрохлорид, Portrazza (Necitumumab), Pralatrexate, Prednisone, Procarbazine Гидрохлорид , Proleukin (Aldesleukin), Prolia (Denosumab), Promacta (Eltrombopag Olamine), Propranolol Гидрохлорид, Provenge (Sipuleucel-T), Purinethol (Mercaptopurine), Purixan (Mercaptopurine), Дихлорид радия 223, Raloxifene Гидрохлорид, Ramucirumab, Rasburicase, R-CHOP, R-CVP, Рекомбинантная бивалентная вакцина против вируса папилломы человека (ВПЧ), Рекомбинантная неновалентная вакцина против вируса папилломы человека (ВПЧ), Рекомбинантная четырехвалентная вакцина против вируса папилломы человека (ВПЧ), Рекомбинантный интерферон альфа-2b, Regorafenib, Relistor (Methylnaltrexone Бромид), R-EPOCH, Revlimid (Lenalidomide), Rheumatrex (Methotrexate), Ribociclib, R-ICE, Rituxan (Rituximab), Rituxan Hycela (Rituximab и Гиалуронидаза человека), Rituximab, Rituximab и , Гиалуронидаза человека, Rolapitant Гидрохлорид, Romidepsin, Romiplostim, Rubidomycin (Daunorubicin Гидрохлорид), Rubraca (Rucaparib Camsylate), Rucaparib Camsylate, Ruxolitinib Фосфат, Rydapt (Midostaurin), Sclerosol Внутриплевральный аэрозоль (тальк), Siltuximab, Sipuleucel-T, Somatuline Depot (Lanreotide Ацетат), Sonidegib, Sorafenib Tosylate, Sprycel (Dasatinib), STANFORD V, Стерильный порошок талька (тальк), Steritalc (тальк), Stivarga (Regorafenib), Sunitinib Малат, Sutent (Sunitinib Малат), Sylatron (Peginterferon Alfa-2b), Sylvant (Siltuximab), Synribo (Omacetaxine Мепесукцинат), Tabloid (Тиогуанин), TAC, Tafinlar (Dabrafenib), Tagrisso (Osimertinib), тальк, Talimogene Laherparepvec, Tamoxifen Цитрат, Tarabine PFS (Cytarabine), Tarceva (Erlotinib Гидрохлорид), Targretin (Bexarotene), Tasigna (Nilotinib), Taxol (Paclitaxel), Taxotere (Docetaxel), Tecentriq, (Atezolizumab), Temodar (Temozolomide), Temozolomide, Temsirolimus, Thalidomide, Thalomid (Thalidomide), Тиогуанин, Thiotepa, Tisagenlecleucel, Tolak (Фторурацил--Для местного применения, Topotecan Гидрохлорид, Toremifene, Torisel (Temsirolimus), Tositumomab и Йод I 131 Tositumomab, Totect (Dexrazoxane Гидрохлорид), TPF, Trabectedin, Trametinib, Trastuzumab, Treanda (Bendamustine Гидрохлорид), Trifluridine и Tipiracil Гидрохлорид, Trisenox (триоксид мышьяка), Tykerb (Lapatinib Дитозилат), Unituxin (Dinutuximab), Uridine Триацетат, VAC, Vandetanib, VAMP, Varubi (Rolapitant Гидрохлорид), Vectibix (Panitumumab), VeIP, Velban (Vinblastine Сульфат), Velcade (Bortezomib), Velsar (Vinblastine Сульфат), Vemurafenib, Venclexta (Venetoclax), Venetoclax, Verzenio (Abemaciclib), Viadur (Leuprolide Ацетат), Vidaza (Azacitidine), Vinblastine Сульфат, Vincasar PFS (Vincristine Сульфат), Vincristine Сульфат, Vincristine Сульфат Липосомы, Vinorelbine Tartrate, VIP, Vismodegib, Vistogard (Uridine Триацетат), Voraxaze (Glucarpidase), Vorinostat, Votrient (Pazopanib Гидрохлорид), Vyxeos (Daunorubicin Гидрохлорид и Липосомы Cytarabine), Wellcovorin (Leucovorin Кальция), Xalkori (Crizotinib), Xeloda (Capecitabine), XELIRI, XELOX, Xgeva (Denosumab), Xofigo (Дихлорид радия 223), Xtandi (Enzalutamide), Yervoy (Ipilimumab), Yondelis (Trabectedin), Zaltrap (Ziv-Aflibercept), Zarxio (Filgrastim), Zejula (Niraparib Tosylate Monohydrate), Zelboraf (Vemurafenib), Zevalin (Ibritumomab Tiuxetan), Zinecard (Dexrazoxane Гидрохлорид), Ziv-Aflibercept, Zofran (Ondansetron Гидрохлорид), Zoladex (Goserelin Ацетат), Zoledronic Кислота, Zolinza (Vorinostat), Zometa (Zoledronic Кислота), Zydelig (Idelalisib), Zykadia (Ceritinib), and/or Zytiga (Abiraterone Ацетат). В данном документе также рассматриваются химиотерапевтические средства, которые представляют собой ингибиторы блокады PD1/PDL1 (такие как, например, lambrolizumab, nivolumab, pembrolizumab, pidilizumab, BMS-936559, Atezolizumab, Durvalumab, или Avelumab).
[94] Альтернативно, дополнительный терапевтический агент может быть противовирусным агентом, выбранным, но не ограничиваясь этим, из 5-замещенного аналога 2-дезоксиуридина, аналога нуклеозида, (ненуклеозидного) пирофосфатного аналога, нуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы (NRTI), а также ненуклеозидного ингибитора обратной транскриптазы (NNRTI), ингибитора протеазы (PI) и ингибитора интегразы, ингибитора интегразы и аналога ациклического гуанозина, аналога ациклического нуклеозидфосфоната (ANP), ингибитора NS5A и NS5B вируса гепатита C (HCV) и ингибитора вируса гриппа, иммуностимулятора, интерферона, олигонуклеотида и антимитотического ингибитора. Неограничивающими примерами противовирусных агентов являются ацикловир, фамцикловир, валацикловир, пенцикловир, ганцикловир, ритонавир, лопинавир, саквинавир и т.п.; циметидин; ранитидин; каптоприл; метформин; бупропион; фексофенадин; окскарбазепин; леветерацетам; трамадол; или любые из их изомеров, таутомеры, аналоги, полиморфы, сольваты, производные или фармацевтически приемлемые соли.
[95] Альтернативно, дополнительный терапевтический агент может быть антибиотическим агентом, выбранным, помимо прочего, из пенициллина, тетрациклина, цефалоспорина, линкомицина, макролида, сульфонамида, гликопептида, аминогликозида и карбапенема. Неограничивающими примерами противовирусных агентов являются амоксициллин, доксициклин, цефалексин, ципрофлоксацин, клиндамицин, метронидазол, азитромицин, сульфаметоксазол и триметоприм, клавуланат и левофлоксацин.
[96]
(V) Наборы
[97] Дополнительный аспект данного раскрытия обеспечивает наборы, содержащие по меньшей мере один из слитых пептидов, как подробно описано выше, и/или по меньшей мере одну из Fc-связанных фидерных клеток, и/или по меньшей мере одну Fc-связанную сконструированную частицу (PM-частицу и/экзосому), как описано выше. Слитые пептиды могут быть предоставлены в подходящих контейнерах вместе с другими компонентами набора, такими как клеточные реагенты, среды для роста клеток, среды для селекции, реагенты для очистки белков, буферы и т.п. Наборы, представленные здесь, обычно включают инструкции по выполнению методов, подробно описанных ниже. Инструкции, входящие в наборы, могут быть прикреплены к упаковочному материалу или могут быть включены в качестве вкладыша в упаковку. Хотя инструкции обычно представляют собой письменные или печатные материалы, они не ограничиваются ими. Данное раскрытие предполагает любой носитель, способный хранить такие инструкции и передавать их конечному пользователю. Такие носители включают в себя, но не ограничиваются ими, электронные носители данных (например, магнитные диски, ленты, картриджи, чипы), оптические носители (например, CD-ROM) и т.п. Используемый здесь термин «инструкции» может включать адрес интернет-сайта, который предоставляет инструкции.
ПРИМЕРЫ
Пример 1: Вовлечение CD16 через участок Fc в увеличение скорости пролиферации в течение 14 дней
[98] Была получена клеточная линия K562, то есть клеточная линия, экспрессирующая 41BBL и связанный с мембраной IL-21 («CSTX-002»).
[99] Отдельный образец клеток K562 трансфицировали NA-Fc для получения Fc-связанных клеток K562 («CSTX002-Fc»).
[100] Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) были получены из источников лейкоцитов от двух разных доноров (L43 и L44) и были разделены на несколько аликвот. Образец PBMC от каждого донора тестировали на размножение NK-клеток в присутствии CSTX002, а другой образец тестировали на рост NK-клеток в присутствии CSTX002-Fc.
[101] PBMC, выделенные из лейкоцитов с помощью градиента плотности Ficoll-Paque, выращивали в среде SCGM CellGro с добавлением 10% FBS и 100 ед/мл IL-2 и фидерных клеток обработанных митомицином C или облученных, либо клеток CSTX002, либо клеток CSTX002-Fc для совместного культивирования в соотношении 1 фидерная клетка на NK-клетку. Клетки культивировали при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Начиная с 5-го дня, культуральные среды меняли через день, заменяя половину среды свежей средой с добавлением 100 ед. IL2. Клетки подсчитывали через день, а состояние культуры проверяли регулярно, начиная с 7-го дня.
[102] На Фиг. 5 показан график роста NK-клеток в зависимости от дней культивирования, показывающий, что вовлечение CD16 через участок Fc увеличивает скорость пролиферации в течение 14 дней. NK-клетки размножали из PBMC, полученных от двух доноров, L54 (круги) или L44 (квадраты), с использованием клеточных линий CSTX002 (светлые символы) или CSTX002-Fc (темные символы) в качестве фидерных клеток. Вовлечение CD16 способствует увеличению пролиферации NK-клеток. NK-клетки от обоих доноров множились с одинаковой скоростью при стимуляции одним IL21 или IL21 и Fc до 14 дня, по достижению которого культуры стимулированные Fc делились с большей скоростью по сравнению со стимулированными только IL21.
Пример 2: Цитотоксичность естественных клеток-киллеров усиливается в присутствии Fc-связанных фидерных клеток
[103] Клетки CSTX002 и клетки CSTX002-Fc получали, как описано в Примере 1. Анализы цитотоксичности выполняли следующим образом. Целевая клеточная линия SKOV3, полученная из рака яичников, трансфицированная зеленым флуоресцентным белком (GFP), была использована в качестве мишеней для измерения противоопухолевой цитотоксичности эффекторных NK-клеток. Клетки-мишени культивировали отдельно (контрольные лунки) или культивировали совместно при концентрации 0,5×106 клеток/мл с NK-клетками при указанных соотношениях эффектор-мишень (E:T) в течение 45 минут при 37°C, в атмосфере 5% CO2. Затем клетки центрифугировали и ресуспендировали в буфере для мечения аннексином V, содержащем антитело к аннексину V-PacBlue, и инкубировали в течение 15 минут при 4°C перед анализом методом проточной цитометрии. Цитотоксичность определяли на основании абсолютного количества жизнеспособных клеток-мишеней (GFP+/Аннексин V-), оставшихся в каждой лунке с эффекторами (VTCE:T), и соотносили со средним VTC в контрольных лунках «только мишень» (VTCT ctrl.).
Цитотоксичность E:T(%) = (VTCE:T/Среднее VTCT ctrl.)*100
[104] На Фиг.6 представлены два графика, каждый из которых показывает цитотоксичность NK-клеток, размноженных из PBMC, полученных от двух разных доноров (L43 и L44) Для каждого донора NK-клетки размножали из PBMC, используя либо клеточные линии CSTX002 (●), либо CSTX002-Fc (■) в качестве фидерных клеток. Было обнаружено, что NK-клетки, размноженные от каждого из двух разных доноров с помощью CSTX002-Fc, обладают повышенной цитотоксичностью к клеткам SKOV3.
Пример 3: Цитотоксичность естественных клеток-киллеров из PBMCs от донора со слабым реагированием
[105] PBMC, полученные от донора, у которого ранее было обнаружено отсутствие цитотоксичности в отношении клеток SKOV3 при размножении путем стимуляции клетками CSTX002 (без добавления Fc). NK-клетки размножали из PBMC, у которых ранее наблюдали слабое реагирование, используя либо клеточные линии CSTX002 (●), либо CSTX002-Fc (■) в качестве фидерных клеток, как описано в Примере 1. Две разные полученные популяции NK-клеток затем тестировали на цитотоксичность, как также описано в Примере 1, но с использованием SKOV3, трансформированных для экспрессии Fc. Фиг. 7 представляет собой график цитотоксичности NK-клеток, размноженных из PBMC с использованием либо CSTX002 (●) либо CSTX002-Fc (■). Результаты, показанные на Фиг. 7, демонстрируют, что NK-клетки из PBMC, полученные от донора со слабым цитотоксическим реагированием против клеток SKOV3, хорошо реагируют при размножении Fc-связанными фидерными клетками (CSTX002-Fc), демонстрируя цитотоксичность по отношению к опухолевым мишеням, которые имеют связанный домен Fc по сравнению с теми NK-клетками из PBMC, полученными от того же донора со слабым реагированием и размноженными фидерными клетками, не связанными с Fc (CSTX002). NK-клетки, размноженные с помощью CSTX002-Fc, будут лучше вовлечены в антителозависимую клеточную цитотоксичность и будут проявлять более высокую активность в отношении киллинга опухолевых мишеней, связанных с антителом.
Пример 4: Желательная экспрессия рецептора
[106] NK-клетки были размножены из PBMC полученных от двух доноров L43 (●), либо L44 (■), используя либо клеточные линии CSTX002, либо CSTX002-Fc в качестве фидерных клеток, как описано в Примере 1. Затем полученные NK-клетки анализировали. Фиг. 8 представляет собой серию из шести (6) графиков, каждый из которых показывает сравнительную экспрессию рецептора NK-клетками, размноженными фидерными клетками CSTX002 с или без связанного с мембраной Fc. NK-клетки были размножены из PBMC полученных от двух доноров L43 (●), либо L44 (■), используя либо клеточные линии CSTX002, либо CSTX002-Fc в качестве фидерных клеток. Размноженные NK-клетки анализировали на предмет экспрессии рецепторов, которые считаются важными для цитотоксической функции или хоуминга. NK-клетки, размноженные с помощью CSTX002-Fc, имеют более высокую экспрессию CD16, NKp46 и CD62L, по сравнению с клетками размноженными с помощью CSTX002.
Пример 5: Fc-связанные частицы плазматической мембраны
[107] Сконструированные клетки K562, т.е. клеточная линия, экспрессирующая 41BBL и связанный с мембраной IL-21, обрабатывают, как описано в патенте США №9,623,082 для получения везикул плазматической мембраны PM-mb21-41BBL, или частиц «CSTX002», или частиц PM21. Вкратце, K562 культивируют в среде RPMI с добавлением 10% FBS, и культуру масштабируют до 1 л. Клетки собирают центрифугированием при 1000×g, промывают холодным PBS с 10 мМ EDTA и ресуспендируют в буфере для лизиса (50 мМ HEPES, pH 7,4, коктейль ингибиторов протеаз). Клетки разрушают, а раствор лизата центрифугируют при 300×g в течение 15 минут для удаления любых оставшихся целых клеток. Неочищенные плазматические мембраны отделяют от цитозольных компонентов центрифугированием в течение 30 мин при 4°C. Неочищенные мембраны ресуспендируют и дополнительно очищают с использованием градиента плотности сахарозы, чтобы получить чистые везикулы плазматической мембраны, называемые PM-mb21-41BBL.
[108] Отдельный образец клеток K562 трансфицируют для экспрессии Fc для получения Fc-связанного K562, который затем обрабатывают, как описано выше, для получения везикул плазматической мембраны PM-mb21-41BBL, связанных с Fc, или частиц «CSTX002-Fc».
[109] Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) получают от одного донора и разделяют на образцы. Размножение NK-клеток из PBMC проверяют в присутствии мембранных частиц CSTX002 или мембранных частиц CSTX002-Fc. Количество каждой мембранной частицы составляет 200 мкг мембранного белка на 1 мл культуры. PBMC, выделенные из крови с помощью градиента плотности Ficoll-Paque, выращивали в среде SCGM CellGro с добавлением 10% FBS и 100 ед/мл IL-2. Клетки культивируют при 37°C в увлажненном инкубаторе с 5% CO2. Начиная с 5-го дня, культуральные среды меняли через день, заменяя половину среды свежей средой, а также заменяли количества удаленной мембраны путем замены среды. Подсчет клеток проводится через день, а состояние культуры проверяется на 7, 10 и 14 день.
[110] Анализы цитотоксичности проводят, как описано в Примере 1. NK-клетки, размноженные с помощью CSTX002-Fc, будут обладать повышенной цитотоксичностью к клеткам SKOV3.
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ
SEQ ID NO: 29
ATGAATCCAAATCAGAAAATAACAACCATTGGATCAATCTGTCTGGTAGTCGGACTAATTAGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATAATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGCACCTGGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAATTCATCTCTTTGTCCCATCCGTGGGTGGGCTATATACAGCAAAGACAATAGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAGACGTTTTTGTCATAAGAGAGCCCTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACCTTTTTTCTGACCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCCTGCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCCGGAGGAGCAGTACAACAGCACGCTGCGTGTGGTCAGCATTCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCTGGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO: 30
ATGAATCCAAATCAGAAAATAACAACCATTGGATCAATCTGTCTGGTAGTCGGACTAATTAGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATAATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGCACCTGGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAATTCATCTCTTTGTCCCATCCGTGGGTGGGCTATATACAGCAAAGACAATAGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAGACGTTTTTGTCATAAGAGAGCCCTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACCTTTTTTCTGACCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGATGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCACTGCCCGAAGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATAATAA
SEQ ID NO: 31
ATGAATCCAAATCAGAAAATAACAACCATTGGATCAATCTGTCTGGTAGTCGGACTAATTAGCCTAATATTGCAAATAGGGAATATAATCTCAATATGGATTAGCCATTCAATTCAAACTGGAAGTCAAAACCATACTGGAATATGCAACCAAAACATCATTACCTATAAAAATAGCACCTGGGTAAAGGACACAACTTCAGTGATATTAACCGGCAATTCATCTCTTTGTCCCATCCGTGGGTGGGCTATATACAGCAAAGACAATAGCATAAGAATTGGTTCCAAAGGAGACGTTTTTGTCATAAGAGAGCCCTTTATTTCATGTTCTCACTTGGAATGCAGGACCTTTTTTCTGACCGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGATGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCACTGCCCGAAGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCACGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Исследовательский фонд Университета Центральной Флориды, Inc.
<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК-КИЛЛЕРОВ
<130> 10613-070WO1
<160> 31
<170> PatentIn версия 3.5
<210> 1
<211> 50
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 1
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn
50
<210> 2
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 2
Leu Glu Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 3
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 3
Thr Gly Ser Gly
1
<210> 4
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5
<210> 5
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 5
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 4
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 6
Gly Gly Gly Ser
1
<210> 7
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 7
Gly Ser Gly Gly Gly Gly
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 8
Glu Ala Ala Ala Lys
1 5
<210> 9
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 9
Ala Glu Ala Ala Ala Lys Ala
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 10
Pro Ala Pro Ala Pro
1 5
<210> 11
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 11
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1 5 10 15
<210> 12
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 12
Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
1 5 10
<210> 13
<211> 279
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 13
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Arg Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
50 55 60
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
65 70 75 80
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
85 90 95
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp
100 105 110
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr
115 120 125
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
130 135 140
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu
145 150 155 160
Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
165 170 175
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys
180 185 190
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
195 200 205
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
210 215 220
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
225 230 235 240
Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser
245 250 255
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
260 265 270
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
275
<210> 14
<211> 212
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 14
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1 5 10 15
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
20 25 30
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
35 40 45
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
50 55 60
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
100 105 110
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
115 120 125
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
130 135 140
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
145 150 155 160
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
165 170 175
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
180 185 190
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
195 200 205
Ser Pro Gly Lys
210
<210> 15
<211> 105
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 15
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1 5 10 15
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
20 25 30
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
35 40 45
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
50 55 60
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 16
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 16
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 17
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Ser Thr Trp Val Lys Asp
50 55 60
Thr Thr Ser Val Ile Leu Thr Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg
65 70 75 80
Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys
85 90 95
Gly Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu
100 105 110
Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr
115 120
<210> 18
<211> 347
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 18
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Ser Thr Trp Val Lys Asp
50 55 60
Thr Thr Ser Val Ile Leu Thr Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg
65 70 75 80
Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys
85 90 95
Gly Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu
100 105 110
Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
245 250 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
305 310 315 320
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 19
<211> 1044
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 19
atgaatccaa atcagaaaat aacaaccatt ggatcaatct gtctggtagt cggactaatt 60
agcctaatat tgcaaatagg gaatataatc tcaatatgga ttagccattc aattcaaact 120
ggaagtcaaa accatactgg aatatgcaac caaaacatca ttacctataa aaatagcacc 180
tgggtaaagg acacaacttc agtgatatta accggcaatt catctctttg tcccatccgt 240
gggtgggcta tatacagcaa agacaatagc ataagaattg gttccaaagg agacgttttt 300
gtcataagag agccctttat ttcatgttct cacttggaat gcaggacctt ttttctgacc 360
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 420
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 480
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 540
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 600
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 660
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 720
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 780
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 840
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 900
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 960
aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1020
ctctccctgt ctccgggtaa ataa 1044
<210> 20
<211> 347
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 20
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Ser Thr Trp Val Lys Asp
50 55 60
Thr Thr Ser Val Ile Leu Thr Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg
65 70 75 80
Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys
85 90 95
Gly Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu
100 105 110
Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro
180 185 190
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
245 250 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
305 310 315 320
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 21
<211> 211
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 21
Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1 5 10 15
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
20 25 30
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
35 40 45
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
50 55 60
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro
85 90 95
Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
100 105 110
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
115 120 125
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
130 135 140
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
145 150 155 160
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
165 170 175
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
180 185 190
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
195 200 205
Ser Pro Gly
210
<210> 22
<211> 105
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 22
Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1 5 10 15
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
20 25 30
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
35 40 45
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
50 55 60
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro
85 90 95
Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 23
<211> 347
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 23
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Ser Thr Trp Val Lys Asp
50 55 60
Thr Thr Ser Val Ile Leu Thr Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg
65 70 75 80
Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys
85 90 95
Gly Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu
100 105 110
Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Ala Leu Pro Leu Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
245 250 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
305 310 315 320
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345
<210> 24
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 24
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
100 105
<210> 25
<211> 212
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 25
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1 5 10 15
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
20 25 30
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
35 40 45
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
100 105 110
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
115 120 125
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
130 135 140
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
145 150 155 160
Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
165 170 175
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
180 185 190
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
195 200 205
Ser Pro Gly Lys
210
<210> 26
<211> 105
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 26
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Leu Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
1 5 10 15
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
20 25 30
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
35 40 45
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Pro Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
50 55 60
Leu Arg Val Val Ser Ile Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
65 70 75 80
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
85 90 95
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
100 105
<210> 27
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 27
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
1 5 10 15
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
20 25 30
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Leu Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
50 55 60
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
65 70 75 80
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
85 90 95
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
100 105
<210> 28
<211> 559
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 28
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gly Ser Ile Cys Leu Val
1 5 10 15
Val Gly Leu Ile Ser Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
20 25 30
Trp Ile Ser His Ser Ile Gln Thr Gly Ser Gln Asn His Thr Gly Ile
35 40 45
Cys Asn Gln Asn Ile Ile Thr Tyr Lys Asn Ser Thr Trp Val Lys Asp
50 55 60
Thr Thr Ser Val Ile Leu Thr Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Ile Arg
65 70 75 80
Gly Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Ile Gly Ser Lys
85 90 95
Gly Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser His Leu
100 105 110
Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro
115 120 125
Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
130 135 140
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
145 150 155 160
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
165 170 175
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
180 185 190
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
195 200 205
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
210 215 220
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
225 230 235 240
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
245 250 255
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
260 265 270
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
275 280 285
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
290 295 300
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
305 310 315 320
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
325 330 335
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Pro Ser Val
340 345 350
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
355 360 365
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu
370 375 380
Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
385 390 395 400
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
405 410 415
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
420 425 430
Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile
435 440 445
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
450 455 460
Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
465 470 475 480
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
485 490 495
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
500 505 510
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
515 520 525
Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
530 535 540
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
545 550 555
<210> 29
<211> 1041
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 29
atgaatccaa atcagaaaat aacaaccatt ggatcaatct gtctggtagt cggactaatt 60
agcctaatat tgcaaatagg gaatataatc tcaatatgga ttagccattc aattcaaact 120
ggaagtcaaa accatactgg aatatgcaac caaaacatca ttacctataa aaatagcacc 180
tgggtaaagg acacaacttc agtgatatta accggcaatt catctctttg tcccatccgt 240
gggtgggcta tatacagcaa agacaatagc ataagaattg gttccaaagg agacgttttt 300
gtcataagag agccctttat ttcatgttct cacttggaat gcaggacctt ttttctgacc 360
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 420
ttcctcctgc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 480
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 540
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgccggagg agcagtacaa cagcacgctg 600
cgtgtggtca gcattctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 660
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 720
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 780
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 840
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctctggt gctggactcc 900
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 960
aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1020
ctctccctgt ctccgggtaa a 1041
<210> 30
<211> 1047
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 30
atgaatccaa atcagaaaat aacaaccatt ggatcaatct gtctggtagt cggactaatt 60
agcctaatat tgcaaatagg gaatataatc tcaatatgga ttagccattc aattcaaact 120
ggaagtcaaa accatactgg aatatgcaac caaaacatca ttacctataa aaatagcacc 180
tgggtaaagg acacaacttc agtgatatta accggcaatt catctctttg tcccatccgt 240
gggtgggcta tatacagcaa agacaatagc ataagaattg gttccaaagg agacgttttt 300
gtcataagag agccctttat ttcatgttct cacttggaat gcaggacctt ttttctgacc 360
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accggatgtc 420
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 480
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 540
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 600
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 660
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccactg cccgaagaga aaaccatctc caaagccaaa 720
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 780
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 840
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 900
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 960
aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1020
ctctccctgt ctccgggtaa ataataa 1047
<210> 31
<211> 1722
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический конструкт
<400> 31
atgaatccaa atcagaaaat aacaaccatt ggatcaatct gtctggtagt cggactaatt 60
agcctaatat tgcaaatagg gaatataatc tcaatatgga ttagccattc aattcaaact 120
ggaagtcaaa accatactgg aatatgcaac caaaacatca ttacctataa aaatagcacc 180
tgggtaaagg acacaacttc agtgatatta accggcaatt catctctttg tcccatccgt 240
gggtgggcta tatacagcaa agacaatagc ataagaattg gttccaaagg agacgttttt 300
gtcataagag agccctttat ttcatgttct cacttggaat gcaggacctt ttttctgacc 360
gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc 420
ttcctcttcc ccccaaaacc caaggacacc ctcatgatct cccggacccc tgaggtcaca 480
tgcgtggtgg tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac 540
ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgcgggagg agcagtacaa cagcacgtac 600
cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac caggactggc tgaatggcaa ggagtacaag 660
tgcaaggtct ccaacaaagc cctcccagcc cccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa 720
gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggagga gatgaccaag 780
aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag 840
tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc 900
gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 960
aacgtcttct catgctccgt gatgcacgag gctctgcaca accactacac gcagaagagc 1020
ctctccctgt ctccgggtaa agacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 1080
ctcctggggg gaccggatgt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 1140
tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1200
aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1260
gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1320
ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccact gcccgaagag 1380
aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1440
tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1500
cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1560
acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1620
aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcacga ggctctgcac 1680
aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 1722
<---
Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к средствам, стимулирующим естественные (натуральные) клетки-киллеры (NK), и может быть использовано в медицине для лечения рака, а также для ингибирования острой или хронической реакции «трансплантат против хозяина», реактивации вируса и оппортунистических инфекций. Предложена композиция, содержащая фидерную клетку, сконструированную для экспрессии слитого белка, содержащую связанные с мембраной перевернутый домен Fc, IL-21 и 4-1BBL, или полученную из указанной фидерной клетки частицу плазматической мембраны (PM) или экзосому. При этом слитый белок содержит трансмембранный домен, связанный с аминоконцом связанного с мембраной перевернутого домена Fc, и сконфигурирован для связывания аминоконца перевернутого домена Fc с внешней поверхностью сконструированных фидерной клетки, частицы РМ или экзосомы. Изобретение позволяет увеличить число и цитотоксичность NK-клеток, что обеспечивает проявление терапевтического эффекта. 6 н. и 18 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 пр.
1. Композиция для увеличения числа естественных клеток-киллеров (NK), содержащая
а) фидерную клетку, сконструированную для экспрессии слитого белка, содержащую связанный с мембраной перевернутый домен Fc,
b) частицу плазматической мембраны (PM), полученную из фидерной клетки, сконструированной для экспрессии слитого белка, содержащей связанный с мембраной перевернутый домен Fc, или
с) экзосому, полученную из фидерной клетки, сконструированной для экспрессии слитого белка, содержащей связанный с мембраной перевернутый домен Fc,
при этом слитый белок содержит трансмембранный домен, связанный с аминоконцом связанного с мембраной перевернутого домена Fc, и сконфигурирован для связывания аминоконца перевернутого домена Fc с внешней поверхностью сконструированной фидерной клетки, сконструированной частицы РМ или сконструированной экзосомы, и при этом сконструированная фидерная клетка, сконструированная частица РМ или сконструированная экзосома дополнительно содержит связанный с мембраной IL-21 и связанный с мембраной 4-1BBL.
2. Композиция для увеличения числа NK-клеток по п. 1, содержащая сконструированную частицу PM или сконструированную экзосому, по существу не содержащую фидерных клеток.
3. Композиция для увеличения числа NK-клеток по п. 1, отличающаяся тем, что сконструированная частица PM получена из клетки K562.
4. Композиция для увеличения числа NK-клеток по п. 3, отличающаяся тем, что сконструированная фидерная клетка содержит клетку К562.
5. Композиция для увеличения числа NK-клеток по п. 1, дополнительно содержащая по меньшей мере один дополнительный эффекторный агент NK-клетки, причем по меньшей мере один дополнительный эффекторный агент NK-клетки представляет собой цитокин, молекулу адгезии или агент, активирующий NK-клетки; и причем по меньшей мере один дополнительный эффекторный агент NK-клетки выбран из IL-15, IL-2, IL-12, IL-18, IL-21, MICA, UBLP, 2sB4, LFA-1, лиганда Notch, лиганда для NKp46 или BCM1/SLAMF2, лиганда TLR и лиганда NKG2D.
6. Композиция для увеличения числа NK-клеток по п. 1, отличающаяся тем, что сконструированная частица PM дополнительно содержит твердый носитель, по меньшей мере часть которого покрыта плазматической мембраной.
7. Композиция для увеличения числа NK-клеток по п. 6, отличающаяся тем, что твердый носитель содержит по меньшей мере одну из магнитных микрочастиц, гранул диоксида кремния, гранул полистирола, гранул латекса, микроструктур, контрастного агента и/или противоракового терапевтического агента.
8. Композиция для увеличения числа NK-клеток по любому из пп. 1-7, составленная в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем.
9. Способ лечения, уменьшения и/или ингибирования рака у субъекта, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества популяции NK-клеток, число которых увеличено in vitro посредством контакта с композицией для увеличения числа NK-клеток по любому из пп. 1-7.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что рак включает рак яичников.
11. Способ по п. 9, дополнительно включающий введение субъекту по меньшей мере одного терапевтического агента против рака в комбинации с эффективным количеством композиции.
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что по меньшей мере один терапевтический агент против рака выбран из химиотерапевтического агента, препаративной схемы на основе лекарственного средства или их комбинации.
13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что химиотерапевтический агент выбран из CHOP, FLAG и 7+3, а препаративная схема на основе лекарственного средства выбрана из Cy-Flu, Bu-Flu и Flu-Mel.
14. Способ предотвращения, ингибирования или уменьшения острой или хронической реакции «трансплантат против хозяина», включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции для увеличения числа NK-клеток по любому из пп. 1-7.
15. Способ по п. 14, где композицию используют в комбинации с профилактическим агентом против реакции «трансплантат против хозяина» (GvHD).
16. Способ предотвращения, ингибирования или уменьшения реактивации вируса, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции для увеличения числа NK-клеток по любому из пп. 1-7.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что вирус включает вирус простого герпеса - 1 (HSV-1), вирус простого герпеса - 2 (HSV-2), цитомегаловирус (CMV), ветряную оспу, вирус опоясывающего лишая (VZV), вирус Эпштейна-Барра (EBV), аденовирус, аденоассоциированный вирус, парвовирус, вирус JC и вирус BK.
18. Способ предотвращения, ингибирования или уменьшения оппортунистических инфекций, включающий введение субъекту, нуждающемуся в этом, эффективного количества композиции для увеличения числа NK-клеток по любому из пп. 1-7.
19. Способ повышения цитотоксичности NK-клеток исходной популяции NK-клеток, включающий воздействие на исходную популяцию NK-клеток in vitro композицией для увеличения числа NK-клеток по любому из пп. 1-7.
20. Способ по п. 19, дополнительно включающий получение популяции размноженных NK-клеток, имеющих повышенную цитотоксичность по сравнению с исходной популяцией NK-клеток.
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что цитотоксичность размноженных NK-клеток по меньшей мере примерно в 2 раза превышает цитотоксичность исходной популяции NK-клеток.
22. Способ по п. 19, отличающийся тем, что цитотоксичность размноженных NK-клеток по меньшей мере примерно в 5 раз превышает цитотоксичность исходной популяции NK-клеток.
23. Способ по п. 19, отличающийся тем, что цитотоксичность размноженных NK-клеток по меньшей мере примерно в 10 раз превышает цитотоксичность исходной популяции NK-клеток.
24. Способ по любому из пп. 9-23, отличающийся тем, что источники NK- клеток, которые должны быть размножены, могут включать периферическую кровь (PBMC, аферез, лейкопаки, лейкоциты), NK-клетки, полученные из iPSC, NK-клетки, полученные из ESC, NK-клетки, имеющие полиморфизм высокоаффинного рецептора Fc, имеющего Phe или Val в 158, и генетически модифицированные NK-клетки.
| WO 2018218151 A1, 29.11.2018, US 2017320959 A1, 09.11.2017, WO 2014005072 A1, 03.01.2014, EP 3138905 A1, 08.03.2017, RU 2015140811 A, 03.04.2017, RU 2322455 C2, 20.04.2008, ACCHIONE M | |||
| et al | |||
| Impact of linker and conjugation chemistry on antigen binding, Fc receptor binding and thermal stability of model antibody-drug conjugates, MAbs, 2012, v |
