[0001] Настоящая заявка испрашивает преимущества и приоритет предварительной заявки на патент США 62/461,145, поданной 20 февраля 2017 года, все содержание которой включено в настоящий документ посредством отсылки во всех отношениях.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0002] Настоящая заявка содержит Список последовательностей, который был представлен в электронном виде в формате ASCII и настоящим полностью включен посредством отсылки. Указанная копия ASCII, созданная 19 февраля 2018 года, имеет название DFY-007PC_SL.txt и размер 98304 байта.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
[0003] Изобретение относится к мультиспецифичным связывающим белкам, которые связываются с CD33, рецептором NKG2D и CD16.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0004] Рак остается серьезной проблемой здравоохранения, несмотря на значительные объемы исследований и научные достижения, описанные в литературе, в лечении этого заболевания. Некоторые из наиболее часто диагностируемых форм рака у взрослых включают рак предстательной железы, рак молочной железы и рак легкого. Гемобластозы, хотя и реже, чем солидный рак, имеют низкую выживаемость. Существующие варианты лечения этих форм рака не эффективны во всех группах пациентов и/или могут иметь существенные нежелательные побочные эффекты. Другие формы рака также остаются сложными для лечения с применением существующих схем лечения.
[0005] Методы иммунотерапии рака предпочтительны, поскольку они обладают высокой специфичностью и могут способствовать разрушению раковых клеток собственной иммунной системой пациента. Слитые белки, такие как биспецифичные активаторы T-клеток, представляют собой противораковые иммунотерапевтические средства, описанные в литературе, которые связываются с опухолевыми клетками и T-клетками, способствуя разрушению опухолевых клеток. Антитела, которые связываются с некоторыми опухолеассоциированными антигенами и некоторыми иммунными клетками, были описаны в литературе. См., например, WO 2016/134371 и WO 2015/095412.
[0006] Естественные киллеры (NK-клетки) являются компонентом врожденной иммунной системы и составляют приблизительно 15% циркулирующих лимфоцитов. NK-клетки инфильтрируют практически все ткани и изначально отличаются своей способностью эффективно убивать опухолевые клетки без необходимости в предшествующей сенсибилизации. Активированные NK-клетки убивают клетки-мишени подобно цитотоксическим T-клетками, т.е. посредством цитолитических гранул, которые содержат перфорин и гранзимы, а также через пути рецептора смерти. Активированные NK-клетки также секретируют воспалительные цитокины, такие как IFN-гамма, и хемокины, которые вызывают рекрутинг других лейкоцитов в целевую ткань.
[0007] NK-клетки отвечают на сигналы посредством множества активирующих и ингибирующих рецепторов на своей поверхности. Например, когда NK-клетки встречают здоровые клетки, их активность ингибируется в результате активации иммуноглобулино-подобных рецепторов (KIR) киллерных клеток. В альтернативе, когда NK-клетки встречают чужеродные клетки или раковые клетки, они активируются посредством своих активирующих рецепторов (например, NKG2D, NCR, DNAM1). NK-клетки также активируются константной областью некоторых иммуноглобулинов через рецепторы CD16 на своей поверхности. Общая чувствительность NK-клеток к активации зависит от суммы стимулирующих и ингибиторных сигналов.
[0008] CD33 является представителем связывающих сиаловую кислоту иммуноглобулиноподобных лектинов. CD33, как трансмембранный рецептор, экспрессирующийся в основном на клетках миелоидной линии дифференцировки, модулирует воспалительные и иммунные реакции посредством ослабляющего эффекта в отношении регулируемых тирозин-киназой сигнальных путей. Например, было показано, что CD33 конститутивно подавляет продукцию провоспалительных цитокинов, таких как IL-1β, ФНО-α и IL-8 в моноцитах человека.
[0009] CD33 ассоциирован с гемобластозами. Он широко экспрессируется в бластных клетках почти всех форм острого миелоидного лейкоза (ОМЛ). Кроме того, гемопоэтические раковые стволовые клетки и/или клетки-предшественники, как было обнаружено, являются CD33+, что предполагает, что CD33-направленная терапия может потенциально устранять злокачественные стволовые клетки и/или клетки-предшественники в таких случаях, экономя нормальные гемопоэтические стволовые клетки. В дополнение к его экспрессии при ОМЛ, CD33 обнаружен на других миелоидных опухолях (например, миелодиспластические синдромы и миелопролиферативные неоплазии) и на субпопуляциях B-клеточных и T-клеточных острых лимфообластных лейкозов (ОЛЛ)/лимфообластных лимфом. Такой профиль экспрессии привел к использованию CD33-направленной терапии у пациентов со злокачественными опухолями, включая ОМЛ, миелодиспластические синдромы, хронические миеломоноцитарный лейкоз, миелоидный бластный криз при хроническом миелоидном лейкозе, а также различными формами ОЛЛ.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0010] В изобретении предложены мультиспецифичные связывающие белки, которые связываются с CD33 на раковой клетке и с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на NK-клетках. Такие белки могут связывать больше одного типа NK-активирующего рецептора и могут блокировать связывание естественных лигандов с NKG2D. В некоторых вариантах осуществления белки могут агонистически воздействовать на NK-клетки у людей, а также других видов, таких как грызуны и яванские макаки. Различные аспекты и варианты осуществления изобретения более подробно описаны ниже.
[0011] Таким образом, один аспект изобретения относится к белку, который включает первый антигенсвязывающий участок, который связывает NKG2D; второй антигенсвязывающий участок, который связывается с CD33; и Fc-домен антитела, его часть, достаточную для связывания CD16, или третий антигенсвязывающий участок, который связывает CD16. Каждый из антигенсвязывающих участков может включать вариабельный домен тяжелой цепи антитела и вариабельный домен легкой цепи антитела, например, расположенные как в антителе или слитые вместе с scFv, или один или более антигенсвязывающих участков могут быть однодоменным антителом, таким как VHH-антитело, такое как антитело верблюдового, или VNAR-антитело, подобное антителам, которые обнаружены у хрящевых рыб.
[0012] Первый антигенсвязывающий участок, который связывается с NKG2D, в одном варианте осуществления может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:1, например тем, что он имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентична SEQ ID NO:1, и/или включает аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:54), CDR2 (SEQ ID NO:55) и CDR3 (SEQ ID NO:56) в SEQ ID NO:1. В альтернативе первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:41, и вариабельный домен легкой цепи, вариабельный SEQ ID NO:42. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:41, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:57), CDR2 (SEQ ID NO:58) и CDR3 (SEQ ID NO:59) в SEQ ID NO:41. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:42, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:60), CDR2 (SEQ ID NO:61) и CDR3 (SEQ ID NO:62) в SEQ ID NO:42. В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:43, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:44. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:43, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:63), CDR2 (SEQ ID NO:64), и CDR3 (SEQ ID NO:65) в SEQ ID NO:43. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:44, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:66), CDR2 (SEQ ID NO:67) и CDR3 (SEQ ID NO:68) в SEQ ID NO:44.
[0013] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:45, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:46, например тем, что он имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100%) идентична SEQ ID NO:45, и по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентична SEQ ID NO:46, соответственно. В другом варианте осуществления первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:47, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:48, например тем, что он имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, или 100%) идентична SEQ ID NO:47 и по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентична SEQ ID NO:48, соответственно.
[0014] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:69, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:70. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:69, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:71), CDR2 (SEQ ID NO:72), и CDR3 (SEQ ID NO:73) в SEQ ID NO:69. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:70, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:74), CDR2 (SEQ ID NO:75), и CDR3 (SEQ ID NO:76) в SEQ ID NO:70. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:77, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:78. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:77, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:69), CDR2 (SEQ ID NO:80) и CDR3 (SEQ ID NO:81) в SEQ ID NO:77. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:78, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:82), CDR2 (SEQ ID NO:83), и CDR3 (SEQ ID NO:84) в SEQ ID NO:78.
[0015] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:85, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:86. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:85, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:87), CDR2 (SEQ ID NO:88), и CDR3 (SEQ ID NO:89) в SEQ ID NO:85. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:86, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:90), CDR2 (SEQ ID NO:91) и CDR3 (SEQ ID NO:92) в SEQ ID NO:86.
[0016] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:133, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:134. Например, вариабельный домен тяжелой цепи первого антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:133, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:135), CDR2 (SEQ ID NO:136), и CDR3 (SEQ ID NO:137) в SEQ ID NO:133. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:134, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:138), CDR2 (SEQ ID NO:139) и CDR3 (SEQ ID NO:140) в SEQ ID NO:134.
[0017] Второй антигенсвязывающий участок может необязательно включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:93, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:94. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:93, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:95), CDR2 (SEQ ID NO:96) и CDR3 (SEQ ID NO:97) в SEQ ID NO:93. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:94, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:98), CDR2 (SEQ ID NO:99) и CDR3 (SEQ ID NO:100) в SEQ ID NO:94.
[0018] В альтернативе второй антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:101, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:102. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:101, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:103), CDR2 (SEQ ID NO:104) и CDR3 (SEQ ID NO:105) в SEQ ID NO:101. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:58, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:106), CDR2 (SEQ ID NO:107) и CDR3 (SEQ ID NO:108) в SEQ ID NO:102.
[0019] В другом варианте осуществления второй антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:109, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:110. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:59, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:111), CDR2 (SEQ ID NO:112) и CDR3 (SEQ ID NO:113) в SEQ ID NO:109. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:110, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:114), CDR2 (SEQ ID NO:115) и CDR3 (SEQ ID NO:116) в SEQ ID NO:110.
[0020] В другом варианте осуществления второй антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:117, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:118. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:117, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:119), CDR2 (SEQ ID NO:120) и CDR3 (SEQ ID NO:121) в SEQ ID NO:117. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:118, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:122), CDR2 (SEQ ID NO:123) и CDR3 (SEQ ID NO:124) в SEQ ID NO:118.
[0021] В другом варианте осуществления второй антигенсвязывающий участок может включать вариабельный домен тяжелой цепи, родственный SEQ ID NO:125, и вариабельный домен легкой цепи, родственный SEQ ID NO:126. Например, вариабельный домен тяжелой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:125, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:127), CDR2 (SEQ ID NO:128) и CDR3 (SEQ ID NO:129) в SEQ ID NO:125. Аналогичным образом, вариабельный домен легкой цепи второго антигенсвязывающего участка может быть по меньшей мере на 90% (например, на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%) идентичен SEQ ID NO:126, и/или может включать аминокислотные последовательности, идентичные последовательностям CDR1 (SEQ ID NO:130), CDR2 (SEQ ID NO:131) и CDR3 (SEQ ID NO:132) в SEQ ID NO:126.
[0022] В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий участок включает вариабельный домен легкой цепи, имеющий аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности вариабельного домена легкой цепи, присутствующего в первом антигенсвязывающем участке.
[0023] В некоторых вариантах осуществления белок включает часть Fc-домена антитела, достаточную для связывания CD16, где Fc-домен антитела включает шарнирный и CH2 домены и/или аминокислотные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны аминокислотным последовательностям 234-332 IgG антитела человека.
[0024] Также предложены лекарственные формы, содержащие один из этих белков; клетки, содержащие одну или более нуклеиновых кислот, экспрессирующих эти белки, и способы усиления гибели опухолевых клеток с применением этих белков.
[0025] В другом аспекте изобретения предложен способ лечения рака у пациента. Способ включает введение нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества мультиспецифичного связывающего белка, описанного в настоящем документе. Примеры форм рака для лечения с применением мультиспецифичных связывающих белков включают, например, рак, выбранный из группы, состоящей из ОМЛ, миелодиспластических синдромов, хронического миеломоноцитарного лейкоза, миелоидного бластного криза при хроническом миелоидном лейкозе и различных форм ОЛЛ.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0026] ФИГ. 1 - схематическое изображение гетеродимерного мультиспецифичного антитела. Каждое плечо может представлять собой либо NKG2D-связывающий домен, либо CD33-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления NKG2D- и CD33-связывающие домены могут иметь одинаковую легкую цепь.
[0027] ФИГ. 2 - схематическое изображение гетеродимерного мультиспецифичного антитела. NKG2D- или CD33-связывающий домен может иметь формат scFv (правое плечо).
[0028] ФИГ. 3 - линейные графики, демонстрирующие аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны) с рекомбинантным NKG2D человека в анализе ИФА.
[0029] ФИГ. 4 - линейные графики, демонстрирующие аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны) с рекомбинантным NKG2D яванского макака в анализе ИФА.
[0030] ФИГ. 5 - линейные графики, демонстрирующие аффинность связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны) с рекомбинантным NKG2D мыши в анализе ИФА.
[0031] ФИГ. 6 - гистограммы, демонстрирующие связывание NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны) с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D человека, с помощью проточной цитометрии, на которых показано кратное отношение средней интенсивности флуоресценции (MFI) к фону.
[0032] ФИГ. 7 - гистограммы, демонстрирующие связывание NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны) с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D мыши, с помощью проточной цитометрии, на которых показано кратное отношение средней интенсивности флуоресценции (MFI) к фону.
[0033] ФИГ. 8 - линейные графики, демонстрирующие аффинность специфичного связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны) с рекомбинантным NKG2D-Fc человека при конкурировании с естественным лигандом ULBP-6.
[0034] ФИГ. 9 - линейные графики, демонстрирующие аффинность специфичного связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны) с рекомбинантным NKG2D-Fc человека при конкурировании с естественным лигандом MICA.
[0035] ФИГ. 10 - линейные графики, демонстрирующие аффинность специфичного связывания NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны) с рекомбинантным NKG2D-Fc мыши при конкурировании с естественным лигандом Rae-1 дельта.
[0036] ФИГ. 11 - гистограммы, на которых показана активация NKG2D человека NKG2D-связывающими доменами (перечисленными как клоны), путем количественного определения процента ФНО-альфа положительных клеток, которые экспрессируют слитые белки человеческого NKG2D-CD3 дзета.
[0037] ФИГ. 12 - гистограммы, на которых показана активация NKG2D мыши NKG2D-связывающими доменами (перечисленными как клоны) путем количественного определения процента ФНО-альфа положительных клеток, которые экспрессируют слитые белки мышиного NKG2D-CD3 дзета.
[0038] ФИГ. 13 - гистограммы, на которых показана активация человеческих NK-клеток NKG2D-связывающими доменами (перечисленными как клоны).
[0039] ФИГ. 14 - гистограммы, на которых показана активация человеческих NK-клеток NKG2D-связывающими доменами (перечисленными как клоны).
[0040] ФИГ. 15 - гистограммы, на которых показана активация мышиных NK-клеток NKG2D-связывающими доменами (перечисленными как клоны).
[0041] ФИГ. 16 - гистограммы, на которых показана активация мышиных NK-клеток NKG2D-связывающими доменами (перечисленными как клоны).
[0042] ФИГ. 17 - гистограммы, на которых показан цитотоксический эффект NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны) в отношении опухолевых клетках.
[0043] ФИГ. 18 - гистограммы, на которых показана температура плавления NKG2D-связывающих доменов (перечисленных как клоны), измеренная с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии.
[0044] ФИГ. 19A-19C - гистограммы синергической активации NK-клеток при использовании связывания NKG2D и CD16. На ФИГ. 19A продемонстрированы уровни CD107a; на ФИГ. 19B продемонстрированы уровни IFNγ; на ФИГ. 19C продемонстрированы уровни CD107a и IFNγ. Графики указывают среднее значение (n=2) ±SD. Данные является репрезентативными для пяти независимых экспериментов с использованием пяти различных здоровых доноров.
[0045] ФИГ. 20 - схематическое изображение TriNKET в форме Triomab, которое является трифункциональным биспецифичным антителом, которое сохраняет IgG-подобную форму. Эта химера состоит из двух полуантител, каждое из которых содержит одну легкую и одну тяжелую цепь, которые получены из двух исходных антител. Форма Triomab может быть гетеродимерной конструкцией, содержащей 1/2 крысиного антитела и 1/2 мышиного антитела.
[0046] ФИГ. 21 - схематическое изображение TriNKET в форме KiH одинаковой легкой цепи (LC), которое включает технологию выступы во впадину (KIH). KiH представляет собой гетеродимер, содержащий 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и 2, и Fc, стабилизированный гетеродимеризационными мутациями. TriNKET в формате KiH может быть гетеродимерной конструкцией с 2 fabs, связывающимися с мишенью 1 и мишенью 2, содержащими две разных тяжелых цепи и одинаковую легкую цепь, которая спарена с обеими тяжелыми цепями.
[0047] ФИГ. 22 - схематическое изображение TriNKET в форме иммуноглобулина с двойным вариабельным доменом (DVD-Ig™), которое объединяет мишеньсвязывающие домены двух моноклональных антител через гибкие природные линкеры с получением тетравалентной IgG-подобной молекулы. DVD-Ig™ представляет собой гомодимерную конструкцию, в которой вариабельный домен, направленно взаимодействующий с антигеном 2, слит с N-концом вариабельного домена Fab, направленно взаимодействующего с антигеном 1, конструкция содержит обычный Fc.
[0048] ФИГ. 23 - схематическое изображение TriNKET в форме Ортогонального Fab интерфейса (Ortho-Fab), которое является гетеродимерной конструкцией, которая содержит 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с Fc. Спаривание LC-HC обеспечено ортогональным интерфейсом. Гетеродимеризация обеспечена мутациями в Fc.
[0049] ФИГ. 24 - схематическое изображение TrinKET в формате 2 в 1 Ig.
[0050] ФИГ. 25 - схематическое изображение TriNKET в форме ES, которое является гетеродимерной конструкцией, содержащей два разных Fab, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с Fc. Гетеродимеризация обеспечена мутациями электростатического направления в Fc.
[0051] ФИГ. 26 - схематическое изображение TriNKET в форме Обмена плечами Fab: антитела обмениваются плечами Fab с заменой тяжелой цепи и присоединенной легкой цепи (полумолекулы) парой тяжелой-легкой цепей другой молекулы, что приводит к получению биспецифичных антител. Форма Обмена плечами Fab (cFae) является гетеродимером, содержащим 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и 2, и Fc, стабилизированный гетеродимеризационными мутациями.
[0052] ФИГ. 27 - схематическое изображение TriNKET в форме SEED Body, которая является гетеродимером, содержащим 2 Fab, связывающихся с мишенью 1 и 2, и Fc, стабилизированный гетеродимеризационными мутациями.
[0053] ФИГ. 28 - схематическое изображение TriNKET в форме LuZ-Y, в которой лейциновая молния используется для индукции гетеродимеризации двух разных HC. Форма LuZ-Y представляет собой гетеродимер, содержащий два разных scFab, связывающихся с мишенью 1 и 2, слитых с Fc. Гетеродимеризация обеспечена посредством мотивов лейциновых молний, слитых с C-концом Fc.
[0054] ФИГ. 29 - схематическое изображение TriNKET в форме Cov-X-Body.
[0055] ФИГ. 30A-30B - схематическое изображение TriNKET в формах κλ-Body, которые являются гетеродимерными конструкциями с двумя разными Fab, слитыми с Fc, стабилизированным гетеродимеризационными мутациями: Fab1, направленный против антигена 1, содержит LC каппа, тогда как второй Fab, направленный против антигена 2, содержит LC лямбда. ФИГ. 30A является примерной схемой одной формы κλ-Body; ФИГ. 30B является примерной схемой другого κλ-Body.
[0056] ФИГ. 31 - гетеродимерная конструкция Oasc-Fab, которая включает Fab, связывающийся с мишенью 1, и scFab, связывающийся с мишенью 2, слитые с Fc. Гетеродимеризация обеспечена мутациями в Fc.
[0057] ФИГ. 32 - DuetMab, которое является гетеродимерной конструкцией, содержащей два разных Fab, связывающихся с антигенами 1 и 2, и Fc, стабилизированный гетеродимеризационными мутациями. Fab 1 и 2 содержит разные S-S мостики, которые гарантируют правильное соединение легкой цепи (LC) и тяжелой цепи (HC).
[0058] ФИГ. 33 - CrossmAb, которой является гетеродимерной конструкцией с двумя разными Fab, связывающимися с мишенями 1 и 2, слитыми с Fc, стабилизированным гетеродимеризацией. Домены CL и CH1 и домены VH и VL переставлены, например, CH1 слит последовательно с VL, тогда как CL слит последовательно с VH.
[0059] ФИГ. 34 - Fit-Ig, которое является гомодимерной конструкцией, в которой Fab, связывающийся с антигеном 2, слит с N-концом HC Fab, который связывается с антигеном 1. Конструкция содержит Fc дикого типа.
[0060] ФИГ. 35A-35B - профили связывания CD33-направляющих TriNKET с NKG2D, экспрессируемым на клетках EL4. На ФИГ. 35A показано связывание конструкций TriNKET по сравнению с моноклональными антителами, которые содержат соответствующий NKG2D-связывающий домен. На ФИГ. 35B показан профиль связывания CD33-направляющих TriNKET, которые включают 6 разных NKG2D-связывающих доменов.
[0061] ФИГ. 36А и 36B - профили связывания CD33-направляющих TriNKET с CD33, экспрессируемым на клетках ОМЛ человека MV4-11. ФИГ. 36C - профиль связывания CD33-направляющих TriNKET и моноклонального антитела к CD33 с CD33, экспрессируемым на клетках ОМЛ человека Molm-13. ФИГ. 36D - профиль связывания CD33-направляющих TriNKET и моноклонального антитела к CD33 с CD33, экспрессируемым на линии клеток ОМЛ человека MV4-11.
[0062] ФИГ. 37А-37B являются линейными графиками, демонстрирующими TriNKET-опосредованную активацию покоящихся или IL-2-активированных NK-клеток человека в совместной культуре с CD33-экспрессирующей линией клеток ОМЛ человека MV4-11. На ФИГ. 37A показана TriNKET-опосредованная активация покоящихся NK-клеток человека. На ФИГ. 37B показана TriNKET-опосредованная активация IL-2-активированных NK-клеток человека от того же донора. Отдельно культивируемые NK-клетки, совместную культуру NK-клеток с клетками MV4-11, но без TriNKET и CD20-направляющие TriNKET использовали в качестве контролей.
[0063] ФИГ. 38А-38C - гистограммы, на которых показана экспрессия высокоаффинного FcRγI (CD64) на трех линиях клеток ОМЛ человека: линии клеток Molm-13 (ФИГ. 38A), линии клеток MV4-11 (ФИГ. 38B) и линии клеток THP-1 (ФИГ. 38C).
[0064] ФИГ. 39А-39B - линейные графики активации человеческих NK-клеток, опосредованной моноклональным антителом к CD33, или TriNKET, в совместной культуре с клетками Molm-13 (ФИГ. 39B) или с THP-1 (ФИГ. 39A). На ФИГ. 39C показана активация человеческих NK-клеток конструкциями TriNKET в совместной культуре с линией клеток ОМЛ человека MV4-11. HER2-TriNKET использовали в качестве контроля.
[0065] ФИГ. 40А-40C - линейные графики цитотоксичности NK человека в отношении трех линий клеток ОМЛ человека, опосредованной CD33-направляющими TriNKET и соответствующим моноклональным антителом к CD33. На ФИГ. 40A показано, что моноклональное антитело к CD33 показало сниженную эффективность в отношении клеток MV4-11, которые экспрессируют CD64, но на более низком уровне, чем THP-1. На ФИГ. 40B продемонстрировано, что моноклональное антитело CD33 показало хорошую эффективность в отношении клеток Molm-13, которые не экспрессируют CD64. На ФИГ. 40C продемонстрировано, что моноклональное антитело к CD33 не показывало действия в отношении клеток THP-1.
[0066] ФИГ. 41 показана TriNKET-опосредованная цитотоксичность покоящихся NK-клеток человека в отношении клеток Molm-13.
[0067] ФИГ. 42A - гистограмма, на которой показано, что B-клетки здорового донора защищены от лизиса, опосредованного CD33-направляющим TriNKET. ФИГ. 42B - гистограмма, на которой показано, что аутологичные CD33+ миелоидные клетки были защищены от опосредованных CD33-направляющим TriNKET NK-клеточных ответов, и, таким образом, были устойчивы к опосредованному TriNKET лизису.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0068] В изобретении предложены мультиспецифичные связывающие белки, которые связывают CD33 на раковой клетке и рецептор NKG2D и рецептор CD16 на естественных киллерных клетках, для активации NK-клеток, фармацевтические композиции, содержащие такие мультиспецифичные связывающие белки, и терапевтические способы с применением таких мультиспецифичных белков, а также фармацевтические композиции, в том числе для лечения рака. Различные аспекты изобретения изложены в разделах ниже; однако аспекты изобретения, описанные в одном конкретном разделе, не должны быть ограничены каким-либо конкретным разделом.
[0069] Для облегчения понимания настоящего изобретения ряд терминов и фраз определен ниже.
[0070] Формы единственного числа "a" и "an", при использовании в настоящем документе, означают "один или более" и включают множественное число, если это не противоречит контексту.
[0071] При использовании в настоящем документе термин "антигенсвязывающий участок" относится к части молекулы иммуноглобулина, которая участвует в связывании антигена. В человеческих антителах антигенсвязывающий участок сформирован аминокислотными остатками N-концевых варибельных ("V") областей тяжелой ("H") и легкой ("L") цепей. Три крайне неоднородных фрагмента в границах V-областей тяжелых и легких цепей называются "гипервариабельными областям", которые чередуются с более консервативными фланкирующими фрагментами, известными как "каркасные области" или "FR". Таким образом, термин "FR" относится к аминокислотным последовательностям, которые в иммуноглобулинах обычно расположены между гипервариабельными областями и примыкают к ним. В молекуле человеческого антитела три гипервариабельных области легкой цепи и три гипервариабельных области тяжелой цепи расположены друг относительно друга в трехмерном пространстве с образованием антигенсвязывающей поверхности. Антигенсвязывающая поверхность комплементарна трехмерной поверхности связанного антигена, и три гипервариабельных области каждой тяжелой и легкой цепей называются "определяющими комплементарность областями" или "CDR-областями". У некоторых животных, таких как верблюды и хрящевые рыбы, антигенсвязывающий участок сформирован одной цепью антитела, представляющей "однодоменное антитело". Антигенсвязывающие участки могут существовать в интактном антителе, в антигенсвязывающем фрагменте антитела, который сохраняет антигенсвязывающую поверхность, или в рекомбинантном полипептиде, таком как scFv, при использовании пептидного линкера для соединения вариабельного домена тяжелой цепи с вариабельным доменом легкой цепи в одном полипептиде.
[0072] Термин "опухолеассоциированный антиген" при использовании в настоящем документе означает любой антиген, в том числе, без ограничения перечисленным, белок, гликопротеин, ганглиозид, углевод, липид, который ассоциирован с раком. Такой антиген может экспрессироваться на злокачественных клетках или в микроокружении опухоли, например, на связанных с опухолью кровеносных сосудах, внеклеточном матриксе, мезенхимальной строме, или в иммунных инфильтратах.
[0073] При использовании в настоящем документе термины "субъект" и "пациент" относятся к организму, подлежащему лечению с применением способов и композиций, описанных в настоящем документе. Такие организмы предпочтительно включают, без ограничения перечисленными, млекопитающих (например, мышевидных грызунов, человекообразных обезьян, лошадей, коров, свиней, псовых, кошачьих и т.п.), и более предпочтительно включают людей.
[0074] При использовании в настоящем документе термин "эффективное количество" относится к количеству соединения (например, соединения согласно настоящему изобретению), достаточному для получения полезных или требуемых результатов. Эффективное количество могут вводить в одно или более введений, применений или доз, при этом оно не должно быть ограничено конкретной лекарственной формой или путем введения. При использовании в настоящем документе термин "лечение" включает любой эффект, например, уменьшение, снижение, модуляцию, улучшение или устранение, который приводит к улучшению состояния, уменьшению тяжести заболевания, нарушения и т.п., или ослаблению их симптома.
[0075] При использовании в настоящем документе термин "фармацевтическая композиция" относится к комбинации действующего вещества с носителем, инертным или активным, что делает композицию особенно подходящей для диагностического или терапевтического применения in vivo или ex vivo.
[0076] При использовании в настоящем документе термин "фармацевтически приемлемый носитель" относится к любому из типичных фармацевтических носителей, таким как фосфатно-солевой буферный раствор, вода, эмульсии (например, такие как эмульсии масло/вода или вода/масло), и различным типам смачивающих веществ. Композиции также могут включать стабилизаторы и консерванты. Для ознакомления с примерами носителей, стабилизаторов и вспомогательных веществ, см., например, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975].
[0077] При использовании в настоящем документе термин "фармацевтически приемлемая соль" относится к любой фармацевтически приемлемой соли (например, с кислотой или основанием) соединения настоящего изобретения, которая при введении субъекту способна давать соединение настоящего изобретения или его активный метаболит или остаток. Как известно специалистам в данной области, "соли" соединений данного изобретения могут быть получены из неорганических или органических кислот и оснований. Примеры кислот включают, без ограничения перечисленными, соляную, бромоводородную, серную, азотную, хлорную, фумаровую, малеиновую, фосфорную, гликолевую, молочную, салициловую, янтарную, толуол-п-сульфоновую, винную, уксусную, лимонную, метансульфоновую, этансульфоновую, муравьиную, бензойную, малоновую, нафталин-2-сульфоновую, бензолсульфоновую кислоту и т.п. Другие кислоты, такие как щавелевая кислота, которые сами по себе и не являются фармацевтически приемлемыми, могут использоваться при получении солей, подходящих в качестве промежуточных соединений при получении соединений согласно изобретению и их фармацевтически приемлемых солей присоединения кислот.
[0078] Примеры оснований включают, без ограничения перечисленными, гидроксиды щелочных металлов (например, натрия), гидроксиды щелочноземельных металлов (например, магния), аммиак и соединения формулы NW4+, где W является C1–4 алкилом, и т.п.
[0079] Примеры солей включают, без ограничения перечисленными: ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидроиодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат, ундеканоат и т.п. Другие примеры солей включают анионы соединений согласно настоящему изобретению в сочетании с подходящим катионом, таким как Na+, NH4+ и NW4+ (где W является C1–4 алкильной группой), и т.п.
[0080] Для терапевтического применения соли соединений настоящего изобретения считаются фармацевтически приемлемыми. Однако соли кислот и оснований, которые не являются фармацевтически приемлемыми, также могут находить применение, например, при получении или очистке фармацевтически приемлемого соединения.
[0081] По всему тексту описания, где композиции описаны как содержащие или включающие определенные компоненты, или где процессы и способы описаны как содержащие или включающие конкретные этапы, предполагается, что помимо этого существуют композиции настоящего изобретения, которые состоят по существу из или состоят из перечисленных компонентов, и что существуют процессы и способы согласно настоящему изобретению, которые состоят по существу или состоят из перечисленных технологических этапов.
[0082] Как правило, в композициях, для которых указан процент, такой процент является весовым, если не указано иное. Кроме того, если переменная не сопровождается определением, то предыдущее определение переменной имеет преимущественную силу.
I. БЕЛКИ
[0083] В изобретении предложены мультиспецифичные связывающие белки, которые связывают CD33 на раковой клетке и рецептор NKG2D и рецептор CD16 на NK-клетках, вызывая активацию NK-клетки. Мультиспецифичные связывающие белки могут применяться в фармацевтических композициях и терапевтических способах, описанных в настоящем документе. Связывание мультиспецифичного связывающего белка с рецептором NKG2D и рецептором CD16 на NK-клетке увеличивает активность NK-клетки в направлении разрушения раковой клетки. Связывание мультиспецифичного связывающего белка с CD33 на раковой клетке приводит раковую клетку в непосредственную близость к NK-клетке, что облегчает прямое и непрямое разрушение раковой клетки NK-клеткой. Дополнительное описание иллюстративных мультиспецифичных связывающих белков предоставлено ниже.
[0084] Первый компонент мультиспецифичных связывающих белков связывается с клетками, экспрессирующими NKG2D рецептор, которые могут включать, без ограничения перечисленными, NK-клетки, γδ T-клетки и CD8+ αβ T-клетки. При связывании NKG2D мультиспецифичные связывающие белки могут блокировать связывание естественных лигандов, таких как ULBP6 и MICA, с NKG2D и активацию рецепторов NKG2D.
[0085] Второй компонент мультиспецифичных связывающих белков связывается с CD33-экспрессирующими клетками, которые могут включать, без ограничения перечисленными ОМЛ, миелодиспластические синдромы, хронический миеломоноцитарный лейкоз, миелоидный бластный криз при хроническом миелоидном лейкозе и различные формы ОЛЛ.
[0086] Третий компонент мультиспецифичных связывающих белков связывается с клетками, экспрессирующими CD16, Fc-рецептор на поверхности лейкоцитов, включающих натуральные киллеры, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, тучные клетки и фолликулярные дендритные клетки.
[0087] Мультиспецифичные связывающие белки, описанные в настоящем документе, могут иметь различные форматы. Например, одним из форматов является гетеродимерное, мультиспецифичное антитело, включающее первую тяжелую цепь иммуноглобулина, первую легкую цепь иммуноглобулина, вторую тяжелую цепь иммуноглобулина и вторую легкую цепь иммуноглобулина (ФИГ. 1). Первая тяжелая цепь иммуноглобулина включает первый Fc-домен (шарнир-CH2-CH3), первый вариабельный домен тяжелой цепи и, необязательно, первый CH1-домен тяжелой цепи. Первая легкая цепь иммуноглобулина включает первый вариабельный домен легкой цепи и первый константный домен легкой цепи. Первая легкая цепь иммуноглобулина вместе с первой тяжелой цепью иммуноглобулина формирует антигенсвязывающий участок, который связывает NKG2D. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина включает второй Fc-домен (шарнир-CH2-CH3), второй вариабельный домен тяжелой цепи и, необязательно, второй CH1-домен тяжелой цепи. Вторая легкая цепь иммуноглобулина включает второй вариабельный домен легкой цепи и второй константный домен легкой цепи. Вторая легкая цепь иммуноглобулина вместе со второй тяжелой цепью иммуноглобулина формирует антигенсвязывающий участок, который связывает CD33. Первый Fc-домен и второй Fc-домен вместе способны связываться с CD16 (ФИГ. 1). В некоторых вариантах осуществления первая легкая цепь иммуноглобулина может быть идентична второй легкой цепи иммуноглобулина.
[0088] Другой иллюстративный формат включает гетеродимерное, мультиспецифичное антитело, включающее первую тяжелую цепь иммуноглобулина, вторую тяжелую цепь иммуноглобулина и легкую цепь иммуноглобулина (ФИГ. 2). Первая тяжелая цепь иммуноглобулина включает первый Fc-домен (шарнир-CH2-CH3), слитый либо через линкер, либо через шарнирную область антитела с одноцепочечным вариабельным фрагментом (scFv), состоящим из вариабельного домена тяжелой и вариабельного домена легкой цепи, который спаривается и связывает NKG2D или CD33. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина включает второй Fc-домен (шарнир-CH2-CH3), второй вариабельный домен тяжелой цепи и, необязательно, CH1-домен тяжелой цепи. Легкая цепь иммуноглобулина включает вариабельный домен легкой цепи и константный домен легкой цепи. Вторая тяжелая цепь иммуноглобулина спаривается с легкой цепью иммуноглобулина и связывается с NKG2D или CD33. Первый Fc-домен и второй Fc-домен вместе способны связываться с CD16 (ФИГ. 2).
[0089] Один или более дополнительных связывающих мотивов могут быть слиты с C-концом CH3-домена константной области, необязательно через линкерную последовательность. В некоторых вариантах осуществления антигенсвязывающий участок может быть одноцепочечной или стабилизированной дисульфидной связью вариабельной областью (scFv) или может образовывать тетравалентную или трехвалентную молекулу.
[0090] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок находится в форме Triomab, которое представляет собой трифункциональное, биспецифичное антитело, которое сохраняет IgG-подобную форму. Эта химера состоит из двух полуантител, каждое из которых содержит одну легкую и одну тяжелую цепь, которые получены из двух исходных антител.
[0091] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок имеет форму KiH одинаковой легкой цепи (LC), которая включает технологию выступы во впадины (KIH). KIH включает конструирование CH3 доменов с созданием "выступа" или "впадины" в каждой тяжелой цепи, что способствует гетеродимеризации. Концепция технологии Fc с "выступами во впадины (KiH)" заключалась во введении "выступа" в один CH3 домен (CH3A) путем замены небольшого остатка крупным (например, T366WCH3A согласно нумерации EU). Для помещения "выступа" в другом CH3 домене (CH3B) была создана комплементарная поверхность "впадины" путем замены ближайших к выступу, соседних остатков более мелкими (например, T366S/L368A/Y407VCH3B). Мутация, приводящая к появлению "впадины", была оптимизирована с помощью структурного скрининга фаговой библиотеки (Atwell S, Ridgway JB, Wells JA, Carter P., Stable heterodimers from remodeling the domain interface of a homodimer using a phage display library, J. Mol. Biol. (1997) 270(1):26-35). Рентгеновские кристаллические структуры KiH вариантов Fc (Elliott JM, Ultsch M, Lee J, Tong R, Takeda K, Spiess C, et al., Antiparallel conformation of knob and hole aglycosylated half-antibody homodimers is mediated by a CH2-CH3 hydrophobic interaction. J. Mol. Biol. (2014) 426(9):1947-57; Mimoto F, Kadono S, Katada H, Igawa T, Kamikawa T, Hattori K. Crystal structure of a novel asymmetrically engineered Fc variant with improved affinity for FcgammaRs. Mol. Immunol. (2014) 58(1):132-8) продемонстрировали, что гетеродимеризации термодинамически способствуют гидрофобные взаимодействия, обусловленные стерической комплементарностью в центральной области контакта между CH3 доменами, тогда как области контакта выступ-выступ и впадина-впадина не способствуют гомодимеризации из-за стерических препятствий и блокирования требуемых взаимодействий, соответственно.
[0092] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок имеет форму иммуноглобулина с двойным вариабельным доменом (DVD-Ig™), в которой мишеньсвязывающие домены двух моноклональных антител объединены через гибкие природные линкеры с получением тетравалентной IgG-подобной молекулы.
[0093] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок имеет форму Ортогонального Fab интерфейса (Ortho-Fab). В методе Ortho-Fab IgG (Lewis SM, Wu X, Pustilnik A, Sereno A, Huang F, Rick HL, et al., Generation of bispecific IgG antibodies by structure-based design of an orthogonal Fab interface. Nat. Biotechnol. (2014) 32(2):191-8), с помощью основанной на структуре инженерии областей вводят дополнительные мутации в LC и интерфейс HCVH-CH1 только в одном Fab без введения каких-либо изменений в другой Fab.
[0094] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок имеет формат Ig 2 в 1. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок имеет форму ES, которая является гетеродимерной конструкцией, содержащей два разных Fab, связывающихся с мишенью 1 и мишенью 2, слитых с Fc. Гетеродимеризация обеспечена электростатическими направляющими мутациями в Fc. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок находится в форме κλ-Body, которая является гетеродимерной конструкцией с двумя разными Fab, слитыми с Fc, стабилизированным гетеродимеризационными мутациями: Fab1, направленный против антигена 1, содержит LC каппа, тогда как второй Fab, направленный против антигена 2, содержит LC лямбда. ФИГ. 30A является иллюстративной схемой одной формы κλ-Body; ФИГ. 30B является иллюстративной схемой еще одного κλ-Body.
[0095] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок находится в форме Обмена плечами Fab (антитела, которые обмениваются плечами Fab путем замены тяжелой цепи и присоединенной легкой цепи (полумолекулы) парой тяжелой легкой цепи из другой молекулы, что приводит к получению биспецифичных антител). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок находится в форме SEED Body. Платформа сконструированных доменов с заменой цепей (SEED) была разработана для получения асимметричных и биспецифичных антителоподобных молекул, свойства которых расширяют терапевтические применения природных антител. Эта платформа белковой инженерии основана на обмене структурно родственных последовательностей иммуноглобулина в рамках консервативных CH3 доменов. Дизайн SEED позволяет эффективно создавать гетеродимеры AG/GA, одновременно исключая гомодимеризацию AG и GA SEED CH3 доменов (Muda M. et al., Protein Eng. Des. Sel. (2011, 24(5):447-54)). В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок находится в форме LuZ-Y, в которой лейциновая молния используется для индукции гетеродимеризации двух разных HC (Wranik, BJ. et al., J. Biol. Chem. (2012), 287:43331-9).
[0096] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок находится в форме Cov-X-Body. В биспецифичных CovX-телах два различных пептида объединены с использованием разветвленного азетидинонового линкера и слиты с каркасным антителом при мягких условиях сайт-специфическим образом. С учетом того, что фармакофоры отвечают за функциональные активности, иммуноглобулиновый каркас придает длительный полупериод существования и Ig-подобное распределение. Фармакофоры могут быть химически оптимизированы или заменены другими фармакофорами с получением оптимизированных или уникальных биспецифичных антител (Doppalapudi VR et al., PNAS (2010), 107(52);22611-22616).
[0097] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок находится в гетеродимерной форме Oasc-Fab, которая включает Fab, связывающийся с мишенью 1, и scFab, связывающийся с мишенью 2, слитые с Fc. Гетеродимеризацию обеспечивают мутации в Fc.
[0098] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок имеет форму DuetMab, которая является гетеродимерной конструкцией, содержащей два разных Fab, связывающихся с антигенами 1 и 2, и Fc, стабилизированный гетеродимеризационными мутациями. Fab 1 и 2 содержат разные S-S мостики, которые гарантируют правильное соединение LC и HC.
[0099] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок находится в форме CrossmAb, которая является гетеродимерной конструкцией с двумя разными Fab, связывающимися с мишенями 1 и 2, слитыми с Fc, стабилизированным гетеродимеризацией. Домены CL и CH1 и домены VH и VL переставлены, например, CH1 слит последовательно с VL, тогда как CL слит последовательно с VH.
[00100] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичный связывающий белок находится в форме Fit-Ig, которая является гомодимерной конструкцией, в которой Fab, связывающийся с антигеном 2, слит с N-концом HC Fab, который связывается с антигеном 1. Конструкция содержит Fc дикого типа.
[00101] В Таблице 1 перечислены пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с NKG2D. NKG2D-связывающие домены могут обладать различной аффинностью связывания к NKG2D, тем не менее, они все активируют человеческий NKG2D и NK-клетки.
(SEQ ID NO:1)
CDR1 (SEQ ID NO:54) - GSFSGYYWS
CDR2 (SEQ ID NO:55) -
EIDHSGSTNYNPSLKS
CDR3 (SEQ ID NO:56) -
ARARGPWSFDP
(SEQ ID NO:2)
(SEQ ID NO:3)
(SEQ ID NO:4)
(A40)
(SEQ ID NO:5)
(SEQ ID NO:6)
(SEQ ID NO:7)
(SEQ ID NO:8)
(SEQ ID NO:9)
(SEQ ID NO:10)
(SEQ ID NO:11)
(SEQ ID NO:12)
(C26)
(SEQ ID NO:13)
(SEQ ID NO:14)
(SEQ ID NO:15)
(SEQ ID NO:16)
(SEQ ID NO:17)
(SEQ ID NO:18)
(SEQ ID NO:19)
(SEQ ID NO:20)
(SEQ ID NO:21)
(SEQ ID NO:22)
(SEQ ID NO:23)
(SEQ ID NO:24)
(SEQ ID NO:25)
(SEQ ID NO:26)
(SEQ ID NO:27)
(SEQ ID NO:28)
(SEQ ID NO:29)
(SEQ ID NO:30)
(SEQ ID NO:31)
(SEQ ID NO:32)
(SEQ ID NO:33)
(SEQ ID NO:34)
(SEQ ID NO:35)
(SEQ ID NO:36)
(SEQ ID NO:37)
(SEQ ID NO:38)
(F47)
(SEQ ID NO:39)
(SEQ ID NO:40)
(SEQ ID NO:41)
CDR1 (SEQ ID NO:57) -
GTFSSYAIS
CDR2 (SEQ ID NO:58) -
GIIPIFGTANYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:59) -
ARGDSSIRHAYYYYGMDV
(SEQ ID NO:42)
CDR1 (SEQ ID NO:60) -
KSSQSVLYSSNNKNYLA
CDR2 (SEQ ID NO:61) -
WASTRES
CDR3 (SEQ ID NO:62) -
QQYYSTPIT
(F43)
(SEQ ID NO:43)
CDR1 (SEQ ID NO:63) -
GSISSSSYYWG
CDR2 (SEQ ID NO:64) -
SIYYSGSTYYNPSLKS
CDR3 (SEQ ID NO:65) -
ARGSDRFHPYFDY
(SEQ ID NO:44)
CDR1 (SEQ ID NO:66) -
RASQSVSRYLA
CDR2 (SEQ ID NO:67) -
DASNRAT
CDR3 (SEQ ID NO:68) -
QQFDTWPPT
(F04)
(SEQ ID NO:45)
(SEQ ID NO:46)
(SEQ ID NO:47)
(SEQ ID NO:48)
(A44)
(SEQ ID NO:69)
CDR1 (SEQ ID NO:71) - FTFSSYAMS
CDR2 (SEQ ID NO:72) - AISGSGGSTYYADSVKG
CDR3 (SEQ ID NO:73) - AKDGGYYDSGAGDY
(SEQ ID NO:70)
CDR1 (SEQ ID NO:74) - RASQGIDSWLA
CDR2 (SEQ ID NO:75) - AASSLQS
CDR3 (SEQ ID NO:76) - QQGVSYPRT
(A49)
(SEQ ID NO:77)
CDR1 (SEQ ID NO:79) - FTFSSYSMN
CDR2 (SEQ ID NO:80) - SISSSSSYIYYADSVKG
CDR3 (SEQ ID NO:81) - ARGAPMGAAAGWFDP
(SEQ ID NO:78)
CDR1 (SEQ ID NO:82) - RASQGISSWLA
CDR2 (SEQ ID NO:83) - AASSLQS
CDR3 (SEQ ID NO:84) - QQGVSFPRT
(F63)
(SEQ ID NO:85)
CDR1 (SEQ ID NO:87) - YTFTGYYMH
CDR2 (SEQ ID NO:88) - WINPNSGGTNYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:89) - ARDTGEYYDTDDHGMDV
(SEQ ID NO:86)
CDR1 (SEQ ID NO:90) - RASQSVSSNLA
CDR2 (SEQ ID NO:91) - GASTRAT
CDR3 (SEQ ID NO:92) - QQDDYWPPT
(E79)
(SEQ ID NO:133)
CDR1 (SEQ ID NO:135) - YTFTSYYMH
CDR2 (SEQ ID NO:136) - IINPSGGSTSYAQKFQG
CDR3 (SEQ ID NO:137) - ARGAPNYGDTTHDYYYMDV
(SEQ ID NO:134)
CDR1 (SEQ ID NO:138) - RASQSVSSNLA
CDR2 (SEQ ID NO:139) - GASTRAT
CDR3 (SEQ ID NO:140) - QQYDDWPFT
[00102] В альтернативе вариабельный домен тяжелой цепи, определенный SEQ ID NO:49, может быть соединен с вариабельным доменом легкой цепи, определенным SEQ ID NO:50, с получением антигенсвязывающего участка, который может связываться с NKG2D, как показано в US 9,273,136.
QVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAFIRYDGSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDRGLGDGTYFDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:49)
QSALTQPASVSGSPGQSITISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGKAPKLLIYYDDLLPSGVSDRFSGSKSGTSAFLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGPVFGGGTKLTVL (SEQ ID NO:50)
[00103] В альтернативе вариабельный домен тяжелой цепи, определенный SEQ ID NO:51, может быть спарен с вариабельным доменом легкой цепи, определенным SEQ ID NO:52, с получением антигенсвязывающего участка, который может связываться с NKG2D, как показано в US 7,879,985.
QVHLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSDDSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGHISYSGSANYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCANWDDAFNIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO:51)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSSPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO:52)
[00104] В Таблице 2 перечислены пептидные последовательности вариабельных доменов тяжелой цепи и вариабельных доменов легкой цепи, которые в комбинации могут связываться с CD33.
(SEQ ID NO:93)
CDR1 (SEQ ID NO:95) - GYTFTDY
CDR2 (SEQ ID NO:96) - YIYPYNGGTG
CDR3 (SEQ ID NO:97) - GRPAMDY
(SEQ ID NO:94)
CDR1(SEQ ID NO:98) - ESVDNYGISFMN
CDR2 (SEQ ID NO:99) - AASNQGS
CDR3 (SEQ ID NO:100) - QQSKEVPWT
(SEQ ID NO:101)
CDR1 (SEQ ID NO:103) - GYTITDS
CDR2 (SEQ ID NO:104) - YIYPYNGGTD
CDR3 (SEQ ID NO:105) - GNPWLAY
(SEQ ID NO:102)
CDR1 (SEQ ID NO:106) - ESLDNYGIRFLT
CDR2 (SEQ ID NO:107) - AASNQGS
CDR3 (SEQ ID NO:108) - QQTKEVPWS
(SEQ ID NO:109)
CDR1 (SEQ ID NO:111) - GYTFTSY
CDR2 (SEQ ID NO:112) - YPGNDD
CDR3 (SEQ ID NO:113) - EVRLRYFDV
(SEQ ID NO:110)
CDR1 (SEQ ID NO:114) - QSVFFSSSQKNYLA
CDR2 (SEQ ID NO:115) - WASTRES
CDR3 (SEQ ID NO:116) - HQYLSSRT
(SEQ ID NO:117)
CDR1 (SEQ ID NO:119): GYTFTNY
CDR2 (SEQ ID NO:120): YPGDGS
CDR3 (SEQ ID NO:121): GYEDAMDY
(SEQ ID NO:118)
CDR1 (SEQ ID NO:122): QDINSYLS
CDR2 (SEQ ID NO:123): RANRLVD
CDR3 (SEQ ID NO:124): LQYDEFPLT
[00105] В альтернативе новые антигенсвязывающие участки, которые могут связываться с CD33, могут быть идентифицированы при скрининге на связывание с аминокислотной последовательностью, определенной SEQ ID NO:53.
SEQ ID NO:53
MPLLLLLPLLWAGALAMDPNFWLQVQESVTVQEGLCVLVPCTFFHPIPYYDKNSPVHGYWFREGAIISRDSPVATNKLDQEVQEETQGRFRLLGDPSRNNCSLSIVDARRRDNGSYFFRMERGSTKYSYKSPQLSVHVTDLTHRPKILIPGTLEPGHSKNLTCSVSWACEQGTPPIFSWLSAAPTSLGPRTTHSSVLIITPRPQDHGTNLTCQVKFAGAGVTTERTIQLNVTYVPQNPTTGIFPGDGSGKQETRAGVVHGAIGGAGVTALLALCLCLIFFIVKTHRRKAARTAVGRNDTHPTTGSASPKHQKKSKLHGPTETSSCSGAAPTVEMDEELHYASLNFHGMNPSKDTSTEYSEVRTQ
[00106] В Fc-домене связывание CD16 опосредовано шарнирной областью и CH2 доменом. Например, в IgG1 человека взаимодействие с CD16, прежде всего, направлено на аминокислотные остатки Asp 265 - Glu 269, Asn 297 - Thr 299, Ala 327 - Ile 332, Leu 234 - Ser 239 и углеводный остаток N-ацетил-D-глюкозамина в CH2 домене (см., Sondermann et al., Nature, 406 (6793):267-273). На основе известных доменов могут быть подобраны мутации, увеличивающие или уменьшающие аффинность связывания с CD16, например, при использовании библиотек фагового дисплея или библиотек дисплея кДНК на поверхности дрожжей, или они могут быть разработаны на основе известной трехмерной структуры взаимодействия.
[00107] Сборка тяжелых цепей гетеродимерных антител может быть осуществлена при экспрессии двух последовательностей тяжелых цепей разных антител в одной клетке, что может приводить к сборке гомодимеров каждой тяжелой цепи антитела, а также сборке гетеродимеров. Обеспечение преимущественной сборки гетеродимеров может быть достигнуто при введении различных мутаций в CH3 домен каждой константной области тяжелой цепи антитела, как показано в US13/494870, US16/028850, US11/533709, US12/875015, US13/289934, US14/773418, US12/811207, US13/866756, US14/647480 и US14/830336. Например, мутации могут быть введены в CH3 домен на основе IgG1 человека и включают различные пары аминокислотных замен в первом полипептиде и втором полипептиде, которые позволяют этим двум цепям селективно гетеродимеризоваться друг с другом. Положения аминокислотных замен, представленных ниже, пронумерованы в соответствии с EU индексом, как описано в публикации Кэбата.
[00108] В одной ситуации аминокислотная замена в первом полипептиде состоит в замене исходной аминокислоты более крупной аминокислотой, выбранной из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) или триптофана (W), и по меньшей мере одна аминокислотная замена во втором полипептиде состоит в замене исходной аминокислоты (аминокислот) менее крупной аминокислотой(ами), выбранной из аланина (A), серина (S), треонина (T) или валина (V), при этом более крупная аминокислотная замена (выступ) помещается в поверхность менее крупной аминокислотной замены (впадину). Например, один полипептид может включать замену T366W, а другой может включать три замены, включающих T366S, L368A и Y407V.
[00109] Вариабельный домен тяжелой цепи антитела согласно изобретению необязательно может быть соединен с аминокислотной последовательностью, которая по меньшей мере на 90% идентична константной области антитела, такой как константная область IgG, включающая шарнир, CH2 и CH3 домены, с доменом CH1 или без него. В некоторых вариантах осуществления аминокислотная последовательность константной области по меньшей мере на 90% идентична константной области человеческого антитела, такой как константная область IgG1 человека, константная область IgG2 человека, константная область IgG3 человека или константная область IgG4 человека. В некоторых других вариантах осуществления аминокислотная последовательность константной области по меньшей мере на 90% идентична константной области антитела другого млекопитающего, такого как кролик, собака, кошка, мышь или лошадь. Одна или более мутаций могут быть введены в константную область в сравнении с константной областью IgG1 человека, например, Q347, Y349, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 и/или K439. Примерные замены включают, например, Q347E, Q347R, Y349S, Y349K, Y349T, Y349D, Y349E, Y349C, T350V, L351K, L351D, L351Y, S354C, E356K, E357Q, E357L, E357W, K360E, K360W, Q362E, S364K, S364E, S364H, S364D, T366V, T366I, T366L, T366M, T366K, T366W, T366S, L368E, L368A, L368D, K370S, N390D, N390E, K392L, K392M, K392V, K392F, K392D, K392E, T394F, T394W, D399R, D399K, D399V, S400K, S400R, D401K, F405A, F405T, Y407A, Y407I , Y407V, K409F, K409W, K409D, T411D, T411E, K439D и K439E.
[00110] В некоторых вариантах осуществления мутации, которые могут быть введены в CH1 константной области IgG1 человека, могут быть сделаны по аминокислотам V125, F126, P127, T135, T139, A140, F170, P171 и/или V173. В некоторых вариантах осуществления мутации, которые могут быть введены в Cκ константной области IgG1 человека, могут быть сделаны по аминокислотам E123, F116, S176, V163, S174 и/или T164.
[00111] Аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих наборов замен, показанных в Таблице 3.
[00112] В альтернативе аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих наборов замен, показанных в Таблице 4.
[00113] В альтернативе аминокислотные замены могут быть выбраны из следующих наборов замен, показанных в Таблице 5.
[00114] В альтернативе по меньшей мере одна аминокислотная замена в каждой полипептидной цепи может быть выбрана из Таблицы 6.
[00115] В альтернативе по меньшей мере одна аминокислотная замена может быть выбрана из следующего набора замен в Таблице 7, где положение(я), указанное в столбце Первый полипептид, заменено любой известной отрицательно заряженной аминокислотой, и положение(я), указанное в столбце Второй полипептид, заменено любой известной положительно заряженной аминокислотой.
[00116] В альтернативе по меньшей мере одна аминокислотная замена может быть выбрана из следующего набора в Таблице 8, где положение(я), указанное в столбце Первый полипептид, заменено любой известной положительно заряженной аминокислотой, и положение(я), указанное в столбце Второй полипептид, заменено любой известной отрицательно заряженной аминокислотой.
[00117] В альтернативе аминокислотные замены могут быть выбраны из следующего набора в Таблице 9.
[00118] В альтернативе или дополнительно, структурная стабильность гетеромультимерного белка может быть повышена при введении S354C либо в первую, либо во вторую полипептидную цепь и Y349C в противостоящую полипептидную цепь, которая формирует искусственную дисульфидную связь в области контакта этих двух полипептидов.
[00119] Мультиспецифичные белки, описанные выше, могут быть получены при использовании технологии рекомбинантных ДНК, известной специалисту в данной области. Например, первая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая первую тяжелую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована в первый вектор экспрессии; вторая последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая вторую тяжелую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована во второй вектор экспрессии; третья последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая легкую цепь иммуноглобулина, может быть клонирована в третий вектор экспрессии; первый, второй и третий векторы экспрессии можно стабильно трансфицировать вместе в клетки-хозяева с получением мультимерных белков.
[00120] Для получения наибольшего выхода мультиспецифического белка можно изучить различные соотношения первого, второго и третьего векторов экспрессии, чтобы определить оптимальное соотношение для трансфекции в клетки-хозяева. После трансфекции отдельные клоны можно выделить для получения банка клеток с использованием методов, известных в данной области, таких как серийное разведение, ИФА, FACS, микроскопия или Clonepix.
[00121] Клоны можно культивировать в условиях, подходящих для масштабирования в биореакторе и поддержания экспрессии мультиспецифичного белка. Мультиспецифичные белки могут быть выделены и очищены с помощью способов, известных в данной области, включающих центрифугирование, глубинную фильтрацию, лизис клеток, гомогенизацию, замораживание-оттаивание, аффинную очистку, гель-фильтрацию, ионообменную хроматографию, обменную хроматографию гидрофобного взаимодействия и хроматографию смешанного режима.
II. Характеристики мультиспецифичных белков
[00122] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичные белки, описанные в настоящем документе, которые включают NKG2D-связывающий домен и связывающий домен к CD33, связываются с клетками, экспрессирующими NKG2D человека. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичные белки связываются с опухолеассоциированным антигеном CD33 на уровне, сопоставимом с моноклональным антителом, имеющим такой же CD33-связывающий домен. Однако мультиспецифичные белки, описанные в настоящем документе, могут быть более эффективными в уменьшении роста опухоли и уничтожении раковых клеток, экспрессирующих CD33, чем соответствующие моноклональные антитела к CD33.
[00123] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичные белки, описанные в настоящем документе, которые включают NKG2D-связывающий домен и связывающий домен к CD33, могут активировать первичные человеческие NK-клетки при культивировании с опухолевыми клетками, экспрессирующими антиген CD33. Активация NK-клеток характеризуется увеличением CD107a дегрануляции и продукции цитокина IFNγ. Кроме того, по сравнению с моноклональным антителом, которое включает такой же CD33-связывающий домен, мультиспецифичные белки показывают превосходную активацию человеческих NK-клеток в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих антиген CD33.
[00124] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичные белки, описанные в настоящем документе, которые включают NKG2D-связывающий домен и связывающий домен к CD33, могут увеличивать активность покоящихся и IL-2-активированных человеческих NK-клеток в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих антиген CD33.
[00125] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичные белки, описанные в настоящем документе, которые включают NKG2D-связывающий домен и связывающий домен к опухолеассоциированному антигену CD33, могут увеличивать цитотоксическую активность покоящихся и IL-2-активированных человеческих NK-клеток в присутствии опухолевых клеток, экспрессирующих антиген CD33. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с соответствующими моноклональными антителами, мультиспецифичные белки могут обеспечивать преимущество против опухолевых клеток, экспрессирующих CD33 на среднем и низком уровне.
[00126] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичные белки, описанные в настоящем документе, могут быть полезными при лечении злокачественных опухолей с высокой экспрессией Fc-рецептора (FcR) или злокачественных опухолей, находящихся в микроокружении опухоли с высоким уровнем FcR, по сравнению с соответствующими моноклональными антителами к CD33. Моноклональные антитела оказывают свое действие на рост опухоли посредством множества механизмов, включающих, помимо прочего, ADCC, CDC, фагоцитоз и блокаду сигналов. Среди различных FcγR рецепторов, CD16 обладает наиболее низкой аффинностью к Fc IgG; FcγRI (CD64) является высокоаффинным FcR, который примерно в 1000 раз сильнее связывается с Fc IgG, чем CD16. CD64 обычно экспрессируется на многих гемопоэтических линиях, таких как миелоидная линия, и может экспрессироваться на опухолях, происходящих из этих типов клеток, таких как острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Иммунные клетки, инфильтрирующие опухоль, такие как MDSC и моноциты, также экспрессируют CD64 и, как известно, инфильтрируют микроокружение опухоли. Экспрессия CD64 опухолью или в микроокружении опухоли может оказывать отрицательное влияние на терапию моноклональными антителами. Экспрессия CD64 в микроокружении опухоли затрудняет взаимодействие этих антител с CD16 на поверхности NK-клеток, поскольку антитела предпочитают связывать рецептор с высокой аффинностью. Мультиспецифичные белки при воздействии на два активирующих рецептора на поверхности NK-клеток могут преодолевать отрицательное влияние экспрессии CD64 (либо на опухоли, либо в микроокружении опухоли) на терапию моноклональными антителами. Независимо от экспрессии CD64 на опухолевых клетках мультиспецифичные белки способны опосредовать ответы человеческих NK-клеток против всех опухолевых клеток, поскольку двойное взаимодействие с двумя активирующими рецепторами на NK-клетках обеспечивает более сильное специфичное связывание с NK-клетками.
[00127] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичные белки, описанные в настоящем документе, могут обеспечивать лучший профиль безопасности за счет уменьшения целевых внеопухолевых побочных эффектов. Естественные клетки-киллеры и CD8 T-клетки способны непосредственно лизировать опухолевые клетки, хотя механизмы, посредством которых NK-клетки и CD8 T-клетки распознают нормальные аутологичные клетки, отличая их от опухолевых клеток, различаются. Активность NK-клеток регулируется балансом сигналов от активирующих (NCR, NKG2D, CD16 и т.д.) и ингибирующих (KIR, NKG2A и т.д.) рецепторов. Баланс этих активирующих и ингибирующих сигналов позволяет NK-клеткам отличать здоровые аутологичные клетки от стрессовых, инфицированных вирусами или переродившихся аутологичных клеток. Этот "встроенный" механизм аутотолерантности позволяет защитить нормальную здоровую ткань от ответов NK-клеток. Чтобы расширить этот принцип, аутотолерантность NK-клеток позволит конструкциям TriNKET адресно взаимодействовать с антигенами, экспрессируемыми как на аутологичных клетках, так и на опухолях, без внеопухолевых побочных эффектов или с расширенным терапевтическим окном. В отличие от естественных киллеров, T-клетки требуют распознавания специфического пептида, презентируемого молекулами МНС, для активации и эффекторных функций. T-клетки были главной целью иммунотерапии, при этом было разработано множество стратегий для перенаправления T-клеточных ответов против опухоли. Биспецифичные T-клетки, ингибиторы контрольных точек и CAR-T-клетки были одобрены FDA, однако часто они имеют недостатки, связанные с дозолимитирующим токсическим действием. Биспецифичные T-клетки и CAR-T-клетки действуют в рамках системы распознавания TCR-MHC, используя связывающие домены для направленного взаимодействия с антигенами на поверхности опухолевых клеток и используя модифицированные сигнальные домены для передачи сигналов активации в эффекторную клетку. Несмотря на то, что эти методы лечения эффективны для индукции противоопухолевого иммунного ответа, они часто сопровождаются синдромом высвобождения цитокинов (CRS) и внеопухолевыми побочными эффектами. Мультиспецифичные белки уникальны тем, что они не будут "блокировать" природные системы активации и ингибирования NK-клеток. Напротив, мультиспецифичные белки предназначены для поддержания баланса и обеспечения дополнительных сигналов активации для NK-клеток, сохраняя при этом толерантность NK-клеток к здоровым аутологичным клеткам.
[00128] В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичные белки, описанные в настоящем документе, могут задерживать развитие опухоли более эффективно, чем соответствующие моноклональные антитела к CD33, которые включают такой же CD33-связывающий домен. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифичные белки, описанные в настоящем документе, могут быть более эффективными против метастазов, чем соответствующие моноклональные антитела к CD33, которые включают такой же CD33-связывающий домен.
III. ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ ПРИМЕНЕНИЯ
[00129] В изобретении предложены способы лечения рака с применением мультиспецифичного связывающего белка, описанного в настоящем документе, и/или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе. Способы могут применяться для лечения различных форм рака, которые экспрессируют CD33, путем введения нуждающемуся в этом пациенту терапевтически эффективного количества мультиспецифичного связывающего белка, описанного в настоящем документе.
[00130] Терапевтический способ может быть охарактеризован в зависимости от рака, подлежащего лечению. Например, в некоторых вариантах осуществления рак представляет собой ОМЛ, миелодиспластические синдромы, хронический миеломоноцитарный лейкоз, миелоидный бластный криз при хроническом миелоидном лейкозе и различные формы ОЛЛ.
[00131] В некоторых других вариантах осуществления рак представляет собой рак головного мозга, рак молочной железы, рак шейки матки, рак толстой кишки, рак толстой и прямой кишки, рак эндометрия, рак пищевода, лейкоз, рак легкого, рак печени, меланому, рак яичника, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки, рак почки, рак желудка, рак яичка или рак матки. В других вариантах осуществления рак представляет собой плоскоклеточную карциному, аденокарциному, мелкоклеточную карциному, меланому, нейробластому, саркому (например, ангиосаркому или хондросаркому), рак гортани, рак околоушной железы, рак желчных протоков, рак щитовидной железы, акральную лентигинозную меланому, актинический кератоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, аденокистозную карциному, аденомы, аденосаркому, аденосквамозную карциному, рак анального канала, астроцитарную опухоль, карциному бартолиновой железы, базальноклеточную карциному, рак желчных путей, рак кости, рак костного мозга, рак бронхов, карциному бронхиальной железы, карциноид, холангиокарциному, хондосаркому, папиллому/карциному хориоидного сплетения, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, светлоклеточную карциному, рак из соединительной ткани, цистаденому, рак пищеварительной системы, рак двенадцатиперстной кишки, рак эндокринной системы, опухоль эндодермального синуса, гиперплазию эндометрия, стромальную саркому эндометрия, эндометриоидную аденокарциному, рак из эндотелиальных клеток, эпендимальный рак, эпителиоцитарный рак, саркому Юинга, рак глаза, рак половых органов у женщин, фокальную нодулярную гиперплазию, рак желчного пузыря, рак антрального отдела желудка, рак дна желудка, гастриному, глиобластому, глюкагоному, рак сердца, гемангибластому, гемангиоэндотелиому, гемангиомы, аденому печени, аденоматоз печени, гепатобилиарный рак, гепатоцеллюлярный рак, болезнь Ходжкина, рак подвздошной кишки, инсулиному, внутриэпителиальную неоплазию, межэпителиальную плоскоклеточную неоплазию, внутрипеченочный рак желчных протоков, инвазивный плоскоклеточный рак, рак тощей кишки, рак сустава, саркому Капоши, рак почечной лоханки, крупноклеточную карциному, рак толстой кишки, лейомиосаркому, меланома типа злокачественного лентиго, лимфому, рак половых органов у мужчин, злокачественную меланому, злокачественные мезотелиальные опухоли, медуллобластому, медуллоэпителиому, менингеальный рак, мезотелиальный рак, метастатическую карциному, рак полости рта, мукоэпидермоидную карциному, множественную миелому, рак мышц, рак носового канала, рак нервной системы, нейроэпителиальную аденокарциному, нодулярную меланому, неэпителиальный рак кожи, неходжкинскую лимфому, овсяно-клеточную карциному, олигодендроглиальный рак, рак ротовой полости, остеосаркому, папиллярную серозную аденокарциному, рак полового члена, рак глотки, опухоли гипофиза, плазмоцитому, псевдосаркому, бластому легкого, рак прямой кишки, почечно-клеточный рак, рак дыхательной системы, ретинобластому, рабдомиосаркому, саркому, серозную карциному, рак пазух, рак кожи, рак кожи, мелкоклеточную карциному, рак тонкой кишки, рак гладких мышц, рак мягких тканей, соматостатин-секретирующую опухоль, рак позвоночника, плоскоклеточную карциному, рак поперечно-полосатых мышц, субмезотелиальный рак, поверхностную распространяющуюся меланому, T-клеточный лейкоз, рак языка, недифференцированную карциному, рак мочеточника, рак мочеиспускательного канала, рак мочевого пузыря, рак мочевой системы, рак шейки матки, рак матки, увеальную меланому, рак влагалища, веррукозную карциному, ВИПому, рак вульвы, хорошо дифференцированную карциному или опухоль Вильмса.
[00132] В некоторых других вариантах осуществления рак представляет собой неходжкинскую лимфому, такую как B-клеточная лимфома или Т-клеточная лимфома. В некоторых вариантах осуществления неходжкинская лимфома является B-клеточной лимфомой, такая как диффузная B-крупноклеточная лимфома, первичная медиастинальная B-клеточная лимфома, фолликулярная лимфома, лимфоцитарная лимфома, мантийноклеточная лимфома, B-клеточная лимфома из клеток краевой зоны, экстранодальная B-клеточная лимфома из клеток краевой зоны, нодальная B-клеточная лимфома из клеток краевой зоны, B-клеточная лимфома из клеток краевой зоны селезенки, лимфома Беркитта, лимфоплазмоцитарная лимфома, волосатоклеточный лейкоз или первичная лимфома центральной нервной системы (ЦНС). В некоторых других вариантах осуществления неходжкинская лимфома является T-клеточной лимфомой, такой как Т-лимфобластная лимфома из клеток-предшественников, периферическая T-клеточная лимфома, кожная T-клеточная лимфома, ангиоиммунобластная T-клеточная лимфома, экстранодальная NK-клеточная/T-клеточная лимфома, T-клеточная лимфома энтеропатического типа, подкожная панникулитоподобная T-клеточная лимфома, анапластическая крупноклеточная лимфома или периферическая T-клеточная лимфома.
[00133] Рак, подлежащий лечению, может быть охарактеризован в соответствии с присутствием определенного антигена, экспрессируемого на поверхности раковой клетки. В некоторых вариантах осуществления раковая клетка в дополнение к CD33 может экспрессировать одно или более из следующего: CD2, CD19, CD20, CD30, CD38, CD40, CD52, CD70, EGFR/ERBB1, IGF1R, HER3/ERBB3, HER4/ERBB4, MUC1, cMET, SLAMF7, PSCA, MICA, MICB, TRAILR1, TRAILR2, MAGE-A3, B7.1, B7.2, CTLA4 и PD1.
IV. КОМБИНИРОВАННАЯ ТЕРАПИЯ
[00134] В другом аспекте изобретения предусмотрена комбинированная терапия. Мультиспецифичные связывающие белки, описанные в настоящем документе, могут применяться для лечения рака в комбинации с дополнительными терапевтическими средствами.
[00135] Примеры терапевтических средств, которые могут применяться в качестве части комбинированной терапии при лечении рака, включают, например, радиацию, митомицин, третиноин, рибомустин, гемцитабин, винкристин, этопозид, кладрибин, митобронитол, метотрексат, доксорубицин, карбоквон, пентостатин, нитракрин, зиностатин, цетрореликс, летрозол, ралтитрексед, даунорубицин, фадрозол, фотемустин, тималфазин, собузоксан, недаплатин, цитарабин, бикалутамид, винорелбин, веснаринон, аминоглутетимид, амсакрин, проглумид, эллиптиния ацетат, кетансерин, доксифлуридин, этретинат, изотретиноин, стрептозоцин, нимустин, виндезин, флутамид, дрогенил, бутоцин, кармофур, разоксан, сизофилан, карбоплатин, митолактол, тегафур, ифосфамид, преднимустин, пицибанил, левамизол, тенипозид, импросульфан, эноцитабин, лизурид, оксиметолон, тамоксифен, прогестерон, мепитиостан, эпитиостанол, форместан, интерферон-2-альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, колониестимулирующий фактор-1, колониестимулирующий фактор-2, денилейкин дифтитокс, интерлейкин-2, рилизинг-фактор лютеинизирующего гормона и вариации вышеуказанных средств, которые могут демонстрировать дифференциальное связывание с его когнатным рецептором, а также увеличивать или уменьшать полупериод существования в сыворотке.
[00136] Дополнительным классом средств, которые могут применяться в качестве части комбинированной терапии при лечении рака, являются ингибиторы иммунных контрольных точек. Примеры ингибиторов иммунных контрольных точек включают средства, которые ингибируют одно или более следующих: (i) цитотоксический T-лимфоцит-ассоциированный антиген 4 (CTLA4), (ii) белок запрограммированной смерти клетки 1 (PD1), (iii) PDL1, (iv) LAG3, (v) B7-H3, (vi) B7-H4 и (vii) TIM3. Ингибитор CTLA4 ипилимумаб был одобрен Управлением по контролю качества продуктов питания и лекарственных средств США для лечения меланомы.
[00137] Еще одними средствами, которые могут применяться в качестве части комбинированной терапии при лечении рака, являются средства на основе моноклональных антител, которые направленно воздействуют на мишени, не являющиеся контрольными точками (например, герцептин), а также нецитотоксические средства (например, ингибиторы тирозинкиназы).
[00138] Другие категории противоопухолевых средств включают, например: (i) ингибитор, выбранный из ингибитора ALK, ингибитора ATR, антагониста A2A, ингибитора эксцизионной репарации оснований, ингибитора Bcr-Abl тирозинкиназы, ингибитора тирозинкиназы Брутона, ингибитора CDC7, ингибитора CHK1, ингибитора циклин-зависимой киназы, ингибитора ДНК-ПК, ингибитора ДНК-ПК и mTOR, ингибитора DNMT1, ингибитора DNMT1 плюс 2-хлор-дезоксиаденозин, ингибитора HDAC, ингибитора сигнального пути Hedgehog, ингибитора IDO, ингибитора JAK, ингибитора mTOR, ингибитора MEK, ингибитора MELK, ингибитора MTH1, ингибитора PARP, ингибитора фосфоинозитид-3-киназы, ингибитора PARP1 и DHODH, ингибитора протеасомы, ингибитора топоизомеразы-II, ингибитора тирозинкиназы, ингибитора VEGFR и ингибитора WEE1; (ii) агонист OX40, CD137, CD40, GITR, CD27, HVEM, TNFRSF25 или ICOS; и (iii) цитокин, выбранный из IL-12, IL-15, ГМ-КСФ и Г-КСФ
[00139] Белки согласно изобретению также могут применяться в качестве вспомогательного средства при хирургическом удалении первичного очага.
[00140] Количество мультиспецифичного связывающего белка и дополнительного терапевтического средства, а также относительное время применения могут быть выбраны так, чтобы достигать требуемого комбинированного терапевтического эффекта. Например, в случае применения комбинированной терапии у нуждающегося в таком применении пациента, терапевтические средства в комбинации или фармацевтическая композиция или композиции, включающие терапевтические средства, могут применять в любом порядке, например, последовательно, параллельно, вместе, одновременно и т.п. Кроме того, например, мультиспецифичный связывающий белок могут вводить в течение времени, когда дополнительное терапевтическое средство(а) оказывает свое профилактическое или терапевтическое действие, или наоборот.
V. ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ
[00141] В настоящем изобретении также предложены фармацевтические композиции, которые содержат терапевтически эффективное количество белка, описанного в настоящем документе. Композиция может быть изготовлена для применения в различных системах доставки лекарственных средств. Одно или более физиологически приемлемых вспомогательных веществ или носителей также могут быть включены в композицию для получения надлежащей лекарственной формы. Подходящие лекарственные формы для применения в настоящем изобретении можно найти в справочнике Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985. Для ознакомления с кратким обзором способов доставки лекарственных средств см., например, Langer (Science 249:1527-1533, 1990).
[00142] Лекарственная форма для внутривенной доставки согласно настоящему изобретению может содержаться в пакете, шприц-ручке или шприце. В некоторых вариантах осуществления пакет может быть соединен с каналом, содержащим трубку и/или иглу. В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма может представлять собой лиофилизированную форму или жидкую форму. В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма может быть лиофильно высушенной (лиофилизированной) и содержаться приблизительно в 12-60 флаконах. В некоторых вариантах лекарственная форма может быть лиофилизирована, и 45 мг лиофилизированной лекарственной формы может содержаться в одном флаконе. В некоторых вариантах осуществления приблизительно 40-100 мг лиофилизированной лекарственной формы может содержаться в одном флаконе. В некоторых вариантах осуществления лиофилизированную лекарственную форму из 12, 27 или 45 флаконов объединяют с получением терапевтической дозы белка в лекарственном препарате для внутривенного применения. В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма может представлять собой жидкую форму и храниться в количестве от приблизительно 250 мг/флакон до приблизительно 1000 мг/флакон. В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма может представлять собой жидкую форму и храниться в количестве приблизительно 600 мг/флакон. В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма может представлять собой жидкую форму и храниться в количестве приблизительно 250 мг/флакон.
[00143] Настоящее описание может включать жидкую водную фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество белка в буферном растворе, составляющем лекарственную форму.
[00144] Эти композиции могут стерилизовать с помощью стандартных способов стерилизации или могут стерилизовать фильтрованием. Полученные водные растворы могут быть упакованы для применения в таком виде или лиофилизированы, при этом лиофилизированный препарат объединяют со стерильным водным носителем перед введением. Значение рН препаратов обычно составляет от 3 до 11, более предпочтительно от 5 до 9 или от 6 до 8, и наиболее предпочтительно от 7 до 8, например, от 7 до 7,5. Полученные композиции в твердой форме могут быть упакованы в виде нескольких однократных единиц дозы, каждая из которых содержит фиксированное количество вышеуказанного средства или средств. Композиция в твердой форме также может быть упакована в контейнер для получения переменного количества.
[00145] В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена лекарственная форма с увеличенным сроком годности, включающая белок согласно настоящему изобретению, в комбинации с маннитом, моногидратом лимонной кислоты, цитратом натрия, дигидратом фосфата двунатрия, дигидратом дигидрофосфата натрия, хлоридом натрия, полисорбатом 80, водой и гидроксидом натрия.
[00146] В некоторых вариантах осуществления изготавливают водную лекарственную форму, включающую белок согласно настоящему изобретению в pH-буферном растворе. Буфер согласно настоящему изобретению может иметь pH в пределах от приблизительно 4 до приблизительно 8, например, от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0 или от приблизительно 4,8 до приблизительно 5,5, или может иметь pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,2. Промежуточные диапазоны по отношению к указанным выше значениям pH также включены в настоящее описание. Например, должны быть включены диапазоны значений с использованием комбинации любого из вышеуказанных значений в качестве верхней и/или нижней границы. Примеры буферов, которые будут регулировать pH в пределах данного диапазона, включают ацетат (например, ацетат натрия), сукцинат (такой как сукцинат натрия), глюконат, гистидин, цитрат и другие буферы на основе органических кислот.
[00147] В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма включает буферную систему, которая содержит цитрат и фосфат, для поддержания pH в диапазоне от приблизительно 4 до приблизительно 8. В некоторых вариантах осуществления диапазон pH может составлять от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,0, или от приблизительно pH 4.8 до приблизительно 5,5, или в диапазоне pH от приблизительно 5,0 до приблизительно 5,2. В некоторых вариантах осуществления буферная система включает моногидрат лимонной кислоты, цитрат натрия, дигидрат фосфата динатрия и/или дигидрат дигидрофосфата натрия. В некоторых вариантах осуществления буферная система включает приблизительно 1,3 мг/мл лимонной кислоты (например, 1,305 мг/мл), приблизительно 0,3 мг/мл цитрата натрия (например, 0,305 мг/мл), приблизительно 1,5 мг/мл дигидрата фосфата динатрия (например, 1,53 мг/мл), приблизительно 0,9 мг/мл дигидрата дигидрофосфата натрия (например, 0,86) и приблизительно 6,2 мг/мл хлорида натрия (например, 6,165 мг/мл). В некоторых вариантах осуществления буферная система включает 1-1,5 мг/мл лимонной кислоты, 0,25-0,5 мг/мл цитрата натрия, 1,25-1,75 мг/мл дигидрата фосфата динатрия, 0,7-1,1 мг/мл дигидрата дигидрофосфата натрия и 6,0-6,4 мг/мл хлорида натрия. В некоторых вариантах осуществления pH лекарственной формы доводят гидроксидом натрия.
[00148] Полиол, который действует как регулятор тоничности и может стабилизировать антитело, также может быть включен в состав лекарственной формы. Полиол добавляют к лекарственной форме в количестве, которое может изменяться в зависимости от требуемой изотоничности лекарственной формы. В некоторых вариантах осуществления водная лекарственная форма может быть изотонической. Количество добавляемого полиола также может быть изменено в зависимости от молекулярной массы полиола. Например, может быть добавлено меньшее количество моносахарида (например, маннита) по сравнению с дисахаридом (таким как трегалоза). В некоторых вариантах осуществления полиолом, который может использоваться в лекарственной форме в качестве регулятора тоничности, является маннит. В некоторых вариантах осуществления концентрация маннита может составлять от приблизительно 5 до приблизительно 20 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация маннита может составлять приблизительно 7,5-15 мг/мл. В некоторых вариантах концентрация маннита может составлять приблизительно 10-14 мг/мл. В некоторых вариантах концентрация маннита может составлять приблизительно 12 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления в лекарственную форму может быть включен такой полиол как сорбит.
[00149] Детергент или поверхностно-активное вещество также могут быть добавлены в лекарственную форму. Примеры детергентов включают неионогенные детергенты, такие как полисорбаты (например, полисорбаты 20, 80 и т.д.) или полоксамеры (например, полоксамер 188). Количество добавляемого детергента является таким, что оно уменьшает агрегацию включенного в лекарственную форму антитела и/или сводит к минимуму образование частиц в лекарственной форме и/или снижает адсорбцию. В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма может включать поверхностно-активное вещество, которое представляет собой полисорбат. В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма может содержать детергент полисорбат 80 или Tween 80. Tween 80 - это термин, используемый для описания полиоксиэтилен (20) сорбитанмоноолеата (см. Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, 4th edi., 1996). В некоторых вариантах осуществления лекарственная форма может содержать от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мг/мл полисорбата 80, или от приблизительно 0,5 до приблизительно 5 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления в композицию могут добавлять приблизительно 0,1% полисорбата 80.
[00150] В вариантах осуществления белковый продукт согласно настоящему изобретению изготовлен в виде жидкой лекарственной формы. Жидкая лекарственная форма может быть предоставлена с концентрацией 10 мг/мл во флаконе USP/Ph Eur типа I 50R, закрытом резиновой пробкой и запечатанном алюминиевой обжимной крышкой. Пробка может быть изготовлена из эластомера, соответствующего требованиям USP и Ph Eur. В некоторых вариантах осуществления флаконы могут быть заполнены 61,2 мл раствора белкового продукта для обеспечения отбираемого объема 60 мл. В некоторых вариантах осуществления жидкая лекарственная форма может быть разведена 0,9% раствором хлорида натрия.
[00151] В некоторых вариантах осуществления жидкая лекарственная форма согласно изобретению может быть изготовлена в виде раствора с концентрацией 10 мг/мл в комбинации с сахаром в стабилизирующих уровнях. В некоторых вариантах осуществления жидкая лекарственная форма может быть приготовлена в водном носителе. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор может быть добавлен в количестве не больше, чем такое количество, которое может привести к нежелательной или неподходящей для внутривенного введения вязкости. В некоторых вариантах осуществления сахар может быть дисахаридом, например, сахарозой. В некоторых вариантах осуществления жидкая лекарственная форма также может включать одно или более из буферного вещества, поверхностно-активного вещества и консерванта.
[00152] В некоторых вариантах осуществления pH жидкой лекарственной формы может быть установлено путем добавления фармацевтически приемлемой кислоты и/или основания. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемая кислота может быть соляной кислотой. В некоторых вариантах осуществления основание может быть гидроксидом натрия.
[00153] В дополнение к агрегации, дезамидирование является распространенным вариантом продукта пептидов и белков, которые могут быть получены при ферментации, сборе/осветлении клеток, очистке, хранении лекарственной субстанции/лекарственного продукта и во время анализа образца. Дезамидирование является потерей белком NH3 с образованием промежуточного сукцинимида, который может подвергаться гидролизу. Промежуточный сукцинимид приводит к снижению массы исходного пептида на 17 дальтон. Последующий гидролиз приводит к увеличению массы на 18 дальтон. Выделение промежуточного сукцинимида затруднено из-за нестабильности в водных условиях. Таким образом, дезамидирование обычно определяют как увеличение массы на 1 дальтон. Дезамидирование аспарагина приводит к образованию аспарагиновой или изоаспарагиновой кислоты. Параметры, влияющие на скорость дезамидирования, включают pH, температуру, диэлектрическую проницаемость растворителя, ионную силу, первичную последовательность, локальную конформацию полипептида и третичную структуру. Аминокислотные остатки, примыкающие к Asn в пептидной цепи, влияют на скорость дезамидирования. Gly и Ser, следующие после Asn в белковых последовательностях, приводят к более высокой склонности к дезамидированию.
[00154] В некоторых вариантах осуществления жидкая лекарственная форма согласно настоящему изобретению может храниться при условиях pH и влажности для предотвращения дезамидирования белкового продукта.
[00155] Представляющий интерес водный носитель в настоящем описании является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и подходящим для приготовления жидкой композиции. Иллюстративные носители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), pH буферный раствор (например, фосфатно-солевой буферный раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.
[00156] Консервант может быть необязательно добавлен в лекарственные формы в настоящем описании для уменьшения жизнедеятельности бактерий. Добавление консерванта может, например, облегчать производство многократно применяемой (многодозовой) лекарственной формы.
[00157] Лекарственные формы для внутривенного (в/в) применения могут быть предпочтительным путем введения в конкретных случаях, например, когда пациент находится в больнице после трансплантации, получая все лекарственные препараты в/в путем. В некоторых вариантах осуществления жидкую лекарственную форму разбавляют 0,9% раствором хлорида натрия перед введением. В некоторых вариантах осуществления разбавленный лекарственный продукт для инъекций является изотоническим и пригодным для введения путем внутривенной инфузии.
[00158] В некоторых вариантах осуществления солевые или буферные компоненты могут быть добавлены в количестве 10-200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и получены из различных известных кислот (неорганических и органических) с "образующими основание" металлами или аминами. В некоторых вариантах осуществления буфер может быть фосфатным буфером. В некоторых вариантах осуществления буфер может быть глицинатным, карбонатным, цитратным буфером, и в таком случае противоионом могут служить ионы натрия, калия или аммония.
[00159] Консервант может быть необязательно добавлен в лекарственные формы в настоящем описании для уменьшения жизнедеятельности бактерий. Добавление консерванта может, например, облегчать производство многократно применяемой (многодозовой) лекарственной формы.
[00160] Представляющий интерес водный носитель в настоящем описании является фармацевтически приемлемым (безопасным и нетоксичным для введения человеку) и подходящим для приготовления жидкой композиции. Иллюстративные носители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), pH буферный раствор (например, фосфатно-солевой буферный раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.
[00161] Настоящее изобретение может включать лиофилизированную лекарственную форму, включающую белки и лиопротектор. Лиопротектор может быть сахаром, например, дисахаридом. В некоторых вариантах осуществления лиопротектор может быть сахарозой или мальтозой. Лиофилизированная лекарственная форма также может включать одно или более из буферного вещества, поверхностно-активного вещества, объемообразующего вещества и/или консерванта.
[00162] Количество сахарозы или мальтозы, подходящее для стабилизации лиофилизированного фармацевтического продукта, может составлять в весовом отношении, по меньшей мере, 1:2 белка к сахарозе или мальтозе. В некоторых вариантах осуществления весовое отношение белка к сахарозе или мальтозе может составлять от 1:2 до 1:5.
[00163] В некоторых вариантах осуществления pH лекарственной формы до лиофилизации может быть установлено путем добавления фармацевтически приемлемой кислоты и/или основания. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемая кислота может быть соляной кислотой. В некоторых вариантах осуществления фармацевтически приемлемое основание может быть гидроксидом натрия.
[00164] Перед лиофилизацией, pH раствора, содержащего белок согласно настоящему изобретению, может быть доведен до 6-8. В некоторых вариантах осуществления диапазон pH лиофилизированного фармацевтического продукта может составлять от 7 до 8.
[00165] В некоторых вариантах осуществления солевые или буферные компоненты могут быть добавлены в количестве 10-200 мМ. Соли и/или буферы являются фармацевтически приемлемыми и получены из различных известных кислот (неорганических и органических) с "образующими основание" металлами или аминами. В некоторых вариантах осуществления буфер может быть фосфатным буфером. В некоторых вариантах осуществления буфер может быть глицинатным, карбонатным, цитратным буфером, и в таком случае противоионом могут служить ионы натрия, калия или аммония.
[00166] В некоторых вариантах осуществления может быть добавлено "объемообразующее вещество". "Объемообразующее вещество" является соединением, которое увеличивает массу лиофилизированной смеси и улучшает физическую структуру лиофилизированной массы (например, облегчает получение по существу однородной лиофилизированной массы, которая сохраняет структуру с открытыми порами). Иллюстративные объемообразующие вещества включают маннит, глицин, полиэтиленгликоль и сорбит. Лиофилизированные лекарственные формы согласно настоящему изобретению могут содержать такие объемообразующие вещества.
[00167] Консервант может быть необязательно добавлен в лекарственные формы в настоящем описании для уменьшения жизнедеятельности бактерий. Добавление консерванта может, например, облегчать производство многократно применяемой (многодозовой) лекарственной формы.
[00168] В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный фармацевтический продукт может быть изготовлен с водным носителем. Представляющий интерес водный носитель в настоящем документе является фармацевтически приемлемым (например, безопасным и нетоксичным для введения человеку) и подходящим для приготовления жидкой лекарственной формы после лиофилизации. Иллюстративные носители включают стерильную воду для инъекций (SWFI), бактериостатическую воду для инъекций (BWFI), pH буферный раствор (например, фосфатно-солевой буферный раствор), стерильный физиологический раствор, раствор Рингера или раствор декстрозы.
[00169] В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный фармацевтический продукт согласно настоящему изобретению восстанавливают либо стерильной водой для инъекций (USP (SWFI)), либо 0,9% раствором натрия хлорида для инъекций (USP). Во время восстановления лиофилизированный порошок растворяется в растворе.
[00170] В некоторых вариантах осуществления лиофилизированный белковый продукт настоящего изобретения составляют до приблизительно 4,5 мл воды для инъекций и разводят 0,9% физиологическим раствором (раствором хлорида натрия).
[00171] Фактические уровни дозы активных веществ в фармацевтических композициях настоящего изобретения могут изменяться для получения количества активного вещества, которое является эффективным для достижения требуемого терапевтического ответа у конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсического воздействия на пациента.
[00172] Определенная доза может быть единой дозой для каждого пациента, например, 50-5000 мг белка. В альтернативе доза для пациента может быть рассчитана по приблизительной массе или площади поверхности тела пациента. Другие факторы при определении подходящей дозы могут включать заболевание или состояние, которое подлежит лечению или предотвращению, тяжесть заболевания, путь введения, а также возраст, пол и состояние здоровья пациента. Дальнейшее уточнение вычислений, необходимое для определения подходящей дозы для лечения, обычно производят специалисты в данной области, в особенности с учетом информации по дозировке и анализов, раскрытых в настоящем документе. Доза также может быть определена с помощью известных анализов для определения доз, используемых в сочетании с соответствующими данными о зависимости эффекта от дозы. Дозы для отдельного пациента можно корректировать по мере наблюдения прогрессирования заболевания. Уровни направляемой конструкции или комплекса в крови пациента могут быть измерены для определения, требуется ли произвести коррекцию доз для получения или поддержания эффективной концентрации. Фармакогенетические показатели можно использовать для определения, какие направляемые конструкции и/или комплексы и их дозы с наиболее высокой вероятностью будут эффективными для данного пациента (Schmitz et al., Clinica Chimica Acta 308: 43-53, 2001; Steimer et al., Clinica Chimica Acta 308: 33-41, 2001).
[00173] Как правило, дозы в расчете на массу тела составляют от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 100 мг на кг массы тела, например, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 10 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 1 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 100 мкг/кг массы тела, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 50 мкг/кг массы тела, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 10 мкг/кг массы тела, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 1 мкг/кг массы тела, от приблизительно 0,01 мкг до приблизительно 0,1 мкг/кг массы тела, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 10 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 1 мг/кг массы тела, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 100 мкг/кг массы тела, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 10 мкг/кг массы тела, от приблизительно 0,1 мкг до приблизительно 1 мкг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 1 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 100 мкг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 50 мкг/кг массы тела, от приблизительно 1 мкг до приблизительно 10 мкг/кг массы тела, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 10 мг/кг массы тела, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 1 мг/кг массы тела, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 100 мкг/кг массы тела, от приблизительно 10 мкг до приблизительно 50 мкг/кг массы тела, от приблизительно 50 мкг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 50 мкг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 50 мкг до приблизительно 10 мг/кг массы тела, от приблизительно 50 мкг до приблизительно 1 мг/кг массы тела, от приблизительно 50 мкг до приблизительно 100 мкг/кг массы тела, от приблизительно 100 мкг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 100 мкг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 100 мкг до приблизительно 10 мг/кг массы тела, от приблизительно 100 мкг до приблизительно 1 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 1 мг до приблизительно 10 мг/кг массы тела, от приблизительно 10 мг до приблизительно 100 мг/кг массы тела, от приблизительно 10 мг до приблизительно 50 мг/кг массы тела, от приблизительно 50 мг до приблизительно 100 мг/кг массы тела.
[00174] Дозы могут вводить один или более раз в день, неделю, месяц или год, или даже один раз в 2-20 лет. Средние специалисты в данной области могут легко оценить частоту повторного введения доз на основе измеренных значений времени пребывания и концентрации направляемой конструкции или комплекса в биологических жидкостях или тканях. Введение согласно настоящему изобретению может быть внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутримышечным, подкожным, внутриплевральным, интратекальным, внутриполостным, путем перфузии через катетер или прямой внутриочаговой инъекции. Введение могут производить один или более раз в день, один или более раз в неделю, один или более раз в месяц и один или более раз в год.
[00175] В представленном выше описании описано множество аспектов и вариантов осуществления изобретения. В заявке на патент прямо рассмотрены все комбинации и сочетания аспектов и вариантов осуществления.
ПРИМЕРЫ
[00176] Далее изобретение, уже описанное в общем виде, можно будет более легко понять при обращении к следующим примерам, которые включены исключительно в целях иллюстрации некоторых аспектов и вариантов осуществления настоящего изобретения и не предназначены для ограничения изобретения.
Пример 1 - NKG2D-связывающие домены связываются с NKG2D
NKG2D-связывающие домены связываются с очищенным рекомбинантным NKG2D
[00177] Последовательности нуклеиновых кислот эктодоменов NKG2D человека, мыши или яванского макака были слиты с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими Fc-домены IgG1 человека, и введены в клетки млекопитающих для экспрессии. После очистки слитые белки NKG2D-Fc адсорбировали в лунках микропланшетов. После блокирования лунок бычьим сывороточным альбумином для предотвращения неспецифического связывания, NKG2D-связывающие домены титровали и добавляли в лунки с предварительно адсорбированными слитыми белками NKG2D-Fc. Связывание первичного антитела определяли с использованием вторичного антитела, которое конъюгировано с пероксидазой хрена и специфически распознает каппа легкую цепь человека, чтобы исключить перекрестную реактивность с Fc. 3,3',5,5'-тетраметилбензидин (TMB), субстрат пероксидазы хрена, добавляли в лунки для визуализации сигнала связывания, поглощение которого измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. Клон NKG2D-связывающего домена, изотипический контроль или положительный контроль (выбранный из SEQ ID NO: 45-48 или клоны против мышиного NKG2D, MI-6 и CX-5, доступные в eBioscience) добавляли в каждую лунку.
[00178] Изотипический контроль показал минимальное связывание с рекомбинантными белками NKG2D-Fc, тогда как положительный контроль наиболее сильно связывался с рекомбинантными антигенами. NKG2D-связывающие домены, продуцированные всеми клонами, продемонстрировали связывание с рекомбинантными белками NKG2D-Fc человека, мыши и яванского макака, хотя с различной аффинностью в зависимости от клона. Как правило, каждый клон против NKG2D связывался с рекомбинантным NKG2D-Fc человека (ФИГ. 3) и яванского макака (ФИГ. 4) с подобной аффинностью, но с более низкой аффинностью связывался с рекомбинантным NKG2D-Fc мыши (ФИГ. 5).
NKG2D-связывающие домены связываются с клетками, экспрессирующими NKG2D
[00179] Линии клеток мышиной лимфомы EL4 модифицировали для экспрессии химерных антигенных человеческих или мышиных рецепторов NKG2D с сигнальным доменом CD3 дзета. NKG2D-связывающий клон, изотипический контроль или положительный контроль использовали в концентрации 100 нМ для окрашивания внеклеточного NKG2D, экспрессированного на клетках EL4. Связывание антител определяли с использованием вторичных антител против человеческого IgG, конъюгированных с флуорофором. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и рассчитывали кратную интенсивность сигнала в сравнении с фоном (FOB) с использованием средней интенсивности флуоресценции (MFI) NKG2D-экспрессирующих клеток по сравнению с исходными клетками EL4.
[00180] NKG2D-связывающие домены, продуцированные всеми клонами, связывались с клетками EL4, экспрессирующими NKG2D человека и мыши. Антитела положительного контроля (выбранные из SEQ ID NO: 45-48, или клоны против мышиного NKG2D, MI-6 и CX-5, доступные в eBioscience) давали лучший сигнал связывания FOB. Аффинность связывания с NKG2D каждого клона была сходной между клетками, экспрессирующими NKG2D человека (ФИГ. 6) и NKG2D мыши (ФИГ. 7).
Пример 2 - NKG2D-связывающие домены блокируют связывание естественного лиганда с NKG2D
Конкуренция с ULBP-6
[00181] Рекомбинантные белки NKG2D-Fc человека адсорбировали в лунках микропланшета и блокировали лунки бычьим сывороточным альбумином для снижения неспецифичного связывания. Насыщающую концентрацию ULBP-6-His-биотина добавляли в лунки с последующим добавлением клонов NKG2D-связывающих доменов. После 2-часового инкубирования лунки промывали и ULBP-6-His-биотин, который оставался связанным в покрытых NKG2D-Fc лунках, детектировали стрептавидином, конъюгированным с пероксидазой хрена, и субстратом TMB. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфическое связывание NKG2D-связывающих доменов с белками NKG2D-Fc вычисляли на основе процента ULBP-6-His-биотина, связывание которого с белками NKG2D-Fc в лунках было блокировано. Антитело положительного контроля (выбранное из SEQ ID NO:45-48) и различные NKG2D-связывающие домены блокировали связывание ULBP-6 с NKG2D, тогда как изотипический контроль показал небольшую конкуренцию с ULBP-6 (ФИГ. 8).
Конкуренция с MICA
[00182] Рекомбинантные белки человеческого MICA-Fc адсорбировали в лунках микропланшета и блокировали лунки бычьим сывороточным альбумином для уменьшения неспецифического связывания. NKG2D-Fc-биотин добавляли в лунки с последующим добавлением NKG2D-связывающих доменов. После инкубирования и промывки, NKG2D-Fc-биотин, который оставался связанным в лунках, покрытых MICA-Fc, детектировали с использованием стрептавидина-HRP и субстрата TMB. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфичное связывание NKG2D-связывающих доменов с белками NKG2D-Fc вычисляли на основе процента NKG2D-Fc-биотина, связывание которого с покрытыми MICA-Fc лунками было блокировано. Антитело положительного контроля (выбранное из SEQ ID NO:45-48) и различные NKG2D-связывающие домены блокировали связывание MICA с NKG2D, тогда как изотипический контроль показал небольшую конкуренцию с MICA (ФИГ. 9).
Конкуренция с Rae-1 дельта
[00183] Рекомбинантный мышиный Rae-1дельта-Fc (приобретенный в R&D Systems) адсорбировали в лунках микропланшета и блокировали лунки бычьим сывороточным альбумином для уменьшения неспецифичного связывания. Мышиный NKG2D-Fc-биотин добавляли в лунки с последующим добавлением NKG2D-связывающих доменов. После инкубирования и промывки, NKG2D-Fc-биотин, который оставался связанным в лунках, покрытых Rae-1дельта-Fc, детектировали с использованием стрептавидина-HRP и субстрата TMB. Поглощение измеряли при 450 нМ и корректировали при 540 нМ. После вычитания фона специфичное связывание NKG2D-связывающих доменов с белками NKG2D-Fc вычисляли на основе процента NKG2D-Fc-биотина, связывание которого с покрытыми Rae-1-дельта-Fc лунками было блокировано. Положительный контроль (выбранный из SEQ ID NO:45-48 или клонов против мышиного NKG2D, MI-6 и CX-5, доступных в eBioscience) и различные клоны NKG2D-связывающего домена блокировали связывание Rae-1-дельта с мышиным NKG2D, тогда как антитело изотипического контроля демонстрировало низкую конкуренцию с Rae-1дельта (ФИГ. 10).
Пример 3 - клоны NKG2D-связывающего домена активируют NKG2D
[00184] Последовательности нуклеиновых кислот NKG2D человека и мыши были слиты с последовательностями нуклеиновых кислот, кодирующими сигнальный домен CD3 дзета, с получением конструкций химерного антигенного рецептора (CAR). Затем конструкции NKG2D-CAR клонировали в ретровирусный вектор при использовании сборки по методу Гибсона и трансфицировали в клетки expi293 для получения ретровируса. Клетки EL4 инфицировали вирусами, содержащими NKG2D-CAR, вместе с 8 мкг/мл полибрена. Через 24 часа после заражения уровни экспрессии NKG2D-CAR в клетках EL4 исследовали с помощью проточной цитометрии и отбирали клоны, которые с высоким уровнем экспрессировали NKG2D-CAR на поверхности клеток.
[00185] Для определения, активируют ли NKG2D-связывающие домены NKG2D, их адсорбировали в лунках микропланшета и культивировали клетки NKG2D-CAR EL4 в покрытых фрагментом антитела лунках в течение 4 часов в присутствии брефелдина-A и монензина. Внутриклеточную продукцию ФНО-альфа, индикатора активации NKG2D, исследовали с помощью проточной цитометрии. Процент ФНО-альфа положительных клеток нормализовали по клеткам, обработанным положительным контролем. Все NKG2D-связывающие домены активировали человеческий NKG2D (ФИГ. 11) и мышиный NKG2D (ФИГ. 12).
Пример 4 - NKG2D-связывающие домены активируют NK-клетки
Первичные человеческие NK-клетки
[00186] Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3-CD56+) выделяли с использованием негативного отбора с помощью магнитных гранул из МКПК, при этом чистота выделенных NK-клеток обычно составляла >95%. Затем выделенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл IL-2, в течение 24-48 часов, после чего их переносили в лунки микропланшета, в которых были адсорбированы NKG2D-связывающие домены, и культивировали в среде, содержащей конъюгированное с флуорофором антитело против CD107a, брефелдин-А и монензин. После культивирования NK-клетки исследовали с помощью проточной цитометрии при использовании конъюгированных с флуорофором антител против CD3, CD56 и IFN-гамма. Окрашивание CD107a и IFN-гамма исследовали в CD3–CD56+ клетках для оценки активации NK-клеток. Увеличение количества двойных положительных по CD107a/IFN-гамма клеток указывает на лучшую активацию NK-клеток в результате связывания двух активирующих рецепторов, а не одного рецептора. NKG2D-связывающие домены и положительный контроль (выбранный из SEQ ID NO:45-48) показали более высокий процент ставших CD107a+ и IFN-гамма+ NK-клеток, чем изотипический контроль (на ФИГ. 13 и ФИГ. 14 представлены данные из двух независимых экспериментов, в каждом из которых для получения NK-клеток использовали МКПК разных доноров).
Первичные мышиные NK-клетки
[00187] Селезенки получали от мышей C57Bl/6 и протирали через клеточное сито с ячейками 70 мкм для получения суспензии отдельных клеток. Клетки осаждали и ресуспендировали в лизисном буфере ACK (приобретенном в Thermo Fisher Scientific, #A1049201; 155 мМ хлорида аммония, 10 мМ бикарбоната калия, 0,01 мМ ЭДТА) для удаления эритроцитов. Оставшиеся клетки культивировали с 100 нг/мл hIL-2 в течение 72 часов, после чего собирали и подготавливали для выделения NK-клеток. Затем NK-клетки (CD3–NK1.1+) выделяли из клеток селезенки с использованием методики отрицательного истощения с использованием магнитных гранул с чистотой >90%. Очищенные NK-клетки культивировали в среде, содержащей 100 нг/мл mIL-15, в течение 48 часов, после чего их переносили в лунки микропланшета, в которых были адсорбированы NKG2D-связывающие домены, и культивировали в среде, содержащей конъюгированное с флуорофором антитело против CD107a, брефелдин-А и монензин. После культивирования в лунках, покрытых NKG2D-связывающим доменом, NK-клетки анализировали с помощью проточной цитометрии при использовании антител, конъюгированных с флуорофором, против CD3, NK1.1 и IFN-гамма. Окрашивание на CD107a и IFN-гамма исследовали в CD3-NK1.1+ клетках для оценки активации NK-клеток. Увеличение количества двойных положительных по CD107a/IFN-гамма клеток указывает на лучшую активацию NK-клеток в результате связывания двух активирующих рецепторов, а не одного рецептора. NKG2D-связывающие домены и положительный контроль (выбранный из клонов против мышиного NKG2D, MI-6 и CX-5, доступных в eBioscience) показали более высокий процент ставших CD107a+ и IFN-гамма+ NK-клеток, чем изотипический контроль (на ФИГ. 15 и ФИГ. 16 представлены данные из двух независимых экспериментов, в каждом из которых для получения NK-клеток использовали разных мышей).
Пример 5 - NKG2D-связывающие домены обеспечивают цитотоксичность в отношении целевых опухолевых клеток
[00188] Анализы активации первичных NK-клеток человека и мыши демонстрируют повышение маркеров цитотоксичности на NK-клетках после инкубирования с NKG2D-связывающими доменами. Для определения, приводит ли это к усилению лизиса опухолевых клеток, использовали клеточный анализ, в котором каждый NKG2D-связывающий домен превращали в моноспецифичное антитело. Fc-область использовали в качестве одного направляющего плеча, тогда как Fab-область (NKG2D-связывающий домен) действовала в качестве другого направляющего плеча для активации NK-клеток. Клетки THP-1, которые имеют человеческое происхождение и экспрессируют высокие уровни Fc-рецепторов, использовали в качестве опухоли-мишени, а также использовали набор для анализа цитотоксичности Perkin Elmer DELFIA Cytotoxicity Kit. Клетки THP-1 метили реагентом BATDA и ресуспендировали при плотности 105/мл в культуральной среде. Затем меченые клетки THP-1 объединяли с антителами NKG2D и выделенными мышиными NK-клетками в лунках микротитровального планшета при 37°С на 3 часа. После инкубирования удаляли 20 мкл культурального супернатанта, смешивали с 200 мкл раствора европия и инкубировали при встряхивании в течение 15 минут в темноте. Флуоресценцию измеряли в зависимости от времени с помощью микропланшетного анализатора PHERAstar, оборудованного модулем флуоресценции с временным разрешением (возбуждение 337 нм, эмиссия 620 нм), и вычисляли специфический лизис в соответствии с инструкциями в наборе.
[00189] Положительный контроль, ULBP-6 - естественный лиганд NKG2D, показал увеличенный специфический лизис клеток-мишеней THP-1 мышиными NK-клетками. Антитела NKG2D также увеличивали специфический лизис клеток-мишеней THP-1, тогда как антитело изотипического контроля показало сниженный специфический лизис. Пунктирная линия указывает на специфический лизис клеток THP-1 мышиными NK-клетками без добавления антитела (ФИГ. 17).
Пример 6 - антитела к NKG2D демонстрируют высокую термостабильность
[00190] Температуры плавления NKG2D-связывающих доменов измеряли с помощью дифференциальной сканирующей флуориметрии. Экстраполированные кажущиеся температуры плавления являются относительно высокими для типичных IgG1 антител (ФИГ. 18).
Пример 7 - Синергическая активация человеческих NK-клеток при перекрестном связывании NKG2D и CD16
Анализ активации первичных человеческих NK-клеток
[00191] Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови человека при использовании центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки очищали из МКПК при использовании негативных магнитных гранул (StemCell #17955). NK-клетки являлись >90% CD3–CD56+ согласно определению с помощью проточной цитометрии. Затем клетки культивировали 48 часов в среде, содержащей 100 нг/мл hIL-2 (Peprotech #200-02) перед использованием в анализах активации. Антителами покрывали 96-луночные планшеты с плоскодонными лунками при концентрации 2 мкг/мл (антитело против CD16, Biolegend #302013) и 5 мкг/мл (антитело против NKG2D, R&D #MAB139) в 100 мкл стерильного PBS в течение ночи при 4°C с последующей тщательной промывкой лунок для удаления избытка антитела. Для оценки дегрануляции IL-2-активированные NK-клетки ресуспендировали при плотности 5×105 клеток/мл в культуральной среде с добавкой 100 нг/мл hIL2 и 1 мкг/мл APC-конъюгированного мАт против CD107a (Biolegend #328619). Затем 1×105 клеток/лунка добавляли в покрытые антителом планшеты. Ингибиторов транспорта белков брефелдин A (BFA, Biolegend #420601) и монензин (Biolegend #420701) добавляли в конечном разведении 1:1000 и 1:270 соответственно. Посеянные клетки инкубировали в течение 4 часов при 37°C в 5% CO2. Для внутриклеточного окрашивания IFN-γ NK-клетки метили мАт против CD3 (Biolegend #300452) и против CD56 (Biolegend #318328) и затем фиксировали, пермеабилизировали и метили мАт против IFN-γ (Biolegend #506507). NK-клетки анализировали на экспрессию CD107a и IFN-γ с помощью проточной цитометрии после гейтирования на живых CD56+CD3– клетках.
[00192] Для исследования относительной активности комбинации рецепторов производили сшивание NKG2D или CD16 и совместное сшивание обоих рецепторов при стимуляции в связанном состоянии на планшете. Как показано на Фигуре 19 (ФИГ. 19A-19C), комбинированная стимуляция CD16 и NKG2D приводила к сильно повышенным уровням продукции CD107a (дегрануляция) (ФИГ. 19A) и/или IFN-γ (ФИГ. 19B). Пунктирные линии представляют аддитивный эффект отдельной стимуляции каждого рецептора.
[00193] Уровни CD107a и внутриклеточную продукцию IFN-γ IL-2-активированными NK-клетками анализировали через 4 часа стимуляции в связанном состоянии на планшете с антителом против CD16, против NKG2D или комбинацией обоих моноклональных антител. На графиках указано среднее значения (n=2) ±SD. ФИГ. 19A демонстрирует уровни CD107a; ФИГ. 19B демонстрирует уровни IFNγ; ФИГ. 19C демонстрирует уровни CD107a и IFNγ. Данные, показанные в ФИГ. 19A-19C, являются репрезентативными для пяти независимых экспериментов с использованием пяти разных здоровых доноров.
Пример 8 - Мультиспецифичные связывающие белки связываются с NKG2D
[00194] Линии клеток лимфомы мыши EL4 модифицировали для экспрессии человеческого NKG2D. Триспецифичные связывающие белки (TriNKET), каждый из которых содержал NKG2D-связывающий домен, опухолеассоциированный антигенсвязывающий домен (CD33-связывающий домен) и Fc-домен, который связывается с CD16, как показано на ФИГ. 1, тестировали на их аффинность к внеклеточному NKG2D, экспрессируемому на клетках EL4. Связывание мультиспецифичных связывающих белков с NKG2D детектировали при использовании флуорофор-конъюгированных вторичных антител против человеческого IgG. Клетки исследовали с помощью проточной цитометрии и вычисляли кратное значение в сравнении с фоном (FOB) при использовании средней интенсивности флуоресценции (MFI) NKG2D-экспрессирующих клеток по сравнению с исходными клетками EL4.
[00195] Тестируемые TriNKET включали CD33-TriNKET-C26 (ADI-28226 и CD33-связывающий домен), CD33-TriNKET-F04 (ADI-29404 и CD33-связывающий домен), CD33-TriNKET-A44 (ADI-27744 и CD33 CD33-связывающий домен), CD33-TriNKET-F47 (ADI-29447 и CD33-связывающий домен), CD33-TriNKET-A49 (ADI-27749 и CD33-связывающий домен) и CD33-TriNKET-F63 (ADI-27463 и CD33-связывающий домен). CD33-связывающий домен, используемый в тестируемых молекулах, состоял из вариабельного домена тяжелой цепи и вариабельного домена легкой цепи, как указано ниже.
Вариабельный домен тяжелой цепи к CD33 (SEQ ID NO:125):
Вариабельный домен легкой цепи к CD33 (SEQ ID NO:126):
[00196] Данные показывают, что TriNKET, которые включают CD33-связывающий домен и NKG2D-связывающий домен, связываются с NKG2D (ФИГ. 35A-35B). На ФИГ. 35A показано связывание различных TriNKET в сравнении с моноклональными антителами, которые содержат соответствующий NKG2D-связывающий домен. На ФИГ. 35B показан профиль связывания CD33-направляющих TriNKET, которые включают 6 разных NKG2D-связывающих доменов.
Пример 9 - Мультиспецифичные связывающие белки связываются с человеческими опухолевыми антигенами
Триспецифичные связывающие белки связываются с CD33
[00197] Линию клеток ОМЛ человека MV4-11 и Molm-13, экспрессирующую CD33, использовали для анализа связывания TriNKET с опухолеассоциированным антигеном CD33. Белки TriNKET и, необязательно, исходное моноклональное антитело против CD33 инкубировали с клетками и связывание детектировали с использованием конъюгированных с флуорофором вторичных антител против человеческого IgG. Клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и вычисляли кратное значение сигнала по сравнению с фоном (FOB) при использовании средней интенсивности флуоресценции (MFI) для белков TriNKET и исходного моноклонального антитела против CD33, нормализованных по вторичным контрольным антителам. CD33-направляющие TriNKET показывают сопоставимые уровни связывания с CD33 по сравнению с исходным антителом против CD33 (ФИГ. 36). TriNKET демонстрируют связывание с CD33 клеточной поверхности на клетках MV4-11 (ФИГ. 36A, 36B и 36D) и Molm-13 (ФИГ. 36C). Общий сигнал связывания сопоставим у различных TriNKET, поскольку они содержат один и тот же CD33-связывающий домен.
Пример 10 - Мультиспецифичные связывающие белки активируют NK-клетки
[00198] Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3–CD56+) выделяли при использовании отрицательного отбора с магнитными гранулами из МКПК, при этом чистота выделенных NK-клеток, как правило, составляла >90%. Выделенные NK-клетки культивировали в средах, содержащих 100 нг/мл IL-2, для активации или оставляли на ночь без цитокина. IL-2-активированные NK-клетки использовали в течение 24-48 часов после активации.
[00199] Клетки MV4-11, экспрессирующие CD33, собирали и ресуспендировали в культуральных средах при плотности 2×106/мл. Моноклональные антитела к CD33 или CD33-направляющие TriNKET разводили в культуральных средах. Активированные NK-клетки собирали, промывали и ресуспендировали при плотности 2×106/мл в культуральных средах. Затем раковые клетки смешивали с моноклональными антителами/TriNKET и активированными NK-клетками в присутствии IL-2. Брефелдин-A и монензин также добавляли к смешанной культуре для блокирования транспорта белка из клетки для внутриклеточного окрашивания цитокинов. Флуорофор-конъюгированное антитело против CD107a добавляли к смешанной культуре и инкубировали культуру в течение 4 часов, после чего подготавливали образцы для FACS анализа с использованием флуорофор-конъюгированных антител против CD3, CD56 и IFN-гамма. Окрашивание CD107a и IFN-гамма исследовали в CD3–CD56+ клетках для оценки активации NK-клеток. Увеличение количества двойных положительных по CD107a/IFN-гамма клеток указывает на лучшую активацию NK-клеток в результате связывания двух активирующих рецепторов, а не одного рецептора.
[00200] Совместное культивирование первичных человеческих NK-клеток с CD33-положительными клетками MV4-11 приводило к TriNKET-опосредованной активации первичных человеческих NK-клеток. CD33-направляющее TriNKET опосредовало активацию человеческих NK-клеток, совместно культивируемых с клетками MV4-11, на что указывало увеличение CD107a дегрануляции и продукции цитокина IFNγ (ФИГ. 37A И 37B). В качестве контроля использовали NK-клетки отдельно, NK-клетки, совместно культивируемые с клетками MV4-11, но без TriNKET, и CD20-направляющие TriNKET. По сравнению с моноклональным антителом к C33, CD33-направляющий TriNKET показал увеличенную активность NK-клеток (ФИГ. 37A и 37B).
Пример 11 - Триспецифичные связывающие белки обеспечивают цитотоксичность в отношении раковых клеток-мишеней
[00201] Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) выделяли из лейкотромбоцитарного слоя периферической крови человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности. NK-клетки (CD3–CD56+) выделяли при использовании отрицательного отбора с магнитными гранулами из МКПК, при этом чистота выделенных NK-клеток, как правило, составляла >90%. Выделенные NK-клетки культивировали в средах, содержащих 100 нг/мл IL-2, для активации или оставляли на ночь без цитокина. IL-2-активированные или покоящиеся NK-клетки использовали на следующий день в анализах цитотоксичности.
Анализ цитотоксичности DELFIA:
[00202] Линии раковых клеток человека, экспрессирующие CD33, собирали из культуры, клетки промывали PBS и ресуспендировали в средах для выращивания при плотности 106/мл для мечения реактивом BATDA (Perkin Elmer AD0116). Мечение клеток-мишеней проводили согласно инструкциям производителя. После мечения клетки 3 раза промывали PBS и ресуспендировали при плотности 0,5-1,0×105/мл в культуральных средах. Для подготовки фоновых лунок аликвоту меченых клеток отбирали и осаждали клетки из среды с помощью центрифугирования. 100 мкл среды осторожно добавляли в лунки в тройной повторности, стараясь не повредить осажденные клетки. 100 мкл меченных BATDA клеток добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета. Лунки сохраняли для спонтанного высвобождения из клеток-мишеней, и лунки подготавливали для максимального лизиса клеток-мишеней путем добавления 1% Triton-X. Моноклональные антитела или TriNKET против представляющей интерес целевой опухоли разводили в культуральных средах и по 50 мкл разведенного мАт или TriNKET добавляли в каждую лунку. Покоящиеся и/или активированные NK-клетки собирали из культуры, клетки промывали и ресуспендировали при плотности 105-2,0×106/мл в культуральных средах в зависимости от требуемого отношения эффекторных клеток к клеткам-мишеням (E:T). По 50 мкл NK-клеток добавляли в каждую лунку планшета с получением общего объема культуры 200 мкл. Планшет инкубировали при 37°C в 5% CO2 в течение 2-3 часов, после чего анализ проявляли.
[00203] После культивирования в течение 2-3 часов планшет извлекали из термостата и осаждали клетки с помощью центрифугирования при 200 g в течение 5 минут. 20 мкл культурального супернатанта переносили в чистый микропланшет, предоставленный производителем, и в каждую лунку добавляли по 200 мкл раствора европия при комнатной температуре. Планшет защищали от света и инкубировали на шейкере для планшетов при 250 об/мин в течение 15 минут. Планшет считывали с использованием приборов Victor 3 или SpectraMax i3X. % специфичного лизиса рассчитывали следующим образом: % специфичного лизиса = ((Экспериментальное высвобождение - спонтанное высвобождение)/(Максимальное высвобождение - спонтанное высвобождение))*100%.
[00204] TriNKET опосредовали цитотоксичность человеческих NK-клеток в отношении CD33-положительных линий человеческих раковых клеток. Покоящиеся человеческие NK-клетки смешивали с раковыми клетками MV4-11 (ФИГ. 40A), покоящиеся человеческие NK-клетки смешивали с раковыми клетками Molm-13 (ФИГ. 40B) и покоящиеся человеческие NK-клетки смешивали с раковыми клетками THP-1 (ФИГ. 40C). Конструкции TriNKET (например, CD33-TriNKET-C26 и CD33-TriNKET-F04) способны дозозависимо усиливать цитотоксическую активность покоящихся человеческих NK-клеток в отношении раковых клеток. Пунктирная линия указывает на цитотоксическую активность покоящихся NK-клеток без TriNKET. Моноклональное антитело к CD33 показало сниженную эффективность в отношении клеток MV4-11, которые экспрессируют CD64, но на более низком уровне, чем клетки THP-1. Моноклональное антитело к CD33 показало хорошую эффективность в отношении клеток Molm-13, которые не экспрессируют CD64. Моноклональное антитело к CD33 не показало эффекта в отношении клеток THP-1, которые имеют высокий уровень CD64.
[00205] Исследовали TriNKET-опосредованный лизис CD33-положительных человеческих раковых клеток Molm-13. Покоящиеся человеческие NK-клетки смешивали с раковыми клетками Molm-13 в соотношении 5:1 (ФИГ. 41), при этом TriNKET (например, CD33-TriNKET-A49, CD33-TriNKET-A44, CD33-TriNKET-C26 и CD33-TriNKET-E79) могли дозозависимо повышать цитотоксическую активность покоящихся человеческих NK-клеток в отношении раковых клеток. Пунктирная указывает на цитотоксическую активность покоящихся NK-клеток без TriNKET.
Пример 12 - Преимущество TriNKET при лечении злокачественных опухолей с высокой экспрессией FcR или в микроокружениях опухолей с высоким уровнем FcR
[00206] Терапия моноклональными антителами была одобрена для лечения многих типов рака, включая гемобластозы и солидные опухоли. Хотя применение моноклональных антител при лечении рака улучшало результаты лечения пациентов, все еще существуют ограничения. Исследования механизма действия продемонстрировали, что моноклональные антитела оказывают действие на рост опухоли посредством различных механизмов, включающих, помимо прочего, ADCC, CDC, фагоцитоз и блокаду сигналов.
[00207] Прежде всего, считается, что ADCC является основным механизмом, посредством которого моноклональные антитела оказывают свое действие. ADCC основан на взаимодействии Fc антитела с низкоаффинным FcγRIII (CD16) на поверхности естественных киллеров, которые опосредуют прямой лизис опухолевой клетки. Из всех FcγR, CD16 обладает наименьшей аффинностью к Fc IgG, FcγRI (CD64) является высокоаффинным FcR и связывается примерно в 1000 раз сильнее с Fc IgG, чем CD16.
[00208] CD64 обычно экспрессируется на многих гемопоэтических линиях, таких как миелоидная линия, и может экспрессироваться на опухолях, происходящих из этих типов клеток, таких как острый миелоидный лейкоз (ОМЛ). Иммунные клетки, инфильтрирующие опухоль, такие как MDSC и моноциты, также экспрессируют CD64 и, как известно, инфильтрируют микроокружение опухоли. Экспрессия CD64 опухолью или в микроокружении опухоли может оказывать негативное влияние на терапию моноклональными антителами. Экспрессия CD64 в микроокружении опухоли затрудняет взаимодействие этих антител с CD16 на поверхности NK-клеток, поскольку антитела предпочитают связывать высокоаффинный рецептор. Посредством направленного связывания двух активирующих рецепторов на поверхности NK-клеток, конструкции TriNKET могут преодолевать негативное влияние экспрессии CD64 на терапию моноклональными антителами.
Экспрессия FcRγI (CD64) на трех линиях клеток ОМЛ
[00209] Была разработана система культивирования in vitro для тестирования активности TriNKET и моноклональных антител против опухолей с высоким и низким уровнем поверхностной экспрессии CD64. Molm-13 и THP-1 представляют собой две линии клеток ОМЛ человека, которые имеют сходную экспрессию поверхностного CD33, однако клетки Molm-13 не экспрессируют CD64, тогда как клетки THP-1 экспрессируют CD64 на своей поверхности (ФИГ. 38A-38C). При использовании моноклональных антител или TriNKET, направленных против мишени CD33, тестировали влияние экспрессии CD64 опухолью на терапию моноклональными антителами или TriNKET. На ФИГ. 38A-38C показана экспрессия высокоаффинного FcRγI (CD64) на трех линиях клеток ОМЛ человека, клеточной линии Molm-13 (ФИГ. 38A), клеточной линии MV4-11 (ФИГ. 38B) и клеточной линии THP-1 (ФИГ. 38C). Клетки Molm-13 не экспрессируют CD64, тогда как клетки MV4-11 имеют низкий уровень, а THP-1 имеют высокий уровень CD64 на клеточной поверхности.
Конструкции TriNKET обладают преимуществом при направленном взаимодействии с опухолевыми клетками с высокой поверхностной экспрессией FcR
[00210] На ФИГ. 39А-39B показана опосредованная моноклональным антителом или TriNKET активация человеческих NK-клеток в совместной культуре с клетками Molm-13 (ФИГ. 39B) или с THP-1 (ФИГ. 39A). Моноклональное антитело против человеческого CD33 продемонстрировало хорошую активацию человеческих NK-клеток в системе совместной культуры Molm-13, что подтверждалось повышенной дегрануляцией CD107a и продукцией IFNγ. Моноклональное антитело не оказывало никакого воздействия на систему совместной культуры THP-1, где на раковых клетках присутствует высокий уровень CD64. Примечательно, что TriNKET оказались эффективными как против клеток Molm-13 (ФИГ. 39B), так и против клеток THP-1 (ФИГ. 39A), что указывает на то, что TriNKET способны преодолевать связывание с CD64 на опухоли и эффективно взаимодействовать с NK-клеток для активации. Двойное направленное связывание двух активирующих рецепторов на NK-клетках обеспечивало более сильное специфичное связывание с NK-клетками. Моноклональные антитела, которые взаимодействуют только с CD16 на NK-клетках, могут связываться другими высокоаффинными FcR и препятствовать связыванию CD16 на NK-клетках. Как показано на ФИГ. 39C, TriNKET также эффективно опосредовали активацию покоящихся человеческих NK-клеток в совместной культуре с человеческими клетками ОМЛ MV4-11.
TriNKET демонстрируют эффективность в отношении линий клеток ОМЛ независимо от экспрессии FcγRI
[00211] На ФИГ. 40А-40C показаны анализы цитотоксичности NK человека с использованием в качестве мишеней трех линий клеток ОМЛ человека. Моноклональное антитело против CD33 показало хорошую эффективность против клеток Molm-13 (ФИГ. 40B), которые не экспрессируют CD64. Клетки MV4-11 (ФИГ. 40A), которые экспрессируют CD64, но на более низком уровне, чем THP-1, показали сниженную эффективность с моноклональным антителом к CD33. Клетки THP-1 (ФИГ. 40C) не показали эффекта только с моноклональным антителом к CD33. Независимо от экспрессии CD64 на опухолевых клетках, TriNKET были способны опосредовать ответы человеческих NK-клеток против всех опухолевых клеток, протестированных в данном примере.
[00212] На ФИГ. 40А-40C показано, что клетки THP-1 были защищены от терапии моноклональным антителом из-за высокого уровня экспрессии высокоаффинного FcR на своей поверхности. TriNKET преодолевали эту защиту, воздействуя на два активирующих рецептора на поверхности NK-клеток. Данные цитотоксичности непосредственно коррелировали с результатами, которые наблюдали в экспериментах активации в совместных культурах. TriNKET могли преодолевать защиту от терапии мАт, наблюдаемой у клеток THP-1, и вызывали опосредованный NK-клетками лизис несмотря на высокий уровень FcR.
Пример 13 - Цитолиз нормальных миелоидных и нормальных B-клеток в культурах МКПК: TriNKET обеспечивают лучший профиль безопасности в результате снижения целевых внеопухолевых побочных эффектов
[00213] Естественные киллеры и CD8 T-клетки способны непосредственно вызывать лизис опухолевых клеток, хотя механизмы, посредством которых NK-клетки и CD8 T-клетки отличают нормальные аутологичные от опухолевых клеток, различаются. Активность NK-клеток регулируется балансом сигналов от активирующих (NCR, NKG2D, CD16 и т.д.) и ингибирующих (KIR, NKG2A и т.д.) рецепторов. Баланс этих активирующих и ингибирующих сигналов позволяет NK-клеткам отличать здоровые аутологичные клетки от стрессовых, инфицированных вирусами или переродившихся аутологичных клеток. Этот "встроенный" механизм аутотолерантности позволяет защитить нормальную здоровую ткань от ответов NK-клеток. Чтобы расширить этот принцип, аутотолерантность NK-клеток позволит конструкциям TriNKET адресно взаимодействовать с антигенами, экспрессируемыми как на аутологичных клетках, так и на опухолях, без внеопухолевых побочных эффектов или с расширенным терапевтическим окном.
[00214] В отличие от естественных киллеров, Т-клетки требуют распознавания специфического пептида, презентируемого молекулами МНС, для активации и эффекторных функций. T-клетки были главной целью иммунотерапии, при этом было разработано множество стратегий для перенаправления T-клеточных ответов против опухоли. Биспецифичные T-клетки, ингибиторы контрольных точек и CAR-T-клетки были одобрены FDA, однако часто они имеют недостатки, связанные с дозолимитирующим токсическим действием. Биспецифичные T-клетки и CAR-T-клетки действуют в рамках системы распознавания TCR-MHC, используя связывающие домены для направленного взаимодействия с антигенами на поверхности опухолевых клеток и используя модифицированные сигнальные домены для передачи сигналов активации в эффекторную клетку. Несмотря на то, что эти методы лечения эффективны для индукции противоопухолевого иммунного ответа, они часто сопровождаются синдромом высвобождения цитокинов (CRS) и целевыми внеопухолевыми побочными эффектами. TriNKET уникальны в этом отношении, поскольку они не будут "блокировать" природные системы активации и ингибирования NK-клеток. Напротив, TriNKET сконструированы с возможностью поддержания баланса и обеспечения дополнительных сигналов активации для NK-клеток, сохраняя при этом толерантность NK-клеток к здоровым аутологичным клеткам.
[00215] МКПК выделяли из цельной крови с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Оставшиеся контаминирующие эритроциты лизировали при инкубировании в лизисном буфере ACK. МКПК промывали 3 раза в PBS и подсчитывали общее количество МКПК. МКПК доводили до плотности 106/мл в среде для первичной культуры клеток. 1 мл МКПК сеяли в лунки 24-луночного планшета, указанные TriNKET или мАт добавляли к культурам МКПК в количестве 10 мкг/мл. Клетки культивировали в течение ночи при 37°C в 5% CO2. На следующий день (через 24 часа) МКПК собирали из культуры и подготавливали к FACS анализу. Процент CD45+; CD19+ B-клеток и CD45+; CD33+; CD11b+ миелоидных клеток определяли в различных группах лечения.
[00216] На ФИГ. 42A показано, что B-клетки (CD33-отрицательные) от здорового донора не подвергались воздействию CD33-направляющего TriNKET. МКПК, обработанные TriNKET, направленно взаимодействующими с CD33, не показали воздействия на популяцию CD45+, CD3-, CD56- лимфоцитов. На ФИГ. 42B показано, что аутологичные CD33+ миелоидные клетки были защищены от опосредованных CD33-направляющими TriNKET ответов NK-клеток и, следовательно, были устойчивы к TriNKET-опосредованному лизису. В этих культурах частота CD45+, CD33+, CD11b+ миелоидных клеток не изменялась при инкубировании с CD33-направляющими TriNKET.
ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ОТСЫЛКИ
[00217] Полное описание каждого из патентных документов и научных статей, указанных в настоящем документе, включено посредством отсылки во всех отношениях.
ЭКВИВАЛЕНТЫ
[00218] Изобретение может быть осуществлено в других конкретных формах без отступления от его сущности или существенных характеристик. Таким образом, предыдущие варианты осуществления следует во всех отношениях считать иллюстративными, а не ограничивающими изобретение, описанное в настоящем документе. Таким образом, объем изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения, а не предыдущим описанием, при этом все изменения, которые находятся в пределах значения и диапазона эквивалентности формулы изобретения, должны быть включены в него.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> ADIMAB, LLC.
<120> БЕЛКИ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ CD33, NKG2D И CD16
<130> DFY-007PC
<140>
<141>
<150> 62/461,145
<151> 2017-02-20
<160> 140
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 3
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 4
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 5
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 6
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 7
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 7
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 8
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Tyr Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 9
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 9
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 10
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 10
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 11
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Gly Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 12
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 12
Glu Leu Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Asp Ile Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 13
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 15
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 15
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 16
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 18
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Phe Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 19
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 19
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 20
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ile Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 21
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 22
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 22
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 23
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 24
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 24
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Phe Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 25
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 25
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 26
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Phe Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 27
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 27
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 28
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Phe Ser Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 29
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 29
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 30
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Ser Tyr Ser Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 31
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 32
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 32
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Phe Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 33
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 33
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 34
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 34
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 35
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 35
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 36
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 36
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 37
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 38
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 38
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Leu Tyr Ser Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 39
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 39
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 40
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Thr Phe Ile Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 41
<211> 125
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 42
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 43
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 43
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 44
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 44
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 45
<211> 117
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 45
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Glu Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 47
<211> 126
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Arg Lys Ala Ser Gly Ser Phe Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 48
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Glu Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 49
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Phe Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Gly Leu Gly Asp Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 50
<211> 110
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 50
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Tyr Asp Asp Leu Leu Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Phe Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
85 90 95
Asn Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 51
<211> 115
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 51
Gln Val His Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Asp Asp Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly His Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Asn Trp Asp Asp Ala Phe Asn Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr
100 105 110
Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Homo sapiens
<400> 52
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65 70 75 80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro
85 90 95
Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 53
<211> 364
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 53
Met Pro Leu Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Trp Ala Gly Ala Leu Ala
1 5 10 15
Met Asp Pro Asn Phe Trp Leu Gln Val Gln Glu Ser Val Thr Val Gln
20 25 30
Glu Gly Leu Cys Val Leu Val Pro Cys Thr Phe Phe His Pro Ile Pro
35 40 45
Tyr Tyr Asp Lys Asn Ser Pro Val His Gly Tyr Trp Phe Arg Glu Gly
50 55 60
Ala Ile Ile Ser Arg Asp Ser Pro Val Ala Thr Asn Lys Leu Asp Gln
65 70 75 80
Glu Val Gln Glu Glu Thr Gln Gly Arg Phe Arg Leu Leu Gly Asp Pro
85 90 95
Ser Arg Asn Asn Cys Ser Leu Ser Ile Val Asp Ala Arg Arg Arg Asp
100 105 110
Asn Gly Ser Tyr Phe Phe Arg Met Glu Arg Gly Ser Thr Lys Tyr Ser
115 120 125
Tyr Lys Ser Pro Gln Leu Ser Val His Val Thr Asp Leu Thr His Arg
130 135 140
Pro Lys Ile Leu Ile Pro Gly Thr Leu Glu Pro Gly His Ser Lys Asn
145 150 155 160
Leu Thr Cys Ser Val Ser Trp Ala Cys Glu Gln Gly Thr Pro Pro Ile
165 170 175
Phe Ser Trp Leu Ser Ala Ala Pro Thr Ser Leu Gly Pro Arg Thr Thr
180 185 190
His Ser Ser Val Leu Ile Ile Thr Pro Arg Pro Gln Asp His Gly Thr
195 200 205
Asn Leu Thr Cys Gln Val Lys Phe Ala Gly Ala Gly Val Thr Thr Glu
210 215 220
Arg Thr Ile Gln Leu Asn Val Thr Tyr Val Pro Gln Asn Pro Thr Thr
225 230 235 240
Gly Ile Phe Pro Gly Asp Gly Ser Gly Lys Gln Glu Thr Arg Ala Gly
245 250 255
Val Val His Gly Ala Ile Gly Gly Ala Gly Val Thr Ala Leu Leu Ala
260 265 270
Leu Cys Leu Cys Leu Ile Phe Phe Ile Val Lys Thr His Arg Arg Lys
275 280 285
Ala Ala Arg Thr Ala Val Gly Arg Asn Asp Thr His Pro Thr Thr Gly
290 295 300
Ser Ala Ser Pro Lys His Gln Lys Lys Ser Lys Leu His Gly Pro Thr
305 310 315 320
Glu Thr Ser Ser Cys Ser Gly Ala Ala Pro Thr Val Glu Met Asp Glu
325 330 335
Glu Leu His Tyr Ala Ser Leu Asn Phe His Gly Met Asn Pro Ser Lys
340 345 350
Asp Thr Ser Thr Glu Tyr Ser Glu Val Arg Thr Gln
355 360
<210> 54
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 54
Gly Ser Phe Ser Gly Tyr Tyr Trp Ser
1 5
<210> 55
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 55
Glu Ile Asp His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 56
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 56
Ala Arg Ala Arg Gly Pro Trp Ser Phe Asp Pro
1 5 10
<210> 57
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 57
Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser
1 5
<210> 58
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 58
Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 59
<211> 18
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 59
Ala Arg Gly Asp Ser Ser Ile Arg His Ala Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
1 5 10 15
Asp Val
<210> 60
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 60
Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 61
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 61
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 62
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 62
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Ile Thr
1 5
<210> 63
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 63
Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly
1 5 10
<210> 64
<211> 16
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 64
Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210> 65
<211> 13
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 65
Ala Arg Gly Ser Asp Arg Phe His Pro Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 66
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 67
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 67
Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr
1 5
<210> 68
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 68
Gln Gln Phe Asp Thr Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 69
<211> 121
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 69
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 70
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 71
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 71
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5
<210> 72
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 72
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 73
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 73
Ala Lys Asp Gly Gly Tyr Tyr Asp Ser Gly Ala Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 74
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 74
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 75
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 75
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 76
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 76
Gln Gln Gly Val Ser Tyr Pro Arg Thr
1 5
<210> 77
<211> 122
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 78
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 79
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 79
Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn
1 5
<210> 80
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 80
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 81
<211> 15
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 81
Ala Arg Gly Ala Pro Met Gly Ala Ala Ala Gly Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210> 82
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 82
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210> 83
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 83
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 84
Gln Gln Gly Val Ser Phe Pro Arg Thr
1 5
<210> 85
<211> 124
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 85
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp
100 105 110
Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 86
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 86
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 87
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 87
Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 88
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 88
Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 89
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 89
Ala Arg Asp Thr Gly Glu Tyr Tyr Asp Thr Asp Asp His Gly Met Asp
1 5 10 15
Val
<210> 90
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 90
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 91
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 91
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 92
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 92
Gln Gln Asp Asp Tyr Trp Pro Pro Thr
1 5
<210> 93
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 93
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Ser Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 94
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 94
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 95
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 95
Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
1 5
<210> 96
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 96
Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Gly
1 5 10
<210> 97
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 97
Gly Arg Pro Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 98
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 98
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn
1 5 10
<210> 99
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 99
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 100
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 100
Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 101
<211> 116
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 101
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser
20 25 30
Asn Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asn Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Asn Pro Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Asn Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 102
<211> 111
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 102
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Asp Asn Tyr
20 25 30
Gly Ile Arg Phe Leu Thr Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Met Tyr Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser Gly Val Pro Ser
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Lys
85 90 95
Glu Val Pro Trp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Val Lys
100 105 110
<210> 103
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 103
Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Ser
1 5
<210> 104
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 104
Tyr Ile Tyr Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Asp
1 5 10
<210> 105
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 105
Gly Asn Pro Trp Leu Ala Tyr
1 5
<210> 106
<211> 12
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 106
Glu Ser Leu Asp Asn Tyr Gly Ile Arg Phe Leu Thr
1 5 10
<210> 107
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 107
Ala Ala Ser Asn Gln Gly Ser
1 5
<210> 108
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 108
Gln Gln Thr Lys Glu Val Pro Trp Ser
1 5
<210> 109
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 109
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Val Ile Tyr Pro Gly Asn Asp Asp Ile Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 110
<211> 113
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 110
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Phe Phe Ser
20 25 30
Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 111
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 111
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
1 5
<210> 112
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 112
Tyr Pro Gly Asn Asp Asp
1 5
<210> 113
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 113
Glu Val Arg Leu Arg Tyr Phe Asp Val
1 5
<210> 114
<211> 14
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 114
Gln Ser Val Phe Phe Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 115
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 115
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 116
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 116
His Gln Tyr Leu Ser Ser Arg Thr
1 5
<210> 117
<211> 118
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 117
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Asp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ala Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Tyr Glu Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala
115
<210> 118
<211> 108
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 118
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 119
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 119
Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
1 5
<210> 120
<211> 6
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 120
Tyr Pro Gly Asp Gly Ser
1 5
<210> 121
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 121
Gly Tyr Glu Asp Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 122
<211> 8
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 122
Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Ser
1 5
<210> 123
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 123
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1 5
<210> 124
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 124
Leu Gln Tyr Asp Glu Phe Pro Leu Thr
1 5
<210> 125
<211> 120
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Val Val His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Arg Tyr Glu Val Tyr Gly Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 126
<211> 106
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
полипептид
<400> 126
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Pro Val Glu Ala Asn
65 70 75 80
Asp Thr Ala Asn Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Tyr Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 127
<211> 5
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 127
Asp Tyr Val Val His
1 5
<210> 128
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 128
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 129
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 129
Asp Tyr Arg Tyr Glu Val Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 130
<211> 10
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 130
Thr Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile His
1 5 10
<210> 131
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 131
Asp Thr Ser Lys Val Ala Ser
1 5
<210> 132
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический
пептид
<400> 132
Gln Gln Trp Arg Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 133
<211> 126
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 133
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 134
<211> 107
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 134
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 135
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 135
Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Tyr Met His
1 5
<210> 136
<211> 17
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 136
Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 137
<211> 19
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 137
Ala Arg Gly Ala Pro Asn Tyr Gly Asp Thr Thr His Asp Tyr Tyr Tyr
1 5 10 15
Met Asp Val
<210> 138
<211> 11
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 138
Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 139
<211> 7
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 139
Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr
1 5
<210> 140
<211> 9
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Описание искусственной последовательности: Синтетический пептид
<400> 140
Gln Gln Tyr Asp Asp Trp Pro Phe Thr
1 5
<---
Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены мультиспецифичные связывающие белки, которые связывают CD33, рецептор NKG2D и CD16, а также фармацевтические композиции и терапевтические способы, полезные для лечения рака. Изобретение обеспечивает улучшенную активацию NK-клеток в результате связывания двух активирующих рецепторов. 5 н. и 12 з.п. ф-лы, 57 ил., 9 табл., 13 пр.
1. Мультиспецифичный связывающий белок, который связывается с NKG2D, CD33 и CD16, включающий:
(a) первый антигенсвязывающий участок молекулы иммуноглобулина, который связывает NKG2D, где первый антигенсвязывающий участок включает вариабельный домен тяжелой цепи (VH) и вариабельный домен легкой цепи (VL);
(b) второй антигенсвязывающий участок молекулы иммуноглобулина, который связывает CD33, где второй антигенсвязывающий участок включает VH и VL; и
(c) Fc-домен человеческого IgG1 антитела, которое связывается с CD16,
где человеческое IgG1 антитело включает первый Fc-домен человеческого IgG1 антитела и второй Fc-домен антитела IgG1 человека, и где VH или VL первого антигенсвязывающего участка связан первым Fc-доменом человеческого IgG1 антитела, и где VH или VL второго антигенсвязывающего участка связан со вторым Fc-доменом человеческого IgG1 антитела; и, где первый антигенсвязывающий участок включает:
(i) VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:13, и VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:14;
(ii) VH, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:45, и VL, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:46;
(iii) VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:71, VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:72, VH CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:73, VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:74, VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:75, и VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:76;
(iv) VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:79, VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:80, VH CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:81, VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:82, VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:83, и VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:84; или
(v) VH CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:135, VH CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:136, VH CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:137, VL CDR1, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:138, VL CDR2, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:139, и VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:140.
2. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 1, где первый антигенсвязывающий участок связывается с NKG2D человека и примата, не являющегося человеком.
3. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 1, где VH первого антигенсвязывающего участка и VL первого антигенсвязывающего участка присутствуют на одном полипептиде.
4. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 1, где VH второго антигенсвязывающего участка и VL второго антигенсвязывающего участка присутствуют на одном полипептиде.
5. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 1, где VH второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:93, и VL второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:94.
6. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 1, где VH второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:101, и VL второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:102.
7. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 1, где VH второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:109, и VL второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:110.
8. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 1, где VH второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:117, и VL второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:118.
9. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 1, где VH второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:125, и VL второго антигенсвязывающего участка включает аминокислотную последовательность SEQ ID NO:126.
10. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 1, где Fc-домен человеческого IgG1 антитела включает шарнирный и CH2 домены.
11. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 10, где Fc-домен человеческого IgG1 антитела включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотам 234-332 человеческого IgG1 антитела.
12. Мультиспецифичный связывающий белок по п. 10, где Fc-домен человеческого IgG1 антитела включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична Fc-домену человеческого IgG1, и отличается в одном или более положениях, выбранных из группы, состоящей из Q347, Y349, T350, L351, S354, E356, E357, K360, Q362, S364, T366, L368, K370, N390, K392, T394, D399, S400, D401, F405, Y407, K409, T411 и K439.
13. Лекарственная форма для лечения рака, включающая мультиспецифичный связывающий белок по любому из предыдущих пунктов и фармацевтически приемлемый носитель.
14. Клетка-хозяин для продуцирования мультиспецифичного связывающего белка по любому из пп. 1-12, включающая одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих полипептид мультиспецифичного связывающего белка по любому из пп. 1-12.
15. Способ непосредственного и/или опосредованного усиления цитолиза опухолевой клетки, включающий контакт опухолевой клетки и клетки естественного киллера с мультиспецифичным связывающим белком по любому из пп. 1-12.
16. Способ лечения рака, где способ включает введение пациенту мультиспецифичного связывающего белка по любому из пп. 1-12 или лекарственной формы по п. 13.
17. Способ по п. 16, где рак выбран из группы, состоящей из острого миелоидного лейкоза (ОМЛ), миелодиспластических синдромов, хронического миеломоноцитарного лейкоза, миелоидного бластного криза при хроническом миелоидном лейкозе и различных форм острых лимфообластных лейкозов (ОЛЛ).
| GLEASON M.K | |||
| et al | |||
| Устройство для электрической сигнализации | 1918 |
|
SU16A1 |
| Устройство для разметки подлежащих сортированию и резанию лесных материалов | 1922 |
|
SU123A1 |
| Способ изготовления электрических сопротивлений посредством осаждения слоя проводника на поверхности изолятора | 1921 |
|
SU19A1 |
| US 2004038339 A1, 26.02.2004 | |||
| US 2016122432 A1, 05.05.2016 | |||
| FELICES M | |||
| et al | |||
| Generation of BiKEs and TriKEs to Improve NK Cell-Mediated Targeting of Tumor Cells | |||
| In: | |||
