СПОСОБ ПОВЫШЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА БЕЛКА РЕЗИСТЕНТНОСТИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В ЭКСПЕРИМЕНТЕ НА КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ ГЕПАТОЦЕЛЛЮЛЯРНОЙ КАРЦИНОМЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2023 года по МПК A61K31/00 C12N5/00 A61K31/57 

Изобретение относится к медицине, а именно к биологической химии, фармакологии и клинической фармакологии, и предназначено для индуцирования белка резистентности рака молочной железы (breast cancer resistance protein, BCRP, ABCG2) в эксперименте на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2.

BCRP локализован в синцитиотрофобластах плаценты, эпителиоцитах тонкой кишки, гепатоцитах, эпителиоцитах почечных канальцев, в эндотелиоцитах микрососудов головного мозга, в клетках молочной железы и участвует в транспорте широкого спектра эндогенных и экзогенных субстратов (стероидных гормонов и их метаболитов, желчных кислот, уратов), в том числе многих лекарственных веществ (противоопухолевых средств, блокаторов кальциевых каналов, противовирусных препаратов, фторхинолонов, антибиотиков, статинов, ингибиторов протоновой помпы). Экспрессируясь в клетках печени, данный белок-транспортер обеспечивает выведение субстратов с желчью. Для изучения транспорта лекарственных веществ печеночными клетками в эксперименте in vitro применяется клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2, гиперэкспрессирующая BCRP.

Известен ряд ингибиторов BCRP (антиретровирусные препараты, противоопухолевые средства, блокаторы протоновой помпы, антигипертензивные препараты), однако лекарственных препаратов, индуцирующих активность и количество данного белка-транспортера в настоящее время не выявлено [Zattoni I.F., Delabio L.C., Dutra J..P, Kita D.H., Scheiffer G., Hembecker M., Pereira G.D.S., Moure V.R., Valdameri G. Targeting breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2): Functional inhibitors and expression modulators. Eur. J. Med. Chem. 2022 Jul 5; 237: 114346].

Известно, что инкубация клеток линии клеток хориокарциномы человека (BeWo cells) с прогестероном (1-10 мкМ) в течение 72 ч повышает экспрессию мРНК и белка BCRP в два раза [Wang H., Lee E.W., Zhou L., Leung, P. C., Ross, D. D., Unadkat, J. D. et al. Progesterone receptor (PR) isoforms PRA and PRB differentially regulate expression of the breast cancer resistance protein in human placental choriocarcinoma BeWo cells. Mol. Pharmacol. 2008; 73(3): 845-854]. Кроме того, прогестерон снижает внутриклеточное накопление маркерного субстрата BCRP, митоксантрона, в клетках BeWo, что свидетельствует об увеличении его активности [Wang H., Lee E.W., Zhou L., Leung, P. C., Ross, D. D., Unadkat, J. D. et al. Progesterone receptor (PR) isoforms PRA and PRB differentially regulate expression of the breast cancer resistance protein in human placental choriocarcinoma BeWo cells. Mol. Pharmacol. 2008; 73(3): 845-854]. Однако данная клеточная линия применяется в качестве модели плацентарного транспорта [Prouillac C., Lecoeur S. The role of the placenta in fetal exposure to xenobiotics: importance of membrane transporters and human models for transfer studies. Drug Metab. and Disp.2010; 38(10): 1623-1635].

Следует отметить, что способа повышения количества белка резистентности рака молочной железы в эксперименте на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 для исследования транспорта субстратов данного транспортера гепатоцитами в настоящее время не разработано.

Техническим результатом настоящего изобретения является разработка доступного и эффективного способа повышения количества белка резистентности рака молочной железы в эксперименте на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2.

С данной целью был выполнен эксперимент на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) (ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных», Санкт-Петербург, Россия), которая была получена из ФГБУН ИНЦ РАН, Санкт-Петербург.Клетки культивировали при 37°С и 5% содержании СО₂ в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы (4500 мг/л) («Sigma-Aldrich», Германия), содержащей L-глутамин (4 мМ) («Sigma-Aldrich», Германия), 10% фетальной бычьей сыворотки («Sigma-Aldrich», Германия), 100 ЕД/мл пенициллина («Sigma-Aldrich», Германия) и 100 мкг/мл стрептомицина («Sigma-Aldrich», Германия) на 6-луночных планшетах («Corning», США). После образования монослоя клетки использовали в экспериментах.

После чего для активации BCRP в культуральную среду добавляли прогестерон («Sigma-Aldrich», Германия) до достижения его концентрации 10 и 100 мкМ и инкубировали в течение 24 ч. На каждый эксперимент было выполнено по 3 повторения. Контрольным клеткам в эквивалентном объеме в культуральную среду добавляли воду для инъекций.

Определение относительного количества BCRP в клетках линии HepG2 проводили методом вестерн-блот. 20 мкг белков супернатанта подвергали электрофорезу с использованием TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit («Bio-Rad», США) в буферной системе Laemmli («BioRad», США). Образцы смешивали с буфером Laemmli («Bio-Rad», США), содержащим 50 мМ 2-меркаптоэтанола («Bio-Rad», США) в соотношении 1:3, инкубировали 10 мин при температуре 70°C. Гели прогоняли при 100 В в течение 90 мин. Детекцию белка BCRP проводили с использованием первичных мышиных моноклональных антител (CD338 (ABCG2) Monoclonal Antibody (5D3) «Invitrogen», США) в разведении 1:200 в блокирующем растворе Casein blocker («Bio-Rad», США) в течение 2 ч при 37°C. Визуализацию первичных антител осуществляли с использованием вторичных кроличьих антител (Rabbit-anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP, «Invitrogen») в разведении 1:4000 и инкубацией в течение 1 ч при комнатной температуре.

Полученные результаты анализировали с помощью программ «StatSoft Statistica 13.0» (США, номер лицензии JPZ811I521319AR25ACD-W) и Microsoft Excel for MAC ver. 16.24 (ID02984-001-000001). Результаты представлены в виде M±SD. Для оценки статистической значимости различий использовали дисперсионный анализ (ANOVA), попарные сравнения выполняли с помощью критерия Ньюмена-Кейлса. Статистически значимыми считали различия при p<0.05.

Установлено, что влияние прогестерона повышало количество BCRP в клетках линии HepG2 при концентрации 10 мкМ на 105,1% (р<0.05) и 100 мкМ на 79,5% (р<0.05) по сравнению с показателями контроля.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1. Относительное количество BCRP в клетках линии HepG2 в интактных клетках (1) при воздействии прогестерона в концентрациях 10 (2), 100 мкМ (3). Примечание: к -контроль; * - p<0,05 по сравнению с контролем

Таким образом, для повышения количества BCRP в клетках линии гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2) необходимо добавление в Дульбекко модифицированную среду Игла прогестерона до достижения его концентрации в среде концентрации 10 и 100 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов.

Способ был использован при изучении фармакокинетики лекарственных веществ - субстратов BCRP в трех экспериментах.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу индуцирования белка резистентности рака молочной железы (breast cancer resistance protein, BCRP, ABCG2) в эксперименте на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 путем культивирования клеток человека в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы, бычьей сыворотки, пенициллина и стрептомицина до образования монослоя с последующим добавлением в культуральную среду прогестерона до достижения его концентрации 10 и 100 мкМ и инкубацией в течение 24 часов. Изобретение позволяет разработать доступный способ повышения количества белка резистентности рака молочной железы в эксперименте на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2. 1 ил., 1 пр.

Способ повышения количества белка резистентности рака молочной железы в эксперименте на клеточной линии гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2, включающий использование прогестерона, отличающийся тем, что культивирование линии клеток гепатоцеллюлярной карциномы человека проводили в Дульбекко модифицированной среде Игла с содержанием глюкозы 4500 мг/л, содержащей L-глутамин 4 мМ, 15% бычьей сыворотки, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина до образования монослоя с последующим добавлением в культуральную среду прогестерона до достижения его концентрации 10 и 100 мкМ с последующей инкубацией в течение 24 часов.