Способ получения смеси биологически активных веществ: биогенных аминов гистамина, триптамина, тирамина, кинуренина, а также производного кинуренина - кинуреновой кислоты Российский патент 2024 года по МПК A61K31/136 A61K31/137 A61K31/192 A61K31/198 A61K31/4045 A61K31/417 B01D11/02 

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, и может быть использовано для получения биологически активных веществ из растительного сырья, а конкретно - ряда биогенных аминов и производного биогенного амина с использованием сырья моховидного растения - яванского мха (Vesicularia dubyana). Содержание в растительной массе моховидных растений ряда биогенных аминов (и их производных) и возможность реализации способа получения биогенных аминов путем экстракции из растительного сырья дают возможность применения предлагаемого изобретения в фармацевтических и биомедицинских производствах.

Vesicularia dubyana (В. Muller) Brotherus (1908), или яванский мох, относится к семейству Hypnaceae (Гипновые). В естественной среде яванский мох обильно растет в регионах с жарким и влажным климатом. Растение часто встречается в Индии, Малайзии, юго-восточных азиатских странах, на острове Ява. Яванский мох растет на сухих и влажных участках, на почве, на стволах деревьев и камнях, часто на берегах периодически разливающихся рек. V. dubyana представляет собой однодомный многолетний мох, образующий своей рыхлой или густой листвой темно-зеленые подушки. Растение характеризуется мягким, зачастую разветвленным стеблем, длиной до 17 см. Ризоиды кустистые, красновато-коричневые. Боковые ветви неравномерные, одно- или многократно ветвящиеся. Длина боковых ветвей составляет от 5 до 22 мм длиной, листья расположены или по кругу, или двусторонние. Листья прямостоячие, полые, слегка асимметричные, ланцетные до яйцевидных, с остроконечной или вытянутой верхушкой, длиной около 1 мм. Листовая пластинка зубчатая.

Подобно иным моховидным растениям V. dubyana размножается спорами. Длина ножки коробочки составляет от 15 до 30 мм. Ножка красная, закрученная. Коробочка горизонтальная, с крышкой и коротким кончиком, длиной 1,0-1,5 мм, шириной 0,5-0,7 мм. Цвет коробочек в период созревания красно-коричневый. В другое время споры зеленые, гладкие и округлые. Период созревания спор может длиться до двух месяцев.

V. dubyana выступают распространенным растением в аквакультуре. Взрослые растения образуют заросли, которые служат убежищем для мальков рыб, а также являются субстратом для нереста рыб.

Биогенные амины представляют собой азотистые органические основания с низкой молекулярной массой, образованные декарбоксилированием аминокислот под действием ферментных систем растений и микроорганизмов, являются биологически активными молекулами, которые оказывают влияние на центральную нервную и сосудистую системы у животных и человека. Типовыми представителями биогенных аминов выступают гистамин, кинуренин, кинуреновая кислота, триптамин, тирамин и др.

Гистамин относится к классу имидазолов, представляющих собой имидазол, замещенный в положении С-4 2-аминоэтильной группой. Образуется в организмах при декарбоксилировании гистидина, катализируемого гистидиндекарбоксилазой. Является одним из эндогенных медиаторов, участвующих в регуляции жизненно важных функций организма и играющих важную роль в патогенезе ряда болезненных состояний.

Кинуренин является ароматической аминокислотой, которая представляет собой продукт метаболизма триптофана. Кинуренин представляет собой предшественника кинуреновой кислоты и интермедиата в превращении триптофана в ниацин.

Кинуреновая кислота - производное кинуренина - представляет собой хинолин-2-карбоновую кислоту, замещенную гидроксильиной группой в положении С-4. Играет роль агониста рецептора, связанного с G-белком, антагониста ионотропного рецептора глутамата, селективно связывающий N-метил-D-аспартат (NMDA, НМДА), антагониста никотина, нейропротекторного агента и метаболита человека.

Триптамин представляет собой моноаминный алкалоид, производное индола. Триптамин является промежуточным звеном при биосинтезе большинства индольных алкалоидов и алкалоидов группы хинина. Триптамин играет роль нейромедиатора и нейротрансмиттера в головном мозге млекопитающих.

Тирамин представляет собой первичное аминосоединение, полученное декарбоксилированием тирозина. Непрямой симпатомиметик, естественным образом встречающийся в сыре и других пищевых продуктах. Тирамин напрямую не активирует адренорецепторы, но может служить субстратом для систем захвата адренергических клеток и моноаминооксидазы для пролонгирования действия адренергических трансмиттеров. Он также провоцирует высвобождение медиатора из адренергических окончаний нейронов и является нейротрансмиттером у некоторых беспозвоночных.

Несмотря на достаточно широкий интерес к биогенным аминам в экспериментальной и клинической медицине, реальное производство субстанций во всем мире относительно невелико и не превышает десятков килограммов в год. В связи с этим для производства используются малотоннажные полупромышленные установки. С учетом ограниченного объема производства стоимость конечного (целевого) продукта по любой из известных технологических схем высока и составляет, например, для гистамина более 1000 $ за 100 мг (Merck).

Из уровня техники известно, что существует несколько способов получения биогенных аминов. Так, известен биотехнологический способ получения гистамина путем бактериального декарбоксилирования гистидина (Авторское свидетельство SU 166355 А1 - «Способ получения гистамина»). Указанный способ неудобен из-за продолжительности производственного цикла, вырождения культур продуцентов и необходимостью их регулярных микробиологических пересевов. В качестве сырья используется ценный продукт - гистидин, что делает способ получения дорогостоящим. Также, продуцируемого микроорганизмами фермента, декарбоксилирующего сырье, недостаточно для конверсии всего объема гистидина.

Другой биотехнологический способ получения гистамина представлен в патенте РФ RU 2628536 С2 - "Получение и применение бактериального гистамина", (он же - патент WO 2013011137 A1 - "Production and use of bacterial histamine"). Патент описывает способ локального биосинтеза гистамина в желудочно-кишечном тракте млекопитающих молочнокислыми бактериями. Недостатком данного метода является локальное производство гистамина культурой микроорганизмов внутри организма реципиента и малыми выходами целевого продукта в пересчете на общую биомассу. Принимая во внимание, что биосинтез целевого продукта происходит внутри организма млекопитающих (в т.ч. и человека), выделение целевого продукта - гистамина - при этом способе невозможно.

Известен химический способ получения тирамина, приведенный в патенте РФ RU 2218326 С2 - "Способ получения 4-(2-аминоэтил)фенола". Приведенный патент позволяет с высоким выходом получить тирамин из доступного исходного соединения в две химические стадии, а именно получать гидробромид тирамина из фенола без выделения и очистки промежуточного вещества - 4-(2-бромэтилфенола). Недостатком данного способа является то, что высокая чистота целевого продукта достигается путем использования дорогого химического сырья, а также получением побочных продуктов в виде летучих и токсичных компонентов, энерго- и трудозатратных для утилизации.

Химических и биотехнологических способов получения кинуренина, кинуреновой кислоты, и используемых в производстве, не выявлено. Не описаны и технические решения, посвященные одновременному получению нескольких биогенных аминов и/или их производных.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является патент на изобретение RU 2628536 С2 - "Получение и применение бактериального гистамина", WO 2013011137 A1 - "Production and use of bacterial histamine"). Недостатки данного технического решения отмечены выше. Также в отличие от данного известного способа, основным биологическим агентом которого являются штаммы микроорганизмов с нестабильным, неустойчивым и высокоадаптивным генетическим аппаратом, в рамках предлагаемого нами изобретения использованы растения, выращенные в лабораторных условиях и характеризующиеся стабильным генетическим аппаратом.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является разработка способа одновременного получения ряда биологически активных веществ: биогенных аминов гистамина, триптамина, тирамина, кинуренина и его производного - кинуреновой кислоты из растительного сырья, а именно - из моховидного растения Vesicularia dubyana.

Технический результат - получение ряда биогенных аминов гистамина, триптамина, тирамина, кинуренина и его производного - кинуреновой кислоты значительно дешевле, без использования многостадийных процессов химического и биотехнологического синтеза, а также отсутствие токсичных отходов в виде органических растворителей, аммиака и других химических агентов.

Технический результат достигается тем, что предлагаемый способ получения ряда биологически активных веществ: биогенных аминов гистамина, триптамина, тирамина, кинуренина и его производного - кинуреновой кислоты - включает измельчение биомассы моховидного растения Vesicularia dubyana, экстрагирование из измельченной растительной биомассы смеси биологически активных веществ в присутствии растворителя - метилового либо этилового спирта - в соотношении измельченная биомасса растения : растворитель, равном 1 к 10, в условиях качающего перемешивания на протяжении 1 часа, затем центрифугирование при скорости 4 тыс. об/мин на протяжении 10 минут, далее охлаждение в термостате при температуре 6°С на протяжении 8 часов, после чего повторное центрифугирование при 13,5 тыс. об/мин и далее отфильтровывание полученного экстракта.

Разработанный способ обладает рядом преимуществ ввиду упрощения и удешевления процессов получения ряда биогенных аминов за счет следующих факторов:

- моховидные растения могут быть выращены (культивированы) в контролируемых, неконтролируемых и в условно контролируемых условиях (температурные условия, условия освещенности, тип и состав спектра света);

- моховидные растения могут быть выращены в питательных средах с низкой концентрацией минеральных элементов, на уровне содержания последних в водопроводной воде;

- моховидные растения могут быть выращены в средах и в воде без добавления низкомолекулярных гормонов;

- моховидные растения могут синтезировать метаболиты в нестерильных условиях. Изобретение иллюстрируется следующими чертежами:

Фиг. 1 - а) Хроматограмма кинуренина 209.0 Да (диагностические ионы 192,0 Да, 146.0 Да, 94.0 Да) и б) кинуреновой кислоты 190.0 Да (диагностические ионы 172.0 а, 162.0 Да, 144.0 Да) обнаруженные в образцах мха V. dubyana, выращенного в лабораторных условиях.

Фиг. 2 - Хроматограмма экстракта образца мха V. dubyana, выращенного в лабораторных условиях. Молекулярный ион тирамина 138.0 Да (диагностические ионы 121.1 Да, 103.0 Да, 93.1 Да, 91.0 Да, 77.0 Да)

Фиг. 3 - Хроматограмма экстракта образца мха V. dubyana, выращенного в лабораторных условиях. Молекулярный ион триптамина 161.0 Да (диагностический ион 144.0 Да)

Фиг. 4 - Хроматограмма раствора стандартного образца гистамина дигидрохлорида 2 мг/л. Молекулярный ион гистамина 112.0 Да (диагностические ионы 95.1 Да, 83.0 Да, 68.0 Да)

Фиг. 5 - Хроматограмма экстракта образца мха V. dubyana, выращенного в лабораторных условиях. Молекулярный ион гистамина 112.0 Да (диагностические ионы 95.1 Да, 83.0 Да, 68.0 Да)

Фиг. 6 - Хроматограмма экстракта культуральной жидкости мха V. dubyana, выращенного в лабораторных условиях. Молекулярный ион гистамина 112.0 Да (диагностические ионы 95.1 Да, 83.0 Да, 68.0 Да.

Способ осуществляется следующим образом.

Растения яванского мха V. dubyana выращивали в лабораторных условиях, при комнатной температуре в диапазоне 18-25°С. Для выращивания мха использовали полипропиленовые прозрачные контейнеры. Контейнеры наполняли наполовину разными составами: водопроводной водой, питательной средой Тамия в различных концентрациях (от 1 до 10%). Среду Тамия готовили в соответствии с ПНД Ф Т 14.1:2:4.10-2004 Т 16.1:23:3.7-2004. Водопроводную воду предварительно отстаивали в пластиковых емкостях. Замену воды в культивационных установках проводили каждые 10 дней. Для освещения использовали фитолампы с фотопериодом 12/12 ч., фотосинтетическим фотонным потоком 9 мкмоль/с. Для перемешивания водной массы в контейнере использовали погружную аквариумную помпу. Выращивание проводили на протяжении 4 недель, или до прироста биомассы в объеме не менее чем на 50%.

Образцы растительной массы V. dubyana измельчали с помощью стеклянного пестика. Образцы экстрагировали 100% метиловым спиртом (ХЧ), 96% этиловым спиртом. Навеску измельченной биомассы растений помещали в полипропиленовые пробирки, в присутствии десятикратного объема растворителя. Так, на 1 г V. dubyana использовали 10 мл спирта, после чего оставляли в условиях качающего перемешивания на протяжении 1 часа. Образцы центрифугировали при скорости 4 тыс. об/мин на протяжении 10 минут. Затем образцы помещали в термостат при температуре 6°С на 8 часов, после чего образцы повторно центрифугировали при 13,5 тыс. об/мин и переносили в виалы, предварительно профильтровав экстракты через PTFE шприцевые фильтры (0,45 мкм).

Содержание в полученном из измельченного растительного сырья V. dubyana целевых продуктов подтверждено путем хромато-масс-спектрометрического анализа. Общий хромато-масс-спектрометрический анализ образцов проводили на базе хромато-масс-спектрометра Agilent Technologies Infinity II с масс-спектрометрическим детектором 6470 В. Хроматографические условия представлены в таблице 1.

Режимы хроматографирования и работы масс-спектрометрического детектора представлены в таблицах 2 и 3.

Выявление в полученном экстракте биогенных аминов и их производных проводили с применением аналитических стандартов и совокупности MRM-переходов при фрагментации молекул. MRM-переходы, используемые в качестве диагностических, приведены в таблице 4 ниже [Wallace W.Е. Mass spectra // NIST chemistry webbook, NIST standard reference database. - 2018. - №69]:

Для идентификации и установления концентрации гистамина, полученного в экстракте из растительного сырья V. dubyana, применяли аналитический стандарт гистамина дигидрохлорида в 0,1 н. соляной кислоте (ГСО 4 мг/мл). Хромато-масс-спектрометрический анализ по определению концентрации гистамина в экстракте проводили на базе хромато-масс-спектрометра Agilent Technologies Infinity II с масс-спектрометрическим детектором 6470 В. Хроматографические условия представлены в таблице 5.

Режимы хроматографирования и масс-спектрометрического детектора представлены в таблицах 6 и 7.

Концентрация раствора стандартного образца гистамина дигидрохлорида в метаноле составляла 2 мг/л. Выявленные диагностические ионы стандартного образца соотносили с ионами, детектированными в испытуемом экстракте в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).

Заявленный способ поясняем следующими примерами:

Пример 1. Выявление кинуренина и кинуреновой кислоты в экстрактах яванского мха V. dubyana при выращивании мха в лабораторных условиях в воде и в питательной среде.

На фиг. 1. представлены материалы, характеризующие MRM-переходы (хроматограммы масс) кинуренина и кинуреновой кислоты. Кинуренин и кинуреновая кислота обнаружены в образцах мха V. dubyana, выращенного в лабораторных условиях, описанных выше. Метаболиты получены посредством измельчения сырья и экстракции раствором метилового и этилового спиртов. Анализ воды, в которой был выращен яванский мох, указывает на отсутствие кинуренина и кинуреновой кислоты. Сводные материалы представлены в таблице 8.

Пример 2. Выявление тирамина в экстрактах яванского мха V. dubyana при выращивании мха в лабораторных условиях в воде и в питательной среде.

На фиг. 2. представлены материалы, характеризующие MRM-переходы (хроматограммы масс) тирамина. Тирамин обнаружен в образцах мха V. dubyana, выращенного в лабораторных условиях, описанных выше. Тирамин получен посредством измельчения сырья и экстракции раствором метилового спирта. Анализ воды, в которой был экспонирован яванский мох, указывает на отсутствие тирамина. Сводные материалы представлены в таблице 9.

Пример 3. Выявление триптамина в экстрактах яванского мха V. dubyana при выращивании мха в лабораторных условиях в воде и в питательной среде.

На фиг. 3 представлены материалы, характеризующие MRM-переходы (хроматограммы масс) триптамина. Триптамин обнаружен в образцах мха V. dubyana, выращенного в лабораторных условиях, описанных выше. Триптамин получен посредством измельчения сырья и экстракции раствором метилового спирта. Анализ воды, в которой был экспонирован яванский мох, указывает на отсутствие триптамина. Сводные материалы представлены в таблице 10.

Пример 4. Выявление гистамина в экстрактах яванского мха при выращивании мха в лабораторных условиях в воде и питательной среде.

На фиг. 4. представлены материалы, характеризующие MRM-переходы (хроматограммы масс) стандартного образца гистамина. На фиг. 5 представлены материалы, характеризующие MRM-переходы гистамина в полученных экстрактах мха. Гистамин обнаружен в образцах мха V. dubyana, выращенного в лабораторных условиях, описанных выше. Гистамин получен посредством измельчения сырья и экстракции раствором метилового спирта. На фиг. 6 представлен анализ воды, в которой был экспонирован яванский мох, данные указывают на наличие гистамина. Внутриклеточная концентрация гистамина составляет не менее 2 мг/кг биомассы мха. Внеклеточная концентрация гистамина в воде составляет не менее 2 мг/л питательной среды. Сводные материалы представлены в таблице 11.

Таким образом, способ получения ряда биологически активных веществ: биогенных аминов гистамина, триптамина тирамина, кинуренина и его производного - кинуреновой кислоты может быть внедрен в практику фармацевтических и биомедицинских предприятий. Принимая во внимание преимущества данного способа, в т.ч. одновременное получение ряда названных биологически активных веществ, отсутствие требований по стерильности производственного процесса, выраженный экзогенный синтез, а также широкий спектр условий выращивания мха, использование водных мхов, V. dubyana является конкурентным способом получения биогенных аминов.

Список источников

1. Патент SU 166355 А1 - "Способ получения гистамина". Авторы: Липковский, А.С., Пошивак З.М.

2. Патент РФ RU 2628536 С2 - "Получение и применение бактериального гистамина". Авторы: Версалович Д., Томас К.М., Коннолли И.

3. Патент РФ RU 2218326 С2 - "Способ получения 4-(2-аминоэтил)фенола". Авторы: Крысин А.П., Егорова Т.Г., Просенко А.Е., Кобрин B.C.

4. Wallace W.Е. Mass spectra // NIST chemistry webbook, NIST standard reference database. - 2018. - №. 69.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно к способу получения смеси биологически активных веществ – биогенных аминов гистамина, триптамина, тирамина, кинуренина и кинуреновой кислоты. Способ получения смеси биологически активных веществ: биогенных аминов гистамина, триптамина, тирамина, кинуренина и производного кинуренина - кинуреновой кислоты, включающий измельчение биомассы моховидного растения Vesicularia dubyana, экстрагирование из измельченной растительной биомассы смеси биологически активных веществ в присутствии растворителя - метилового 100% либо этилового спирта 96% - в соотношении измельченная биомасса растения : растворитель, равном 1 к 10, в условиях перемешивания на протяжении 1 часа, затем центрифугирование при скорости 4 тыс. об/мин на протяжении 10 минут, далее охлаждение в термостате при температуре 6°С на протяжении 8 часов, после чего повторное центрифугирование при 13,5 тыс. об/мин и далее отфильтровывание полученного экстракта. Изобретение позволяет получить указанные биогенные амины без использования многостадийных процессов химического и биотехнологического синтеза и без токсичных отходов в виде органических растворителей, аммиака и других химических агентов. 6 ил., 11 табл., 4 пр.

Способ получения смеси биологически активных веществ: биогенных аминов гистамина, триптамина, тирамина, кинуренина и производного кинуренина - кинуреновой кислоты, включающий измельчение биомассы моховидного растения Vesicularia dubyana, экстрагирование из измельченной растительной биомассы смеси биологически активных веществ в присутствии растворителя - метилового 100% либо этилового спирта 96% - в соотношении измельченная биомасса растения : растворитель, равном 1 к 10, в условиях перемешивания на протяжении 1 часа, затем центрифугирование при скорости 4 тыс. об/мин на протяжении 10 минут, далее охлаждение в термостате при температуре 6°С на протяжении 8 часов, после чего повторное центрифугирование при 13,5 тыс. об/мин и далее отфильтровывание полученного экстракта.