Способ выделения двуцепочечной РНК из штамма E. coli HT115 Российский патент 2025 года по МПК C12N15/10 C12P19/34 C12N1/21 C12R1/19 

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к способу выделения рибонуклеиновых кислот (двуцепочечной РНК) из бактериальной суспензии E. coli HT115.

Регуляция активности генов с помощью механизмов РНК-интерференции является очень перспективным и мощным инструментом в сельском хозяйстве, помогая защищать растения от различных патогенов. Подходы, основанные на сайленсинге генов через использование двуцепочечных РНК (дцРНК) более избирательные и экологически чистые, что делает их еще более привлекательными для внедрения (Koch, A., Biedenkopf, D., Furch, A., Weber, L., Rossbach, O., Abdellatef, E., Linicus, L., Johannsmeier, J., Jelonek, L., Goesmann, A., Cardoza, V., McMillan, J., Mentzel, T., Kogel, K. H. An RNAi-Based Control of Fusarium graminearum Infections Through Spraying of Long dsRNAs Involves a Plant Passage and Is Controlled by the Fungal Silencing Machinery. PLoS Pathogens 2016, e1005901, doi: 10.1371/journal.ppat.1005901). Самый простой способ регуляции генной активности – это модификации генома растений, когда соответствующая генетическая конструкция внедряется в геном различными способами, а с нее уже нарабатывается дцРНК. Однако в ряде стран, включая РФ, существует запрет на использование ГМО в сельском хозяйстве, соответственно, необходимо разрабатывать способы наработки экзогенной дцРНК в больших количествах, пригодных для обработки растений. Один из вариантов для решения этой проблемы – система из штамма E. coli HT115 и вектора L4440. Штамма E. coli HT115 является дефицитным по РНКазе III, что позволяет накапливать в нем фрагменты дцРНК, а вектор L4440 обладает двумя сильными Т7-промоторами, направленными друг на друга, за счет чего транскрибируется обе цепи ДНК с последующим образованием дцРНК с целевой последовательностью. Далее идет этап лизиса клеток для высвобождения наработанной дцРНК и ее последующей экстракции.

Из уровня техники известен наиболее близкий аналог - способ выделения дцРНК с помощью смеси фенола и хлороформа, который является прототипом изобретения (Tenllado, F., Martínez-García, B., Vargas, M., Díaz-Ruíz, J.R., Crude extracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections. BMC Biotechnol. 2003, 3, doi:10.1186/1472-6750-3-3). Способ включает извлечение дцРНК из суспензии клеток с использованием смеси фенол/хлороформ в равных соотношениях, а затем дополнительного этапа экстракции для удаления остаточного фенола. Полученную дцРНК осаждают добавлением этанола.

Недостатком прототипа является использование фенола – достаточно токсичного компонента. Этот недостаток характерен для фенол-хлороформной экстракции в принципе. Также для получения чистой фракции дцРНК необходимо выполнить экстракцию как минимум дважды, что увеличивает времязатраты.

Задачей настоящего изобретения является получение дцРНК высокого качества и с большим выходом из бактериальной суспензии штамма E. coli HT155, трансформированного плазмидой L4440, несущей встройку целевого фрагмента между двумя поздними промоторами фага Т7.

Технический результат от реализации изобретения заключается в получении препарата экзогенно синтезированной дцРНК, которая может быть использована для сайленсинга генов посредством РНК-интерференции. Дополнительный технический результат заключается в сокращении количества операций для получения целевой дцРНК (достаточно одной процедуры экстракции), а также снижении использования токсичных компонентом (отказ от фенола).

Технический результат достигается предлагаемым способом, который заключается в подготовке бактериальной суспензии E. coli HT115, трансформированного плазмидой L4440 с встройкой необходимой последовательности, получении лизата с последующей обработкой лизата ДНКазой и экстракцией дцРНК с помощью смеси метанол/хлороформ, центрифугированием в 7.5% ПЭГ-8000 в присутствии 0.5 М NaCl и отмывкой этанолом. Полученный осадок дцРНК просушивается и растворяется в деионизованной воде.

Способ включает следующую последовательность стадий:

1. Трансформация штамма E. coli HT115 плазмидой L4440 с целевой последовательностью.

2. Наработка бактериальной суспензии.

3. Индукция синтеза целевой дцРНК с помощью ИПТГ.

4. Лизирование клеток E. coli HT115 и обработка ДНКазой.

5. Метанол-хлороформная экстракция.

6. Осаждение целевой дцРНК в 7.5% ПЭГ-8000 в присутствии 0.5 М NaCl.

7. Очистка целевой дцРНК с помощью этанола.

8. Получение фракции очищенной дцРНК.

Разработанный способ позволяет получить препараты экзогенной дцРНК очень высокого качества, пригодные для сайленсинга генов через регуляцию с помощью РНК-интерференции.

Общие этапы с прототипом заключаются в использовании хлороформа и отмывкой этанолом.

Определяющими отличительными признаками предлагаемого способа по сравнению с прототипом являются:

1) замена фенола на менее токсичный метанол;

2) сокращение этапов экстракции метанол/хлороформом до одной по сравнению минимум с двумя в прототипе.

Изобретение иллюстрируется следующим примером конкретного выполнения способа.

Пример 1

Колония бактерий E. coli HT115, трансформированных плазмидой L4440 со встройкой целевого участка дцРНК, который необходимо наработать, переносится с чашки Петри в среду LB с добавлением 100 мкг/мл ампициллина и инкубируются 14-16 ч в шейкере при 37 ⁰С и 200 об/мин. Полученная культура разводится в 20 раз свежей средой LB с добавленным 100 мкг/мл ампициллином и инкубируется в шейкере при 37 ⁰С и 200 об/мин до достижения показателя OD₆₀₀ = 0.5. Далее добавляется ИПТГ до концентрации 0.6 ммоль/л и культура инкубируется в шейкере при 37 ⁰С и 200 об/мин еще 5 ч.

По прошествии 5 ч бактерии осаждаются центрифугированием при комнатной температуре с ускорением 5000 g в течение 5 минут. Осадок ресуспендируется деионизованной водой из расчета 1 мл на 50 мл исходной культуры и выдерживается 5 мин при 95 ⁰С. Полученный лизат центрифугируется 5 мин с ускорением 12000 g, супернатант отбирается в отдельную пробирку, к нему добавляется 100 ед активности ДНКазы и смесь инкубируется еще 15 мин при 37 ⁰С.

Полученный лизат может храниться на –20 ⁰С не менее месяца и при –80 ⁰С не менее полугода. Для дальнейшей очистки он смешивается с метанолом и хлороформом в пропорции лизат:метанол:хлороформ: 4:4:1, тщательно перемешивается и центрифугируется 15 мин с ускорением не менее 15000 g при 4 ⁰С. После центрифугирования верхняя фаза отбирается, но не полностью, чтобы не захватить интерфазу, и смешивается с деионизованной водой, 40% ПЭГ-8000 и 4 М NaCl так, чтобы в конечной смеси массовая доля ПЭГ была 7.5 %, а концентрация NaCl – 0.5 М. Смесь тщательно перемешивается.

Полученная смесь молочно-белого цвета инкубируется 15 мин при 4 ⁰С, затем центрифугируется 15 мин с ускорением не менее 15000 g при 4 ⁰С. После центрифугирования необходимо полностью удалить верхнюю фазу, сохранив интерфазу. Далее в пробирку добавляется охлажденный до 4 ⁰С 96% этанол до половины объема пробирки, смесь тщательно перемешивается и центрифугируется 5 мин с ускорением не менее 12000 g при 4 ⁰С. После центрифугирования этанол аккуратно удаляется, и процедура отмывки повторяется еще 1 раз 70% этанолом. После второго раза необходимо тщательно удалить всю жидкость из пробирки, оставив только осадок. Осадок требуется просушить до 15 мин при 37 ⁰С. Высушенный осадок растворяется в деионизованной воде из расчета 250 мкл на 1 мл исходного лизата, концентрация РНК далее может быть измерена спектрофотометрически.

Для оценки качества полученные образцы дцРНК были проанализированы на приборе NanoDrop Spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific, США). Распределение полученных параметров поглощения представлено на фиг. 1, где по оси абсцисс представлена длина целевой молекулы в п.н., по оси ординат слева – распределение концентраций в нг/мкл, по центру – соотношение поглощения образцом на длинах волн 260 нм и 280 нм, справа – соотношение поглощения света образцом на длинах волн 260 нм и 230 нм. Полученные результаты свидетельствуют об отсутствии примесей белков, ДНК, хлороформа и метанола в образце.

Для оценки содержания примесей нуклеиновых кислот образцы анализировались электрофорезом в агарозном геле (фиг. 2). В дорожке M100 представлен ДНК-маркер молекулярных длин, в дорожках 2-3, 5-6, 8-9 представлены очищенные образцы РНК, в дорожках 1, 4, 7 – соответствующие им грубые лизаты. Длины целевых молекул дцРНК подписаны, можно заметить, что они преобладают в образце, при отсутствии примеси ДНК и низкомолекулярной РНК.

Для сравнения представлена электроферограмма из прототипа на фиг. 3 (Tenllado, F., Martínez-García, B., Vargas, M., Díaz-Ruíz, J.R., Crude extracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections. BMC Biotechnol. 2003, 3, doi:10.1186/1472-6750-3-3), где выделение производилось смесью фенола и хлороформ. На дорожках 3-4, не обработанных РНКазой А, заметны значительные примеси низкомолекулярной РНК, на дорожках 1-2, дополнительно обработанных РНКазой А, примеси присутствуют в меньшем количестве. В предлагаемой разработке, аналогичное или меньшее содержание примесей достигается без необходимости проводить обработку РНКазой А.

Использование предлагаемого способа позволит нарабатывать дцРНК в бактериях с использованием дешевых и нетоксичных реагентов на доступном оборудовании и развивать исследования РНК-интерференции.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной биологии. Предложен способ выделения двуцепочечной РНК из штамма E. coli HT115, трансформированного плазмидой L4440, несущей встройку целевого фрагмента. Проводят лизис бактериальной суспензии. Обрабатывают лизат ДНКазой. Экстрагируют целевую дцРНК с помощью смеси метанола и хлороформа. Затем осаждают целевую дцРНК в 7,5% ПЭГ-8000 в присутствии 0,5 М NaCl. Удаляют следы смеси отмывкой этанолом. Получаемую готовую фракцию дцРНК растворяют в деионизованной воде. Изобретение обеспечивает сокращение количества операций для получения препарата экзогенно синтезированной дцРНК. 3 ил., 1 пр.

Способ выделения двуцепочечной РНК из штамма E. coli HT115, трансформированного плазмидой L4440, несущей встройку целевого фрагмента, заключающийся в лизисе бактериальной суспензии с последующей обработкой лизата ДНКазой и экстракцией целевой дцРНК с помощью смеси метанола и хлороформа, с последующим осаждением целевой дцРНК в 7,5% ПЭГ-8000 в присутствии 0,5 М NaCl, с последующим удалением следов смеси отмывкой этанолом, получаемая готовая фракция дцРНК растворяется в деионизованной воде.