Способ определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче Российский патент 2024 года по МПК G01N33/493 G01N30/72 

Изобретение относится к области аналитической токсикологии, и может быть использовано при биомониторинге лиц, подвергающихся воздействию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) метаболизируются в полярные гидроксильные производные (ОН-ПАУ) с помощью оксидазной системы со смешанными функциями в присутствии молекулярного кислорода и никотинамидадениндинуклеотида или никотинамидадениндинуклеотидфосфата. Так, например, нафталин, метаболизируется в 2-гидроксинафталин; флуорен в 2-гидроксифлуорен; фенантрен в 9-гидроксифенатрен, 3-гидроксифенатрен, 2-гироксифенатрен; пирен в 1-гидроксипирен, хризен в 6-гидроксихризен.

Известен способ определения гидроксилированных ПАУ методом газовой хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ-МС), предполагающий извлечение аналитов жидкостной экстракцией (Campo L, F. Rossella, S. Fustinoni. Development of a gas chromatography/mass spectrometry method to a quantify several urinary monohydroxy metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in occupationally exposed subjects // J. Chromatog. B. 2008. V. 875. P. 531-540.) Данный способ включает следующие этапы: ферментативный гидролиз образца мочи β-глюкуронидазой при 37°С 16 ч, экстракция гексаном дважды, упаривание объединенного экстракта в токе азота при комнатной температуре, дериватизация сухого остатка реагентом N,O-бистриметилсилилтрифторацетамид (БСТФА) 100 мкл при температуре 90°С в течение 45 мин, ГХ-МС анализ на капиллярной колонке HP-5MS в течение 40 мин. К недостаткам данного способа можно отнести трудоемкость и длительность анализа, возможность потерь легких гидроксилированных ПАУ в процессе упаривания экстракта до сухого остатка.

Имеется также способ определения гидроксилированных ПАУ твердофазной микроэкстракцией (ТФМЭ). (Luan, Т., Fang, S., Zhong, Y., Lin, L., Chan, S.M.N., Lan, C. et al. Determination of hydroxyl metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons by fully automated solid-phase microextraction derivatization and gas chromatography-mass spectrometry // Journal of Chromatography A, 2007. Vol. 1173, P. 37-43.)

Однако этим способом требуется длительное время выдержки волокна ТФМЭ от 45 минут до 12 ч, что делает его неприменимым для рутинного анализа.

Наиболее близким аналогом-прототипом к заявляемому способу является способ ГХ-МС определения ОН-ПАУ в донных отложениях (Wang, X., Lin, L., Yang, L., Tam. N.F.Y. Determination of hydroxylated metabolites of polycyclic aromatic hydrocarbons in sediments samples by combining subcritical water extraction and dispersive liquid-liquid microextraction with derivatization. Analytica Chimica Acta. 2012. V. 753. P. 57-63.) Способ включает в себя ускоренную экстракцию из твердой матрицы (10 г) очищенной водой с ацетонитрилом (20%) при температуре 150°С и давлении 1500 psi в течении 10 мин, дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию хлорбензолом (100 мкл) из водно-ацетонитрильной смеси (11 мл), упаривание экстракта до сухого остатка, силилирование сухого остатка реагентом N-метилтретбутилдиметилсилилтрифторацетамидом (МТБСТФА) при 60°С в течение 1 ч в трет-бутилдиметилсильные производные, ГХ-МС анализ на капиллярной колонке DB-5 (30 м, 0,25 мм. 0,25 мкм) в течение 48 мин. Однако данный способ обладает следующими недостатками: возможность потерь легких ОН-ПАУ в процессе упаривания экстракта до сухого остатка, длительность силилирования (1 ч) гидрокси-ПАУ в сухом остатке, длительность ГХ-МС анализа (48 мин).

Технической задачей предлагаемого нами способа является упрощение пробоподготовки и более полное извлечение аналитов за счет дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстроакции (ДЖЖМЭ), исключающей процесс упаривания, проведения силилирования в инжекционном порту (испарителе), уменьшения продолжительности ГХ-МС анализа на капиллярной колонке.

Для достижения технического результата при ГХ-МС определении ОН-ПАУ в моче в режиме мониторинга заданных ионов с использованием ДЖЖМЭ и силилирования в инжекционном порту во флакон вместимостью 5 мл и с острым коническим дном вносят пробу мочи 2 мл, 20 мкл β-глукуронидазы (Helix Pomatia, 85000 ед/мл), выдерживают 60 мин при 55°С, далее добавляют 20 мкл внутреннего стандарта (1-гидроксипирен-d9, 1 мкг/мл), 2 мл 0,1 М соляной кислоты, 300 мкл этанола - диспергирующий растворитель, 100 мкл трихлорметана - экстрагирующий растворитель; проводят встряхивание в течение 25 с для образования эмульсии; центрифугируют при 5000 об/мин 10 мин; переносят нижний трихлорметановый слой во флакон на 250 мкл и осуществляют автоматический ввод микрошприцом в инжекционный порт хроматографа 3-х фазную систему: 1 мкл силилирующего реагента БСТФА, 0,2 мкл воздуха и 1 мкл трихлорметанового экстракта с последующим ГХ-МС анализом на капиллярной колонке НТ-8 (30 м, 0.25 мм, 0,25 мкм) в условиях перечисленных в таблице 1.

Идентификацию проводят по времени удерживания и по соотношению интенсивностей регистрируемых ионов (табл. 2)

Количественное определение по предлагаемому способу проводят методом внутреннего стандарта по растворам известной концентрации ОН-ПАУ в моче от 0,1 до 100 нг/см³, предварительно обработанным аналогично анализируемым пробам. При градуировке процедуру ферментативного гидролиза допускается не проводить.

Описание графических материалов:

Фиг. 1 - Зависимость площади пика ТМС производного ОН-ПАУ от температуры инжектора

Фиг. 2. Зависимость степени извлечения ОН-ПАУ из мочи от природы диспергирующего растворителя

Фиг.3 - Масс-хроматограмма образца мочи с концентрацией ОН-ПАУ 10 нг/мл

Общими признаками с прототипом являются:

- применение ДЖЖМЭ для извлечения ОН-ПАУ;

- центрифугирование для эффективного разделения трехкомпонентной системы на этапе ДЖЖМЭ;

- дериватизация ОН-ПАУ силилирующим реагентом.

Отличительными признаками заявляемого способа от прототипа являются:

- использование трихлорметана в качестве экстрагента на этапе ДЖЖМЭ;

- использование этанола в качестве диспергирующего растворителя на этапе ДЖЖМЭ;

- использование 0,1М соляной кислоты для создания кислой среды рН 1,6-2;

- дериватизация в инжекционном порту силилирующим реагентом БСТФА;

- использование высокотемпературной колонки НТ-8 для уменьшения времени ГХ-МС анализа.

Имеющийся прототип не содержит совокупность предложенных нами признаков, что позволяет сделать вывод о новизне заявляемого технического результата.

Поскольку силилирование происходит внутри порта инжектора системы ГХ-МС, температуру инжекционного порта можно рассматривать как температуру реакции силилирования. Поэтому влияние температуры порта инжектора на эффективность силилирования в виде максимальной площади пика ТМС производного ОН-ПАУ было исследовано в диапазоне 150-370°С.

Из рисунка фиг. 1 ясно видно, что при повышении температуры порта инжектора от 150 до 300°С, площади пиков всех производных ОН-ПАУ также увеличиваются, однако при превышении 300°С не наблюдается значительного увеличения площадей пиков производных ОН-ПАУ. Также следует учесть то, что при температуре выше 350°С может разрушаться капиллярная колонка. Поэтому 300°С было выбрано в качестве оптимальной температуры порта инжектора при силилировании ОН-ПАУ реагентом БСТФА.

В ДЖЖМЭ диспергирующий растворитель должен смешиваться как с экстрагентом, так и с водно-солевой фазой. Роль диспергирующего растворителя заключается в диспергировании экстрагента по водно-солевой фазе в виде мелких капель и в образовании эмульсии (моча/диспергирующий растворитель/экстрагент). При образовании мутного раствора контакт между экстрагентом и водной фазой бесконечно больше, что помогает очень быстро достичь равновесия, что приводит к сокращению времени экстракции, повышению коэффициентов распределения и степени извлечения. Исходя из этих условий, для выбора лучшего растворителя-диспергатора были использованы четыре наиболее часто используемых диспергирующих растворителей, а именно ацетон, ацетонитрил, этанол и метанол. К 2 мл образца мочи с добавкой 5 нг/мл каждого ОН-ПАУ вводили 3 мл бидистилированной воды, подвергали ДЖЖМЭ с 100 мкл трихлорметана в качестве экстрагента и 300 мкл диспергирующего растворителя (ацетон, ацетонитрил, этанол и метанол).

Из рисунка фиг. 2 видно, что этанол показал самую высокую эффективность экстракции ДЖЖМЭ для всех метаболитов ОН-ПАУ.

Следующими факторами, влияющих на эффективность экстракции ДЖЖМЭ остаются рН пробы, объем диспергирующего растворителя этанола, время экстракции. Для этого был проведен ряд опытов с изменением объема этанола в диапазоне 100-300 мкл, рН в диапазоне 1,6-4.8, времени экстракции (встряхивания) 5-25 с (табл. 3).

Картина складывается следующая: с увеличением рН степень извлечения уменьшается. Только для 1-гидроксинафталина величина рН оказывает влияния на степень извлечения. Увеличению степени извлечения способствуют также увеличение объема диспергирующего растворителя этанола и времени экстракции. При большем объеме этанола степень извлечения увеличивается. Следует также отметить, что при увеличении времени встряхивания вклад факторов рН и объема этанола уменьшается. Степень извлечения ДЖЖМЭ для ОН-ПАУ была максимальной, когда рН водной фазы поддерживался на уровне 1.6, объем этанола составляет 300 мкл и время экстракции 25 с.

Установлены валидационные характеристики: предел обнаружения, предел количественного определения, линейный диапазон, повторяемость, внутрилабораторная прецизионность, правильность, селективность.

Предел обнаружения и предел количественного определения приведены в таблице 4.

Линейный диапазон установили по 6 модельным образцам мочи с разными концентрациями ОН-ПАУ (0.5, 2, 5, 10, 40, 100 нг/см³), коэффициент корреляции r>0.999. Приемлемый критерий для r не ниже 0,990. Таким образом, линейный диапазон составил от 0.5 до 100 нг/см³. Прецизионность и точность оценивали для 3 образцов мочи с веденными концентрациями 0.5, 10 и 40 нг/см³, каждый образец анализировали 4 раза 5 дней. По результатам анализа рассчитали относительное стандартное отклонение (RSD, %) повторяемости и внутрилабораторной прецизионности, оценили значимость систематической погрешности по t-критерию (табл. 5).

Расчетные значения t-критерия, соответствовали приемлемому критерию t_pacч<t_таб (t_таб(0.05;15)=2.13), что говорит о незначимости систематической погрешности. Исключения составляют только 2-ОН-нафталин для концентрации 0.5 нг/см³ и 9-ОН-фенантрен для концентраций 0.5 и 40 нг/см³.

На рисунке фиг. 3 приведена масс-хроматограмма образца мочи с концентрацией каждого ОН-ПАУ 10 нг/см³.

Пики триметилсилильных (ТМС) производных ОН-ПАУ узкие (полуширина пика 1.5 с), симметричные, контаминирующие пики не оказывают мешающего влияния. Таким образом, достигается отличная селективность определения.

Пример конкретного анализа.

Во флакон вместимостью 5 мл с острым коническим дном вносят 2 мл пробы мочи, 20 мкл β-глукуронидазы (Helix Pomatia, 85000 ед/мл), выдерживают 60 мин при 55°С.Затем после охлаждения до комнатной температуре вносят 20 мкл внутреннего стандарта (1-гидроксипирен-d9, 1 мкг/мл), 2 мл 0,1М соляной кислоты, 300 мкл этанола, 100 мкл трихлорметана; проводят встряхивание в течение 25 с для образования эмульсии; центрифугируют при 5000 об/мин 10 мин; переносят нижний (трихлорметановый) слой во флакон на 250 мкл и осуществляют автоматический ввод микрошприцом в инжекционный порт хроматографа 3-х фазную систему (1 мкл силилирующего реагента БСТФА, 0,2 мкл воздуха и 1 мкл трихлорметанового экстракта) с последующим ГХ-МС анализом на капиллярной колонке НТ-8 (30 м, 0.25 мм, 0,25 мкм) в условиях по табл. 1.

Далее проводят обработку полученных данных с применением программного обеспечения (табл. 6).

Благодаря повышенной селективности и чувствительности предлагаемого способа удалось количественно определить содержание ОН-ПАУ в моче не только у работников производства алюминия, но и у лиц, не контактирующих с ПАУ в производственных условиях.

Результаты экспериментальных исследований и приведенный пример подтверждают достижение технического результата:

использование ДЖЖМЭ вместо классической жидкостной экстракции с упариванием экстракта упростило пробоподготовку и обеспечило количественное извлечение аналитов на 70-100% (табл. 3);

благодаря силилированию в инжекционном порту удалось исключить стадию упаривания трихлорметанового экстракта и достигнуть экспрессность дериватизации;

быстрый ГХ-МС анализ за 15 мин стал возможным благодаря высокотемпературной колонке НТ-8.

Заявленные отличительные признаки позволяют исследовать образцы мочи на содержание семи ОН-ПАУ: 2-гидроксинафталин, 2-гидроксифлуорен, 9-гидроксифенантрен, 3-гидроксифенантрен, 2-гидроксифенантрен, 1-гидроксипирен, 6-гидроксихризен. Предлагаемый способ является новым, обладает изобретательским уровнем и может широко использоваться для биомониторинга ОН-ПАУ в моче, в том числе у лиц, не контактирующих с ПАУ в производственных условиях.

Изобретение относится к области аналитической токсикологии и может быть использовано при биомониторинге лиц, подвергающихся воздействию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) в производственных условиях, а именно способу хромато-масс-спектрометрического определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче. Способ хромато-масс-спектрометрического определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче включает дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию, центрифугирование и дериватизацию гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов силилирующим реагентом, при этом дополнительно проводят ферментативный гидролиз пробы β-глюкуронидазой при 55°С в течение 1 ч, дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию проводят путем внесения в пробу внутреннего стандарта 1-гидроксипирен-d9, 2 мл 0,1 М соляной кислоты, 300 мкл этанола, 100 мкл трихлорметана, встряхивания в течение 25 с с образованием эмульсии, центрифугирования 5000 об/мин в течение 10 мин, отбирают нижний слой во вставку на 250 мкл, дериватизацию проводят в испарителе хроматографа трехфазной системой из 1 мкл силилирующего реагента N,O-бистриметилсилилтрифторацетамида, 0,2 мкл воздуха и 1 мкл трихлорметанового экстракта с последующим анализом на капиллярной колонке НТ-8 в режиме температурного градиента в течение 15 мин. Вышеописанный способ упрощает пробоподготовку и способствует более полному извлечению аналитов за счет дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракции (ДЖЖМЭ), исключающей процесс упаривания, проведения силилирования в инжекционном порту (испарителе), уменьшения продолжительности ГХ-МС анализа на капиллярной колонке. Изобретение также обеспечивает повышение селективности. 3 ил., 6 табл.

Способ хромато-масс-спектрометрического определения гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов в моче, включающий дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию, центрифугирование и дериватизацию гидроксилированных полициклических ароматических углеводородов силилирующим реагентом, отличающийся тем, что дополнительно проводят ферментативный гидролиз пробы β-глюкуронидазой при 55°С в течение 1 ч, дисперсионную жидкостно-жидкостную микроэкстракцию проводят путем внесения в пробу внутреннего стандарта 1-гидроксипирен-d9, 2 мл 0,1 М соляной кислоты, 300 мкл этанола, 100 мкл трихлорметана, встряхивания в течение 25 с с образованием эмульсии, центрифугирования 5000 об/мин в течение 10 мин, отбирают нижний слой во вставку на 250 мкл, дериватизацию проводят в испарителе хроматографа трехфазной системой из 1 мкл силилирующего реагента N,O-бистриметилсилилтрифторацетамида, 0,2 мкл воздуха и 1 мкл трихлорметанового экстракта с последующим анализом на капиллярной колонке НТ-8 в режиме температурного градиента в течение 15 мин.