СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ ДЛЯ ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИОДИГЛИКОЛЕВОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к медицинским, химико-токсикологическим исследованиям, и может быть использовано при диагностике профессионального воздействия винилхлорида в лабораториях биохимии и клинико-диагностических лабораториях научно-исследовательских и медицинских учреждений.

Известны способы для количественного определения тиодигликолевой кислоты (ТДГК) в моче с использованием реакционной газожидкостной хроматографии, основанные на химической дериватизации, т.е. переводе ТДГК в более летучие соединения.

Известен способ подготовки пробы для количественного определения ТДГК в моче, предложенный китайскими учеными (Chen Z.Y. Sensitive flame-photometric-detector analysis of thiodiglycolic acid in urine as a biological monitor of vinyl chloride / Z.Y. Chen, X.R. Gu, M.Z. Cui, X.X. Zhu // Int. Arch. Occup. Environ. Health. - 1983. - Vol.82. - P.281-284). Согласно этому способу пробу мочи в объеме 1 см³ упаривают досуха, растворяют сухой остаток в смеси метанола и диэтилового эфира, проводят дериватизацию ТДГК диазометаном, пропуская последний через эфирный раствор. После завершения реакции (раствор пробы становится слегка желтым) упаривают эфирный раствор до 1 см³. Хроматографирование полученного экстракта выполняется на насадочной колонке с пламенно-фотометрическим детектированием. Предел обнаружения ТДГК в пробе мочи по данному способу составляет 0.5 мкг/см³.

Согласно способу количественного определения ТДГК в моче, предложенному тайванскими учеными (Tsun-Jen Cheng, Yu-fang Huang, Yee-Chung Ma. Urinary thiodiglycolic acid levels for vinyl chloride monomer exposed polyvinyl chloride workers // J. Occup. Environ. Med. 2001. V 43. №11. P.934-938) пробу мочи в объеме 5 см³ ТДГК экстрагируют этилацетатом с последующим центрифугированием. Полученный этилацетатный экстракт упаривают досуха и к остатку добавляют N-триметилсилилдиэтиламин в пиридине, чтобы добиться силилирования. Хроматографирование силильного производного ТДГК в полученной смеси выполняется на капиллярной колонке с масс-селективным детектированием. Предел обнаружения ТДГК в пробе мочи по данному способу составляет 1 мкг/см³.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по технической сущности является способ подготовки пробы, описанный в статье W. Draminski, B. Trojanowska. Chromatographic determination of thiodiglycolic acid - a metabolite of vinyl chloride / Archives of Toxicology. - 1981. - Vol.48. - P.289-292. Согласно этому способу из пробы мочи в объеме 5 мл проводят 3-кратную экстракцию ТДГК этилацетатом, упаривают растворитель досуха и осуществляют дериватизацию ТДГК N-триметилсилилдиэтиламином в пиридине в силильное производное. Хроматографирование полученного экстракта выполняется на насадочной колонке с пламенно-ионизационным детектированием. Предел обнаружения ТДГК в пробе мочи по данному способу составляет 10 мкг/см³. Недостатками указанных способов являются:

1. Использование в качестве дериватизирующего реагента - очень токсичного, канцерогенного, взрывоопасного диазометана.

2. Неудовлетворительная пробоподготовка, о чем говорит предел обнаружения от 1 до 10 мкг/см³ при объеме пробы 5 см³ и использовании очень чувствительного масс-селективного детектора, а также предел обнаружения 10 мкг/см³ при использовании пламенно-ионизационного детектора.

3. Длительная и трудоемкая пробоподготовка во всех способах, использование больших количеств особо чистых растворителей: метанола, диэтилового эфира, этилацетата. Кроме того, такие детекторы как масс-селективный детектор и пламенно-фотометрический детектор доступны не во всех лабораториях по причине их высокой стоимости, по сравнению с пламенно-ионизационным детектором.

Целью настоящего изобретения является разработка менее длительного и трудоемкого способа подготовки пробы для количественного определения в моче ТДГК, позволяющего достигнуть предел обнаружения не более чем 1 мкг/см³, и использовать более доступный пламенно-ионизационный детектор.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу пробоподготовки, ТДГК дериватизируют метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C в течение 15 минут, после чего осуществляют извлечение ТДГК из пробы этилацетатом посредством жидкостно-жидкостной микроэкстракци в течение 5 минут. При этом все операции выполняют в одной емкости.

Отличительными от прототипа признаками является последовательность операций: в предлагаемом способе дериватизация предшествует экстракции; осуществление дериватизации метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C в течение 15 минут; проведение всех операций в одной емкости.

Из патентной и научно-технической литературы нам неизвестны способы количественного определения ТДГК в моче, содержащие совокупность предложенных нами признаков, что позволяет сделать вывод о новизне заявляемого технического решения. Кроме того, из существующего уровня техники нам неизвестно, что существенные признаки, характеризующие предлагаемый способ, в совокупности способны обеспечить понижение предела обнаружения ТДГК в моче до 0.5 мкг/см³.

Краткое описание чертежей

На рисунке 1 приведен график зависимости степени дериватизации ТДГК от времени при разных температурах.

На рисунке 2 приведен график зависимости степени экстракции диметилового эфира ТДГК от времени экстракции

Способ осуществляется следующим образом: в стеклянную хроматографическую виалу вместимостью 1.5 см помещают 0.36 г сульфата натрия, 0.1 см³ пробы мочи, 0.1 см³ метанола, 0.02 см³ концентрированной серной кислоты; виалу закрывают пластмассовой завинчивающей крышкой с септой и выдерживают 15 мин при температуре 80°C; после охлаждения откручивают пробку с септой, добавляют 0.5 мл этилацетата, 0.9 мл дистиллированной воды, снова закручивают виалу крышкой с септой и проводят экстракцию на мульти-вортексе в течение 5 мин. После разделения фаз виалу помещают в автоинжектор газового хроматографа, который отбирает из впалы 2 мкл верхнего органического слоя на определенной глубине и вводит в испаритель хроматографа. Хроматографирование экстракта проводят на капиллярной колонке НР-5 (30 м × 0.32 мм) в режиме линейного программирования температуры и режиме ввода пробы в капиллярную колонку "splitless". Условия хроматографирования приведены в таблице 1, а основные хроматографические параметры пика диметилового эфира ТДГК представлены в таблице 2.

Таблица 1 Условия хроматографирования условия значения колонка HP-5 30 м × 320 мкм, толщина фазы 0.5 мкм газ-носитель азот особой чистоты, скорость потока через колонку 1.7 см³/мин температурный режим термостата колонок программирование, 80°C с выдержкой 1 мин, подъем со скоростью 5°C/мин до 130°C режим ввода 250°C; splitless 0.3 мин 40 см³/мин режим пламенно-ионизационного детектора 300°C, скорость потока водорода 30 см³/мин, воздуха 250 см³/мин, поддува азота 25 см³/мин

Таблица 2 Основные хроматографические параметры Параметр значение Время удерживания, мин 10 полуширина пика, мин 0.05 Коэффициент удерживания 5.3 Число теоретических тарелок 250000 симметрия 0.90

Идентификация пика диметилового эфира ТДГК осуществляется по времени удерживания, полуширине пика и его симметрии, которые приведены в табл.2. Более надежная идентификация осуществляется методом сравнения-наложения двух или нескольких хроматограмм модельных смесей ТДГК в моче с разными концентрациями, а также методом сравнения-наложения хроматограммы модельной смеси ТДГК в моче и хроматограммы модельной смеси диметилового эфира ТДГК в этилацетате. Получение градуировочной зависимости осуществляется по аттестованным (модельным) смесям ТДГК моче.

Выполнение операций: внесение пробы, реактивов, дериватизация, экстракция, отбор и ввод аликвотной части экстракта в хроматограф автоинжектором в одной емкости исключает потерю реагентов и способствует повышению точности проведения анализа. В качестве емкости используется стандартная хроматографическая виала на 1.5 см³, снабженная закручивающейся крышкой с септой. С учетом объема виалы эмпирически выбраны объемы жидкой фазы и органической фазы (экстрагента), которые составляют 1 и 0.5 мл соответственно.

Использование в качестве дериватизирующего реагента метанола с серной кислотой позволяет проводить первоначально дериватизацию ТДГК в диметиловый эфир ТДГК, а затем экстракцию образовавшегося эфира.

Жидкостно-жидкостная микроэкстракция (т.е. экстракция небольшим количеством растворителя) позволяет экономить расход особо чистых растворителей.

В качестве экстрагента выбран этилацетат, который очень хорошо экстрагирует эфиры.

Экспериментальным путем получены зависимости степени дериватизации ТДГК от времени при разных температурах (рис.1), и зависимость степени экстракции диметилового эфира ТДГК от времени экстракции (рис.2).

Данные рисунки показывают, что оптимальный эффект реакции дериватизации ТДГК метанолом наблюдается при времени нагревания 15 мин и температуре 80°C, о чем говорит значение степени дериватизации 94%. Оптимальный эффект экстракции образовавшегося диметилового эфира ТДГК наблюдается при времени экстракции 5 мин, о чем говорит значение степени экстракции 87%.

Оценены метрологические характеристики способа количественного определения ТДГК в моче: повторяемость, воспроизводимость, правильность (границы неисключенной систематической погрешности) и точность (границы относительной погрешности), представленные в табл.3.

Таблица 3 Метрологические характеристики способа количественного определения ТДГК в моче Метрологическая характеристика значение Предел обнаружения, мкг/см³ 0.5 Диапазон определяемых концентраций, мкг/см³ 1.0-18 Повторяемость (относительное стандартное отклонение σ_r), % 5-0,8 Воспроизводимость (относительное стандартное отклонение σ_R), % 6.5 Правильность (границы неисключенной относительной систематической погрешности δ_с), % 3 Точность (границы относительной погрешности δ), % 15

Таким образом, предлагаемый способ пробоподготовки позволяет определять ТДГК в моче с удовлетворительным пределом обнаружения и высокой точностью, использовать малый объем анализируемой пробы (0.1 см³). Применение данного способа позволяет повысить чувствительность и точность, уменьшить продолжительность анализа, упростить пробоподготовку, сэкономить расходы особо чистых веществ (этилацетат, метанол) по сравнению с аналогами. Данный способ пробоподготовки позволяет использовать пламенно-ионизационный детектор при проведении газохроматографии.

Настоящее изобретение относится к медицине, в частности к медицинским, химико-токсикологическим исследованиям, и описывает способ подготовки пробы для газохроматографического определения тиодигликолевой кислоты в моче, включающий дериватизацию, извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы этилацетатом, где дериватизацию тиодигликолевой кислоты проводят метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C в течение 15 минут, а извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы проводят этилацетатом путем жидкостно-жидкостной микроэкстракции в течение 5 минут, при этом все операции выполняют в одной емкости. Данный способ позволяет повысить чувствительность и точность, уменьшить продолжительность анализа, упростить пробоподготовку, сэкономить расходы особо чистых веществ. 3 табл., 1 пр., 2 ил.

Способ подготовки пробы для газохроматографического определения тиодигликолевой кислоты в моче, включающий дериватизацию, извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы этилацетатом, отличающийся тем, что дериватизацию тиодигликолевой кислоты проводят метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты при температуре 80°C в течение 15 мин, а извлечение тиодигликолевой кислоты из пробы проводят этилацетатом путем жидкостно-жидкостной микроэкстракции в течение 5 мин, при этом все операции выполняют в одной емкости.