Способ подготовки проб мочи на принципах мицеллярной экстракции для определения содержания адреналина Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 G01N33/50 A61B5/00 

Изобретение относится к аналитической химии и касается количественного определения адреналина в пробах мочи и включает предварительное выделение аналита из матрицы пробы посредством мицеллярной экстракции и может быть использовано для проведения клинических исследований.

Наиболее часто для определения адреналина в биологических жидкостях применяют хроматографические методы. В хроматографических методах обязательной стадией анализа является пробоподготовка, направленная на устранение мешающего влияния компонентов матрицы пробы. Обычно для этого используют жидкостную или твердофазную экстракцию. При этом анализ экстракта или элюата проводят используя флуоресцентное, электрохимическое или масс-спектрометрическое детектирование [1].

Известен способ [2] определения адреналина предполагающий сорбцию аналита на полярный сорбент Al₂O₃. Элюирование аналита с сорбента проводили раствором уксусной кислоты с последующим анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с амперомет-рическим детектированием. Недостатком способа является необходимость проведения стадии фильтрования для устранения частиц сорбента, а также использование специальной подвижной фазы, состоящей из поверхностно-активного вещества (ПАВ), необходимого для создания ион-парного ассоциата с адреналином и другими катехоламинами для их разделения. Введение ПАВ в подвижную фазу способствует модификации колонки, что может отрицательно сказываться на ее эксплуатации. Кроме того, общей проблемой электрохимического детектирования является невозможность использования градиентного режима элюирования аналитов.

Известен способ [3] основанный на использовании сорбционных патронов для извлечения адреналина из проб мочи. В патрон помещали полимерный слабополярный сорбент, который предварительно кондиционируют смесью метанола с ацетатным буферным раствором. Элюирование аналита проводили метанолом с последующим анализом методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Недостатком способа является необходимость проведения кондиционирование сорбента, а также использования токсичны органических растворителей на стадии пробоподготовки.

Известен способ определения адреналина [4], который аналогично заявленному способу включает дериватизацию и концентрирование. Известный способ заключается в том, что пробу мочи пропускают через патрон для твердофазной экстракции, где сорбируются целевые аналиты, далее мешающие компоненты устраняют путем пропускания смеси муравьиной кислоты и метанола. На следующем этапе проводят дератизацию в щелочной среде с помощью дериватизирующего агента 9-флуоренил-метоксикарбонил хлорида, после чего патрон выдерживают при комнатной температуре в течение 20 мин. Элюирование производных катехоламинов осуществляют 5% раствором ацетата аммония в метаноле. Элюат переносят в виалы и анализируют с использованием метода ультравысокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Данный способ упрощает процедуру дериватизации, поскольку эта стадия проводится непосредственно в сорбционном патроне и протекает при комнатной температуре. Недостатком известного способа является необходимость использования специальных сорбционных патронов, использование токсичных органических растворителей на этапе пробоподготовки и необходимость использования дорогостоящего оборудования для анализа.

Известен способ определение андреналина в моче [5], основанный на предварительном экстрагировании аналита в тетрагидрофуран, центрифугировании и последующей стадией дериватизации, позволяющей получить люминесцирующий дериват для анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием. Недостатком способа является его низкая чувствительность, поскольку процедура пробоподготовки не предусматривает концентрирование целевых веществ.

Еще один способ определения адреналина [6] основан на дисперсионной жидкостной микроэкстракции и предполагает использование бромалканов в качестве экстрагента и полярных растворителей (ацетон, ацетонитрил или метанола) в качестве диспергатора. После экстракции проводят дериватизацию аналита с добавлением 4'-карбонилхлорида (фосгена) и родамина. Далее экстракт анализируют с помощью методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Существенным недостатком способа является необходимость использования токсичных реагентов как для дериватизации так и экстракции целевых веществ.

Наиболее близким к заявленному изобретению и выбранным в качестве прототипа является способ определения адреналина в моче методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием [7], который включает дериватизацию аналитов. Подготовку проб осуществляют путем дериватизации аналита с использованием боратного буфера и 9-флуоренил-метоксикарбонил хлорида (дериватизирующий агент). Смесь выдерживали при комнатной температуре 15 мин. После чего проводили жидкостную экстракцию хлороформом с последующим упариванием экстракта в токе азота и перерастворением сухого остатка.

Недостатком предложенного способа является необходимость использования токсичного органического растворителя хлороформа, который несовместим с обращенно-фазовой хроматографией и требует замены растворителя.

Техническим результатом заявленного изобретения является способ подготовки проб мочи, позволяющий определить ультранизкие концентрации адреналина в пробах мочи и исключающий использование токсичных органических растворителей или специальных сорбентов для выделения аналита из пробы.

Техническая задача заявленного изобретена состоит в сокращение расхода применяемых реагентов для проведения стадии пробоподготовки, использование экологически-безопасных и биоразлагаемых компонентов, достижение низких пределов обнаружения благодаря концентрированию аналита и использованию флуоресцентного детектирования.

Указанный технический результат достигается тем, что на этапе пробоподготовки изначально пробу мочи разбавляют в 40 раз, далее осуществляют дериватизацию адреналина с о-фенилендиамином для получения люминофора, обеспечивающего возможность анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием [8]. После дериватизации проводится этап мицеллярной экстракции, который заключается в добавлении к деривату раствора биоразлагаемого неоиногенного поверхностно-активного вещества алкилполигликозида. Далее к пробе добавляют гептановую кислоту и хлорид натрия, в результате чего наблюдается разделение фаз - в нижнюю фазу обогащенную алкилполигликози-дом концентрируется дериват. После центрифугирования экстракционную смесь охлаждают 5 мин при минус 20°С с целью увеличения вязкости мицеллярной фазы и ее более простого отбора для последующего анализа. Охлаждение смеси позволило легко удалить водную фазу и обеспечило высокую воспроизводимость результатов анализа (прецизионность в условиях повторяемости не превышала 7%). Количественное определение аналита в пробе проводили с использованием метода абсолютной градуировки.

Отличительными признаками заявляемого способа от наиболее близкого аналога, взятого за прототип, являются:

- проведение процедуры в микромасштабах с использованием микрообьемов применяемых реагентов и компонентов экстракционной смеси;

- использование экологически безопасной и биоразлагаемой экстракционной смеси;

- исключение необходимости осуществлять стадию замены растворителя для последующего хроматографического анализа.

Заявляемые отличительные признаки позволяют обеспечить концентрирование и определение низких содержаний адреналина в биологических жидкостях без использования токсичных органических экстрагентов.

Заявленный способ был апробирован в лабораторных условиях СПбГУ, результаты апробации представлены в виде конкретного примера реализации. Исследования проведены с использованием оборудования ресурсного центра «Методы анализа состава вещества» Научного парка СПбГУ и инструментального обеспечения кафедры аналитической химии.

Пример.

Пробоотбор

Пробы мочи отбирали у некурящих добровольцев в полимерные стерильные емкости объемом 50 мл и консервировали добавлением 1,25 мл 4 моль/л HCl для получения конечной концентрации кислоты 0,1 моль/л. После этого пробы хранились в холодильной камере не более недели.

Пробоподготовка

Непосредственно перед анализом законсервированные пробы мочи разбавляли в 40 раз. Далее, на первой стадии проводили дериватизацию адреналина. Для этого к 300 мкл пробы добавляли 30 мкл 0,25 моль/л NaOH и проводили термостатирование смеси 8 мин при 40°С. После этого к раствору добавляли 70 мкл 4,5% раствора ацетона и 100 мкл 0,005 моль/л раствора дериватизирующего агента о-фенилендиамина. Полученную смесь термостатиро-вали повторно на кипящей водяной бане в течение 4 мин. В результате дериватизации адреналина протекало образование люминофора. Далее проводили стадию выделения деривата с помощью мицеллярной экстракции. К раствору деривата добавляли 210 мкл ал-килполигликозида С8-10 (ПАВ), 20 мкл гептановой кислоты и 40 мкл 20% раствора NaCl. Полученную смесь интенсивно встряхивали и центрифугировали, в результате чего образовывалась мицеллярная фаза, в которую извлекался дериват. На следующем этапе пробу охлаждали с целью увеличения вязкости мицеллярной фазы и ее более простого отделения для последующего анализ методом ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием. Диапазон определяемых концентраций адреналина составил 0,03-1000 мкг/л, а предел обнаружения 0,01 мкг/л. Степень извлечения аналита превышает 90%. Предложенный способ был использован для анализа 4 проб мочи, полученных от добровольцев. Результаты анализа представлены в таблице 1. Во всех пробах удалось обнаружить адреналин в количестве от 18 до 45 мкг/л.

Предложенный способ прост в реализации, обеспечивает высокую чувствительность анализа и исключает использование токсичных растворителей на стадии экстрагирования, что полностью соответствует современным научным и социальным трендам, направленным на внедрение концепции обеспечения экологической безопасности окружающей среды. Предложенный способ может быть использован в клинических исследованиях для определения содержания адреналина в биологических жидкостях и оценки общего состояния пациента.

Список использованных источников информации

[1] R. P. Н. Nikolajsen and А. М. Hansen, "Analytical methods for determining urinary catecholamines in healthy subjects," Anal. Chim. Acta, vol. 449, no. 1-2, pp. 1-15, 2001, doi: 10.1016/S0003-2670(01)01358-7.

[2] Л. А. Сидорова, А А, Карпова, "Хроматографическое и электрофоретическое определение катехоламинов, метанефринов и 3,4-дигидроксифенилаланина в моче и плазме крови Сидорова," Сорбционные и хроматографические процессы, pp. 533-542, 2010.

[3] М. Peitzsch et ah, "Simultaneous liquid chromatography tandem mass spectrometric

determination of urinary free metanephrines and catecholamines, with comparisons of free and deconjugated metabolites," Clin. Chim. Acta, vol. 418, pp. 50-58, 2013, doi: 10.1016/j.cca.2012.12.031.

[4] Патент РФ А. А. Азарян, A. 3. Темердашев, E. В. Дмитриева, Гашимова Э.М., "Способ определения производных катехоламинов в моче," №2688184 С1, 2019 (прототип)

[5] Y. Sakaguchi et ah, "Selective liquid-chromatographic determination of native fluorescent biogenic amines in human urine based on fluorous derivatization," J. Chromatogr. A, vol. 1218, no. 33, pp.5581-5586, 2011, doi: 10.1016/j.chroma.2011.05.076.

[6] Патент КНР Z. XIANEN et ah, "Detecting method for determining various neurotransmitters on the basis of in situ derivation," №105866303 B, 2016.

[7] E. C. Y. Chan, P. Y. Wee, P. Y. Ho, and P. С.Ho, "High-performance liquid

chromatographic assay for catecholamines and metanephrines using fluorimetric detection with pre-column 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride derivatization," J. Chromatogr. BBiomed. Sci. Apph, vol. 749, no. 2, pp.179-189, 2001, doi: 10.1016/S0378- 4347(00)00423-0. (прототип)

[8] J. Yang et al., "Fluorimetric determination of epinephrine with o-phenylenediamine," Anal. Chim. Acta, vol. 363, no. 1, pp. 105-110, May 1998, doi: 10.1016/S0003-2670(98)00017-8.

Изобретение относится к области анализа биологических материалов. Описан способ подготовки проб мочи для определения содержания адреналина, заключающийся в том, что пробу мочи разбавляют дистиллированной водой, проводят дериватизацию в присутствии о-фенилендиамина, к полученному флуоресцирующему деривату добавляют биоразлагаемый алкилполигликозид, раствор хлорида натрия и гептановую кислоту. Смесь перемешивают, центрифугируют и охлаждают для повышения вязкости выделившейся мицеллярной фазы, в которую концентрируется дериват. Далее водную фазу удаляют, а органическую используют для последующего хроматографического анализа. Количественное определение аналита в пробе проводят на основе предварительно построенного градуировочного графика с применением калибровочных растворов аналита. Техническим результатом заявленного изобретения является способ подготовки проб мочи, позволяющий определить ультранизкие концентрации адреналина в пробах мочи и исключающий использование токсичных органических растворителей или специальных сорбентов для выделения аналита из пробы. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 пр.

1. Способ подготовки проб мочи для определения содержания адреналина, основанный на использовании жидкостно-жидкостной экстракции с предварительной дериватизацией, последующим извлечением деривата в экстрагент и анализом экстракта с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием, отличающийся тем, что пробу мочи разбавляют дистиллированной водой, взятой в соотношении с пробой 1:40, после чего 300 мкл разбавленной пробы мочи помещают в полимерную микропробирку и добавляют 30 мкл 0,25 моль/л NaOH, затем смесь термостатируют не менее 8 мин при 40°С, добавляют к раствору 70 мкл 4,5% раствора ацетона и 100 мкл 0,005 моль/л раствора дериватизирующего агента, в качестве которого берут о-фенилендиамин, полученную смесь термостатируют на кипящей водяной бане в течение не менее 4 мин до образования люминофора и затем проводят экстракцию путем добавления к раствору смеси из 210 мкл алкилполигликозида С8-10, 20 мкл гексановой кислоты и 40 мкл 20% раствора NaCl, полученную смесь после интенсивного встряхивания центрифугируют и охлаждают при температуре -18°С в течение 5 мин, после чего сливают верхнюю водную фазу, а оставшуюся органическую фазу с экстрагированным дериватом адреналина подвергают анализу ВЭЖХ с флуориметрическим детектированием с длинами волн возбуждения и испускания 484 и 500 нм соответственно, в качестве элюента используют смесь органических растворителей метанола и ацетонитрила, взятых в соотношении 2:1, и 0,5% муравьиную кислоту, при объемной доли органического компонента 40% и скорости потока подвижной фазы 0,8 мл/мин, после чего определяют площадь хроматографического пика и по его величине судят о концентрации адреналина в пробе мочи, используя градировочную зависимость.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дериватизацию аналита проводят с помощью о-фенилендиамина при нагревании с последующим извлечением деривата в мицеллярную фазу, образующуюся при использовании неионогенного биоразлагаемого поверхностно-активного вещества и гептановой кислоты.