Средство, обладающее капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью, и способ его получения Российский патент 2024 года по МПК A61K36/489 A61P9/14 A61P7/00 

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, и касается способов получения средств, содержащих извлечения из растительного сырья, а именно средства, содержащего извлечение из плодов софоры японской, обладающего капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью.

Из уровня техники известен способ получения средства, обладающего антианафилактическим действием, включающий экстракцию плодов софоры японской 55 - 60 %-ым спиртом этиловым при соотношении сырье : экстрагент, равном 1:7, с последующей обработкой экстракта электроимпульсными разрядами продолжительностью 50 - 52 мин и напряжением 22,4 - 23,0 кВ [RU 2029555C1, 27.02.1995]. Недостатками этого способа являются однократная экстракция и применение высокого напряжения для активации экстракта.

Также из уровня техники известно средство на растительной основе, обладающее капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью [RU 2241483C1, 10.12.2004]. Средство содержит водно-спиртовой экстракт (содержание спирта этилового 25 %) смеси плодов конского каштана обыкновенного, корней солодки, плодов шиповника и плодов боярышника. Недостатком данного средства является композиция активных компонентов неопределенного состава.

Также из уровня техники известна лекарственная форма с антиагрегационным действием и способ ее изготовления [RU 2303980C2, 10.08.2007]. Способ получения лекарственной формы, обладающей антиагрегационным действием, включает смешивание порошков клопидогрела гидросульфата, сахара молочного, крахмала, таблетирование и нанесение оболочки, отличающийся тем, что при смешивании добавляют порошки полиэтиленгликоля и целлюлозы микрокристаллической, увлажняют полученную смесь водным раствором гидроксипропилметилцеллюлозы, осуществляют влажное гранулирование, сушку, сухое гранулирование, последующее опудривание смесью магния стеарата и кислоты стеариновой, а ядра-таблетки покрывают оболочкой нанося водную суспензию диоксида титана в водном растворе гидроксипропилметилцеллюлозы, полиэтиленгликоля и оксида железа красного. Недостатком данного способа является применение активного вещества с сильным побочным действием, а также не предусмотрено получение экстрактов из растительного сырья.

Также из уровня техники известен способ получения средства, содержащего растительные извлечения, путем трехкратной экстракции методом мацерации смеси растительного сырья, состоящей из травы мелиссы, травы зверобоя, травы пустырника, 70 % этиловым спиртом, фильтрации, при этом растительное сырье предварительно измельчают до 2 мм, смесь растительного сырья дополнительно содержит траву чабреца при соотношении растительных компонентов в смеси - трава пустырника : трава зверобоя : трава чабреца : трава мелиссы 4:2,5:1:2,5, экстрагируют смесь при соотношении сырье : экстрагент : 1:1, при температуре не более 60°С, с делением экстрагента на равные части и времени контактов 60 мин, 60 мин и 30 мин, соответственно, полученные водно-спиртовые экстракты объединяют, отстаивают при температуре 4-8°С в течение 3 суток, фильтруют, упаривают до получения 70% водно-спиртового экстракта [RU 2683643C1, 01.04.2019]. Недостатком данного способа является длительность процесса для получения сгущенного водно-спиртового экстракта в 70% спирте этиловом. Данный способ может быть выбран в качестве ближайшего аналога для заявленного изобретения.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение экстракта в виде аморфного гигроскопичного порошка с установленным составом.

Технический результат достигается благодаря тому, что в способе получения средства, обладающего капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью, который включает измельчение высушенных плодов софоры японской до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1-2 мм, и трёхкратную экстракцию спиртом этиловым 40-70 % в соотношении сырье:экстрагент 1:10 - 1:12 при постоянном перемешивании в течение 60 мин для каждой стадии, затем объединение полученных извлечений, и концентрирование под вакуумом до водного остатка, затем очищение водного остатка от липофильных соединений путём трёхкратной обработки дихлорэтаном или хлороформом, затем отделение образовавшегося в водном остатке осадка путем фильтрования, и концентрирование надосадочной части и сушка досуха до получения аморфного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета.

Пример 1. Способ получения средства, обладающего капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью.

Высушенные плоды софоры японской измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1-2 мм, и трёхкратно экстрагировали спиртом этиловым 40 % в соотношении сырье:экстрагент 1:10 при постоянном перемешивании в течение 60 мин, затем извлечения объединяли, и концентрировали под вакуумом до водного остатка, затем водный остаток очищали от липофильных соединений путём трёхкратной обработки дихлорэтаном или хлороформом, затем отделяли образовавшийся в водном остатке осадок путем фильтрования, а надосадочную часть концентрировали и высушивали досуха до получения аморфного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета. Выход сухого экстракта от сырья составил 49,2% (по массе), с содержанием суммы флавоноидов в пересчете на кемпферол-глюкозид в экстракте 12,99 %.

Пример 2. ВЭЖХ-УФ-МС/МС спектроскопия полученного сухого экстракта.

В результате проведенного фитохимического исследования методом ВЭЖХ-УФ-МС/МС в полученном экстракте идентифицированы вещества фенольного характера, представленные гликозидами кемпферола, кверцетина и генистеина (Рис. 1, Табл. 3).

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на кемпферол-глюкозид, установленное методом дифференциальной спектрофотометрии в экстракте составляет 13,03%.

Пример 3. Способ получения средства, обладающего капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью.

Высушенные плоды софоры японской измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1-2 мм, и трёхкратно экстрагировали спиртом этиловым 40 % в соотношении сырье : экстрагент 1:12 при постоянном перемешивании в течение 60 мин, затем извлечения объединяли, и концентрировали под вакуумом до водного остатка, затем водный остаток очищали от липофильных соединений путём трёхкратной обработки дихлорэтаном или хлороформом, затем отделяли образовавшийся в водном остатке осадок путем фильтрования, а надосадочную часть концентрировали и высушивали досуха до получения аморфного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета. Выход сухого экстракта от сырья составил 54,88 % (по массе), с содержанием суммы флавоноидов в пересчете на кемпферол-глюкозид в экстракте 13,08 %.

Пример 4. Способ получения средства, обладающего капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью.

Высушенные плоды софоры японской измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1-2 мм, и трёхкратно экстрагировали спиртом этиловым 70 % в соотношении сырье : экстрагент 1:10 при постоянном перемешивании в течение 60 мин, затем извлечения объединяли, и концентрировали под вакуумом до водного остатка, затем водный остаток очищали от липофильных соединений путём трёхкратной обработки дихлорэтаном или хлороформом, затем отделяли образовавшийся в водном остатке осадок путем фильтрования, а надосадочную часть концентрировали и высушивали досуха до получения аморфного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета. Выход сухого экстракта от сырья составил 51,61 % (по массе), с содержанием суммы флавоноидов в пересчете на кемпферол-глюкозид в экстракте 13,14 %.

Пример 5. Способ получения средства, обладающего капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью.

Высушенные плоды софоры японской измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1-2 мм, и трёхкратно экстрагировали спиртом этиловым 70 % в соотношении сырье : экстрагент 1:12 при постоянном перемешивании в течение 60 мин, затем извлечения объединяли, и концентрировали под вакуумом до водного остатка, затем водный остаток очищали от липофильных соединений путём трёхкратной обработки дихлорэтаном или хлороформом, затем отделяли образовавшийся в водном остатке осадок путем фильтрования, а надосадочную часть концентрировали и высушивали досуха до получения аморфного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета. Выход сухого экстракта от сырья составил 57,62 % (по массе), с содержанием суммы флавоноидов в пересчете на кемпферол-глюкозид в экстракте 13,68 %.

Пример 6. Определение капилляроукрепляющей активности экстракта плодов софоры.

Изучение капилляроукрепляющего действия экстракта плодов софоры японской выполняли согласно «Методике определения реактивности капилляров кожи к воспалительным раздражителям» на модели локальной воспалительной реакции (ксилолового воспаления) на крысах [Миронов А.Н. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств // М., ФГБУ «НЦЭМСП» в 2-х томах - 2012].

В эксперименте использовали нелинейных крыс самцов массой тела 200,0-220,0 г. Животные были разделены на 4 группы по 8 особей в каждой. Животным опытных групп экстракт вводили в дозах 100 и 200 мг/кг. Препаратом сравнения являлась очищенная микронизированная флавоноидная фракция (диосмин + флавоноиды в пересчете на гесперидин) (ОМФФ) в дозе 80 мг/кг. Исследуемые вещества суспендировали в 1 % крахмальном геле и водили крысам внутрижелудочно 1 раз в сутки на протяжении 30 суток. Контрольные животные получали крахмальный гель в эквивалентном объеме.

За сутки до последнего введения исследуемых веществ всем животным депилировали переднюю брюшную стенку. Площадь депилируемой поверхности составляла 3×3 см². За 12 часов до начала проведения эксперимента животных лишали корма. В качестве индикатора проницаемости сосудов использовали раствор трепановой сини. Через 1 час после последнего введения исследуемых веществ животным в хвостовую вену вводили 0,5% раствор трепанового синего в 0,9% растворе NaCl в объеме 1 мл на 100 г массы тела. Через 30 секунд на кожу животных наносили 50 мкл ксилола. Далее регистрировали время появления первых петехий (в мин), время их отчетливого окрашивания, а также интенсивность прокрашивания. По разнице во времени появления пятен и их диаметру (визуально) в контрольной и опытных группах судили о действии исследуемых объектов на проницаемость капилляров.

Результаты изучения капилляроукрепляющего действия экстракта плодов софоры японской приведены в табл. 1.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что экстракт плодов софоры японской обладает выраженным капилляроукрепляющим действием в условиях экспериментальной модели ксилолового воспаления, снижая проницаемость сосудистой стенки. В группах животных, получавших экстракта плодов софоры японской в дозах 100 и 200 мг/кг, отмечено достоверное увеличение времени появления петехий (на 28 и 34 % соответственно) и времени отчетливого их прокрашивания (на 25 и 31 %), что говорит о выраженном капилляроукрепляющем действии исследуемого экстракта. У животных, получавших препарат сравнения в дозе 80 мг/кг, также отмечено достоверно выраженное увеличение времени появления петехий (на 38%) по сравнению с контрольной группой. Также отмечено увеличение времени отчетливого прокрашивания петехий на 28 %. Достоверных различий между временем появления петехий у животных, получавших экстракт плодов софоры в дозах 200 мг/кг и группы, получавшей препарат сравнения, зарегистрировано не было, что свидетельствует о сопоставимом капилляроукрепляющем эффекте экстракта плодов софоры японской и препарата сравнения.

Пример 7. Определение антиагрегационной активности экстракта плодов софоры японской.

Эксперименты в условиях in vitro выполнены на крови здоровых доноров-мужчин в возрасте 18-24 лет. Общее количество доноров составило 8 человек. Забор крови для исследования соединений в отношении системы гемостаза проводился из кубитальной вены с использованием систем вакуумного забора крови BD Vacutainer® (Becton Dickinson and Company, США). В качестве стабилизатора венозной крови использовался 3,8% раствор цитрата натрия в соотношении 9:1. Все тесты проводились на обогащенной и обедненной тромбоцитами плазмах. Образцы богатой тромбоцитами плазмы получали центрифугированием цитратной крови при 1000 об/мин в течение 10 минут, бестромбоцитарной плазмы - при 3000 об/мин в течение 20 минут. В работе использовалась центрифуга ОПН-3.02 (ОАО ТНК "ДАСТАН", Киргизия).

Исследование влияния на агрегацию тромбоцитов проводили по методу Born (Born G.G.V.Nature (London).-1962 .-V. 194.) на агрегометре АТ-02 (НПФ «Медтех», Россия). В качестве индукторов агрегации использовали аденозиндифосфат (АДФ) в концентрации 20 мкг/мл и коллаген в концентрации 5 мг/мл производства «Технология-Стандарт» (Россия). Проводили оценку максимальной амплитуды агрегации, скорости агрегации, время достижения максимальной амплитуды и дезагрегацию в присутствии изучаемых соединений при агрегации тромбоцитов, индуцированной АДФ. При коллаген-индуцированной агрегации тромбоцитов оценивали латентный период, во время которого происходит активация фосфолипазы С (что приводит к образованию вторичных посредников, вследствие чего развивается секреция тромбоцитарных гранул и синтез тромбоксана А2).

Для оценки фармакологической активности исследуемый экстракт вносили в плазму из расчета 5 % от объема реакционной смеси. Антиагрегационная активность пентоксифиллина и ацетилсалициловой кислоты представлена для концентрации 1×10-3 М/л, антикоагуляционная активность гепарина натрия - для концентрации 5×10-4 г/мл.

Показатели антиагрегационной активности образцов экстракта софоры японской и препаратов сравнения представлены в табл. 2.

Согласно полученным данным, экстракт плодов софоры японской как и препараты сравнения, уменьшает максимальную амплитуду агрегации тромбоцитов на 11,4% на уровне с препаратом сравнения ацетилсалициловой кислотой, что говорит об их влиянии на агрегацию тромбоцитов.

Экстракт плодов софоры японской на 11,43 % увеличивает латентный период агрегации тромбоцитов, как и препарат сравнения - пентоксифиллин (на 32,4%), в то время как препарат сравнения - ацетилсалициловая кислота уменьшает этот показатель (на 2,1%). Исследуемый экстракт оказывает влияние на скорость агрегации тромбоцитов достоверно снижая ее на 14,2%, при этом результаты превосходили препарат сравнения - ацетилсалициловую кислоту (10,9%) и в меньшей степени, но были сопоставимы с пентоксифиллином (34,9%). По показателю - время достижения максимальной амплитуды показатели (20,2 %) экстракт плодов софоры японской превосходили ацетилсалициловую кислоту (10,5%) и был сопоставим с пентоксифиллином (32,1%). В присутствии исследуемого экстракта, как и препарата сравнения - ацетилсалициловой кислотой, не наблюдалась дезагрегация тромбоцитов, в отличие от препарата сравнения - пентоксифиллина.

Таким образом, на основании представленных примеров установлено, что экстракт плодов софоры японской проявляют антиагрегационную активность, на уровне с ацетилсалициловой кислотой.

Группа изобретений относится к области фармацевтики, а именно к средству, обладающему капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью, и способу его получения. Средство, обладающее капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью, включает сухой экстракт плодов софоры японской в виде аморфного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета, с содержанием суммы флавоноидов в пересчете на кемпферол-глюкозид в экстракте 12,99-13,68 % по массе. Способ получения средства, обладающего капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью, включает измельчение высушенных плодов софоры японской до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1-2 мм, и трёхкратную экстракцию спиртом этиловым 40-70 % в соотношении сырье:экстрагент 1:10–1:12 при постоянном перемешивании в течение 60 мин для каждой стадии, затем объединение полученных извлечений, и концентрирование под вакуумом до водного остатка, затем очищение водного остатка от липофильных соединений путём трёхкратной обработки дихлорэтаном или хлороформом, затем отделение образовавшегося в водном остатке осадка путем фильтрования, и концентрирование надосадочной части и сушка досуха до получения аморфного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета. Вышеописанная группа изобретений позволяет получать экстракт, обладающий капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью, в виде аморфного гигроскопичного порошка с установленным составом. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 3 табл., 7 пр.

1. Средство, обладающее капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью, включающее сухой экстракт плодов софоры японской в виде аморфного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета, с содержанием суммы флавоноидов в пересчете на кемпферол-глюкозид в экстракте 12,99-13,68 % по массе.

2. Способ получения средства, обладающего капилляроукрепляющей и антиагрегационной активностью, по п. 1, включающий измельчение высушенных плодов софоры японской до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1-2 мм, и трёхкратную экстракцию спиртом этиловым 40-70 % в соотношении сырье:экстрагент 1:10–1:12 при постоянном перемешивании в течение 60 мин для каждой стадии, затем объединение полученных извлечений, и концентрирование под вакуумом до водного остатка, затем очищение водного остатка от липофильных соединений путём трёхкратной обработки дихлорэтаном или хлороформом, затем отделение образовавшегося в водном остатке осадка путем фильтрования, и концентрирование надосадочной части и сушка досуха до получения аморфного гигроскопичного порошка светло-коричневого цвета.