СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА ИЗ ТРАВЫ ЯРУТКИ ПОЛЕВОЙ, ОБЛАДАЮЩЕГО АНТИОКСИДАНТНОЙ, ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ, АНТИКОАГУЛЯЦИОННОЙ И АНТИАГРЕГАЦИОННОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2025 года по МПК A61K36/31 B01D11/00 A61K135/00 A61P7/02 A61P29/00 A61P39/06 

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа получения средства растительного происхождения, а именно средства, обладающего антиоксидантной, противовоспалительной, антикоагуляционной и антиагрегационной активностью, полученного из травы ярутки полевой.

Известен способ получения растительного средства, обладающего антиоксидантной активностью, из красных листьев винограда культурного сорта Каберне [патент RU 2568908, 2015], которое получают в виде сухого экстракта путем трехкратной экстракции спиртом этиловым 20-50% и содержащего сумму фенольных соединений в пересчете на рутин - не менее 5% и ресвератрола - не менее 0,005%. Недостатком данного способа является использование водно-спиртового экстрагента низкой концентрации, которое недостаточно полно извлекает действующие вещества из листьев винограда.

Известен способ получения средства растительного происхождения в виде густого экстракта из травы первоцвета весеннего [патент RU 2342942, 2009], который получают путем экстракции спиртом этиловым 70% методом мацерации и рекомендуют использовать для лечения и профилактики заболеваний, где основным патогенетическим фактором является нарушение процессов перекисного и свободнорадикального окисления, особенно липидов. Недостатком известного способа является проведение экстракции без нагревания, что не позволяет извлечь всю сумму фенольных соединений из сырья.

Известен способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования действующих веществ спиртом этиловым 50-60% при температуре 90°С или водой при температуре 100°С из листьев какалии копьевидной и получение сухого экстракта [патент RU 2206333, 2003]. Недостатком является то, что в качестве сырья используют листья какалии копьевидной, которая в природе не образует плотных зарослей, что затрудняет заготовку сырья и ограничивает возможность промышленного получения продукта [Губанов И.А., Киселёва К.В., Новиков B.C., Тихомиров В.Н. Иллюстрированный определитель растений Средней России: Том 3. Покрытосеменные (двудольные: спайнолепестные). - М.: Тов-во науч. изд. КМК: Ин-т технол. исслед., 2004. - С. 354].

Известен способ получения средства, обладающего противовоспалительным действием, путем экстракции измельченных листьев осины обыкновенной спиртом этиловым 40% методом многоступенчатого противоточного экстрагирования при определенных условиях [патент RU 2456015, 2012]. Недостатком данного способа является длительный процесс получения готового продукта.

Известен способ получения средства, обладающего антиагрегационной и гипотензивной активностью, включающий трехкратное экстрагирование надземной части и корней марьянника лугового спиртом этиловым 50% в соотношении сырье-экстрагенг 1:10 в течение 60 мин в присутствии карбоната кальция при нагревании на кипящей водяной бане и получение сухого экстракта [патент RU 2222339, 2004]. Недостатком является использование лекарственного растительного сырья, содержащего сильнодействующие вещества.

Известен способ получения средства, обладающего антиагрегантной и антикоагулянтной активностью [патент RU 2601407, 2016], путем трехкратной экстракции сухой коры корней Maackia amurensis спиртом этиловым 90% при определенных условиях, содержащего комплекс изофлавоноидов. Недостатком данного способа является сложная схема получения гликозидных форм изофлавонов.

Наиболее близким аналогом изобретения, взятым за прототип, является способ получения средства, обладающего антиагрегантной и антиоксидантной активностью [патент RU 2785678, 2022], согласно которому побеги различных видов боярышников, измельченных до размера 2 мм, экстрагируют водой очищенной при соотношении сырье-экстрагент 1:10 в течение 2 часов при кипении. Полученное извлечение фильтруют, после чего фильтрат упаривают при температуре 55°С до получения густой массы и затем высушивают при температуре 50-60°С. Недостатком прототипа является использование в качестве экстрагента воды очищенной, которая не позволяет достаточно полно извлечь сумму флавоноидов, которые в большей степени отвечают за фармакологический эффект.

Задачей изобретения является разработка способа получения растительного средства из травы ярутки полевой, обладающего антиоксидантной, противовоспалительной, антикоагуляционной и антиагрегационной активностью.

Техническим результатом предлагаемого способа является увеличение выхода суммы флавоноидов, как основной группы действующих веществ и расширение спектра биологической активности.

Предлагаемый способ получения растительного средства, обладающего антиоксидантной, противовоспалительной, антикоагуляционной и антиагрегационной активностью, осуществляется следующим образом. В качестве растительного сырья используют траву ярутки полевой. Сырье измельчают до размера частиц 2 мм и трехкратно экстрагируют спиртом этиловым 70% в соотношении сырье:экстрагент 1:50 в течение 2 час при температуре 80-90°С. При этом первую экстракцию проводят в течение 60 мин, вторую - 30 мин и третью - 30 мин. Полученные извлечения фильтруют, объединяют, упаривают, концентрируют и высушивают с получением сухого экстракта.

Для выявления оптимального экстрагента, извлекающего основную группу действующих веществ из растительного сырья и обеспечивающего наиболее выраженную биологическую активность были получены спиртовой и водный экстракты из травы ярутки полевой.

Получение спиртового экстракта из травы ярутки полевой: 100,0 грамм сухой травы ярутки полевой измельчают до размера частиц 2 мм, трехкратно экстрагируют спиртом этиловым 70% при температуре 80-90°С в соотношении сырье:экстрагент 1:50 в течение 2 часов, при этом первую экстракцию проводят в течение 60 мин, вторую - 30 мин и третью - 30 мин. Полученные извлечения фильтруют, объединяют и концентрируют под вакуумом. Густой экстракт высушивают при температуре 60±5°С до получения гигроскопичного порошка зеленовато-коричневого цвета. Выход сухого экстракта составляет 20-23% от массы воздушно-сухого сырья.

Получение водного экстракта из травы ярутки полевой: 100,0 грамм сухой травы ярутки полевой измельчают до размера частиц 2 мм, трехкратно экстрагируют водой очищенной при температуре 100°С в соотношении сырье:экстрагент 1:50 в течение 2 часов, при этом первую экстракцию проводят в течение 60 мин, вторую - 30 мин и третью - 30 мин. Полученные извлечения фильтруют, объединяют и концентрируют под вакуумом. Густой экстракт высушивают при температуре 60±5°С до получения гигроскопичного порошка зеленовато-коричневого цвета. Выход сухого экстракта составляет 24-27% от массы воздушно-сухого сырья.

В полученных водном и спиртовом экстрактах было определено содержание суммы флавоноидов (таблица 1), как основной группы действующих веществ, от которой зависит биологическая активность растительного средства. В результате установлено, что в большем количестве они содержатся в спиртовом экстракте.

Для оценки биологической активности из спиртового и водного сухих экстрактов были приготовлены водные растворы в соотношении 1:10, которые использовали для исследования.

Пример 1. Антиоксидантная активность.

Антиоксидантная активность определялась в условиях in vitro методом хемолюминисценции [Пупыкина К.А., Красюк Е.В., Старцева Л.В. Сравнительное изучение антиоксидантной активности некоторых представителей семейства губоцветных // Матер. международной научной конференции «От биохимии растений к биохимии человека». - Москва, 2022. - С. 216-220]. Исследование антиоксидантной активности проводилось при добавлении 1 мл исследуемого раствора на 20 мл реакционной смеси. В качестве препарата сравнения использовали аскорбиновую кислоту (2-ацетилоксибензойная кислота «Ацетилсалициловая кислота», Фармацевтическая фабрика Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Ко., ЛТД, Китай). Оценка антиоксидантной активности проводилась в двух модельных системах.

Модель 1 (I). Генерацию активных форм кислорода (АФК) осуществляли при использовании 20 мл фосфатного буфера с добавлением цитрата натрия и люминола. Состав буфера: 2,72 г KH₂PO₄, 7,82 г. KCl, 1,5 г цитрата натрия C₆H₈O₇Na₃⋅5,5H₂O на 1 литр дистиллированной воды. Величину рН полученного раствора доводили до значения 7,45 с помощью насыщенного раствора КОН, к которому затем добавляли 0,2 мл маточного раствора люминола (10^-5М). Люминол (5-амино-2,3-дегидро-4-фталазиндион) окисляется и образует электронно-возбужденные карбонильные хромофоры с высоким квантовым выходом. В результате образования активных форм кислорода резко повышается интенсивность свечения. Образование АФК инициировали введением 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа. Хемилюминесценцию регистрировали в течение 5 минут.

Модель 2 (II). Оценку влияния исследуемого раствора на перекисное окисление липидов (ПОЛ) осуществляли, используя липопротеиновые комплексы из куриного желтка. Желток смешивали с фосфатным буфером в соотношении 1:5, затем гомогенизировали. Хемилюминесценцию инициировали добавлением 1 мл 50 мМ раствора сернокислого железа, запускавшего процесс окисления ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав липидов. По интенсивности развивающегося свечения судили о процессах перекисного окисления липидов.

Регистрацию свечения проводили на хемилюминомере «ХЛМ-003» (Россия). В качестве контроля использовали модельные системы без добавления исследуемого раствора. Антиоксидантная активность определялась по степени угнетения хемолюминесценции в процентах от контроля (таблица 2).

В результате установлено, что исследуемые экстракты травы ярутки полевой проявляют антиоксидантную активность как в модельной системе генерации активных форм кислорода (I), так и перекисного окисления липидов (II). Препарат сравнения - аскорбиновая кислота уменьшала генерацию АФК на 84,5% и снижала скорость ПОЛ на 78,1%. Показатели спиртового экстракта были выше, чем показатели водного экстракта: спиртовой экстракт ярутки полевой уменьшал генерацию АФК на 22,4% и снижал скорость ПОЛ на 50,5%, а водный экстракт уменьшал генерацию АФК на 14,5% и снижал скорость ПОЛ на 30,3%. Таким образом, в условиях in vitro на модельных системах генерации активных форм кислорода (I) и перекисного окисления липидов (II) спиртовой экстракт из травы ярутки полевой проявлял более выраженную антиоксидантную активность, чем водный экстракт.

Пример 2. Противовоспалительная активность.

Противовоспалительная активность определялась в условиях in vivo на половозрелых крысах-самцах линии Wistar массой 250-300 г, которые содержались в условиях вивария согласно положениям «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях ETS N 123» (Страсбург, 18.03.1986 г) [Шамсутдинова С.Р., Макарова Н.Н., Валеева Л.А., Пупыкина К.А. Изучение противовоспалительной активности водных извлечений из травы и корней бодяка полевого // Медицинский вестник Башкортостана. - 2015. - №6. - С. 51-53]. Острую воспалительную реакцию в виде отека воспроизводили субплантарным введением 0,1 мл 2% раствора формалина. Исследуемые растворы вводили принудительно ежедневно на протяжении недели. Отек лапки животных определяли по разнице диаметра лапки (мм), измеренного через 4 и 24 часа после индукции воспаления относительно диаметра лапки до индукции воспаления - 0 час. В качестве препарата сравнения использовали диклофенак натрия (ООО «Гротекс», Россия), который вводили за 1 час до моделирования отека в дозировке 10 мг/кг внутрибрюшинно. Противовоспалительный эффект оценивали по уменьшению отека лапки у крыс исследуемого раствора относительно показателя контрольной группы и препарата сравнения. Об интенсивности выраженности воспаления судили по проценту индекса ингибирования отека на пике воспаления через 4 часа (таблица 3).

В результате исследования установлено, что все экстракты из травы ярутки полевой снижали величину отека через 4 часа после индукции воспаления, т.е. на пике его развития. При этом индекс ингибирования отека на пике воспаления у спиртового экстракта составил 66,67%, что было сопоставимо с препаратом сравнения - диклофенаком натрия (72,22%), а индекс водного экстракта был несколько ниже и составил 50,02%. К концу опыта через 24 часа после индукции воспаления выраженность воспалительной реакции снизилась в обеих исследуемых группах, что свидетельствовало о торможении экссудативной фазы воспаления, но более выраженные показатели отмечались при использовании спиртового экстракта травы ярутки полевой.

Пример 3. Антиагрегационная и антикоагуляционная активность.

Антиагрегационная и антикоагуляционная активность определялась in vitro. Исследуемые растворы экстрактов травы ярутки полевой вносились в плазму из расчета 5% от объема реакционной смеси. Определение антиагрегационной активности проводили на агрегометре «АТ-02» (НПФ «Медтех», Россия) по методу Born [Born G.G.V. Nature (London). - 1962. - V. 94, p. 927-929], определение антикоагуляционной активности - на оптическом двухканальном автоматизированном анализаторе свертывания крови АСКа 2-01-«Астра» (НПЦ «Астра», Россия) с использованием реактивов «Технология-Стандарт» (г.Барнаул, Россия). Препараты сравнения: пентоксифиллин (3,7-диметил-1-(5-оксогексил)ксантин, ОАО «Дальхимфарм», Россия) в концентрации 2×10^-3 М/л, ацетилсалициловая кислота (2-ацетилоксибензойная кислота, Шандонг Ксинхуа Фармасьютикал Ко., ЛТД, Китай) в концентрации 2×10^-3 М/л, гепарин натрия (ОАО «Синтез», Россия) в концентрации 5×10^-4 г/мл [Камилов Ф.Х., Тимирханова Г.А., Самородова А.И. и др. Выбор растворителя для изучения влияния водонерастворимых веществ на коагуляционный компонент гемостаза в условиях in vitro на доклиническом этапе // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. 2014. - Т. 12, №6. - С. 11-14; Ураков А.Л. Самородов А.В., Камилов Ф.Х., Халиуллин Ф.А. Полирегионарная агрегатометрия крови пациентов с острым тромбозом, как потенциональная модель доклинических исследований новых корректоров системы гемостаза ex vivo // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2017. - Т. 16, №1(61). - С. 65-71.].

Показатели агрегации тромбоцитов характеризуют антиагрегационную активность исследуемых растворов и препаратов сравнения и представлены в таблице 4.

В результате исследования установлено, что водные и спиртовые экстракты травы ярутки полевой увеличивают латентный период агрегации тромбоцитов: водный экстракт на 4,2%, спиртовой экстракт на 6,5%, а препарат сравнения - пентоксифиллин на 33,2%, в то время как препарат сравнения - ацетилсалициловая кислота уменьшает этот показатель на 2,3%. Исследуемые растворы уменьшают максимальную амплитуду агрегации тромбоцитов на уровне с препаратом сравнения ацетилсалициловой кислотой: водный экстракт - на 12,5%, спиртовой экстракт - на 12,0%, ацетилсалициловая кислота - на 13,2%, а препарат сравнения пентоксифиллин - на 49,3%. Экстракты ярутки полевой оказывают влияние на скорость агрегации тромбоцитов снижая ее: водный экстракт - на 2,4%, спиртовой экстракт - на 2,0%, в то время как препараты сравнения сильнее снижают этот параметр: ацетилсалициловая кислота - на 9,9% и пентоксифиллин - на 35,6%. По времени достижения максимальной амплитуды агрегации показатели соответствовали для водного экстракта - 11,8% и спиртового экстракта - 13,5% и превосходили препарат сравнения ацетилсалициловую кислоту - 11,2%, но отличались от значений пентоксифиллина - 33,3%. Выявлено, что в присутствии исследуемых экстрактов ярутки полевой, как и препарата сравнения - ацетилсалициловой кислотой, отсутствует дезагрегация тромбоцитов, в отличие от препарата сравнения пентоксифиллин - 13,9%. Следовательно, экстракты ярутки полевой проявляют антиагрегационную активность сопоставимую с препаратом сравнения - ацетилсалициловой кислоты. При этом более выражено показатели антиагрегационной активности отмечались для спиртового экстракта в отличие от водного экстракта.

Антикоагуляционная активность экстрактов из травы ярутки полевой оценивалась по показателям плазменного звена гемостаза, представленным в таблице 5. Изучались показатели активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ), протромбинового времени (ПВ) и концентрации фибриногена по A. Clauss.

Согласно полученным данным установлено, что водный и спиртовой экстракты ярутки полевой показывают различной степени выраженности влияние на плазменный компонент системы гемостаза, проявляющееся изменением показателя внутреннего пути свертывания крови - удлинением активированного парциального тромбопластинового времени. Гепарин натрия пролонгирует АПТВ на 19,8%, медиана удлинения АПТВ для водного экстракта травы ярутки полевой составляет 4,7%, а для спиртового экстракта травы ярутки полевой - 5,3%. Исследуемые образцы в указанной концентрации не влияли на содержание фибриногена и показатель протромбинового времени. Исследования показали, что спиртовой экстракт ярутки полевой проявляет антикоагуляционную активность выше, чем водный экстракт.

Таким образом, на основании полученных результатов следует, что способ экстракции при котором в качестве экстрагента используется спирт этиловый 70%, обеспечивает максимальный выход суммы флавоноидов, как основной группы действующих веществ с высокой биологической активностью и позволяет получить спиртовой экстракт из травы ярутки полевой, обладающий антиоксидантной, противовоспалительной, антикоагуляционной и антиагрегационной активностью, с применением которого более значимо обеспечивается расширение спектра биологической активности растительного средства.

Пример 4. Получение растительного средства из травы ярутки полевой: 100,0 грамм высушенной до воздушно-сухого состояния травы ярутки полевой измельчили до размера частиц 2 мм, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, трехкратно экстрагировали спиртом этиловым 70% при температуре 80°С в соотношении сырье:экстрагент 1:50 в течение 2 часов, при этом первую экстракцию проводили в течение 60 мин, вторую и третью экстракции - по 30 мин. Полученные извлечения профильтровали через бумажный фильтр, объединили и сконцентрировали под вакуумом до густой массы. Густой экстракт высушили в вакуум-сушильном шкафу при температуре 65°С до получения гигроскопичного порошка зеленовато-коричневого цвета. Выход сухого экстракта равнялся 20% от массы воздушно-сухого сырья. Содержание флавоноидов в полученном растительном средстве составило 1,3%.

Пример 5. Получение растительного средства из травы ярутки полевой: 100,0 грамм высушенной до воздушно-сухого состояния травы ярутки полевой измельчили до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм, трехкратно экстрагировали спиртом этиловым 70% при температуре 90°С в соотношении сырье:экстрагент 1:50 в течение 2 часов, при этом первую экстракцию проводили в течение 60 мин, вторую и третью экстракции - по 30 мин. Полученные извлечения профильтровали через бумажный фильтр, объединили и сконцентрировали под вакуумом до густой массы. Густой экстракт высушили в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60°С до получения гигроскопичного порошка зеленовато-коричневого цвета. Выход сухого экстракта составил 23% от массы воздушно-сухого сырья. Содержание флавоноидов в полученном растительном средстве - 1,4%.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается способа получения растительного средства из травы ярутки полевой. Способ получения растительного средства из травы ярутки полевой, обладающего антиоксидантной, противовоспалительной, антикоагуляционной и антиагрегационной активностью, включает измельчение растительного сырья до размера частиц 2 мм, экстракцию в течение 2 ч при нагревании, фильтрование, упаривание, концентрирование и высушивание экстракта, где в качестве растительного сырья используют траву ярутки полевой, экстракцию проводят трехкратно спиртом этиловым 70% при температуре 80-90°С в соотношении сырье:экстрагент 1:50, при этом первую экстракцию проводят в течение 60 мин, вторую – 30 мин и третью – 30 мин. Вышеуказанный способ получения средства растительного происхождения увеличивает выход суммы флавоноидов как основной группы действующих веществ и расширяет спектр биологической активности, при котором средство из травы ярутки полевой обладает антиоксидантной, противовоспалительной, антикоагуляционной и антиагрегационной активностью. 5 табл., 5 пр.

Способ получения растительного средства из травы ярутки полевой, обладающего антиоксидантной, противовоспалительной, антикоагуляционной и антиагрегационной активностью, включающий измельчение растительного сырья до размера частиц 2 мм, экстракцию в течение 2 часов при нагревании, фильтрование, упаривание, концентрирование и высушивание экстракта, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют траву ярутки полевой, экстракцию проводят трёхкратно спиртом этиловым 70% при температуре 80-90°С в соотношении сырье:экстрагент 1:50, при этом первую экстракцию проводят в течение 60 мин, вторую – 30 мин и третью – 30 мин.