Способ интегральной оценки морфофункционального статуса тромбоцитов при экспериментальных ортопедических хирургических вмешательствах Российский патент 2024 года по МПК G01N33/49 G01N33/86 G01N33/52 G01N15/02 G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, а именно травматологии и ортопедии, и может быть использовано для оценки качества тромбоцитов и эффективности их применения в научных исследованиях и клинической практике при хирургическом лечении больных травматолого-ортопедического профиля.

В последнее время возрос интерес исследователей к изучению морфо-функциональных характеристик тромбоцитов и их влияния на репаративную регенерацию костной ткани. Тромбоцитарное звено гемостаза обеспечивает остановку кровотечения при травме сосудов и является важнейшим участником регенерации тканей организма. В процессе репаративного остеогенеза активированные тромбоциты являются первыми клетками, контактирующими с травмированными тканями и поверхностью имплантатов, они катализируют формирование стабильного сгустка, который обеспечивает гемостаз и является механическим и биохимическим компонентом, необходимый для привлечения и миграции остеогенных клеток [1-3]. Сгусток функционирует как биодеградируемая матрица, и тромбоциты служат важным источником сигнальных молекул, опосредующих остеиндукцию [4-5]. Ключевую роль в восстановлении тканей играют факторы роста, выделяемые из а-гранул тромбоцитов при активации последних [6-9]. Кроме выделения собственных факторов роста, тромбоциты индуцируют также продукцию ростовых факторов мезенхимальными стволовыми клетками [10-11]. Для стимуляции регенерации костной ткани используются различные стратегии применения продуктов на основе концентратов тромбоцитов [12-13]. Важными параметрами для осуществления гемостазиологической и репарационной роли тромбоцитов, а так же их участия в иммунологических и воспалительных процессах, антимикробной защите являются количество клеток, их объем, содержание гранул, агрегационная способность. Таким образом, интегральной характеристикой морфо-функциональных свойств тромбоцитов может служить оценка их количества, среднего объема, количества содержащихся в них гранул, агрегация.

Морфологическое исследование тромбоцитов с помощью атомно-силовой и электронной микроскопии имеет высокую стоимость, трудоемкость, длительность подготовки образцов, что не позволяет использовать данные методы в клинической практике [14].

Используемые в настоящее время в клинической практике технические решения предполагают характеристику отдельных звеньев функционирования тромбоцитов.

Способ оценки агрегационных свойств тромбоцитов» (патент RU 2213976, 2003) предлагает расчет интегрального показателя агрегации тромбоцитов, который определяется как сумма отношений показателей степени и скорости агрегации с индуктором аденозиндифосфатом (АДФ) и коллагеном к средним арифметическим аналогичным показателям здоровых людей. Способ оценки агрегационного статуса тромбоцитов (патент RU 2390027, 2010) предлагает оценивать агрегацию тромбоцитов в условиях, приближенных к внутрисосудистым, с целью диагностики гипо- и гиперагрегации тромбоцитов при физиологических и патологических состояниях у людей.

Способ определения агрегационной активности тромбоцитов у больных острым коронарным синдромом» (патент RU 2619858, 2017) предназначен для оценки функциональной активности тромбоцитов у больных с острым коронарным синдромом, в том числе на фоне проводимой медикаментозной антиагрегантной терапии.

Способ количественной оценки агрегационной активности тромбоцитов у пациентов с новой коронавирусной инфекцией (патент RU 2760095, 2021) позволяет оценивать агрегацию тромбоцитов у пациентов с новой коронавирусной инфекцией (COVID-19), которым проводится интенсивная терапия, в том числе с применением антиагрегантных и антикоагулянтных лекарственных препаратов и трансфузией тромбоцитарной массы.

Существенным недостатком известных способов является односторонность в оценке функцинальной активности тромбоцитов, не учитывающая их полифункциональность.

Известны «Способ оценки морфофункционального статуса тромбоцитов человека» (патент RU 2485502, 2013) и «Экспресс-метод морфофункционального анализа тромбоцитов, пригодных для клинического использования» (патент RU 2623074, 2017), принятого за прототип, в которых предлагают проводить морфофункциональный анализ тромбоцитов на основе определения концентрации тромбоцитов, окраску тромбоцитов витальным флуоресцентным красителем с последующим определением средней интенсивности свечения поля зрения микроскопа.

Однако при оценке функцинальной активности тромбоцитов так же не учитывается их полифункциональность, что снижает объективность и полноту оценки морфофункционального статуса тромбоцитов.

Задачей настоящего изобретения является создание интегрального показателя для комплексной оценки тромбоцитов, основанного на результатах измерения их количества, морфологических параметров, агрегационной активности, содержания гранул, что позволит объективизировать и повысить диагностическую значимость способа для тромбоцитарной характеристики потенциала при хирургических вмешательствах в травматологии и ортопедии.

Для решения поставленной задачи определяют показатели, включающие определение количества клеток, отдельных морфологических характеристик и функциональной активности, которые переводятся в баллы, суммируются, затем по сумме количественных значений показателей, выраженных в баллах, оценивают интегральный морфофункциональный статус тромбоцитов.

Выбранный комплекс показателей, включающий количество, объем, агрегационный и секреторный потенциал тромбоцитов позволяет наиболее достоверно дать интегральную оценку морфофункционального статуса тромбоцитов. Показатели обладают информативностью, используются в научных и практических целях [15-18].

Способ осуществляют следующим образом.

Проводится забор венозной крови в 2 пробирки: 1) в пробирку с ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) в качестве антикоагулянта, 2) в пробирку с цитратом натрия в соотношении 9:1.

В образце с ЭДТА в качестве антикоагулянта определяют на автоматическом гематологическом анализаторе показатели: количество тромбоцитов, средний объем тромбоцитов, процент крупных тромбоцитов (с гранулами ≥3).

Образец крови с цитратом натрия в качестве антикоагулянта центрифугируют 7 минут при скорости вращения ротора 1000 об/мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Далее образцы ОТП используют для определения агрегации тромбоцитов с использованием оптической агрегатометрии (индуктор АДФ, 5 мкмоль), а так же для витального окрашивания тромбоцитов смесью 2-х флуорохромов - трипафлавина и акридинового оранжевого. Просмотр образцов осуществляют с применением флуоресцентного микроскопа (длина волны λ возбуждения 450-490 нм и А, эмиссии от 520 нм) (патенты RU 2485502 и 2623074).

Полученные показатели переводят в бальную систему (таблица 1).

Обоснованность и достоверность предложенного способа оценки морфофункционального статуса тромбоцитов при ортопедических хирургических вмешательствах подтверждена математическим анализом взаимосвязи морфофункциональной активности анализируемых тромбоцитов.

Исследование выполнено на 20 кроликах породы Шиншилла массой 3-3,5 кг. Животные содержались в виварии Уральского государственного медицинского университета, были здоровы, имели ветеринарный сертификат качества и состояния здоровья, находились в идентичных условиях кормления и содержания. В условиях малой операционной под воздействием внутривенного наркоза проводился разрез кожного покрова кролика размерами 0.2×0.5 см в проекции дистального эпиметафиза бедренной кости. Рассверливался канал в области надмыщелка бедренной кости размерами 0.2×0.6 см, который ориентирован строго перпендикулярно оси бедренной кости. После чего проводилась импалантация титанового стержня размерами 0.2×0.6 см по принципу pressfit. Осуществлялся контроль стабильности имплантации, затем послойное ушивание раны. Образцы крови отбирали из краевой вены уха кроликов за 1 сутки до операции и через 8 недель после операции перед выведением животных из эксперимента. Кровь отбирали в стандартные пробирки для лабораторных исследований с антикоагулянтами ЭДТА и цитратом натрия.

Определение морфо-функциональных свойств тромбоцитов (количество тромбоцитов, средний объем тромбоцитов, распределение тромбоцитов по объему, тромбокрит, относительное количество крупных тромбоцитов, агрегация тромбоцитов на индукторы, определение количества гранул тромбоцитов) проводили до операции, через 1 сутки и 8 недель после операции.

Механические исследования системы «периимплантная костная ткань -имплантат» (определение максимального напряжения, максимальной нагрузки, эластичности) проведены через 8 недель после операции. Проведена морфологическая диагностика гистологическим методом, а также методом растровой электронной микроскопии, проведен энергодисперсионный микроанализ с целью определения содержания Са, Р и Са/Р отношения в периимплантной кости (электронный микроскоп MIRA3 LMU TESCAN, Чехия). Образцы костной ткани забирались из области дистального эпиметафиза, а также диафиза бедренной кости, обезжиривались в ацетоне, затем производилась их заливка в эпоксидную смолу с последующей шлифовкой и полировкой поверхности

Статистический анализ проводили в рамках правил вариационной статистики с использованием пакета программ Ststtistica-8.0. Характер распределения вариационных рядов оценивался с помощью критерия Колмогорова-Смирнова. Сравнение показателей между изучаемыми группами проводили с помощью теста Манна-Уитни, Различия принимались статистически значимыми при р<0,05. Результаты представлены как медиана (интерквартильный размах).

В соответствии с результатом дооперационного определения морфо-функциональных характеристик тромбоцитов (количественные показатели переводились в баллы) кролики были разделены на 2 группы: группа с низким уровнем тромбоцитарного потенциала (НТП, количество баллов <10) и группа с высоким тромбоцитарным потенциалом (ВТП, количество баллов ≥10).

Группа экспериментальных животных с высоким тромбоцитарным потенциалом существенно отличалась от группы с низким тромбоцитарным потенциалом. На Фиг. 1А, Б, В, Г, Д, Е показаны различия основных тромбоцитарных показателей у экспериментальных животных с различным исходным тромбоцитарным потенциалом.

Через 8 недель после операции уровень маркера остеогенеза остеокальцина в группе ВТП был существенно выше, чем в группе НТП. (Фиг. 2 - показана концентрация остеокальцина в группах НТП и ВТП через 8 недель после операции).

Гистологический анализ показал, что у животных группы НТП преобладают мелкие фокусы незавершенного энхондрального окостенения (Фиг. 3А), тогда как у животных группы ВТП преобладают костные балки с остеобластами (регенерирующие костные балки) (Фиг. 3Б).

Анализ результатов механического исследования системы «периимплантная кость - имплантат» показал, что максимальная нагрузка, которую выдерживала система была существенно выше в группе ВТП (Фиг. 4 - Максимальная нагрузка, которую выдерживала система «периимплантная кость - имплантат» в группах НТП и ВТП).

Для определения содержания Са, Р и Са/Р отношения в периимплантной кости проводили исследования на растровом электронном микроскопе. Анализировались от 10 до 12 точек по периметру имплантата (Фиг. 5 - Точки энергодисперсионного микроанализа). Анализ показал, что концентрация кальция была существенно выше в группе ВТП, по сравнению с группой НТП: 29,00[26,46; 30,28]% и 26,19[25,22; 27,91]% (р=0,039). Отношение Са/Р также было существенно выше в группе ВТП по сравнению с группой НТП: 2,19 [2,17; 2,28] и 2,03 [1,99; 2,11] соответственно (р<0,01).

Проведенное исследование показало, что низкий (<10 баллов) тромбоцитарный морфо-функциональный потенциал сопряжен с низкой активностью остеогенеза, снижением Са/Р отношения в периимплантной кости и механической прочностью кости в целом. А выбранный комплекс показателей, включающий количество, объем, агрегационный и секреторный потенциал тромбоцитов, дает их интегральную оценку.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает объективную оценку морфофункционального статуса тромбоцитов для формирования репарационной матрицы при ортопедических хирургических вмешательствах и может быть применен в клинической практике.

Используемая литература

1. Alrayyes Y, Al-Jasser R. Regenerative Potential of Platelet Rich Fibrin (PRF) in Socket Preservation in Comparison with Conventional Treatment Modalities: A Systematic Review and Meta-Analysis. Tissue Eng Regen Med. 2022 Jun; 19(3):463-475. doi: 10.1007/s 13770-021 -00428-y.

2. Liu Y, Sun X, Yu J, Wang J, Zhai P, Chen S, Liu M, Zhou Y. Platelet-Rich Fibrin as a Bone Graft Material in Oral and Maxillofacial Bone Regeneration: Classification and Summary for Better Application. Biomed Res Int. 2019 Dec 6;2019:3295756. doi: 10.1155/2019/3295756.

3. Li K, Wang P, Nie C, Luo H, Yu D. The effect of joint distraction osteogenesis combined with platelet-rich plasma injections on traumatic ankle arthritis. Am J Transl Res. 2021 Jul 15; 13(7):8344-8350.

4. Blatt S, Thiem DGE, Kyyak S, Pabst A, Al-Nawas B, Kammerer PW. Possible Implications for Improved Osteogenesis? The Combination of Platelet-Rich Fibrin With Different Bone Substitute Materials. Front Bioeng Biotechnol. 2021 Mar 16; 9:640053. doi: 10.3389/fbioe.2021.640053.

5. Han J, Gao F, Li Y, Ma J, Sun W, Shi L, Wu X, Li T. The Use of Platelet-Rich Plasma for the Treatment of Osteonecrosis of the Femoral Head: A Systematic Review. Biomed Res Int. 2020 Mar 7; 2020:2642439. doi: 10.1155/2020/2642439.

6. Nikolovska B, Miladinova D, Pejkova S, Trajkova A, Georgieva G, Jovanoski T, Jovanovska K. Platlet-Rich Plasma - Review of Literature. Pril (Makedon Akad Nauk Umet Odd Med Nauki). 2021 Apr 23; 42(1):127-139. doi: 10.2478/prilozi-2021-0011.

7. Zhang XL, Shi KQ, Jia PT, Jiang LH, Liu YH, Chen X, Zhou ZY, Li YX, Wang LS. Effects of platelet-rich plasma on angiogenesis and osteogenesis-associated factors in rabbits with avascular necrosis of the femoral head. Eur Rev Med Pharmacol Sci. 2018 Apr; 22(7):2143-2152. doi: 10.26355/eurrev_201804_14748.

8. Farmani AR, Nekoofar MH, Ebrahimi Barough S, Azami M, Rezaei N, Najafipour S, Application of Platelet Rich Fibrin in Tissue Engineering: Focus on Bone Regeneration. Ai J.Platelets. 2021 Feb 17;32(2):183-188. doi: 10.1080/09537104.2020.1869710.

9. Bahammam MA, Attia MS. Expression of Vascular Endothelial Growth Factor Using Platelet Rich Fibrin (PRF) and Nanohydroxyapatite (nano-HA) in Treatment of Periodontal Intra-Bony Defects - A Randomized Controlled Trial. Saudi J Biol Sci. 2021 Jan;28(l):870-878. doi: 10.1016/j.sjbs.2020.11.027.

10. Liebig BE, Kisiday JD, Bahney CS, Ehrhart NP, Goodrich LR. The platelet-rich plasma and mesenchymal stem cell milieu: A review of therapeutic effects on bone healing. J Orthop Res. 2020 Dec;38(12):2539-2550. doi: 10.1002/jor.24786.

11. Zhang N, Lo CW, Utsunomiya T, Maruyama M, Huang E, Rhee C, Gao Q, Yao Z, Goodman SB. PDGF-BB and IL-4 co-overexpression is a potential strategy to enhance mesenchymal stem cell-based bone regeneration. Stem Cell Res Ther. 2021 Jan 7;12(1):40. doi: 10.1186/sl3287-020-02086-8.

12 Forteza-Genestra MA, Calvo J, Monjo M, Ramis JM. Platelet-derived extracellular vesicles promote osteoinduction of mesenchymal stromal cells. Bone Joint Res. 2020 Oct 16; 9(10):667-674. doi: 10.1302/2046-3758.910.BJR-2020-0111.R2.

13. Ferreira MR, Zambuzzi WF. Platelet microparticles load a repertory of miRNAs programmed to drive osteogenic phenotype. J Biomed Mater Res A. 2020 Dec 1. doi: 10.1002/jbm.a.37140.

14. Донников М.Ю., Орлов C.A., Зиновьева A.B. Качественная оценка морфофункциональной активности тромбоцитов по данным атомно-силовой микроскопии. Клиническая лабораторная диагностика, 2009, №8, с. 30-32.

15. Korniluk A., Koper-Lenkiewicz О.М., Kaminska J., Kemona H., Dymicka-Piekarska V. Mean Platelet Volume (MPV): New Perspectives for an Old Marker in the Course and Prognosis of Inflammatory Conditions // Mediators Inflamm. 2019 Apr 17;2019:9213074. doi: 10.1155/2019/9213074. eCollection 2019.

16. Ntolios P., Papanas N., Nena E., Boglou P., Koulelidis A., Tzouvelekis A., Xanthoudaki M., Tsigalou C, Froudarakis M. E., Bouros D., Mikhailidis D. P., Steiropoulos P. Mean Platelet Volume as a Surrogate Marker for Platelet Activation in Patients With Idiopathic Pulmonary Fibrosis // Clin Appl Thromb Hemost. 2016 May; 22(4):346-50. doi: 10.1177/1076029615618023.

17. Braekkan S.K., Mathiesen E.В., Njnlstad I., Wilsgaard Т., Stormer J., Hansen J.B Mean platelet volume is a risk factor for venous thromboembolism: the Tromso Study, Troms0, Norway // J Thromb Haemost. 2010 Jan; 8(1):157-62. doi: 10.1111/j.1538-7836.2009.03498.x.

18. Chu S.G., Becker R.C, Berger P.В., Bhatt D.L., Eikelboom J. W., Konkle В., Mohler E.R., Reilly M.P., Berger J.S. Mean platelet volume as a predictor of cardiovascular risk: a systematic review and meta-analysis // J Thromb Haemost. 2010 Jan; 8(1): 148-156. doi: 10.111 l/j.l538-7836.2009.03584.x

Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, и может быть использовано для интегральной оценки морфофункционального статуса тромбоцитов при экспериментальных ортопедических хирургических вмешательствах. Проводят забор крови до операции, анализ морфофункциональных характеристик тромбоцитов. Определяют: количество тромбоцитов ×10⁹/л, агрегацию тромбоцитов в % с индуктором аденозиндифосфатом (АДФ), средний объем тромбоцитов в фл, количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, в % при флуоресцентной микроскопии. Полученные значения тромбоцитарных показателей переводят в баллы от 1 до 4:

1 балл - количество тромбоцитов 100-200; агрегация тромбоцитов 20-30; средний объем тромбоцитов 6,0-6,5; количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, 50-60,

2 балла - количество тромбоцитов 201-300; агрегация тромбоцитов 31-40; средний объем тромбоцитов 6,6-7,0; количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, 61-70,

3 балла - количество тромбоцитов 301-400; агрегация тромбоцитов 41-50; средний объем тромбоцитов 7,1-7,5; количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, 71-80,

4 балла - количество тромбоцитов 401-500; агрегация тромбоцитов 51-60; средний объем тромбоцитов 7,6-8,0; количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, 81-90. Баллы суммируют. При сумме баллов более или равной 10, интегральный морфофункциональный статус тромбоцитов оценивают как нормальный. При сумме баллов менее 10 - как сниженный. Способ обеспечивает возможность оценки интегрального морфофункционального статуса тромбоцитов для комплексной оценки тромбоцитов, за счет измерения их количества, морфологических параметров, агрегационной активности, содержания гранул, что позволит объективизировать и повысить диагностическую значимость способа для тромбоцитарной характеристики потенциала при хирургических вмешательствах в травматологии и ортопедии. 5 ил., 1 табл.

Способ интегральной оценки морфофункционального статуса тромбоцитов при экспериментальных ортопедических хирургических вмешательствах, включающий забор крови до операции, анализ морфофункциональных характеристик тромбоцитов, отличающийся тем, что определяют: количество тромбоцитов ×10⁹/л, агрегацию тромбоцитов в % с индуктором аденозиндифосфатом (АДФ), средний объем тромбоцитов в фл, количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, в % при флуоресцентной микроскопии, полученные значения тромбоцитарных показателей переводят в баллы от 1 до 4:

1 балл - количество тромбоцитов 100-200; агрегация тромбоцитов 20-30; средний объем тромбоцитов 6,0-6,5; количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, 50-60,

2 балла - количество тромбоцитов 201-300; агрегация тромбоцитов 31-40; средний объем тромбоцитов 6,6-7,0; количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, 61-70,

3 балла - количество тромбоцитов 301-400; агрегация тромбоцитов 41-50; средний объем тромбоцитов 7,1-7,5; количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, 71-80,

4 балла - количество тромбоцитов 401-500; агрегация тромбоцитов 51-60; средний объем тромбоцитов 7,6-8,0; количество тромбоцитов, содержащих 3 и более гранулы, 81-90,

баллы суммируют, и при сумме баллов более или равной 10, интегральный морфофункциональный статус тромбоцитов оценивают как нормальный, при сумме баллов менее 10 - как сниженный.