Способ приготовления растворимой в воде фармацевтической композиции на основе берберина Российский патент 2024 года по МПК A61K31/4375 A61K31/4745 A61K9/08 A61K47/22 A61K47/44 

Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, в том числе ветеринарной медицины и может быть использовано качестве удобной для применения инъекционной формы антибактериального препарата на основе берберина.

Известна «Композиции, содержащие берберин или его аналоги для лечения кожных заболеваний, связанных с розацеа или с покраснением лица», (№ RU 2 533 458 МПК A61K 9/06 опубликовано 20.11.2014 Бюл. № 32), в которой представлена фармацевтическая композиция для лечения розацеа, содержащая, по меньшей мере, 0,02% берберина или биологически эквивалентного аналога берберина, такого как пальматин и компонент, выбранный из группы, состоящей из воды, метанола, этанола и диметилсульфоксида, где берберин или биологически эквивалентный аналог берберина представляет собой основной фармацевтический активный компонент. Изобретение предназначено, в качестве наружного лекарственного средства для лечения розацеа.

Недостатками данной фармацевтической композиции является высокая токсичность, невозможность инъекционного применения и низкая биодоступность действующего вещества – берберина.

Известны «Составы на основе берберина и их применение» (№ RU 2 016 129 193 МПК A61K31/00 опубл. 2018.01.24), приняты в качестве прототипа, в которой представлены различные варианты композиции используемые в качестве наружного средства.

1. Фармацевтическая композиция, содержащая берберин, при этом указанная композиция представляет собой состав в виде крема, содержащий водную фазу и масляную фазу, при этом указанный берберин находится в концентрации от 0,01 до 10 мас.%, и при этом указанная композиция содержит вещество, способствующее проникновению.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой концентрация берберина составляет от 0,01 до 0,3 мас.%.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой вещество, способствующее проникновению, представляет собой анионное вещество, способствующее проникновению.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, в которой анионное вещество, способствующее проникновению, содержит додецилсульфат натрия (ДСН).

5. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой вещество, способствующее проникновению, содержит Tween® 60 и глицерин.

6. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой берберин является единственным фармацевтически активным компонентом.

7. Фармацевтическая композиция, содержащая берберин в качестве единственного фармацевтически активного компонента, при этом указанный берберин находится в концентрации около 0,12 мас.%, при этом указанная композиция представляет собой состав в виде крема, содержащий водную фазу и масляную фазу, при этом указанная композиция содержит вещество, способствующее проникновению, консервант и стабилизатор, и при этом указанная композиция имеет рН около 5,5.

8. Фармацевтическая композиция, содержащая берберин, при этом указанная композиция представляет собой состав на основе геля, при этом указанная композиция содержит анионное вещество, способствующее проникновению.

9. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой анионное вещество, способствующее проникновению, содержит додецилсульфат натрия (ДСН).

10. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой около 90% частиц указанного берберина имеют средний размер менее 10 мкм.

11. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой концентрация берберина составляет от 0,01 до 0,3 мас.%.

12. Фармацевтическая композиция по п.8, в которой берберин является единственным фармацевтически активным компонентом.

13. Способ лечения расстройств, связанных с покраснением кожи лица, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.1.

14. Способ лечения расстройств, связанных с покраснением кожи лица, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.8.

15. Способ лечения и/или предотвращения кожной токсичности, вызванной таргетной терапией, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.1.

16. Способ лечения и/или предотвращения кожной токсичности, вызванной терапией, включающий введение пациенту, нуждающемуся в этом, фармацевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п.8.

17. Способ по п.13, в котором указанное расстройство, связанное с покраснением кожи лица, выбрано из группы, состоящей из розацеа, обыкновенного акне, себорейного дерматита, фотодерматита, контактного дерматита и розацеаподобного дерматита, вызванного стероидами.

18. Способ по п.14, в котором указанное расстройство, связанное с покраснением кожи лица, выбрано из группы, состоящей из розацеа, обыкновенного акне, себорейного дерматита, фотодерматита, контактного дерматита и розацеаподобного дерматита, вызванного стероидами.

19. Способ по п.15, в котором указанные виды таргетной терапии выбраны из группы, состоящей из ингибиторов EGFR, мультитирозинкиназы (МТК), МЕК, фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), протеинкиназы В (АКТ) и BRAF, и в котором указанная кожная токсичность, вызванная таргетной терапией, выбрана из группы, состоящей из папулезно-пустулезной сыпи, макулопапулезной сыпи, эритемы, телеангиэктатической гиперемии, паронихии и трещин, изменений волос, ксероза, мукозита, зуда и ладонно-подошвенного синдрома.

20. Способ по п.16, в котором указанные виды таргетной терапии выбраны из группы, состоящей из ингибиторов EGFR, мультитирозинкиназы (МТК), МЕК, фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), протеинкиназы В (АКТ) и BRAF, и в котором указанная кожная токсичность, вызванная таргетной терапией, выбрана из группы, состоящей из папулезно-пустулезной сыпи, макулопапулезной сыпи, эритемы, телеангиэктатической гиперемии, паронихии и трещин, изменений волос, ксероза, мукозита, зуда и ладонно-подошвенного синдрома.

Недостатками известного технического решения фармацевтических композиций в виде мазей, гелей и растворов являются невозможность инъекционного их применения и достаточно низкая биологическая доступность.

В упомянутых описаниях представлены фармацевтические композиции (составы), содержащие берберин от 0,02 вес.% до 10 вес.% для наружного применения.

Известно, что берберин плохо растворим в воде, поэтому в качестве одного из компонентов выбран 1-метил-2-пирролидон, который является фармокопейным растворителем.

Технической задачей данного изобретения является создание растворимой в воде формы препарата на основе берберина в качестве активно действующего вещества, обладающего антимикробным действием, для применения в качестве инъекционной формы.

Технический результат достигается путём создания растворимой в воде мицелярной формы препарата на основе не растворимого в воде берберина в качестве активно действующего вещества, позволяющего использовать его в инъекционной форме.

Техническая задача решается, а технический результат достигается в способе получения растворимой в воде формы препарата на основе берберина, характеризующийся тем, что в качестве действующего вещества, используется порошок берберина, в качестве растворителя берут 1-метил-2-пирролидон при температуре 40 °С и при постоянном перемешивании, например на магнитной мешалке со скоростью 1000 об/мин, добавляют в него порошок берберина, полученную смесь перемешивают до полного растворения, и продолжая перемешивать добавляют в качестве поверхностно-активного вещества кремофор EL-20, а через 15 минут, продолжая перемешивать, добавляют воду, доводя объем раствора до 100 мл при следующем соотношении компонентов мас.%:

берберин - 1-10,

1-метил-2-пирролидон - 20-50,

кремофор EL - 2-10

остальное - вода.

Способ осуществляется следующим образом: при температуре 40 °С и постоянном перемешивании со скоростью 1000 об/мин, например, на магнитной мешалке, к 1-метил-2-пирролидона добавляют порошок берберина. Полученную смесь перемешивают до полного растворения и добавляют кремофор EL-20 при постоянном перемешивании. Через 15 минут добавляют воду при постоянном перемешивании, доводя объем раствора до 100 мл Полученный стабильный раствор - прозрачный, с желтоватым оттенком, разливают во флаконы из тёмного стекла, укупоривают и хранят при температуре +2 °С -+4 °С. Срок хранения препарата - 2 года.

В таблице 1 представлены стабильные растворы препарата на основе берберина, которые получают при соотношении компонентов (действующего вещества - Берберин, растворителя - 1-метил-2-пирролидон, поверхностно-активного вещества - Кремофор EL-20 и воды) представленных в ней.

В таблице 2 представлены дизайн и организация исследования, которые направлены на решение поставленной цели и базируются на общих принципах организации исследований по оценке острой токсичности лекарственных препаратов на лабораторных животных.

В таблице 3 представлены результаты исследования острой токсичности после однократного внутрижелудочного введения препарата белым нелинейным мышам.

В таблице 4 представлены результаты исследования острой токсичности после однократного внутрибрюшинного введения препарата белым нелинейным мышам.

В таблице 5 представлены данные по динамике прироста массы тела у мышей после однократного внутрижелудочного введения препарата.

В таблице 7 представлены расчетные токсикологические параметры для белых нелинейных мышей препарата при внутрижелудочном введении Пробит-анализ - Метод Финни [Логнормальный закон распределения].

В таблице 8 представлены расчетные токсикологические параметры для белых нелинейных мышей препарата при внутрибрюшинном введении Пробит-анализ - Метод Финни [Логнормальный закон распределения].

Берберин известен как изохинолиновый алкалоид, который содержится в корнях и коре стеблей барбарисов, а также является основным активным ингредиентом корневища коптидиса и коры phellodendri, и широко используется в народной медицине. Это соединение проявляет активность против бактерий, грибков, простейших и вирусов. Интеркаляция ДНК, нацеливание на РНК-полимеразу, гиразу и топоизомеразу IV и, наконец, ингибирование клеточного деления являются механизмом антибактериального действия берберина. Результаты исследования Boberek JM, Stach J, Good L. (2010) показали, что его антибактериальные свойства связаны с ингибированием белка клеточного деления FtsZ (Boberek JM, Stach J, Good L. Genetic evidence for inhibition of bacterial division protein FtsZ by berberine. PLoS One. 2010; 5(10): e13745.). Это соединение также способно ингибировать клеточную функцию бактерий с помощью различных механизмов, таких как повреждающие клеточную структуру, так и ингибирующих синтез белков и ДНК, приводящие к гибели бактерий. К настоящему времени берберин стал сильным антибактериальным средством с целью замены обычных антибиотиков, а также для преодоления препятствий, связанных с устойчивостью к антибиотикам.

Антибактериальная активность и механизм действия берберина в отношении Streptococcus agalactiae были исследованы Lianci Peng et all. (2015) путем анализа роста, морфологии и белка клеток S. agalactiae, обработанных берберином. Результат теста на антибактериальную чувствительность показал, что минимальная ингибирующая концентрация (МИК) берберина в отношении Streptococcus agalactiae составила 78 мкг/мл, а кривые время-этоксикация показали корреляцию концентрации — времени. После воздействия на бактерии 78 мкг/мл берберина фрагментарная клеточная мембрана и неравное деление клеток наблюдались с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), что указывает на повреждение бактериальных клеток. Исследование электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) показало, что берберин может повреждать бактериальные клетки за счёт разрушения клеточных белков. Между тем, флуоресцентный микроскоп показал, что берберин может влиять на синтез ДНК. Эти результаты доказывают, что берберин может повреждать структуру бактериальной клеточной мембраны и ингибировать синтез белка и ДНК, что в конечном итоге приводит к гибели бактерий Streptococcus agalactiae (Lianci Peng1, Shuai Kang1, Zhongqiong Yin, Renyong Jia, Xu Song, Li Li1, Zhengwen Li, Yuanfeng Zou, Xiaoxia Liang, Lixia Li, Changliang He, Gang Ye, Lizi Yin, Fei Shi, Cheng Lv, Bo Jing Antibacterial activity and mechanism of berberine against Streptococcus agalactiae. Int J Clin Exp Pathol 2015;8(5):5217-5223 www.ijcep.com /ISSN:1936-2625/IJCEP0007991).

Данный способ приготовления растворимой в воде фармацевтической композиции на основе берберина иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение фармацевтической композиции, содержащей берберин в качестве активнодействующего вещества

При температуре 40 °С и постоянном перемешивании со скоростью 1000 об/мин, на магнитной мешалке, к 20 мл 1-метил-2-пирролидона добавляют 1 г порошка берберина. Полученную смесь перемешивают до полного растворения и добавляют 2 мл кремофора EL-20 при постоянном перемешивании. Через 15 минут добавляют воду при постоянном перемешивании, доводя объем раствора до 100 мл Полученный стабильный раствор, прозрачный, с желтоватым оттенком, разливают во флаконы из тёмного стекла, укупоривают и хранят при температуре +2-+4 °С, срок хранения - 2 года.

Пример 2. Получение фармацевтической композиции, содержащей берберин в качестве активнодействующего вещества

При температуре 40 °С и постоянном перемешивании со скоростью 1000 об/мин, на магнитной мешалке, к 30 мл 1-метил-2-пирролидона добавляют 5 г порошка берберина. Полученную смесь перемешивают до полного растворения и добавляют 7 мл кремофора EL-20 при постоянном перемешивании. Через 15 минут добавляют воду при постоянном перемешивании, доводя объем раствора до 100 мл Полученный стабильный раствор, прозрачный, с желтоватым оттенком, разливают во флаконы из тёмного стекла, укупоривают и хранят при температуре +2-+4 °С, срок хранения - 2 года.

Пример 3. Получение фармацевтической композиции, содержащей берберин в качестве активнодействующего вещества

При температуре 40 °С и постоянном перемешивании со скоростью 1000 об/мин, на магнитной мешалке, к 50 мл 1-метил-2-пирролидона добавляют 10 г порошка берберина. Полученную смесь перемешивают до полного растворения и добавляют 10 мл кремофора EL-20 при постоянном перемешивании. Через 15 минут добавляют воду при постоянном перемешивании, доводя объем раствора до 100 мл Полученный стабильный раствор, прозрачный, с желтоватым оттенком, разливают во флаконы из тёмного стекла, укупоривают и хранят при температуре +2-+4 °С, срок хранения - 2 года.

Определение чувствительности бактерий Streptococcus spp. к фармацевтической композиции на основе берберина проводили по следующей методике. Стерильные стеклянные чашки Петри, устанавливали на столе со строго горизонтальной поверхностью. Затем во флакон с 25 мл. стерильной и охлажденной до температуры 45-50 °С среды Мюллера-Хинтона вносили по 1 мл суспензии суточной культуры испытуемого микроорганизма с концентрацией 500 млн м.т.\мл и тщательно перемешивали. Затем питательную среду, содержащую исследуемую взвесь микроорганизмов, вносили в чашки Петри. После застывания агара в его толще с помощью стерильного сверла делали лунки. В лунки вносили по 100 мкл предварительно разведённого на фосфатном буфере раствора антибиотика в следующих концентрациях: 200 мкг\мл по действующему веществу (№1), 100 мкг\мл по действующему веществу (№2), 50 мкг\мл по действующему веществу (№3) и 25 мкг\мл по действующему веществу (№4). Активность различных концентраций антибиотика учитывали визуально по наличию зон угнетения роста испытуемых микробов.

Самая большая зона угнетения роста тест культуры Streptococcus spp. отмечалась в концентрации 200 мкг/мл, немного меньше в концентрации 100 мкг\мл, в концентрациях 50 и 25 мкг/мл зона угнетения роста тест культуры микроорганизма Streptococcus spp. была незначительной. Выделенная культура проявляла чувствительность к берберину в концентрации 100 мкг/мл.

Исследование по оценке сроков годности препарата поводили согласно ОФС.1.1.0009.15 «Сроки годности лекарственных средств». Предполагаемая температура хранения +2 °С -+4 °С. Согласно ОФС.1.1.0009.15 Испытания стабильности методом «ускоренного старения», образцы препаратов подвергали нагреванию в термостатирующем устройстве до 40 °С в течение 1 месяца. В соответствии ОФС.1.1.0009.15 при повышенных температурах, как правило, ускоряются протекающие в лекарственных средствах физико-химические процессы, приводящие к изменениям качества.

Таким образом, промежуток времени, в течение которого контролируемые показатели качества лекарственного средства сохраняются в допустимых пределах (экспериментальный срок годности), искусственно сокращается в сравнении со сроком годности при температуре хранения. Это позволяет значительно сократить время, необходимое для установления срока годности. По результатам, полученным в процессе «ускоренного старения» лекарственного средства, можно решить также обратную задачу, т.е. установить температуру хранения, обеспечивающую какой-либо заданный срок годности.

Срок годности (С) при температуре экспериментальным сроком годности (СЭ) при повышенной температуре экспериментального хранения (tэ) следующей зависимостью:

C=K х CЭ,

Значения коэффициента соответствия (K) при температурном интервале (tэ-tхр) 35 °С равен 24,7.

Таким образом С=30 сут. х 24,7 = 741 день или 2 года.

По истечении срока оценивали физико-химические характеристики образцов препарата. Все образцы соответствовали предъявляемым требованиям.

Внешний вид, цвет - прозрачная жидкость с желтоватым оттенком; PH - 5,0-5,3; относительная вязкость - 4,6-5,1; плотность при 20 °С, г/см³- 1,03-1,07; берберин, мг/мл - соответствует изначальным значениям.

На основе проведённых исследований можно сделать вывод о том, что при помощи заявляемого способа можно получать растворимые в воде формы берберина.

Определение острой токсичности полученного препарата.

Для определения острой токсичности был использован препарат, полученный по примеру 2.

Целью настоящих исследований явилась оценка острой токсичности препарата на мышах при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении.

Настоящее исследование является доклиническим изучением безопасности новых лекарственных средств. Исследования, которые проводят на лабораторных животных, предоставляют наиболее полную информацию об острой токсичности лекарственного препарата, который предлагается для применения у домашних животных.

В таблице 2 представлены дизайн и организация исследования, которые направлены на решение поставленной задачи и базируются на общих принципах организации исследований по оценке острой токсичности лекарственных препаратов на лабораторных животных.

Подбор животных в группы проводили произвольно методом «Случайных чисел», используя в качестве критерия массу тела. Индивидуальные значения массы тела не отклонялись от среднего значения в группе более, чем на 10%. Животных взвешивали на весах PA2102C (OHAUS).

Каждая группа мышей как при внутрижелудочном, так и при внутрибрюшинном введении испытуемого препарата состояла из 10 животных (5 самцов, 5 самок) массой 18-20 г.

Масса животных указана на время введения препаратов.

Подготовку к опыту мышей проводили в соответствии с указаниями ОФС «Аномальная токсичность» ГФ XII (Государственная фармакопея Российской Федерации XII, ч. 1, 25. Аномальная токсичность (ОФС 42-0060-07), 2012.). Перед опытом у животных отбирали корм и воду. Через два часа животных взвешивали и распределяли по группам.

Препарат использовали в нативном виде. Для достижения адекватных объемов при внутрибрюшинном и внутрижелудочном введении препараты разводили в соответствующем объёме воды для инъекций.

Процедура введения препарата

При оценке пероральной токсичности испытуемый препарат вводили в желудок белым нелинейным мышам с помощью желудочного зонда.

Расчёт доз производили на 100% лекарственную форму. Препарат вводили внутрижелудочно белым нелинейным мышам в дозах 3000, 4500, 6000 и 7500 мг/кг по лекарственной форме.

Контрольным мышам вводили однократно внутрижелудочно воду для инъекций в максимально допустимом объеме 0,5 мл.

Учитывая тот факт, что максимальная доза вещества, вводимого в желудок составляет для мышей 0,5 мл, дозы 6000 и 7500 мг/кг вводили дробно с интервалом 4 часа.

При оценке парентеральной токсичности испытуемый препарат вводили белым нелинейным мышам при помощи одноразовых шприцев в брюшную полость.

Расчет доз производили на 100% лекарственную форму. Препарат вводили внутрибрюшинно белым нелинейным мышам в дозах 3000, 4500, 6000 и 7500 мг/кг по лекарственной форме.

Контрольным мышам вводили однократно внутрибрюшинно воду для инъекций в максимально допустимом объеме 0,5 мл.

Учитывая тот факт, что максимальная доза вещества, вводимого внутрибрюшинно составляет для мышей 0,5 мл, дозы 6000 и 7500 мг/кг вводили дробно с интервалом 4 часа.

Наблюдение за животными проводили в течение 14 дней, в течение первых суток животные находились под непрерывным наблюдением. При наблюдении за животными оценивали и документировали следующие параметры: интенсивность и характер двигательной активности, наличие судорог, координацию движений, реакция на звуковые раздражители, состояние кожи и шерсти, состояние слизистых, частоту дыхательных движений, вид и консистенцию фекальных масс, потребление корма, массу тела.

На 14 день после введения исследуемый препарат белым нелинейным мышам, провели эвтаназию выживших животных методом транслокации шейных позвонков под ингаляцией эфира. При проведении вскрытия оценивали состояние желудочно-кишечного тракта, печени, почек, поджелудочной железы, проводили взвешивание органов.

Опытных и контрольных животных взвешивали перед введением препарата, а также на 1; 7 и 14 сутки после введения препарата; определяли относительный привес по отношению к исходной массе тела (%) (таблица 5).

Введение препарата в дозе 3000 мг/кг по лекарственной форме не привело к гибели животных. Вместе с этим, сразу после введения препарата отмечали угнетение, мыши были гиподинамичны, отмечали нарушение груминга. Данные симптомы купировались в течение 1-2 часов после введения. В последующем мыши не отличались от контрольных.

Дозы 4500, 6000 и 7500 мг/кг по лекарственной форме. Животные угнетены, движения некоординированы. У некоторых животных отмечались клонические судороги. Отказ от корма в течение 1-3 суток после введения препарата. Тремор, нарушение груминга. Смерть наступала в течение первых трех суток после введения препарата (таблица 3). У выживших животных гиподинамия отмечалась на протяжении 6 -7 суток, мыши плохо потребляли корма.

При вскрытии павших мышей отмечали следующее: печень увеличена, сосуды печени кровенаполнены. Селезёнка увеличена, дряблая. Сосуды мягкой мозговой оболочки кровенаполнены, отек головного мозга. Легкие мышей темно-красные, с синюшным оттенком и светлыми участками, тестоватой консистенции. Кровеносные сосуды переполнены кровью. Почки увеличены, гиперемированы, отмечаются точечные кровоизлияния.

В контрольной группе животных, которым вводили воду для инъекций в максимально допустимых объемах, падежа и признаков интоксикации не отмечалось.

Аналогичные изменения наблюдались при однократном парентеральном (внутрибрюшинном) введении препарата.

В таблице 4 представлены результаты исследования острой токсичности после однократного внутрибрюшинного введения препарата белым нелинейным мышам.

В таблице 5 представлены данные по динамике прироста массы тела у мышей после однократного внутрижелудочного введения препарата.

Введение препарата белым нелинейным мышам внутрижелудочно в дозе 3000 мг/кг не привел к статистически значимому изменению динамики привесов.

Вместе с этим, при введении препарата в диапазоне доз 4500 и 6000 мг/кг массы тела привело к статистически значимому снижению динамики привесов в группе мышей, которым вводили препарат.

Так для препарата отмечается отрицательный среднесуточный привес за 14 дней который составил соответственно 98,12±1,35* и 97,39±3,07*% против контрольного значения 112,1±5,6 %.

Показатели коэффициентов внутренних органов белых нелинейных мышей на 14 сутки после однократного внутрижелудочного введения препарата представлены в таблице 6.

Анализируя результаты взвешивания внутренних органов животных после однократного внутрижелудочного введения препарата белым нелинейным мышам, можно заключить, что данные лекарственные средства не оказывают отрицательного влияния на весовые коэффициенты внутренних органов животных. Массовые коэффициенты печени, почек, селезёнки и сердца опытных групп мышей не отличаются от контрольных животных.

Данный факт указывает, что все вводимые дозы препарата оказывают общетоксическое действие на организм животных. Вместе с этим отмечается дозозависимый эффект общетоксического действия данного препарата на организм белых нелинейных мышей, который проявляется в интенсивности снижения динамики среднесуточных привесов в зависимости от дозы препарата. Чем выше доза, тем интенсивнее снижение привесов.

Анализируя полученные данные, при внутрижелудочном введении белым нелинейным мышам, как самцам, так и самкам препарата, можно констатировать следующее -дозу 3000 мг/кг следует рассматривать в качестве переносимой, дозы в диапазоне 4500 - 7500 мг/кг - в качестве летальных.

В таблице 7 представлены расчетные токсикологические параметры для белых нелинейных мышей препарата при внутрижелудочном введении Пробит-анализ - Метод Финни [Логнормальный закон распределения].

Параметры острого токсического действия препарата при внутрибрюшинном введении составили: LD16 - 3856,51± 4215,98мг/кг; LD50 - 5661,01± 1240,5 мг/кг; LD 84 - 8290,49± 7450,27 мг/кг (Пробит-анализ - Метод Финни, Логнормальный закон распределения).

При внутрижелудочном введении белым нелинейным мышам среднесмертельная доза для препарата составила 5661,01± 1240,5 мг/кг.

Согласно общепринятой гигиенической классификации ГОСТ 12.1.007-76, препарат относятся к 4 классу опасности (вещества малоопасные).

Анализ полученных данных, при парентеральном (внутрибрюшинном) введении белым нелинейным мышам, как самцам, так и самкам препарата, показал, что, как и при внутрижелудочном введении дозу 3000 мг/кг следует рассматривать в качестве переносимой, дозы в диапазоне 4500 - 7500 мг/кг - в качестве летальных.

В таблице 8 представлены расчетные токсикологические параметры для белых нелинейных мышей препарата при внутрибрюшинном введении Пробит-анализ - Метод Финни [Логнормальный закон распределения].

Параметры острого токсического действия препарата при внутрибрюшинном введении составили: LD16 – 3565,84± 3,183,40 мг/кг; LD50 – 5087,85± 1321,47 мг/кг; LD 84 – 7259,51± 3318,54 мг/кг (Пробит-анализ - Метод Финни, Логнормальный закон распределения).

В результате проведенных исследований установлено, что LD50 препарата при парентеральном введении препарата белым нелинейным мышам, как самцам, так и самкам составляет 5087,85± 1321,47 мг/кг.

Заявляемое изобретение является новым и промышленно применимым, так как может быть реализовано с использованием известных компонентов, обеспечивает высокую биодоступность действующего вещества берберина, за счёт его мицелярной формы.

Таблица 1.

№ Берберин, % 1-метил-2-пирролидон, % Кремофор EL-20, % 1,0 20,0 2,0 1,0 20,0 3,0 1,0 22,0 5,0 1,0 25,0 3,0 2,0 20,0 3,0 2,0 20,0 4,0 2,0 40,0 2,0 3,0 20,0 4,0 3,0 30,0 5,0 3,0 30,0 6,0 4,0 40,0 6,0 5,0 30,0 7,0 6,0 40,0 5,0 6,0 40,0 7,0 6,0 40,0 10,0 7,0 40,0 5,0 7,0 40,0 7,0 7,0 40,0 10,0 8,0 40,0 7,0 8,0 40,0 10,0 9,0 40,0 8,0 9,0 40,0 10,0 9,0 50,0 10,0 10,0 50,0 10,0

Таблица 2.

Вид, пол животных Кол-во животных в группе Препарат (вариант опыта) Дозы, кол-во Объем раствора для введения, мл/животное Режим введения мыши- самцы массой 18-20 г 5 Испытуемый препарат Несколько доз 0,1 – 0,5 Внутрижелудочно, однократно мыши- самки массой 18-20 г 5 Испытуемый препарат Несколько доз 0,1 – 0,5 Внутрижелудочно, однократно мыши- самцы массой 18-20 г 5 Испытуемый препарат Несколько доз 0,1 – 0,5 Внутрибрюшинно, однократно мыши- самки массой 18-20 г 5 Испытуемый препарат Несколько доз 0,1 – 0,5 Внутрибрюшинно, однократно мыши- самцы массой 18-20 г 10 Раствор натрия хлорида
(контроль) 0,5 Внутрижелудочно, однократно мыши- самцы массой 18-20 г 10 Раствор натрия хлорида
(контроль) 0,5 Внутрибрюшинно, однократно

Таблица 3.

Вид, пол Доза препарата (мг/кг) Число мышей в опыте Число погибших мышей после однократного введения препаратов в различных дозах через (сутки) Итоговый результат 1 2 3 4 5 6 7 14 Мыши-самцы 3000 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 Миши-самки 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 Мыши-самцы 4500 5 0 1 0 0 0 0 0 0 1/5 Миши-самки 5 1 1 0 0 0 0 0 0 2/5 Мыши-самцы 6000 5 2 1 0 0 0 0 0 0 3/5 Миши-самки 5 1 0 1 0 0 0 0 0 2/5 Мыши-самцы 7500 5 3 1 1 0 0 0 0 0 5/5 Миши-самки 5 1 1 0 1 0 0 0 0 3/5

Таблица 4.

Вид, пол Доза препарата (мг/кг) Число мышей в опыте Число погибших мышей после однократного введения препаратов в различных дозах через (сутки) Итоговый результат 1 2 3 4 5 6 7 14 Мыши-самцы 3000 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 Миши-самки 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0/5 Мыши-самцы 4500 5 0 1 1 0 0 0 0 0 2/5 Миши-самки 5 1 1 0 0 0 0 0 0 2/5 Мыши-самцы 6000 5 2 1 1 0 0 0 0 0 4/5 Миши-самки 5 1 0 1 0 0 0 0 0 2/5 Мыши-самцы 7500 5 3 1 1 0 0 0 0 0 5/5 Миши-самки 5 2 1 0 1 0 0 0 0 4/5

Таблица 5.

Доза, мг/кг Масса (г) после введения через (суток) Прирост
за 14 дней %
к исходной массе тела 0 1 7 14 3000 18,97±0,42 19±0,44 19,7±0,5 20,53±0,7 1,56±0,4 108,19±2,3 4500 19,1±0,44 18,97±0,36 18,56±0,22 18,41±0,23 -0,36±0,26* 98,12±1,35* 6000 19,23±0,75 18,92±0,66 18,68±0,58 18,51±0,75 -0,5±0,59* 97,39±3,07* 7500 19,1±0,65 * Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной группами ( Р ≤ 0,05 при t критическом 2,10)

Таблица 6.

Доза, мг/кг Вес мыши Печень Почки Селезенка Сердце масса коэффициент масса коэффициент масса коэффициент масса коэффициент 3000 20,53±0,7 1,15±0,1014 0,05±0,0057 0,31±0,0339 0,02±0,0014 0,33±0,1029 0,02±0,0048 0,13±0,0214 0,01±0,001 4500 18,41±0,23 0,97±0,1116 0,05±0,0065 0,26±0,0284 0,01±0,0015 0,31±0,1311 0,02±0,0069 0,26±0,2559 0,01±0,0007 6000 18,51±0,75 1,05±0,0954 0,06±0,0047 0,25±0,0316 0,01±0,0016 0,3±0,0649 0,02±0,0037 0,12±0,0205 0,01±0,001 7500

Таблица 7.

Препарат LD₁₆ (мг/кг) LD₅₀ (мг/кг) LD ₈₄ (мг/кг) Берберин 3856,51± 4215,98 5661,01± 1240,5 8290,49± 7450,27

Таблица 8.

Препарат LD₁₆ (мг/кг) LD₅₀ (мг/кг) LD ₈₄ (мг/кг) Берберин 3565,84± 3,183,40 5087,85± 1321,47 7259,51± 3318,54

Изобретение относится к области фармацевтики и может быть использовано для получения инъекционной формы антибактериального препарата на основе берберина. Способ получения растворимой в воде формы препарата на основе берберина характеризуется тем, что в качестве растворителя берут 1-метил-2-пирролидон при температуре 40 °С и при постоянном перемешивании добавляют в него порошок берберина, полученную смесь перемешивают до полного растворения, и, продолжая перемешивать, добавляют в качестве поверхностно-активного вещества кремофор EL, а через 15 мин, продолжая перемешивать, добавляют воду, доводя объем раствора до 100 мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%: берберин - 1-10; 1-метил-2-пирролидон - 20-50; кремофор EL - 2-10; остальное - вода. Изобретение обеспечивает высокую биодоступность действующего вещества берберина за счёт его мицелярной формы. 8 табл., 3 пр.

Способ получения растворимой в воде формы препарата на основе берберина, характеризующийся тем, что в качестве действующего вещества используется порошок берберина, в качестве растворителя берут 1-метил-2-пирролидон при температуре 40 °С и при постоянном перемешивании добавляют в него порошок берберина, полученную смесь перемешивают до полного растворения, и, продолжая перемешивать, добавляют в качестве поверхностно-активного вещества кремофор EL, а через 15 мин, продолжая перемешивать, добавляют воду, доводя объем раствора до 100 мл, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

берберин - 1-10,

1-метил-2-пирролидон - 20-50,

кремофор EL - 2-10,

остальное - вода.