Способ получения молокосвертывающего фермента из биомассы плодовых тел высших грибов Российский патент 2024 года по МПК C12N9/58 B01J19/10 A23C19/32 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам извлечения протеолитических ферментов из биомассы грибов, и может быть использовано в пищевой и биотехнологической промышленности.

Молокосвертывающие ферменты являются одними из протеолитических ферментов и используются для расщепления белков молока, их коагуляции и последующего образования сгустка при производстве твердых сыров и творога из натурального молока. Наиболее часто для этой цели используют ферменты животного происхождения и микробные коагулянты. Биомасса грибов также содержит протеолитические ферменты, которые могут быть использованы, после выделения и очистки, в качестве молокосвертывающего фермента.

Известен способ получения молокосвертывающего фермента «Руссулин». В качестве продуцента фермента используют высшие базидиальные грибы вида Russula decoloraus (штамм 2). Культивирование биомассы мицелия производят на питательной среде, содержащей источники углеводов, азота и минеральных веществ. Полученную культуральную жидкость отделяют от мицелия, охлаждают, осаждают белки этиловым спиртом, выдерживают смесь в течение 24 часов при температуре - 15°С, декантируют надосадочную жидкость, осадок отделяют и высушивают [1].

Применение в качестве осадителя этилового спирта вызывает значительную инактивацию протеолитических ферментов и не способствует их стабильности. Также данный способ не позволяет получить фермент с высоким выходом.

Известен способ получения молокосвертывающего фермента из высших базидиальных грибов Hirschioporus laricinus ВКПМ F-263. Способ заключается в культивировании биомассы мицелия на глюкозо-пептонной среде, отделении культуральной жидкости, охлаждении ее до температуры 4-5°С, осаждении фермента сернокислым аммонием при 55-80%-ном насыщении с последующей его очисткой от низкомолекулярных веществ и белков, не растворимых в воде, методом гидролиза и дальнейшей очисткой фермента методом электрофореза [2].

Недостатком данного способа является многостадийность и невозможность получить фермент в промышленных объемах из-за сложности применяемого оборудования.

Известен также способ получения молокосвертывающих ферментов из высших грибов Fomitopsis pinicola (штамм АТСС 20036) и Irpex lacteus (штамм IFO 5367). Способ получения включает культивирование продуцентов на жидкой питательной среде, состоящей из источников углеводов (крахмал, декстрин, сахароза, лактоза, мальтоза, глюкоза, меласса, гидролизат древесины), азота (соли аммония, нитраты, кукурузный отвар, пептон, мясной экстракт, соевый порошок, пшеничные отруби, дрожжи, дрожжевой экстракт, мочевина), минеральных веществ (соли кальция, магния, натрия, цинка, меди, железа) и витаминов. После культивирования осуществляют выделение ферментов из культуральной жидкости центрифугированием с последующей фильтрацией, осаждением спиртом (этанолом, метанолом), который может быть заменен ацетоном или изопропанолом, либо сульфатом аммония (50-75% насыщения экстракта). Полученные ферменты высушивают под вакуумом или в морозильной камере [3].

Однако получаемые таким образом ферменты обладают недостаточно высокой молокосвертывающей активностью (МСА) и высокой протеолитической активностью (ПА), что приводит к разжижению молочного сгустка в процессе созревания сыра.

Существует способ получения молокосвертывающего фермента из агарикового макромицета Coprinus lagopides. Способ предусматривает глубинное культивирование продуцента на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли. По достижении максимальной молокосвертывающей активности мицелиальную биомассу отделяют фильтрованием от культуральной жидкости. Затем культуральный фильтрат концентрируют и очищают от низкомолекулярных соединений методом ультрафильтрации и лиофильно высушивают. Способ прост в исполнении, непродолжителен по времени, не требует токсичных реагентов [4].

Недостатком данного способа является использование дорогостоящего оборудования и высоких энергозатрат для осуществления процесса глубинного культивирования биомассы мицелия.

Наиболее близким техническим решением является способ, предусматривающий получение молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus). Способ характеризуется тем, что плодовые тела Pleurotus ostreatus гомогенизируют, замораживают с последующим размораживанием и разделением на экстракт и осадок. Осадок соединяют с дистиллированной водой в соотношении 1:2, выдерживают при температуре (+4)-(+8)°С, отделяют вторичный экстракт и соединяют его с ранее полученным экстрактом. В смесь экстрактов добавляют уксусную или соляную кислоту до достижения рН=3,8 и осуществляют осаждение насыщением раствора хлоридом натрия при температуре (+4)-(+8)°С. Отделяют полученный осадок и высушивают вымораживанием при температуре (-18)-(-20)°С. Полученный фермент хранят в холодильнике [5, прототип].

Недостатки:

- низкая молокосвертывающая активность фермента - 0,13 ед. на мг препарата;

- низкий показатель соотношения молокосвертывающей и общей протеолитической активности - 2,6, что может привести к разжижению сыра в процессе созревания. Например, у стандартного сычужного фермента, полученного из сычугов телят отношение МСА к ПА составляет 9,1 [6].

Целью изобретения является получение сухого фермента с высокой молокосвертывающей активностью и небольшой протеолитической активностью.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения молокосвертывающего фермента из плодовых тел высших грибов, включающем гомогенизацию, замораживание полученного гомогената с последующим размораживанием, соединение осадка с дистиллированной водой, высушивание вымораживанием в качестве продуцента фермента используют плодовые тела Grifola frondosa, после размораживания гомогената получают суспензию добавлением дистиллированной воды в соотношении 1:5-1:25, проводят ультразвуковую экстракцию водной суспензии плодовых тел с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт при температуре 24-32°С в течение 10-30 минут, обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании, центрифугируют при 3000 об/мин, микрофильтруют полученную жидкость с размером пор фильтра 0,45 мкм., концентрируют фильтрат под вакуумом по объему в 6 раз при 28-40°С и высушивают вымораживанием при (-27)-(-39)°C с наполнителем поваренная соль в концентрации 15-35% на лиофильной сушилке.

Технический результат - повышение молокосвертывающей активности фермента и показателя соотношения МСА к ПА. Результат достигается за счет того, что в качестве продуцента фермента используют плодовые тела Grifola frondosa, из которых получают суспензию гомогената добавлением дистиллированной воды в соотношении 1:5-1:25, проводят ультразвуковую экстракцию с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт варьируя температуру 24-32°С и время 10-30 минут, обрабатывают бентонитом, центрифугируют, проводят микрофильтрацию, концентрируют фильтрат под вакуумом при 28-40°С и лиофильно высушивают при (-27)-(-39)°C с наполнителем поваренная соль в концентрации 15-35%.

Для достижения заявленного технического результата используют плодовые тела грибов G. frondosa. Эти грибы культивируются по всему миру и при отработке технологии могут являться доступным, дешевым и нетоксичным сырьем для получения ферментных препаратов.

Также применяют ультразвуковое воздействие на биомассу плодовых тел грибов, что приводит к нарушению диффузионного слоя клеточной стенки и, как следствие, быстрому экстрагированию растворимых компонентов [7].

Также этому способствует повышенная температура 24-32°С и длительность обработки 10-30 минут. При температуре меньше 24°С скорость экстракции низкая, при температуре выше 32°С может происходить частичная денатурация ферментов. При длительности меньше 10 минут количество экстрагируемого фермента очень мало. При длительности свыше 30 минут количество экстрагируемого фермента уже не увеличивается с ростом времени обработки.

В отличие от прототипа предлагаемая ультразвуковая экстракция является одноступенчатой и, соответственно, проще реализуется, не требует смешивания экстрактов.

В отличие от прототипа предлагается использование более низких соотношений гомогената и дистиллированной воды. Получение суспензии гомогената и дистиллированной воды в соотношении 1:5-1:25 против 1:2 позволяет создать большую разность концентраций для обеспечения высокой движущей силы экстрагируемого фермента, а также приемлемую вязкость суспензии для удобной технологической обработки.

Обработка бентонитом направлена на коагуляцию тонкой взвеси твердых частиц, которая загрязняет фермент. Концентрация бентонита обусловлена обеспечением требуемой вязкости раствора. Центрифугирование позволяет эффективно отделить коагулированный осадок.

Микро фильтрация также направлена на получение требуемой степени очистки получаемого фермента. Концентрирование под вакуумом позволяет сократить количество влаги, подлежащей удалению в процессе сушки. При температуре свыше 40°С может происходить частичная денатурация белков фермента, при температуре ниже 28°С вязкость жидкости слишком велика, что очень замедляет процесс концентрирования.

Лиофильная сушка направлена на сохранение нативной структуры фермента и получение его в сухом виде. Температурный диапазон является отличным от прототипа и находится в более низком диапазоне температур (-27)-(-39)°С против (-18)-(-20)°С. Предлагаемая в настоящем способе температурный диапазон обуславливает более высокую скорость удаления влаги. Поваренная соль имеет высокую степень сродства к воде и эффективно ее сорбирует. Концентрация наполнителя обусловлена необходимостью обеспечения требуемого градиента концентраций влаги при удалении ее из раствора.

Предлагаемое изобретение позволяет повысить уровень МСА фермента в 2,5 раза и показатель МСА к ПА в 1,9 раз по сравнению с прототипом за счет обработки водной суспензии плодовых тел грибов ультразвуком, частичной очистки раствором бентонита, концентрирования фильтрата под вакуумом и лиофильной сушки с наполнителем. Достигнутые показатели сухого фермента позволяют использовать его в качестве эффективного молокосвертывающего агента в молочной отрасли промышленности.

В таблице представлены показатели МСА, ПА и их соотношение в сравнении с прототипом.

Данные таблицы показывают, что МСА фермента выше прототипа на 2,5 раза и составляет 0,325 ед/мг. Отношение МСА к ПА выше в сравнении с прототипом в 1,9 раз.

Предлагаемый способ получения молокосвертывающего фермента может быть осуществлен следующим образом. Гомогенизация, перемешивание, суспендирование, обработка бентонитом могут быть проведены в емкостном сосуде с мешалкой. Ультразвуковая экстракция может быть проведена в ультразвуковой ванне или в ультразвуковом проточном аппарате. Замораживание может быть проведено в морозильной камере, с предварительным помещением сырья в тару. Размораживание может быть проведено в дистиллированной воде в емкостном сосуде с мешалкой. Концентрированием может быть выполнено на роторном испарителе. Фильтрование и микрофильтрация могут быть выполнены на вакуум-фильтре и нутч-фильтре соответственно. Центрифугирование может быть реализовано на отстойной центрифуге.

Возможность получения заявленного технического результата подтверждаются следующими примерами.

Пример 1

Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:10 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 26°С в течение 15 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 30°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 20% при -30°С. Выход фермента по массе в пересчете на стандартную активность составляет 0,98 г/л водного экстракта плодовых тел. Молокосвертывающий фермент содержит 0,87 мг белка, 0,300 ед/мг МСА и 0,064 ед/мг ПА. Соотношение МСА к ПА составляет 4,7.

Пример 2

Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированную воду в соотношении 1:15 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 28°С в течение 20 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 34°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 25% при -33°С. Выход фермента по массе в пересчете на стандартную активность составляет 0,83 г/л водного экстракта плодовых тел с содержанием белка 0,84 мг. Общая МСА сухого фермента составляет 0,325 ед/мг, ПА - 0,062 ед/мг. Соотношение МСА к ПА составляет 5,2.

Пример 3

Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированной воды в соотношении 1:20 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 30°С в течение 25 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 38°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 30% при -36°С. Выход фермента по массе в пересчете на стандартную активность составляет 0,92 г/л водного экстракта плодовых тел. Молокосвертывающий фермент содержит 0,87 мг белка, 0,302 ед/мг МСА и 0,066 ед/мг ПА. Соотношение МСА к ПА составляет 4,6.

Пример 4

Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированной воды в соотношении 1:5 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 24°С в течение 10 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 28°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 15% при -27°С. Выход фермента составляет 0,52 г/л. Молокосвертывающий фермент содержит 0,79 мг белка, 0,205 ед/мг МСА и 0,056 ед/мг ПА. Соотношение МСА к ПА составляет 3,6.

Пример 5

Свежие плодовые тела Grifola frondosa в количестве 250 г гомогенизируют, замораживают при температуре -18°C с последующим размораживанием, добавляют дистиллированной воды в соотношении 1:25 для получения равномерной суспензии и проводят экстракцию в ультразвуковой ванне с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт, при температуре 32°С в течение 30 минут. Полученный экстракт фильтруют через хлопчатобумажный фильтр на установке под вакуумом. Далее полученную смесь обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 минут при перемешивании. Отработанное бентонитовое, нерастворимое вещество отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. Далее проводят микрофильтрацию полученной жидкости через фильтр с размером пор 0,45 мкм. Фильтрат концентрируют в 6 раз методом вакуум-выпаривания при температуре 40°С, после чего лиофильно высушивают с наполнителем поваренная соль в концентрации 35% при -39°С. Выход фермента по массе в пересчете на стандартную активность составляет 0,60 г/л водного экстракта плодовых тел. Молокосвертывающий фермент содержит 0,62 мг белка, 0,258 ед/мг МСА и 0,068 ед/мг ПА. Соотношение МСА к ПА составляет 3,8.

Использование предлагаемого способа получения фермента в сравнении с существующим способом согласно прототипу имеет следующие преимущества:

1. Увеличивается молокосвертывающую активность фермента в 2,5 раза.

2. Повышается соотношение МСА к ПА в 1,9 раз.

Список использованных источников

1. Пат. 883174 Союз Советских Социалистических Республик, МПК C12N 9/50 А23С 19/032. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата руссулин / В.М. Гуцалюк, В.Р. Кулинченко, М.Н. Нудьга, Е.Е. Каталевский, Н.П. Круглова, П.Н. Евтихов, А.Е. Епифанов, П.Н. Ручков; заявитель и патентообладатель Киевский технологический институт пищевой промышленности. - №2903964; заявл. 31.03.1980: опубл. 23.11.1981, Бюл. №43.

2. А.с. 1395672 Союз Советских Социалистических Республик, МПК C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата / М.И. Бойко, С.Ф. Негруцкий, Т.В. Мирошниченко; заявитель и патентообладатель Донецкий государственный университет. - №4153167/31-13; заявл. 29.08.1986; опубл. 15.05.1988, Бюл. №18.

3. Пат. 3858492 USA, МПК C12N 9/00. Flavoren hancement of milk food stuffs / N. Mukai; M. Kawai; заявитель и патентообладатель Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha. - №145515; заявл. 20.05.1971; опубл. 07.01.1975.

4. Пат. 2354698 Российская Федерация, МПК C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего фермента / Т.А. Дмитриева, М.М. Шамцян, Н.П. Денисова, И.В. Змитрович, А.В. Корчмарева; заявитель и патентообладатель Т.А. Дмитриева, М.М. Шамцян, Н.П. Денисова, И.В. Змитрович, А.В. Корчмарева. - №2006133208/13; заявл. 20.03.2008; опубл. 10.05.2009, Бюл. №13.

5. Пат. 2380416 Российская Федерация, МПК МПК C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной / Г.В. Лебедева, М.Т. Проскуряков, Т.В. Бархатова, М.А. Кожухова; заявитель и патентообладатель ГОУВПО «КубГТУ». - №2008132270/13; заявл. 04.08.2008; опубл. 27.01.2010, Бюл. №3. (прототип)

6. Novel milk-clotting enzyme produced by Coprinus lagopides basidial mushroom / M. Shamtsyan, T. Dmitriyeva, B. Kolesnikov, N. Denisova // Lebensmittel-Wissenschaftund-Technologie. - 2014. - Vol. 58(2). - Pp. 343-347. DOI:10.1016/j.lwt.2013.10.009

7. Пат. 2390364 Российская Федерация, МПК B01D 11/00, B01J 19/10. Способ экстракции биологически активных веществ из растительного сырья / Е.Р. Давидов, П.С. Каныгин, О.А. Фракин, И.В. Черемнов; заявитель и патентообладатель Общество с ограниченной ответственностью «ПРОФ БИЗНЕС». - №2008151906/15; заявл. 29.12.2008; опубл. 27.05.2010, Бюл. №15.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения молокосвертывающего фермента из плодовых тел высших грибов Grifola frondosa, включающий гомогенизацию плодовых тел и замораживание. Полученный гомогенат размораживают, осадок смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5-1:25, проводят ультразвуковую с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт экстракцию водной суспензии плодовых тел при температуре 24-32°С в течение 10-30 мин, обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 мин при перемешивании, центрифугируют, фильтруют полученную жидкость с размером пор микрофильтра 0,45 мкм, концентрируют фильтрат под вакуумом по объему в 6 раз при 28-40°C и лиофильно высушивают при (-27)-(-39)°C с наполнителем поваренной солью в концентрации 15-35%. Изобретение обеспечивает повышение молокосвертывающей активности фермента и показателя соотношения молокосвертывающей и общей протеолитической активности. 1 табл., 5 пр.

Способ получения молокосвертывающего фермента из плодовых тел высших грибов, характеризующийся тем, что плодовые тела гомогенизируют, замораживают полученный гомогенат с последующим размораживанием, смешивают с дистиллированной водой, высушивают продукт вымораживанием, отличающийся тем, что в качестве продуцента фермента используют высшие грибы Grifola frondosa, после размораживания осадок смешивают с дистиллированной водой в соотношении 1:5-1:25, проводят ультразвуковую с частотой 28 кГц, мощностью 170 Вт экстракцию водной суспензии плодовых тел при температуре 24-32°С в течение 10-30 мин, обрабатывают 5% водным раствором бентонита в течение 20 мин при перемешивании, центрифугируют, фильтруют полученную жидкость с размером пор микрофильтра 0,45 мкм, концентрируют фильтрат под вакуумом по объему в 6 раз при 28-40°C и лиофильно высушивают при (-27)-(-39)°C с наполнителем поваренной солью в концентрации 15-35%.