Питательная среда для выращивания продуцента молокосвертывающего фермента Piptoporus betulinus - продуцента молокосвертывающего фермента Российский патент 2024 года по МПК C12N1/14 C12N1/22 C12N9/58 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментной технологии и может найти применение в биотехнологической или молочной промышленности при получении различных типов сыров и творога.

Для получения молокосвертывающих ферментов грибного происхождения в промышленности в основном используют культуры микроскопических мицелиальных грибов родов Mucor, Endothia, Aspergillus, Penicillium, Fusarium. Однако использование в технологии производства ферментов спорообразующих микроскопических грибов сопровождается повышенным риском профзаболеваний персонала (микозы, аллергические реакции), связанным с биологической природой применяемых продуцентов. Помимо этого, использование ферментов из микроскопических грибов часто приводит к получению сыров низкого качества, с легким или выраженным привкусом горечи из-за высокого уровня общего неспецифического протеолиза белков молока.

В настоящее время ведется активный поиск молокосвертывающих ферментов среди продуцентов высших базидиомицетов. Известны продуценты ферментов среди культур высших базидиальных грибов родов Irpex, Trametes, Fomitopsis, Ganoderma, Russula, Coprinus. Мицелий высших грибов в отличие от микроскопических не имеет стадию спорообразования, что значительно упрощает технологию его культивирования, в частности выделения и очистки фермента.

Большинство технологий получения молокосвертывающих ферментов основаны на глубинной ферментации продуцентов. Однако использование технологии твердофазной ферментации позволяет существенно снизить энергозатраты за счет статических условий культивирования продуцентов в простых конструкциях биореакторов. Известно, что около 30-40% стоимости производства ферментов приходится на стоимость питательных сред, поэтому технология твердофазного культивирования мицелия высших грибов является экономически выгодной за счет использования лигноцеллюлозных отходов сельскохозяйственной и деревоперерабатывающей промышленности.

Вышеперечисленные грибы, за исключением Russula и Coprinus, относятся к дереворазрушающим, что дает возможность культивировать мицелий твердофазным способом на лигноцеллюлозных субстратах. Однако из уровня техники известны питательные среды для получения молокосвертывающих ферментов из высших грибов с использованием технологии глубинного культивирования [1, 2]. Питательные среды для твердофазного культивирования высших грибов - продуцентов ферментов молокосверты-вающего действия представлены в ограниченном количестве.

Известна питательная среда для культивирования продуцентов ферментов среди высших грибов Fomitopsis pinicola (штамм АТСС 20036) и Irpex lacteus (штамм IFO 5367). Культивирование биомассы мицелия осуществляют на питательной среде, состоящей из источников углеводов (крахмал, декстрин, сахароза, лактоза, мальтоза, глюкоза, меласса, гидролизат древесины), азота (соли аммония, нитраты, кукурузный отвар, пептон, мясной экстракт, соевый порошок, пшеничные отруби, дрожжи, дрожжевой экстракт, мочевина), минеральных веществ (соли кальция, магния, натрия, цинка, меди, железа) и витаминов [3]. Однако получаемые ферменты на предложенной питательной среде обладают недостаточно высокой молокосвертывающей активностью (МСА) и высокой протеолитической активностью, что приводит к разжижению молочного сгустка в процессе созревания сыра.

Известен субстрат для твердофазного культивирования высших грибов ежовика гребенчатого (Hericium erinaceum), содержащий 100 г пшеничных отрубей и 120 мл дистиллированной воды [4]. Основным недостатком предлагаемого субстрата является продолжительный период культивирования биомассы мицелия (зарастание в течение 14 суток 100 г субстрата) из-за затрудненного воздухообмена, возникающего в результате слипания пшеничных отрубей при добавлении воды. MCA Hericium erinaceum на представленном субстрате зависит от способов выделения, очистки и концентрирования ферментов и составляет до 450 ед/мл.

Наиболее близким по своей технической сущности к предложенному изобретению относится питательная среда для выращивания базидиальных грибов Russula decolorans следующего состава, %: мука кукурузная - 0,9-1,6; натрий азотнокислый - 0,1-0,3; дрожжи - 0,1-0,4; калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,01-0,08; калий фосфорнокислый двузамещенный - 0,02-0,06; кальций хлористый - 0,05-0,05; магний сернокислый - 0,03-0,1; вода - остальное. На среде указанного состава максимальный уровень МСА составляет 400 ед/мл [5, прототип]. Недостатком питательной среды является дороговизна источника углеводов, невысокий уровень МСА в сравнении с предлагаемым способом, а также сравнительно легкая подверженность питательной среды и культуры контаминации посторонней микрофлорой.

Задачей изобретения является разработка состава питательной среды для культивирования биомассы мицелия грибов Piptoporus betulinus - продуцента фермента молокосвертывающего действия с целью повышения уровня МСА с высокой скоростью зарастания.

Поставленная задача решается тем, что в питательной среде состава - лигноцеллюлозное сырье, минеральные компоненты, вода, используют березовые опилки, лузгу подсолнечника в виде механической смеси и следующем соотношении, масс. %: березовые опилки - 60,0-80,0; лузга подсолнечника - 18,5-38,5; СаСО₃ - 1,2; CaSO₄×2H₂O - 0,3; вода для создания относительной влажности 50-70% (сверх 100%), а в качестве продуцента фермента используют мицелий Piptoporus betulinus (сверх 100%).

Технический результат - повышение уровня МСА водного экстракта, содержащего фермент, высокая скорость зарастания питательной среды, достигается за счет того, что используют питательную среду для культивирования продуцента фермента P. betulinus, состоящую из механической смеси березовых опилок, лузги подсолнечника и минеральных компонентов в следующем соотношении, масс. %: березовые опилки - 60,0-80,0; лузга подсолнечника - 18,5-38,5; СаСО_з - 1,2; CaSO₄×2H₂O - 0,3; вода для создания относительной влажности 60% (сверх 100%).

Для достижения заявленного технического результата используют лигноцеллюлозные отходы деревоперерабатывающей промышленности и сельского хозяйства - березовые опилки и лузгу подсолнечника. Переработка сырья мицелием грибов - продуцентами ферментов в ценные продукты, является перспективным направлением современной биотехнологии. Использование технологии твердофазной ферментации позволяет существенно снизить энергозатраты за счет статических условий культивирования продуцентов в простых конструкциях биореакторов.

Березовые опилки и лузга подсолнечника являются лигноцеллюлозным сырьем и выступают в роли источника углерода и азота для питания и роста грибного мицелия. Кроме того, березовые опилки имеют состав, соответствующий составу ствола березы Betula, которая в природных условиях является естественным питанием для трутовика березового Piptoporus betulinus. Соответственно, используемый продуцент имеет хорошо адаптированную к используемому компоненту питательной среды систему целлюлозоразрушающих ферментов. Также обеспечивается высокая скорость зарастания питательной среды гифами мицелия продуцента.

Лузга подсолнечника представляет собой легко усвояемый и доступный для продуцента источник азота и углерода что обеспечивает высокую скорость зарастания. Карбонат кальция и двуводный сульфат кальция используются как раскислители для создания необходимого уровня рН питательной среды. Указанные компоненты в совокупности состава питательной среды позволяют продуценту генерировать водный экстракт фермента с высокой МСА и высокой скоростью зарастания.

Использование механической смеси компонентов позволяет выровнять концентрацию каждого из компонентов в составе композиции питательной среды, обеспечить хороший доступ гифов мицелия к источникам питания, создать благоприятные условия для растворения водорастворимых компонентов питательной среды и, в итоге, продуцирование фермента с высокой МСА и высокую скорость зарастания. Применение питательной среды не в форме механической смеси не позволяет получить водный экстракт фермента с высокой МСА.

Вода в композиции с содержанием 60% (масс.) сверх 100% используется для создания необходимой влажности субстрата, растворения водорастворимых компонентов питательной среды, сорбции ряда продуктов разложения лигноцеллюлозных компонентов питательной среды, создания условий для высокой скорости зарастания. При концентрации свыше 60% сильно снижается концентрация ферментов продуцента, снижается их выход, ослабевает МСА водного экстракта фермента. При концентрации ниже 60% снижается скорость диффузии водорастворимых компонентов питательной среды и возрастает срок зарастания.

Соотношение березовых опилок и лузги подсолнечника в диапазоне от 3:1 до 3:2 (масс.) позволяет обеспечить высокую скорость зарастания мицелием питательной среды и целлюлозоразрушающую активность синтезируемого продуцентом фермента, соответственно - требуемый выход фермента, а также его высокую МСА. При ином соотношении скорость роста мицелия продуцента и выход фермента крайне низки, сильно снижается МСА водного экстракта фермента.

Использование в качестве продуцента мицелия Piptoporus betulinus (сверх 100%) в заявляемой питательной среде позволяет обеспечить хорошее усвоение компонентов питательной среды и синтез фермента с высокой МСА и высокой скоростью зарастания. Использование в качестве продуцента другого мицелия не позволяет получить водный экстракт фермента с высокой МСА и высокой скоростью зарастания.

Для создания относительной влажности питательной среды 60% (сверх 100%)) в их состав добавляется нагретая до 80-100°С водопроводная вода. Готовые питательные среды распределяют по полипропиленовым контейнерам объемом 2000 см³, закрывают крышками с фильтрующим материалом, стерилизуют при 1,0 атм в течение 1,5 часов в автоклаве ВК-75 и засевают чистой культурой мицелия (сверх 100%), выращенной на агари-зованной среде. Питательную среду, инокулированную мицелием грибов, помещают в термостатируемое помещение и инкубируют в течение 12-30 суток при температуре 22-28°С.

Экстракцию ферментов осуществляют дистиллированной водой. Для этого твердофазную культуру диспергируют в 100 мл дистиллированной воды (соотношение питательная среда-растворитель 1:10) и энергично встряхивают на шейкере при 240 об/мин, температуре 25°С в течение 10 минут. После чего смесь фильтруют через складчатый бумажный фильтр (синяя лента). Полученный фильтрат центрифугируют при 10000 об/мин, температуре +4°С в течение 10 мин. Надосадочную жидкость используют в качестве неочищенных ферментов для определения МСА [4].

Общую МСА определяют по методу N. Mukai и М. Kawai после полного зарастания питательной среды мицелием грибов. В пробирки объемом 20 мл вносят по 10 мл коровьего молока жирностью 3,2%, добавляют 1,7 мл 10% раствора хлорида кальция. Полученную смесь нагревают до температуры 35°С на водяной бане в течение 1-2 минут. Далее в опытные пробирки вносят по 2 мл водного извлечения, содержащих ферменты. В контрольные пробирки с молочным субстратом и хлоридом кальция добавляют по 2 мл предварительно прокипяченного водного экстракта. Смеси в пробирках встряхивают, ставят в термостат при температуре 35°С и начинают отсчет времени до момента образования молочного сгустка.

За единицу МСА принимают количество водного извлечения, которое сворачивает 100 мл коровьего молока за 40 минут при температуре 35°С.

Молокосвертывающую активность определяют по формуле:

где К - коэффициент разведения изучаемого фермента;

П - время, за которое образуется плотный молочный сгусток, в минутах;

40 - среднее время производства сыра;

2 - количество внесенного фермента мл [1].

Культивирование мицелия грибов на питательной среде, состоящей из лигноцеллюлозных компонентов, с последующей экстракцией дистиллированной водой позволяет получать водные извлечения, обладающие молокосвертывающей активностью, превышающей прототип в 3,7 раза.

Примеры, иллюстрирующие использование рекомендуемой питательной среды для выращивания P. betulinus - продуцента фермента моло-косвертывающего действия, представлены ниже.

Пример 1

Питательная среда для культивирования продуцента молокосверты-вающего фермента содержит следующие компоненты (мас. %):

Березовые опилки - 60

Лузга подсолнечника - 38,5

СаСО₃ - 1,2

CaSO₄×2H₂O - 0,3

Компоненты используют в питательной среде в форме механической смеси. Относительную влажность питательной среды доводят водопроводной водой до 60%. Питательную среду помещают в полипропиленовые контейнеры объемом 2000 см³ стерилизуют, охлаждают, затем вносят посевной материал из расчета 4% от объема засеваемой питательной среды и выращивают с соблюдением разработанных условий. Продолжительность зарастания питательной среды мицелием грибов P. betulinus составляет 14 суток. Общая МСА водного извлечения, содержащего фермент, составляет 1260 ед/мл.

Пример 2

Питательная среда для культивирования продуцента фермента содержит следующие компоненты (мас. %):

Березовые опилки - 70

Плодовые оболочки овса - 28,5

СаСО₃ - 1,2

CaSO₄×2H₂O - 0,3

Отличие состава питательной среды от примера 1 заключается в изменении соотношения лигноцеллюлозных компонентов березовых опилок и лузги подсолнечника. Подготовка питательной среды к засеву и культивированию осуществляется по способу, описанному в примере 1. Продолжительность зарастания питательной среды мицелием грибов составляет 16 суток. Общая МСА водного экстракта составляет 1290 ед/мл.

Пример 3

Питательная среда для культивирования продуцента фермента содержит следующие компоненты (мас. %):

Березовые опилки - 75

Лузга подсолнечника - 23,5

СаСО₃ - 1,2

CaSO₄×2H₂O - 0,3

Пример отличается соотношением основного древесного компонента питательной среды, взятого в меньшем количестве и лузги подсолнечника. Подготовка питательной среды к культивированию осуществляется по примеру 1. Продолжительность зарастания питательной среды мицелием грибов составляет 12 суток. Общая МСА водного извлечения составляет 1490 ед/мл.

Пример 4

Питательная среда для культивирования продуцента фермента содержит следующие компоненты (мас. %):

Березовые опилки - 80

Лузга подсолнечника - 18,5

СаСО₃ - 1,2

CaSO₄×2H₂O - 0,3

Отличие состава питательной среды от описанных примеров заключается в использовании большего количества березовых опилок. Подготовка питательной среды к культивированию осуществляется по примеру 1. Продолжительность зарастания питательной среды мицелием грибов составляет 18 суток. Общая МСА водного экстракта составляет 1230 ед/мл.

Таким образом, разработанные составы питательных сред для культивирования мицелия грибов P. betulinus позволяют получать водные извлечения, обладающие высоким уровнем МСА (до 1490 ед/мл). Для более высоких показателей МСА необходимо проводить очистку и концентрирование ферментных растворов.

Использование предлагаемой питательной среды в сравнении с существующей позволяет повысить молокосвертывающую активность водного экстракта, содержащего фермент, в 3,7 раза.

Список использованных источников

1. Novel milk-clotting enzyme produced by Coprinus lagopides basidial mushroom / M. Shamtsyan, T. Dmitriyeva, B. Kolesnikov, N. Denisova // Le-bensmittel-Wissenschaft und-Technologie. - 2014. - Vol. 58(2). - Pp. 343-347. DOI: 10.1016/j.lwt.2013.10.009

2. Пат. 2354698 Российская Федерация, МПК C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего фермента / Т.А. Дмитриева, М.М. Шамцян, Н.П. Денисова, И.В. Змитрович, А.В. Корчмарева; заявитель и патентообладатель Т.А. Дмитриева, М.М. Шамцян, Н.П. Денисова, И.В. Змитрович, А.В. Корчмарева. - №2006133208/13; заявл. 20.03.2008; опубл. 10.05.2009, Бюл. №13.

3. Пат. 3858492 USA, МПК C12N 9/00. Flavor enhancement of milk foodstuffs / N. Mukai; M. Kawai; заявитель и патентообладатель Kyowa Hakko Kogyo Kabushiki Kaisha. - №145515; заявл. 20.05.1971; опубл. 07.01.1975.

4. Crude enzymes from a Hericium edible mushroom isolated in Japan: variability in milk-clotting activity and the ability to coagulate ultra-high-temperature pasteurized milk / M. Kishimoto, K. Nakamura, K. Kanemaru, T. Tasaki, T. Nakamura, K. Sato, M. Tanimoto // Food science and technology Research. - 2018. - Vol. 24 (1). - Pp. 139-143. doi.org/10.3136/fstr.24.139

5. A.c. 753895 Союз Советских Социалистических Республик, МПК С12 В 3/00, C12D 13/10. Питательная среда для выращивания продуцента молокосвертывающего фермента Russula decolorans I А.Е. Епифанов, П.Н. Евтихов, Н.П. Круглова, В.А. Королев, Т.Н. Макарова, В.Д. Маковкина, Л.Н. Федорова; заявитель и патентообладатель Ефремовский ордена Трудового Красного Знамени биохимический завод. - 2606910/28-13; заявл. 14.04.1978; опубл. 07.08.1980, Бюл. №29. (прототип).

Изобретение относится к биотехнологии. Предложена питательная среда для культивирования биомассы мицелия гриба Piptoporus betulinus - продуцента молокосвертывающего фермента, включающая лигноцеллюлозное сырье - березовые опилки, лузгу подсолнечника, карбонат кальция и сульфат кальция 2-водного, при следующем соотношении, масс. %: березовые опилки - 60-80; лузга подсолнечника - 18,5-38,5; СаСО₃ - 1,2; CaSO₄×2H₂O - 0,3; с относительной влажностью 50-70%. Изобретение обеспечивает повышение молокосвертывающей активности водного экстракта фермента и повышение скорости зарастания мицелием питательной среды. 4 пр.

Питательная среда для культивирования биомассы мицелия гриба Piptoporus betulinus - продуцента молокосвертывающего фермента, включающая лигноцеллюлозное сырье, минеральные компоненты, воду, отличающаяся тем, что в качестве источников углеводов, азота и минеральных веществ используют механическую смесь, состоящую из березовых опилок, лузги подсолнечника, карбоната кальция и сульфата кальция 2-водного, причем компоненты питательной среды взяты в следующем соотношении, масс. %: березовые опилки - 60-80; лузга подсолнечника - 18,5-38,5; СаСО₃ - 1,2; CaSO₄×2H₂O - 0,3; с относительной влажностью 50-70%.