Способ получения фибринолитического фермента Советский патент 1982 года по МПК C12N9/50 

I

Изобретение относится к производству ферментов, в частности к получению фибринолитических ферментов, которые могут быть использованы в

медицине.

Известен способ получения фибринолитического фермента из базидиального гриба aria mellea, заключающийся в обработке плодовых тел грибов водой при 2 С и извлечении водного экстракта вещества, содержащего фермент. После этого при рН 6,0 дважды этиловым спиртом или другим органическим растворителем, смешиваюоцшся с водой, осаждают при минус 5°С АМ-протеазуо Очистку протеазм ведут ионообменной хроматографией и гельфильтрацией. Полученный фермент лиофилизуют. Способ позволяет получить фермент, обладающий способностью к разрушению фибрина и вызываюгдий антикоагулирукщее действие L 1 J

Однако ограниченность ассортимента исходного сырья и трудоемкость извлечения из него фермента, а также отсутствие отечественных фибрино;штических препаратов из базидиальных грибов заставляет предпринимать поиски новых путей получения фибринолитического фермента из других родов съедобных грибов.

Наиболее близким по технической

10 сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому является способ получения фибринолитического фермента из плодовых тел бази;;иального гриба Tricholoma fla vovirens (Fr) Lundell et Nannp синоним Т. eguestre (зеленушка).

Способ получения фибринолитического фермента заключается 0 том, что собранные грибы предварительно

20 высушивают, затем плодовые тела размельчают и суспензируют в физиологическом растворе при соотношении грибы: раствор, равном 1:10, 3 после чего проводят экстрагирование белков (инкубацию суспензии) при 37°С L тече1ше 2-3 ч, затем втечение ночи при комнатной температуре. Далее отделяют экстракт фи трацией через марлю и повторно через фильтр Шамберлена, .после чего выделяют фермент в верхний слой це трифугированием, предварительно ос ветлив раствор добавлением 20%-ног6 уксусного цинка при соотношении 1:10, для того, чтобы удалить балластные пигментные вещества. Вы деленный фермент диализуют против дистиллированной воды в течение не скольких дней и лиофилизуют 2. Однако известный способ не позв ляет получить достаточно высокую активность фибринолитического фермента из Tricholoma flavovirens, т как на стадии экстракции при происходит частичная потеря биологической активности фермента и не предусматривается концентрация бел Ков, содержащих фермент. Кроме того, известный способ дл телен за счет стадии высушивания грибов и обработки больших объемов растворов (1:10), а также их двойной фильтрации через марлю и фильт Шамберлена, что к тому же явлйется трудоемкой операцией. Цель изобретения - повьшение ак тивности фермента, обладающего фибринолитическим действием. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения фибринолитического фермента из плодовых тел баэидиального гриба рода Tricholoma путем суспендирования плодовых тел, экстрагирования белков из суспензии, отделения экстрак та и вьщеления из него фермента с последующим диализом и лиофилизацией целевого продукта, используют плодовые тела Tricholoma portentosum (Fr) Quel, экстрагирование осуществляют при 3-5 С в течение 12-14 ч, а выделение фермента прово дят сернокислым аммонием до насыщения 0,75-0,80 в течение 1-2 ч. Проведение экстрагирования на х лоду при Позволяет сохранить фермент в нативном состоянии. В те чение 12-14 ч происходит полное экстрагирование фермента. Вьщелени фермента из экстракта сернокислым аммонием позволяет сконцентрировать в осадке белки, содержащие фермент. При насыщении сернокислым аммонием от 0,75 до 0,80 осаждаются белки с фибринолитической активностью, тогда как при насыщении ниже 0,75 наблюдается потеря фермента, а выше 0,8 в осадок выпадают неактивные балластные белки, что загрязняет продукт и снижает его удельную активность. Щадящий режим осаждения в течение 1-2 ч, за которые полностью формируется осадок, способствует сохранению исходной активкости нативного фермента, тогда как более длительная экспозиция осадка приводит к частичной необратимой денатурации белка, который теряет свою биологическую активность. Способ осуществляется следующим образом. Свежие плодовые тела Tricholoma portentosum суспензируют в физиологическом или забуференном физиологическом растворе (рН 7,0-7,2) при соотношении грибы: раствор, равном 1:3, после чего экстрагируют при 3-5 С в течение 12-14 ч, затем центрифугируют и супернатант осаждают сернокислым аммонием до насыщения 0,75-0,80, концентрируя фермент в осадке. Через 1-2 ч осадок отфильтровывают, .растворяют в дистиллированной воде и диализуют в течение 2-3 дней сначала против водопроводной, воды, затем против дистил4 С и далее лиофильлированнон при но высушивают. Пример. К 1 кг очищенных плодовых тел грибов Т. portentosum, собранных в Минской области, добавляли физиологический раствор ( рН 7,2) в соотношении 1:3 и грибы размельчали в гомогенизаторе (РТ-2) Полученный гомогенизат оставляли на 14 ч, при 5 С для экстракции фермента, после чего экстракт центрифугирова:ли (3,5 тыс. об/мин),осадок отбрасывали, а из экстракта высаливали фермент сернокисль:м аммонием до насыщения 0,8 ч в течение одного часа при . Затем осадок отфильтровывали на бумажном фильтре и собирали. Полученный ферментативный белок растворяли в 40 мл дистиллированной воды и ставили на диализ против проточной водопроводной воды в течение трех суток (отсутствие ионов SO проверяли качественной реакцией с BaCI) Затем раствор фермента диализовали против дистиллированной воды в .тече ние 14 при . Отдиапизованный раствор фермента лиофильно высушивали. Получили 1,5 г сухого фермента со специфической фибринолитической активноетыо.

Удельная фибринолитическая активность фермента (по Аструпу) составляет 16850 ед., фибринолитическая активность (по Эстоло) - 1:64, фибриногенолитическая (по Эстоло) 1:1024.

9070706

Тромболитическая активность составляет 2,0 ч на 1 мг белка.

Для сравнения активности фермента, полученного по предлагаемому способу, с активностью фермента, полученного по известному была произведена оценка фибринолитической (ФА) И фйбриногенолитической (ФГА) активности по методу, описанному Эстоло и другими.

Результаты сравнения приведены в таблице..