Штамм @ @ ( @ ) @ - продуцент молокосвертывающего фермента Советский патент 1986 года по МПК C12N9/58 C12N15/00 C12N9/58 C12R1/645 

112

Изобретение относится к ферментативной технологии и представляет собой новьй вид гриба для получения молокосвертьгеающего фермента в качестве заменителя сычужного фермента, применяющегося при изготовлении

СЬфОВ,

Целью изобретения является использование нового штамма гриба Hirschioporus laricinus М-81 в качестве продуцент молокосвертьшаю- щего: фермента, обладак ще го более высокой активностью, ч Ы -известные штаммы Грибов.

ПредлагаеМьй штамм М-81 сапро- итового дереворазругаающего гриба Hirschioporus laricinus (класс Basidiomyutes, порядок Aphyllopho- ralis, семейство Polyporaceae) синтезирует и вьщеляет в сферу фермент, обладающий высокой молокосвертываю- щей активностью (МСА)« МСА культу- рального фильтрата составляет 16000 ед/мл, а ферментного препарата 1000000 ед/г. Образукмцййся сгусток белого цвета, посторонних запахов и привкусов не имеет. Штамм -81 образует молокосвертываклций ермент даже при произрастании на минеральной среде Чапека-Докса, где источником углерода служит фильтровальная бумага.

Штамм М-81 Hirschioporus laricinus хранится в коллекции кафедры физиологии растений Донецкого госуниверситета и в ЩШМ ВНИИгенетика (Москва) под шифром №ЦМПМ F-263.

Полученный штамм М-81 Hirschioporus laricinus имеет следующие характеристики.

Морфология. Плодовых тел в культуре не образует. Мицелий белый, достаточно плотньй. Гифы ветвящиеся, с перегородками. Ширина гиф составляет 2,49-5,71 ммк. Спороношений в культуре не дает, В естественных уело- ВИЯХ образует плодовые тела, имеющие шляпку, разделенную на две полукругые половинки. Размер их 3,15х5,30.мм, о 7 мм толщиной. Плодовые тела жесткие, слабо опущенные, темно-серого цвета, гименофор пластинчатый. Споры цилиндрической формы: 5,5-8 х 2- 2,5 ммк.

Минеральная среда Чапека. Грибица белого цвета, редкая, паутинобразная. Воздушный мицелий развит лабо. Гифы ветвящиеся, с перегород82

ками. Средняя скорость роста мицелия за 1 сут при 30°С 13,9±0,15мм. Спороношений не образует. Обратная сторона колонии непигментирована.

Органические среды. На агаризи- рованном, неохмелен«ом пивном сусле . штамм М-81 образует пьш1ный, белый мицелий. Воздушный мицелий хорошо развит. Средний линейный рост за

1 сут при 14,410,3 мм.. Споро- ношений не образует. Среда непигментирована. Хорошо растет на ага- ризированной глюкозо-картофельной среде. При линейный рост мицелия

за 1 сут. 13;4±0,12 мм. Мицелий пьш1ный, белый, достаточно плотный. Спороношений не образует. Обратная сторона колонии гриба непигментирована.

При 50 С рост грибницы отсутствует.

Физиологические признаки. Лучше всего усваивает, глюкозу, фруктозу и ксилозу, слабее арабинозу, маннит и очень слабо сахарозу. Штамм М-81,

произрастая на среде с указанными источниками углерода, образует моло- косвертывающий фермент, активность которого различна.

Токсичность и патогенность культу- рального фильтра определяли на беспородных белых Mbmiax обоего пола. Полученные результаты показали, что культуральный фильтрат штамма М-81 Hirschioporus laricinus при внутри- брюшном и пероральном методах введения патогенными и токсичными свойствами не обладает.

П р и м е р 1. Штамм М-81 Hirschioporus laricinus вьщелен из плодового тела, произраставшего на стволе срубленной сосны. Культуру штамма сохраняли путем редких пересевов на агаризированную глюкозо- картофельную среду или агаризиро- ванное пивное сусло.

Для обнаружения молокосвертываю- щей активности штамм М-81 культивировали на глюкозо-пептонной среде следующего состава: г/л: глюкоза 10,0; пептон, 3,0; KiHPO 0,4; KHjPOj, 0,6, MgSQ,- 7НгО 0,5, ZnSOi, 7НгО 0,001{ CaCli 0,05, дистиллированная вода до 1 л. Кислотность среды после, стерилизации 5, рН. Гриб вы-, ращивали в колбах Эрленмейера на 250 мл, с объемом питательной среды 50 мл, поверхностным способом при температуре 30 С, являющейся,оптимальной для раста штамма М-81. Посевным материалом служила 10-15-су- точная культура, вьфащенная на указанных агаризирсванных средах.

Молокосвертывающую активность культурального фильтрата определяли в 3-, 7-, 5-, 12-, 14-, 17-,22-, 30- и 70-суточном возрасте гриба. Для ;этого мицелий отделяли от питательной среды путем фильтрования через стеклянный фильтр (размер пор 16-40 мкм),, соединенный с колбой Бунзена. Полученный таким образом культуральный фильтрат использовали для обнаруже20

ния в нем молокосвертывающего фермен- 15 ная с 3-суточного возраста, продуци- та по методу, предложенному Каваи и Мукаи,

В 100 мл натурального молока вносили 1 мл 15%-ного раствора CaClj, , перемешивали на магнитной мешалке и доводили кислотность 10%- ной НС1 до рН 6,0. В пробирки вносили по 10 мл молока и помещали в водяную баню при . Через 2-3 мин в опытные пробирки вносили 1 мл культурального фильтрат а (КФ) или 1 мл 0,1%-ного раствора ферментного препарата, полученного из КФ путем осаждения белков сернокислым аммонием и других соответствующих процедур. В контрольные пробирки вносили 1 мл прокипяченного КФ или раствора фермента. Смесь в пробирках встряхивали и ставили на водяную баню при 35°С. О молокосвертьгоающей активности КФ судили по времени свертывания молока в минутах. Расчет МСА вели.гв условных единицах по формуле, предложенной Типограф Д.Я. и Петиной Т.А.

30

рует в среду молокосвертывающий фермент. Активность этого фермента постепенно увеличивается от 9 мин (-суточная культура) до 2,5 мин (j 12-15-суточном возрасте), когда отмечается наибольшая активность фермента, В 16-22-суточном возрасте створаживание молока осуществляются за 3 мин, а МСА культурального филь- 25 трата штамма в 30-суточном возрасте составляет 4 мин. Культура штамма и в 70-суточном возрасте обладает молокосвертывающей активностью, равной 21 мин.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что активность молокосвертывающего фермента остается высокой на протяжении месячного возраста культуры. Обнаруженное свойство может быть использовано при про- мьшшенном культивировании штамма М-81 с целью молокосвертывёю- щего фермента.

Активность ферментного препарата, полученного из КФ штамма 15-суточ- ного возраста, составляет 6orfee 1000000 ед/г.

35

40

40 2lOg; K П

.2il22lL

П-а

ед/мл.

ед/г.

Редактор Н. Горват

Составитель В. Голимбет

Техред Ж.Кастелевич Корректор С. Шекмар

Заказ 610/31Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

211288

где К

to

- коэффициент разведения КФ

или препарата фермента , П - время, в течение которого

из 100 мл молока при добав- f лении 1 мл КФ или 1 мл раствора фермента образуется плотный сгусток, мину 40 - среднее время свертывания молока при производстве сьфа, мин;

а - навеска ферментного препарата, г.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что штамм М-81, начи

ная с 3-суточного возраста, продуци-

рует в среду молокосвертывающий фермент. Активность этого фермента постепенно увеличивается от 9 мин (-суточная культура) до 2,5 мин (j 12-15-суточном возрасте), когда отмечается наибольшая активность фермента, В 16-22-суточном возрасте створаживание молока осуществляются за 3 мин, а МСА культурального филь- трата штамма в 30-суточном возрасте составляет 4 мин. Культура штамма и в 70-суточном возрасте обладает молокосвертывающей активностью, равной 21 мин.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что активность молокосвертывающего фермента остается высокой на протяжении месячного возраста культуры. Обнаруженное свойство может быть использовано при про- мьшшенном культивировании штамма М-81 с целью молокосвертывёю- щего фермента.

Активность ферментного препарата, полученного из КФ штамма 15-суточ- ного возраста, составляет 6orfee 1000000 ед/г.

Таким образом, предлагаемый штамм продуцирует молокосвертывающий фермент, активность которого в 2 раза выше, чем активность фермента, продуцируемого известным штаммом.

Подписное

Штамм Hirschioporus laricinus М-81 (Karst.) Ryv. (хранится в Центральном музее промьгатенных микроорганизмов ВНИИгенетика под номером ЦМПМ Б-263)-продуцент молокосверты- вающего фермента. О) с IN9 00 00