Способ дифференциальной диагностики детской шизофрении и детского аутизма по количеству копий генов, кодирующих рибосомную РНК, в геноме ребенка с психическими нарушениями Российский патент 2024 года по МПК G01N33/50 C12Q1/6804 

Настоящее изобретение относится к области медицинской генетики, молекулярной биологии, психиатрии, педиатрии и может быть использовано в детской психиатрии, а именно, для дифференциальной диагностики детской шизофрении и детского аутизма. Уровень техники

Согласно классификации МКБ-10 детский аутизм отнесен к рубрике «Общие расстройства психологического/психического развития F84.0», а шизофрения в детском возрасте - к рубрике «Другой тип шизофрении F20.8». Детский аутизм определяется по наличию следующих признаков: а) аномалий и задержек в развитии, проявляющихся у ребенка в возрасте до трех лет; б) психопатологических изменений во всех трех сферах: эквивалентных социальных взаимодействиях, функциях общения и поведения, которое ограничено, стереотипно и монотонно [МКБ-10, 1994]. Шизофрения у детей представляет собой «шизофрению, характеризующуюся своеобразием и полиморфизмом клинической картины с началом заболевания в детском возрасте» [МКБ-10,1994].

Дифференциальная диагностика детского аутизма и шизофрении, своевременная их диагностика представляют одну из важных проблем детской психиатрии [1-5]. До сих пор не решен вопрос, возможна ли дифференцировка детского аутизма и шизофрении в детском возрасте, учитывая скудность клинической картины, бурный рост и формирование нейронных связей у ребенка, трудности с оценкой психометрическими шкалами. Кроме того, дискуссии вызывают и сами нозологии: либо это единое заболевание, либо это два разных заболевания, либо это коморбидность двух состояний [3,4,6]. В последних работах было высказано предположение, что расстройства аутистического спектра (РАС) могут являться специфичным преморбидным фенотипом для шизофрении в детском возрасте [7]. Отсутствие единого мнения на процессы, происходящие при нарушении онтогенетического развития ребенка, также создают проблемы с классификацией и трудности с постановкой диагноза.

В настоящее время для постановки диагноза РАС, как правило, используется метод скрининга, в основе которого лежит анкетирование и наблюдение за ребенком. Предложены несколько подходов: обследование психического статуса аутизма согласно AMSE (Autism Mental Status Examination) [8], опрос родителей по SCQ (Social communication questionnaire) [9], оценка общих функций согласно C-GAS (Children's Global Assessment Scale) [10], оценка тяжести кататонии согласно BFCRS (Bush-Francis Catatonia Rating Scale) [11], оценка степени тяжести аутизма согласно CARS (The Childhood Autism Rating Scale) [12], анкета для родителей по выявлению нарушений психического (психологического) развития, риска возникновения расстройств аутистического спектра у детей раннего возраста (до 2 лет) [13]. Общим недостатком метода анкетирования является субъективная оценка, которая в значительной степени зависит от квалификации специалиста. Кроме того, тесты направлены на ранние выявления РАС, но не на дифференциальную диагностику детской шизофрении и РАС.

Остается открытым вопрос о привлечении биофизических и биохимических методов с целью ранней дополнительной диагностики. Примером биофизического метода выявления РАС является «Способ диагностики расстройств аутистического спектра (РАС) у детей, включающий определение нейрофизиологического маркера РАС, отличающийся тем, что в качестве нейрофизиологического маркера определяют усредненный уровень постоянных потенциалов (УПП) головного мозга» (патент RU 2687580 С1, опубликован 15.05.2019) [14]. Метод нейроэргометрии предназначен для определения уровня постоянных потенциалов (УПП), характеризующего интенсивность протекания обменных процессов головного мозга. Регистрацию УПП выполняют с помощью аппаратно-программного комплекса “Нейроэнергокартограф”. Результаты нейроэргометрии свидетельствуют о наличии особенностей энергообмена головного мозга ребенка, соответствующих РАС. Недостатком метода является отсутствие сравнительных характеристик УПП для мозга детей больных РАС и детской шизофренией. Кроме того, метод требует наличие достаточно дорогого оборудования.

Примером биохимического метода выявления шизофрении является «Способ диагностики шизофрении с использованием крови» (патент RU 2302002 С2, опубликован 20.11.2005) [15]. Способ включает определение в мононуклеарных клетках крови уровня экспрессии 152 генов с использованием разработанных авторами чипов. Метод позволяет диагностировать шизофрению, однако авторы не проводили сравнительное исследование профилей экспрессии генов при шизофрении и РАС. Вместе с тем, многие гены, например гены, вовлеченные в воспаление, могут отличаться повышенным уровнем экспрессии и при шизофрении, и при аутизме. Интерес представляет патент «Диагностика аутизма» (RU 2340900 С2, опубликован 10.12.2008). Авторы предлагают проводить анализ содержания в плазме крови больных нескольких пептидов методом масс-спектрометрии. Недостатком метода является малая выборка исследуемых больных, требование для анализа дорогого и сложного оборудования и отсутствие сравнительных данных о профиле экспрессии пептидов при РАС и шизофрении.

Таким образом, дифференциальная диагностика аутизма и детской шизофрении в настоящее время на практике осуществляется, в основном, методом анкетирования и наблюдения за ребенком. В литературе не встречается описания биохимических маркеров, которые могли бы подтверждать дифференциальный диагноз шизофрении или РАС, полученный на основе анкетирования. Вместе с тем, своевременная дифференциальная диагностика детского аутизма и шизофрении в детском возрасте с использованием биохимического маркера позволит выявлять болезнь на ранних этапах, снизить число «ошибочных» диагнозов и, как следствие, улучшить качество жизни пациента путем адекватной и последовательной терапии.

Предлагаемый метод предлагает биохимический маркер, позволяющий выявлять болезнь, прост в исполнении и не требует специального высокотехнологичного оборудования.

Раскрытие сущности изобретения

Отбор крови и выделение ДНК: венозную кровь отбирают в пробирки с гепарином; ДНК выделяют методом экстракции органическим растворителем; Раствор, содержащий 0,04 М ЭДТА, 2% натрий лаурил саркозилата и 150 мкг/мл РНКазы A (“Sigma”, США), добавляют к свежеотобранной крови на 45 минут при 37°С, обрабатывают протеиназой К (200 мкг/мл, “Promega”, США) в течение 24 часов при 37°С, экстрагируют равными объемами смеси фенол/хлороформ/изоамиловый спирт (25:24:1), фенола и смеси хлороформ/изоамиловый спирт (24:1). ДНК осаждают добавлением 1/10 объема 3 М ацетата натрия (рН 5,2) и 2,5 объемов ледяного этилового спирта. Фенол стабилизируют 8-гидроксихинолином. ДНКсобирают путем центрифугирования при 10 000 G в течение 15 минут при 4°С, промывают 70% этанолом (об./об.), высушивают и растворяют в воде.

Определение копийности рибосомных генов: содержание рибосомных повторов в геномной ДНК пациента определяют методом нерадиоактивной количественной гибридизации. Для выявления рДНК человека (образец “GenBank” №U13369) используют ДНК-зонд, который включает фрагмент рДНК длиной 5836 пар оснований (область от -515 до 5321 нуклеотида), клонированный в плазмиде pBR322. Денатурированную ДНК наносят на фильтр (Optitran BA-S85, “GE Healthcare”) в количестве 4-6 точек на каждый образец. Стандартные образцы геномной ДНК (50 нг/мл) с известным содержанием рДНК наносят на тот же самый фильтр, чтобы построить калибровочную кривую зависимости интенсивности сигнала от числа копий рДНК. ДНК фага лямбда (50 нг/мл) также наносят на тот же самый фильтр, чтобы контролировать уровень шума. Затем фильтр прогревают при 80°С в вакууме в течение 1,5 ч. После завершения гибридизации мембранный фильтр обрабатывают конъюгатом стрептавидин с щелочной фосфатазой (“Sigma”) и помещают в раствор субстратов для щелочной фосфатазы (BCIP/NBT). После этого фильтр промывают водой, высушивают в темноте и сканируют. Далее производят вычисление интегральной интенсивности сигнала от каждой точки (например, при помощи специально разработанной программы ”Imager 6”). Сигналы от всех точек, соответствующих одному и тому же образцу, суммируют и вычисляют среднее арифметическое и среднеквадратическую ошибку каждого образца, после чего по калибровочной зависимости рассчитывают число копий рДНК в ДНК.

Осуществление изобретения

В пилотном исследовании принимали участие 54 ребенка с диагнозом расстройства аутического спектра, 37 детей с диагнозом детская шизофрения и 32 здоровых ребенка. В исследовании принимали участие пациенты в возрасте 4-12 лет.

При анализе предполагаемых различий между выборками исходили из нуль-гипотезы об отсутствии различий, которую проверяли с помощью расчета U-критерия Манна-Уитни. Распределения числа копий в группах сравнивали с использование критерия Колмогорова-Смирнова (D и α) и Краскела-Уоллиса (Н и р). Различия считали достоверными при р<0,001. ROC (Receiver Operating Characteristic) кривые строили с использованием программы MedCalc (https://www.medcalc.org/manual/roc-curves.php). Каждая точка на кривой отражаетсоотношение между чувствительностью и специфичностью, которые соответствуют заданному порогу значений числа копий рДНК. Площадь под кривой (AUC) отражает различия между анализируемыми группами.

На фигуре 1 приводятся численные значения параметра «число копий рДНК» для каждого участника исследования в трех группах. В таблице 1 приводятся данные описательной статистики. Группы попарно сравнили с использованием теста Манна-Уитни. Число копий рДНК в ДНК клеток крови детей больных шизофренией было достоверно выше, чем число копий рДНК в образцах ДНК, выделенных их крови здоровых детей и детей, больных аутизмом. Число копий рДНК в геномах здоровых детей и детей больных аутизмом не различались.

На фигуре 2 приводится попарное сравнение распределений значений параметра в исследуемых группах методом Колмогорова- Смирнова и сравнение трех групп методом Краскела-Уоллиса. Распределение числа копий в группе SZ с вероятностью р<0,001 отличается от распределений в группах ЗК и А.

На фигуре 3 приводятся данные о частотах встречаемости в группах значений параметра выше медианных в группе SZ (536 копий). Согласно точному критерию Фишера, частота в группе SZ (49%) достоверно выше, чем в группе А (14%) и в группе контроля ЗК (3%). Частота встречаемости значений параметра ниже, чем медианные в группе А (393 копии) достоверно ниже в группе SZ (9%).

На фигуре 4 приводятся данные ROC анализа - соотношение между чувствительностью и специфичностью.

Таким образом, число копий рДНК в геномах детей с диагнозом шизофрения (F20.8), который поставлен на основании анкетирования и наблюдения за ребенком, достоверно выше, чем в геномах детей с диагнозом аутизм (F 84.0). Параметр может быть использован для уточнения диагноза

Пример 1.

Больной З в возрасте 2 года 11 мес.Родители обратились к детскому психиатру по поводу проблем с поведением и адаптацией ребенка в детском коллективе. При первом приеме был взят образец крови и определено число копий рДНК в геноме, которое составило 343 копии. Такое низкое содержание рДНК в геноме встречается в группе детей больных шизофренией только в 9% случаев, однако характерно для геномов здоровых детей и детей с диагнозом аутизм. Дальнейшие всесторонние исследования позволили врачу- психиатру поставить диагноз: детский аутизм, кататонический, психопатоподобный синдромы, когнитивный дизонтогенез (F84.02 по шкале МКБ-10). Более длительное наблюдение больного позволило подтвердить диагноз и исключить вариант детской шизофрении.

Пример 2.

Больной Ш. в возрасте 10 лет. Родители четырьмя годами ранее обратились к детскому психиатру по поводу нарастающих проблем с поведением и общением ребенка в семье. Вначале был поставлен диагноз аутизма (F84.02 по шкале МКБ-10). При приеме был взят образец крови и определено число копий рДНК в геноме, которое составило 665 копий. Такие большие значения встречаются в выборке больных аутизмом только в 1,8% случаев. Дальнейшее наблюдение больного, появление новых симптомов и всесторонние исследования в ходе госпитализации позволили врачу- психиатру уточнить диагноз: шизофрения, детский тип, кататонический, психопатоподобный синдромы, когнитивный дефект (F20.8063 по шкале МКБ-10).

Краткое описание чертежей

Фигура 1. Число копий рДНК в геномах исследуемых групп.

Фигура 2. Кумулятивные распределения по числу копий рДНК, построенные для исследуемых групп детей. В рамках приводятся данные сравнения распределений методами непараметрической статистики.

Фигура 3. Частоты встречаемости в группах образцов ДНК с содержание 536 копий на геном (медианное значение для группы больных шизофренией). Приводятся данные сравнения частот с использованием точного критерия Фишера.

Фигура 4. ROC-кривые, построенные для групп больных детей по сравнению с группой контроля.

Список литературы

1. Соколова Н.Н., Тарханов B.C., Денисова Е.А., др. К вопросу дифференциальной диагностики детского аутизма и детской шизофрении (клинико-психологическая оценка случая) // Педиатр. 2018. Т. 9. №5. С. 125-130. doi: 10.17816/PED95125-130).

2. Макаров И.В. Психиатрия детского возраста. Санкт-Петербург, из-во Наука и Техника, 2019, ISBN: 978-5-94387-773-5.

3. Fernandez A, Pasquet-Levy М, Laure G, Thummler S, Askenazy F. Atteintes Neurodeveloppementales, Comorbidites Psychiatriques Et Pathologies Associees Chez Des Patients Atteints de Schizophrenie Tres Precoce Avec Symptomes Autistiques Premorbides [Neurodevelopmental Disorders, Psychiatric Comorbidities and Associated Pathologies in Patients with Childhood-Onset Schizophrenia and Premorbid Autistic Symptoms.]. Can] Psychiatry. 2021 Dec;66(12):1042-1050. French, doi: 10.1177/0706743721990822.

4. Unenge Hallerback M, Lugnegard T, Gillberg C. Is autism spectrum disorder common in schizophrenia? Psychiatry Res. 2012 Jun 30;198(l):12-7. doi: 10.1016/j.psychres.2012.01.016.

5. Cochran DM, Dvir Y, Frazier JA. “Autism-plus” spectrum disorders: intersection with psychosis and the schizophrenia spectrum. Child Adolesc Psychiatr Clin N Am. 2013 Oct;22(4):609-27. doi: 10.1016/j.chc.2013.04.005.

6. Volkmar FR, Jackson SLJ, Hart L. Transition Issues and Challenges for Youth with Autism Spectrum Disorders. Pediatr Ann. 2017 Jun I;46(6):e219-e223. doi: 10.3928/19382359-20170519-03.

7. Driver DI, Thomas S, Gogtay N, Rapoport JL. Childhood-Onset Schizophrenia and Early-onset Schizophrenia Spectrum Disorders: An Update. Child Adolesc Psychiatr Clin N Am. 2020 Jan;29(l):71-90. doi: 10.1016/j.chc. 2019.08.017.

8. Grodberg D, Weinger PM, Halpern D, Parides M, Kolevzon A, Buxbaum JD. The autism mental status exam: sensitivity and specificity using DSM-5 criteria for autismspectrum disorder in verbally fluent adults. J Autism Dev Disord. 2014 Mar;44(3]:609-14. doi: 10.1007/S10803-013-1917-5. PM1D: 23989909; PMCID: PMC5510161.

9. Rutter M, Bailey A., Lord C. Social communication questionnaire (SCQ). Los Angeles, CA: Western Psychological Services, 2003.

10. Shaffer D, Gould MS, Brasic J, Ambrosini P, Fisher P, Bird H, Aluwahlia S. A children's global assessment scale (CGAS). Arch Gen Psychiatry. 1983 Nov;40(ll):1228-31. doi: 10.1001/archpsyc.l983.01790100074010.

11. Carroll ВТ, Kirkhart R, Ahuja N, Soovere I, Lauterbach EC, Dhossche D, Talbert R. Katatonia: a new conceptual understanding of catatonia and a new rating scale. Psychiatry (Edgmont). 2008 Dec;5(12):42-50. PMID: 19724775; PMCID: PMC2729619.

12. Schopler, E., Reichler, R.)., & Renner, B. R. (1988). The Childhood Autism Rating Scale. Los Angeles, CA: Western Psychological Services.

13. Симашкова HB, Иванов MB, Макушкин ЕВ, Шарлай ИА, Клюшник ТП, Козловская ГВ. Скрининг риска возникновения нарушений психического развития у детей раннего возраста (данные по 9 регионам России в 2017-2019 гг.). Журнал неврологии и психиатрии им. С.С.Корсакова. 2020; 120(11):79-86. https://doi.org/10.17116/jnevro202012011179.

14. Рожнова Т.М., Рожнова Т.С. Способ диагностики расстройств аутистического спектра. Патент RU 2687580 С1, опубликован 15.05.2019.

15. Нава Хироюки, Сомейа Тосиюки, Муратаке Тацуюки, Кавамура Меико. Способ диагностики шизофрении с использованием крови. Патент RU 2302002 С2, опубликован 20.11.2005.

16. Момени Нагхи, Грубб Андерс.Патент «Диагностика аутизма» RU 2340900 С2, опубликован 10.12.2008.

17. Opler LA, Kay SR, Lindenmayer JP, Fiszbein A. Structured Clinical Interview Positive and Negative Syndrome Scale (SCI-PANSS). Multi-Health Systems Inc. 1999, №4: 15 p.

18. Bush G, Fink M, Petrides G, Dowling F, Francis A. Catatonia. I. Rating scale and standardized examination. Acta Psychiatr Scand. 1996 Feb;93(2):129-36. doi: 10.1111/j, 1600-0447.1996.tb09814.x. PMID: 8686483.

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской генетике, молекулярной биологии, психиатрии и педиатрии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики детской шизофрении и аутизма у детей с психическим расстройством. Определяют копийность рибосомной ДНК (рДНК) в геноме ребенка методом нерадиоактивной количественной гибридизации ДНК, выделенной из клеток крови. При определении более чем 536 копий на диплоидный геном диагностируют наличие у ребенка детской шизофрении. При определении менее чем 393 копий на диплоидный геном диагностируют наличие у ребенка детского аутизма. Способ обеспечивает простую в исполнении и не требующую специального высокотехнологичного оборудования дифференциальную диагностику шизофрении и аутизма у детей с психическим расстройством за счет определения количества копий рДНК на диплоидный геном. 4 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ дифференциальной диагностики детской шизофрении и аутизма у детей с психическим расстройством, отличающийся тем, что определяют копийность рибосомной ДНК (рДНК) в геноме ребенка методом нерадиоактивной количественной гибридизации ДНК, выделенной из клеток крови, и при определении более чем 536 копий на диплоидный геном диагностируют наличие у ребенка детской шизофрении, а при определении менее чем 393 копий на диплоидный геном диагностируют наличие у ребенка детского аутизма.