ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА Российский патент 2024 года по МПК A61K38/08 A61P25/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к пептидной композиции для профилактики или лечения деменции Альцгеймера.

По данной заявке испрашивается приоритет и преимущество по заявке на патент Кореи № 10-2020-0108861, поданной в Ведомство интеллектуальной собственности Кореи 27 августа 2020 г., и все содержание, раскрытое в описании и чертежах этой заявки, включено в эту заявку.

Предшествующий уровень техники

Деменция является патологическим явлением, которое следует отличать от нормального старения, и классифицируется как деменция Альцгеймера, сосудистая деменция и другие типы деменции, вызванные алкоголизмом, травмой или последствиями болезни Паркинсона в зависимости от ее причины.

Среди них патогенез деменции Альцгеймера точно не известен, но в качестве важной причины была предложена токсичность бета-амилоида, который является нейротоксическим белком. Известно, что это вещество образуется в результате неправильного метаболизма белка-предшественника амилоида (АРР), и, как сообщается, нормальный метаболит АРР оказывает нейропротекторное действие. Недавние исследования с использованием генной инженерии выявили, что в клетках и сосудах накапливаются токсичные белки, такие как β-амилоид, который токсичен для нервных клеток, в результате чего нарушается работа головного мозга.

Хотя количество больных деменцией Альцгеймера значительно увеличивается в связи со старением населения и заболевание стремительно превращается в социальную проблему, требующую решения, почти не существует пищевого сырья или лекарственных средств, способных эффективно предотвращать или лечить заболевание. Деменция - это неврологическое заболевание, которым страдает 10% или более пожилых людей в возрасте 65 лет и старше, 50% или более деменции приходится на деменцию Альцгеймера, а в 2017 году доля пожилого населения превысила 7 миллионов человек, что составляет 14% от общей численности населения и, как ожидается, быстро увеличится до 41,0% в 2060 году. Кроме того, число пациентов с деменцией достигло 724 000 по состоянию на 2017 год и, как ожидается, увеличится до 1,68 миллиона к 2040 году и составит 2,127 миллиона или более в 2050 году по мере старения населения.

Однако современные терапевтические способы для деменции являются мерами не для устранения основной причины, а просто для облегчения симптомов, и существует потребность в разработке вещества для супрессии, отсрочки или лечения начала деменции.

Описание

Техническая задача

В результате исследований по разработке средств для профилактики или лечения деменции Альцгеймера авторы настоящего изобретения разработали пептид, который проявляет такие эффекты, как супрессия опосредованного липополисахаридами (ЛПС) продуцирования цитокинов, супрессия нейровоспаления, нормализация когнитивных нарушений, супрессия бета-амилоида или тау-белка и супрессия гибели нейронов, что лежит в основе настоящего изобретения.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является создание пептидной композиции для профилактики, лечения или облегчения деменции Альцгеймера.

Однако технические проблемы, которые призвано решить настоящее изобретение, не ограничиваются техническими проблемами, которые были упомянуты выше, и другие технические проблемы, которые не были упомянуты, будут ясно поняты специалистом в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, из следующего описания.

Техническое решение

Для решения вышеуказанной задачи настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения деменции Альцгеймера, включающую полипептид, представленный следующей общей формулой последовательности или его солью, в качестве активного ингредиента:

[Общая формула]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

В общей формуле

n равно 0 или 1;

L представляет собой лейцин;

V представляет собой валин;

R представляет собой аргинин;

X1 представляет собой лизин (К) или аргинин (R);

X2 представляет собой глицин (G) или аргинин (R);

X3 представляет собой глутаминовую кислоту (Е) или лизин (К);

X4 представляет собой аланин (А) или лейцин (L);

X5 представляет собой лизин (К), аргинин (R) или лейцин (L);

X6 представляет собой тирозин (Y), аланин (A), триптофан (W), лизин (K) или аспарагиновую кислоту (D); и

X7 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или аргинин (R),

при условии, что из общей формулы исключен полипептид, представленный последовательностью K-L-G-V-E-A-K-R-Y-L-D.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается пищевая композиция для профилактики или облегчения деменции Альцгеймера, включающая полипептид, представленный следующей общей формулой последовательности или его солью, в качестве активного ингредиента:

Общая формула

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

В общей формуле

n равно 0 или 1;

L представляет собой лейцин;

V представляет собой валин;

R представляет собой аргинин;

X1 представляет собой лизин (К) или аргинин (R);

X2 представляет собой глицин (G) или аргинин (R);

X3 представляет собой глутаминовую кислоту (Е) или лизин (К);

X4 представляет собой аланин (А) или лейцин (L);

X5 представляет собой лизин (К), аргинин (R) или лейцин (L);

X6 представляет собой тирозин (Y), аланин (A), триптофан (W), лизин (K) или аспарагиновую кислоту (D); и

X7 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или аргинин (R),

при условии, что из общей формулы исключен полипептид, представленный последовательностью K-L-G-V-E-A-K-R-Y-L-D.

В качестве примерного воплощения настоящего изобретения пищевая композиция может представлять собой функциональную пищевую композицию для здоровья, без ограничения указанным.

В качестве примера воплощения настоящего изобретения полипептид может представлять собой полипептид, состоящий из следующих аминокислот, без ограничения указанным:

в общей формуле,

n равно 0.

X1 представляет собой лизин (К);

X2 представляет собой аргинин (R);

X3 представляет собой лизин (К);

X4 представляет собой лейцин (L);

X5 представляет собой аргинин (R);

X6 представляет собой тирозин (Y), и

X7 представляет собой аргинин (R).

В качестве другого иллюстративного воплощения настоящего изобретения полипептид может представлять собой пептидомиметик, включая пептоид, или L-форму, D-форму или содержать не встречающуюся в природе аминокислоту, без ограничения указанным.

В качестве еще одного иллюстративного воплощения настоящего изобретения конец полипептида может быть алкилирован, ПЭГилирован или амидирован, без ограничения указанным.

В качестве еще одного иллюстративного воплощения настоящего изобретения полипептид может иметь аминогруппу (NH2), добавленную к С-концу, без ограничения указанным.

В качестве еще одного иллюстративного воплощения настоящего изобретения заменяющая соль полипептида может представлять собой ацетатную соль, без ограничения указанным.

В качестве еще одного иллюстративного воплощения настоящего изобретения полипептид или заменяющая его соль могут обладать одним или несколькими свойствами из приведенных ниже, без ограничения указанным:

супрессия липополисахарид (ЛПС)-опосредованного продуцирования цитокинов;

супрессию нейровоспаления;

нормализация когнитивных нарушений;

супрессия агрегации бета-амилоида или тау-белка; и

супрессия гибели нейронов.

В качестве еще одного иллюстративного воплощения настоящего изобретения полипептид или заменяющая его соль могут проходить через гематоэнцефалический барьер, без ограничения указанным.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ профилактики или лечения деменции Альцгеймера, включающий введение нуждающемуся субъекту композиции, включающей полипептид или заменяющую его соль в качестве активного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению композиции, включающей полипептид или его соль, в качестве активного ингредиента для профилактики или лечения деменции Альцгеймера.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению полипептида или его соли для получения лекарственного средства для лечения деменции Альцгеймера.

Преимущественные эффекты

Пептид или его соль по настоящему изобретению проявляет такие эффекты, как супрессия ЛПС-опосредованного продуцирования цитокинов, супрессия ЛПС-индуцированного нейровоспаления, нормализация когнитивных нарушений, супрессия агрегации бета-амилоида или тау-белка и супрессия гибели нейронов. Полипептид или его соль могут проходить через гематоэнцефалический барьер, и, таким образом, ожидается, что они будут эффективно использоваться для профилактики или лечения деменции Альцгеймера.

Описание рисунков

Фиг. 1A представляет собой набор изображений, иллюстрирующих результаты подтверждения области ЛПС (+) в полушариях головного мозга мышей с деменцией Альцгеймера, в соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения с помощью иммуногистохимического окрашивания.

Фиг. 1B представляет собой изображение, иллюстрирующее результаты подтверждения экспрессии ЛПС во вторичной моторной коре (M2) головного мозга мыши с деменцией Альцгеймера, в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения с помощью иммуногистохимического окрашивания.

Фиг. 1C представляет собой изображение, иллюстрирующее результаты подтверждения экспрессии ЛПС в гиппокампе мыши с деменцией Альцгеймера, в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения с помощью иммуногистохимического окрашивания.

Фиг. 2 представляет собой изображение, подтверждающее уровни ЛПС в образцах крови и спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов с деменцией Альцгеймера, по клинической стадии в соответствии с примерным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 3 представляет собой изображение, подтверждающее экспрессию мРНК IL-1β и TNF-α при введении пептида DD-S052 в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 4А представляет собой изображение, иллюстрирующее экспериментальный процесс подтверждения действия пептида DD-S052 на индуцированное ЛПС нейровоспаление в головном мозге мышей дикого типа в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 4B представляет собой изображение, иллюстрирующее результаты проведения иммуногистохимического окрашивания Iba-1 для подтверждения наличия микроглии в гиппокампе мыши дикого типа в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 4C представляет собой изображение, иллюстрирующее количественную оценку Iba-1-положительных клеток в гиппокампе мышей дикого типа в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 4D представляет собой изображение, иллюстрирующее результаты иммуногистохимического окрашивания Iba-1 для подтверждения наличия микроглии в компактном слое черной субстанции мозга мышей дикого типа в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 5А представляет собой изображение, иллюстрирующее экспериментальный процесс подтверждения действия пептида DD-S052 на ЛПС-индуцированное нейровоспаление в головном мозге мышей с деменцией Альцгеймера в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 5B представляет собой изображение, иллюстрирующее результаты иммуногистохимического окрашивания Iba-1 для подтверждения наличия микроглии в головном мозге мышей с деменцией Альцгеймера, согласно примерному воплощению настоящего изобретения.

Фиг. 6A представляет собой изображение, иллюстрирующее экспериментальный процесс подтверждения влияния пептида DD-S052 на когнитивные нарушения и патологию, связанные с деменцией Альцгеймера, у мышей с деменцией Альцгеймера, в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 6B представляет собой набор изображений, подтверждающих спонтанное чередование (слева) и общее количество заходов в рукава (справа) при введении пептида DD-S052 мышам с деменцией Альцгеймера, в соответствии с типичным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 6C представляет собой набор изображений, подтверждающих эффект супрессии накопления бета-амилоида, путем введения пептида DD-S052 мышам с деменцией Альцгеймера, в соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 6D представляет собой набор изображений, подтверждающих эффект супрессии микроглиоза путем введения пептида DD-S052 мышам с деменцией Альцгеймера, в соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 6E представляет собой набор изображений, подтверждающих эффект супрессии гибели нейронов путем введения пептида DD-S052 мышам с деменцией Альцгеймера, в соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 7 представляет собой набор изображений, подтверждающих эффект супрессии агрегации тау-белка введением DD-S052 и ПЭГилированного пептида DD-S052 мышам с деменцией Альцгеймера, в соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения.

Фиг. 8A представляет собой изображение, иллюстрирующее результаты анализа пептида DD-S052 согласно иллюстративному воплощению настоящего изобретения с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии.

Фиг. 8B представляет собой набор изображений, иллюстрирующих результаты анализа теста на проницаемость искусственной мембраны с использованием пептида DD-S052 согласно воплощению настоящего изобретения с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии.

Фиг. 8C представляет собой изображение, иллюстрирующее степень проникновения DD-S052 через сосудисто-мозговой барьер в соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения.

Способы осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения деменции Альцгеймера, включающей полипептид, представленный следующей общей формулой последовательности или его солью, в качестве активного ингредиента:

Общая формула

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7

В общей формуле

n равно 0 или 1;

L представляет собой лейцин;

V представляет собой валин;

R представляет собой аргинин;

X1 представляет собой лизин (К) или аргинин (R);

X2 представляет собой глицин (G) или аргинин (R);

X3 представляет собой глутаминовую кислоту (Е) или лизин (К);

X4 представляет собой аланин (А) или лейцин (L);

X5 представляет собой лизин (К), аргинин (R) или лейцин (L);

X6 представляет собой тирозин (Y), аланин (A), триптофан (W), лизин (K) или аспарагиновую кислоту (D); и

X7 представляет собой аспарагиновую кислоту (D) или аргинин (R),

при условии, что из общей формулы исключен полипептид, представленный последовательностью K-L-G-V-E-A-K-R-Y-L-D.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает пищевую композицию для профилактики или облегчения деменции Альцгеймера, включающую полипептид, представленный вышеуказанной общей формулой последовательности или его солью, в качестве активного ингредиента.

Кроме того, в настоящем изобретении предлагается способ профилактики или лечения деменции Альцгеймера, включающий введение нуждающемуся субъекту композиции, включающей полипептид или его соль, в качестве активного ингредиента.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению композиции, включающей полипептид или его соль, в качестве активного ингредиента для профилактики или лечения деменции Альцгеймера.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению полипептида или его соли для получения лекарственного средства для лечения деменции Альцгеймера.

Согласно иллюстративному воплощению настоящего изобретения полипептид может быть представлен полипептидом, состоящим из следующих аминокислот, без ограничения указанным.

в общей формуле,

n равно 0.

X1 представляет собой лизин (К);

X2 представляет собой аргинин (R);

X3 представляет собой лизин (К);

X4 представляет собой лейцин (L);

X5 представляет собой аргинин (R);

X6 представляет собой тирозин (Y), и

X7 представляет собой аргинин (R).

Используемый в настоящем описании термин «полипептид» относится к линейной молекуле, образованной путем связывания аминокислотных остатков друг с другом пептидными связями. Полипептид по настоящему изобретению может быть получен методом химического синтеза, известным в данной области (например, методом твердофазного синтеза), наряду с методами молекулярной биологии (Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).

Кроме того, полипептид по настоящему изобретению может включать биологически функциональные эквиваленты с вариациями аминокислотной последовательности, которые проявляют биологическую активность, эквивалентную полипептиду по настоящему изобретению. Такие вариации аминокислотной последовательности могут быть основаны на относительном сходстве заместителей боковой цепи аминокислот с точки зрения таких свойств, как гидрофобность, гидрофильность, заряд и размер. Анализ размера, формы и типа заместителя боковой цепи аминокислоты показал, что аргинин, лизин и гистидин являются положительно заряженными остатками; аланин, глицин и серин имеют близкие размеры; а фенилаланин, триптофан и тирозин имеют сходную форму. Поэтому, исходя из этих соображений, можно сказать, что аргинин, лизин и гистидин; аланин, глицин и серин; фенилаланин, триптофан и тирозин являются биологически функциональными эквивалентами.

При введении вариации можно учитывать индекс гидрофобности аминокислоты. Каждой аминокислоте присваивается индекс гидрофобности в соответствии с ее гидрофобностью и зарядом. Кроме того, также известно, что замены между аминокислотами с аналогичными значениями гидрофильности приводят к получению пептидов с эквивалентной биологической активностью.

Замены аминокислот в пептидах, которые полностью не изменяют активность молекулы, известны в данной области (H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Наиболее типичны замены между аминокислотными остатками Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu и Asp/Gly.

Принимая во внимание вариации, обладающие описанной выше биологически эквивалентной активностью, полипептид по настоящему изобретению также интерпретируется как включающий последовательность, обладающую существенной идентичностью. Вышеуказанная существенная идентичность может относиться к случайной последовательности, отличающейся от последовательности по настоящему изобретению и имеющей по меньшей мере 80 % гомологии, 90 % гомологии или 95 % гомологии с последовательностью по настоящему изобретению, когда данная последовательность выровнена таким образом, чтобы соответствовать последовательности по настоящему изобретению в максимально возможной степени, и выровненные последовательности анализируются с использованием алгоритма, обычно используемого в данной области. Способы выравнивания для сравнения последовательностей известны в данной области (Huang et al., Comp. Appl. BioSci. 8:155-65(1992); Pearson et al., Meth. Mol. Biol. 24:307-31(1994)).

В качестве иллюстративного воплощения настоящего изобретения полипептид может представлять собой пептидомиметик, включая пептоид, или L-форму, D-форму или содержать не встречающуюся в природе аминокислоту.

Полипептид D-формы относится к полипептиду алломерного типа в виде энантиомера, имеющего ту же аминокислотную последовательность, что и полипептид L-формы.

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения полипептид, представленный общей формулой последовательности согласно настоящему изобретению, может иметь аминогруппу (NH2), добавленную к С-концу, без ограничения указанным.

Добавление аминогруппы (NH2) к С-концу полипептида может осуществляться различными способами, известными в данной области.

Кроме того, соль полипептида (или заменяющая его соль) может быть включена в объем настоящего изобретения применительно к полипептиду.

Соль включает, например, кислотно-аддитивные соли, образованные свободными кислотами, и фармацевтически приемлемые соли металлов.

Примеры подходящей кислоты включают соляную кислоту, бромную кислоту, серную кислоту, азотную кислоту, хлорную кислоту, фумаровую кислоту, малеиновую кислоту, фосфорную кислоту, гликолевую кислоту, молочную кислоту, салициловую кислоту, янтарную кислоту, толуол-п-сульфоновую кислоту, винную кислоту, уксусную кислоту, лимонную кислоту, метансульфоновую кислоту, муравьиную кислоту, бензойную кислоту, малоновую кислоту, глюконовую кислоту, нафталин-2-сульфоновую кислоту, бензолсульфоновую кислоту и т.п. Кислотно-аддитивная соль может быть получена обычным способом, например, растворением соединения в избыточном количестве водного раствора кислоты и осаждением соли с использованием смешивающегося с водой органического растворителя, такого как метанол, этанол, ацетон или ацетонитрил. Кроме того, кислотно-аддитивная соль может быть получена путем нагревания эквимолярного количества соединения и кислоты или спирта в воде с последующим выпариванием смеси для высушивания смеси или фильтрованием с отсасыванием осажденной соли.

Соль, полученная из подходящего основания, может включать щелочной металл, такой как натрий и калий, щелочноземельный металл, такой как магний, аммоний и т.п., без ограничения указанным. Соль щелочного или щелочноземельного металла может быть получена, например, растворением соединения в избыточном количестве раствора гидроксида щелочного или щелочноземельного металла, фильтрованием нерастворимой соли соединения, выпариванием фильтрата и сушкой полученного продукта. В этом случае с фармацевтической точки зрения особенно целесообразно приготовить соль натрия, калия или кальция в качестве соли металла, и соответствующую соль серебра можно также получить путем взаимодействия соли щелочного металла или щелочноземельного металла с подходящей солью серебра (например, нитратом серебра).

В качестве солей вышеописанного полипептида в настоящем изобретении предлагаются ацетатные соли полипептида.

Более конкретно, предлагается ацетатная соль вместо соли трифторуксусной кислоты (ТФК) полипептида по настоящему изобретению.

В соответствии с иллюстративным воплощением настоящего изобретения пептид (KLRVKLRRYLR-NH2 (AcOH), SEQ ID NO: 1, далее обозначаемый DD-S052) по настоящему изобретению предлагается в виде полипептида алломерного типа, имеющего ту же аминокислотную последовательность в виде FP13-NH2 (SEQ ID NO: 5), сконструированную на основе модели связывания FP3 и ЛПС для усиления взаимодействия с ЛПС в последовательности остатков FP3 (SEQ ID NO: 4) с точечной мутацией в FP1 (SEQ ID NO: 3), а в пептиде DD-S052 по настоящему изобретению (AcOH) означает, что трифторуксусная кислота (ТФК) на конце девятой аминокислоты от N-конца пептида была заменена ацетатной солью (см. Пример 2) .

В настоящем изобретении конец полипептида, представленного общей формулой последовательности по настоящему изобретению, может быть алкилирован, ПЭГилирован или амидирован, без ограничения указанным.

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения DD-S052P (SEQ ID NO: 2) получают путем ПЭГилирования N-конца DD-S052 (SEQ ID NO: 1) в полипептиде по изобретению. Без ограничения указанным, полипептид по настоящему изобретению может быть подвергнут реакции с Fmoc-NH-PEG2-CH2COOH для ПЭГилирования, и в этом случае полиэтиленгликоль имеет молекулярную массу (Mw) 385,4 Да.

Специалисты в данной области могут подобрать условия для ПЭГилирования в соответствии с выбранным полипептидом, и способ ПЭГилирования может соответствовать различным методам, известным в данной области.

Для алкилирования или амидирования специалисты в данной области могут также регулировать условия алкилирования или амидирования в соответствии с выбранным полипептидом, и способ алкилирования или амидирования может следовать различным способам, известным в данной области.

Как описано выше, в настоящем изобретении предлагаются: полипептид, представленный общей формулой последовательности; полипептид, который представляет собой L-форму, D-форму, пептидомиметик, включая пептоид, или содержит неприродную аминокислоту; ацетатная соль полипептида, имеющего аминогруппу (NH2), присоединенную к С-концу; или полипептид, конец которого алкилирован, ПЭГилирован или амидирован.

В настоящем изобретении полипептид или его соль могут обладать одним или несколькими следующими свойствами, без ограничения указанным:

супрессия липополисахарид (ЛПС)-опосредованного продуцирования цитокинов;

супрессия нейровоспаления;

нормализация когнитивных нарушений;

супрессия агрегации бета-амилоида или тау-белка; и

супрессия гибели нейронов.

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения было подтверждено, что количество липополисахаридных (ЛПС)-положительных клеток с возрастом увеличивается в головном мозге модельных мышей с деменцией Альцгеймера, и было подтверждено, что ЛПС экспрессируется в микроглии мышей в возрасте 3 и 5,5 месяцев и в нейронах у мышей в возрасте 11 месяцев. Кроме того, было подтверждено, что ЛПС (+) клетки обильно экспрессируются во вторичной моторной коре головного мозга и в основном распределяются в полиморфном слое зубчатой извилины в гиппокампе (см. Пример 1).

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения в результате подтверждения уровней ЛПС в образцах крови и спинномозговой жидкости (СМЖ) пациентов с деменцией Альцгеймера на клинической стадии было установлено, что более высокий уровень ЛПС измеряется по мере прогрессирования деменции Альцгеймера (см. пример 2).

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения были подтверждены следующие свойства полипептида по изобретению, но без ограничения этими свойствами.

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения было показано, что полипептид по настоящему изобретению супрессирует экспрессию мРНК цитокинов IL-1β и TNF-α, индуцированную липополисахаридом (ЛПС) (см. Пример 4).

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения с помощью иммуногистохимического метода было подтверждено, что полипептид по настоящему изобретению супрессирует индуцированный ЛПС микроглиоз в гиппокампе и компактном слое черной субстанции головного мозга мышей дикого типа, тем самым проявляя ингибирующее действие на нейровоспаление (см. пример 5).

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения с помощью иммуногистохимического метода было подтверждено, что полипептид по настоящему изобретению проявляет ингибирующее действие на нейровоспаление, индуцированное ЛПС, в головном мозге мышей с деменцией Альцгеймера (см. пример 6).

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения иммунофлуоресцентным окрашиванием клеток было подтверждено, что полипептид по настоящему изобретению нормализует когнитивные нарушения и супрессирует связанные с болезнью Альцгеймера патологии, такие как накопление бета-амилоида, микроглиоз и потеря нейронов (см. пример 7).

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения было подтверждено, что полипептид и ПЭГилированный полипептид по настоящему изобретению проявляют эффекты супрессии агрегации тау-белка (см. пример 8).

В иллюстративном воплощении настоящего изобретения было подтверждено, что полипептид по настоящему изобретению проникает через гематоэнцефалический барьер и проницаемость в это время соответствует среднему значению (см. пример 9).

В настоящем изобретении «деменция Альцгеймера» представляет собой дегенеративное заболевание головного мозга, характеризующееся постепенной потерей памяти и когнитивными нарушениями, главным образом, у пожилых людей в возрасте 65 лет и старше. На патологическом уровне типичной этиологией считается переплетение отложений бета-амилоидных белков и тау-белков нервных волокон. Деменция при болезни Альцгеймера часто сопровождается психоповеденческими симптомами, такими как изменения личности, ажитация, депрессия, бред, галлюцинации, повышенная агрессия и нарушения сна, а также снижением когнитивных функций при прогрессировании болезни, а в конце деменции Альцгеймера неврологическими расстройствами, такими как ригидность и нарушения походки, а также появляются физические осложнения, такие как недержание кишечника и мочевого пузыря, инфекции и пролежни. Когда мозговую ткань пациентов с деменцией Альцгеймера исследуют под микроскопом, наблюдаются характерные поражения, такие как нейритные бляшки и нейрофибриллярные клубки, а при визуальном наблюдении обнаруживается общая атрофия головного мозга из-за потери нейронов. Такие патологические изменения головного мозга в основном ограничиваются гиппокампом и энторинальной корой, которые являются основными областями мозга, ответственными за память, на ранней стадии заболевания, но постепенно распространяются на весь мозг через теменную долю, лобную долю и т.п. В соответствии с прогрессированием вовлеченных церебральных патологических участков потеря памяти в основном проявляется на ранней стадии, а по мере прогрессирования деменции Альцгеймера клинические симптомы изменяются и становятся более тяжелыми, демонстрируя постепенное течение.

Используемый в данном описании термин «микроглия» относится к клеткам, которые выполняют первичные иммунные функции в центральной нервной системе, и несмотря на то, что токсины, введенные извне или образующиеся внутри, могут обнаруживаться при сохранении микроглией формы удлиненных ветвей и тонких клеточных тел, микроглия трансформируется в активированную форму с толстыми и короткими ветвями и толстыми клеточными телами для защиты нервных клеток от этих токсинов. В отличие от микроглии в нормальном состоянии, активированная микроглия активирует фагоцитоз, пролиферирует клетки и вырабатывает медиаторы воспаления путем экспрессии генов, например, цитокиновых, таких как TNF-α, IL-1β и IL-6, хемокины, индуцируемая синтаза оксида азота (iNOS) и циклооксигеназа-2 (COX-2). Хотя активация микроглии, с одной стороны, удаляет поврежденные клетки и защищает нервные клетки от вторжения бактерий и вирусов извне, с другой стороны, при этом действуют оксид азота, продуцируемый iNOS, и простагландины, продуцируемые COX-2, TNF-α, и т.п., которые проявляют токсичность для нервных клеток, поэтому активация микроглии усугубляет повреждение нервных клеток.

В настоящем изобретении «нейровоспаление» включает широкий спектр сложных клеточных реакций, включающих активацию микроглии и астроцитов, а также цитокинов, хемокинов, белков комплемента, белков острой фазы, окислительного повреждения и родственных молекулярных процессов, и эти события могут неблагоприятно влиять на нейрональную функцию, вызывая повреждение нейронов, дополнительную активацию глии и, в конечном счете, нейродегенерацию.

Согласно настоящему изобретению, «липополисахарид (ЛПС)» состоит из липида А, основного полисахарида, О-специфической боковой цепи полисахарида. Липополисахарид термически стабилен и проявляет сильную антигенность. Липополисахарид образует множество комплексов с основной единицей молекулярной массы 10 кДа, различающихся по размеру до 10 000 кДа, и с точки зрения химии является амфифильным комплексом. Липополисахарид вызывает воспалительные реакции у животных и в основном находится во внешней мембране грамотрицательных бактерий, таких как Salmonella и E. coli. Среди липополисахаридов токсичной частью, вызывающей воспалительные реакции, является липидная часть, называемая эндотоксином. При попадании таких эндотоксинов в организм человека появляются лихорадка, изменение количества лейкоцитов, коагуляция сосудов, некроз опухоли, гипотензия, шок и т.п., а кроме того, эндотоксин вызывает выработку различных цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8 и TNF, активацию комплемента иммунной системы, активацию свертывания крови и т.п., и действует как митоген для В-клеток, повышая поликлональную дифференцировку и пролиферацию В-клеток, а также выработку антител IgM и IgG.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно включать соответствующий носитель, эксципиент и разбавитель, которые обычно используются для приготовления фармацевтической композиции. Эксципиент может быть, например, одним или несколькими, выбранными из группы, состоящей из разбавителя, связующего вещества, разрыхлителя, лубриканта, адсорбента, увлажнителя, материала пленочного покрытия и добавки с контролируемым высвобождением.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может быть использована в форме препарата для наружного применения, такого как порошок, гранулы, гранулы с замедленным высвобождением, энтеросолюбильной гранулы, жидкости, коллириума, эликсира, эмульсии, суспензии, эссенции, пастилки, ароматизированной воды, лимонада, таблетки, таблетки пролонгированного действия, таблетки кишечнорастворимой, таблетки подъязычной, капсулы твердой, капсулы мягкой, капсулы пролонгированного действия, капсулы кишечнорастворимой, пилюли, настойки, густого экстракта, сухого экстракта, жидкого экстракта, инъекции, капсулы, перфузата, пластыря, лосьона, пасты, спрея, ингалятора, патча, стерилизованного раствора для инъекций или аэрозоля, причем препарат для наружного применения может иметь такой состав, как крем, гель, патч, спрей, мазь, пластырь, лосьон, линимент, паста или катаплазма.

Примеры носителя, эксципиента или разбавителя, которые могут быть включены в композицию по настоящему изобретению, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, олигосахарид, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.

При приготовлении фармацевтической композиции используют разбавитель или эксципиент, такой как наполнитель, экстендер, связующее вещество, смачивающий агент, разрыхлитель и поверхностно-активное вещество, которые обычно применяются в этом случае.

В качестве добавки к таблетке, порошку, грануле, капсуле, пилюле и пастилке по настоящему изобретению можно использовать эксципиент, такой как кукурузный крахмал, картофельный крахмал, пшеничный крахмал, лактозу, сахарозу, глюкозу, фруктозу, D-маннит, осажденный карбонат кальция, синтетический силикат алюминия, моногидрофосфат кальция, сульфат кальция, хлорид натрия, гидрокарбонат натрия, очищенный ланолин, микрокристаллическая целлюлоза, декстрин, альгинат натрия, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия, каолин, мочевина, коллоидный силикагель, гидроксипропилкрахмал, гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, пропиленгликоль, казеин, лактат кальция и Primojel; связующее вещество, такое как желатин, гуммиарабик, этанол, порошок агара, фталат ацетата целлюлозы, карбоксиметилцеллюлоза, кальций карбоксиметилцеллюлоза, глюкоза, очищенная вода, казеинат натрия, глицерин, стеариновая кислота, натрий карбоксиметилцеллюлоза, натрий метилцеллюлоза, метилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, декстрин, гидроксицеллюлоза, гидроксипропилкрахмал, гидроксиметилцеллюлоза, очищенный шеллак, крахмал, гидроксипропилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, поливиниловый спирт и поливинилпирролидон, а также можно использовать разрыхлитель, такой как гидроксипропилметилцеллюлоза, кукурузный крахмал, порошок агара, метилцеллюлоза, бентонит, гидроксипропилкрахмал, карбоксиметилцеллюлоза натрия, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза кальция, цитрат кальция, лаурилсульфат натрия, кремниевый ангидрид, 1-гидроксипропилцеллюлоза, декстран, ионообменная смола, поливинилацетат, обработанный формальдегидом казеин и желатин, альгиновая кислота, амилоза, гуаровая камедь, гидрокарбонат натрия, поливинил 1-пирролидон, фосфат кальция, желатинизированный крахмал, гуммиарабик, амилопектин, пектин, полифосфат натрия, этилцеллюлоза, сахароза, алюмосиликат магния, раствор D-сорбита и легкая безводная кремниевая кислота; и смазывающее вещество, такое как стеарат кальция, стеарат магния, стеариновая кислота, гидрогенизированное растительное масло, тальк, порошок ликоподия, каолин, вазелин, стеарат натрия, масло какао, салицилат натрия, салицилат магния, полиэтиленгликоль (ПЭГ) 4000, ПЭГ 6000, жидкий парафин, гидрогенизированное соевое масло (Lubriwax), стеарат алюминия, стеарат цинка, лаурилсульфат натрия, оксид магния, макрогол, синтетический силикат алюминия, кремниевый ангидрид, высшие жирные кислоты, высшие спирты, силиконовое масло, парафиновое масло, эфир полиэтиленгликоля и жирной кислоты, крахмал, хлорид натрия, ацетат натрия, олеат натрия, dl-лейцин и легкая безводная кремниевая кислота.

В качестве добавки к жидкому составу по настоящему изобретению можно использовать воду, разбавленную соляную кислоту, разбавленную серную кислоту, цитрат натрия, моностеарат сахарозы, сложные эфиры полиоксиэтиленсорбита и жирных кислот (сложные эфиры Tween), моноалкиловый эфир полиоксиэтилена, эфир ланолина, сложные эфиры ланолина, уксусная кислота, соляная кислота, водный раствор аммиака, карбонат аммония, гидроксид калия, гидроксид натрия, проламин, поливинилпирролидон, этилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза натрия и т.п.

В сиропе по настоящему изобретению можно использовать раствор сахарозы, других сахаров или подсластителей и т.п., а также отдушку, краситель, консервант, стабилизатор, суспендирующий агент, эмульгатор, загуститель, а также могут быть использованы соединения, подобные указанным, если это необходимо.

Для эмульсии по настоящему изобретению можно использовать очищенную воду и, при необходимости, можно использовать эмульгатор, консервант, стабилизатор, отдушку и т.п.

В качестве суспендирующего агента по настоящему изобретению можно использовать такой суспендирующий агент, как гуммиарабик, трагакант, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, натрийкарбоксиметилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза, альгинат натрия, гидроксипропилметилцеллюлоза (HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906 и HPMC 2910, а при необходимости можно использовать поверхностно-активное вещество, консервант, краситель и отдушку.

Инъекционный препарат по настоящему изобретению может включать: растворитель, такой как дистиллированная вода для инъекций, 0,9% раствор хлорида натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, декстроза для инъекций, декстроза + хлорид натрия для инъекций, ПЭГ, лактат Рингера для инъекций, этанол, пропиленгликоль, нелетучее кунжутное масло, хлопковое масло, арахисовое масло, кукурузное масло, этилолеат, изопропилмиристат и бензилбензоат; солюбилизирующую добавку, такую как бензоат натрия, салицилат натрия, ацетат натрия, мочевина, уретан, моноэтилацетамид, бутазолидин, пропиленгликоль, Tween, гексамин и диметилацетамид; буфер, такой как слабая кислота и ее соль (уксусная кислота и ацетат натрия), слабое основание и ее соль (аммиак и ацетат аммония), органическое соединение, белок, альбумин, пептон и камеди; изотонический агент, такой как хлорид натрия; стабилизатор, такой как бисульфит натрия (NaHSO3), газообразный диоксид углерода, метабисульфит натрия (Na2S2O5), сульфит натрия (Na2SO3), газообразный азот (N2) и этилендиаминтетрауксусная кислота; сульфатирующий агент, такой как 0,1% бисульфид натрия, формальдегидсульфоксилат натрия, тиомочевина, динатрийэтилендиаминтетраацетат и ацетонбисульфит натрия; анальгетик, такой как бензиловый спирт, хлорбутанол, гидрохлорид прокаина, глюкоза и глюконат кальция; и суспендирующий агент, такой как карбоксиметилцеллюлоза натрия, альгинат натрия, Tween 80 и моностеарат алюминия.

В суппозитории по настоящему изобретению возможно использование такой основы, как масло какао, ланолин, витепсол, полиэтиленгликоль, глицерожелатин, метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, смесь стеариновой и олеиновой кислот, Subanal, хлопковое масло, арахисовое масло, пальмовое масло, масло какао+холестерин, лецитин, ranetwax, моностеарат глицерина, Tween или Span, Imhausen, monolen (моностеарат пропиленгликоля), глицерин, твердый жир, Buytyrum Tego-G, Cebes Pharma 16, hexalide base 95, Cotomar, Hydroxote SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), Hydrokote 25, Hydrokote 711, idropostal, Massa estrarium (A, AS, B, C, D, E, I, T), Massa-MF, Masupol, Masupol-15, Neosupostal-ene, Paramound-B, Suposhiro (OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), суппозиторная основа IV типов (АВ, В, А, ВС, BBG, E, BGF, C, D, 299), Supostal (N, Es), Wecobee (W, R, S, M, Fs) и триглицеридное основание Tegester (TG-95, MA, 57).

Твердый состав для перорального введения включает таблетку, пилюлю, порошок, гранулу, капсулу и т.п., и твердый состав готовят путем смешивания по меньшей мере одного эксципиента, например, крахмала, карбоната кальция, сахарозы или лактозы, желатин и т.п. с экстрактом. Кроме того, в дополнение к простому эксципиенту также используются смазывающие вещества, такие как стеарат магния и тальк.

Жидкий состав для перорального введения соответствует суспензии, жидкости для внутреннего применения, эмульсии, сиропу и т.п., и жидкий состав может включать, помимо воды и жидкого парафина, которые являются простыми обычно используемыми разбавителями, различные эксципиенты, например, смачивающий агент, подсластитель, ароматизатор, консервант и т.п. Примеры состава для парентерального введения включают водный стерильный раствор, неводный растворитель, суспензию, эмульсию, лиофилизированный препарат и суппозиторий. В качестве неводного растворителя и суспензии можно использовать пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительное масло, такое как оливковое масло, сложный эфир для инъекций, такой как этилолеат, и т.п.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению вводят в фармацевтически эффективном количестве. В настоящем изобретении «фармацевтически эффективное количество» означает количество, достаточное для лечения заболеваний с разумным соотношением польза/риск, применимое к медикаментозному лечению, и уровень эффективной дозы может быть определен в соответствии с факторами, включая тип заболевания пациентов, тяжесть заболевания, активность лекарственных средств, чувствительность к лекарственным средствам, время введения, путь введения, скорость выведения, период лечения, одновременно применяемые лекарственные средства и другие факторы, хорошо известные в области медицины.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в виде индивидуального терапевтического средства или в комбинации с другими терапевтическими средствами, ее можно вводить последовательно или одновременно с терапевтическими средствами, известными из соответствующей области техники, а также можно вводить в виде единичной дозы или нескольких доз. Важно вводить композицию в минимальном количестве, которое может обеспечить максимальный эффект без каких-либо побочных эффектов, принимая во внимание все вышеупомянутые факторы, и это количество может быть легко определено специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение.

Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить нуждающемуся субъекту различными путями. При всех существующих способах введения фармацевтическую композицию можно вводить, например, пероральным путем, подкожной инъекцией, перитонеальным путем, внутривенной инъекцией, внутримышечной инъекцией, инъекцией в параспинальное пространство (интрадуральной), сублингвальным путем, буккальным путем, интраректальным путем, интравагинальным путем, назальным путем, можно вводить в глаз, в ухо, с помощью ингаляции, спрея через рот или нос, трансдермальным путем, наносить на кожу и т.п.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению определяется типом лекарственного средства, которое является активным ингредиентом, а также различными сопутствующими факторами, такими как подлежащее лечению заболевание, способ введения, возраст, пол и масса тела пациента, тяжесть заболевания.

Когда полипептид или его соль по настоящему изобретению используют в качестве пищевой добавки, полипептид можно добавлять как таковой или использовать с другим пищевым продуктом или другими пищевыми ингредиентами, а также в соответствии с любым другим обычным способом. Количество смешиваемого активного ингредиента может быть соответствующим образом определено в соответствии с целью применения (профилактика, здоровье или терапевтическое лечение). Как правило, при приготовлении пищевого продукта или напитка полипептид по настоящему изобретению может быть добавлен в количестве 15 масс.% или менее или 10 масс.% или менее в расчете на сырье. Однако в случае длительного приема с целью поддержания здоровья и гигиены или с целью контроля за здоровьем количество может быть равно или меньше указанного выше диапазона, а эффективный ингредиент может использоваться в количестве, равном или большем, чем указанный выше диапазон вследствие отсутствия проблем с точки зрения безопасности.

Тип пищевого продукта ничем особо не ограничен. Примеры пищевых продуктов, к которым может быть добавлен полипептид, включают мясо, колбасу, хлеб, шоколад, конфеты, закуски, кондитерские изделия, пиццу, лапшу быстрого приготовления, другую лапшу, жевательную резинку, молочные продукты, включая мороженое, различные супы, напитки, чай, напитки, алкогольные напитки, витаминные комплексы и т.п., и включают все полезные для здоровья функциональные пищевые продукты в обычном понимании.

Композиция напитка для здоровья по настоящему изобретению может содержать различные ароматизаторы или натуральные углеводы и т.п. в качестве дополнительных ингредиентов, как в обычном напитке. Вышеописанные природные углеводы могут представлять собой моносахариды, такие как глюкоза и фруктоза, дисахариды, такие как мальтоза и сахароза, полисахариды, такие как декстрин и циклодекстрин, и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит и эритрит. В качестве подсластителя можно использовать натуральный подсластитель, такой как тауматин и экстракт стевии, синтетический подсластитель, такой как сахарин и аспартам, и т.п. Доля природных углеводов обычно составляет от около 0,01 до 0,20 г или от около 0,04 до 0,10 г на 100 мл композиции по настоящему изобретению.

В дополнение к вышеуказанным ингредиентам композиция по настоящему изобретению может содержать различные питательные вещества, витамины, электролиты, ароматизаторы, красители, пектиновые кислоты и их соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы рН, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирты, карбонизирующие агенты, используемые в газированных напитках, и т.п. Кроме того, композиция по настоящему изобретению может содержать мякоть для приготовления натурального фруктового сока, напитков из фруктовых соков и напитков из овощей. Эти ингредиенты могут быть использованы либо по отдельности, либо в их комбинациях. Доля этих добавок не очень важна, но обычно ее выбирают в диапазоне от 0,01 до 0,20 частей по массе на 100 частей по массе композиции по настоящему изобретению.

Используемый в данном описании термин «субъект» относится к субъекту, нуждающемуся в лечении деменции Альцгеймера, и, более конкретно, относится к млекопитающим, таким как человек или примат, не являющийся человеком, мышь, крыса, собака, кошка, лошадь и корова.

Используемый в данном описании термин «введение» относится к предоставлению предварительно определенной композиции по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом, любым подходящим способом.

Используемый в данном описании термин «профилактика» относится ко всем действиям, которые подавляют или отсрочивают начало деменции Альцгеймера, а «лечение» относится ко всем действиям, которые нормализуют или благоприятно изменяют деменцию Альцгеймера, путем введения фармацевтической композиции по настоящему изобретению и «нормализация» относится ко всем действиям, которые уменьшают деменцию Альцгеймера, и связанные с ней параметры, например тяжесть симптомов, при введении композиции по настоящему изобретению.

Далее будут предложены предпочтительные примеры для помощи в понимании настоящего изобретения. Однако следующие примеры предоставлены только для того, чтобы настоящее изобретение было легче понять и содержание настоящего изобретения не ограничивается этими примерами.

Пример 1. Подтверждение экспрессии ЛПС в зависимости от возраста на мышиной модели деменции Альцгеймера

1-1. Экспериментальная животная модель

Модельных мышей 5XFAD с деменцией Альцгеймера в возрасте 3, 5,5 и 11 месяцев (n = 3-5) использовали в качестве экспериментальных модельных животных, а 11-месячных мышей дикого типа использовали в качестве контроля.

В качестве мышей 5XFAD с деменцией Альцгеймера использовали самок гетерозиготных трансгенных мышей 5XFAD (B6SJL/фоновый генотип мышей; возраст 6 месяцев; приобретены у Junbiotech, Inc., Корея). Мыши 5XFAD были подтверждены анализом генотипа, а однопометные мыши дикого типа (WT) использовались в качестве контроля.

1-2. Иммуногистохимическое окрашивание

После того, как мозг мыши удаляли посредством перфузионной фиксации сердца с использованием 4% параформальдегида (ПФА), удаленный мозг мыши фиксировали в растворе фосфатного буфера (100 мМ, pH 7,4), содержащем 4% ПФА, в течение ночи, а затем погружали в 50 мМ PBS, содержащий 30% раствор сахарозы. Затем мозг мыши замораживали, делали срезы толщиной 30 мкм и оставляли в растворе для хранения (DW, содержащем 30% этиленгликоля и 30% глицерина) при 4°C.

Иммуногистохимическое окрашивание проводили по следующему способу.

Срезы инкубировали в 1% H₂O₂ в течение 15 минут, а затем помещали в раствор, в котором мышиные антитела против ЛПС E. coli (Abcam, ab35654) были разбавлены 1:400, и инкубировали при 4°C в течение ночи. После инкубации с биотинилированным вторым антителом (разведение 1:200, Vector Laboratories, Inc., Берлингейм, Калифорния, США) при комнатной температуре в течение 1 часа срезы инкубировали с комплексом авидин-биотин-пероксидаза (разведение 1:100, Vector Laboratories) в течение 1 часа. После этого обеспечивали реакцию 0,02% 3,3'-диаминобензидина и 0,01% H₂O₂ в течение около 3 минут. После каждой стадии инкубации срезы трижды промывали PBS. Наконец, срезы помещали на предметные стекла, покрытые желатином, обезвоживали при увеличении концентрации спирта и очищали в ксилоле.

1-3. Подтверждение распределения ЛПС (+) клеток в мозге мыши

Иммуногистохимическое окрашивание на липополисахарид (ЛПС) проводили на мышах дикого типа (WT) и 3-, 5,5- и 11-месячных мышах 5XFAD.

В результате подтверждения изображений областей ЛПС (+) в полушариях головного мозга мышей 5XFAD, как показано на фиг. 1А, экспрессия ЛПС не наблюдалась в мозге мышей дикого типа (WT), а ЛПС (+) клетки и сигналы проявляли тенденцию к увеличению с возрастом в мозге мышей 5XFAD, и в результате подтверждения распределения ЛПС (+) клеток в головном мозге мышей 5XFAD, как показано в следующей таблице 1, было подтверждено, что ЛПС (+) клетки обильно распределены во вторичной моторной коре (соответствует M2 на виде сверху на фиг. 1A). и в основном распространены в полиморфном слое зубчатой извилины в гиппокампе.

Таблица 1 Область мозга Количество ЛПС (+) клеток 3 месячные 5,5 месячные 11 месячные Кора первичная двигательная кора - + +++ вторичная двигательная кора ++ +++ ++++ первичная соматосенсорная кора - ++ +++ вторичная соматосенсорная кора + + + Поясная кора + + ++ Лобная кора + + ++ Теменная ассоциативная кора + + ++ Гиппокамп CA1 - - - CA2 - - - САЗ - - - Зубчатые извилины Полиморфный слой + + ++ Слой гранулярных клеток - - - Молекулярный слой + + +

1-4. Подтверждение наличия ЛПС (+) клеток во вторичной моторной коре (M2) головного мозга мыши

В результате проведения иммуногистохимического окрашивания с целью подтверждения экспрессии ЛПС во вторичной моторной коре (М2) головного мозга 11-месячных мышей дикого типа и 3-, 5,5- и 11-месячных мышей 5XFAD, как показано на фиг. 1B, была подтверждена тенденция к увеличению количества ЛПС(+) клеток у мышей 5XFAD по сравнению с мышами дикого типа, и было подтверждено, что количество ЛПС(+) клеток проявляло тенденцию к увеличению с возрастом у мышей 5XFAD.

При этом было подтверждено, что ЛПС локализован вокруг ядра (перинуклеарная локализация), а клетки, экспрессирующие ЛПС, варьировали в зависимости от возраста мышей 5XFAD. В случае 3- и 5,5-месячных мышей 5XFAD предполагается, что ЛПС экспрессируется в основном в микроглии, а в случае 11-месячных мышей 5XFAD также может быть подтверждена экспрессия ЛПС в нейронах.

1-5. Подтверждение наличия ЛПС (+) клеток в гиппокампе мозга мыши

В результате проведения иммуногистохимического окрашивания для подтверждения экспрессии ЛПС в гиппокампе 3-, 5,5- и 11-месячных мышей 5XFAD, как показано на фиг. 1C, было замечено, что ЛПС(+) клетки проявляли тенденцию к увеличению с возрастом в гиппокампе мышей 5XFAD по сравнению с мышами дикого типа, и было подтверждено, что ЛПС(+) клетки в основном экспрессировались в полиморфном слое зубчатой извилины гиппокампа.

Пример 2. Подтверждение уровней ЛПС в образцах пациентов с болезнью Альцгеймера

Уровни ЛПС в образцах пациентов с болезнью Альцгеймера на каждой клинической стадии подтверждали тестом с использованием лизата амёбоцитов мечехвоста (ЛАМ).

В частности, образцы были разделены на четыре группы: нормальная группа (n = 10), бессимптомные пациенты (n = 10), пациенты с предвестниками деменции болезни Альцгеймера (n = 10) и пациенты с деменцией Альцгеймера (n = 10), а затем были измерены уровни ЛПС в их образцах крови и спинномозговой жидкости (СМЖ).

Уровни ЛПС измеряли с помощью ЛАМ-теста, реагенты и планшеты для использования готовили заранее при комнатной температуре, а после приготовления термоблока при 37°C по 10 мкл каждого образца помещали в 96-луночный планшет. Затем в планщет добавляли 10 мкл реагента ЛАМ, планшет ставили на дно и встряхивали, и после подтверждения того, что полученная смесь хорошо перемешана, смесь оставляли реагировать при 37°С в течение 10 минут. После этого в каждую лунку добавляли по 20 мкл субстрата, планшет ставили на дно, встряхивали и оставляли реагировать при 37°С в течение 6 минут, затем в каждую лунку добавляли по 20 мкл стоп-раствора и слегка встряхивали, а затем измеряли поглощение при 405 нм.

В результате уровни ЛПС, показанные в каждом образце, соответствуют представленным ниже в таблице 2 (образцы крови), таблице 3 (образцы спинномозговой жидкости) и на фиг. 2.

Таблица 2 ЕС/мл Среднее Стандартная ошибка Нормальная группа 20,199 10,813 Бессимптомная ДА 54,631 21,128 Ранние симптомы ДА 94,015 3,235 Деменция Альцгеймера (ДА) 102,392 3,612

Таблица 3 ЕС/мл Среднее Стандартная ошибка Нормальная группа 18,565 11,806 Бессимптомная ДА 44,498 13,039 Ранние симптомы ДА 105,120 8,998 Деменция Альцгеймера (ДА) 128,995 7,303

Как описано выше, по мере прогрессирования деменции Альцгеймера определялись более высокие концентрации ЛПС в крови и спинномозговой жидкости (СМЖ), что подтверждает высокую корреляцию между ЛПС и деменцией Альцгеймера. Таким образом, при лечении деменции Альцгеймера ожидалось, что будут эффективны пептиды, хорошо связывающиеся с ЛПС.

Пример 3: Получение пептида

FP1 (KLGVEAKRYLD, SEQ ID NO: 3) обозначали как дикий тип (WT) и получали пептид FP3 (KLGVEAKRYLR, SEQ ID NO: 4) с точечной мутацией в WT. Для усиления взаимодействия с ЛПС в последовательности аминокислотных остатков FP3, сконструировали пептид FP13-NH2 (KLRRYLR-NH2, SEQ ID NO: 5) на основе модели связывания FP3 и ЛПС и пептид по настоящему изобретению (KLRVKLRRYLR-NH2 (AcOH), SEQ ID NO: 1, обозначенный как DD-S052)) путем дополнительного введения неприродной аминокислоты и изомера аминокислоты (алломерная аминокислота D-типа (все d-формы)). Кроме того, дополнительно сконструировали N-концевой ПЭГилированный пептид (EG-KLRVKLRRYLR-NH2 (AcOH), SEQ ID NO: 2, обозначенный как DD-S052P), который синтезировала и предоставила компания ANYGEN Co., Ltd.

(AcOH) в пептиде DD-S052 по настоящему изобретению означает, что трифторуксусная кислота (ТФК) на конце девятой аминокислоты от N-конца пептида была заменена ацетатной солью.

Пример 4. Влияние пептидов на продуцирование цитокинов, опосредованное ЛПС.

Клетки микроглиальной клеточной линии BV-2 совместно обрабатывали 20 мкг/мл пептида (DD-S052) по изобретению и 2 нг/мл ЛПС и культивировали в течение 6 часов. Далее уровни экспрессии мРНК провоспалительных цитокинов IL-1β и TNF-α измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.

В частности, общую РНК экстрагировали из клеток BV-2 с использованием набора для очистки РНК (Gene All, Сеул, Корея) в соответствии с протоколом производителя. кДНК синтезировали с использованием набора для синтеза кДНК Revert Aid First Strand (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), а анализ qRT-PCR проводили с использованием SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США). Последовательности ген-специфических праймеров для IL-1β и TNF-α показаны в следующей таблице 4, а уровни мРНК IL-1β и TNF-α рассчитывали относительно количества контрольного образца.

Таблица 4 Праймер Последовательность SEQ ID NO. IL-1β Прямой 5'-ccttccaggatgaggacatga-3' 6 Обратный 5'-tgagtcacagaggatgggctc-3' 7 TNF-α Прямой 5'-tcgtagcaaacccaccaagtg-3' 8 Обратный 5'-atatagcaaatcggctgacg-3' 9

В результате, как показано на фиг. 3, было подтверждено, что обработка DD-S052 супрессировала экспрессию мРНК IL-1β и TNF-α, индуцированную ЛПС в клетках BV-2.

Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего, *** означает p<0,001 для контроля по сравнению с клетками BV-2, обработанными ЛПС, а ## и ### означают p<0,01 и p<0,001 для клеток BV-2, обработанных ЛПС, по сравнению с клетками BV-2, обработанными ЛПС+DD-S052, соответственно.

Пример 5. Влияние пептидов на ЛПС-индуцированное нейровоспаление в головном мозге мышей дикого типа

5-1. Влияние пептидов на микроглиоз, индуцированный ЛПС, в гиппокампе мозга мышей дикого типа

Эксперименты были спланированы так, как показано на фиг. 4А, чтобы подтвердить наличие микроглии в головном мозге мышей дикого типа, и иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием козьего анти-Iba-1 антитела (Ab5076, 1:500) против Iba-1, который является маркером микроглии. Трехмесячным мышам дикого типа внутрибрюшинно (в/б) вводили ЛПС (30 мг/кг/день) + носитель (Hartmann dex) или DD-S052 (30 мг/кг/день) + ЛПС (30 мг/кг/день) и умерщвляли через 6 часов после последней инъекции ЛПС. В этом случае ЛПС и DD-S052 загружали в отдельные шприцы и вводили отдельно в правую и левую часть брюшной полости, соответственно, причем сначала вводили ЛПС, а затем примерно через 1 минуту вводили DD-S052. Период полувыведения ЛПС в крови мышей составлял приблизительно от 2 до 4 минут. Через 6 часов после введения ЛПС и DD-S052 мозг мышей удаляли посредством перфузионной фиксации сердца (4% ПФА). Затем удаленный мозг мыши вторично фиксировали в 4% ПФА в течение 20 часов, а затем погружали в 30% раствор сахарозы. Затем мозг мыши замораживали и делали срезы толщиной 30 мкм.

После этого проводили иммуногистохимическое окрашивание на Iba-1 способом, описанным в Примерах 1-2, для подтверждения наличия микроглии в гиппокампе мыши, и результаты показаны на фиг. 4B. Увеличенные изображения на фиг. 4B демонстрируют, что форма активированной микроглии изменилась с разветвленной на амебоидную у контрольных мышей (мыши, получавшие носитель (PBS) + носитель (Hartmann dex) и ЛПС + носитель (Hartmann dex), соответственно. Напротив, морфология микроглии мышей, обработанных ЛПС + DD-S052, показала тенденцию к изменению формы от амебоидной до разветвленной.

Кроме того, при количественном определении количества Iba-1-положительных клеток, как показано на фиг. 4С, количество Iba-1-положительных клеток в гиппокампе мышей, обработанных ЛПС + носитель (Hartmann dex), было значительно увеличено по сравнению с контрольными мышами, тогда как количество Iba-1-положительных клеток заметно уменьшилось у мышей, обработанных ЛПС + DD-S052, по сравнению с мышами, обработанными ЛПС + носитель (Hartmann dex).

Данные представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего, *** указывает на значимое различие для контроля (p<0,001), а ### указывает на значимое различие для группы ЛПС + носитель (p<0,001). Масштабная метка = 200 мкм (гиппокамп), 100 мкм (зубчатая извилина) и 10 мкм (увеличенное изображение микроглии).

5-2. Влияние пептидов на ЛПС-индуцированный микроглиоз в компактной части черной субстанции (nigra pars compacta) головного мозга мышей дикого типа

Наличие микроглия в компактной части черной субстанции (SNc) было подтверждено путем иммуногистохимического окрашивания на Iba-1. Мышей дикого типа обрабатывали ЛПС и DD-S052 таким же образом, как в примере 5-1.

Результаты иммуногистохимического окрашивания для подтверждения наличия микроглии в компактной части черной субстанции головного мозга проиллюстрированы на фиг. 4D. Увеличенное изображение на фиг. 4D демонстрирует, что активированная микроглия изменилась с разветвленной на амебоидную форму у контрольных мышей и мышей, обработанных ЛПС + носитель (Hartmann dex), соответственно. Напротив, морфология микроглии мышей, обработанных ЛПС + DD-S052, показала тенденцию к изменению формы от амебоидной до разветвленной. Было подтверждено, что, несмотря на тенденцию, при которой микроглия Iba-1(+) увеличивалась у SNc мышей, обработанных ЛПС + носитель, по сравнению с контрольными мышами, микроглия Iba-1(+) имела тенденцию к снижению у SNc мышей, обработанных ЛПС + DD-S052, по сравнению с мышами, обработанными ЛПС + носитель (Hartmann dex). Масштабная метка = 200 мкм, 100 мкм (SNc) и 10 мкм (увеличенное изображение микроглии).

Пример 6. Влияние пептидов на индуцированное ЛПС нейровоспаление в головном мозге мышей с деменцией Альцгеймера

Чтобы подтвердить изменения в нейровоспалении и гибели клеток под действием ЛПС и DD-S052 у мышей 5XFAD, которые представляют собой животную модель деменции Альцгеймера со сверхэкспрессией бета-амилоида (Aβ), был разработан эксперимент, показанный на фиг. 5A, ЛПС и DD-S052 вводили 3-месячным мышам 5XFAD (n=5), у которых наблюдалось воспаление и гибель клеток, для анализа микроглиоза методом иммуногистохимического окрашивания.

Поскольку ЛПС вызывает разную степень воспалительной реакции в зависимости от линии животных, которым вводят ЛПС, происхождения ЛПС и т.п., животным совместно вводили единичную дозу 3 мг/кг ЛПС и 10 мг/кг DD-S052, а затем, мышей 5XFAD, обработанных 3 мг/кг ЛПС, умерщвляли через 48 часов со ссылкой на документ, который подтверждает уровень смертности при обработке мышей 5XFAD 3 мг/кг ЛПС (Barton, S. M.; Janve, V. A.; McClure, R.; Anderson, A.; Matsubara, J. A.; Gore, J. C.; Pham, W., Lipopolysaccharide Induced Opening of the Blood Brain Barrier on Aging 5XFAD Mouse Model. J Alzheimers Dis 2019, 67, (2), 503-513.) и документ, который подтверждает, что микроглиоз достигает своего максимального значения со 2-го дня после введения ЛПС (Kondo, S.; Kohsaka, S.; Okabe, S., Long-term changes of spine dynamics and microglia after transient peripheral immune response triggered by LPS in vivo. Mol Brain 2011, 4, 27) на основании LD₅₀ (от 1 до 25 мг/кг) ЛПС. Через 48 часов после введения ЛПС и DD-S052 мозг мышей удаляли посредством перфузионной фиксации сердца (4% ПФА). После этого удаленный мозг мыши вторично фиксировали в 4% ПФА в течение 20 часов, а затем погружали в 30% раствор сахарозы. Затем мозг мыши замораживали и делали срезы толщиной 30 мкм.

После этого в результате проведения иммуногистохимического окрашивания для подтверждения наличия микроглии в головном мозге мышей 5XFAD, как показано на фиг. 5B, было установлено, что вся микроглия Iba-1(+) увеличилась во время введения ЛПС + носитель (Hartmann dex) в коре головного мозга и гиппокампе, но микроглия Iba-1(+) уменьшилась во время введения ЛПС + DD-S052 по сравнению с группой, которой вводили ЛПС + носитель (Hartmann dex). Клетки (положительные клетки), наблюдаемые в темно-коричневом цвете, представляют собой окрашенную микроглию, и изменения в микроглии могут быть подтверждены изменениями количества или формы положительных клеток.

Пример 7. Влияние пептидов на когнитивные нарушения и патологию, связанную с деменцией Альцгеймера, у мышей с деменцией Альцгеймера

7-1. Подтверждение спонтанного чередования и общее количество заходов в рукава

Чтобы подтвердить влияние введения DD-S052 на когнитивные нарушения и патологию, связанную с деменцией Альцгеймера, на мышах 5XFAD, которые представляют собой модельных животных с деменцией Альцгеймера, был разработан эксперимент, показанный на фиг. 6A, согласно которому DD-S052 вводили 5,5-месячным мышам 5XFAD в дозе 2 мг/кг через день в течение 4 недель внутрибрюшинной инъекцией всего в количестве 30 мг/кг (n=5-8). Затем на каждой мыши проводили эксперименты на определение когнитивных функций, а затем мозг мыши удаляли посредством перфузионной фиксации сердца. После этого удаленный мозг мыши вторично фиксировали в 4% растворе ПФА на 20 часов, а затем погружали в 30% раствор сахарозы. Затем мозг мыши замораживали и делали срезы толщиной 30 мкм.

Эксперимент для определения когнитивных функций - это новый эксперимент, основанный на инстинктивном поведении грызунов с желанием исследовать новую среду, и представляет собой эксперимент по оценке способности мышей к пространственному восприятию выбирать путь, отличный от того, который мыши выбрали непосредственно перед этим в лабиринте, и баллы выдаются путем деления спонтанного чередования (коэффициент выбора пути, отличного от пути, выбранного непосредственно перед этим) на общее количество пройденных проходов (общее количество заходов в рукава). Общее количество заходов в рукава во время эксперимента становится показателем для оценки того, имеют ли все группы одинаковую моторику и нормально ли проводится эксперимент, помимо способности к пространственному восприятию.

Результат подтверждения когнитивных нарушений у мышей 5XFAD, получивших DD-S052, мышей 5XFAD, получивших носитель (Hartmann dex) (n = 8), и мышей дикого типа, получивших носитель (Hartmann dex) (n = 5), показан на фиг. 6В. Было установлено, что спонтанное чередование снижено у мышей 5XFAD, получивших носитель (n = 8), по сравнению с мышами дикого типа, тогда как спонтанное чередование было увеличено у мышей 5XFAD, получивших DD-S052, по сравнению с мышами 5XFAD, получившими носитель.

Кроме того, было подтверждено, что во время 8-минутного сеанса общее число заходов в рукав было увеличено у мышей 5XFAD, получивших DD-S052, по сравнению с мышами 5XFAD, получавшими носитель.

Из вышеизложенного видно, что наблюдалась тенденция к увеличению общего числа заходов в рукава у мышей, получавших носитель и DD-S052, но популяции в трех группах имели сходную подвижность, и поведенческий эксперимент проводился нормально, поcкольку между группами нет существенного статистического различия.

7-2. Влияние на патологию, связанную с деменцией Альцгеймера

Влияние DD-S052 на накопление бета-амилоида, микроглиоз и потерю нейронов подтверждали с помощью метода иммунофлуоресцентного окрашивания.

В частности, в случае иммунофлуоресцентного мечения было получено от 4 до 5 коронарных срезов на уровне субвентрикулярной зоны (1,18 и 0,02 мм от брегмы) и гиппокамповой формации (-1,58 и -3,80 мм от брегмы) на основании Paxinos и Franklin “The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates”. Ткань головного мозга промывали PBS с использованием способа свободного плавания в орбитальном шейкере Titramax 101 (Heidolph, Швáбах, Германия) и срезы инкубировали с PBS, содержащем 0,3% Triton X-100, 0,5 мг/мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) и указанные ниже первичные антитела при 4°C в течение ночи: мышиное анти-4G8 антитело (1:2000; кат. №800701, BioLegend, США), мышиное анти-NeuN антитело (1:100; кат. #MAB377, Merck KGaA, Дармштадт, Германия) и козье анти-Iba-1 антитело (1:500; кат. #ab5076, Abcam, Кембридж, Великобритания).

Перед инкубацией с анти-4G8 антителом срезы мозга инкубировали с 70% муравьиной кислотой для обнаружения антигена в течение 20 минут, трижды промывали PBS по 5 минут каждый раз, а затем инкубировали со вторым антителом при комнатной температуре в течение 50 минут и наблюдали сигналы флуоресценции. В качестве вторых антител использовали следующие антитела: антитела осла, конъюгированные с Alexa Fluor, против мышиного IgG (1:200; кат. № A21202, Thermo Fisher Scientific Inc.), антитела осла, конъюгированные с Alexa Fluor 488, против козьего IgG (1:200; кат. #A11055, Thermo Fisher Scientific Inc.), и антитела осла, конъюгированные с Alexa Fluor 594, против крысиного IgG (1:200; кат. № A21209, Thermo Fisher Scientific Inc.). Все антитела разводили PBS, содержащем 0,3% Triton X-100.

7-2-1. Влияние на накопление бета-амилоида

В результате было подтверждено влияние DD-S052 на накопление бета-амилоида после его введения мышам 5XFAD, которые являются моделью животных с деменцией Альцгеймера, как показано на фиг. 6C, поскольку было установлено, что область 4G8(+), которая представляет собой «бета-амилоид-специфическое антитело», уменьшалась при введении DD-S052, и было видно, что DD-S052 проявляет эффект супрессии накопления бета-амилоида.

7-2-2. Влияние на микроглиоз

В результате было подтверждено влияние DD-S052 на микроглиоз у мышей 5XFAD, которые являются моделью животных с деменцией Альцгеймера, как показано на фиг. 6D, поскольку было установлено, что количество клеток Iba-1(+) уменьшалось при введении DD-S052 мышам 5XFAD, и было видно, что DD-S052 проявлял эффект подавления микроглиоза.

7-2-3. Влияние на потерю нейронов

В результате было подтверждено влияние DD-S052 на потерю нейронов у мышей 5XFAD, которые являются моделью животных с деменцией Альцгеймера, как показано на фиг. 6D, поскольку было установлено, что количество клеток NeuN(+) увеличивалось при введении DD-S052, и было видно, что DD-S052 проявляет эффект супрессии гибели нейронов.

Пример 8. Влияние DD-S052 и ПЭГилированного DD-S052 на супрессию агрегации тау-белка

Анализ с тиофлавином Т (ThT) проводили для изучения влияния DD-S052 и ПЭГилированного DD-S052 на агрегацию тау. Известно, что ThT связывается с агрегатами белков, богатых β-слоями, вызывая флуоресценцию. Синтетический тау-белок К18 растворяли в PBS (pH 7,4) для индукции агрегации тау-белка. Полимеризацию тау-белков индуцировали приготовлением раствора, включающего PBS (рН 7,4), 0,5 мг/мл тау-К18, 0,1 мг/мл гепарина и 100 мкМ ДТТ. DD-S052 в различных концентрациях (10, 20, 40, 100 и 1000 мкг/мл), 100 мкМ раствор метиленового синего (МС) (положительный контроль) и ПЭГилированный DD-S052 инкубировали вместе с агрегационной смесью в течение 21 часа. После инкубации раствор ThT (15 мкМ в 50 мМ глициновом буфере, рН 8,9) добавляли в 96-луночный планшет, содержащий образец и агрегационную, и полученную смесь инкубировали в течение 3 часов. Интенсивность флуоресценции ThT измеряли с помощью многорежимного считывателя микропланшетов SpectraMax iD3 (Molecular Devices, Сан-Хосе, Калифорния, США) при длинах волн возбуждения и испускания 440 и 484 нм и определяли количественно.

В результате было подтверждено влияние DD-S052 и ПЭГилированного DD-S052 на тау-белок K18, как показано на фиг. 7, поскольку было установлено, что интенсивность флуоресценции тиофлавина Т (ThT), который представляет собой флуоресцентный краситель, была снижена в случае DD-S052 (вид слева) и ПЭГилированного DD-S052 (DD-S052P). Статистическую значимость определяли односторонним анализом с последующим тестом множественных сравнений Тьюки (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001).

Пример 9. Подтверждение проникновения DD-S052 через гематоэнцефалический барьер

9-1. Ex vivo тест на проникновение через гематоэнцефалический барьер

Чтобы подтвердить, проходит ли пептид DD-S052 по настоящему изобретению через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ), был проведен тест на проницаемость искусственной мембраны, имитирующий гематоэнцефалический барьер, с использованием набора для анализа проницаемости параллельных искусственных мембран (PAMPA-096); BioAssay Systems).

Условия анализа приведены в следующей таблице 5, и анализ был выполнен с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС).

Таблица 5 Покрытие мембраны 4% лептин Время инкубации 18 ч, 64300 с Температура инкубации Комнатная температура Буфер PBS (Фосфатно-солевой буферный раствор)

9-2. Количественный анализ

Количественный анализ проводили с использованием ионизации электрораспылением в сочетании с масс-спектрометрией ионного циклотронного резонанса с Фурье-преобразованием (ESI-FT-ICR-MS), и условия анализа показаны в Таблице 6 ниже.

Таблица 6 Инъекционный объем 150 мкл Размер 1 M Среднее кол-во сканов 16 Аккумуляция (s) 0.200 Поток распыляющего газа 1.2 бар Сухой газ 4.0 Температура по сухому термометру 200 X Напряжение при столкновении -3.0 V Эффект DC-bias экстракта 1.3 Время полета 0.9 мс Частота 4 МГц RF Амплитуда 350.0 Vpp Капиллярный выход 220.0 V Дефлекторная пластина 220.0 V Поток газа 30.0% Выходная трансферная линза -20.0V Вход анализатора -20.0V Боковой удар 3.0V Смещение бокового удара -1.6V Передняя улавливающая пластина 1.500V Задняя улавливающая пластина 1.500V Гашение задней улавливающей панели -22.0V Общее время эксперимента 10.0682 c Скорость потока 12.0 мкл/ч Калибровка ESI TunningMix

9-3. Критерии анализа

Значение интенсивности пика, соответствующего тестируемому материалу, использовали в соответствии с функцией Log Pe, описанной в существующем руководстве (Evaluation of the reproducibility of Parallel Artificial Membrane Permeation Assays PAMPA, Sigma Aldrich), и значение, рассчитанное с помощью функции Log Pe, использовалось для прогнозирования степени проникновения в соответствии с документом (Brian.J et al. Predicting a Drug's Membrane Permeability: A Computational Model Validated With in Vitro Permeability Assay Data. J Phys Chem B. 2017 May 25;121(20):5228-5237).

9-4. Результаты тестирования

Принимая во внимание аналитическую чувствительность и воспроизводимость результатов анализа пептида DD-S052, были выбраны и проанализированы пики при 375,3 и 500,9 m/z, как показано на фиг. 8A, и 100 мкг/мл пептида DD-S052 добавляли для теста на проникновение через искусственную мембрану.

В результате анализа результатов теста на проницаемость искусственной мембраны с помощью жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), как приведено на фиг. 8В, после обработки DD-S052 пики в верхнем и нижнем слоях искусственной мембраны были схожими, и результат количественной оценки и анализа интенсивности соответствующего пика в масс-спектрометрии, соответствующий значениям интенсивности при 375 m/z и 512 m/z, показаны в таблицах 7 и 8 ниже.

Таблица 7 До 1829478400 Донор 909677952 Акцептор 717305173 LogPe -5,40519559

Таблица 8 До 1667509760 Донор 867968256 Акцептор 717488192 LogPe -5,362403774

На основании приведенных выше результатов степень проницаемости классифицируется в соответствии с диапазоном и показана на фиг. 8С. В качестве контроля использовали темозоломид (TMZ) и птелефилизин С. Как показано на фиг. 8C, было подтверждено, что проницаемость DD-S052 через гематоэнцефалический барьер имеет медианное значение log Pe.

Вышеприведенное описание настоящего изобретения представлено в иллюстративных целях, и специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение, поймут, что настоящее изобретение может быть легко модифицировано в другие конкретные формы без изменения технического содержания или существенных признаков настоящего изобретения. Следовательно, следует понимать, что вышеописанные примеры являются во всех аспектах только иллюстративными и не носят ограничительного характера.

Промышленная применимость

Пептид или заменяющая его соль по настоящему изобретению проявляют такие эффекты, как супрессия ЛПС-опосредованного продуцирования цитокинов, супрессия нейровоспаления, нормализация когнитивных нарушений, супрессия агрегации бета-амилоида или тау-белка и супрессия гибели нейронов. Ожидается, что полипептид или заменяющую его соль можно с пользой применять для профилактики или лечения деменции Альцгеймера.

--->

Перечень последовательностей

<110> DanDi Bioscience Inc

<120> ПЕПТИДНАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ

АЛЬЦГЕЙМЕРА

<130> MPCT21-086

<150> KR 10-2020-0108861

<151> 2020-08-27

<160> 10

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DD-S052

<220>

<221> BINDING

<222> (11)

<223> amine group (NH2) is added to C-terminus of polypeptide.

<220>

<221> SITE

<222> (9)

<223> trifluoroacetic acid (TFA) at a terminus of the 9th amino acid

from the N terminus of a peptide is substituted with an acetate

salt.

<400> 1

Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg

1 5 10

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> DD-S052P

<220>

<221> BINDING

<222> (11)

<223> amine group (NH2) is added to C-terminus of polypeptide.

<220>

<221> SITE

<222> (9)

<223> trifluoroacetic acid (TFA) at a terminus of the 9th amino acid

from the N terminus of a peptide is substituted with an acetate

salt.

<220>

<221> SITE

<222> (1)

<223> peptide N-terminus PEGylation

<400> 2

Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FP1 (WT)

<400> 3

Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Asp

1 5 10

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FP3

<400> 4

Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Arg

1 5 10

<210> 5

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> FP13-NH2

<220>

<221> BINDING

<222> (11)

<223> amine group (NH2) is added to C-terminus of polypeptide.

<400> 5

Lys Leu Arg Val Lys Leu Arg Arg Tyr Leu Arg

1 5 10

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1beta forward primer

<400> 6

ccttccagga tgaggacatg a 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL-1beta reverse primer

<400> 7

tgagtcacag aggatgggct c 21

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-alpha forward primer

<400> 8

tcgtagcaaa ccaccaagtg 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TNF-alpha reverse primer

<400> 9

atatagcaaa tcggctgacg 20

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> polypeptide of claim 1 or 9

<220>

<221> VARIANT

<222> (1)

<223> /replace=""

<220>

<221> VARIANT

<222> (2)

<223> /replace="Arg"

<220>

<221> VARIANT

<222> (4)

<223> /replace="Arg"

<220>

<221> VARIANT

<222> (6)

<223> /replace="Lys"

<220>

<221> VARIANT

<222> (7)

<223> /replace="Leu"

<220>

<221> VARIANT

<222> (8)

<223> /replace="Arg"/replace="Leu"

<220>

<221> VARIANT

<222> (10)

<223> /replace="Ala"/replace="Trp"/replace="Lys"/replace="Asp"

<220>

<221> VARIANT

<222> (12)

<223> /replace="Arg"

<400> 10

Leu Lys Leu Gly Val Glu Ala Lys Arg Tyr Leu Asp

1 5 10

<---

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. 1 и 2 объекты представляют собой применение полипептида или его соли для профилактики или лечения деменции при болезни Альцгеймера. 3 объект – способ профилактики или лечения деменции при болезни Альцгеймера, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида или его соли. 4 объект – применение полипептида или его соли для приготовления лекарственного средства для лечения деменции при болезни Альцгеймера. Технический результат заключается в супрессии ЛПС-опосредованного продуцирования цитокинов, супрессии ЛПС-индуцированного нейровоспаления, нормализации когнитивных нарушений, супрессии агрегации бета-амилоида или тау-белка, супрессии гибели нейронов, прохождении через гематоэнцефалический барьер полипептидом или его солью, профилактике или лечении деменции при болезни Альцгеймера. 4 н. и 3 з.п. ф-лы, 8 ил., 8 табл., 9 пр.

1. Применение полипептида, представленного следующей общей формулой последовательности, или его соли для профилактики или лечения деменции при болезни Альцгеймера:

[общая формула]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7,

где в общей формуле

n равно 0;

L представляет собой лейцин;

V представляет собой валин;

R представляет собой аргинин;

X1 представляет собой лизин (К);

X2 представляет собой аргинин (R);

X3 представляет собой лизин (К);

X4 представляет собой лейцин (L);

X5 представляет собой аргинин (R);

X6 представляет собой тирозин (Y) и

X7 представляет собой аргинин (R), и где

необязательно конец полипептида алкилирован, ПЭГилирован или амидирован, и

необязательно полипептид содержит аминогруппу (NH₂), добавленную к С-концу.

2. Применение полипептида, представленного следующей общей формулой последовательности, или его соли для профилактики или лечения деменции при болезни Альцгеймера:

[общая формула]

Ln-X1-L-X2-V-X3-X4-X5-R-X6-L-X7,

где в общей формуле

n равно 0;

L представляет собой лейцин;

V представляет собой валин;

R представляет собой аргинин;

X1 представляет собой лизин (К);

X2 представляет собой аргинин (R);

X3 представляет собой лизин (К);

X4 представляет собой лейцин (L);

X5 представляет собой аргинин (R);

X6 представляет собой тирозин (Y) и

X7 представляет собой аргинин (R), и где

необязательно конец полипептида алкилирован, ПЭГилирован или амидирован, и

необязательно полипептид содержит аминогруппу (NH2), добавленную к С-концу, и где

полипептид представляет собой пептидомиметик, такой, как L-форма, D-форма, пептоид, или пептид, модифицированный включением неприродной аминокислоты.

3. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что соль полипептида представляет собой ацетатную соль.

4. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что полипептид или его соль обладают одним или несколькими свойствами из приведенных ниже:

супрессия липополисахарид (ЛПС)-опосредованного продуцирования цитокинов;

супрессия нейровоспаления;

нормализация когнитивных нарушений;

супрессия агрегации бета-амилоида или тау-белка; и

супрессия гибели нейронов.

5. Применение по п. 1 или 2, отличающееся тем, что полипептид или его соль проходят через гематоэнцефалический барьер.

6. Способ профилактики или лечения деменции при болезни Альцгеймера, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту полипептида или его соли согласно п. 1 или 2.

7. Применение полипептида или его соли, применяемых согласно применению по п. 1 или 2, для приготовления лекарственного средства для лечения деменции при болезни Альцгеймера.