Изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к лабораторной диагностике инфекционных болезней, и может быть использовано для молекулярно-генетического типирования штаммов B. melitensis.
В последние годы для эпидемиологической характеристики штаммов патогенов, наряду с классическими методами, широкое применение нашли методы генетического анализа, позволяющие не только обнаружить искомый патоген, но и изучить его на молекулярно-генетическом уровне, в том числе ретроспективно.
Среди молекулярно-генетических методов, используемых для характеристики бруцелл, широкое применение получила полимеразная цепная реакция (ПЦР) с электрофоретической детекцией результатов, а в последние годы с учетом результатов в режиме реального времени [1, 2, 3]. Основной целью данной методики является дифференциация бруцелл до вида, а в некоторых случаях до биовара.
В качестве эффективных подходов для генетического типирования применяются методы MLST и SNP [4, 5, 6, 7], однако использование данных методик является длительным, трудоемким, дорогостоящим и требует участия высококвалифицированного персонала.
В настоящее время для генетического типирования бруцелл используют метод MLVA, представленный несколькими схемами, содержащими от 8 до 80 VNTR-локусов с размерами повторов от 5 до 339 п.о. [8, 9, 10].
Принцип метода MLVA заключается в том, что после амплификации VNTR-локусов исследуемого штамма с набором специфичных праймеров образуются продукты реакции, отличающиеся по размерам. В зависимости от этого вычисляют число тандемных повторов для каждого исследуемого локуса, сочетание которых составляет уникальный аллельный MLVA-генотип для анализируемого штамма Brucella spp. Однако данный метод имеет ряд существенных недостатков. Например, для детекции локусов с длиной мотива менее 10 п.о. необходимо использовать сложные и трудоемкие методики определения молекулярных размеров амплифицированного фрагмента с применением капиллярных анализаторов. В ряде случаев MLVA типирование проводят с использованием зондов с флуоресцентной меткой, что усложняет и удорожает процедуру синтеза праймеров. Для учета результатов необходим высокотехнологичный, дорогостоящий секвенатор и импортные расходные материалы.
Одним из простых и информативных методов типирования является выявление INDEL-маркеров, представляющих собой вставки-делеции (insertions/deletions) нескольких нуклеотидов. Изучение полиморфизма INDEL-генов в настоящее время широко используется при молекулярном типировании [11, 12].
За прототип изобретения выбран способ MLVA-анализа [13], который заключается в выделении ДНК из исследуемой культуры методом теплового лизиса, постановке ПЦР со специфичными праймерами к 15 VNTR-локусам и учете полученных результатов методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле (напряжение 20 В, время 8 часов).
Недостатком данного способа является то, что в процессе анализа результатов субъективно определяются аллельные варианты одного гена по каждому локусу, различающиеся между собой количеством повторений того или иного мотива. Полученные генотипы представлены в виде набора чисел, отражающих размеры VNTR-локусов, которые для проведения сравнения с доступными базами данных MLVA-генотипов, необходимо перевести в число тандемных повторов по каждому из локусов. Также использование данной методики требует значительных временных и экономических затрат.
Технической задачей изобретения является разработка нового, быстрого, эффективного и экономически доступного способа генетического типирования штаммов Brucella melitensis, основанного на выявлении четко дискриминируемых INDEL-аллелей генома.
Технический результат достигается за счет того, что из чистой культуры исследуемого штамма Brucella melitensis проводят выделение ДНК, с помощью полимеразной цепной реакции со специфичными праймерами к каждому из десяти INDEL-локусов, имеющих по две дискриминируемых аллели, получают амплифицированные фрагменты, которые визуализируют путем электрофореза в агарозном геле и для каждого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип.
На фиг. 1 представлены INDEL-локусы Brucella melitensis.
На фиг. 2 представлен INDEL-генотип штамма Brucella melitensis C-573.
Способ осуществляется следующим образом.
Материалом для исследования служат чистые культуры Brucella melitensis. Обеззараживание и подготовку проб проводят согласно СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)» и МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».
Выделение ДНК проводят с использованием наборов «ДНК-сорб В» или «РИБО-преп» в соответствии с инструкциями производителя.
Далее проводят амплификацию выделенной ДНК со сконструированными специфичными праймерами к INDEL-локусам (фиг. 1).
Реакционную смесь объемом 20 мкл готовят отдельно для каждого локуса из расчета: 5 мкл MgCl2-буфер, 2,5 мкл смеси дНТФ, по 0,2 мкл каждого праймера (SEQ ID NO: 1-10), 0,5 мкл ДНК-полимеразы, 1,6 мкл РНК-элюент и 10 мкл ДНК-матрицы.
Микропробирки помещают в термоциклер и проводят амплификацию по схеме: денатурация 95°C - 15 мин; затем 30 циклов: денатурация 95°C - 15 с, отжиг 56°C - 20 с, синтез 72°C - 15 с; синтез при 72°C - 5 мин.
Учет результатов амплификации проводят методом электрофореза в 2 % агарозном геле при напряженности электрического поля 10 В/см. Анализ результатов проводят по наличию специфических полос амплифицированной ДНК на электрофореграмме, затем определяют размеры полученных ампликонов по всем локусам для каждого исследуемого штамма, сравнивая их с маркером молекулярного размера или аллельными маркерами 1 и 2 (АМ 1 и АМ 2). Аллельные маркеры готовят заранее путем амплификации ДНК штаммов возбудителя бруцеллеза, размеры INDEL-локусов которых установлены методом капиллярного электрофореза или секвенирования.
Возможность практического применения заявленного способа подтверждается примером его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.
Пример 1
Определение INDEL-генотипа штамма Brucella melitensis C-573.
Из двухсуточной агаровой культуры штамма Brucella melitensis C-573, выращенного при 37°С, стандартным методом выделена ДНК, проведена амплификация по вышеуказанной схеме. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проведено в 2% агарозном геле. В результате получен INDEL-генотип штамма, представленный на электрофореграмме в виде «локус - размер ампликона (п.о.)»: RS05410 - 86, RS06765 - 98, RS11140 - 80, RS12095 - 88, RS12365 - 76, RS14755 - 91, RS16525 - 72, RS05465 - 61, RS14470 - 84, RS16540 - 78 (фиг. 2).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и достоверно проводить генетическое типирование штаммов Brucella melitensis при исследовании чистых культур возбудителя бруцеллеза.
Список литературы
1. Jung, S.C. Advanced multiplex PCR assay for differentiation of Brucella syecies / S.C. Jung // Appl. Environ. Microbiol. - 2011. -Vol. 77 (18). - P. 6726-6728.
2. Validation of the multiplex PCR for identification of Brucella spp. / L. Orzil [et al.] // Cienc. Rural. - 2016. -Vol. 46 (5). - P. 847-852.
3. Патент РФ № 2621864С1. Опубликован 06.07.2017 Бюл. № 16.
4. Genotyping of Brucella species using clade specific SNPs / T. F. Jeffrey [et al.] // BMC Microbiology. - 2012. -Vol. 12 (110). DOI: 10.1186/1471-2180-12-110.
5. Development of an extended multilocus sequence typing for genotyping of Brucella isolates / Y. J Chen [et al.] // Microbiol Methods. - 2011. -Vol. 86. - P. 252-254.
6. Changes of predominant species/biovars and sequence types of Brucella isolates, Inner Mongolia, China / Y. Chen [et al.] // BMC Infect Dis. - 2013. -Vol. 13. - P. 1-9.
7. A genome-wide SNP-based phylogenetic analysis distinguishes different biovars of Brucella suis / J. Sankarasubramanian [et al.] // Infection, Genetics and Evolution. - 2016. -Vol. 41. - P. 213-217.
8. Bricker B.J. Evaluation of the HOOF-Print assay for typing Brucella abortus strains isolated from cattle in the United States: results with four performance criteria / B.J. Bricker, D.R. Ewalt // BMC Microbiol. - 2005. - Vol. 5 (37). DOI:10.1186/1471-2180-5-37.
9. MLVA16 loci panel on Brucella spp. using multiplex PCR and multicolor capillary electrophoresis. / G. Garofolo [et al.] // J. Microbiol. Methods. - 2013. - Vol. 92. - Р. 103-107.
10. Genotypic Expansion Within the Population Structure of Classical Brucella Species Revealed by MLVA16 Typing of 1404 Brucella Isolates From Different Anima Geographic Origins, 1974-2006 / G. Vergnaud [et al.] // Frontiers in Microbiology. - 2018. - Vol. 9. - P. 1545.
11. Canonical insertion-deletion markers for rapid DNA typing of Francisella tularensis / P. Larsson // Emerging Infectious Diseases - 2007. - Vol. 13 (11). - P. 1725 - 1732.
12. Minimum InDel pattern analysis of the Zika virus / H. Lee, M.P. Nguyen, Y. Choi, Y.H. Kim // BMC Genomics. - 2018. - Vol. 19, No. 1. - P. 535 / doi: 10.1186/s12864-018-4935-z.
13. Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay / P. Le Flèche [et al.] // BMC Microbiol. - 2006. - Vol. 6 (9). https://doi.org/10.1186/1471-2180-6-9.
--->
Перечень последовательностей праймеров 5' - 3'
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
gctgccgacg atttcctgaa 20
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
gtttcgtcca cttccccttc 20
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
ctggcggcgc ttatcttg 18
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
aacttcggcc agcatgtttt 20
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
tctggcttgc aatcctgatt 20
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
gacacggcgc aaaatgaag 19
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
tccttctgcc tgaccaagc 19
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
tgagaatata gaaatcgccg tcg 23
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
ctggctgttc tttgtgctga 20
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
gccgatagtc tgtccctgat 20
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
aatgtggtga cgggcctt 18
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
cggaaagcag gttgagatcg 20
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
cggatcatcg ggcgtgac 18
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
cgcttgaaac gcaggaag 18
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
gaaaactcgg ccattggtga 20
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
catcgaccac ctcttccga 19
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
gccggacagt tgacttttga 20
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
catgtccacg atgcaggc 18
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
cattccgttg caggttcgc 19
FGHI Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor
acgatgcgct gaagaacaag 20
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Способ дифференциации штаммов Pseudomonas aeruginosa с помощью молекулярно-генетического типирования | 2023 |
|
RU2816184C1 |
| Способ молекулярно-генетического типирования штаммов Klebsiella pneumoniae с использованием INDEL-маркеров | 2022 |
|
RU2796431C1 |
| Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori путем молекулярно-генетического типирования | 2018 |
|
RU2688434C1 |
| Способ дифференциации штаммов Francisella tularensis путем молекулярно-генетического типирования | 2020 |
|
RU2756854C1 |
| Способ сполиготипирования микобактерий туберкулезного комплекса с использованием ДНК-амплификации в иммобилизованной фазе и биологический микрочип для его осуществления | 2023 |
|
RU2807998C1 |
| Способ определения подвидов Francisella tularensis методом мультипраймерной ПЦР | 2021 |
|
RU2765495C1 |
| СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДОВОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРУЦЕЛЛЕЗА МЕТОДОМ ПЦР С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНЫМ УЧЕТОМ РЕЗУЛЬТАТОВ В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ | 2016 |
|
RU2621864C1 |
| Способ обнаружения жизнеспособных холерных вибрионов 01 серогруппы биоваров Classical и El Tor в окружающей среде с помощью бактериофага M3 методом количественной ПЦР | 2023 |
|
RU2808577C1 |
| СПОСОБ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ ИЗОЛЯТОВ NEISSERIA GONORRHOEAE НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ | 2023 |
|
RU2816767C1 |
| Способ дифференциации штаммов Legionella pneumophila путем молекулярно-генетического типирования | 2019 |
|
RU2709174C1 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Заявлен способ молекулярно-генетического типирования штаммов Brucella melitensis. Способ включает выделение ДНК из исследуемого штамма, постановку ПЦР со специфичными праймерами и электрофоретическую детекцию продуктов амплификации в агарозном геле. Охарактеризованный способ основан на INDEL-маркерах, представляющих собой вставки-делеции нескольких нуклеотидов. Амплификацию проводят с праймерами к каждому из десяти INDEL-локусов (RS05410, RS06765, RS11140, RS12095, RS12365, RS14755, RS16525, RS05465, RS14470 и RS16540), имеющих по две дискриминируемых аллели. Учет результатов проводят методом электрофоретической детекции, размер полученного фрагмента определяют с помощью маркера молекулярного веса или аллельных маркеров 1 и 2. Для каждого исследуемого штамма устанавливают уникальный INDEL-генотип. Данный метод может применяться в качестве дополнительного метода генотипирования при установлении пространственного и временного происхождения штамма, определении генеза вспышки заболевания, источника инфекции, возможных маршрутов заноса бруцеллеза. 1 пр., 2 ил.
Способ генетического INDEL-типирования штаммов Brucella melitensis, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма, постановку ПЦР со специфичными праймерами и детекцию продуктов амплификации методом электрофореза в агарозном геле, отличающийся тем, что проводят амплификацию исследуемого локуса ДНК с праймерами SEQ ID NO: 1-10, комплементарными участкам десяти INDEL-локусов, имеющим по две дискриминируемых аллели, INDEL-генотип штамма определяют для каждого локуса путем сравнения размера ампликона с маркером молекулярного веса или аллельными маркерами 1 и 2 в соответствии с фиг.1.
| LE FLECE P., et al, Evaluation and selection of tandem repeat loci for a Brucella MLVA typing assay, BMC Microbiol | |||
| Пломбировальные щипцы | 1923 |
|
SU2006A1 |
| - Vol | |||
| Приспособление для точного наложения листов бумаги при снятии оттисков | 1922 |
|
SU6A1 |
| Печь-кухня, могущая работать, как самостоятельно, так и в комбинации с разного рода нагревательными приборами | 1921 |
|
SU10A1 |
| BRICKER B.J., et al, Evaluation of the HOOF-Print assay for typing Brucella abortus strains isolated from cattle in the United States: results with four performance | |||
