Показать метаданные Скрыть метаданные

(19)

(11)

2 807 135

(13)

(51)

МПК

C07K14/475(2006-01-01)

C07K19/00(2006-01-01)

C12N15/09(2006-01-01)

A61K39/00(2006-01-01)

A61K39/39(2006-01-01)

A61P35/00(2006-01-01)

(21) (22)

Заявка

2019111160, 2017-09-21

(24)

Дата начала отсчета патента

2017-09-21

(22)

дата подачи заявки

2017-09-21

(45)

опубликовано

2023-11-09

(72)

авторы

Деруази МадихаБельну Элоди

(73)

патентообладатели

Амаль Терапьютикс Са

(56)

Документы, цитированные в отчете о поиске

US 20120231030, 13.09.2012DEROUAZI Met al., Novel Cell-Penetrating Peptide-Based Vaccine Induces Robust CD4+ and CD8+ T Cell-Mediated Antitumor Immunity, Cancer research, 2015, volZHAO Met al., Intracellular cargo delivery using tat peptide and derivatives, Medicinal research reviews, 2004, vol

СЛИТАЯ КОНСТРУКЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОНИКАЮЩИЙ В КЛЕТКУ ПЕПТИД, ПОЛИЭПИТОП И ПЕПТИДНЫЙ АГОНИСТ TLR, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Российский патент 2023 года по МПК C07K14/475 C07K19/00 C12N15/09 A61K39/00 A61K39/39 A61P35/00

Описание патента на изобретение RU2807135C2

Настоящее изобретение относится к области вакцинации, прежде всего к вакцинам для предупреждения и/или лечения колоректального рака (CRC).

Колоректальный рак (CRC). В целом, CRC представляет собой широко распространенное и летальное заболевание, оно находится на третьем месте среди наиболее распространенных диагностированных раков (на третьем месте у мужчин и на втором месте у женщин), при этом в 2012 г. зафиксировано более 1,36 миллионов новых случаев и примерно 694000 смертей. Риск развития CRC зависит от человека, на него влияют факторы окружающей среды и генетически факторы (Cancer, I.A.f.R.o. GLOBACAN 2012. 2012 [процитировано 5 июля 2015 г.]; доступно на сайте: http://globocan.iarc.fr/Pages/burden_sel.aspx). Хотя заболеваемость CRC чаще встречается у мужчин, чем у женщин, это в большей степени зависит от возраста и образа жизни. Так, возраст более 90% пациентов с диагностированным CRC составлял 50 лет или более (Prevention, C.f.D.C.a. What Are the Risk Factors for Colorectal Cancer? 2015 [процитировано 5 июля 2015 г.]), при этом 2/3 случаев обнаружено в развитых странах. Имеются данные о том, что в целом потребление пищи и более конкретно красного мяса, или потребление алкогольных напитков, что приводит к общему ожирению, значительно повышает риски CRC (Stewart В. и С. Wild, World Cancer Report 2014, под ред. В. Stewart и С. Wild, 2014, International Agency for Research on Cancer: Geneva). Двумя другими факторами, которые существенно повышают риски развития колоректального рака, являются: наследственность и воспалительное заболевание кишечника. Семейный аденоматозный полипоз (FAP), например, существенно повышает риски развития CRC у людей моложе 50 лет (Burt R.W., J. A. DiSario и L. Cannon-Albright, Genetics of colon cancer: impact of inheritance on colon cancer risk, Annu Rev Med, 46, 1995, cc. 371-379). FAP, аналогично MAP (ассоциированный с геном MUTYH-полипоз) (Sieber O.M. и др., Multiple colorectal adenomas, classic adenomatous polyposis, and germ-line mutations in MYH. N Engl J Med, 348(9), 2003, cc. 791-799) или синдрому Линча (Lynch H.T. и др., Genetics, natural history, tumor spectrum, and pathology of hereditary nonpolyposis colorectal cancer: an updated review. Gastroenterology, 104(5), 1993, cc. 1535-1549), ассоциирован с генными мутациями, что обусловливает предрасположенность пациентов к наследованию множественных аденом толстой кишки (Dennis J Ahnen D.M., FA. 2015 [процитировано 9 июля 2015 г.]; доступен на сайте http://www.uptodate.com/contents/colorectal-cancer-epidemiology-risk-factors-and-protective-factors). Хорошо известно влияние заболеваний, таких как неспецифический язвенный колит или болезнь Крона, на развитие CRC. Например, с неспецифическим язвенным колитом связано повышение рисков в 3-15 раз (Ekbom А. и др., Ulcerative colitis and colorectal cancer. A population-based study. N Engl J Med, 323(18), 1990, cc. 1228-1233). Хотя касательно болезни Крона получено меньше данных, с этим заболеванием ассоциированы сходные относительные риски. Для пациентов, имеющих CRC в семейном анамнезе, настоятельно рекомендуется осуществлять ранний скрининг в отношении аденоматозного полипоза или воспалительного заболевания кишечника (Jemal А. и др., Global cancer statistics. СА Cancer J Clin, 61(2), 2011, cc. 69-90).

Как и при многих другим видах рака, продолжительность жизни пациентов с CRC зависит от стадии развития болезни. Для пациентов с более ранними стадиями (стадии 0, I и II) имеет место хороший прогноз (более 75%). При стадиях III имеет место более значительная гетерогенность коэффициента выживаемости (от 90% до 50%) в зависимости от инвазии опухоли в периферические ткани. И, наконец, только стадия IV характеризуется быстрым и выраженным воздействием на время выживания пациента: после постановки диагноза только примерно у 10% пациентов время выживания составляет более 60 месяцев.

Существующие варианты лечения, как правило, базируются на хирургическом вмешательстве с последующей надежной химиотерапией, лучевой терапией и/или таргетной терапией или без них (Moertel C.G., Chemotherapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 330(16), 1994, cc. 1136-1142; Meyerhardt J.А. и R.J. Mayer, Systemic therapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 352(5), 2005, cc. 476-487). В зависимости от стадии развития болезни существующие варианты лечения обеспечивают коэффициент выживаемости на уровне 30%-95% в течение двух лет после постановки диагноза. При всех ранних стадиях CRC первоначальные стратегии лечения включают хирургию, объединенную или не объединенную с дополнительным режимом. Решение о последующем терапевтическом режиме зависит от стадии развития болезни, идентифицированной на основе предварительных результатов скрининга. В случае запущенной формы CRC, как правило, рекомендовано применение химиотерапии или таргетной терапии в качестве лечения первой линии. Наиболее часто применяемыми режимами являются FOLFOX, СареОХ или FOLFIRI. Эти варианты лечения можно применять в комбинации с одним из следующих рекомендованных биологических лекарственных средств, мишенью которых является VEGF (бевацизумаб/Avastin^® фирмы Genentech или афлиберцепт/Zaltrap^® фирмы Regeneron-Sanofi) или EGFR (цетуксимаб/Erbitux^® фирмы Merck-Serono). Другие таргетные терапии могут быть предложены в качестве автономного лечения первой линии. Продемонстрирована способность моноклонального антитела против EGFR фирмы Amgen (панитумумаб/Vectibix^®) и в последние годы низкомолекулярного ингибитора киназ фирмы Bayer, такого как регорафениб (Stivarga^®) повышать общее время выживания пациентов с CRC. Если уже произошло значительное распространение болезни в другие органы, то можно применять моноклональное антитело против VEGF рамукуримаб (Cyramza^®) фирмы Eli Lilly. На стадии IV для облегчения симптомов, таких как боль, можно применять лучевую терапию.

Хотя химиотерапия CRC хорошо себя зарекомендовала (Moertel C.G., Chemotherapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 330(16), 1994, cc. 1136-1342), в последние десятилетия предпринимались важные усилия, направленные на создание более эффективных и обладающих меньшими вторичными воздействиями стратегий, а именно в случае стадии IV CRC (Gallagher D.J. и N. Kemeny, Metastatic colorectal cancer: from improved survival to potential cure. Oncology, 78(3-4), 2010, cc. 237-248). Первые испытания были направлены на комплементарную адъювантную терапию. Однако через много лет ценность послеоперационной терапии на основе 5-FU остается спорной, в частности для пациентов со стадией II CRC (Meyerhardt J.А. и R.J. Mayer, Systemic therapy for colorectal cancer. N Engl J Med, 352(5), 2005, cc. 476-487).

В этом контексте тщательно оценивались иммунотерапии. Иммунная система может распознавать и в определенной степени элиминировать опухолевые клетки, однако уровень указанного противоопухолевого ответа часто является низким и неэффективным. Усиление этого слабого противоопухолевого ответа с помощью терапевтической вакцинации уже давно является целью противораковой терапии. Таким образом, модуляция иммунной системы с целью повышения иммунных ответов представляет собой перспективный терапевтический подход в онкологии, и ее можно объединять со стандартными методами ухода за больными.

Многообещающие результаты доклинических исследований и успехи в клинических испытаниях, включая одобренные в настоящее время FDA вакцину Sipuleucel-T и антитело против CTLA-4, продемонстрировали, что активная иммунизация является безопасным и реальным путем лечения некоторых типов рака. Опубликованы данные об индукции иммунных ответов, опосредуемых опухольспецифическими цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTL), с использованием различных подходов, включая вакцины на основе модифицированных опухолевых клеток, пептидные вакцины, рекомбинантные вирусные векторы, вакцины на основе ДНК, белка или дендритных клеток. Однако противоопухолевый иммунитет, опосредуемый CTL, только в редких случаях коррелирует с регрессом опухолей, и лишь несколько проектов достигли фазы III клинических испытаний.

В целом, к настоящему времени для противораковых вакцин продемонстрирована очень ограниченная клиническая эффективность. Так, известно, что к концу 2011 г. из 30000 проводимых клинических испытаний противораковых вакцин только 19 достигли фазы III испытаний (Global Data, 2012). Среди них, NeuVax, пептидная вакцина для рака молочной железы, Stimuvax, вакцина на основе липосом для немелкоклеточной карциномы легкого (NSCLC) и рака молочной железы, TG4010, вакцина на основе вируса коровьей оспы для NSCLC, и GSK1572932A, липосома с адъювантом для NSCLC. Эти четыре противораковые вакцины основаны на различных технологиях и общим для них является то, что каждая из них направлена на один единственный антиген.

Терапевтические противораковые вакцины можно разделять на две принципиальные категории: персонализированные (аутологичные) и стандартизированные вакцины, и их дополнительно классифицируют в зависимости от технологической платформы. Современные персонализированные вакцины включают вакцины на основе опухолевого лизата, а также вакцину на основе дендритных клеток (далее в контексте настоящего описания обозначена как вакцина на основе клеток). В последнем случае для загрузки антигена можно использовать либо введение опухолевых лизатов в импульсном режиме, либо трансфекцию РНК, экстрагированной из опухолей. В этом случае антигены являются специфическими для опухоли или ассоциированы с ней, но не являются строго определенными. Дендритные клетки можно вносить также с определенными антигенами либо с помощью обработки в импульсном режиме пептидом, либо с использованием белка, такого как простатическая кислая фосфатаза (РАР), которую применяли для создания вакцины Provenge^®. Однако процесс производства этих терапевтических агентов на основе клеток требует больших временных затрат и является трудоемким, и при этом трудно обеспечивать и поддерживать стандарты качества. Иммуномониторинг сопряжен с дополнительными сложностями. Кроме того, большинство аутологичных противораковых вакцин не позволяют идентифицировать или количественно оценивать применяемые антигены, которые следует контролировать, в отличие от имеющих заданный состав и стандартизованных вакцин.

В отличие от терапии на основе клеток (АРС, Т-клетки, CAR, лизаты) субъединичные вакцины (белок или пептиды) позволяют разрабатывать стандартизованную вакцину с использованием более простого процесса получения и с улучшенной в значительной степени воспроизводимостью от партии к партии, которую можно вводить широкому кругу пациентов. Кроме того, антигены являются полностью определенными, что позволяет улучшать иммуномониторинг и снижать риск нежелательных воздействий, связанных с компонентом вакцины.

Различные подходы, которые оценивали в доклинических и клинических исследованиях, включают вакцины на основе коротких пептидов (Slingluff C.L., Jr., The present and future of peptide vaccines for cancer: single or multiple, long or short, alone or in combination? Cancer journal 17(5), 2011, cc. 343-350), вакцины на основе длинных пептидов (Melief С.J., van der Burg S.H., Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines, Nature reviews Cancer 8(5), 2008, cc. 351-360) и на основе белков. В отличие от вакцин на основе длинных пептидов и белков вакцины на основе коротких пептидов обладают очень коротким временем полужизни и могут оказывать отрицательное воздействие на иммунный ответ.

В случае вакцин на основе белков результаты таргетинга MAGE-А3 с помощью вакцины на основе рекомбинантного слитого белка оказались очень оптимистическими после многообещающих данных, полученных на фазе II, в отношении метастатической меланомы (Kruit W.H., Suciu S., Dreno В., Mortier L., Robert C., Chiarion-Sileni V. и др., Selection of immunostimulant AS15 for active иммунизация with MAGE-А3 protein: results of a randomized phase II study of the European Organisation for Research and Treatment of Cancer Melanoma Group in Metastatic Melanoma. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 31(19), 2013, cc. 2413-2420) и немелкоклеточного рака легкого (NSLC) (Vansteenkiste J., Zielinski M., binder A., Dahabreh J., Gonzalez E.E., Malinowski W. и др., Adjuvant MAGE-А3 immunotherapy in resected non-small-cell lung cancer: phase II randomized study results. Journal of clinical oncology: official journal of the American Society of Clinical Oncology 31(19), 2013, cc. 2396-2403). Однако в 2013 г. на фазе III исследования на коже (DERMA-исследование) в отношении меланомы (NCT00796445) не подтверждена первичная конечная точка, в затем в 2014 г. прекращена фаза III MAGRIT-опыта в отношении NSCL (NCT00480025). Несмотря на указанные очень неутешительные результаты клинических исследований, вакцины на основе белков, безусловно, обладают многими преимуществами.

Кроме того, касательно колоректального рака успешные научные исследования в отношении иммунологии опухолей привели к лучшему пониманию противоопухолевого иммунного ответа посредством клеточного и гуморального путей (Smith C.L. и др., Immunotherapy of colorectal cancer. Br Med Bull, 64, 2002, cc. 181-200; Koido S. и др., Immunotherapy for colorectal cancer. World J Gastroenterol, 19(46), 2013, cc. 8531-8542) и способствовали лучшей идентификации опухолевых антигенов. Указанный прогресс открыл новые перспективы для иммунотерапии при CRC. Пассивные иммунотерапии, включающие антитела, предложены в качестве первых таргетных терапий для лечения CRC. В результате их способности оказывать воздействие на пути роста опухолей через рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) или ингибировать сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), антитела, такие как цетуксимаб, панитумумаб и бевацизумаб, получили одобрение FDA для лечения CRC в 2004, 2006 и 2009 г. соответственно.

К сожалению, клинические испытания по применению адаптивного переноса клеток (ACT) для лечения CRC до настоящего времени давали неудовлетворительные результаты. Фактически основным препятствием, по-видимому, является ограниченная популяция пациентов для изучения лечения с использованием как несконструированных, так и созданных с помощью генной инженерии Т-клеток. Аналогично этому, вторичные эффекты, обнаруженные на пациентах, которых лечили Т-клетками, слитыми с химерными антигенными рецепторами (CAR), не позволили продемонстрировать безопасность и эффективность лечения с использованием ACT (Koido S. и др., Immunotherapy for colorectal cancer. World J Gastroenterol, 19(46), 2013, cc. 8531-8542; Xiang В. и др., Colorectal cancer immunotherapy. Discov Med, 15(84), 2013, cc. 301-308). Таким образом, вышеуказанные обстоятельства в дополнение к присущим ACT недостаткам, связанным с реализуемостью и стоимостью, а также с памятью иммунного ответа (вторичный иммунный ответ), по-видимому, блокируют на данный момент времени возможность применения лечения на основе ACT.

Полученные в последние годы положительные результаты фазы III клинического испытания, касающегося выживаемости пациентов при применении афлиберцепта, позволили FDA одобрить применение этого анти-VEGF слитого белка при метастатическом колоректальном раке (mCRC) (Clarke J.M. и H.I. Hurwitz, Ziv-aflibercept: binding to more than VEGF-A--does more matter? Nat Rev Clin Oncol, 10(1), 2013, cc. 10-11). Эта таргетная терапия прокладывает путь к развитию иммунотерапии, в которых не используются антитела. K настоящему времени отсутствуют активные иммунотерапии и отсутствуют иммуномодуляторы, одобренные для применения при CRC. Подавляющее большинство молекул, протестированных в отношении лечения CRC, структурно представляют собой либо малые молекулы, как правило, ингибиторы киназ, либо антитела (соответственно 52% и 28%).

Как правило, терапевтическую противораковую вакцину вводят страдающим раком пациентам для усиления способности их иммунной системы распознавать и уничтожать опухолевые клетки. Основной целью подхода на основе терапевтической противораковой вакцины является создание Т-клеток-киллеров (которые обозначают также как цитотоксические Т-лимфоциты), специфических для опухолевых клеток. Для этого, а также для достижения сильного иммунного ответа вакцина должна содержать молекулы, называемые антигенами, которые также присутствуют в опухоли и которые требуется доставлять к антигенпрезентирующим клетками (АРС), прежде всего дендритным клеткам (DC), для инициации противоракового иммунитета. DC процессируют эти опухолевые антигены в небольшие пептиды, которые презентируются на поверхности клеток, экспрессирующих молекулы ГКГС класса I или ГКГС класса II, Т-клеткам. Пептиды, которые затем распознаются Т-клетками и тем самым индуцируют их стимуляцию, называются эпитопами. Презентация молекулами ГКГС класса I и ГКГС класса II обеспечивает активацию двух классов Т-клеток, цитотоксических CD8⁺-Т-лимфоцитов (CTL) и хелперных CD4⁺-Т-клеток (T_h) соответственно. Кроме того, для полной активации помимо распознающих антиген Т-клеток требуется второй сигнал, костимуляторный сигнал, который является неспецифическим для антигена и образуется в результате взаимодействия между костимуляторными молекулами, экспрессируемыми на поверхности АРС, и Т-клеткой. Таким образом, двумя основными требованиями, предъявляемыми к эффективной терапевтической противораковой вакцине, является специфичность опухолевых антигенов и способность эффективно доставлять их к DC.

Таким образом, в совокупности для индукции опухольспецифического иммунного ответа требуется три основные стадии: (I) антиген должен быть доставлен к дендритным клеткам, которые должны процессировать его до эпитопов, (II) дендритные клетки должны получать соответствующий активирующий сигнал и (III) активированные загруженные опухолевым антигеном дендритные клетки должны генерировать опосредуемые Т-клетками иммунные ответы в лимфоидных органах.

Поскольку опухолевые клетки могут ускользать от надзора иммунной системы с помощью понижающей регуляции экспрессии индивидуальных антигенов (пассивное ускользание от иммунологического надзора), то доставка имеющего несколько эпитопов антигена (полиэпитопный антиген) должна обеспечивать преимущество. Так, вакцины на основе белков обеспечивают доставку полиэпитопного антигена к антигенпрезентирующим клеткам (АРС), таким как дендритные клетки (DC), без рестрикции по единичному аллелю ГКГС. Другим путем усиления является долговременная презентация эпитопа, описанная в настоящее время для дендритных клеток, загруженных белками (van Montfoort N., Camps M.G., Khan S., Filippov D.V., Weterings J.J., Griffith J.M. и др., Antigen storage compartments in mature dendritic cells facilitate prolonged cytotoxic T lymphocyte cross-priming capacity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106(16), 2009, cc. 6730-6735). Кроме того, для белков требуется поглощение и процессирование DC для достижения рестриктированной по ГКГС презентации присутствующих в них эпитопов. Это снижает риск индукции периферической толерантности, которая обнаружена после вакцинации короткими пептидами, которые не обладают такими строгими требованиями к процессированию (Toes R.E., Offringa R., Blom R.J., Melief С.J., Kast W.M., Peptide vaccination can lead to enhanced tumor growth through specific T-cell tolerance induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 93(15), 1996, cc. 7855-7860).

Однако большинство растворимых белков, как правило, расщепляются в эндолизосомах и слабо перекрестно презентируются на молекулах ГКГС класса I и поэтому обладают слабой иммуногенностью в отношении CD8⁺-Т-клеточных ответов (Rosalia R.A., Quakkelaar E.D., Redeker A., Khan S., Camps M., Drijfhout J.W. и др., Dendritic cells process synthetic long peptides better than whole protein, improving antigen presentation and T-cell activation. European journal of immunology 43(10), 2013, cc. 2554-2565). Кроме того, хотя зрелые DC являются более эффективными, чем незрелые DC, в отношении примирования и вызывания Т-клеточных ответов (Apetoh L., Locher С., Ghiringhelli F., Kroemer G., Zitvogel L., Harnessing dendritic cells in cancer. Semin Immunol. 23, 2011, cc. 42-49), они утрачивают способность эффективно поглощать экзогенные антигены, в частности антигены, рестриктированные по ГКГС класса II (Banchereau J., Steinman R.M., Dendritic cells and the control of immunity. Nature, 392, 1998, cc. 245-252). В результате, на обработанные в импульсном режиме пептидами DC в качестве вакцин накладывается несколько ограничений.

Например, расщепление пептидов, быстрый круговорот молекул ГКГС класса I и диссоциация пептида из молекул ГКГС класса I в процессе получения и инъекции DC/пептидов могут приводить к короткому времени полужизни комплексов ГКГС класса I/пептид на поверхности DC, что приводит к слабым Т-клеточным ответам.

Для повышения эффективности доставки вакцины на основе белка предложено применение проникающих в клетку пептидов для внутриклеточной доставки раковых пептидов в DC (Wang R.F., Wang H.Y., Enhancement of antitumor immunity by prolonging antigen presentation on dendritic cells. Nat Biotechnol. 20, 2002, cc. 149-156). Проникающие в клетку пептиды (СРР) представляют собой пептиды, состоящие из 8-40 остатков, которые обладают способностью пересекать клеточную мембрану и проникать в большинство типов клеток (Copolovici D.M., Langel K., Eriste Е., Langel U., Cell-penetrating peptides: design, synthesis, and applications. ACS nano 8(3), 2014, cc. 1972-1994, Milletti F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today, 2012). Альтернативно этому, их обозначают также как домен трансдукции белка (PTD), что отражает их источник в виде встречающихся в естественных условиях белков. Несколько эффективных СРР идентифицировано из белков, включая белок Tat вируса иммунодефицита человека, белок VP22 вируса герпеса простого и фактор роста фибробластов (Berry С.С. Intracellular delivery of nanoparticles via the HIV-1 tat peptide. Nanomedicine. 3, 2008, cc. 357-365; Deshayes S., Morris M.C., Divita G., Heitz F., Cell-penetrating peptides: Tools for intracellular delivery of therapeutics. Cell Mol Life Sci. 62, 2005, cc. 1839-1849; Edenhofer F. Protein transduction revisited: Novel insights into the mechanism underlying intracellular delivery of proteins. Curr Pharm Des. 14, 2008, cc. 3628-3636; Gupta В., Levchenko T.S., Torchilin V.P., Intracellular delivery of large molecules and small particles by cell-penetrating proteins and peptides. Adv Drug Deliv Rev. 57, 2005, cc. 637-651; Torchilin V.P., Recent approaches to intracellular delivery of drugs and DNA and organelle targeting. Annu Rev Biomed Eng. 8, 2006, cc. 343-375). Установлено, что Т-клеточная активность, обусловленная DC/TAT-TRP2, оказалась в 3-10 раз выше, чем активность, индуцированная DC/TRP2 (Wang H.Y., Fu Т., Wang G., Gang Z., Donna M.P.L, Yang J.C., Restifo N.P., Hwu P., Wang R.F., Induction of CD4+ T cell-dependent antitumor immunity by TAT-mediated tumor antigen delivery into dendritic cells. J Clin Invest. 109, 2002a, cc. 1463-1470).

Кроме того, субъединичные вакцины (пептиды или белки) обладают слабой иммуногенностью. Поэтому с точки зрения терапевтической противораковой вакцины для них обязательным требованием является добавление в вакцину эффективного адъюванта для повышения уровня костимуляторных молекул на DC и, следовательно, для усиления ответа иммунной системы на антигены-мишени. Адъюванты решают эту задачу, имитируя сохраненные микробные компоненты, которые в естественных условиях распознаются иммунной системой. Они включают липополисахарид (LPS), компоненты оболочек бактериальных клеток и нуклеиновые кислоты, такие как двухцепочечная РНК (dsPHK), одноцепочечная ДНК (ssДНК), и ДНК, содержащая неметилированный CpG-динуклеотид. Их присутствие в сочетании с вакциной может значительно повышать врожденный иммунный ответ на антиген. Кроме того, указанный адъювант может усиливать скорее адаптивный иммунный ответ, связанный с CTL и типом поляризованных Th1, чем гуморальный иммунный ответ, приводящий к выработке антител. Изучены различные адъюванты, из них для применения на человеке одобрено лишь ограниченное количество. Они включают квасцы, MPL (монофосфорил-липид А) и ASO₄ (квасцы и MPL), применяемые в США, и MF59 (эмульсия масло-в-воде), ASO₄ липосомы, применяемые в Европе (Lim Y.T., Vaccine adjuvant materials for cancer immunotherapy and control of infectious disease. Clin Exp Vaccine Res, 4(1), 2015, cc. 54-58).

В настоящее время в качестве многообещающего класса адъювантов рассматриваются лиганды Толл-подобного рецептора (TLR) (Baxevanis C.N., I.F. Voutsas и О.Е. Tsitsilonis, Toll-like receptor agonists: current status and future perspective on their utility as adjuvants in improving anticancer vaccination strategies. Immunotherapy, 5(5), 2013, cc. 497-511). Так, в важных исследованиях, направленных на развитие противораковых вакцин, в композиции вакцин включали различные агонисты TLR, такие как TLR-3 (поли I:C), TLR-4 (монофосфорил-липид A; MPL), TLR-5 (флагеллин), TLR-7 (имиквимод) и TLR-9 (CpG) (Duthie M.S., Windish H.P., Fox С.В., Reed S.G., Use of defined TLR ligands as adjuvants within human vaccines. Immunol Rev. 239, 2011, cc. 178-196). Типы сигналов и цитокинов, продуцируемых иммунными клетками после стимуляции TLR, контролируют дифференцировку CD4⁺-Т-клеток в Th1-, Th2-, Th17- и Treg-клетки. Стимуляция иммунных клеток, таких как DC и Т-клетки, большинством адъювантов на основе TLR приводит к выработке провоспалительных цитокинов и усиливает ответы Th1- и CD8⁺-Т-клеток (Manicassamy S., Pulendran В. Modulation of adaptive immunity with Toll-like receptors. Semin Immunol. 21, 2009, cc. 185-193).

Конъюгация вакцины с лигандом TLR представляет собой привлекательный подход, который обладает несколькими преимуществами по сравнению с неконъюгированными вакцинами, включая (I) предпочтительное поглощение иммунными клетками, экспрессирующими TLR, (II) повышенный иммунный ответ и (III) пониженный риск индукции периферической толерантности. Фактически, все антигенпрезентирующие клетки, загруженные антигеном, должны одновременно активироваться. Различные группы исследователей, изучавшие этот подход с использованием различных лигандов TLR, главным образом связывали их химическим путем с вакциной на основе пептида или белка (Zom G.G., Khan S., Filippov D.V., Ossendorp F., TLR ligand-peptide conjugate vaccines: toward clinical application. Adv Immunol. 114, 2012, cc. 177-201). Поскольку химическое связывание с пептидом легко осуществлять, то наиболее изученные лиганды TLR, предназначенные для конъюгации с вакциной, представляли собой агонисты TLR2 Pam2Cys и Pam3Cys (Fujita Y. и Н. Taguchi, Overview and outlook of Toll-like receptor ligand-antigen conjugate vaccines. Ther Deliv, 3(6), 2012, cc. 749-760).

Однако установлено, что большинство изученных к настоящему времени противораковых вакцин обладают ограниченной эффективностью. Одним из объяснений этого является отсутствие терапии, с помощью которой можно одновременно (I) стимулировать опосредуемый цитотоксическими полиэпитопными Т-клетками иммунитет, (II) индуцировать T_h-клетки и (III) повышать иммунологическую память. Эти три параметра являются существенными для создания эффективного длительного противоопухолевого иммунитета. Так, CTL, специфические в отношении различных эпитопов, могут обеспечивать деструкцию многих раковых клеток в гетерогенной опухолевой массе и избегания увеличения вариантов без антигена (ускользание опухоли от иммунологического надзора). T_h-клетки участвуют в поддержании длительного клеточного иммунитета, и инфильтрация опухолей T_h-клетками также является важной стадией рекрутмента и функции CD8⁺-CTL. Иммунологическая память является важной для защиты от рецидива опухоли.

В свете вышесказанного, в основу настоящего изобретения была положена задача преодолеть указанные выше недостатки современных противораковых вакцин и разработать новый комплекс для применения в иммунотерапии колоректального рака, представляющий собой более эффективную вакцину, прежде всего противораковую вакцину, которая обладает улучшенной противоопухолевой активностью, предназначенную для предупреждения и/или лечения колоректального рака.

Эта цель достигается с помощью изложенного ниже объекта изобретения и прилагаемой формулы изобретения.

Хотя настоящее изобретение описано подробно ниже, должно быть очевидно, что настоящее изобретение не ограничено конкретными методологиями, протоколами и реагентами, указанными в настоящем описании, и они могут варьироваться. Также должно быть очевидно, что применяемая в контексте описания терминология не направлена на ограничение объема настоящего изобретения, который определяется только прилагаемой формулой изобретения. Если не указано иное, то все технические и научные понятия, применяемые в контексте настоящего описания, имеют значения, общепринятые и очевидные обычному специалисту в данной области.

Ниже описаны элементы настоящего изобретения. Эти элементы перечислены с помощью конкретных вариантов осуществления изобретения, однако следует понимать, что их можно объединять любым образом и в любом количестве с созданием дополнительных вариантов осуществления изобретения. Различные описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления изобретения не должны рассматриваться, как ограничивающие объем настоящего изобретения, они предназначены только для пояснения описанных вариантов осуществления изобретения. Должно быть очевидно, что настоящее описание предназначено для подтверждения вариантов осуществления изобретения и включает варианты осуществления изобретения, которые поясняют описанные варианты осуществления изобретения с любым количеством описанных и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех указанных элементов в настоящем описании, должны рассматриваться как подпадающие под объем настоящего описания, если из контекста не следует иное.

В настоящем описании и в представленной ниже формуле изобретения, если из контекста не требуется иное, понятие «содержат» и его грамматические формы, такие как «содержит» и «содержащий», следует рассматривать, как включающие указанного представителя, указанное целое число или указанную стадию, но не исключающие любого другого неуказанного представителя, любое другое неуказанное целое число или любую другую неуказанную стадию. Понятие «состоят из» является конкретным вариантом понятия «содержат», при этом исключается любой другой неуказанный представитель, любое другое неуказанное целое число или любая другая неуказанная стадия. В контексте настоящего изобретения понятие «содержат» включает понятие «состоят из». Таким образом, под понятие «содержащий» подпадает также «включающий», а также «состоящий», например, композиция, «содержащая» X, может содержать только X или может иногда включать дополнительный элемент, например, X+Y.

Упоминание в контексте настоящего описания понятия в единственном числе относится также и к множественному числу (особенно в контексте формулы изобретения), если в настоящем описании не указано иное или если это явно противоречит контексту. Упоминание диапазонов величин в контексте настоящего описания должно служить только в качестве метода сокращенной ссылки индивидуально на каждую отдельную величину, подпадающую под диапазон. Если специально не указано иное, то каждое индивидуальное значение включено в описание, как если бы оно было индивидуально указано в настоящем описании. Спецификация не ограничена никаким языком, применяемым для указания незаявляемого элемента, важного для воплощения изобретения на практике.

Понятие «практически» не исключает «полностью», например, композиция, «практически свободная» от Y, может представлять собой композицию полностью свободную от Y. При необходимости понятие «практически» можно опускать в описании изобретения.

Понятие «примерно» касательно численного значения x обозначает x±10%.

Комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении

Первым объектом настоящего изобретения является комплекс, содержащий:

а) проникающий в клетку пептид;

б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп; и

в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR,

в котором компоненты а)-в), т.е. проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и по меньшей мере один пептидный агонист TLR, ковалентно связаны,

предназначенный для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака.

Указанный комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, одновременно обеспечивает (I) стимуляцию опосредуемого полиэпитопной цитотоксической Т-клеткой иммунитета, (II) индукцию T_h-клеток и (III) усиление иммунологической памяти. Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, представляет собой эффективную вакцину, в частности, с улучшенной противоопухолевой активностью.

Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид или белок, в частности, рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок, предпочтительно рекомбинантнй слитый белок или рекомбинантный слитый полипептид. Понятие «рекомбинантный» в контексте настоящего описания обозначает, что субстанция (в настоящем описания полипептид или белок) не встречается в естественных условиях. Таким образом, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, который представляет собой рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок, как правило, содержит компоненты а)-в), в котором компоненты а)-в) имеют различное происхождение, т.е. не встречаются в естественных условиях в такой комбинации.

В контексте настоящего изобретения, т.е. в контексте настоящего описания, понятия «пептид», «полипептид», «белок» и вариации этих понятий относятся к пептиду, олигопептиду, олигомеру или белку, включая слитый белок, соответственно, содержащему по меньшей мере две аминокислоты, сцепленные друг с другом предпочтительно с помощью обычной пептидной связи, или альтернативно этому, с помощью модифицированной пептидной связи, такой, например, как связь в изостерических пептидах. Пептид, полипептид или белок может состоять из L-аминокислот и/или D-аминокислот. Предпочтительно пептид, полипептид или белок либо (полностью) состоит из L-аминокислот, либо (полностью) состоит из D-аминокислот, образуя тем самым «ретро-инвертированные пептидные последовательности». Понятие «ретро-инвертированные (пептидные) последовательности» относится к изомеру линейной пептидной последовательности, в которой направление последовательности является обратным (реверсированным) и хиральность каждого аминокислотного остатка изменена на противоположную (является инвертированной) (см., например, Jameson и др., Nature, 368, 1994, cc. 744-746; Brady др., Nature, 368, 1994, cc. 692-693). В частности, понятия «пептид», «полипептид», «белок» включают также «пептидомиметики», которые обозначают пептидные аналоги, содержащие непептидные структурные элементы, указанные пептиды обладают способностью имитировать или антагонизировать биологическое(ие) действие(я) встречающегося в естественных условиях родительского пептида. У пептидомиметика отсутствуют классические характеристики пептида, такие как расщепляемые ферментами пептидные связи. В частности, пептид, полипептид или белок может содержать аминокислоты, отличные от тех 20 аминокислот, которые определяются генетическим кодом, в дополнение к указанным аминокислотам, или он может состоять из аминокислот, отличных от тех 20 аминокислот, которые определяются генетическим кодом. В частности, в контексте настоящего изобретения пептид, полипептид или белок может также состоять из аминокислот, модифицированных с помощью естественных процессов, таких как процессы пост-трансляционного созревания, или с помощью химических процессов, которые хорошо известны специалисту в данной области. Такие модификации подробно описаны в литературе. Эти модификации могут затрагивать любую область полипептида: пептидный скелет, аминокислотную цепь или даже карбокси- или аминоконцы. В частности, пептид или полипептид может быть разветвлен в результате убиквитинизации или может быть циклическим с разветвлением или без разветвления. Такой тип модификации может являться результатом естественных или искусственных пост-трансляционных процессов, которые хорошо известны специалисту в данной области. Понятия «пептид», «полипептид», «белок» в контексте настоящего изобретения включают, в частности, также модифицированные пептиды, полипептиды и белки. Например, модификации пептида, полипептида или белка могут включать ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное связывание с нуклеотидом или нуклеотидным производным, ковалентное связывание с липидом или липидным производным, ковалентное связывание с фосфатидилинозитом, ковалентное или нековалентное перекрестное сшивание, циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, гликозилирование, включая пэгилирование, гидроксилирование, йодизацию, метилирование, миристоилирование, окисление, протеолитические процессы, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование, присоединение аминокислот, такое как аргинилирование, или убиквитинизацию. Указанные модификации подробно описаны в литературе (Proteins Structure and Molecular Properties, 2-ое изд., под ред. Т.Е. Creighton, New York, 1993; Post-translational Covalent Modifications of Proteins, под ред. В.С. Johnson, изд-во Academic Press, New York, 1983; Seifter и др., Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors, Meth. Enzymol. 182, 1990, cc. 626-646, и Rattan и др., Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging, Ann NY Acad Sci, 663, 1992, cc. 48-62) .Таким образом, понятия «пептид», «полипептид», «белок» предпочтительно включают, например, липопептиды, липопротеины, гликопептиды, гликопротеины и т.п.

Однако в наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой «классический» пептид, полипептид или белок, где «классический» пептид, полипептид или белок, как правило, состоит из аминокислот, выбранных из 20 аминокислот, определяемых генетическим кодом, которые сцеплены друг с другом с помощью обычной пептидной связи.

Если комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой полипептид или белок, то предпочтительно он содержит по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 70, по меньшей мере 80, по меньшей мере 90, более предпочтительно по меньшей мере 100, по меньшей мере 110, еще более предпочтительно по меньшей мере 120, по меньшей мере 130, наиболее предпочтительно по меньшей мере 140 или наиболее предпочтительно по меньшей мере 150 аминокислотных остатков.

Компонент а) - Проникающий в клетку пептид

СРР позволяет эффективно доставлять, т.е. транспортировать и загружать, в частности, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп в антигенпрезентирующие клетки (АРС), в частности, в дендритные клетки (DC), что в результате обеспечивает механизм процессирования антигена дендритными клетками.

Понятие «проникающие в клетку пептиды» («СРР»), как правило, применяют для обозначения коротких пептидов, которые обладают способностью транспортировать различные типы карго-молекул («полезный груз») через плазматическую мембрану и в результате облегчать поглощение клетками различных карго-молекул (от наночастиц до небольших химических молекул и крупных фрагментов ДНК). «Клеточная интернализация» карго-молекул, связанных с проникающим в клетку пептидом, как правило, означает транспорт карго-молекулы через плазматическую мембрану и проникновение таким образом карго-молекулы в клетку. Затем в зависимости от конкретных обстоятельств карго-молекула может высвобождаться в цитоплазму, направляться к внутриклеточной органелле или также презентироваться на клеточной поверхности. Способность проникать в клетку или интернализация проникающего в клетку пептида или комплекса, содержащего указанный проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, можно оценивать стандартными методами, известными специалисту в данной области, включая проточную цитометрию или флуоресцентную микроскопию живых и фиксированных клеток, иммуноцитохимию клеток, трансдуцированных указанным пептидом или комплексом, и Вестерн-блоттинг.

Проникающие в клетку пептиды, как правило, имеют аминокислотную композицию, которая либо содержит в высоком относительном количестве положительно заряженные аминокислоты, такие как лизин или аргинин, либо имеют последовательность, которая содержит чередующуюся схему расположения полярных/заряженных аминокислот и неполярных, гидрофобных аминокислот. Указанные два типа структур обозначают как поликатионные или амфипатические соответственно. Проникающие в клетку пептиды имеют различные размеры, аминокислотные последовательности и заряды, но все СРР обладают общим свойством, представляющим собой способность к транслокации через плазматическую мембрану и облегчение доставки различных карго-молекул в цитоплазму или в органеллу клетки. В настоящее время теории транслокации СРР основаны на трех основных механизмах проникновения: непосредственное проникновение через мембрану, опосредуемое эндоцитозом проникновение и транслокация посредством образования транзиторной структуры. Трансдукция СРР относится к области, требующей дальнейшего исследования. Известно, что проникающие в клетку пептиды нашли многочисленные применения в медицине в качестве агентов, доставляющих лекарственные средства, при лечении различных заболеваний, включая рак, и ингибиторов вирусов, а также контрастных агентов для мечения и визуализации клеток.

Как правило, проникающие в клетку пептиды (СРР) представляют собой пептиды, состоящие из 8-50 остатков, которые обладают способностью пересекать клеточную мембрану и проникать в большинство клеточных типов. Альтернативно этому, их обозначают также как домен трансдукции белка (PTD), что отражает их источник в виде встречающихся в естественных условиях белков. Frankel и Pabo одновременно с Green и Lowenstein описали способность транс-активирующего активатора транскрипции из вируса иммунодефицита человека 1 (HIV-TAT) проникать в клетки (Frankel A.D. и C.O. Pabo, Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 55(6), 1988, cc. 1189-1193). В 1991 г. описана трансдукция в нервные клетки гомеодомена Antennapedia (ДНК-связывающий домен) из Drosophila melanogaster (Joliot А. и др., Antennapedia homeobox peptide regulates neural morphogenesis. Proc Natl Acad Sci USA, 88(5), 1991, cc. 1864-1868). В 1994 г. охарактеризован первый 16-мерный пептид СРР, обозначенный как пенетратин, который имеет аминокислотную последовательность RQIKIYFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1), из третьей спирали гомеодомена Antennapedia (Derossi D. и др., The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J Biol Chem, 269(14), 1994, cc. 10444-10450), после чего в 1998 г. идентифицирован минимальный домен ТАТ, имеющий аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2), необходимый для трансдукции белков (Vives Е., P. Brodin и В. Lebleu, A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem, 272(25), 1997, cc. 16010-16017). В течение двух последних десятилетий описано множество пептидов различного происхождения, включая вирусные белки, например, VP22 (Elliott G. и P. O'Hare, Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell, 88(2), 1997, cc. p.223-233) и белок ZEBRA (Rothe R. и др., Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator. J Biol Chem, 285(26), 2010, cc. 20224-20233), или из ядов, например, мелиттин (Dempsey С.Е., The actions of melittin on membranes. Biochim Biophys Acta, 1031(2), 1990, cc. 143-161), мастопоран (Konno K. и др., Structure and biological activities of eumenine mastoparan-AF (EMP-AF), a new mast cell degranulating peptide in the venom of the solitary wasp (Anterhynchium flavomarginatum micado). Toxicon, 38(11), 2000, cc. 1505-1515), маурокальцин (Esteve E. и др., Transduction of the scorpion toxin maurocalcine into cells. Evidence that the toxin crosses the plasma membrane. J Biol Chem, 280(13), 2005, cc. 12833-12839), кротамин (Nascimento F.D. и др., Crotamine mediates gene delivery into cells through the binding to heparan sulfate proteoglycans. J Biol Chem, 282(29), 2007, cc. 21349-21360) или буфорин (Kobayashi S. и др., Membrane translocation mechanism of the antimicrobial peptide buforin 2. Biochemistry, 43(49), 2004, cc.15610-15616). Созданы также синтетические СРР, включая полиаргинин (R8, R9, R10 и R12) (Futaki S. и др., Arginine-rich peptides. An abundant source of membrane-permeable peptides having potential as carriers for intracellular protein delivery. J Biol Chem, 276(8), 2001, cc. 5836-5840) или транспортан (Pooga M. и др., Cell penetration by transportan. FASEB J, 12(1), 1998, cc. 67-77). Любые из описанных выше СРР можно применять в качестве проникающего в клетку пептида, т.е. компонента а), в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению. В частности, компонент а), т.е. СРР, в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, может содержать минимальный домен ТАТ, который имеет аминокислотную последовательность YGRKKRRQRRR (SEQ ID NO: 2). В частности, компонент а), т.е. СРР, в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, может содержать пенетратин, который имеет аминокислотную последовательность RQIKIYFQNRRMKWKK (SEQ ID NO: 1).

Различные СРР, которые можно использовать в качестве проникающего в клетку пептида, т.е. компонента а), в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, описаны также в обзоре Milletti F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17, (15-16), 2012, cc. 850-860). Другими словами, СРР, описанные у Milletti F., Cell-penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860, можно применять в качестве проникающего в клетку пептида, т.е. компонента а), в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению. Они включают, в частности, катионные СРР, амфипатические СРР и гидрофобные СРР, а также СРР, полученные из гепаран-, РНК- и ДНК-связывающих белков, (см. таблицу 1 у Millett F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860), СРР, полученные из сигнальных пептидов (см. таблицу 2 у Milletti F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860), СРР, полученные из антимикробных пептидов (см. таблицу 3 у Millett F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860), СРР, полученные из вирусных белков (см. таблицу 4 у Millett F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860), СРР, полученные из различных природных белков (см. таблицу 5 у Millett F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860), а также сконструированные СРР и СРР, полученные из пептидных библиотек (см. таблицу 6 у Millett F., Cell-penetrating peptides penetrating: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today 17 (15-16), 2012, cc. 850-860).

Предпочтительно проникающий в клетку пептид, который содержится в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению,

I) имеет длину аминокислотной последовательности указанного пептида, составляющую в целом 5-50 аминокислот, предпочтительно в целом 10-45 аминокислот, более предпочтительно в целом 15-45 аминокислот; и/или

II) имеет аминокислотную последовательность, содержащую фрагмент минимального домена белка ZEBRA, где указанный минимальный домен простирается от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3, в которой необязательно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, или вариант последовательности указанного фрагмента.

Таким образом, предпочтительно проникающий в клетку пептид, который содержится в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению,

Указанные предпочтительные СРР описаны в WO 2014/041505.

Понятие «ZEBRA» (которое имеет также обозначения Zta, Z, ЕВ1 или BZLF1), как правило, обозначает основанный на «лейциновой молнии» (bZIP) активатор транскрипции вируса Эпштейна-Барра (EBV). Минимальный домен ZEBRA, который обладает способностью проникать в клетку, идентифицирован в виде домена, простирающегося от остатка 170 до остатка 220 ZEBRA. Аминокислотная последовательность ZEBRA представлена в NCBI, код доступа YP_401673, и содержит 245 аминокислотных остатков, указанных в SEQ ID NO: 3:

(SEQ ID NO: 3 - аминокислотная последовательность ZEBRA (встречающаяся в естественных условиях последовательность из вируса Эпштейна-Барра (EBV)) (YP_401673)).

В настоящее время описано, что СРР из вирусного белка ZEBRA трансдуцирует карго-белки через биологические мембраны как путем (I) непосредственной транслокации, так и путем (II) опосредуемого липидным рафтом (плотом) эндоцитоза (Rothe R., Liguori L., Villegas-Mendez A., Marques В., Grunwald D., Drouet E. и др. Characterization of the cell-penetrating properties of the Epstein-Barr virus ZEBRA trans-activator. The Journal of biological chemistry 285(26), 2010, cc. 20224-20233). При создании настоящего изобретения высказано предположение о том, что эти два механизма проникновения должны усиливать рестриктированную по ГКГС как класса I, так и класса II, презентацию карго-антигенов CD8⁺ - и CD4⁺-Т-клеткам соответственно. Таким образом, указанный СРР может доставлять полиэпитопные пептиды к дендритным клеткам (DC), и затем усиливать активацию CTL и Th-клеток и противоопухолевую функцию. Таким образом, указанный СРР может эффективно доставлять комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, к антигенпрезентирующим клеткам (АРС) и приводить к рестриктированной по ГКГС класса I и II презентации полиэпитопных антигенов.

В контексте настоящего изобретения понятие «ГКГС класса I» обозначает один из двух основных классов молекул главного комплекса гистосовместимости. Молекулы ГКГС класса I (которые обозначают также как «ГКГС I») обнаружены на каждой имеющей ядро клетке организма. Функция ГКГС класса I состоит в презентации эпитопа цитотоксическим клеткам (CTL). У людей молекулы ГКГС класса I состоят из двух полипептидных цепей, α- и β2-микроглобулина (b2m). Только α-цепь является полиморфной и кодируется геном HLA, а b2m-субъединица не является полиморфной и кодируется геном бета-2 микроглобулина. В контексте настоящего изобретения понятие «ГКГС класса II» означает другой основной класс молекул главного комплекса гистосовместимости. Молекулы ГКГС класса II (которые обозначают также как ГКГС II») обнаружены только в небольшом количестве специализированных клеточных типов, включая макрофаги, дендритные клетки и В-клетки, которые все относятся к антигенпрезентирующим клеткам (АРС).

Предпочтительно вариант последовательности фрагмента минимального домена ZEBRA, описанного выше, характеризуется, в частности по всей длине, идентичностью аминокислотной последовательности, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, с аминокислотной последовательностью фрагмента минимального домена ZEBRA, описанного выше, без аннулирования способности проникающего в клетку пептида проникать в клетку. В частности, под «фрагментом» минимального домена ZEBRA, описанного выше, предпочтительно подразумевается его укороченная последовательность, т.е. аминокислотная последовательность, укороченная на N-конце, С-конце и/или внутри последовательности по сравнению с аминокислотной последовательностью нативной последовательности. Кроме того, указанный «фрагмент» минимального домена ZEBRA предпочтительно в целом состоит из 5-50 аминокислот, предпочтительно в целом состоит из 10-45 аминокислот, более предпочтительно в целом состоит из 15-45 аминокислот.

Таким образом, понятие «вариант последовательности» в контексте настоящего изобретения, т.е. в настоящей заявке, относится к любому изменению в референс-последовательности. Понятие «вариант последовательности» включает варианты нуклеотидной последовательности и варианты аминокислотной последовательности. Предпочтительно референс-последовательность представляет собой любую из последовательностей, указанную в «Таблице последовательностей и номеров SEQ ID» (Перечень последовательностей), т.е. SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 94. Предпочтительно вариант последовательности характеризуется, в частности по всей длине последовательности, идентичностью последовательности, составляющей по меньшей мере 70%, по меньшей мере 75%, предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%, с референс-последовательностью, где идентичность последовательности рассчитывают указанным ниже методом. В частности, вариант последовательности сохраняет специфическую функцию референс-последовательности. Идентичность последовательности рассчитывают с помощью описанного ниже метода. В частности, вариант аминокислотной последовательности имеет измененную последовательность, в которой одна или несколько аминокислот в референс-последовательности удалена(ы) или заменена(ы), или одна или несколько аминокислот встроена(ы) в последовательность аминокислотной референс-последовательности. В результате изменений вариант аминокислотной последовательности имеет аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99%, идентична референс-последовательности. Например, варианты последовательностей, идентичные по меньшей мере на 90%, имеют не более 10 изменений, т.е. любую комбинацию делеций, инсерций или замен, на 100 аминокислот референс-последовательности.

В контексте настоящего изобретения подразумевается, что аминокислотная последовательность «характеризуется идентичностью последовательности», составляющей, например, по меньшей мере 95%, с запрашиваемой аминокислотной последовательностью, предлагаемой в настоящем изобретении, означает, что последовательность рассматриваемой аминокислотной последовательности идентична запрашиваемой последовательности за исключением того, что рассматриваемая аминокислотная последовательность может включать вплоть до 5 аминокислотных изменений на каждые 100 аминокислот запрашиваемой аминокислотной последовательности. Другими словами, для получении аминокислотной последовательности, имеющей последовательность, идентичную по меньшей мере на 95% запрашиваемой аминокислотной последовательности, вплоть до 5% (5 из 100) аминокислотных остатков в рассматриваемой последовательности можно встраивать или заменять на другую аминокислоту или изымать путем делеции, предпочтительно в соответствии с приведенными выше определениями вариантов или фрагментов. Это же, естественно, применимо также к сходству нуклеотидных последовательностей.

Для (аминокислотных или нуклеотидных) последовательностей, не имеющих точного соответствия, «% идентичности» первой последовательности можно определять относительно второй последовательности. В целом, эти две последовательности, подлежащие сравнению, выравнивают для получения максимальной корреляции между последовательностями. Это может включать встраивание «брешей» в любую одну или обе последовательности для повышения степени выравнивания. Затем можно определять % идентичности по всей длине каждой из сравниваемых последовательностей (так называемое глобальное выравнивание), что наиболее пригодно для последовательностей одинаковой или сходной длины, или для более коротких определенных длин (так называемое локальное выравнивание), что наиболее пригодно для последовательностей неодинаковой длины.

Методы сравнения идентичности и гомологии двух или большего количества последовательностей хорошо известны в данной области. Процент идентичности двух последовательностей можно определять, например, с помощью математического алгоритма. Предпочтительным примером математического алгоритма, который можно применять, является (но, не ограничиваясь только ими) алгоритм, описанный у Karlin и др., PNAS USA, 90, 1993, cc. 5873-5877. Указанный алгоритм интегрирован в семейство программ BLAST, например, программу BLAST или NBLAST (см. также Altschul и др., J. Mol. Biol. 215, 1990, cc. 403-410 или Altschul и др., Nucleic Acids Res, 25, 1997, cc. 3389-3402), доступные через домашнюю страницу NCBI в Интернете ncbi.nlm.nih.gov), и FASTA (Pearson, Methods Enzymol. 183, 1990, cc. 63-98; Pearson и Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85, 1988, cc. 2444-2448.). С помощью указанных программ можно идентифицировать последовательности, идентичные в определенной степени другим последовательностям. Кроме того, программы доступны в Wisconsin Sequence Analysis Package, версия 9.1 (Devereux и др., Nucleic Acids Res., 1984, cc. 387-395), например, программы BESTFIT и GAP, которые можно применять для определения % идентичности между двумя полинуклеотидами и % идентичности и % гомологии или идентичности между двумя полипептидными последовательностями. В BESTFIT применяют алгоритм «локальной гомологии», предложенный Smith и Waterman, J. Mol. Biol. 147, 1981, cc. 195-197.), и этот алгоритм позволяет находить наилучшую единичную область сходства между двумя последовательностями.

Более предпочтительно фрагменты проникающего в клетку пептида, предлагаемого в изобретении, или их варианты, описанные выше, сохраняют также способность пептида презентировать карго-молекулу, такую как антигены или антигенные эпитопы, на поверхности клетки в контексте молекул ГКГС класса I и/или ГКГС класса II. Способность проникающего в клетку пептида или комплекса, содержащего указанный проникающий в клетку пептид, презентировать на поверхности клетки карго-молекулу, такую как антигены или антигенные эпитопы, в контексте молекул ГКГС класса I и/или ГКГС класса II можно оценивать стандартными методами, известными специалисту в данной области, включая оценку способности стимулировать пролиферацию и/или функцию ограниченных по ГКГС CD4⁺- или CD8⁺-T-клеток, обладающих специфичностью в отношении этих эпитопов.

Предпочтительным является проникающий в клетку пептид, который

II) имеет аминокислотную последовательность, содержащую фрагмент минимального домена ZEBRA, где указанный минимальный домен простирается от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3, в которой необязательно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, или вариант указанного фрагмента,

предпочтительно содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену по сравнению с референс-последовательностью, это означает, что данный аминокислотный остаток заменен на остаток, имеющий сходные физико-химические характеристики.

Как правило, замены одной или нескольких аминокислот, присутствующих в аминокислотной референс-последовательности, должны представлять собой консервативные замены. Примеры консервативных замен включают замену одного алифатического остатка на другой, например, замену друг на друга Ile, VaI, Leu или Ala, или замены одного полярного остатка на другой, например, замены друг на друга Lys и Arg; Glu и Asp или Gln и Asn. Хорошо известны и другие указанные консервативные замены, например, замены полных областей, имеющих сходные гидрофобные свойства (Kyte и Doolittle, 1J. Mol. Biol. 157(1), 1982, cc. 105-132). Замены одной или нескольких L-аминокислот на одну или несколько D-аминокислот могут рассматриваться в качестве консервативных замен в контексте настоящего изобретения. Примеры аминокислотных замен представлены ниже в таблице 1:

В наиболее предпочтительном варианте предпочтительным является проникающий в клетку пептид, который

II) имеет аминокислотную последовательности, содержащую фрагмент минимального домена ZEBRA, где указанный минимальный домен простирается от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3, в которой необязательно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, или вариант указанного фрагмента,

содержит замену Cys (С) на Ser (S) в положении, эквивалентном положению 189 в аминокислотной последовательности ZEBRA, представленной в SEQ ID NO: 3.

Таким образом, предпочтительно, чтобы указанный предпочтительный проникающий в клетку пептид имел аминокислотную последовательность, содержащую последовательность следующей общей формулы (I):

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁SX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇

в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку, в которой

X₁ обозначает K, R или Н, предпочтительно X₁ обозначает K или R;

Х₂ обозначает R, K или Н, предпочтительно Х₂ обозначает R или K;

Х₃ обозначает Y, W или F, предпочтительно Х₃ обозначает Y, W или F;

Х₄ обозначает K, R или Н, предпочтительно Х₄ обозначает K или R;

Х₅ обозначает N или Q;

Х₆ обозначает R, K или Н, предпочтительно Х₆ обозначает R или K;

Х₇ обозначает V, I, М, L, F или А, предпочтительно Х₇ обозначает V, I, М или L;

X₈ обозначает А, V, L, I или G, предпочтительно X₈ обозначает А или G;

Х₉ обозначает S или Т;

Х₁₀ обозначает R, K или Н, предпочтительно Х₁₀ обозначает R или K;

Х₁₁ обозначает K, R или Н, предпочтительно Х₁₁ обозначает K или R;

X₁₃ обозначает R, K или Н, предпочтительно Х₁₃ обозначает R или K;

Х₁₄ обозначает А, V, L, I или G, предпочтительно Х₁₄ обозначает А или G;

Х₁₅ обозначает K, R или Н, предпочтительно Х₁₅ обозначает K или R;

Х₁₆ обозначает F, L, V, I, Y, W или М, предпочтительно Х₁₆ обозначает F, Y или W; и

Х₁₇ обозначает K, R или Н, предпочтительно Х₁₇ обозначает K или R.

Предпочтительно указанный пептид, полипептид или белок состоит либо (полностью) из L-аминокислот, либо (полностью) из D-аминокислот, образуя «ретро-инвертированные пептидные последовательности». Понятие «ретро-инвертированные (пептидные) последовательности» относится к изомеру линейной пептидной последовательности, в которой направление последовательности является обратным и хиральность каждого аминокислотного остатка изменена на противоположную (см., например, Jameson и др., Nature, 368, 1994, cc. 744-746; Brady др., Nature, 368, 1994, cc. 692-693).

В конкретном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, как правило, описывается указанной выше общей формулой (I), в которой аминокислотный остаток в положении, эквивалентном положению 12 в общей формуле (I), представляет собой Ser (S).

Предпочтительно также предпочтительный проникающий в клетку пептид, который

содержит или состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из группы, которая состоит из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4-13 или вариантов указанных последовательностей, не аннулирующих способность указанного пептида проникать в клетку, предпочтительно из вариантов последовательности, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку.

СРР1 (Z11):

СРР2 (Z12):

СРР3 (Z13):

СРР4 (Z14):

СРР5 (Z15):

СРР6 (Z16):

СРР7 (Z17):

СРР8 (Z18):

СРР9 (Z19):

СРР10 (Z20):

Таким образом, особенно предпочтительным является проникающий в клетку пептид, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13), SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14), SEQ ID NO: 8 (CPP5/Z15) или SEQ ID NO: 11 (CPP8/Z18), или варианты этой последовательности, не аннулирующих способность указанного пептида проникать в клетку, предпочтительно варианты последовательности, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку. Кроме того, более предпочтительным является проникающий в клетку пептид, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13) или SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14) или вариантов указанной последовательности, не аннулирующих способность указанного пептида проникать в клетку, предпочтительно из вариантов последовательности, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку.

Кроме того, наиболее предпочтительным является проникающий в клетку пептид, который имеет аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13) или вариантов указанной последовательности, не аннулирующих способность указанного пептида проникать в клетку, предпочтительно вариантов последовательности, в которой 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот заменены, удалены путем делеции и/или добавлены без аннулирования способности указанного пептида проникать в клетку. Таким образом, наиболее предпочтительно, когда проникающий в клетку пептид содержит или состоит из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13), или функционального варианта последовательности, последовательность которого идентична по меньшей мере на 70%, предпочтительно последовательность которого идентична по меньшей мере на 75%, более предпочтительно последовательность которого идентична по меньшей мере на 80%, еще более предпочтительно последовательность которого идентична по меньшей мере на 90%, особенно предпочтительно последовательность которого идентична по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно последовательность которого идентична по меньшей мере на 99%. В этом контексте «функциональный вариант последовательности» означает вариант последовательности, у которого сохраняется способность пептида проникать в клетку.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит или состоит из SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13).

В другом предпочтительном варианте осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, имеет аминокислотную последовательность, которая содержит или состоит из SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14).

Как должно быть очевидно специалисту в данной области, первичная аминокислотная последовательность проникающего в клетку пептида, предлагаемого в изобретении, может быть подвергнута дополнительной посттрансляционной модификации, такой как гликозилирование или фосфорилирование, без отклонения от объема изобретения.

В следующем варианте осуществления изобретения проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, необязательно дополнительно содержит помимо его аминокислотной последовательности, описанной выше, любой из следующих компонентов или любую комбинацию следующих компонентов:

(I) сигнал ядерной локализации (NLS). Такие сигналы хорошо известны специалисту в данной области и описаны у Nair и др., Nucleic Acids Res. 31(1), 2003, cc. 397-399),

(II) нацеливающий (таргетирующий) пептид, включая пептиды хоминга опухолей, такие как описанные у Kapoor и др., PLoS ONE 7(4), 2012, е35187) и перечисленные в in-http://crdd.osdd.net/raghava/tumorhope/general.php?

Предпочтительно проникающий в клетку пептид, предлагаемый в изобретении, связан с антигеном или антигенным эпитопом и облегчает клеточную интернализацию указанного антигена или антигенного эпитопа.

Комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может содержать один проникающий в клетку пептид или несколько проникающих в клетку пептидов. Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит не более пяти проникающих в клетку пептидов, более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит не более четырех проникающих в клетку пептидов, еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит не более трех проникающих в клетку пептидов, наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит не более двух проникающих в клетку пептидов, и наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит один проникающий в клетку пептид.

Компонент б) - Антиген/антигенный эпитоп

Комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит в качестве компонента б) по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп.

В контексте настоящего описания «антиген» представляет собой субстанцию любой структуры, которая служит в качестве мишени для рецепторов, участвующих в адаптивном иммунном ответе, в частности, в качестве мишени для антител, Т-клеточных рецепторов и/или В-клеточных рецепторов. «Эпитоп», который называют также «антигенной детерминантой», представляет собой часть (или фрагмент) антигена, которая распознается иммунной системой, в частности, антителами, Т-клеточными рецепторами и/или В-клеточными рецепторами. Так, один антиген имеет по меньшей мере один эпитоп, т.е. один антиген имеет один или несколько эпитопов. В контексте настоящего изобретения понятие «эпитоп» применяют главным образом для обозначения Т-клеточных эпитопов, которые презентируются на поверхности антигенпрезентирующей клетки, где они связаны с главным комплексом гистосовметистимости (ГКГС). Т-клеточные эпитопы, которые презентируются молекулами ГКГС класса I, как правило, но не всегда, представляют собой пептиды, состоящие из 8-11 аминокислот, в то время как молекулы ГКГС класса II презентируют более длинные пептиды, как правило, но не всегда, состоящие из 12-25 аминокислот.

Предпочтительно в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп выбран из группы, которая состоит из: (I) пептида, полипептида или белка, (II) полисахарида, (III) липида, (IV) липопротеина или липопептида, (V) гликолипида, (VI) нуклеиновой кислота и (VII) низкомолекулярного лекарственного средства или токсина. Таким образом, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп может представлять собой пептид, белок, полисахарид, липид, их комбинацию, включающую липопротеины и гликолипиды, нуклеиновую кислоту (например, ДНК, siPHК, shPHК, антисмысловые олигонуклеотиды, ДНК-ловушка, плазмида), или низкомолекулярное лекарственное средство (например, циклоспорин А, паклитаксел, доксорубицин, метотрексат, 5-аминолевулиновая кислота), или любую их комбинацию, в частности, если в комплексе, предлагаемом в изобретении, содержится более одного антигена или антигенного эпитопа.

Очевидно, что по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп может содержать, например, по меньшей мере один, т.е. один или несколько пептидов, полипептидов или белков, связанных вместе, и/или по меньшей мере одну, т.е. одну или несколько нуклеиновых кислот, например, каждая из которых кодирует один пептид или полипептид. Кроме того, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп может представлять собой комбинацию белка, липида и/или полисахарида, включая липопротеины и гликолипиды. Так, в частности, если комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит более одного антигена или антигенного эпитопа, то он может содержать более одного пептида, полипептида или белка, более одного полисахарида, более одного липида, более одного липопротеина, более одного гликолипида, более одной нуклеиновой кислоты, более одного низкомолекулярного лекарственного средства или токсина, или их комбинацию.

Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, содержащий один или несколько эпитоп(ов), выбранный(ых) из ассоциированного с раком/опухолью антигена, специфического для рака/опухоли антигена и/или антигенного белка из патогена, включая антигенный белок из вирусов, бактерий, грибов, простейших и многоклеточных паразитов.

Более предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит из (I) по меньшей мере одного эпитопа патогена и/или (II) по меньшей мере одного ракового/опухолевого эпитопа, в частности, по меньшей мере из одного опухолевого эпитопа. Наиболее предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит по меньшей мере из одного ракового/опухолевого эпитопа, в частности, по меньшей мере из одного опухолевого эпитопа.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит только такой(ие) антиген(ы) или антигенный(ые) эпитоп(ы), который(ые) представляет(ют) собой ассоциированный(ые) с раком/опухолью антиген(ы), специфический(ие) для рака/опухоли антиген(ы) и/или раковый(ые)/опухолевый(ые) эпитоп(ы); в частности, представляющий(ие) собой ассоциированный(ые) с опухолью антиген(ы), специфический(ие) для опухоли антиген(ы) и/или опухолевый(ые) эпитоп(ы).

В контексте настоящего описания «раковый эпитоп» означает эпитоп из ассоциированного с раком антигена или из специфического для рака антигена. Соответственно «опухолевый эпитоп» означает эпитоп из ассоциированного с опухолью антигена или из специфического для опухоли антигена. Указанные эпитопы, как правило, являются специфическими (или ассоциированы с) для определенного типа рака/опухоли. В частности, ассоциированные с раком/опухолью (также связанные с раком/опухолью) антигены представляют собой антигены, которые экспрессируются как на раковых/опухолевых клетках, так и на здоровых клетках. Соответственно такие антигены в норме присутствуют с рождения (или даже до рождения). Соответственно существует шанс, что у иммунной системы разовьется самотолерантность к таким антигенам. В отличие от этого, специфические для рака/опухоли антигены представляют собой антигены, которые экспрессируются специфически раковыми/опухолевыми клетками, но не здоровыми клетками. Специфические для рака/опухоли антигены включают, в частности, неоантигены. В целом, неоантигены представляют собой антигены, которые не присутствовали ранее и поэтому являются «новыми» для иммунной системы. Неоантигены, как правило, являются результатом соматических мутаций. Касательно раковых/опухолевых, специфических для рака/опухоли неоантигенов, то они, как правило, не присутствуют до развития рака/опухоли, и специфические для рака/опухоли неоантигены, как правило, кодируются соматическими генными мутациями в раковых клетках/опухолевых клетках. Поскольку неоантигены являются новыми для иммунной системы, то считается, что риск самотолерантности к этим антигенам является существенно более низким, чем к ассоциированным с раком/опухолью антигенам. Однако каждый характерный для рака набор опухольспецифических мутаций, вероятно, является уникальным. Соответственно в контексте настоящего изобретения предпочтительно, чтобы указанные специфические для рака/опухоли антигены, в частности неоантигены, были идентифицированы у индивидуума с диагностированным колоректальным раком с помощью методов, известных специалисту в данной области, например, путем секвенирования ракового генома. После идентификации соответствующие специфические для рака/опухоли неоантигены и/или эпитопы специфических для рака/опухоли неоантигенов применяют в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению.

Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит один или несколько ассоциированных с раком/опухолью эпитопов и/или один или несколько ассоциированных с раком/опухолью антигенов (но предпочтительно не содержит специфические для рака/опухоли эпитопы). Предпочтительно также, чтобы комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержал один или несколько специфических для рака/опухоли эпитопов и/или один или несколько специфических для рака/опухоли антигенов (но предпочтительно не содержал ассоциированные с раком/опухолью эпитопы). Комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может также предпочтительно содержать как (I) один или несколько ассоциированных с раком/опухолью эпитопов и/или один или несколько ассоциированных с раком/опухолью антигенов, так и (II) один или несколько специфических для рака/опухоли эпитопов и/или один или несколько специфических для рака/опухоли антигенов.

В частности, рак/опухоль, с которым/которой ассоциированы антигены или антигенные эпитопы, или для которого/которой антигены или антигенные эпитопы являются специфическими, представляет собой колоректальный рак, указанный в настоящем описании. Так, антигены предпочтительно представляют собой CRC-ассоциированные или CRC-специфические антигены, а эпитопы предпочтительно представляют собой CRC-ассоциированные или CRC-специфические эпитопы.

Сведения о приемлемых раковых/опухолевых эпитопах можно почерпнуть, например, в базах данных раковых/опухолевых эпитопов, например, у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4⁺- или CD8⁺-T-клетками, классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных «Tantigen» (TANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/). Примеры раковых/опухолевых эпитопов включают, например, полученные из TRP2-эпитопы, эпитопы антигена гликопротеина 100 (gp100), ассоциированного с меланомой, эпитопы антигена гликопротеина 70 (gp70), эпитопы сурвивина, IEa-эпитопы, IL13rα2, Epha2 (эфриновый рецептор 2 типа А), их иммуногенные фрагменты и слияния указанных антигенов и/или фрагментов. Кроме того, примеры раковых/опухолевых эпитопов включают эпитопы неоантигенов, таких, например, как неоантиген из опухолевых клеток линии МС-38, описанный у Yadav и др., Nature, 515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576. Как описано выше, неоантигены представляют собой антигены, которые полностью отсутствуют в геноме здорового человека. По сравнению с немутантными аутоантигенами неоантигены актуальные для контроля опухоли, поскольку на качество Т-клеточного пула, доступного для этих антигенов, не влияет центральная Т-клеточная толерантность. В частности, основой неоантигенов могут быть индивидуальные опухолевые геномы. Потенциальные неоантигены можно предсказывать методами, известными специалисту в данной области, такими как секвенирование ракового генома или технологии глубокого секвенирования, позволяющие идентифицировать мутации в кодирующей белок области (ракового) генома.

Конкретными примерами ассоциированных с раком/опухолью, в частности связанных с опухолью или тканеспецифических антигенов, которые можно применять в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, являются (но, не ограничиваясь только ими) следующие антигены: Her-2/neu, SPAS-1, TRP-2, тирозиназа, Melan A/Mart-1, gp1OO, BAGE, GAGE, ганглиозид GM2, кинезин 2, ТАТА-элемент модулирующего фактора 1, опухолевый белок D52, MAGE D, ING2, HIP-55, TGF-1 антиапоптозный фактор, HOM-Mel-40/SSX2, эпителиальный антиген (LEA 135), антиген DF31MUC1 (Apostolopoulos и др., Immunol. Cell. Biol. 74, 1996, сс. 457-464; Pandey и др., Cancer Res. 55, 1995, сс. 4000-4003); MAGE-1, HOM-Mel-40/SSX2, NY-ESO-1, EGFR, CEA, Epha2, Epha4, PCDGF, HAAH, мезотелин; EPCAM; NY-ESO-1, гликопротеин MUC1 и муцины NIUC10 p5 (особенно мутантные версии), EGFR, ассоциированный с раком сывороточный антиген (CASA) и раковый антиген 125 (СА 125) (Kierkegaard и др., Gynecol. Oncol. 59, 1995, сс. 251-254), эпителиальный гликопротеин 40 (EGP40) (Kievit и др., Int. J. Cancer 71, 1997, сс. 237-245), антиген плоскоклеточной карциномы (SCC) (Lozza и др., Anticancer Res. 17, 1997, сс. 525-529), катепсин Е (Mota и др., Am. J Pathol. 150, 1997, сс. 1223-1229), тирозиназа в меланоме (Fishman и др., Cancer 79, 1997, сс. 1461-1464), ядерный антиген клеток (PCNA) церебральных каверном (Notelet и др., Surg. Neurol. 47, 1997, сс. 364-370), ассоциированный с опухолью аутоантиген 35 kD в папиллярной тиреоидной карциноме (Lucas и др., Anticancer Res. 16, 1996, сс. 2493-2496), CDC27 (включая мутантную форму белка), антигены триозофосфатизомеразы, 707-АР, микобактериальный антиген А60 (Macs и др., J. Cancer Res. Clin. Oncol. 122, 1996, сс. 296-300), аннексин II, AFP, ART-4, BAGE, β-катенин/m, BCL-2, bcr-abl, bcr-abl p190, bcr-abl p210, BRCA-1, BRCA-2, CA 19-9 (Tolliver и O'Brien, South Med. J. 90, 1997, cc. 89-90; Tsuruta и др., Urol. Int. 58, 1997, cc. 20-24), CAMEL, CAP-1, CASP-8, CDC27/m, CDK-4/m, CEA (Huang и др., Exper Rev. Vaccines 1, 2002, cc. 49-63), CT9, CT10, Cyp-B, Dek-cain, DAM-6 (MAGE-B2), DAM-10 (MAGE-B1), EphA2 (Zantek и др., Cell Growth Differ. 10, 1999, cc. 629-638; Carles-Kinch и др., Cancer Res. 62, 2002, cc. 2840-2847), EphA4 (Cheng и др., Cytokine Growth Factor Rev. 13, 2002, cc. 75-85), ассоциированный с опухолью антиген Томсена-Фриденрайха (Dahlenborg и др., Int. J Cancer 70, 1997, cc. 63-71), ELF2M, ETV6-AML1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7B, GAGE-8, GnT-V, gp100 (Zajac и др., Int. J Cancer 71, 1997, cc. 491-496), HAGE, HER2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, hTRT, iCE, ингибиторы апоптоза (например, сурвивин), антиген аденокарциномы KH-1 (Deshpande и Danishefsky, Nature 387, 1997, cc. 164-166), KIAA0205, K-ras, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-6, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE D, MART-1, MART-1/Melan-A (Kawakami и Rosenberg, Int. Rev. Immunol. 14, 1997, cc. 173-192), MC1R, MDM-2, миозин/m, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, нео-полиА-полимераза, NA88-A, NY-ESO-1, NY-ESO-1a (CAG-3), PAGE-4, PAP, протеиназа 3 (Molldrem и др., Blood 88, 1996, cc. 2450-2457; Molldrem и др., Blood 90, 1997, cc. 2529-2534), P15, p190, Pm1/RARα, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RAS, RCAS1, RU1, RU2, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SP17, SPAS-1, TEL/AML1, TPI/m, тирозиназа, TARP, TRP-1 (gp75), TRP-2, TRP-2/INT2, WT-1 и альтернативно транслируемые белки NY-ESO-ORF2 и CAMEL, полученные из генов NY-ESO-1 и LAGE-1. Кроме того, другим конкретным примером ассоциированного с раком/опухолью, в частности связанного с опухолью или тканеспецифического антигена, который можно применять в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, является антиген ASCL2 (гомолог Achaete-щита 2 (Achaete-scute 2, гены, обусловливающие отсутствие сенсорных волос щита). В данной области хорошо известны многочисленные другие раковые антигены.

Предпочтительно раковый/опухолевый антиген или раковый/опухолевый эпитоп представляет собой рекомбинантный раковый/опухолевый антиген или рекомбинантный раковый/опухолевый эпитоп. Указанный рекомбинантный раковый/опухолевый антиген или рекомбинантный раковый/опухолевый эпитоп можно создавать путем интродукции мутаций (добавление, делеция или замена), которые изменяют конкретные аминокислоты во всей аминокислотной последовательности нативного ракового/опухолевого антигена или нативного ракового/опухолевого эпитопа. Интродукция мутаций не изменяет раковый/опухолевый антиген или раковый/опухолевый эпитоп столь сильно, чтобы его уже нельзя было применять в качестве универсального для видов млекопитающих и предпочтительно человека или собак, но изменяют его в достаточной степени, чтобы образовавшаяся аминокислотная последовательность нарушала толерантность или рассматривалась в качестве чужеродного антигена для создания иммунного ответа. Другим путем может являться создание консенсусного рекомбинантного ракового/опухолевого антигена или ракового/опухолевого эпитопа, аминокислотная последовательность которого идентична по меньшей мере на 85% и вплоть до 99% последовательности соответствующего нативного ракового/опухолевого антигена или нативного ракового/опухолевого эпитопа; предпочтительно идентичность последовательности составляет по меньшей мере 90% и вплоть до 98% и; более предпочтительно идентичность последовательности составляет по меньшей мере 93% и вплоть до 98%; или еще более предпочтительно идентичность последовательности составляет по меньшей мере 95% и вплоть до 98%. В некоторых случаях аминокислотная последовательность рекомбинантного ракового/опухолевого антигена или рекомбинантного ракового/опухолевого эпитопа идентична на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% последовательности соответствующего нативного ракового/опухолевого антигена или нативного ракового/опухолевого эпитопа. Нативный раковый/опухолевый антиген представляет собой антиген, ассоциированный в норме с конкретным раком или конкретной раковой опухолью. В зависимости от ракового/опухолевого антигена консенсусная последовательность ракового/опухолевого антигена может присутствовать в видах млекопитающих или в подтипах видов или вирусных штаммах или серотипах. Некоторые раковые/опухолевые антигены не отличаются значительно от аминокислотной последовательности дикого типа ракового/опухолевого антигена. Вышеописанные подходы можно объединять так, чтобы конечный рекомбинантный раковый/опухолевый антиген или раковый/опухолевый эпитоп имел указанный выше процент сходства с аминокислотной последовательностью нативного ракового антигена. Однако предпочтительно аминокислотная последовательность эпитопа ракового/опухолевого антигена, указанного в настоящем описании, не является мутантной и, следовательно, является идентичной референс-последовательности эпитопа.

В контексте настоящего описания понятие «эпитоп патогена» означает эпитоп антигенного белка, антигенного полисахарида, антигенного липида, антигенного липопротеина или антигенного гликолипида из патогена, включая вирусы, бактерии, грибы, простейших и многоклеточных паразитов. Антигенные белки, полисахариды, липиды, липопротеины или гликолипиды из патогенов включают в контексте настоящего описания белки, полисахариды, липиды, липопротеины и гликолипиды соответственно из патогенов, ответственных за заболевания, которые могут являться мишенью для вакцинации, включая, например, амебиаз, сибирскую язву, язву Бурули (Mycobacterium ulcerans), ассоциированную с калицивирусом диарею, кампилобактериальную диарею, рак шейки матки (папилломатоз человека), ассоциированные с Chlamydia trachomatis болезни половой системы, холеру, геморрагическую лихорадку Крым-Конго, лихорадку Денге, дифтерию, геморрагическую лихорадку Эбола, диарею, связанную с энтеропатогенной кишечной палочкой (ЕТЕС), рак желудка (Helicobacter pylori), гонорею, болезни, ассоциированные со стафилококком группы А, болезни, ассоциированные со стафилококком группы В, пневмонию и инвазивное заболевание, связанное с Haemophilus influenzae В, диарею, связанную с вирусом гепатита А, гепатита В, гепатита С, гепатита Е, генитальные язвы, связанные с вирусом герпеса простого типа 2, ВИЧ/СПИД, болезнь, связанную с нематодами, грипп, японский энцефалит, лихорадку Ласса, лейшманиоз, лептоспироз, рак печени (гепатит В), рак печени (гепатит С), болезнь Лайма, малярию, геморрагическую лихорадку Марбург, корь, эпидемический паротит, назофарингеальный рак (вирус Эпштейна-Барра), менингит, связанный с Neisseria meningitidis, пневмонию, связанную с вирусом парагриппа, коклюш, чуму, полиомиелит, бешенство, пневмонию, связанную с респираторно-синцитиальным вирусом (RSV), лихорадку Рифт-Валли, диарею, связанную с ротавирусом, краснуху, шистосомоз, серьезный острый респираторный синдром (SARS), шигеллез, оспу, болезни, ассоциированные с Staphylococcus aureus, рак желудка (Helicobacter pylori), стрептококковую пневмонию и инвазивное заболевание, столбняк, клещевой энцефалит, трахому, туберкулез, туляремию, тифозную лихорадку, болезнь, ассоциированную с вирусом Западного Нила, желтую лихорадку.

Предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп должен презентироваться на клеточной поверхности в контексте ГКГС класса I и/или ГКГС класса II, и/или в контексте CD1, при этом презентация на клеточной поверхности в контексте ГКГС класса I и/или ГКГС класса II является предпочтительной. Понятие «презентация эпитопа в контексте ГКГС класса I» относится, в частности, к CD8⁺-эпитопу, расположенному в (пептидсвязывающей) бороздке молекулы ГКГС класса I на поверхности клетки. Понятие «презентация эпитопа в контексте ГКГС класса II» относится, в частности, к CD4⁺-эпитопу, расположенному в бороздке молекулы ГКГС класса II на поверхности клетки. Понятие «презентация эпитопа в контексте CD1» относится, в частности, к липидному эпитопу, расположенному в бороздке молекул кластера дифференцировки 1 на поверхности клетки.

Целесообразно, чтобы комплекс, предлагаемый для применения согласно изобретению, содержал проникающий в клетку пептид и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и обеспечивал транспорт и презентацию указанных эпитопов на клеточной поверхности антигенпрезентирующих клеток в контексте ГКГС класса I и ГКГС класса II, и что делает возможным его применение для вакцинации и иммунотерапии.

Предпочтительно комплекс, предназначенный для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, который представляет собой по меньшей мере один CD4⁺-эпитоп и/или по меньшей мере один CD8⁺-эпитоп.

Понятия «CD4⁺-эпитоп» или «CD4⁺-рестриктированный эпитоп» в контексте настоящего описания означают эпитоп, распознаваемый CD4⁺-T-клеткой, указанный эпитоп, в частности, состоит из фрагмента антигена, расположенного в бороздке молекулы ГКГС класса II. Единичный CD4⁺-эпитоп, содержащийся в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, предпочтительно состоит примерно из 12-25 аминокислот. Он может состоять, например, примерно из 8-25 аминокислот или примерно из 6-100 аминокислот.

Понятия «CD8⁺-эпитоп» или «CD8⁺-рестриктированный эпитоп» в контексте настоящего описания означают эпитоп, распознаваемый CD8⁺-T-клеткой, указанный эпитоп, в частности, состоит из фрагмента антигена, расположенного в бороздке молекулы ГКГС класса I. Единичный CD8⁺-эпитоп, содержащийся в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, предпочтительно состоит примерно из 8-11 аминокислот. Он может состоять, например, примерно из 8-15 аминокислот или примерно из 6-100 аминокислот.

Предпочтительно по меньшей мере один антиген может содержать или по меньшей мере один антигенный эпитоп может состоять из CD4⁺-эпитопа и/или CD8⁺-эпитопа, соответствующего антигенной(ым) детерминанте(ам) ассоциированного с раком/опухолью антигена, специфического для рака/опухоли антигена или антигенного белка из патогена. Более предпочтительно по меньшей мере один антиген может содержать или по меньшей мере один антигенный эпитоп может состоять из CD4⁺-эпитопа и/или CD8⁺-эпитопа, соответствующего антигенной(ым) детерминанте(ам) ассоциированного с раком/опухолью антигена или специфического для рака/опухоли антигена. Наиболее предпочтительно по меньшей мере один антиген может содержать или по меньшей мере один антигенный эпитоп может состоять из CD4⁺-эпитопа и/или CD8⁺-эпитопа, соответствующего антигенной(ым) детерминанте(ам) ассоциированного с опухолью антигена или специфического для опухоли антигена.

Предпочтительно также комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа, где по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит из CD4⁺-эпитопа и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит из CD8⁺-эпитопа. В настоящее время установлено, что T_h-клетки (CD4⁺) играют основную роль в противоопухолевом иммунном ответе, участвуя как в «лицензировании» DC, так и в рекрутменте и поддержании CTL (CD8⁺) в области опухоли. Таким образом, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, который содержит по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа, где по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит из CD4⁺-эпитопа и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп содержит или состоит из CD8⁺-эпитопа, обеспечивает интегрированный иммунный ответ, позволяющий одновременно примировать CTL и T_h-клетки, и поэтому является предпочтительным по сравнению с иммунитетом против только одного CD8⁺-эпитопа или только одного CD4⁺-эпитопа. Например, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может предпочтительно содержать Еальфа-CD4⁺-эпитоп и gp100-CD8⁺-эпитоп.

Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа, где по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа содержат или состоят по меньшей мере из двух, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или большего количества CD4⁺-эпитопов и/или по меньшей мере из двух, например, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или большего количества CD8⁺-эпитопов. При этом, по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа предпочтительно представляют собой различные антигены или антигенные эпитопы, более предпочтительно по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа отличаются друг от друга, но относятся к одному типу опухоли. Полиантигенная вакцина должна (I) предотвращать избыточный рост вариантов без антигена, (II) таргетировать различные опухолевые клетки в гетерогенной опухолевой массе и (III) преодолевать вариабельность опухолей от пациента к пациенту. Таким образом, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, наиболее предпочтительно содержит по меньшей мере четыре антигена или антигенных эпитопа, в частности, по меньшей мере два CD8⁺-эпитопа и по меньшей мере два CD4⁺-эпитопа. Указанный комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, индуцирует синергетическую функциональную активность полиэпитопных CD8-CTL и CD4-T_h-клеток в отношении опухолевых клеток и усиливает эффективность противоопухолевого иммунитета. T_h-клетки участвуют также в поддержании длительного клеточного иммунитета, который обнаружен при осуществлении мониторинга после вакцинации. Указанный комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, индуцирует поликлональные полиэпитопные иммунные ответы и многофункциональные CD8⁺- и CD4⁺-T-клетки, и поэтому обладает эффективной противоопухолевой активностью.

Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере два антигена или антигенных эпитопа, более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере три антигена или антигенных эпитопа, еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере четыре антигена или антигенных эпитопа, еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере пять антигенов или антигенных эпитопов, наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере шесть антигенов или антигенных эпитопов. Антигены или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, могут быть одинаковыми или различными, предпочтительно антигены или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, отличаются друг от друга. Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один CD4⁺-эпитоп и по меньшей мере один CD8⁺-эпитоп.

Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит более одного CD4⁺-эпитопа, например, два или большее количество CD4⁺-эпитопов из одного и того же антигена или из различных антигенов, и предпочтительно не содержит CD8⁺-эпитоп. Предпочтительно также комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит более одного CD8⁺-эпитопа, например, два или большее количество CD8⁺-эпитопов из одного и того же антигена или из различных антигенов, и предпочтительно не содержит CD4⁺-эпитоп. Однако наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит (I) по меньшей мере один CD4⁺-эпитоп, например, два или большее количество CD4⁺-эпитопов из одного и того же антигена или из различных антигенов, и (II) по меньшей мере один CD8⁺-эпитоп, например, два или большее количество CD8⁺-эпитопов из одного и того же антигена или из различных антигенов.

Например, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может предпочтительно содержать gp100-CD8⁺-эпитоп, Еальфа-CD4⁺-эпитоп и дополнительный CD4⁺-эпитоп и дополнительный CD8⁺-эпитоп. Еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может содержать полипептид или белок, содержащий gp100-CD8⁺-эпитоп и Еальфа-CD4⁺-эпитоп. Например, указанный полипептид или белок, содержащийся в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 14, или вариантов указанной последовательности, указанных выше:

SEQ ID NO: 14 (MAD5-карго-молекула, содержащая эпитопы OVA-CD4⁺, gp100-CD8⁺, Еальфа-CD4⁺ и OVA-CD8⁺).

Например, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может предпочтительно содержать gp70-CD8⁺-эпитоп и/или gp70-CD4⁺-эпитоп. Еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может содержать полипептид или белок, содержащий gp70-CD8⁺-эпитоп и/или gp70-CD4⁺-эпитоп. Например, указанный полипептид или белок, содержащийся в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 43, или из вариантов указанной последовательности, указанных выше:

SEQ ID NO: 43 (Mad8-карго-молекула, содержащая эпитопы gp70-CD8⁺ и gp70-CD4⁺).

Например, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может предпочтительно содержать по меньшей мере один эпитоп сурвивина, такой как CD8⁺-эпитоп сурвивина и/или CD4⁺-эпитоп сурвивина. Более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может содержать полипептид или белок, содержащий CD8⁺-эпитоп сурвивина и/или CD4⁺-эпитоп сурвивина. Более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может содержать полипептид или белок, содержащий более одного CD8⁺-эпитопа сурвивина и/или более одного CD4⁺-эпитопа сурвивина, например, два различных CD8⁺-эпитопа сурвивина. Например, указанный полипептид или белок, содержащийся в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 44, или из вариантов указанной последовательности, указанных выше:

SEQ ID NO: 44 (Mad11-карго-молекула, содержащая CD8⁺-эпитоп 1 сурвивина и CD8⁺-эпитоп 2 сурвивина).

Например, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может предпочтительно содержать по меньшей мере один эпитоп из неоантигена. Еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может содержать полипептид или белок, содержащий эпитоп из неоантигена, такого как неоантиген из опухолевых клеток линии МС-38, идентифицированный Yadav и др. Nature. 515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576. Например, указанный полипептид или белок, содержащийся в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 42, или вариантов указанной последовательности, указанных выше:

SEQ ID NO: 42 (Mad9-карго-молекула, содержащая эпитоп из неоантигена, описанного у Yadav и др. Nature, 515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576).

Например, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может предпочтительно содержать более одного, например, два или три эпитопа из неоантигенов. Еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может содержать полипептид или белок, содержащий более одного, например, два или три эпитопа из неоантигенов, таких как неоантигены из опухолевых клеток линии МС-38, идентифицированные Yadav и др. Nature, 515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576. Например, указанный полипептид или белок, содержащийся в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 63, или вариантов указанной последовательности, указанных выше:

SEQ ID NO: 63 (Mad12-карго-молекула, содержащая эпитоп из неоантигена, описанного у Yadav и др. Nature, 515(7528), 27 ноября 2014 г., сс. 572-576). Предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, содержащийся в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой пептид, полипептид или белок. Примеры антигена или антигенного эпитопа пептидной, полипептидной или белковой природы, которые можно применять в изобретении, включают раковые/опухолевые антигены или их антигенные эпитопы, аллергические антигены или их антигенные эпитопы, аутоиммунные аутоантигены или их антигенные эпитопы, антиогены патогенов или их антигенные эпитопы, и антигены или их антигенные эпитопы из вирусов, предпочтительно из таких вирусов, как цитомегаловирус (CMV), ортопоксивирус натуральной оспы, ортопоксивирус белой оспы, парапоксивирус овец, вирус контагиозного моллюска, вирус герпеса простого 1, вирус герпеса простого 2, вирус герпеса В, варицелла-зостер вирус, вирус псевдобешенства, человеческий цитомегаловирус, человеческий вирус герпеса 6, человеческий вирус герпеса 7, вирус Эпштейна-Барра, человеческий вирус герпеса 8, вирус гепатита В, вирус лихорадки Чикунгунья, вирус лихорадки О'Ньонг-Ньонг, рубивирус, вирус гепатита С, GB-вирус С, вирус Западного Нила, вирус Денге, вирус желтой лихорадки, вирус энцефаломиелита овец, вирус энцефалита Сент-Луис, вирус японского энцефалита В, вирус Повассан, FSME-вирус, SARS, SARS-ассоциированный короновирус, человеческий короновирус 229Е, человеческий короновирус Ос43, торовирус, человеческий Т-клеточный лимфотропный вирус типа I, человеческий Т-клеточный лимфотропный вирус типа II, ВИЧ (СПИД), т.е. вирус иммунодефицита человека типа 1 или вирус иммунодефицита человека типа 2, вирус гриппа, вирус Ласса, вирус лимфоцитарного хориомененгита, вирус Такарибе, вирус Хунин, вирус Мачупо, вирус болезни Борна, вирус Буньямвера, вирус калифорнийского энцефалита, вирус лихорадки Рифт-Валли, вирус флеботомной лихорадки, вирус Тоскана, вирус геморрагической лихорадки Крым-Конго, вирус Хазара, вирус Хасан, вирус Хантаан, вирус Сеул, вирус проспекта Хилл, вирус Пуумала, вирус Добрава-Белград, вирус Тула, вирус Син Номбре, Марбург-вирус озера Виктория, вирус Эбола Заир, вирус Эбола Судан, вирус Эбола Берег Слоновой Кости, вирус гриппа А, вирус гриппа В, вирус гриппа С, вирус парагриппа, малярийный паразит (Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi), Марбург-вирус, вирус кори, вирус эпидемического паротита, респираторно-сцинтилляционный вирус, человеческий метапневмовирус, индийский вирус везикулярного стоматита, вирус бешенства, вирус Мокола, вирус Дувенхаге, европейский лисавирус летучих мышей 1+2, австралийский лисавирус летучих мышей, аденовирус A-F, вирус папилломы человека, вирус кондиломы 6, вирус кондиломы 11, вирус полиомы, аденоассоциированный вирус 2, ротавирус, орбивирус, вирус оспы, включая вирус ветряной оспы и т.д., или антигены или антигенные эпитопы из лейшманий, трипаносом, амеб, бактерий и т.д., или можно выбирать из эпитопов или из вариантов указанных выше антигенов или антигенных эпитопов. Предпочтительно эпитопы, а также варианты антигенов, указанных выше, характеризуются гомологией или идентичностью последовательности, составляющей примерно 10%, в частности, по меньшей мере 10%, примерно 20%, в частности, по меньшей мере 20%, примерно 30%, в частности, по меньшей мере 30%, примерно 40%, в частности, по меньшей мере 40%, примерно 50%, в частности, по меньшей мере 50%, примерно 60%, в частности, по меньшей мере 60%, примерно 70%, в частности, по меньшей мере 70%, примерно 80%, в частности, по меньшей мере 80%, примерно 90%, в частности, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или по меньшей мере 98%, с одним из антигенов или последовательностей антигенов, представленных или описанных выше. В этом контексте определения эпитопов и вариантов соответствуют указанным выше.

Примеры антигенов или антигенных эпитопов, относящихся к категории пептида, полипептида или белка, включают комбинацию нескольких эпитопов глиомы, например, описанных у Novellino и др., Cancer Immunol Immunother, 54(3), 2005, cc. 187-207, Vigneron и др. Cancer Immun. 13, 2013, с. 15). Однако индивидуальный комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может содержать также только поднабор, т.е. один или несколько из всех указанных эпитопов глиомы. В таком случае предпочтительно различные комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, содержат различные поднаборы всех указанных эпитопов глиомы, так что, например, вакцина, предлагаемая в настоящем изобретении, содержащая указанные различные комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, содержит все указанные эпитопы глиомы, но распределенные в различные комплексы.

Кроме того, комплекс, предлагаемый для применения согласно изобретению, может содержать также по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, где указанный антиген или антигенный эпитоп представляет собой полисахарид, липид, липопротеин и/или гликолипид, в частности, полисахаридный, липидный, липопротеиновый и/или гликолипидный эпитоп, который может, например, представлять собой эпитопы патогена, указанные в настоящем описании.

В частности, комплекс, предлагаемый для применения согласно изобретению, может содержать по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, где указанный антиген или антигенный эпитоп представляет собой полисахаридный, липидный, липопротеиновый и/или гликолипидный эпитоп, включая антигены или антигенные эпитопы вирусов, бактерий, грибов, простейших и многоклеточных паразитов.

Предпочтительно указанные эпитопы должны презентироваться на клеточной поверхности в контексте ГКГС класса I и/или ГКГС класса II.

Предпочтительно указанные липидные эпитопы должны презентироваться на клеточной поверхности в контексте CD1 (кластер дифференцировки 1).

Комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может содержать также по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, где указанный антиген или антигенный эпитоп представляет собой низкомолекулярное лекарственное средство или токсин.

Примеры карго-молекул, относящихся к категории низкомолекулярных лекарственных средств или токсинов, которые можно применять согласно изобретению, включают циклоспорин А, паклитаксел, доксорубицин, метотрексат, 5-аминолевулиновую кислоту, дифтерийный токсин, сунитиниб и молекулы, сведения о которых обобщены у De wit Amer, Neuro Oncol, 12(3), 2010, cc. 304-316.

Комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит более одного антигена или антигенного эпитопа, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большее количество антигенов или антигенных эпитопов, более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит (по меньшей мере) два или три антигена или антигенных эпитопа, еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит (по меньшей мере) четыре или пять антигенов или антигенных эпитопов.

Если в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, содержится более одного антигена или антигенного эпитопа, то очевидно, что указанный антиген или антигенный эпитоп, в частности, также ковалентно связан в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, например, с другим антигеном или антигенным эпитопом и/или с компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, и/или с компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR.

Различные антигены или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, могут быть одинаковыми или различными. Предпочтительно различные антигены или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, отличаются друг от друга, что приводит к образованию полиантигенного и/или полиэпитопного комплекса.

Кроме того, предпочтительно, чтобы более одного антигена или антигенного эпитопа, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большее количество антигенов или антигенных эпитопов, располагались последовательно в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению. Это означает, в частности, что все антигены и/или антигенные эпитопы, входящие в комплекс, располагаются в виде участка, который не прерывается ни компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, ни компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR. Предпочтительно компонент а) и компонент в) расположены в комплексе, например, перед или после такого участка, состоящего из всех антигенов и/или антигенных эпитопов. Однако антигены и/или антигенные эпитопы, расположенные таким последовательным образом, могут соединяться друг с другом, например, с помощью спейсера или линкера, описанного ниже, который не является ни компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, ни компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR.

Кроме того, предпочтительно также комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит один или несколько эпитопов антигена. Таким образом, комплекс предпочтительно содержит один или несколько эпитопов одного или нескольких антигенов. Например, комплекс может содержать один или несколько эпитопов первого антигена и один или несколько эпитопов второго антигена; или комплекс может содержать один или несколько эпитопов первого антигена, один или несколько эпитопов второго антигена и один или несколько эпитопов третьего антигена; или комплекс может содержать один или несколько эпитопов первого антигена, один или несколько эпитопов второго антигена, один или несколько эпитопов третьего антигена и один или несколько эпитопов четвертого антигена; и т.д. В предпочтительном варианте осуществления изобретения комплекс содержит более одного эпитопа одного или нескольких антигенов; более предпочтительно антигенные эпитопы одного антигена расположены последовательно (или перекрываются) в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению. Это означает, в частности, что все антигенные эпитопы одного антигена, входящие в комплекс, располагаются в виде участка, который не прерывается ни компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, ни компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR, ни любыми другими антигенными эпитопами (т.е. эпитопами из другого антигена).

Однако в альтернативном варианте различные антигены и/или антигенные эпитопы могут располагаться также любым иным образом в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, например, когда компонент а) и/или компонент в) расположены между двумя или большим количеством антигенов и/или антигенных эпитопов, т.е. один или несколько антигенов и/или антигенных эпитопов расположены между компонентом а) и компонентом в) (или наоборот), и необязательно один или несколько антигенов и/или антигенных эпитопов расположены соответственно на другом конце компонента а) и/или компонента в).

Очевидно, что несколько различных антигенов или антигенных эпитопов, связанных с колоректальным раком, целесообразно объединять в одном комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению. Альтернативно этому, несколько различных антигенов или антигенных эпитопов, связанных с колоректальным раком, можно подразделять на поднаборы различных антигенов или антигенных эпитопов, в частности, поднаборы, дополняющие друг друга в контексте колоректального рака, которые входят в различные комплексы, предлагаемые для применения согласно настоящему изобретению, при этом указанные различные комплексы, содержащие различные поднаборы, целесообразно вводить одновременно, например, в виде одной вакцины, индивидууму, который нуждается в этом.

Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один опухолевый эпитоп, представляющий собой эпитоп антигена, выбранного из группы, которая состоит из ЕрСАМ, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, СЕА, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART и IL13Rальфа2. Более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один опухолевый эпитоп, представляющий собой эпитоп антигена, выбранного из группы, которая состоит из ASCL2, ЕрСАМ, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, СЕА, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART и IL13Rальфа2. Указанные антигены являются особенно ценными в контексте колоректального рака. Предпочтительно также комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один антиген, выбранный из группы, которая состоит из ЕрСАМ, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, CEA, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART и IL13Rальфа2, или его фрагмента, или варианта последовательности опухолевого антигена или варианта последовательности его фрагмента. Предпочтительно также комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один опухолевый антиген, выбранный из группы, которая состоит из ASCL2, ЕрСАМ, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, CEA, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART и IL13Raльфa2, или его фрагмента, или варианта последовательности опухолевого антигена или варианта последовательности его фрагмента. В контексте настоящего описания «фрагмент» антигена содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот антигена, предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот антигена, более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот антигена, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот антигена и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот антигена. «Вариант последовательности», указанный выше, означает вариант последовательности, имеющий (аминокислотную) последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, более предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична референс-последовательности. «Функциональный» вариант последовательности означает в контексте антигена/фрагмента антигена/эпитопа, что функция эпитопа(ов), например, входящего(их) в антиген (фрагмент), не нарушена или не утрачена. При этом предпочтительно аминокислотная последовательность эпитопа(ов), например, входящего(их) в антиген (фрагмент), указанный в настоящем описании, не изменена в результате мутации и поэтому идентична референс-последовательности эпитопа.

Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы указанных антигенов известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4⁺- или CD8⁺-Т-клетками, классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных «Tantigen» (TANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).

Ep-CAM

Ер-Cam представляет собой гликопротеин, который опосредует клеточную адгезию. Аминокислотная последовательность ЕрСАМ представлена ниже:

Специалисту в данной области известно несколько эпитопов ЕрСАМ. Предпочтительный эпитоп ЕрСАМ, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности ЕрСАМ, и он подчеркнут в указанной выше последовательности ЕрСАМ; указанная ниже эпитопная последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):

Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 48, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании.

HER-2/neu

Her-2 принадлежит к семейству EGFR (рецептор эпидермального фактора роста). Специалисту в данной области известно много эпитопов HLA-A. Аминокислотная последовательность HER2 представлена ниже:

Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 70, или ее фрагмент или вариант, указанный в настоящем описании. Как описано выше, приемлемые раковые/опухолевые эпитопы Her-2 известны из литературы или их можно идентифицировать с использованием баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, в которых человеческие опухолевые антигены, распознаваемые CD4⁺- или CD8⁺-Т-клетками, классифицированы на 4 основные группы на основе схемы их экспрессии, или из базы данных «Tantigen» (TANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).

Муцин-1 (MUC-1)

MUC-1 представляет собой человеческий эпителиальный муцин, оказывающий воздействие на адгезию клеток. Аминокислотная последовательность MUC-1 представлена ниже:

Специалисту в данной области известно несколько эпитопов MUC-1. Предпочтительные эпитопы MUC-1, которые предпочтительно входят в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, включает следующие эпитопы (представленные ниже последовательности эпитопов представляют собой фрагмент вышеуказанной последовательности MUC-1, и они подчеркнуты в указанной выше последовательности MUC-1; каждая из указанных ниже эпитопных последовательностей может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):

Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 50, и/или аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 51.

ТОММ34

ТОММ34 участвует в импорте белков-предшественников в митохондрии. Специалисту в данной области известно много его этипотов.

RNF43

RNF43 представляет собой Е3-убиквитинлигазу и, вероятно, содержит трансмембранный домен, ассоциированный с протеазой домен, эктодомен и цитоплазматический RING-домен. Вероятно, RNF43 обеспечивает отрицательную регуляцию передачи сигналов Wnt, и экспрессия RNF43 приводит к повышению убиквитинизации рецепторов Фрайззлед, изменяет их субклеточное распределение, что приводит к пониженному уровню этих рецепторов на поверхности. Специалисту в данной области известно много его этипотов.

KOC1

KOC1, также известный как мРНК-связывающий белок 3 инсулиноподобного фактора роста 2 (IGF2BP3), представляет собой мРНК-связывающий белок. Однако отсутствуют данные о его экспрессии.

Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF)/рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGFR)

Сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF), который первоначального называли фактором сосудистой проницаемости (VPF), представляет собой сигнальный белок, продуцируемый клетками, которые стимулируют васкулогенез и ангиогенез. Он является частью системы, которая восстанавливает поставку кислорода к тканям, когда нарушается циркуляция крови. Обычная функция VEGF состоит в создании новых кровеносных сосудов в процессе эмбрионального развития, новых кровеносных сосудов после повреждения мышц в результате физической нагрузки и новых сосудов (коллатеральное кровообращение) для обхода блокированных сосудов. Известно три основных подтипа рецепторов для VEGF (VEGFR), а именно, VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3.

Бета-субъединица человеческого хорионического гонадотропина (βhCG)

Человеческий хорионический гонадотропин (hCG) представляет собой гормон, продуцируемый эмбрионом после имплантации. Некоторые раковые опухоли продуцируют этот гормон; поэтому обнаруженные повышенные уровни у пациентки, которая не является беременной, могут способствовать диагностике рака. hCG является гетердимером, у которого α- (альфа)-субъединица идентична субъединице лютеинизирующего гормона (LH), фолликулостимулирующего гормона (FSH), тиреотропного гормона (TSH), а β- (бета)-субъединица является уникальной для hCG. β-субъединица hCG гонадотропина (бета-hCG) содержит 145 аминокислот и кодируется шестью высоко гомологичными генами.

Сурвивин

Сурвивин, который называют также бакуловирусным ингибитором мотива апоптозных повторов 5 или BIRC5, является представителем семейства ингибиторов апоптоза (IAP). Функции белка сурвивина состоят в ингибировании активации каспазы, что приводит к отрицательной регуляции апоптоза или запрограммированной гибели клеток. Аминокислотная последовательность сурвивина представлена ниже:

Специалисту в данной области известно несколько эпитопов сурвивина. Предпочтительный эпитоп сурвивина, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности сурвивина, и он подчеркнут в указанной выше последовательности сурвивина; указанная ниже эпитопная последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):

Таким образом, предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит эпитоп сурвивина. Более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот (предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 аминокислот), или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности). Еще более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 53. Наиболее предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности).

Карциноэмбриональный антиген (CEA)

СЕА представляет собой внутриклеточный адгезионный гликопротеин. СЕА в норме продуцируется тканью желудочно-кишечной системы в процессе эмбрионального развития, но его производство прекращается перед рождением. Таким образом, СЕА, как правило, присутствует лишь в очень невысоких уровнях в крови здоровых взрослых. Аминокислотная последовательность СЕА представлена ниже:

Специалисту в данной области известно несколько эпитопов СЕА. Предпочтительные эпитопы СЕА, которые предпочтительно входят в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, включает следующие эпитопы (представленные ниже последовательности эпитопов представляют собой фрагмент вышеуказанной последовательности СЕА, и они подчеркнуты в указанной выше последовательности СЕА; каждая из указанных ниже эпитопных последовательностей может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):

Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 55, и/или аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 56.

Таким образом, предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит эпитоп СЕА. Более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот (предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 аминокислот), или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности). Еще более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 55, и/или пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 56. Наиболее предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 96, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности).

Рецептор трансформирующего рост фактора бета 2 (TGFβR2)

TGFβ-рецепторы представляют собой пронизывающие клеточную мембрану один раз серин/треонинкиназные рецепторы. Они присутствуют в нескольких различных изоформах. TGFβR2 представляет собой трансмембранный белок, который содержит протеинкиназный домен, образует гетеродимерный комплекс с другим рецепторным белком и связывается с TGF-бета. Указанный комплекс рецептор/лиганд фосфорилирует белки, которые затем проникают в ядро и регулируют транскрипцию поднабора генов, связанных с клеточной пролиферацией.

Р53

Р53 представляет собой белок-супрессор опухоли, который играет роль в предупреждении мутаций генома. Р53 обладает несколькими механизмами противоракового действия и играет роль в апоптозе, стабильности генома и ингибировании ангиогенеза. Противораковую функцию р53 осуществляет посредством нескольких механизмов: он активирует белки репарации ДНК, когда ДНК существенно повреждена; он может прекращать рост путем удерживания клеточного цикла в точке регуляции G1/S при распознавании повреждения ДНК; и он может инициировать апоптоз.

Kirsten-подтип Ras (KRas)

ГТФаза KRas, известная как вирусный онкогенный гомолог саркомы крыс V-Ki-ras2 Kirsten и KRAS, выполняет важную функцию в передаче сигналов в здоровой ткани, и мутация гена KRAS является важной стадией в развитии многих типов рака. Подобно другим представителям подсемейства ras, белок KRAS представляет собой ГТФазу и является ранним участником многих путей трансдукции сигнала. KRAS, как правило, связан с клеточной мембраной благодаря присутствию изопреновой группы на его С-конце. Аминокислотная последовательность KRas представлена ниже:

Специалисту в данной области известно несколько эпитопов Kirsten Ras. Предпочтительный эпитоп Kirsten Ras, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности Kirsten Ras, и он подчеркнут в указанной выше последовательности Kirsten Ras; указанная ниже эпитопная последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):

О-связанная N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)-трансфераза (OGT)

OGT (О-связанная N-ацетилглюкозамин (GlcNAc)-трансфераза, O-GlcNAc-трансфераза, OGTase, О-связанная N-ацетилглюкозаминилтрансфераза, уридиндифосфо-N-ацетилглюкозамин:полипептид бета-N-ацетилглюкозаминилтрансферазы, белок О-связанной бета-N-ацетилглюкозаминтрансферазы) представляет собой фермент, имеющий систематическое (номенклатурное) название «УДФ-N-ацетил-D-глюкозамин:белок-O-бета-N-ацетил-D-глюкозаминил-трансфераза)». OGT катализирует добавление одного N-ацетилглюкозамина в О-гликозидную связь к остаткам серина или треонина внутриклеточных белков. OGT является компонентом «хозяйских» биологических функций в организме человека. OGT участвует в устойчивости к инсулину в мышечных клетках и адипоцитах путем ингибирования фосфорилирования треонина 308 AKT1, повышает скорость IRS1-фосфорилирования (на серине 307 и серине 632/635), снижает трансдукцию инсулинового сигнала и гликозилирование компонентов пути трансдукции инсулинового сигнала. Кроме того, OGT катализирует внутриклеточное гликозилирование остатков серина и треонина путем добавления N-ацетилглюкозамина. Исследования продемонстрировали, что аллели OGT являются жизненно важными для эмбриогенеза, и OGT необходима для внутриклеточного гликозилирования и жизнеспособности эмбриональных стволовых клеток. OGT катализирует также пост-трансляционную модификацию, которая изменяет факторы транскрипции и РНК-полимеразу II, однако конкретная функция этой модификации в целом неясна.

Каспаза 5 (CASP5)

Каспаза 5 представляет собой фермент, который протеолитически расщепляет другие белки в остатке аспарагиновой кислоты, и принадлежит к семейству цистеиновых протеаз, которые называют каспазами. Она относится к провоспалительным каспазам наряду с каспазой 1, каспазой 4 и мышиной каспазой 4, гомологом каспазы 11, и играет роль в функции иммунной системы.

Колоректальный ассоциированный с опухолью антиген-1 (СОА-1)

СОА-1 идентифицирован в 2003 г. Maccalli с соавторами (Maccall, С. и др., Identification of a colorectal tumor-associated antigen (COA-1) recognized by CD4(+) T lymphocytes. Cancer Res, 63(20), 2003, cc. 6735-6743) в качестве белка с с высоким уровнем экспрессии в колоректальных клетках и клетках меланомы (данные не представлены). Его мутация может влиять на способность дифференцированно распознавать опухолевые и здоровые клетки.

Ассоциированный с меланомой антиген (MAGE)

Представители семейства генов MAGE (ассоциированный с меланомой антиген) из организма млекопитающих первоначально были описаны как полностью молчащие в тканях здоровых взрослых, за исключением мужских зародышевых клеток, и иногда в плаценте. В противоположность этому, указанные гены экспрессируются в различных видах опухолей. Таким образом, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно содержит антиген MAGE-семейства («MAGE»-антиген) или его эпитоп. Из семейства MAGE предпочтительными являются, в частности, MAGE-А3 и MAGE-D4, и наиболее предпочтительным является MAGE-A3. Нормальная функция MAGE-А3 в здоровых клетках неизвестна. MAGE-А3 представляет собой специфический для опухоли белок, и он идентифицирован на многих опухолях. Аминокислотная последовательность MAGE-А3 представлена ниже:

Специалисту в данной области известно несколько эпитопов MAGE-A3. Предпочтительный эпитоп MAGE-A3, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности MAGE-A3, и он подчеркнут в указанной выше последовательности MAGE-A3; указанная ниже эпитопная последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):

Антиген плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками (SART)

Среди семейства SART наиболее предпочтительным является SART-3. Таким образом, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, предпочтительно содержит антиген из SART-семейства (антиген «SART») или его эпитоп; комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, более предпочтительно содержит SART-3 или его эпитоп. Антиген 3 плоскоклеточной карциномы, распознаваемый Т-клетками, несет опухолевые эпитопы, обладающие способностью индуцировать HLA-A24-рестриктированные и опухоль специфические цитотоксические Т-лимфоциты у больных раком пациентов. SART-3, вероятно, участвует в регуляции сплайсинга мРНК.

IL13Rальфа2

IL13Rальфа2 связывается с интерлейкином 13 (IL-13) с очень высокой аффинностью (и может поэтому секвестировать его), но не обусловливает связывание с IL-4. Он действует в качестве негативного регулятора и IL-13, и IL-4, однако его механизм действия пока не установлен. Аминокислотная последовательность IL13Rальфа2 представлена ниже:

Специалисту в данной области известно несколько эпитопов IL13Rальфа2. Предпочтительный эпитоп IL13Rальфа2, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности IL13Rальфа2, и он подчеркнут в указанной выше последовательности IL13Rальфа2; указанная ниже эпитопная последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):

ASCL2 (гомолог Achaete-шита 2)

ASCL2 представляет собой фактор транскрипции с основным доменом типа спираль-петля-спираль, важный для поддержания пролиферирующих трофобластов во время развития плаценты. Установлено, что ASCL2 является возможным регулятором пролиферации, для которого характерна сверхэкспрессия при неоплазме кишечника. Аминокислотная последовательность ASCL2 представлена ниже:

Специалисту в данной области известно несколько эпитопов ASCL2. Предпочтительный эпитоп ASCL2, который предпочтительно входит в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, включает следующий эпитоп (представленная ниже последовательность эпитопа представляет собой фрагмент вышеуказанной последовательности ASCL2, и он подчеркнут в указанной выше последовательности ASCL2; указанная ниже эпитопная последовательность может соответствовать одному эпитопу или нескольким (перекрывающимся) эпитопам):

Таким образом, предпочтительный комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержат аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 93, и/или аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 94.

Таким образом, предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит эпитоп ASCL2. Более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот (предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 аминокислот), или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности). Еще более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 93, и/или пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 94. Наиболее предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 97, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности).

Предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один опухолевый эпитоп, который представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, MUC-1, сурвивина, СЕА, KRas, MAGE-A3 и IL13Raльфa2, такой как эпитоп, имеющий любую из SEQ ID NO: 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60 и 62; предпочтительно, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один опухолевый эпитоп, который представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, MUC-1, сурвивина, СЕА, KRas, MAGE-A3, IL13Rальфа2 и ASCL2, такой как эпитоп, имеющий любую из SEQ ID NO: 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60, 62, 93 и 94; более предпочтительно по меньшей мере один опухолевый эпитоп представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, MUC-1, сурвивина, СЕА, KRas и MAGE-А3, такой как эпитоп, имеющий любую из SEQ ID NO 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58 и 60; более предпочтительно по меньшей мере один опухолевый эпитоп представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, MUC-1, сурвивина, СЕА, KRas, MAGE-А3 и ASCL2, такой как эпитоп, имеющий любую из SEQ ID NO: 48, 50, 51, 53, 55, 56, 58, 60, 93 и 94; еще более предпочтительно по меньшей мере один опухолевый эпитоп представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, MUC-1, сурвивина и СЕА, такой как эпитоп, имеющий любую из SEQ ID NO: 48, 50, 51, 53, 55 и 56; еще более предпочтительно по меньшей мере один опухолевый эпитоп представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, MUC-1, сурвивина, СЕА и ASCL2, такой как эпитоп, имеющий любую из SEQ ID NO: 48, 50, 51, 53, 55, 56, 93 и 94; и наиболее предпочтительно по меньшей мере один опухолевый эпитоп представляет собой эпитоп антигена, выбранного из группы, состоящей из ЕрСАМ, сурвивина, СЕА и ASCL2, такой как эпитоп, имеющий любую из SEQ ID NO: 48, 53, 55, 56, 93 и 94.

Предпочтительным является также комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, который содержит

I) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

II) один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;

III) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей;

IV) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей;

V) один или несколько эпитопов KRas (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 58) или функциональные варианты их последовательностей; и/или

VI) один или несколько эпитопов MAGE-А3 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей.

VII) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

VIII) один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;

IX) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей;

X) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей;

XI) один или несколько эпитопов KRas (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 58) или функциональные варианты их последовательностей;

XII) один или несколько эпитопов MAGE-А3 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей; и/или

XIII) один или несколько эпитопов ASCL2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 93, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 94) или функциональные варианты их последовательностей.

Как описано выше, дополнительные эпитопы этих антигенов (в дополнение к приведенным в качестве примера эпитопам) легко можно получить из баз данных раковых/опухолевых эпитопов, например, описанных у van der Bruggen P., Stroobant V., Vigneron N., Van den Eynde B. Peptide database: T cell-defined tumor antigens. Cancer Immun, 2013; URL: http://www.cancerimmunity.org/peptide/, или из базы данных «Tantigen» (TANTIGEN, версия 1.0, 1 декабря 2009 г., созданной Bioinformatics Core at Cancer Vaccine Center, Dana-Farber Cancer Institute; URL: http://cvc.dfci.harvard.edu/tadb/).

«Вариант последовательности» представляет собой описанный выше вариант, а именно, вариант последовательности имеет (аминокислотную) последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична референс-последовательности. «Функциональный» вариант последовательности означает в контексте эпитопа, что функция в качестве эпитопа не нарушается или не элиминируется. Однако предпочтительно аминокислотная последовательность эпитопа ракового/опухолевого антигена, указанного в настоящем описании, не изменена в результате мутации, и, следовательно, идентична референс-последовательности эпитопа.

- фрагмент ЕрСАМ, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;

- фрагмент MUC-1, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;

- фрагмент сурвивина, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;

- фрагмент СЕА, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;

- фрагмент KRas, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности; и/или

- фрагмент MAGE-А3, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности.

- фрагмент ЕрСАМ, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;

- фрагмент MUC-1, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;

- фрагмент СЕА, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;

- фрагмент KRas, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности;

- фрагмент MAGE-А3, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности; и/или

- фрагмент ASCL2, содержащий один или несколько эпитопов или функциональный вариант его последовательности.

В контексте настоящего описания «фрагмент» антигена содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот антигена, предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот антигена, более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот антигена, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот антигена и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот антигена. Таким образом, фрагмент ЕрСАМ содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот ЕрСАМ (SEQ ID NO: 47); фрагмент MUC-1 содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот MUC-1 (SEQ ID NO: 49); фрагмент сурвивина содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ ID NO: 52), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ ID NO: 52), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ ID NO: 52), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ ID NO: 52) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот сурвивина (SEQ ID NO: 52); фрагмент СЕА содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот СЕА (SEQ ID NO: 54); фрагмент KRas содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот KRas (SEQ ID NO: 57); фрагмент MAGE-A3 содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот MAGE-А3 (SEQ ID NO: 59), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот MAGE-A3 (SEQ ID NO: 59), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот MAGE-А3 (SEQ ID NO: 59), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот MAGE-А3 (SEQ ID NO: 59) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот MAGE-A3 (SEQ ID NO: 59). Кроме того, фрагмент ASCL2 содержит по меньшей мере 10 последовательно расположенных аминокислот ASCL2 (SEQ ID NO: 92), предпочтительно по меньшей мере 15 последовательно расположенных аминокислот ASCL2 (SEQ ID NO: 92), более предпочтительно по меньшей мере 20 последовательно расположенных аминокислот ASCL2 (SEQ ID NO: 92), еще более предпочтительно по меньшей мере 25 последовательно расположенных аминокислот ASCL2 (SEQ ID NO: 92) и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 последовательно расположенных аминокислот ASCL2 (SEQ ID NO: 92).

Функциональный вариант последовательности указанного фрагмента имеет (аминокислотную) последовательность, которая по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, предпочтительно по меньшей мере на 80%, более предпочтительно по меньшей мере на 85%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 95%, наиболее предпочтительно по меньшей мере на 99% идентична референс-последовательности, и эпитопная функция по меньшей мере одного, предпочтительно всех, эпитопа(ов), входящих во фрагмент, сохраняется.

Предпочтительно указанный комплекс содержит

XIV) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

XV) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей; и

XVI) один или несколько эпитопов MAGE-А3 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или IL13Rальфа2. Более предпочтительно, указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или IL13Rальфа2.

Предпочтительно также указанный комплекс содержит

XVII) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

XVIII) один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;

XIX) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий to SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей; и

XX) один или несколько эпитопов MAGE-А3 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или IL13Rальфа2. Более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или IL13Rальфа2.

Предпочтительно также указанный комплекс содержит

XXI) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

XXII) один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;

XXIII) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей; и

XXIV) один или несколько эпитопов KRas (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 58) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2. Более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивин, TGFβR2, р53, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2.

Предпочтительно также указанный комплекс содержит

XXV) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

XXVI) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей;

XXVII) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей; и

XXVIII) один или несколько эпитопов MAGE-А3 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или IL13Rальфа2. Более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или IL13Rальфа2.

Предпочтительно также указанный комплекс содержит

XXIX) один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;

XXX) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей; и

XXXI) один или несколько эпитопов MAGE-А3 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 60) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: ЕрСАМ, HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, СЕА, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или IL13Rальфа2. Более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, ЕрСАМ, HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, СЕА, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, SART или IL13Rальфа2.

Более предпочтительно указанный комплекс содержит

XXXII) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

XXXIII) один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;

XXXIV) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей; и/или

XXXV) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2. Более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2.

Более предпочтительно указанный комплекс содержит

XXXVI) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

XXXVII) один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;

XXXVIII) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей;

XXXIX) один или несколько эпитопов ASCL2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 93, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 94) или функциональные варианты их последовательностей; и/или

XL) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.

Более предпочтительно указанный комплекс содержит

XLI) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

XLII) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей;

XLIII) один или несколько эпитопов ASCL2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 93, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 94) или функциональные варианты их последовательностей; и/или

XLIV) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2.

Особенно предпочтительно указанный комплекс содержит

XLV) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

XLVI) один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей;

XLVII) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей; и

XLVIII) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.

Также особенно предпочтительно указанный комплекс содержит

XLIX) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей;

L) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей;

LI) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей; и

LII) один или несколько эпитопов ASCL2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 93, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 94) или функциональные варианты их последовательностей.

Также особенно предпочтительно указанный комплекс содержит

LIII) один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей;

LIV) один или несколько эпитопов MUC-1 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 50, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 51) или функциональные варианты их последовательностей; и

LV) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивин, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2. Более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, HER-2, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивин, TGFβR2, p53, KRas, OGT, CASP5, COA-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2.

Также особенно предпочтительно указанный комплекс содержит

LVI) один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей;

LVII) один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей; и

LVII) один или несколько эпитопов ASCL2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 93, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 94) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, ЕрСАМ, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2.

Еще более предпочтительно комплекс содержит в направлении от N-конца к С-концу:

- один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей;

- один или несколько эпитопов сурвивина (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 53) или функциональные варианты их последовательностей; и

- один или несколько эпитопов ASCL2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 93, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 94) или функциональные варианты их последовательностей.

Еще более предпочтительно комплекс содержит в направлении от N-конца к С-концу:

I) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот (предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 аминокислот), или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности);

II) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот (предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 аминокислот), или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности); и

III) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот (предпочтительно по меньшей мере 15 аминокислот, более предпочтительно по меньшей мере 20 аминокислот, еще более предпочтительно по меньшей мере 25 аминокислот и наиболее предпочтительно по меньшей мере 30 аминокислот), или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности).

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой дополнительный антиген или никакие дополнительные эпитопы антигенов, отличных от СЕА, сурвивина и ASCL2, более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой другой (опухолевый) эпитоп.

Предпочтительно в указанном комплексе С-конец (I) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент или вариант, непосредственно связан с N-концом (II) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент или вариант; и С-конец (II) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент или вариант, непосредственно связан с N-концом (III) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее фрагмент или вариант.

Еще более предпочтительно комплекс содержит в направлении от N-конца к С-концу:

I) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 96, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности);

II) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95 или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности); и

III) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 97, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности).

Предпочтительно в указанном комплексе С-конец (I) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 96, или ее вариант, непосредственно связан с N-концом (II) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95, или ее вариант; и С-конец (II) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95, или ее вариант, непосредственно связан с N-концом (III) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее вариант.

Наиболее предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 98, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности). Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой дополнительный антиген или никакие дополнительные эпитопы антигенов, отличных от СЕА, сурвивина и ASCL2, более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой другой (опухолевый) эпитоп.

Особенно предпочтительно также указанный комплекс содержит

- один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей; и

- один или несколько эпитопов СЕА (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 55, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 56) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2. Более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Raльфa2.

Особенно предпочтительно также указанный комплекс содержит

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, MUC-1, СЕА, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивин, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Raльфa2.

Особенно предпочтительно также указанный комплекс содержит

- один или несколько эпитопов ASCL2 (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 93, и/или эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 94) или функциональные варианты их последовательностей; и

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, ЕрСАМ, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивин, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Raльфa2.

Особенно предпочтительно также указанный комплекс содержит

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, MUC-1, ЕрСАМ, СЕА, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Raльфa2.

Особенно предпочтительно также указанный комплекс содержит

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, HER-2, ЕрСАМ, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Raльфa2.

Особенно предпочтительно также указанный комплекс содержит

- один или несколько эпитопов ЕрСАМ (например, эпитоп, имеющий SEQ ID NO: 48) или функциональные варианты их последовательностей.

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, СЕА, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Rальфа2. Более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, СЕА, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Raльфa2.

Особенно предпочтительно также указанный комплекс содержит

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: ЕрСАМ, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Raльфa2. Более предпочтительно указанный комплекс не содержит никакой из следующих эпитопов: ASCL2, ЕрСАМ, HER-2, MUC-1, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Raльфa2.

Особенно предпочтительно также указанный комплекс содержит

Указанный комплекс предпочтительно не содержит никакой из следующих эпитопов: ЕрСАМ, HER-2, MUC-1, СЕА, ТОММ34, RNF 43, KOC1, VEGFR, βhCG, сурвивина, TGFβR2, р53, KRas, OGT, CASP5, СОА-1, MAGE, SART или IL13Raльфa2.

Компонент в) - Пептидный агонист TLR

В комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, пептидный агонист TLR обеспечивает наряду с аутоиммуногенностью повышенный таргетинг вакцины к дендритным клеткам. Физическая связь пептидного агониста TLR с СРР и по меньшей мере одним антигеном или антигенным эпитопом, предлагаемым в настоящем изобретении, в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, обеспечивает повышенный иммунный ответ путем одновременной стимуляции антигенпрезентирующих клеток, в частности дендритных клеток, которые интернализируют, метаболизируют и экспонируют антиген(ы).

В контексте настоящего изобретения «пептидный агонист TLR» представляет собой агонист Толл-подобного рецептора (TLR), т.е. он связывается с TLR и активирует TLR, в частности, приводя к биологическому ответу. Кроме того, пептидный агонист TLR представляет собой пептид, полипептид или белок, описанный выше. Предпочтительно пептидный агонист TLR содержит от 10 до 150 аминокислот, более предпочтительно от 15 до 130 аминокислот, еще более предпочтительно от 20 до 120 аминокислот, еще более предпочтительно от 25 до 110 аминокислот и наиболее предпочтительно от 30 до 100 аминокислот.

Толл-подобные рецепторы (TLR) представляют собой трансмембранные белки, характеризующиеся наличием внеклеточных, трансмембранных и цитозольных доменов. Внеклеточные домены, содержащие богатые лейцином повторы (LRR) подковообразной формы, участвуют в распознавании стандартных молекулярных структур (паттернов) из разнообразных микробов. Толл-подобные рецепторы включают TLR 1-10. Соединения, обладающие способностью активировать TLR-рецепторы, и их модификации и производные, хорошо известны в данной области. TLR1 может активироваться бактериальными липопротеинами и их ацетилированными формами, TLR2 может в дополнение к указанному активироваться гликолипидами грамположительных бактерий, LPS, LPA, LTA, фимбриями, белками наружной мембраны, белками теплового шока из бактерий или из хозяина и липоарабиноманнанами микобактерий. TLR3 может активироваться dsPHК, в частности вирусного происхождения, или химическим соединением поли(LC). TLR4 может активироваться LPS, LTA грамотрицательных бактерий, белками теплового шока из хозяина или бактериального происхождения, белками покрытия или оболочки вирусов, таксолом или его производными, содержащими гиалуронан олигосахаридами и фибронектинами. TLR5 может активироваться бактериальными флагеллами или флагеллином. TLR6 может активироваться липопротеинами микобактерий и чувствительным к тепловой обработке растворимым фактором стрептококков группы В (GBS-F) или модулинами стафилококков. TLR7 может активироваться имидазохинолинами. TLR9 может активироваться комплексами неметилированный CpG-ДНК или хроматин-IgG.

Предпочтительно пептидный агонист TLR, входящий в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, является агонистом TLR1, 2, 4, 5, 6 и/или 10. TLR экспрессируются либо на клеточной поверхности (TLR1, 2, 4, 5, 6 и 10), либо на мембранах внутриклеточных органелл, таких как эндосомы (TLR3, 4, 7, 8 и 9). Известные встречающиеся в естественных условиях лиганды для эндосомальных рецепторов представляют собой молекулы на основе нуклеиновых кислот (за исключением TLR4). Экспрессируемые на клеточной поверхности TLR1, 2, 4, 5, 6 и 10 распознают молекулярные паттерны внеклеточных микробов (Monie Т.P., Bryant С.Е. и др., Activating immunity: Lessons from the TLRs and NLRs. Trends Biochem. Sci. 34(11), 2009, cc. 553-561). TLR экспрессируются на нескольких клеточных типах, но фактически все TLR экспрессируются на DC, обеспечивая этим специализированным клеткам чувствительность ко всем возможным патогенам и сигналам опасности.

При этом TLR2, 4 и 5 конститутивно экспрессируются на поверхности DC. Таким образом, пептидный агонист TLR, входящий в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, более предпочтительно представляет собой пептидный агонист TLR2, TLR4 и/или TLR5. Еще более предпочтительно пептидный агонист TLR представляет собой пептидный агонист TLR2 и/или пептидный агонист TLR4. Наиболее предпочтительно пептидный агонист TLR представляет собой пептидный агонист TLR4. Наиболее предпочтительно пептидный агонист TLR представляет собой пептидный агонист TLR, который является агонистом и TLR2, и TLR4. TLR2 может обнаруживать широкое разнообразие лигандов, полученных из бактерий, вирусов, паразитов и грибов. Специфичность лиганда часто определяют по взаимодействию TLR2 с другими TLR, такими как TLR1, 6 или 10, или не относящимися к TLR молекулами, такими как дектин-1, CD14 или CD36. Образование гетеродимера с TLR1 позволят TLR2 идентифицировать триацильные липопротеины или липопептиды (мико)бактериального происхождения, такие как Pam3CSK4 и пептидогликан (PGA; Gay N.J. и Gangloff М., Structure and function of Toll receptors and their ligands. Annu. Rev. Biochem. 76, 2007, cc. 141-165; Spohn R., Buwitt-Beckmann U. и др., Synthetic lipopeptide adjuvants and Toll-like receptor 2 - Structure-activity relationships. Vaccine 22(19), 2004, cc. 2494-2499). Гетеродимеризация TLR2 и 6 позволяет обнаруживать диацильные липопептиды и зимозан. Липополисахарид (LPS) и его производные являются лигандами для TLR4, а флагеллин для TLR5 (Bryant С.Е., Spring D.R. и др., The molecular basis of the host response to lipopolysaccharide. Nat. Rev. Microbiol. 8(1), 2010, cc. 8-14).

TLR2 взаимодействует с широким спектром обладающих структурным разнообразием лигандов, включая молекулы, экспрессируемые микробами и грибами. Идентифицировано множество агонистов TLR2, включая встречающиеся в естественных условиях и синтетические липопептиды (например, активирующий макрофаги липопептид Mycoplasma fermentas (MALP-2)), пептидогликаны (PG, например, из S. aureus), липополисахариды (LPS) из различных штаммов бактерий, полисахариды (например, зимозан), заякоренные гликозидфосфофатидилинозитолом структуры из грамположительных бактерий (например, липотейхоевая кислота (LTA) и липоарабиноманнан из микобактерий и липоманнаны из М. tuberculosis). Некоторые вирусные детерминанты могут также «запускаться» через TLR2 (Barbalat R., Lau L., Locksley R.M., Barton G.M. Toll-like receptor 2 on inflammatory monocytes induces type I interferon in response to viral but not bacterial ligands. Nat Immunol. 10(11), 2009, cc. 1200-1207). Бактериальные липопептиды являются структурными компонентами клеточных оболочек. Они состоят из ацилированного s-глицерилцистеинового остатка, с которым пептид может быть конъюгирован через цистеиновый остаток. Примеры агонистов TLR2, представляющих собой бактериальные липопептиды, включают MALP-2 и его синтетический аналог дипальмитоил-S-глицерилцистеин (Pam₂Cys) или трипалтмитоил-S-глицерилцистеин (Pam₃Cys).

Множество лигандов взаимодействует с TLR4, включая монофосфорил-липид А из Salmonella minnesota R595 (MPLA), липополисахариды (LPS), маннаны (Candida albicans), гликоинозитолфосфолипиды (Trypanosoma), вирусные оболочечные белки (RSV и MMTV) и эндогенные антигены, включая фибриноген и белки теплового шока. Указанные агонисты TLR4 описаны, например, у Akira S., Uematsu S., Takeuchi О., Pathogen recognition and innate immunity. Cell. 124(4), 24 февраля 2006 г., cc. 783-801 или у Kumar H., Kawai Т., Akira S., Toll-like receptors and innate immunity. Biochem Biophys Res Commun. 388(4), 30 октября 2009 г., cc. 621-625. LPS, который обнаружен в наружных мембранах грамотрицательных бактерий, является наиболее широко изученным из семейства лигандов TLR4. Приемлемые полученные из LPS пептидные агонисты TLR4 описаны, например, в WO 2013/120073 (А1).

TLR5 «запускается» областью молекулы флагеллина, экспрессируемой практически всеми подвижными бактериями. Так, флагеллин или пептиды или белки, полученные из флагеллина и/или вариантов или фрагментов флагеллина, также пригодны в качестве пептидных агонистов TLR, входящих в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению.

Таким образом, примеры пептидных агонистов TLR включают липопептидные агонисты TLR2 MALP-2, Pam₂Cys и Pam₃Cys или их модификации, различные формы LPS-агонистов TLR4, например, L3-LPS N. meningitidis дикого типа и мутантный пентаацилированный LpxL1-LPS, и агонист TLR5 флагеллин.

Однако предпочтительно, чтобы пептидный агонист TLR, входящий в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, не представлял собой ни липопептид, ни липопротеин, ни гликопептид, ни гликопротеин, более предпочтительно, пептидный агонист TLR, входящий в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой классический пептид, полипептид или белок, указанный в настоящем описании.

Предпочтительным агонистом TLR2 является аннексии II или его иммуномодуляторный фрагмент, который подробно описан в WO 2012/048190 А1 и заявке на патент США 13/0331546, в частности, предпочтительными являются пептидный агонист TLR2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4 или SEQ ID NO: 7, описанную в WO 2012/048190 А1, или его фрагменты или варианты.

Таким образом, пептидный агонист TLR2, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 или варианта этой последовательности, описанного выше, является наиболее предпочтительным в качестве компонента в), т.е. в качестве по меньшей мере одного пептидного агониста TLR, входящего в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 15 (пептидный агонист TLR2 Anaxa).

Наиболее предпочтительным функциональным вариантом последовательности пептидного агониста TLR, имеющего SEQ ID NO: 15, является пептидный агонист TLR, представленный в SEQ ID NO: 71:

SEQ ID NO: 71

Таким образом, пептидный агонист TLR2, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 71 или варианта этой последовательности, описанного выше, является наиболее предпочтительным в качестве компонента в), т.е. в качестве по меньшей мере одного пептидного агониста TLR, входящего в комплекс. Другими словами, пептидный агонист TLR в комплексе наиболее предпочтительно содержит или состоит из пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 71, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности).

Касательно TLR4 наиболее предпочтительными пептидными агонистами TLR, являются агонисты, которые соответствуют мотивам, которые связываются с TLR4, в частности, (I) пептиды, имитирующие встречающийся в естественных условиях лиганд LPS (RS01: Gln-Glu-Ile-Asn-Ser-Ser-Tyr и RS09: Ala-Pro-Pro-His-Ala-Leu-Ser), и (II) полученные из фибронектина пептиды. Клеточный гликопротеин фибронектин (FN) имеет множество изоформ, созданных из одного гена в результате альтернативного сплайсинга трех экзонов. Одна из этих изоформ представляет собой экстра-домен A (EDA), который взаимодействует с TLR4.

Другие приемлемые пептидные агонисты TLR содержат EDA-домен фибронектина или его фрагмент или вариант. Указанные приемлемые EDA-домены фибронектина или их фрагменты или варианты описаны в ЕР 1913954 В1, ЕР 2476440 A1, US 2009/0220532 А1 и WO 2011/101332 А1. Таким образом, пептидный агонист TLR4, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 45 или варианта этой последовательности, описанного выше, является наиболее предпочтительным в качестве компонента в), т.е. в качестве по меньшей мере одного пептидного агониста TLR, содержащегося в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению.

SEQ ID NO: 45 (пептидный агонист TLR4 EDA).

Кроме того, белок 1 высокомобильной группы (белок из группы ядерных негистоновых белков HMG) (HMGB1) и его пептидные фрагменты, как предполагается, могут являться агонистами для TLR4. Указанные полученные из HMGB1 пептиды описаны, например, в US 2011/0236406 А1.

Кроме того, агонист TLR, представленный в SEQ ID NO: 15, и агонист TLR, представленный в SEQ ID NO: 71, могут действовать в качестве агониста TLR4. Таким образом, пептидный агонист TLR4, содержащий или состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 или 71 или функционального варианта этой последовательности, является наиболее предпочтительным в качестве компонента в), т.е. в качестве по меньшей мере одного пептидного агониста TLR, входящего в комплекс.

Комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит по меньшей мере один пептидный агонист TLR, предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит более одного пептидного агониста TLR, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или большее количество пептидных агонистов TLR, более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит (по меньшей мере) два или три пептидных агониста TLR, еще более предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит (по меньшей мере) четыре или пять пептидных агонистов TLR. Если в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, содержится более одного пептидного агониста TLR, то, как должно быть очевидно, указанный пептидный агонист TLR также, в частности, ковалентно связан в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, например, с другим пептидным агонистом TLR и/или с компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, и/или с компонентом б), т.е. антигеном или антигенным эпитопом.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит один единственный пептидный агонист TLR. В частности, в указанном наиболее предпочтительном варианте осуществления изобретения комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит один единственный пептидный агонист TLR и в нем не присутствует никакой дополнительный компонент, обладающий свойствами ангониста TLR, за исключением одного единственного указанного выше пептидного агониста TLR.

Различные пептидные агонисты TLR, входящие в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, могут быть одинаковыми или различными. Предпочтительно различные пептидные агонисты TLR, входящие в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, отличаются друг от друга.

Кроме того, предпочтительно, чтобы более одного антигена или антигенного эпитопа, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 антигенов или антигенных эпитопов, или несколько пептидных агонистов TLR, в частности, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 агонистов TLR, располагались последовательно в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению. Это означает, в частности, что все пептидные агонисты TLR, входящие в комплекс, располагаются в виде участка, который не прерывается ни компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, ни компонентом б), т.е. по меньшей мере одним антигеном или антигенным эпитопом. Предпочтительно компонент а) и компонент б) располагаются в комплексе, например, до или после указанного участка из всех пептидных агонистов TLR. Однако пептидные агонисты TLR, расположенные таким последовательным образом, могут соединяться друг с другом, например, с помощью спейсера или линкера, описанного ниже, который не является ни компонентом а), т.е. проникающим в клетку пептидом, ни компонентом б), т.е. по меньшей мере одним антигеном или антигенным эпитопом.

Однако, альтернативно этому, различные пептидные агонисты TLR можно располагать также любым другим образом в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, например, с компонентом а) и/или компонентом б), расположенным между двумя или большим количеством пептидных агонистов TLR, т.е. с одним или большим количеством пептидных агонистов TLR, расположенных между компонентом а) и компонентом б) (или наоборот) и необязательно с одним или несколькими пептидными агонистами TLR, расположенными на соответствующем другом конце компонента а) и/или компонента б).

Должно быть очевидно, что может оказаться целесообразным, чтобы несколько различных пептидных агонистов TLR, активирующих одинаковые или различные TLR-рецепторы, входили в один комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению. Альтернативно этому, несколько различных пептидных агонистов TLR, активирующих одинаковые или различные TLR-рецепторы, можно подразделять на поднаборы различных пептидных агонистов TLR, активирующих одинаковые или различные TLR-рецепторы, которые входят в различные комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, при этом, указанные различные комплексы, содержащие различные поднаборы, целесообразно вводить одновременно, например, в виде одной вакцины, индивидууму, который нуждается в этом.

Соединение компонентов а), б) и в) в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению

В комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, компоненты а), б) и в) ковалентно связаны, т.е. связь между двумя из трех компонентов а), б) и в) в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой ковалентную связь. Предпочтительно два из трех компонентов а), б) и в) комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению (т.е. «первый» и «второй» компонент), ковалентно связаны друг с другом, а третий компонент из трех компонентов а), б) и в) ковалентно связан либо с первым компонентом из трех компонентов а), б) и в), либо со вторым компонентом из трех компонентов а), б) и в). Тем самым предпочтительно образуется линейная молекула. Однако также возможно, чтобы каждый из трех компонентов а), б) и в) был ковалентно связан с обоими другими компонентами из трех компонентов а), б) и в).

Понятие «ковалентное соединение» (также ковалентная связь) в контексте настоящего изобретения относится к химической связи, которая включает перекрытие («обобществление») электронных пар между атомами. «Ковалентное соединение» (также ковалентная связь) включает, в частности, стабильный баланс сил притяжения и отталкивания между атомами, когда они имеют общие электроны. Для многих молекул обобществление электронов позволяет каждому атому достигать состояния полной внешней оболочки, соответствующего стабильной электронной конфигурации. Ковалентное связывание включает много типов взаимодействий, включая, например, σ-связывание, π-связывание, связывание по типу металл-с-металлом, агонистические взаимодействия и трехцентровые двухэлектронные связи. Таким образом, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, можно обозначать также как «соединение», в частности, его можно обозначать как «молекула».

Предпочтительно в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, компоненты а), б) и в) ковалентно связаны путем химического сочетания любым приемлемым путем, известным в данной области, например, методами перекрестного сшивания. Однако следует учитывать тот факт, что многие известные методы химического перекрестного сшивания являются неспецифическими, т.е. они не направляют точку сочетания к какому-либо конкретному положению на компонентах а), б) и в). Таким образом, применяемые неспецифические перекрестносшивающие агенты могут атаковать функциональные сайты или стерически блокировать активные сайты, делая слитые компоненты комплекса биологически неактивными. Специалисту в данной области известно, как блокировать потенциально реактивные группы путем применения соответствующих защитных групп. Альтернативно этому, можно применять методики на основе сильного и универсального лигирования оксима и гидразона, которые представляют собой хемоселективные субстанции, пригодные для перекрестного сшивания компонентов а), б) и в). Указанная технология связывания описана, например, у Rose и др., JACS 116, 1994, с. 30.

Специфичность сочетания можно повышать путем прямого химического связывания с функциональной группой, которая встречается только один раз или несколько раз в компонентах а), б) и/или в), при этом функциональную группу можно перекрестно связывать с другой, присутствующей в компонентах а), б) или в). Так, например, можно применять тиольную группу цистеина, если только один остаток цистеина присутствует в конкретном компоненте а), б) или в) комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению. Так, например, если конкретный компонент а), б) или в) не содержит остатки лизина, то перекрестносшивающий реагент, специфический для первичных аминов, может быть селективным для аминоконца соответствующего компонента. Альтернативно этому, перекрестное сшивание можно осуществлять также через боковую цепь остатка глутаминовой кислоты, расположенного на N-конце пептида, в результате чего можно создавать амидную связь через ее боковую цепь. Таким образом, может оказаться целесообразным связывать остаток глутаминовой кислоты с N-концом конкретного компонента а), б) или в). Однако, если цистеиновый остаток подлежит интродукции в конкретный компонент а), б) или в), то предпочтительной является интродукция на N- или С-конец или вблизи него. Известны общепринятые методы для осуществления таких изменений аминокислотных последовательностей, основанные на модификациях конкретного компонента а), б) или в), либо путем добавления одной или нескольких дополнительных аминокислот, например, среди прочего, остатка цистеина, для транслоцирования последовательности, либо путем замены по меньшей мере одного остатка транслоцированной(ых) последовательности(ей), входящей(их) в соответствующий компонент. В случае, когда боковую цепь цистеина используют для целей сочетания, то конкретный компонент а), б) или в) предпочтительно имеет один остаток цистеина. Любой второй остаток цистеина предпочтительно не требуется и его можно необязательно заменять, когда он присутствует в соответствующем компоненте, который входит в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению. Когда остаток цистеина заменяют в исходной последовательности конкретного компонента а), б) или в), то, как правило, требуется минимизировать образовавшиеся изменения в укладке пептида соответствующего компонента. Изменения в укладке минимизируют, когда замена представляет собой химически и стерически сходную с цистеином замену. Так, серии является предпочтительной заменой для цистеина.

Сочетание двух из трех компонентов а), б) и в) можно осуществлять с помощью связывающего или конъюгирующего агента, используя стандартные связывающие реагенты для синтеза пептидов, такие как HOBt, HBTU, DICI, TBTU. Известно несколько агентов, осуществляющих межмолекулярное перекрестное сшивание, которые можно использовать, см. например, Means и Feeney, Chemical Modification of Proteins, изд-во Holden-Day, 1974, cc 39-43. Среди этих реагентов следует отметить, например, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) или N,N'-(1,3-фенилен)бисмалеимид; N,N'-этилен-бис(йодацетамид) или другой такой реагент, имеющий метиленовые мостики, содержащие 6-11 атомов углерода; и 1,5-дифтор-2,4-динитробензол. Другие перекрестносшивающие агенты, которые можно применять для этой цели, включают: n,n'-дифтор-м,м'-динитродифенилсульфон; диметиладипимидат; фенол-1,4-дисульфонилхлорид; гексаметилендиизоцианат или диизотиоцианат или азофенил-n-диизоцианат; глутаровый альдегид и дисдиазобензидин. Перекрестносшивающие агенты могут быть гомобифункциональными, т.е. иметь две функциональные группы, которые подвергаются одинаковой реакции. Предпочтительным гомобифункциональным перекрестносшивающим агентом является бисмалеимидогексан (ВМН). ВМН содержит две малеимидные функциональные группы, которые взаимодействуют специфически с содержащими сульфгидрил соединениями в мягких условиях (рН 6,5-7,7). Две малеимидные группы соединены углеводородной цепью. Таким образом, ВМН можно применять для необратимого перекрестного сшивания белков (или полипептидов), которые содержат остатки цистеина. Перекрестносшивающие агенты могут быть также гетеробифункциональными. Гетеробифункциональные перекрестносшивающие агенты имеют две различные функциональные группы, например, амино-реактивную группу и тиол-реактивную группу, которые могут перекрестно сшивать два белка, имеющие свободные амины и тиолы соответственно. Примерами гетеробифункциональных перекрестеносшивающих агентов являются сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), сложный м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидиловый эфир (MBS) и сукцинимид-4-(n-малеимидофенил)бутират (SMPB) и аналог с удлиненной цепью MBS. Сукцинимидильная группа указанных перекрестносшивающих агентов взаимодействует с первичным амином, тиол-реактивный малеимид образует ковалентную связь с тиолом остатка цистеина. Поскольку перекрестносшивающие агенты часто обладают низкой растворимостью в воде, гидрофильный остаток, такой как сульфонатная группа, можно добавлять к перекрестносшивающему агенту для повышения его растворимости в воде. Сульфо-MBS и сульфо-SMCC являются примерами перекрестносшивающих агентов, модифицированных для растворимости в воде. Многие перекрестносшивающие агенты образуют конъюгат, который практически не расщепляется в условиях клетки. Таким образом, некоторые перекрестносшивающие агенты содержат ковалентную связь, такую как дисульфид, которая может расщепляться в условиях клетки. Например, реагент Траута, дитиобис(сукцинимидилпропионат) (DSP) и N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP) являются хорошо известными расщепляемыми перекрестносшивающими агентами. Применение расщепляемого перекрестносшивающего агента позволяет проникающему в клетку пептиду, по меньшей мере одному антигену или антигенному эпитопу и по меньшей мере одному пептидному агонисту TLR, которые образуют комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, отделяться друг от друга после их доставки в клетку-мишень. Для этой цели можно применять также прямую дисульфидную связь. Химическое перекрестное сшивание может включать также применение спейсерных плечей. Спейсерные плечи обеспечивают внутримолекулярную гибкость или позволяют регулировать внутримолекулярные расстояния между конъюгированными фрагментами и поэтому могут способствовать сохранению биологической активности. Спейсерное плечо может находиться в форме белкового (или полипептидного) фрагмента, который включает спейсерные аминокислоты, например, пролин. Альтернативно этому, спейсерное плечо может являться частью перекрестносшивающего агента, такого как «длинноцепочечный SPDP» (фирма Pierce Chem. Co., Рокфорд, шт. Иллинойс, каталожный №21651 Н). Многочисленные перекрестносшивающие агенты, включая описанные выше, поступают в продажу. Подробные инструкции по их применению доступны от коммерческих поставщиков. Более подробную информацию о перекрестном сшивании белков и получении конъюгатов, которые можно применять в контексте связывания компонентов а), б) и в), образующих комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, можно почерпнуть из: Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, изд-во CRC Press, 1991.

Перекрестносшивающие агенты для перекрестного сшивания пептида или белка включают, например, (I) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу амин-амин, например, гомобифункциональные амино-специфические белковые перекрестносшивающие реагенты на основе реактивных группы сложного NHS-эфира и сложного имидоэфира для селективной конъюгации первичных аминов; доступны в виде коротких, длинных, расщепляемых, необратимых, проникающих через мембраны и находящихся на клеточной поверхности вариантов; (II) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу сульфгидрил-углевод, например, перекрестносшивающие реагенты на основе реактивных групп малеимида и гидразида для конъюгации и образования ковалентных перекрестных связей; (III) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу сульфгидрил-сульфгидрил, например, гомобифункциональные сульфгидрил-специфические перекрестносшивающие реагенты на основе реактивных групп малеимида или пиридилдитиола для избирательной ковалентной конъюгации тиолов белка и пептида (восстановленные цистеины) для образования стабильных тиоэфирных связей; (IV) фотореактивные перекрестносшивающие агенты, например, арилазид, диазирин и другие фотореактивные (активируемые светом) химические гетеробифункциональные перекрестносшивающие агенты для конъюгации белков, нуклеиновых кислот и других молекулярных структур, участвующих в образовании комплексов рецептор-лиганд посредством двухстадийной активации; (V) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу амин-сульфгидрил, например, гетеробифункциональные перекрестносшивающие агенты для белков для конъюгации между первичным амином (лизин) и сульфгидрильными (цистеин) группами белков и других молекул; доступны со спейсерными плечами различной длины и типов; и (VI) агенты, обеспечивающие перекрестное сшивание по типу карбоксил-амин, например, перекрестносшивающие реагенты на основе карбодиимида, DCC и EDC (EDAC), для конъюгации карбоксильных групп (глутамат, аспартат, С-концы) с первичными аминами (лизин, N-концы), а также N-гидроксисукцинимид (NHS) для стабильной активации карбоксилатов для конъюгации с амином.

Примеры перекрестносшивающих агентов, которые можно применять в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, включают сложный N-(α-малеимидоацетокси)сукцинимидиловый эфир, N-5-азидо-2-нитробензилоксисукцинимид, 1,4-бисмалеимидобутан, 1,4-бисмалеимидил-2,3-дигидроксибутан, бисмалеимидогексан, бисмалеимидоэтан, гидразид N-(β-малеимидопропионовой кислоты)×ТРА, сложный N-(β-малеимидопропилокси)сукцинимидиловый эфир, 1,8-бисмалеимидодиэтиленгликоль, 1,11-бисмалеимидотриэтиленгликоль, бис(сульфосукцинимидил)суберат, бис(сульфосукцинимидил)глутарат-d0, бис(сульфосукцинимидил)-2,2,4,4-глутарат-d4, бис(сульфосукцинимидил)суберат-d0, бис(сульфосукцинимидил)-2,2,7,7-суберат-d4, бис(NHS)ПЭГ5, бис(NHS)ПЭГ9, бис(2-[сукцинимидоксикарбонилокси]этил)сульфон, N,N-дициклогексилкарбодиимид, 1-5-дифтор-2,4-динитробензол, диметиладипимидат×HCI, диметилпимелимидат×2HCI, диметилсуберимидат×2HCl, дисукцинимидилглутарат, дитиобис(скуцимидилпропионат) (реагент Ломанта), дисукцинимидилсуберат, дисукцинимидилтартрат, диметил-3,3'-дитиобиспропионимидат×2HCI, дитиобисмалеимидоэтан, 3,3'-дитиобис(сульфосукцинимидилпропионат), гидрохлорид 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида, этиленгликоль-бис(сукцинимидилсукцинат), N-ε-малеимидокапроновую кислоту, гидразид N-(ε-малеимидокапроновой кислоты), сложный N-(ε-малеимидокапроилокси)сукцинимидиловый эфир, N-(γ-малеимидобутирилокси) сукцинимидиловый эфир, гидразид N-(κ-малеимидоундекановой кислоты), NHS-LC-диазирин, сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбокси(6-амидокапроат), сукцинимидил-6-(3'-[2-пиридилтио]пропионамидо)гексаноат, L-фото-лейцин, L-фото-метионин, сложный м-малеимидобензоил-N-гидроксисукцинимидиловый эфир, гидразид 4-(4-N-малеимидофенил)масляной кислоты×HCI, 2-[N2-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-N6-(6-биотинамидокапроил)-L-лизинил]этилметантиосульфат, 2-{N2-[N6-(4-азидо-2,3,5,6-тетрафторбензоил)-N6-(6-биотинамидокапроил)-L-лизинил]}этилметантиосульфат, N-гидроксисукцинимид, сложный N-гидроксисукцинимидиловый эфир этаназида, сложный N-гидроксисукцинимидиловый эфир тетраоксапентадеканазида, сложный N-гидроксисукцинимидиловый эфир додекаоксанонатриаконтаназида, NHS-фосфин, 3-(2-пиридилтио)пропионилгидразид, 2-пиридилдитиолтетраоксатетрадекан-N-гидроксисукцинимид, 2-пиридилдитиолтетраоксаоктатриаконтан-N-гидроксисукцинимид, N-(n-малеимидофенил)изоцианат, сукцинимидил-3-(бромацетамидо)пропионат, NHS-диазирин, NHS-SS-диазирин, N-сукцинимидилйодацетат, N-сукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат, сукцинимидил 4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, NHS-ПЭГ2-малеимид, NHS-ПЭГ4-малеимид, NHS-ПЭГ6-малеимид, NHS-ПЭГ8-малеимид, NHS-ПЭГ12-малеимид, NHS-ПЭГ24-малеимид, сукцинимидил-4-(n-малеимидофенил)бутират, сукцинимидил-6-(β-малеимидопропионамидо)гексаноат, 4-сукцинимидилоксикарбонилметил-α-(2-пиридилдитио)толуол, сукцинимидил-(4-псорален-8-илокси)бутират, N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат, этиленгликоль-бис(сульфосукцинимидилсукцинат), сложный N-(ε-малеимидокапроилокси)сульфосукцинимидиловый эфир, сложный N-(γ-малеимидобутилокси)сульфосукцинимидиловый эфир, сложный N-(κ-малеимидоундеканоилокси)сульфосукцинимидиловый эфир, сульфо-NHS-LC-диазирин, сульфосукцинимидил-6-(3'-[2-пиридилдитио]пропионамидо)гексаноат, сложный м-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукцинимидиловый эфир, N-гидроксисукцинимид, сульфо-NHS-фосфин, сульфосукцинимидил-6-(4'-азидо-2'-нитрофениламино)гексаноат, сульфо-NHS-(2-6-[биотинамидо]-2-(n-азидобензамид), сульфо-NHS-диазирин, сульфо-NHS-SS-диазирин, сульфосукцинимидил(4-йодацетил)аминобензоат, сульфосукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат, сульфосукцинимидил-4-(n-малеимидофенил)бутират, трис(2-малеимидоэтил)амин (трехфункциональный) и трис(сукцинимидиламинотриацетат) (трехфункциональный).

Связь между двумя из трех компонентов а), б) и в) в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, может быть прямой или косвенной, т.е. два компонента могут быть соединены непосредственно, или они могут быть связаны с помощью дополнительного компонента комплекса, например, спейсера или линкера.

Предпочтительно реализацией прямой связи является амидный мостик, если подлежащие связыванию компоненты имеют реактивные аминогруппы или карбоксигруппы. Более конкретно, если подлежащие связыванию компоненты представляют собой пептиды, полипептиды или белки, то предпочтительной является пептидная связь. Указанную пептидную связь, можно создавать с помощью химического синтеза, включающего оба подлежащих связыванию компонента (N-конец одного компонента и С-конец другого компонента), или ее можно создавать непосредственно путем белкового синтеза полной пептидной последовательности обоих компонентов, при этом оба (белок или пептид) компонента предпочтительно синтезируют на одной стадии. Указанные методы белкового синтеза включают (но, не ограничиваясь только ими), например, методы жидкофазного пептидного синтеза или методы твердофазного пептидного синтеза, например, методы твердофазного пептидного синтеза Меррифильда, твердофазной пептидный синтез с использованием t-Вос, твердофазной пептидный синтез с использованием Fmoc, твердофазной пептидный синтез на основе ВОР (гексафторфосфат бензотриазол-1-илокситрис(диметиламино)фосфония) и т.д. Альтернативно этому, предпочтительными являются сложноэфирные или простые эфирные связи.

Кроме того, если, в частности, подлежащие связыванию компоненты представляют собой пептиды, полипептиды или белки, то связь можно осуществлять через боковые цепи, например, с помощью дисульфидного мостика. Дополнительные компоненты другой химической природы, например, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, если он не имеет пептидную природу, можно также присоединять к компонентам пептидной природы, например, к проникающему в клетку пептиду, по меньшей мере одному пептидному агонисту TLR и по меньшей мере одному антигену или антигенному эпитопу, если он имеет пептидную природу. Связь через боковую цепь предпочтительно должна базироваться на аминогруппах, тиольных или гидроксильных группах боковой цепи, например, представлять собой амидную или сложноэфирную или простую эфирную связь. Связь главной пептидной цепи с боковой пептидной цепью другого компонента может представлять собой также изопептидную связь. Изопептидная связь представляет собой амидную связь, которая не присутствует в главной цепи белка. Связь образуется между карбоксильным концом одного пептида или белка и аминогруппой остатка лизина на другом пептиде или белке (мишень).

Комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, может необязательно содержать спейсер или линкер, представляющие собой неиммунологические фрагменты, которые предпочтительно являются расщепляемыми и которые соединяют компонент а) и б) и/или компонент а) и в), и/или компонент б) и в), и/или соединяют последовательно расположенные антигены или антигенные эпитопы, и/или соединяют последовательно расположенные пептидные агонисты TLR, и/или соединяют последовательно расположенные проникающие в клетку пептиды, и/или которые могут быть помещены в С-концевую область компонентов б) и/или в). Линкер или спейсер предпочтительно могут обладать дополнительными функциональностями помимо способности связывать компоненты, предпочтительно являются расщепляемыми, более предпочтительно расщепляемыми в естественных условиях внутри клетки-мишени, например, расщепляемыми ферментами. Однако указанные другие функциональности не должны, включать, в частности, иммунологические функциональности. Примеры дополнительных функциональностей, в частности, касательно линкеров в слитых белках, представлены у Chen X. и др.: Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10), 2013, cc. 1357-1369, где описаны также, например, расщепляемые in vivo линкеры. Кроме того, у Chen X. и др., Fusion Protein Linkers: Property, Design and Functionality. Adv Drug Deliv Rev. 65(10), 2013, cc. 1357-1369 описаны также различные линкеры, например, гибкие линкеры и жесткие линкеры, и инструменты и базы данных для создания линкеров, которые можно применять в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, или для создания линкера, который можно применять в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению,

Указанный спейсер может быть пептидным или непептидным, предпочтительно спейсер является пептидным. Предпочтительно пептидный спейсер состоит примерно из 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, более предпочтительно примерно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. Аминокислотная последовательность пептидного спейсера может быть идентична последовательности N-концевой или С-концевой фланкирующей области любого из компонентов а), б) или в). Альтернативно этому, пептидный спейсер может состоять из не встречающихся в естественных условиях аминокислотных последовательностей, таких как аминокислотная последовательность, полученная в результате консервативных аминокислотных замен указанных встречающихся в естественных условиях фланкирующих областей, или последовательности известных расщепляемых протеазами сайтов, такие как сайт-мишень для энтерокиназы (аминокислотная последовательность: DDDK, SEQ ID NO: 16), сайт-мишень для фактора Ха (аминокислотная последовательностье: IEDGR, SEQ ID NO: 17), сайт-мишень для тромбина (аминокислотная последовательность: LVPRGS, SEQ ID NO: 18), сайт-мишень для протеазы TEV (аминокислотная последовательность: ENLYFQG, SEQ ID NO: 19), сайт-мишень для протеазы PreScission (аминокислотная последовательность LEVLFQGP, SEQ ID NO: 20), поликатионные аминокислоты, например, сайт-мишень для полиK, фурина (аминокислотная последовательность RX(R/K)R, SEQ ID NO: 21). В конкретном варианте осуществления изобретения пептидный спейсер не должен содержать никаких остатков Cys (С). В предпочтительном варианте осуществления изобретения линкерная последовательность содержит по меньшей мере 20%, более предпочтительно по меньшей мере 40% и еще более предпочтительно по меньшей мере 50% остатков Gly или β-аланина, например, GlyGlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 22), GlyGlyGlyGly (SEQ ID NO: 23), GlyGlyGly, CysGlyGly или GlyGlyCys и т.д. Специалист в данной области легко может выбирать и получать приемлемые линкерные последовательности. Они могут состоять из D- и/или L-аминокислот. Другие примеры пептидного спейсера включают аминокислотные последовательности EQLE (SEQ ID NO: 24) или TEWT (SEQ ID NO: 25), или любые их консервативные замены.

Непептидный спейсер может включать или может представлять собой сложный эфир, сложный тиоэфир и дисульфид.

В частности, комплекс, предлагаемый для применения согласно изобретению, может содержать спейсер или линкер, в частности, пептидный спейсер, расположенный между компонентами а) и б) и/или между компонентами а) и в), и/или между компонентами б) и в). Специалист в данной области может выбирать такой пептидный спейсер, чтобы он мог отщепляться с помощью присущего клетке механизма после интернализации комплекса, содержащего проникающий в клетку пептид и карго-молекулу.

Когда комплекс содержит несколько антигенов или антигенных эпитопов или когда комплекс содержит несколько пептидных агонистов TLR, то, как должно быть очевидно специалисту в данной области, каждый из антигенов или антигенных эпитопов и/или каждый из пептидных агонистов TLR, входящих в комплекс, предлагаемый в изобретении, могут быть либо непосредственно соединены друг с другом, либо связаны через спейсеры или линкеры, такие, например, как пептидный спейсер, состоящий из нескольких аминокислот. Альтернативно этому, когда комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит несколько антигенов или антигенных эпитопов или когда комплекс содержит несколько пептидных агонистов TLR, то также является возможным, что некоторые антигены или антигенные эпитопы и/или некоторые пептидные агонисты TLR, входящие в комплекс, предлагаемый в изобретении, непосредственно связаны друг с другом, а некоторые другие антигены или антигенные эпитопы и/или некоторые другие пептидные агонисты TLR связаны через спейсеры или линкеры, такие, например, как пептидный спейсер, состоящий из нескольких аминокислот.

Например, два последовательно расположенных антигена или антигенных эпитопа или два последовательно расположенных пептидных агониста TLR, которые входят в комплекс, предлагаемый в изобретении, соединены друг с другом с помощью спейсеров, состоящих из встречающихся в естественных условиях фланкирующих областей указанных антигенов или антигенных эпитопов, или указанных пептидных агонистов TLR соответственно. Например, спейсер, применяемый для соединения первого антигена/антигенного эпитопа или первого пептидного агониста TLR со вторым антигеном/антигенным эпитопом или со вторым пептидным агонистом TLR соответственно, может состоять примерно из вплоть до 8 аминокислот, соответствующих примерно вплоть до 4 аминокислот N-концевой или С-концевой фланкирующей области первого антигена/антигенного эпитопа или первого пептидного агониста TLR, за которыми расположены примерно вплоть до 4 аминокислот N-концевой или С-концевой фланкирующей области второго антигена/антигенного эпитопа или второго пептидного агониста TLR. В настоящем изобретении в качестве иллюстрации спейсер, применяемый для соединения первого антигена/антигенного эпитопа или первого пептидного агониста TLR («антиген/эпитоп/пептидный агонист TLR 1») со вторым эпитопом («антиген/эпитоп/пептидный агонист TLR 2» состоит примерно из 8 аминокислот, соответствующих любой возможной следующей комбинации: от 0 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 8 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, до 8 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и до 0 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, т.е. включая 1 фланкирующую аминокислоту антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 7 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 2 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 6 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 3 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 5 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 4 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 4 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 5 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 3 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 6 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 2 фланкирующие аминокислоты антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 7 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 1 фланкирующая аминокислота антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2, 8 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 и 0 фланкирующих аминокислот антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2. Должно быть очевидно, что 8 аминокислот в целом, образующих спейсер, который соединяет два последовательно расположенных антигена/эпитопа/пептидных агониста TLR, не является абсолютной величиной, и спейсер может состоять в целом, например, из 3 аминокислот, 4 аминокислот, 5 аминокислот, 6 аминокислот, 7 аминокислот, 9 аминокислот или 10 аминокислот. Аналогично этому, комбинации, эквивалентные указанным выше, могут также служить иллюстрацией изобретения в ситуации, когда спейсер состоит из менее чем 8 аминокислот или более чем из 8 аминокислот.

Согласно другой конкретной иллюстрации настоящего изобретения спейсер, применяемый для соединения первого антигена/антигенного эпитопа или первого пептидного агониста TLR («антиген/эпитоп/пептидный агонист TLR 1») со вторым антигеном/антигенным эпитопом или со вторым пептидным агонистом TLR соответственно («антиген/эпитоп/пептидный агонист TLR 2»), состоит, например, из 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот. Более конкретно, указанная спейсерная аминокислотная последовательность может соответствовать 4 аминокислотам N-концевой или С-концевой фланкирующей области антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 1 или антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR 2. Спейсер, описанный выше, может также находиться в С-области последнего антигена/эпитопа/пептидного агониста TLR, входящего в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению.

Методы соединения двух из трех компонентов а), б) и в) подробно описаны в литературе, и они могут зависеть от природы по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа. Например, соединение двух из трех компонентов а), б) и в) можно достигать посредством расщепляемых дисульфидных связей, получаемых в целом с помощью постадийного твердофазного синтеза или сочетания фрагментов в фазе раствора или на твердой фазе, стабильной амидной, тиазолидиновой, оксимовой и гидразиновой связи, дисульфидной связи, стабильной тиомалеимидной связи, пептидной связи (включая пептидные связи между аминокислотами слитого белка), или электростатических или гидрофобных взаимодействий.

Предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, входящий в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, а также любой необязательный спейсер или линкер, входящий в комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, имеют пептидную природу. Более предпочтительно все компоненты комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению, например, проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, представляющий собой пептид, полипептид или белок, по меньшей мере один пептидный агонист TLR и необязательный пептидный линкер или спейсер, соединены в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, пептидной связью. Таким образом, наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой пептид, полипептид или белок, такой как слитый белок, например, рекомбинантный слитый белок.

В этом контексте комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 или SEQ ID NO: 87; или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 или SEQ ID NO: 87, является предпочтительным. Кроме того, комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 или SEQ ID NO: 91; или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 или SEQ ID NO: 91, является предпочтительным. Кроме того, комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46, или SEQ ID NO: 69; или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 69, является предпочтительным. Комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69 или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, является предпочтительным. Комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, является предпочтительным. Комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, является более предпочтительным. Кроме того, комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 или SEQ ID NO: 87, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86 или SEQ ID NO: 87, является более предпочтительным. Кроме того, комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 или SEQ ID NO: 91, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 90 или SEQ ID NO: 91, является более предпочтительным. Комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, является еще более предпочтительным. Комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, является еще более предпочтительным. Комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, или комплекс, который содержит или состоит из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41 или SEQ ID NO: 69, является особенно предпочтительным. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 72 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 72. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 73 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 73. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 74 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 74. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 75 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 75.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 76 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 76. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 77 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 77.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 78 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 78. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 79 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 79.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 80 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 80. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 81 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 81.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 82 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 82.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 83 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 83. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 84 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 84.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 85 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 85. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 86 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 86. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 87 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 87. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 88 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 88.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 89 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 89. Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 90 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 90.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 91 или из аминокислотной последовательности, идентичной по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% SEQ ID NO: 91.

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит или состоит из полипептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 89, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 50%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 60%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 70%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, еще болеее предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную и наиболее предпочтительно по меньшей мере 98%-ную или 99%-ную идентичность последовательности).

SEQ ID NO: 26:

SEQ ID NO: 27:

SEQ ID NO: 28:

SEQ ID NO: 33:

SEQ ID NO: 34:

SEQ ID NO: 37:

SEQ ID NO: 38:

SEQ ID NO: 39:

SEQ ID NO: 40:

SEQ ID NO: 41:

SEQ ID NO: 46:

SEQ ID NO: 69:

SEQ ID NO: 72:

SEQ ID NO: 73:

SEQ ID NO: 74:

SEQ ID NO: 75:

SEQ ID NO: 76:

SEQ ID NO: 77:

SEQ ID NO: 78:

SEQ ID NO: 79:

SEQ ID NO: 80:

SEQ ID NO: 81:

SEQ ID NO: 82:

SEQ ID NO: 83:

SEQ ID NO: 84:

SEQ ID NO: 85:

SEQ ID NO: 86:

SEQ ID NO: 87:

SEQ ID NO: 88:

SEQ ID NO: 89:

SEQ ID NO: 90:

SEQ ID NO: 91:

Наиболее предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, содержит (или состоит из) следующих компонентов:

(I) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6 (CPP3/Z13), или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности);

(II) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 96, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности);

(III) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности);

(IV) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 97, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности); и

(V) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 71 или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности). Предпочтительно комплекс содержит компоненты (I) - (V) (описанные выше) в направлении от N-конца к С-концу. Однако компоненты могут располагаться иным образом, что будет описано ниже.

Другим объектом настоящего изобретения является также комплекс, содержащий:

проникающий в клетку пептид;

по меньшей мере три антигенных эпитопа; и

по меньшей мере один пептидный агонист TLR,

в котором компоненты а) - в) ковалентно связаны и

в котором по меньшей мере три антигенных эпитопа содержат (I) один или несколько эпитопов сурвивина или функциональный(ые) вариант(ы) последовательности(ей), (II) один или несколько эпитопов СЕА или функциональный(ые) вариант(ы) последовательности(ей), и (III) один или несколько эпитопов ASCL2 или функциональный(ые) вариант(ы) последовательности(ей).

Предпочтительные варианты указанного комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, соответствуют предпочтительным вариантам комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению, который описан выше.

Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше. Более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 53. Еще более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше.

Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше. Более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 55, и/или пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 56. Еще более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 96, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше.

Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, предпочтительно содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше. Более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 93, и/или пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 94. Еще более предпочтительно комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 97, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше.

Предпочтительно комплекс содержит в направлении от N-конца к С-концу:

один или несколько эпитопов СЕА или функциональные варианты последовательностей, указанные выше;

один или несколько эпитопов сурвивина или функциональные варианты последовательностей, указанные выше; и

один или несколько эпитопов ASCL2 или функциональные варианты последовательностей, указанные выше.

Более предпочтительно комплекс содержит в направлении от N-конца к С-концу:

- пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот, как указано выше, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше;

- пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот, как указано выше, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше; и

- пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее фрагмент, состоящий по меньшей мере из 10 аминокислот, как указано выше, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше;

Еще более предпочтительно С-конец (I) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент или вариант, указанный выше, непосредственно связан с N-концом (II) пептида, указанного выше, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент или вариант, указанный выше; и С-конец (II) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент или вариант, указанный выше, непосредственно связан с N-концом (III) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее фрагмент или вариант, указанный выше.

Предпочтительно также комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 96, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше; пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше; и пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 97, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности, как указано выше.

Предпочтительно комплекс представляет собой рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок, описанный выше.

Кроме того, проникающий в клетку пептид в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, предпочтительно соответствует проникающему в клетку пептиду в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, указанному выше. Это относится, в частности, к предпочтительным вариантам проникающего в клетку пептида.

Кроме того, пептидный агонист TLR в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, предпочтительно соответствует пептидному агонисту TLR в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, указанному выше. Это относится, в частности, к предпочтительным вариантам пептидного агониста TLR.

Например, комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, содержит, предпочтительно в направлении от N-конца к С-концу следующие указанные выше компоненты:

(V) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 71, или функциональный вариант последовательности, имеющий по меньшей мере 70%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности), в котором компоненты (I)-(V) необязательно сцеплены с помощью линкера или спейсера.

Наиболее предпочтительно комплекс содержит или состоит из полипептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 89, или функциональный вариант этой последовательности, имеющий по меньшей мере 50%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 60%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 70%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%-ную идентичность последовательности).

Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, можно применять для предупреждения и/или лечения указанного в настоящем описании колоректального рака.

Расположение компонентов а), б) и в) в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению

Компоненты а), б) и в) могут располагаться в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, в любом порядке.

В частности, если более одного проникающего в клетку пептида и/или более одного антигена или антигенного эпитопа, и/или более одного пептидного агониста TLR содержатся в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, то несколько проникающих в клетку пептидов могут располагаться не последовательным образом, т.е. по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп (компонент б)) и/или по меньшей мере один пептидный агонист TLR (компонент в)) могут прерывать участок из последовательно расположенных проникающих в клетку пептидов и/или проникающие в клетку пептиды могут чередоваться с компонентом б) и/или компонентом в). Аналогично этому, несколько антигенов или антигенных эпитопов могут располагаться не последовательным образом, т.е. по меньшей мере один проникающий в клетку пептид (компонент а)) и/или по меньшей мере один пептидный агонист TLR (компонент в)) могут прерывать участок из последовательно расположенных антигенов или антигенных эпитопов и/или антигены или антигенные эпитопы могут чередоваться с компонентом а) и/или компонентом в). Аналогично этому, несколько пептидных агонистов TLR могут располагаться не обязательно последовательным образом, т.е. по меньшей мере один проникающий в клетку пептид (компонент а)) и/или по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп (компонент б)) могут прерывать участок из последовательно расположенных пептидных агонистов TLR и/или пептидные агонисты TLR могут чередоваться с компонентом а) и/или компонентом б).

Однако предпочтительно, чтобы несколько проникающих в клетку пептидов располагались в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, последовательным образом и/или несколько антигенов или антигенных эпитопов располагались в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, последовательным образом, и/или несколько пептидных агонистов TLR располагались в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению последовательным образом. Это означает, в частности, что все единичные элементы определенного компонента, т.е. все проникающие в клетку пептиды, все антигены или антигенные эпитопы или все пептидные агонисты TLR, которые содержатся в комплексе, расположены в виде участка, который не прерывается любым из двух других компонентов. Предпочтительнее два других компонента располагаются в комплексе, например, до или после указанного участка из всех единичных элементов указанного конкретного компонента. Однако последовательно расположенные единичные элементы указанного конкретного компонента могут быть связаны друг с другом, например с помощью указанного в настоящем описании спейсера или линкера, что не имеет места для двух других компонентов.

Наиболее предпочтительно, чтобы каждый из компонентов а), б) и в) располагался последовательным образом.

Структурно каждый компонент а), б) и в), как правило, содержит одну главную цепь и по меньшей мере одну боковую цепь. Понятие «главная цепь» (синоним «каркасная цепь») в контексте настоящего изобретения относится к главной непрерывной цепи ковалентно связанных атомов в молекуле. Например, в пептидах, полипептидах и белках главная цепь (каркас), как правило, содержит альфа-атомы углерода и атомы азота, образующие аминокислоты, сцепленные пептидной связью. Каркас не включает боковые цепи. Понятие «боковая цепь» (синоним «концевая (висящая) цепь») в контексте настоящего изобретения относится к химической группе, присоединенной к коровой части молекулы, называемой «главной цепью» или каркасом. Например, в пептидах, полипептидах и белках боковые цепи, как правило, представляют собой (основные) части, образующие аминокислоты, которые присоединены к альфа-атомам углерода каркаса.

В комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, компоненты а), б) и в) могут быть ковалентно связаны через линкер или спейсер, указанный в настоящем описании, или они могут быть непосредственно ковалентно связаны. Вне зависимости от того, применяют ли спейсер или линкер для ковалентного связывания, в принципе существует четыре возможных типа соединения друг с другом двух из трех компонентов в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, а именно:

(I) посредством связи главная цепь/главная цепь,

(II) посредством связи главная цепь/боковая цепь,

(III) посредством связи боковая цепь/главная цепь или

(IV) посредством связи боковая цепь/боковая цепь.

Предпочтительно все три компонента а), б) и в) соединяют посредством связи главная цепь /главная цепь, что позволяет получать, в частности, главную цепь комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению, которая содержит главную цепь одного или нескольких проникающего(их) в клетку пептида(ов), главную цепь одного или нескольких антигена(ов) или антигенного(ых) эпитопа(ов) и главную цепь одного или несколько пептидного(ых) агониста(ов) TLR. Другими словами, главная цепь одного или нескольких проникающего(их) в клетку пептида(ов), главная цепь одного или нескольких антигена(ов) или антигенного(ых) эпитопа(ов) и главная цепь одного или нескольких пептидного(ых) агониста(ов) TLR образуют главную цепь комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению, необязательно в сочетании с дополнительными компонентами, например, линкером(ами), спейсером(ами) и т.д. Таким образом, предпочтительными являются следующие расположения компонентов а), б) и в), в частности, если по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп представляет собой пептид, полипептид или белок, где указанные предпочтительные расположения представлены ниже в направлении N-конец → С-конец главной цепи комплекса и где все три компонента а), б) и в) связаны посредством связи главная цепь/главная цепь и необязательно могут быть соединены с помощью линкера, спейсера или другого дополнительного компонента:

(α) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR);

(β) компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR) - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп);

(γ) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп);

(δ) компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) -компонент а) (проникающий в клетку пептид);

(ε) компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR); или

(ζ) компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - компонент в) (по меньшей мере один пептидный агонист TLR) - компонент а) (проникающий в клетку пептид).

В частности, если все три компонента а), б) и в) связаны посредством связи главная цепь/главная цепь, то предпочтительно, чтобы по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп располагались на С-конце проникающего в клетку пептида, а проникающий в клетку пептид и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп необязательно были сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера, или с помощью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR. Таким образом, это соответствует варианту расположения, указанному в (α), (β) и (γ), из описанных выше вариантов расположения, т.е. из описанных выше вариантов расположения более предпочтительными являются (α), (β) и (γ).

Еще более предпочтительно по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп располагаются на С-конце проникающего в клетку пептида, при этом проникающий в клетку пептид и по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп необязательно сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера, но не с помощью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR. Таким образом, это соответствует варианту расположения, указанному в (α) и (β), из описанных выше вариантов расположения, т.е. из описанных выше вариантов расположения еще более предпочтительными являются (α) и (β). Особенно предпочтительно комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, представляет собой рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок и компоненты а)-в) располагаются в направлении N-конец → С-конец главной цепи указанного комплекса в следующем порядке:

(α) компонент а) - компонент б) - компонент в); или

(β) компонент в) - компонент а) - компонент б),

где компоненты могут быть сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера или спейсера.

Особенно предпочтительным является вариант расположения (α), в котором по меньшей мере один агонист TLR содержит или состоит по меньшей мере из одного агониста TLR2, например:

(α1) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2;

(α2) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2, один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5;

(α3) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2, и один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4; или

(α4) компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5.

Альтернативно этому, в вариантах расположения, содержащих пептидный агонист TLR2, дополнительные пептидные агонисты TLR могут располагаться в комплексе в других положениях, например:

(α5) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2;

(α6) один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2; или

(α7) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2. Наиболее предпочтительным является вариант расположения (β), в котором по меньшей мере один агонист TLR содержит или состоит по меньшей мере из одного агониста TLR4, например:

(β1) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп)

(β2) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2 и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп);

(β3) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, и один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп); или

(β4) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп).

Альтернативно этому, в вариантах расположения, содержащих пептидный агонист TLR4, дополнительные пептидные агонисты TLR могут располагаться в комплексе в других положениях, например:

(β5) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2;

(β6) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5; или

(β7) один или несколько пептидных агонистов TLR4, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR4 - компонент а) (проникающий в клетку пептид) - компонент б) (по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп) - один или несколько пептидных агонистов TLR2, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR2, и один или несколько пептидных агонистов TLR5, например, 1, 2, 3, 4 или 5 пептидный(ых) агонист(ов) TLR5.

Альтернативно этому, только два из трех компонентов а), б) и в) соединяют посредством связи главная цепь/главная цепь в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению.

Например, компоненты а) и б) соединяют посредством связи главная цепь/главная цепь, получая тем самым следующее расположение компонентов а) и б) в комплексе, в направлении N-конец → С-конец главной цепи комплекса, при этом компоненты а) и б) необязательно могут быть сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера и т.д.:

(1) проникающий в клетку пептид (а) - антиген/антигенный эпитоп (б); или

(2) антиген/антигенный эпитоп (б) - проникающий в клетку пептид (а).

В таком случае компонент в), т.е. по меньшей мере один пептидный агонист TLR, затем можно соединять посредством связи главная цепь/боковая цепь, посредством связи боковая цепь/главная цепь или посредством связи боковая цепь/боковая цепь либо с проникающим в клетку пептидом (а), либо с антигеном/антигенным эпитопом (б), либо, если он присутствует, с дополнительным компонентом типа спейсера или линкера, который может, например, находиться между проникающим в клетку пептидом (а) и антигеном/антигенным эпитопом (б). Это предусматривает следующие варианты расположения:

(I) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом а), т.е. главная цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью проникающего в клетку пептида;

(II) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом а), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью проникающего в клетку пептида;

(III) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом а), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью проникающего в клетку пептида;

(IV) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом б), т.е. главная цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа;

(V) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом б), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа;

(VI) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом б), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа;

(VII) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом б), т.е. главная цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом б);

(VIII) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом б), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом б); или

(IX) компонент в) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом б), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного пептидного агониста TLR ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом б).

Например, компоненты б) и в) соединяют посредством связи главная цепь/главная цепь, получая тем самым следующее расположение компонентов б) и в) в комплексе, в направлении N-конец → С-конец главной цепи комплекса, при этом компоненты б) и в) необязательно могут быть сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера и т.д.:

(3) антиген/антигенный эпитоп (б) - пептидный агонист TLR (в); или

(4) пептидный агонист TLR (в) - антиген/антигенный эпитоп (б).

В таком случае компонент а), т.е. проникающий в клетку пептид, затем можно соединять посредством связи главная цепь/главная цепь, посредством связи боковая цепь/главная цепь или посредством связи боковая цепь/боковая цепь либо с антигеном/антигенным эпитопом (б), либо с пептидным агонистом TLR (в), либо, если он присутствует, с дополнительным компонентом типа спейсера или линкера, который может, например, находиться между антигеном/антигенным эпитопом (б) и пептидным агонистом TLR (в). Это предусматривает следующие варианты расположения:

(X) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом б), т.е. главная цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа;

(XI) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом б), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа;

(XII) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом б), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа;

(XIII) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом в), т.е. главная цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;

(XIV) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом в), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;

(XV) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом в), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;

(XVI) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом б) и компонентом в), т.е. главная цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом б);

(XVII) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом б) и компонентом в), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом б) и компонентом в); или

(XVIII) компонент а) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом б) и компонентом в), т.е. боковая цепь проникающего в клетку пептида ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом б) и компонентом в).

Например, компоненты а) и в) соединяют посредством связи главная цепь/главная цепь, получая тем самым следующее расположение компонентов б) и в) в комплексе, в направлении N-конец → С-конец главной цепи комплекса, при этом компоненты а) и в) необязательно могут быть сцеплены с помощью дополнительного компонента, например, линкера, спейсера и т.д.:

(5) проникающий в клетку пептид (а) - пептидный агонист TLR (в); или

(6) пептидный агонист TLR (в) - проникающий в клетку пептид (а).

В таком случае компонент б), т.е. по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, затем можно соединять посредством связи главная цепь/главная цепь, посредством связи боковая цепь /главная цепь или посредством связи боковая цепь/боковая цепь либо с проникающим в клетку пептидом (а), либо с пептидным агонистом TLR (в), либо, если он присутствует, с дополнительным компонентом типа спейсера или линкера, который может, например, находиться между проникающим в клетку пептидом (а) и пептидным агонистом TLR (в). Это предусматривает следующие варианты расположения:

(XIX) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом а), т.е. главная цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью проникающего в клетку пептида;

(XX) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом а), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью проникающего в клетку пептида;

(XXI) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом а), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью проникающего в клетку пептида;

(XXII) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с компонентом в), т.е. главная цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;

(XXIII) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с компонентом в), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;

(XXIV) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с компонентом в), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью по меньшей мере одного пептидного агониста TLR;

(XXV) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи главная цепь/боковая цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом в), т.е. главная цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом в);

(XXVI) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/главная цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом в), т.е. боковая цепь по меньшей мере по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с главной цепью линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом в); или

(XXVII) компонент б) может быть соединен - необязательно через спейсер или линкер - посредством связи боковая цепь/боковая цепь с линкером или спейсером, расположенным между компонентом а) и компонентом в), т.е. боковая цепь по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа ковалентно связана - необязательно через спейсер или линкер - с боковой цепью с линкера или спейсера, расположенного между компонентом а) и компонентом в).

Альтернативно этому, также можно в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, все три компонента а), б) и в) располагать посредством связи главная цепь/боковая цепь, связи боковая цепь/главная цепь или связи боковая цепь/боковая цепь, необязательно сцепленных с помощью дополнительного компонента, например, спейсера или линкера.

Колоректальный рак

В настоящем изобретении предложен описанный выше комплекс, предназначенный для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака.

Колоректальный рак (CRC, который называют также «рак кишечника») представляет собой рак, который включает раки ободочной кишки и раки прямой кишки (СС). Оба указанных рака имеют многие общие признаки, но исходные точки раков отличаются. Согласно данным Siegel R., С. Desantis и А. Jemal, Colorectal cancer statistics, 2014. CA Cancer J Clin, 64(2), 2014, cc. 104-117, в США в период между 2006 и 2010 г.г. встречаемость области опухоли являлась несколько более частой в проксимальной части ободочной кишка (первая и средняя части ободочной кишки). Из примерно 19 случаев на 100000 человек на их долю приходится 42% случаев. Далее следует рак прямой кишки, на долю которого приходится 28% случаев, и дистальный рак (нижняя часть ободочной кишки), на долю которого приходится 10 случаев на 100000 человек.

Анатомически понятие «колоректальный рак» включает (I) раки ободочной кишки, такие как раки слепой кишки (включая раки илеоцекального клапана), аппендикса, восходящей ободочной кишки, печеночного (правого) изгиба, поперечной ободочной кишки, селезеночного изгиба, нисходящей ободочной кишки, сигмовидной ободочной кишки (раки сигмовидного изгиба), а также перекрывающихся областей ободочной кишки; (II) раки ректосигмовидного соединения, такие как раки ободочной кишки и прямой кишки и раки ректосигмовидного отдела, (III) раки прямой кишки, такие как раки ампулы прямой кишки.

Предпочтительно колоректальный рак представляет собой рак ободочной кишки, такой как рак слепой кишки (включая рак илеоцекального клапана), рак аппендикса, рак восходящей ободочной кишки, рак печеночного изгиба, рак поперечной ободочной кишки, рак селезеночного изгиба, рак нисходящей ободочной кишки, рак сигмовидной ободочной кишки (включая раки сигмовидного изгиба), или их комбинацию.

Предпочтительно также колоректальный рак представляет собой рак ректосигмовидного соединения, такой как (I) рак ободочной кишки и прямой кишки или (II) рак ректосигмовидного отдела.

Кроме того, предпочтительно также колоректальный рак представляет собой рак прямой кишки, такой как рак ампулы прямой кишки.

В зависимости от типа клеток колоректальные раки включают колоректальную аденокарциному, колоректальные стромальные опухоли, первичную колоректальную лимфому, колоректальную леймиосаркому, колоректальную меланому, колоректальную плоскоклеточную карциному и колоректальные карциноидные опухоли, такие, например, как карциноидные опухоли слепой кишки, аппендикса, восходящей ободочной кишки, поперечной ободочной кишки, нисходящей ободочной кишки, сигмовидной ободочной кишки и/или прямой кишки. Так, предпочтительные колоректальные раки включают колоректальную аденокарциному, колоректальные стромальные опухоли, первичную колоректальную лимфому, колоректальную леймиосаркому, колоректальную меланому, колоректальную плоскоклеточную карциному и колоректальные карциноидные опухоли, такие, например, как карциноидные опухоли слепой кишки, аппендикса, восходящей ободочной кишки, поперечной ободочной кишки, нисходящей ободочной кишки, сигмовидной ободочной кишки и/или прямой кишки. Более предпочтительно колоректальный рак представляет собой колоректальную аденокарциному или колоректальную карциноидную карциному. Еще более предпочтительно колоректальный рак представляет собой колоректальную аденокарциному.

Более 95% CRC представляют собой аденокарциномы. Колоректальные аденокарциномы, как правило, начинаются из железистых клеток, которые образуют слизь для смазывания ободочной кишки или прямой кишки. CRC, как правило, начинается в самом внутреннем слое и может прорастать через некоторые или все другие слои. В редких случаях CRC может образовывать полип, что облегчает его прорастание в стенку исходной области. При запущенной стадии (стадия III и IV) рак проникает в близлежащие лимфатические узлы или отдаленные части организма через кровеносные сосуды.

Например, при колоректальном раке система классификации злокачественных опухолей (TNM) включает следующие стадии первичных опухолей (“Т”-стадии): ТХ - первичная опухоль не поддается обнаружению, Т0 - отсутствует проявление первичной опухоли, Та - неинвазивная папиллярная карцинома, Tis - карцинома in situ: внутриэпителиальная или инвазия в собственную пластинку, Т1 - инвазия опухолей под слизистую оболочку, Т2 - инвазия опухолей в собственную мускулатуру, Т3 - инвазия опухолей через собственную мускулатуру в периколоректальные ткани, Т4а - проникновение опухолей на поверхность висцеральной брюшины и T4b - непосредственное внедрение или прикрепление опухолей к другим органам или структурам; следующие стадии для лимфатических узлов (“N”-стадии): NX - состояние регионарных лимфатических узлов не поддается оценке, N0 - в регионарных лимфатических узлах отсутствует метастаз, N1 - метастаз в 1-3 регионарных лимфатических узлах, где N1a - метастаз в 1 регионарном лимфатическом узле, N1b - метастаз в 2-3 регионарных лимфатических узлах и N1c - депозит(ы) опухоли в субсерозной, брыжеечной или неперитонеализированной перикишечной или периректальной тканей без метастаза в регионарные узлы, N2 - метастаз в 4 или большем количестве лимфатических узлов, где N2a - метастаз в 4-6 регионарных лимфатических узлах и N2b - метастаз в 7 или большем количестве регионарных лимфатических узлов; и следующие стадии для отдаленного метастаза (“М”-стадии): М0 - отдаленный метастаз отсутствует и M1 - отдаленные метастазы, где M1a - метастаз, подтвержденный для 1 органа или области (например, печень, легкое, яичник, нерегионарный узел) и M1b - метастазы в более, чем 1 органе/области или брюшине.

Указанные стадии можно объединять с использованием следующей нумерованной классификации стадий колоректального рака: стадия 0: Tis, N0, М0; стадия I: Т1, N0, М0 или Т2, N0, М0; стадия IIA: Т3, N0, М0; стадия IIB: Т4а, N0, М0; стадия IIC: T4b, N0, М0; стадия IIIA: Т1-Т2, N1/N1c, М0 или Т1, N2a, М0; стадия IIIB: Т3-Т4а, N1/N1c, М0 или Т2-Т3, N2a, М0, или Т1-Т2, N2b, М0; стадия IIIC: Т4а, N2a, М0 или Т3-Т4а, N2b, М0, или T4b, N1-N2, М0; стадия IVA: любая Т, любая N, М1а и стадия IVB: любая Т, любая N, M1b. В целом, на стадии 0, рак не выходит за внутренний слой ободочной кишки или прямой кишки; на стадии I рак распространяется из слизистой в мышечный слой; на стадии II рак распространяется через мышечный слой в серозный слой ближайших органов; на стадии III рак распространяется в ближайших(ие) лимфатический(ие) узел(ы) или раковые клетки распространяются в ткани вблизи лимфатических узлов; и на стадии IV рак распространяется через кровь и лимфатические узлы в другие части организма.

В отличие от понятия «рак», колоректальный рак включает все указанные выше пронумерованные стадии, и поэтому предпочтительную стадию колоректальный рак можно выбирать из группы, состоящей из стадии 0 (Tis, N0, М0), стадии I (Т1, N0, М0 или Т2, N0, М0), стадии IIA (Т3, N0, М0), стадии IIB (Т4а, N0, М0), стадии IIC (T4b, N0, М0), стадии IIIA (Т1-Т2, N1/N1c, М0 или Т1, N2a, М0), стадии IIIB (Т3-Т4а, N1/N1c, М0 или Т2-Т3, N2a, М0, или Т1-Т2, N2b, М0), стадии IIIC (Т4а, N2a, М0 или Т3-Т4а, N2b, М0, или T4b, N1-N2, М0), стадии IVA (любая Т, любая N, М1а) и стадии IVB (любая Т, любая N, M1b). Более предпочтительно колоректальный рак выбирают из группы, состоящей из стадии I (Т1, N0, М0 или Т2, N0, М0), стадии IIA (Т3, N0, М0), стадии IIB (Т4а, N0, М0), стадии IIC (T4b, N0, М0), стадии IIIA (Т1-Т2, N1/N1c, М0 или T1, N2a, М0), стадии IIIB (Т3-Т4а, N1/N1c, М0 или Т2-Т3, N2a, М0, или Т1-Т2, N2b, М0), стадии IIIC (Т4а, N2a, М0 или Т3-Т4а, N2b, М0, или or T4b, N1-N2, М0), стадии IVA (любая Т, любая N, М1а) и стадии IVB (любая Т, любая N, M1b). Еще более предпочтительно колоректальный рак выбирают из группы, состоящей из стадии IIA (Т3, N0, М0), стадии IIB (Т4а, N0, М0), стадии IIC (T4b, N0, М0), стадии IIIA (Т1-Т2, N1/N1c, М0 или T1, N2a, М0), стадии IIIB (Т3-Т4а, N1/N1c, М0 или Т2-Т3, N2a, М0, или Т1-Т2, N2b, М0), стадии IIIC (Т4а, N2a, М0 или Т3-Т4а, N2b, М0, или T4b, N1-N2, М0), стадии IVA (любая Т, любая N, M1a) и стадии IVB (любая Т, любая N, M1b). Наиболее предпочтительно колоректальный рак представляет собой (I) стадию III колоректального рака, такую как стадия IIIA (Т1-Т2, N1/N1c, М0 или T1, N2a, М0), стадия IIIB (Т3-Т4а, N1/N1c, М0 или Т2-Т3, N2a, М0, или Т1-Т2, N2b, М0) или стадия IIIC (Т4а, N2a, М0 или Т3-Т4а, N2b, М0, или T4b, N1-N2, М0), или (II) стадию IV колоректального рака, такую как стадия IVA (любая Т, любая N, М1а) и стадия IVB (любая Т, любая N, M1b).

Нуклеиновая кислота, кодирующая пептиды и белки комплексов

Другим объектом настоящего изобретения является нуклеиновая кислота, в частности, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая комплекс, указанный в настоящем описании, где комплекс представляет собой полипептид или белок, предназначенный для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака. В частности, в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, предназначенные для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака, указанные полинуклеотиды кодируют комплекс, который описан выше. Другими словами, в настоящем изобретении предложена, в частности, нуклеиновая кислота, в частности, молекула нуклеиновой кислоты, которая содержит полинуклеотид, где полинуклеотид кодирует комплекс, представленный в настоящем описании, и где комплекс представляет собой полипептид или белок, предназначенный для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака.

В настоящем изобретении предложена также нуклеиновая кислота, в частности, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая описанный выше комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, где комплекс представляет собой полипептид или белок. В частности, в настоящем изобретении предложены полинуклеотиды, которые кодируют комплекс, описанный выше. Другими словами, в настоящем изобретении предложена, в частности, нуклеиновая кислота, в частности, молекула нуклеиновой кислоты, содержащая полинуклеотид, где полинуклеотид кодирует описанный выше комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, и где комплекс представляет собой полипептид или белок. Указанную нуклеиновую кислоту можно применять для предупреждения и/или лечения колоректального рака.

Нуклеиновые кислоты предпочтительно содержат одноцепочечные, двухцпепочечные или частично двухцепочечные нуклеиновые кислоты, предпочтительно выбранные из геномной ДНК, кДНК, РНК, siPHК, антисмысловой ДНК, антисмысловой РНК, рибозима, комплементарных последовательностей РНК/ДНК со способствующими экспрессии элементами минигеном, генными фрагментами, регуляторными элементами, промоторами или без них, и их комбинаций. Другие предпочтительные примеры нуклеиновой кислоты (молекул) и/или полинуклеотидов включают, например, рекомбинантный полинуклеотид, вектор, олигонуклеотид, молекулу РНК, такую как рРНК, мРНК, miPHК, siPHК или тРНК, или молекулу ДНК, описанную выше. Таким образом, предпочтительно, чтобы нуклеиновая кислота (молекула) представляла собой молекулу ДНК или молекулу РНК; предпочтительно выбранную из геномной ДНК; кДНК; siPHК; рРНК; мРНК; антисмысловой ДНК; антисмысловой РНК; рибозима; комплементарных последовательностей РНК/ДНК; последовательностей РНК/ДНК со способствующими экспрессии элементами, регуляторными элементами и/или промоторами или без них; вектора; и их комбинаций.

Предпочтительно изобретение относится к нуклеиновой кислоте (предназначенной для применения), предлагаемой в настоящем изобретении, где указанная нуклеиновая кислота кодирует комплекс, который представляет собой, в частности, полипептид или белок, где комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, который представляет собой полипепид или белок, и по меньшей мере один пептидный агонист TLR, где проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и по меньшей мере один пептидный агонист TLR связаны ковалентно, необязательно с помощью пептидного(ых) спейсера(ов) или линкера(ов), указанного(ых) в настоящем описании. Если более одного антигена или антигенного эпитопа, который представляет собой полипептид или белок, содержится в указанном комплексе, то несколько антигенов или антигенных эпитопов также ковалентно связаны необязательно с помощью пептидного(ых) спейсера(ов) или линкера(ов), указанного(ых) в настоящем описании. Аналогично этому, если более одного пептидного агониста TLR содержится в указанном комплексе, то несколько пептидных агонистов TLR также ковалентно связаны, необязательно с помощью пептидного(ых) спейсера(ов) или линкера(ов), указанного(ых) в настоящем описании.

Особенно предпочтительно, нуклеиновая кислота (предназначенная для применения), предлагаемая в настоящем изобретении, кодирует комплекс, представляющий собой (рекомбинантный) слитый белок, который содержит (а) проникающий в клетку пептид, описанный выше, (б) по меньшей мере один, предпочтительно по меньшей мере два, более предпочтительно по меньшей мере три, еще более предпочтительно по меньшей мере четыре, особенно предпочтительно по меньшей мере пять, наиболее предпочтительно по меньшей мере шесть антигенов или антигенных эпитопов, описанных выше, предпочтительно расположенных последовательным образом, описанным выше, и (в) по меньшей мере один агонист TLR, описанный выше.

Наиболее предпочтительно нуклеиновая кислота (молекула) кодирует приведенный в качестве примера комплекс, представленный в настоящем описании, или функциональный вариант его последовательности. Таким образом, нуклеиновая кислота (молекула) наиболее предпочтительно содержит полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность соответствующую любой из SEQ ID NO: 26-28, 33-34, 37-41, 46, 69 или 72-87, или аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из последовательностей SEQ ID NO: 26-28, 33-34, 37-41, 46, 69 или 72-87. В частности, нуклеиновая кислота (молекула) наиболее предпочтительно содержит полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую любой из SEQ ID NO: 26-28, 33-34, 37-41, 46, 69 или 72-91, или аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 98% любой из SEQ ID NO: 26-28, 33-34, 37-41, 46, 69 или 72-91.

Наиболее предпочтительно нуклеиновая кислота (молекула), предлагаемая в настоящем изобретении, содержит полинуклеотид, который кодирует аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 89, или функциональный вариант этой последовательности, имеющий по меньшей мере 50%-ную идентичность последовательности (предпочтительно по меньшей мере 60%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 70%-ную, более предпочтительно по меньшей мере 75%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 80%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 85%-ную, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%-ную, особенно предпочтительно по меньшей мере 95%-ную, наиболее предпочтительно по меньшей мере 98%-ную или 99%-ную идентичность последовательности).

Получение и очистка комплексов

Следующим объектом настоящего изобретения является вектор, предпочтительно предназначенный для предупреждения и/или лечения колоректального рака, в частности, рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, описанную выше.

Понятие «вектор» в контексте настоящего изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, предпочтительно к искусственной молекуле нуклеиновой кислоты, т.е. молекуле нуклеиновой кислоты, которая не встречается в естественных условиях. Вектор в контексте настоящего изобретения можно применять для включения или укрытия требуемой нуклеотидной последовательности. Указанные векторы могут представлять собой векторы для хранения, экспрессионные векторы, клонирующие векторы, векторы для переноса и т.д. Вектор для хранения представляет собой вектор, который обеспечивает удобное хранение молекулы нуклеиновой кислоты. Так, вектор может содержать последовательность, соответствующую, например, требуемому комплексу, предлагаемому в настоящем изобретении. Экспрессионный вектор можно применять для получения продуктов экспрессии, таких как РНК, например, мРНК, или пептидов, полипептидов или белков. Например, экспрессионный вектор может содержать последовательности, необходимые для транскрипции участка последовательности вектора, такие как промоторная последовательность. Клонирующий вектор, как правило, представляет собой вектор, который содержит сайт клонирования, который можно использовать для включения нуклеотидных последовательностей в вектор. Клонирующий вектор может представлять собой, например, плазмидный вектор или вектор на основе бактериофага. Вектор для переноса может представлять собой вектор, пригодный для переноса молекул нуклеиновых кислот в клетки или организмы, например, вирусные векторы. Вектор в контексте настоящего изобретения может представлять собой, например, РНК-вектор или ДНК-вектор. Предпочтительно вектор представляет собой молекулу ДНК. Например, вектор в контексте настоящего описания содержит сайт клонирования, маркер для селекции, такой как фактор, обусловливающий устойчивость к антибиотикам, и последовательность, пригодную для размножения вектора, такую как сайт инициации репликации. Предпочтительно в контексте настоящего описания вектор представляет собой плазмидный вектор. Предпочтительно в контексте настоящего описания вектор представляет собой экспрессионный вектор.

Под объем изобретения подпадают также клетки, трансформированные вектором, описанным выше, предпочтительно предназначенным для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака. Примеры таких клеток включают (но, не ограничиваясь только ими) бактериальные клетки, например, Е. coli, и эукариотические клетки, например, клетки дрожжей, клетки животных или клетки растений. В одном из вариантов осуществления изобретения клетки представляют собой клетки млекопитающих, например, человека, СНО, HEK293T, PER.C6, NS0, клетки миеломы или клетки гибридомы. Таким образом, настоящее изобретение относится также к клетке, экспрессирующей комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; или содержащей вектор (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении.

В частности, клетку можно трансфектировать вектором, предлагаемым в настоящем изобретении, предпочтительно экспрессионным вектором. Понятие «трансфекция» относится к интродукции молекул нуклеиновых кислот, таких как молекулы ДНК или РНК (например, мРНК), в клетки, предпочтительно в эукариотические клетки. В контексте настоящего изобретения под понятие «трансфекция» подпадает любой известный специалисту в данной области метод интродукции молекул нуклеиновых кислот в клетки, предпочтительно в эукариотические клетки, например, в клетки млекопитающих. Указанные методы включают, например, электропорацию, липофекцию, например, на основе катионных липидов и/или липосом, осаждение фосфатом кальция, трансфекцию на основе наночастиц, трансфекцию на основе вирусов или трансфецию на основе катионных полимеров, таких как ДЭАЭ-декстран или полиэтиленимин и т.д. Предпочтительно интродукцию осуществляют без применения вирусов.

Можно использовать многочисленные экспрессионные системы, включая (но, не ограничиваясь только ими) хромосомы, эписомы и производные вирусов. Более конкретно применяемый вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, в частности, рекомбинантный вектор, можно получать из бактериальных плазмид, транспозонов, эписом дрожжей, элементов-вставок, элементов хромосом дрожжей, вирусов, таких как бакуловирус, вирусы папилломы, такие как SV40, вирусы коровьей оспы, аденовирусы, вирусы ветряной оспы, вирусы псевдобешенства, ретровирусы.

Например, указанные векторы, в частности рекомбинантные векторы, могут являться производными как космид, так и фагмид. Нуклеотидную последовательность, в частности, нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем изобретении, можно встраивать в рекомбинантный экспрессионный вектор с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области, таких, например, как методы, описанные в MOLECULAR CLONING: А LABORATORY MANUAL, Sambrook и др., 4-ое изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001.

Вектор, в частности, рекомбинантный вектор, может включать также нуклеотидные последовательности, которые контролируют регуляцию экспрессии, в частности нуклеиновую кислоту, предлагаемую в настоящем изобретении, а также нуклеотидные последовательности, обеспечивающие экспрессию, транскрипцию и трансляцию, в частности, нуклеиновую кислоту (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении. Как правило, эти последовательности выбирают в зависимости от применяемых клеток-хозяев.

Так, например, соответствующий секреторный сигнал можно интегрировать в вектор, предлагаемый в настоящем изобретении, в частности, в рекомбинантный вектор, так, чтобы полипептид или белок, кодируемый нуклеиновой кислотой (предназначенной для применения), предлагаемой в настоящем изобретении, направлялся, например, к полости эндоплазматического ретикулума, к периплазматическому пространству, к мембране или к внеклеточному окружению. Выбор соответствующего секторного сигнала может облегчать последующую очистку белка.

Еще одним объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин, предпочтительно предназначенная для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака, где клетка-хозяин содержит вектор, в частности, рекомбинантный вектор, указанный в настоящем описании.

Интродукцию вектора, в частности, рекомбинантного вектора, в клетку-хозяина можно осуществлять методами, хорошо известными специалисту в данной области, такими как описанные в BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis и др., 2-ое изд., изд-во McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, и MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, выше, включая, например описанную выше трансфекцию, например, с помощью фосфата кальция, ДЭАЭ-дектрана или катионных липидов; микроинъекцию, электропорацию, трансдукцию или заражение.

Клетка-хозяин может представлять собой, например, бактериальные клетки, такие как Е. coli, клетки грибов, такие как клетки дрожжей и клетки Aspergillus, Streptomyces, клетки насекомых и/или любые линии клеток, например, клетки яичника китайского хомячка (СНО), мышиную клеточную линию С127, клеточную линию BHK или клетки сирийского хомяка, клетки почки человеческого эмбриона 293 (HEK 293). Предпочтительно клетка-хозяин (предназначенная для применения), предлагаемая в настоящем изобретении, представляет собой клетку млекопитающего, например, человека, СНО, HEK293T, PER.C6, NS0, клетки миеломы или гибридомы. В качестве клетки-хозяина наиболее предпочтительными являются дендритные клетки и линии дендритных клеток. Как правило, выбор культуральной среды зависит, в частности, от выбора типа клеток и/или линии клеток, при этом, специалист в данной области обладает информацией о приемлемых культуральных средах, пригодных для выбранного типа клеток и/или линии клеток.

Клетки-хозяева можно применять, например, для экспрессии полипептида или белка, в частности, комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в настоящем изобретении, на основе вектора и/или нуклеиновой кислоты, предлагаемого/предлагаемой в настоящем изобретении. После очистки стандартными методами полипептида или белка, в частности, комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в настоящем изобретении, его можно применять в способе, указанном в настоящем описании.

Таким образом, настоящее изобретение относится также к способу получения комплекса, указанного в настоящем описании, в частности, когда комплекс представляет собой полипептид или белок. Указанный способ содержит стадии, на которых:

(I) культивируют описанную выше клетку-хозяина в культуральной среде; и

(II) отделяют комплекс, указанный в настоящем описании, от культуральной среды или отделяют комплекс, указанный в настоящем описании, от лизата клеток-хозяев после лизиса клеток-хозяев.

Таким образом, комплекс, полученный с помощью указанного способа, предлагаемого в настоящем изобретении, предпочтительно представляет собой комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении, который представлен в настоящем описании.

Для экстракции белка можно применять поступающие в продажу наборы и/или реагенты, например BugBuster™ фирмы Novagen.

Предпочтительно способ получения комплекса, указанного в настоящем описании, дополнительно включает следующую стадию, на которой:

(III) солюбилизируют комплекс, указанный в настоящем описании, например, путем ресуспендирования в растворах, содержащих мочевину или гуанидина гидрохлорид (GuHCl),

при этом стадию (III) осуществляют после описанной выше стадии (II).

Кроме того, предпочтительно, чтобы описанный выше способ получения комплекса, указанного в настоящем описании, дополнительно содержал следующую стадию, на которой:

(IV) очищают комплекс, указанный в настоящем описании, предпочтительно с помощью одной стадии аффинной хроматографии, при этом стадию (IV) осуществляют после стадии (II) или, если она присутствует, стадии (III), которые описаны выше.

Кроме того, комплекс, указанный в настоящем описании, можно получать также с помощью методов химического синтеза, например, с помощью твердофазного пептидного синтеза.

Очистку указанных пептидов или белков можно осуществлять посредством любого метода, известного в данной области для очистки белков/пептидов. Примеры методов включают ионообменную хроматографию, хроматографию гидрофобного взаимодействия и методы, основанные на иммуноаффинности.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен также способ получения комплекса, указанного в настоящем описании, включающий стадии, на которых:

(I) химически синтезируют указанный комплекс; и

(II) очищают указанный комплекс.

Предпочтительно в способе получения комплекса, указанного в настоящем описании, комплекс, химически синтезированный на стадии (I) и очищенный на стадии (II), содержит указанные в настоящем описании аминокислотные последовательности проникающего в клетку пептида, указанную в настоящем описании аминокислотную последовательность пептидного агониста TLR и, необязательно, если по меньшей мере один антиген и/или антигенный эпитоп представляет собой пептид или белок, то указанную в настоящем описании аминокислотную последовательность антигена или антигенного эпитопа.

Альтернативно этому, в настоящем изобретении предложен также способ получения комплекса, указанного в настоящем описании, в котором

(I) проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный фрагмент и/или по меньшей мере один пептидный агонист TLR синтезируют отдельно;

(II) необязательно проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный фрагмент и/или по меньшей мере один пептидный агонист TLR очищают; и

(III) проникающий в клетку пептид, по меньшей мере один антиген или антигенный фрагмент и/или по меньшей мере один пептидный агонист TLR ковалентно связывают, как описано выше, необязательно с помощью спейсера или линкера или с помощью описанного выше перекрестносшивающего агента.

Клетки, загруженные комплексами, предлагаемыми в изобретении

Другим объектом настоящего изобретения являются клетка, загруженная комплексом, указанным в настоящем описании, предпочтительно предназначенным для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака. Например, клетки, загруженные комплексом, указанным в настоящем описании, представляют собой клетки индивидуума, подлежащего лечению, в частности, выделенные клетки индивидуума, подлежащего лечению, т.е. клетки, выделенные из индивидуума, подлежащего лечения.

В контексте настоящего изобретения понятие «индивидуум» относится, в частности, к млекопитающим. Например, рассматриваемые в настоящем изобретении млекопитающие включают человека, приматов, одомашненных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи, лошади, лабораторные грызуны и т.п. Более предпочтительно понятие «индивидуум» относится к человеку.

В контексте настоящего изобретения понятия «лечение» и «лечить» и т.п., как правило, означают получение требуемого фармакологического и физиологического действия. Действие может быть профилактическим, относящимся к предупреждению или частичному предупреждению заболевания, симптома или состояния, и/или может быть терапевтическим, относящимся к частичному или полному излечиванию заболевания, состояния, симптома или нежелательного явления, связанного с заболеванием. Под понятие «лечение» в контексте настоящего описания подпадает любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности у человека, и оно включает: (а) предупреждение возникновения заболевания у индивидуума, который предрасположен к заболеванию, но у которого заболевание еще не началось, и/или заболевание еще не диагностировано у этого индивидуума, например, профилактическое раннее асимптоматическое вмешательство; (б) ингибирование заболевания, т.е. прекращение или замедление его развития; или (в) ослабление заболевания, т.е. вызывание по меньшей мере частичного регресса заболевания и/или по меньшей мере одного из его симптомов или состояний, таких как улучшение или излечение повреждения. В частности, способы, варианты применения, препараты и композиции, предлагаемые в изобретении, пригодны для лечения различных видов рака или инфекционных заболеваний и/или для предупреждения развития различных видов рака до запущенной или метастатической стадии у индивидуумов с ранней стадией рака, облегчая тем самым стадию рака. При применении в случае разных видов рака предупреждение заболевания или нарушения включает предупреждение появления или развития рака у индивидуума, у которого идентифицирован риск развития указанного вида рака, например, связанный с известным наличием этого вида рака у родственников индивидуума, и предупреждение заражения стимулирующими опухоль патогенами, такими, например, как вирус Эпштейна-Барра (EBV), вирус папилломы человека (HPV), вирус гепатита В (HBV), вирус гепатита С (HCV), вирус герпеса человека типа 8 (HHV8), вирус человеческого Т-клеточного лейкоза типа 1 (HTLV-1), вирус полиомы из клеток Меркеля (MCV) и Helicobacter pylori. Под понятия «предупреждение/лечение» рака подпадает также стабилизация или замедление уже диагностированного рака у индивидуума. По «стабилизацией» понимают предупреждение развития рака в запущенную или метастатическую стадию у индивидуумов с ранней стадией рака.

Предпочтительно клетка, загруженная комплексом, указанным в настоящем описании, представляет собой антигенпрезентирующую клетку (АРС). Предпочтительно антигенпрезентирующие клетки выбирают из группы, состоящей из дендритной клетки (DC), макрофага и В-клетки. Дендритные клетки, в частности, дендритные клетки (обычные и/или плазмацитоидные), выделенные из индивидуума, подлежащего лечению, являются более предпочтительными.

Методы выделения антигенпрезентирующих клеток, в частности дендритных клеток, из индивидуума известны специалистам в данной области. Они включают сбор моноцитов или гематопоэтических стволовых клеток из костного мозга, пуповинной крови или периферической крови. Они включают также применения эмбриональных стволовых (ES) клеток и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS). Антигенпрезентирующие клетки, в частности, дендритные клетки или их предшественники, можно обогащать методами, которые включают отмучивание и разделение на основе магнитных гранул, которые можно применять для обогащения CD14⁺-клеток-предшественников.

Методы загрузки комплекса, указанного в настоящем описании, в клетки, предпочтительно в вышеуказанные антигенпрезентирующие клетки, более предпочтительно в дендритные клетки, а также методы получения таких клеток перед введением индивидууму известны специалисту в данной области. Например, получение дендритных клеток может включать их культивирование или дифференцировку с использованием цитокинов, которые могут включать, например, GM-CSF и IL-4. Можно применять также линии дендритных клеток. Загрузка комплекса, предлагаемого в изобретении, в клетки, предпочтительно в АРС, более предпочтительно в дендритные клетки, может включать совместную инкубацию комплекса, предлагаемого в изобретении, с клетками в культуре, с использованием свойств, присущих проникающему в клетку пептиду, который содержится в комплексе, указанном в настоящем описании (т.е. его способности к интернализации). Дополнительное культивирование клеток, например, дендритных клеток, загруженных таким образом, может включать для индукции эффективного созревания добавление цитокинов, включая IL-1β, IL-6, TNFα, ПЭГ2, IFNα, и адъювантов, которые могут включать поли-IC, поли-ICLC (т.е. синтетического комплекса карбоксиметилцеллюлозы, двухцепочечной РНК полиинозиновой-полицитидиловой кислоты и поли-L-лизина), а также агонисты TLR и агонисты NLR (рецепторы, подобные олигонуклеотидсвязывающему домену олигомеризации).

Способ получения клеток, в частности, антигенпрезентирующих клеток, загруженных комплексом, указанном в настоящем описании, может включать стадии, на которых:

(I) трансдуцируют или трансфектируют указанные клетки комплексом, предлагаемым в изобретении;

(II) культивируют указанные клетки в культуральной среде; и

(III) отделяют указанные клетки от культуральной среды.

Предпочтительно клетки загружают комплексом, указанным в настоящем описании, где комплекс представляет собой полипептид или белок, и применяют для предупреждения и/или лечения колоректального рака.

Предпочтительно клетки, загруженные комплексом(ами), указанным(и) в настоящем описании, и который(е) применяют для предупреждения и/или лечения колоректального рака, презентируют по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, содержащийся в указанном комплексе, на клеточной поверхности в контексте ГКГС класса I и/или в контексте ГКГС класса II.

Композиции и наборы, предлагаемые в настоящем изобретении

Другим объектом изобретения является композиция, предпочтительно предназначенная для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака, где композиция содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из:

(I) комплекса, который описан выше,

(II) нуклеиновой кислоты, которая описана выше,

(III) вектора, который описан выше,

(IV) клетки-хозяина, которая описана выше, и

(V) клетки, загруженной комплексом, указанным в настоящем описании, которая описана выше.

Предпочтительно композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит комплекс, который описан выше.

Композиция (предназначенная для применения), предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать также более одного из вышеуказанных компонентов (I)-(V). Например, композиция (предназначенная для применения), предлагаемая в настоящем изобретении, может содержать по меньшей мере два различных комплекса, указанных в подпункте (I), по меньшей мере две различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II), по меньшей мере два различных вектора, указанных в подпункте (III), по меньшей мере две различные клетки-хозяева, указанные в подпункте (IV), и/или по меньшей мере две различные клетки, указанные в подпункте (V); например, композиция (предназначенная для применения), предлагаемая в изобретении, может содержать по меньшей мере два различных комплекса, указанных в подпункте (I), и/или по меньшей мере две различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II).

Например, различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться либо компонентом а), т.е. проникающими в клетку пептидами, либо компонентом б), т.е. антигенами или антигенными эпитопами или поднаборами из нескольких антигенов или антигенных эпитопов, либо компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR или поднабором из нескольких пептидных агонистов TLR; или различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться двумя из трех компонентов а), б) и в); или различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться всеми тремя компонентами а), б) и в) комплекса. Соответственно различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они кодируют указанные различные комплексы; различные векторы, указанные в подпункте (III), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные нуклеиновые кислоты; различные клетки-хозяева, указанные в подпункте (IV), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные векторы; и различные загруженные комплексом клетки, указанные в подпункте (V), которые содержатся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они загружены указанными различными комплексами.

В настоящем изобретении предложена также вакцина, предпочтительно предназначенная для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака, где вакцина содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из:

(I) комплекса, который описан выше,

(II) нуклеиновой кислоты, которая описана выше,

(III) вектора, который описан выше,

(IV) клетки-хозяина, которая описана выше, и

(V) клетки, загруженной комплексом, которая описана выше.

Предпочтительно вакцина (предназначенная для применения), предлагаемая в настоящем изобретении, содержит комплекс, указанный в настоящем описании.

При этом детали, описанные выше применительно к композиции (предназначенной для применения), предлагаемой в настоящем изобретении, которые касаются использования более одного компонента (I)-(V), применимы также и к вакцине (предназначенной для применения), предлагаемой в настоящем изобретении.

В контексте настоящего изобретения понятие «вакцина» относится к биологическому препарату, обусловливающему врожденный и/или адаптивный иммунитет, как правило, к конкретному заболеванию, предпочтительно раку. Так, вакцина поддерживает врожденный и/или адаптивный иммунный ответ иммунной системы индивидуума, подлежащего лечению. Например, антиген или антигенный эпитоп комплекса, указанного в настоящем описании, как правило, обусловливает или поддерживает адаптивный иммунный ответ у пациента, подлежащего лечению, а пептидный агонист TLR комплекса, указанного в настоящем описании, может обусловливать или поддерживать врожденный иммунный ответ.

Предлагаемая в изобретении композиция, в частности предлагаемая в изобретении вакцина, может содержать также указанные ниже фармацевтически приемлемые носитель, адъювант и/или наполнитель для предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. Согласно конкретному варианту предлагаемой в изобретении композиции, в частности, предлагаемой в изобретении вакцины, выбор фармацевтически приемлемого носителя определяется в принципе тем путем, которым вводят предлагаемую в изобретении композицию, в частности, предлагаемую в изобретении вакцину. Предлагаемую в изобретении композицию, в частности, предлагаемую в изобретении вакцину, можно применять, например, системно или местно. Пути системного введения, в целом, включают, например, чрескожный, оральный, парентеральный пути, включая подкожные, внутривенные, внутримышечные, внутриартериальные, внутрикожные и внутрибрюшинные инъекции и/или интраназальный путь введения. Пути местного применения, в целом, включают, например, местное нанесение, но также и внутрикожные, чрескожные, подкожные или внутримышечные инъекции или инъекции внутрь повреждения, внутричерепные, внутрилегочные, внутрисердечные, внутринодальные (внутрь лимфатических узлов) и подъязычные инъекции. Более предпочтительно предлагаемую в изобретении композицию, в частности, вакцины, можно вводить внутрикожным, подкожным, внутринодальным или внутримышечным путем. Еще более предпочтительно предлагаемую в изобретении композицию, в частности, вакцину, можно вводить подкожным, внутринодальным или внутримышечным путем. Особенно предпочтительно предлагаемую в изобретении композицию, в частности, вакцины, можно вводить подкожным или внутринодальным путем. Наиболее предпочтительно предлагаемую в изобретении композицию, в частности, вакцины, можно вводить подкожным путем. Таким образом, предлагаемую в изобретении композицию, в частности, предлагаемые в изобретении вакцины, предпочтительно приготавливать в жидкой (или иногда твердой) форме.

Приемлемое количество предлагаемой в изобретении композиции, в частности, предлагаемой в изобретении вакцины, подлежащей введению, можно определять с помощью общепринятых экспериментов с использованием животных моделей. Такие модели включают (но, не ограничиваясь только ими) модели, созданные с использованием кроликов, овец, мышей, крыс, собак и приматов кроме человека. Предпочтительные стандартные лекарственные формы для инъекции включают стерильные растворы воды, физиологического раствора или их смеси. рН таких растворов следует доводить примерно до 7,4. Приемлемые носители для инъекции включают гидрогели, устройства для контролируемого или замеленного высвобождения, полимолочную кислоту и коллагеновые матриксы. Приемлемые фармацевтически приемлемые носители для местного применения включают носители, которые пригодны для применения в лосьонах, кремах, гелях и т.п. Если предлагаемая в изобретении композиция, в частности, предлагаемая в изобретении вакцина, предназначена для орального введения, то предпочтительной стандартной лекарственной формой являются таблетки, капсулы и т.п. Фармацевтически приемлемые носители для получения стандартных лекарственных форм, которые можно использовать для орального введения, известны из существующего уровня техники. Их выбор зависит от вторичных параметров, таких как вкус, стоимость и стабильность при хранении, которые не имеют решающего значения для целей настоящего изобретения, и выбор легко может сделать специалист в данной области.

Предлагаемая в изобретении композиция, в частности, предлагаемая в изобретении вакцина, может содержать дополнительно одну или несколько вспомогательных субстанций для дополнительного повышения иммуногенности. Тем самым предпочтительно достигается синергетическое действие предлагаемого в изобретении комплекса, указанного выше, и вспомогательной субстанции, которая необязательно может содержаться в предлагаемой в изобретении вакцине, описанной выше. В этой связи в зависимости от различных типов вспомогательных субстанций можно рассматривать различные механизмы. Например, соединения, которые способствуют созреванию дендритных клеток (DC), например липополисахариды, TNF-альфа или лиганд CD40, образуют первый класс приемлемых вспомогательных субстанций. В целом, в качестве вспомогательной субстанции можно применять любой агент, который влияет на иммунную систему по типу «сигнал опасности» (LPS, GP96 и т.д.), или цитокины, такие как GM-CSF, способствующие усилению и/или таргетному воздействию иммунного ответа, который вырабатывается в ответ на стимулирующий иммунитет адъювант, предлагаемый в изобретении. Наиболее предпочтительными вспомогательными субстанциями являются цитокины, такие как монокины, лимфокины, интерлейкины или хемокины, которые дополнительно способствуют врожденному иммунному ответу, такие как IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, LT-бета или TNF-альфа, факторы роста, такие как hGH.

Следующими добавками, которые можно включать в предлагаемую в изобретении вакцину, являются эмульгаторы, такие, например, как Tween^®; смачивающие агенты, такие, например, как лаурилсульфат натрия; красители; придающие вкус агенты; фармацевтические носители; агент для формования таблеток; стабилизаторы; антиоксиданты; консерванты.

Предлагаемая в изобретении композиция, в частности, предлагаемая в изобретении вакцина, может содержать также любое дополнительное соединение, для которого известно наличие иммуностимулирующих свойств благодаря аффинности связывания (в качестве лигандов) с человеческими Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, или благодаря аффинности связывания (в качестве лигандов) с мышиными Толл-подобными рецепторами TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13.

Другим классом соединений, которые в этом контексте можно добавлять в предлагаемую в изобретении композицию, в частности, в предлагаемую в изобретении вакцину, могут являться нуклеиновые кислоты CpG, в частности CpG-РНК или CpG-ДНК. CpG-РНК или CpG-ДНК могут представлять собой одноцепочечную CpG-ДНК (ssCpG-ДНК), двухцепочечную CpG-ДНК (dsДНК), одноцепочечную CpG-РНК (ssCpG-РНК) или двухцепочечную CpG-РНК (dsCpG-РНК). Нуклеиновая кислота CpG предпочтительно находится в форме CpG-РНК, более предпочтительно в форме одноцепочечной CpG-РНК (ssCpG-РНК). Нуклеиновая кислота CpG предпочтительно содержит по меньшей мере одну или несколько (митогенную(ых)) динуклеотидную(ых) цитозин/гуаниновую(ых) последовательность(ей) (CpG-мотив(ы)). Согласно первой предпочтительной альтернативе по меньшей мере один CpG-мотив в этих последовательностях, в частности С (цитозин) и G (гуанин) CpG-мотива, является неметилированным. Все другие цитозины или гуанины, необязательно содержащиеся в этих последовательностях, могут быть метилированными, либо неметилированными. Однако согласно дополнительной предпочтительно альтернативе С (цитозин) и G (гуанин) CpG-мотива могут присутствовать также в метилированной форме.

В настоящем изобретении предложена также фармацевтическая композиция, предпочтительно предназначенная для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака, в частности, композиция вакцины, описанная выше, и способ лечения индивидуума, предпочтительно млекопитающего и наиболее предпочтительно человека, который страдает колоректальным раком.

В частности, в настоящем изобретении предложена также фармацевтическая композиция (предназначенная для применения) для предупреждения и/или лечения колоректального рака, содержащая по меньшей мере один комплекс, указанный в настоящем описании, или по меньшей мере одну клетку, загруженную комплексом, указанным в настоящем описании, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель или любой эксципиент, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области, в частности, фармацевтическая композиция, содержащая по меньшей мере один комплекс, указанный в настоящем описании, или по меньшей мере одну клетку, загруженную комплексом, указанным в настоящем описании, и фармацевтически приемлемый носитель.

В качестве дополнительного ингредиента предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция может содержать, в частности, фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель. В контексте настоящего изобретения фармацевтически приемлемый носитель, как правило, включает жидкую или нежидкую основу предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции. Если предлагаемая в изобретении композиция находится в жидкой форме, то носитель должен, как правило, представлять собой свободную от пирогенов воду; изотонические соляные или забуференные (водные) растворы, например, забуференные фосфатом, цитратом и т.д. растворы. В частности, для инъекции предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно использовать воду или предпочтительно буфер, более предпочтительно водный буфер, содержащий натриевую соль, предпочтительно по меньшей мере 30 мМ натриевую соль, кальциевую соль, предпочтительно по меньшей мере 0,05 мМ кальциевую соль, и необязательно калиевую соль, предпочтительно по меньшей мере 1 мМ калиевую соль. Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения натриевая, кальциевая и необязательно калиевая соль может находиться в форме их галогенидов, например, хлоридов, йодидов или бромидов, в форме их гидроксидов, карбонатов, бикарбонатов или сульфатов и т.д. Примеры натриевых солей включают (но, не ограничиваясь только ими), в частности, NaCl, NaI, NaBr, Na₂CO₃, NaHCO₃, Na₂SO₄, примеры необязательных калиевых солей включают, в частности, KCl, KI, KBr, K₂CO₃, KHCO₃, K₂SO₄, а примеры кальциевых солей включают, в частности, CaCl₂, CaI₂, CaBr₂, СаСО₃, CaSO₄, Са(ОН)₂. Кроме того, в буфере могут содержаться органические анионы вышеуказанных катионов. Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения указанный выше буфер, который можно применять для целей инъекции, может содержать соль, выбранную из хлорида натрия (NaCl), хлорида кальция (CaCl₂) и необязательно хлорида калия (KCl), при этом, помимо хлоридов могут присутствовать дополнительные анионы. CaCl₂ можно заменять также другой солью типа KCl. Как правило, соли в буфере для инъекций присутствуют в концентрации по меньшей мере 30 мМ в случае хлорида натрия (NaCl), по меньшей мере 1 мМ в случае хлорида калия (KCl) и по меньшей мере 0,05 мМ в случае хлорида кальция (CaCl₂). Буфер для инъекций может быть гипертоническим, изотоническим или гипотоническим относительно конкретной референс-среды, т.е. буфер может иметь более высокое, идентичное или более низкое содержание солей относительно конкретной референс-среды, при этом предпочтительно можно применять вышеуказанные соли в таких концентрациях, которые не приводят к повреждению клеток в результате осмоса или других зависящих от концентрации эффектов. Референс-среды представляют собой, например, жидкости, присутствующие в методах «in vivo», такие как кровь, лимфа, цитозольные жидкости или другие жидкости организма или, например, жидкости, которые можно использовать в качестве референс-сред в методах «in vitro», такие как обычные буферы или жидкости. Такие обычные буферы или жидкости известны специалистам в данной области. Предпочтительными в качестве жидкой основы являются соляной раствор (0,9% NaCl) и лактированный раствор Рингера.

Предпочтительно (фармацевтическая) композиция, которая содержит комплекс, указанный в настоящем описании, дополнительно содержит аргинин, например, L-аргинин.

Однако в предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно применять также один или несколько совместимых твердых или жидких наполнителей или разбавителей, или капсулирующих соединений, которые можно использовать для введения индивидууму, подлежащему лечению. Понятие «совместимый» в контексте настоящего описания означает, что эти составляющие предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно смешивать с указанным выше комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении, таким образом, что отсутствует взаимодействие, которое могло бы приводит к существенному снижению фармацевтической эффективности предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции в обычных условиях применения. Фармацевтически приемлемые носители, наполнители и разбавители должны, естественно, иметь достаточно высокую степень чистоты и достаточной низкую токсичность для того, чтобы их можно было бы применять для введения индивидууму, подлежащему лечению. Некоторыми примерами соединений, которые можно применять в качестве фармацевтически приемлемых носителей, наполнителей или составляющих, являются сахара, такие, например, как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие, например, как кукурузный крахмал или картофельный крахмал; целлюлоза и ее производные, такие, например, как натриевая соль карбоксиметилцеллюлозы, этилцеллюлоза, ацетат целлюлозы; порошкообразный трагакант; солод, желатин; жир; твердые вещества, обеспечивающие скольжение, такие, например, как стеариновая кислота, стеарат магния; сульфат кальция; растительные масла, такие, например, как арахисовое масло, масло из семян хлопчатника, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и масло из теобромы (шоколадное дерево); полиолы, такие, например, полипропиленгликоль, глицерин, сорбит, маннит и полиэтиленгликоль; альгиновая кислота.

Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить орально, парентерально, путем ингаляции спрея, местно, ректально, назально, трансбуккально, вагинально или с помощью имплантированного резервуара. В контексте настоящего описания понятие парентерально включает подкожную, внутривенную, внутримышечную, внутрисуставную, в синовиальную жидкость, надчревную, внутриоболочечную, внутрипеченочную, внутрь повреждения, внутричерепную, чрескожную, внутрикожную, внутрилегочную, внутрибрюшинную, внутрисердечную, внутриартериальную, внутринодальную и подъязычную инъекцию или инфузию. Предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить внутрикожно, внутримышечно, внутринодально или подкожно. Более предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить внутримышечно, внутринодально или подкожно. Еще более предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить внутринодально или подкожно. Наиболее предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить подкожно. Также особенно предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить подкожно или внутрикожно.

Предпочтительно предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно вводить с помощью парентеральной инъекции, более предпочтительно подкожной, внутривенной, внутрисуставной, внутрь синовиальной жидкости, надчревной, внутриоболочечной, внутрипеченочной, внутрь повреждения, внутричерепной чрескожной, внутрикожной, внутрилегочной, внутрибрюшинной, внутрисердечной, внутриартериальной, внутринодальной и подъязычной инъекции или инфузии. Стерильные инъецируемые формы предлагаемых в изобретении фармацевтических композиций могут представлять собой водную или маслянистую суспензию. Эти суспензии можно приготавливать с помощью методов, известных в данной области, с использованием приемлемых диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный инъецируемый препарат может также представлять собой стерильный инъецируемый раствор или инъецируемую суспензию в нетоксичном приемлемом для парентерального введения разбавителе или растворителе, таком, например, как раствор в 1,3-бутандиоле. Среди приемлемых наполнителей и растворителей, которые можно применять, следует упомянуть воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, в качестве растворителя или суспендирующей среды, как правило, применяют стерильные нелетучие масла. Для этой цели можно применять мягкое нелетучее масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицериды можно применять в препаратах для инъекции в виде встречающихся в естественных условиях фармацевтически приемлемых масел, таких как оливковое масло или касторовое масло, прежде всего в виде их полиоксиэтилированных производных. Эти масляные растворы или суспензии могут содержать также спирт с длинной цепью с качестве разбавителя или диспергирующего агента, такой как карбоксиметилцеллюлоза или аналогичные диспергирующие агенты, которые обычно применяют для приготовления фармацевтически приемлемых лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. Для приготовления предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции можно применять также общепринятые поверхностно-активные вещества, такие как Твины, Спаны и другие эмульгирующие агенты или биологически доступные энхансеры, которые обычно применяют для производства фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм.

Для внутривенной, кожной или подкожной инъекции или инъекции в область поражения действующее вещество должно предпочтительно находиться в форме приемлемого для парентерального введения водного раствора, свободного от пирогенов и имеющего приемлемую величину рН, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области могут приготавливать приемлемые растворы, используя, например, придающие изотоничность наполнители, такие как хлорид натрия для инъекций, раствор Рингера для инъекций, лактированный раствор Рингера для инъекций. Можно включать при необходимости консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Вне зависимости от того, применяют ли полипептид, пептид или молекулу нуклеиновой кислоты, другое фармацевтически приемлемое соединение, предлагаемое в изобретении, которое следует вводить индивидууму, введение предпочтительно осуществляют в «профилактически эффективном количестве» или «терапевтически эффективном количестве» (в зависимости от ситуации), которое является достаточным для оказания благоприятного воздействия на индивидуума. Фактически вводимое количество и скорость, и продолжительность введения должны зависеть от природы и серьезности состояния, подлежащего лечению.

Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию, указанную выше, можно вводить также орально в виде любой приемлемой для орального введения лекарственной формы, включая (но, не ограничиваясь только ими) капсулы, таблетки, водные суспензии или растворы. В случае таблеток для орального применения общепринятые носители представляют собой лактозу и кукурузный крахмал. Как правило, добавляют также замасливатели, такие как стеарат магния. Для орального введения в форме капсулы приемлемыми разбавителями являются лактоза и безводный кукурузный крахмал. Когда для орального введения требуются водные суспензии, то действующее вещество, т.е. указанный выше предлагаемый в изобретении, транспортер конъюгированной карго-молекулы, указанной выше, объединяют с эмульгирующими и суспендирующими агентами. При необходимости можно добавлять определенные подслащивающие вещества, корргиенты или красители.

Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно применять также местно, прежде всего, если мишень обработки включает области или органы, легкодоступные для местного нанесения, например, включая заболевания кожи или любой другой доступной эпителиальной ткани. Приемлемые местные препаративные формы легко приготавливать для каждой/каждого из указанных областей или органов. Для местного применения предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно приготавливать в виде приемлемой мази, содержащей предлагаемую в изобретении иммуностимулирующую композицию, в частности ее компоненты, описанные выше, суспендированные или растворенные в одном или нескольких носителях. Носители для местного применения включают (но, не ограничиваясь только ими) минеральное масло, жидкий вазелин, белый вазелин, пропиленгликоль, полиоксиэтилен, прлиоксипропилен, эмульгирующийся воск и воду. Альтернативно этому, предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно приготавливать в форме приемлемого лосьона или крема. В контексте настоящего изобретения приемлемые носители включают (но, не ограничиваясь только ими) минеральное масло, сорбитанмоностеарат, полисорбат 60, сложные цетиловые эфиры воска, цетеариловый спирт, 2-октилдодеканол, бензиловый спирт и воду.

В этом контексте предписание лечения, например, выбор доз и т.д. при применении описанной выше фармацевтической композиции, находится в компетенции обычных практикующих специалистов и других врачей, и, как правило, при этом учитываются нарушение, подлежащее лечению, состояние индивидуального пациента, место введения, метод обработки и другие факторы, известные практикующему специалисту. Примеры упомянутых выше методик и протоколов можно почерпнуть из REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 160-е изд., под ред. Osol А., 1980.

Таким образом, предлагаемая в изобретении фармацевтическая композиция, как правило, содержит в «безопасном и эффективном» количестве компоненты предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции, в частности указанного выше комплекса, представленного в настоящем описании, и/или клеток, загруженных указанным комплексом. В контексте настоящего описания «безопасное и эффективное количество» означает количество комплекса, указанного в настоящем описании, которое является достаточным для существенной индукции положительных изменений заболевания или нарушения, т.е. количество комплекса, указанного в настоящем описании, или клеток, загруженных указанным комплексом, которое вызывает биологический или медицинский ответ в рассматриваемой ткани, системе, у животного или человека. Эффективное количество может представлять собой «терапевтически эффективное количество» для облегчения симптомов заболевания или состояния, подлежащего лечению, и/или «профилактически эффективное количество» для профилактики симптомов заболевания или состояния, подлежащего предупреждению. Понятие включает также количество активного комплекса, достаточное для замедления развития заболевания, в частности, для снижения или ингибирования роста опухоли или инфекции, и тем самым вызывает ожидаемый ответ, в частности, указанный ответ может представлять собой иммунный ответ, направленный против антигенов или антигенных эпитопов, которые содержатся в комплексе (т.е. «ингибирующее эффективное количество»). Однако, в то же время «безопасное и эффективное количество» является достаточно небольшим, чтобы избегать серьезных побочных действий, т.е. обеспечивает разумное соотношение между пользой и риском. Указанные пределы, как правило, определяются разумными медицинскими решениями. «Безопасное и эффективное» количество компонентов предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции, в частности, указанного выше комплекса, представленного в настоящем описании, должно также варьироваться в зависимости от конкретного состояния, подлежащего лечению, а также возраста и физического состояния пациента, подлежащего лечению, веса тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени обработки, скорости экскреции, комбинации лекарственных средств, активности конкретных компонентов а), б) и в) описанного выше комплекса, представленного в настоящем описании, серьезности состояния, продолжительности лечения, природы сопутствующей терапии, конкретного применяемого фармацевтически приемлемого носителя и аналогичных факторов, которые являются известными и находятся в компетенции соответствующего врача. Предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию можно применять для человека, а также в ветеринарной медицине, предпочтительно в медицине человека, в качестве фармацевтической композиции в целом, или в качестве вакцины.

Фармацевтические композиции, в частности, композиции вакцины, или препаративные формы, предлагаемые в изобретении, можно вводить в виде фармацевтической препаративной формы, которая может содержать комплекс, представленный в настоящем описании, в любой форме, указанной в настоящем описании.

Понятия «фармацевтическая препаративная форма» и «фармацевтическая композиция» в контексте настоящего изобретения относится, в частности, к препаратам, которые находятся в форме, обеспечивающей биологическую активность действующего(их) вещества(в), таким образом, чтобы оно(и) однозначно проявляло(и) эффективность, и которая не содержит дополнительный компонент, который может обладать токсичностью для индивидуумов, которым должна вводиться указанная препаративная форма.

В контексте настоящего изобретения «эффективность» лечения можно измерять на основе изменений протекания заболевания в ответ на применение, предлагаемое в настоящем изобретении, или на способ, предлагаемый в настоящем изобретении. Например, эффективность лечения рака можно измерять по снижению объема опухоли и/или удлинению времени жизни без прогрессирования заболевания, и/или снижению риска рецидива после резекции первичного рака. Более конкретно, при раке, который лечат с помощью иммунотерапии, оценка эффективности может включать спектр клинических картин противоопухолевого ответа на иммунотерапевтические агенты с использованием новых критериев ответа на иммунотерапию (irRC), которые являются адаптацией критериев оценки ответа солидных опухолей (RECIST), и критерии Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) (J. Natl. Cancer Inst. 102(18), 2010, сс. 1388-1397). Эффективность предупреждения инфекционного заболевания в конечном счете оценивают с помощью эпидемиологических исследований человеческих популяций, которые часто коррелируют с титрами нейтрализующих антител в сыворотке, и по индукции многофункциональных патогенспецифических Т-клеточных ответов. Доклиническая оценка может включать устойчивость к инфекции после контрольного заражения инфекционным патогеном. Лечение инфекционного заболевания можно оценивать по ингибированию роста патогена или элиминации патогена (и, как следствие, отсутствию поддающегося обнаружению патогена), что коррелирует с патогенспефическими антителами и/или Т-клеточными иммунными ответами.

Фармацевтические композиции, в частности композиции вакцины, или препаративные формы, предлагаемые в изобретении, можно вводить также в виде фармацевтической препаративной формы, которая может содержать антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в изобретении, в любой указанной в настоящем описании форме.

Вакцину и/или композицию (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении, можно приготавливать также в виде фармацевтических композиций и их стандартных доз, в частности, в сочетании с общепринятыми адъювантами, иммуномодулирующим агентом, носителем, разбавителем или эксципиентом, которые описаны выше и будут описаны ниже, в такой форме их можно применять в виде твердых препаратов, таких как таблетки или заполненные капсулы, или в виде жидкостей, таких как растворы, суспензии, эмульсии, эликсиры, или заполненные ими капсулы, все для орального применения, или в форме стерильных инъецируемых растворов для парентерального (включая подкожное и внутрикожное введение), которые вводят с помощью инъекции или непрерывной инфузии.

В контексте настоящего изобретения, в частности, в контексте фармацевтической композиции и вакцин, предлагаемых в настоящем изобретении, основой инъецируемых композиций, как правило, является инъецируемый стерильный физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор, или другие инъецируемые носители, известные в данной области. Указанные фармацевтические композиции и их формы в виде стандартных доз могут содержать ингредиенты в общепринятых пропорциях, с добавлением дополнительных действующих веществ или ингредиентов или без них, и такие стандартные дозы могут содержать в любом пригодном эффективном количестве действующее вещество, в соответствии с предполагаемым диапазоном суточных доз при применении.

Примеры приемлемых адъювантов и/или иммуномодулирующих агентов в контексте настоящего изобретения включают MPL® (фирма Corixa), минералы на основе алюминия, включая производные алюминия (как правило, называемые квасцами), ASO1-4, MF59, фосфат кальция, липосомы, Iscom, полиинозиновую-полицитидиловую кислоту (полиIС), включая ее стабилизированную форму поли-ICLC (фирма Hiltonol), CpG-олигодезоксинуклеотиды, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), липополисахарид (LPS), монтанид, сополимер полилактида-полигликолида (PLG), флагеллин, сапонины коры мыльного дерева (QS21), аминоалкилглюкозамиды (например, RC529), два компонента антибактериальных пептидов с синтетическими олигодезоксинуклеотидами (например, IC31), имиквимод, резиквимод, иммуностимулирующие последовательности (ISS), монофосфорил-липид A (MPLA), фибробласт-стимулирующий липопептид (FSL1) и антитела к CD40.

Композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины (предназначенные для применения), предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой жидкие препаративные формы, включая (но, не ограничиваясь только ими) водные или масляные суспензии, растворы, эмульсии, сиропы и эликсиры. Композиции можно приготавливать также в виде безводного продукта, предназначенного для восстановления водой или другим пригодным наполнителем перед применением. Указанные жидкие препараты могут содержать добавки, включая (но, не ограничиваясь только ими) суспендирующие агенты, эмульгирующие агенты, неводные наполнители и консерванты. Суспендирующие агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) сироп сорбита, метилцеллюлозу, сироп глюкозы/сахара, желатин, гидроксиэтилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, гель стеарата алюминия и гидрогенизированные съедобные жиры. Эмульгирующие агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) лецитин, сорбитанмоноолеат и гуммиарабик. Консерванты включают (но, не ограничиваясь только ими) метил- или пропил-пара-гидроксибензоат и сорбиновую кислоту. Диспергирующие или смачивающие агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) поли(этиленгликоль), глицерин, бычий сывороточный альбумин, Tween®, Span®.

Композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины (предназначенные для применения), предлагаемые в настоящем изобретении, можно приготавливать также в виде препарата в форме депо, который можно вводить путем имплантации или внутримышечной инъекции.

Композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины (предназначенные для применения), предлагаемые в настоящем изобретении, могут находиться в форме твердых композиций, которые могут иметь форму таблеток или лепешек, которые приготавливают общепринятым образом. Например, таблетки и капсулы для орального введения могут содержать общепринятые эксципиенты, включая (но, не ограничиваясь только ими) связывающие агенты, наполнители, замасливатели, разрыхлители и смачивающие агенты. Связывающие агенты включают (но, не ограничиваясь только ими) сироп, гуммиарабик, желатин, сорбит, трагакант, клейкое вещество из крахмала и поливинилпирродидон. Наполнители включают (но, не ограничиваясь только ими) лактозу, сахар, микрокристаллическую целлюлозу, кукурузный крахмал, фосфат кальция и сорбит. Замасливатели включают (но, не ограничиваясь только ими) стеарат магния, стеариновую кислоту, тальк, полиэтиленгликоль и кремнезем. Разрыхлители включают (но, не ограничиваясь только ими) картофельный крахмал и натрий гликолят крахмала. Смачивающие агенты включают (но, не ограничиваясь только им) лаурилсульфат натрия. На таблетки можно наносить покрытие с помощью известных в данной области методов.

Композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины (предназначенные для применения), предлагаемые в настоящем изобретении, можно вводить также в виде форм с замедленным высвобождением или систем для доставки лекарственных форм с замедленным высвобождением.

Кроме того, композиции, в частности, фармацевтические композиции и вакцины (предназначенные для применения), предлагаемые в настоящем изобретении, можно адаптировать для доставки путем многократного введения.

Дополнительные материалы, а также методы обработки препаративных форм и т.п., которые можно применять в контексте композиций, в частности, фармацевтических композиций и вакцин (предназначенных для применения) или в контексте их получения, изложены в «части 5 Remington's «The Science and Practice of Pharmacy», 22-ое изд., изд-во University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins, 2012.

Следующим объектом настоящего изобретения являются также состоящие из частей наборы, предпочтительно предназначенные для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака, которые содержат по меньшей мере один из следующих компонентов:

(I) комплекс, который описан выше,

(II) нуклеиновую кислоту, которая описана выше,

(III) вектор, который описан выше,

(IV) клетку-хозяина, которая описана выше, и

(V) клетку, загруженную комплексом, которая описана выше.

В частности, состоящий из частей набор, предлагаемый в изобретении, может содержать более одного компонента (I)-(V). Например, состоящий из частей набор, предлагаемый в настоящем изобретении, может содержать по меньшей мере два различных комплекса, указанных в подпункте (I), по меньшей мере две различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II), по меньшей мере два различных вектора, указанных в подпункте (III), по меньшей мере две различные клетки-хозяева, указанные в подпункте (IV), и/или по меньшей мере две различные клетки, указанные в подпункте (V); например, состоящей из частей набор, предлагаемый в изобретении, может содержать по меньшей мере два различных комплекса, указанных в подпункте (I), и/или по меньшей мере две различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II).

Например, различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться либо компонентом а), т.е. проникающими в клетку пептидами, либо компонентом б), т.е. антигенами или антигенными эпитопами или поднаборами из нескольких антигенов или антигенных эпитопов, либо компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR или поднаборами из нескольких пептидных агонистов TLR; или различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться двумя из трех компонентов а), б) и в); различные комплексы, указанные в подпункте (I), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться всеми тремя компонентами а), б) и в) комплекса. Соответственно, различные нуклеиновые кислоты, указанные в подпункте (II), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться тем, что они кодируют указанные различные комплексы; различные векторы, указанные в подпункте (III), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные нуклеиновые кислоты; различные клетки-хозяева, указанные в подпункте (IV), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные векторы; и различные клетки, загруженные комплексом, указанные в подпункте (V), которые входят в описанный выше состоящий из частей набор, могут отличаться тем, что они загружены указанными различными комплексами.

Различные компоненты состоящего из частей набора могут быть упакованы в один или несколько контейнеров. Указанные выше компоненты могут находиться в лиофилизированной или безводной форме или могут быть растворены в приемлемом буфере. Набор может содержать также дополнительные реагенты, включая, например, консерванты, среды для роста и/или буферы для хранения и/или восстановления вышеуказанных компонентов, промывочные растворы и т.п. Кроме того, состоящий из частей набор, предлагаемый в настоящем изобретении, необязательно может содержать инструкции по применению.

Кроме того, в настоящем изобретении предложен также набор для вакцинации для лечения, предупреждения и/или стабилизации колоректального рака, который содержит фармацевтическую композицию, указанную в настоящем описании, или вакцину, указанную в настоящем описании, и инструкции по применению указанной фармацевтической композиции или указанной вакцины для предупреждения и/или лечения колоректального рака.

Таким образом, в настоящем изобретении, предложен также набор, который содержит указанный в настоящем описании комплекс, указанную в настоящем описании клетку, указанную в настоящем описании композицию, указанную в настоящем описании вакцину и/или указанную в настоящем описании фармацевтическую композицию.

Предпочтительно указанный набор содержит также листовку-вкладыш в упаковку или листок с инструкцией по применению для лечения колоректального рака с помощью указанного в настоящем описании комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в настоящем изобретении, указанной в настоящем описании клетки, указанной в настоящем описании композиции, указанной в настоящем описании вакцины, и/или указанной в настоящем описании фармацевтической композиции.

Предпочтительно также, чтобы помимо любых указанных выше в подпунктах (I)-(V) компонентов, набор содержал химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, которые указаны в настоящем описании в контексте комбинации, предназначенной для применения, указанного в настоящем описании.

Применение и способы, предлагаемые в изобретении

Другим объектом настоящего изобретения является применение одного из следующих компонентов: (I) комплекса, указанного в настоящем описании, и/или (II) клеток, таких как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, указанным в настоящем описании (для приготовления лекарственного средства), для предупреждения, лечения или стабилизации колоректального рака. Таким образом, в настоящем изобретении предложен любой из следующих компонентов: (I) комплекс, указанный в настоящем описании, и/или (II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, указанным в настоящем описании, для применения для предупреждения, лечения или стабилизации колоректального рака.

В настоящем изобретение предложен также комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, который обеспечивает транспорт и презентацию по меньшей мере одного антигена или антигенного эпитопа, содержащегося в комплексе, на клеточной поверхности антигенпрезентирующих клеток в контексте ГКГС класса I и/или ГКГС класса II, для применения для вакцинации и/или иммунотерапии.

Таким образом, другим объектом настоящего изобретения является способ предупреждения, лечения или подавления колоректального рака, где указанный способ включает введение указанному индивидууму любого одного из следующих компонентов: (I) комплекс, предлагаемый в изобретении, (II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в изобретении, или (III) фармацевтическая препаративная форма, содержащая компоненты, указанные в подпунктах (I)-(II).

Кроме того, в настоящем изобретении предложен способ вызывания или повышения у индивидуума иммунного ответа против одного или нескольких эпитопов, который зависит от CD4⁺-Т-клеток-хелперов и/или цитотоксических CD8⁺-Т-клеток, где указанный способ включает введение указанному индивидууму любого одного из следующих компонентов: (I) комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, (II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, или (III) фармацевтическая препаративная форма, содержащая компоненты, указанные в подпунктах (I)-(II).

Иммунный ответ, который зависит от CD4⁺ - и/или CD8⁺-ответа, можно определять по воспалительному ответу, ответу провоспалительных цитокинов, включающему увеличение экспрессии одной/одного или нескольких из мРНК или белков IFN-γ, TNF-α и IL-2 относительно уровня до введения соединений, предлагаемых в изобретении. Его можно измерять также по повышению частоты встречаемости или абсолютному количеству антигенспецифических Т-клеток после введения соединений, предлагаемых в изобретении, измеренному по окрашиванию мультимером HLA-пептида, с помощью ELISPOT-анализов, и в опытах по оценке гиперчувствительности замедленного типа. Его можно косвенно оценивать по увеличению титров антигенспецифических антител в сыворотке, которые зависят от антигенспецифических Т-клеток-хелперов.

В настоящем изобретении предложен способ вызывания или повышения у индивидуума иммунного ответа против одного или нескольких эпитопов, который рестриктирован по нескольким молекулам ГКГС класса I и/или нескольким молекулам ГКГС класса II, где указанный способ включает введение указанному индивидууму одного из следующих компонентов: (I) комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, (II) клеток, таких как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, или (III) фармацевтической препаративной формы, содержащей компоненты, указанные в подпунктах (I)-(II).

Способ вызывания или повышения у индивидуума иммунного ответа против одного или нескольких эпитопов, указанных в настоящем описании, который рестриктирован по нескольким молекулам ГКГС класса I и/или нескольким молекулам ГКГС класса II, можно оценивать по цитокиновому ответу, включающему увеличение экспрессии одной/одного или нескольких из мРНК или белков IFN-γ, TNF-α и IL-2 относительно уровня до введения соединений, предлагаемых в изобретении, после стимуляции in vitro Т-клеток индивидуальными пептидами, связывающимися дискретно с молекулами ГКГС класса I и класса II на антигенпрезентирующих клетках. Рестрикцию по различным молекулам ГКГС можно подтверждать с помощью антигенпрезентирующих клеток, которые экспрессируют различные молекулы ГКГС, или с помощью блокирующих ГКГС антител. Это можно измерять также по повышению частоты встречаемости или абсолютному количеству антигенспецифических Т-клеток после введения соединений, предлагаемых в изобретении, измеренному по окрашиванию мультимером HLA-пептида, в которых используют мультимеры, объединенные с дискретными молекулами ГКГС.

Предпочтительно в способах вызывания или повышения иммунного ответа против одного или нескольких антигенов или антигенных эпитопов, предлагаемых в настоящем изобретении, иммунный ответ направлен против одного или нескольких эпитопов ассоциированного с опухолью антигена или опухольспецифического антигена, такого, например, как комбинация эпитопов, указанных в настоящем описании.

В альтернативном или дополнительном варианте иммунный ответ может быть направлен против нескольких эпитопов антигенного белка патогена.

Представленные в настоящем описании способы, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для вызывания или повышения у индивидуума иммунного ответа против одного или нескольких эпитопов, которые рестрикированы по молекулам ГКГС класса I и/или молекулам ГКГС класса II.

В частности, в настоящем изобретении предложен способ предупреждения и/или лечения колоректального рака или инициации, повышения или пролонгирования противоопухолевого ответа у индивидуума, нуждающегося в этом, который включает введение индивидууму комплекса, содержащего:

проникающий в клетку пептид;

по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп; и

по меньшей мере один пептидный агонист TLR,

в котором компоненты а)-в) ковалентно связаны.

В указанном способе индивидууму предпочтительно вводят указанный в настоящем описании комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении, указанную в настоящем описании нуклеиновую кислоту, указанную в настоящем описании клетку, указанную в настоящем описании композицию, указанную в настоящем описании вакцину и/или указанную в настоящем описании фармацевтическую композицию.

Предпочтительно индивидуум имеет колоректальный рак и/или у него диагностирован колоректальный рак.

Другим объектом настоящего изобретения является применение любого одного из следующих компонентов: (I) комплекс, указанный в настоящем описании, и/или (II) клетки, такие как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, указанным в настоящем описании, для приготовления визуализирующей композиции, предназначенной для применения в методах визуализации в контексте (диагностирования) колоректального рака или для получения диагностической композиции («диагностических композиций»), предназначенной для диагностирования колоректального рака. Диагностическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, для диагностирования колоректального рака содержит по меньшей мере один компонент, выбранный из:

(I) комплекса, который описан выше,

(II) нуклеиновой кислоты, которая описана выше,

(III) вектора, который описан выше,

(IV) клетки-хозяина, которая описана выше, и

(V) клетки, загруженной комплексом, которая описана выше.

Предпочтительно диагностическая композиция, предлагаемая в настоящем изобретении, содержит описанный выше комплекс.

В частности, комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении, нуклеиновую кислоту, указанную в настоящем описании, клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемым в настоящем изобретении, предлагаемую в изобретении композицию, предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину, или наиболее предпочтительно предлагаемую в изобретении диагностическую композицию можно использовать в диагностике в качестве диагностического инструмента, например в анализах (in vivo или in vitro), например, в иммуноанализах, для обнаружения, прогнозирования, диагностирования или мониторинга колоректального рака.

Например, анализы (in vitro) можно осуществлять путем доставки комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в настоящем изобретении, клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемым в настоящем изобретении, предлагаемой в изобретении композиции, предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины или наиболее предпочтительно предлагаемой в изобретении диагностической композиции, к клеткам-мишеням, как правило, выбранным, например, из культивируемых клеток животных, человеческих клеток или микроорганизмов, и мониторинга клеточного ответа с помощью биофизических методов, как правило, известных специалистам в данной области. Применяемые для этого клетки-мишени, как правило, могут представлять собой культивируемые клетки (in vitro), например, клетки, выделенные из организма человека или животного, например, клетки крови, выделенные из организма человека или животного, или клетки in vivo, т.е. клетки, содержащиеся в органах или тканях живых животных или людей, или микроорганизмы, присутствующие в живых животных или людях. Особенно предпочтительными в этом контексте являются так называемые маркеры или метки, которые могут входить в комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении, и, в частности, в диагностическую композицию, предлагаемую в настоящем изобретении.

Следующим объектом изобретения является способ диагностирования колоректального рака у индивидуума, где способ включает введение любого из компонентов: (I) комплекса, предлагаемого в изобретении, (II) клеток, таких как антигенпрезентирующие клетки, загруженные комплексом, предлагаемым в изобретении, или (III) фармацевтической препаративной формы, содержащей компоненты, указанные в подпунктах (I)-(II), указанному индивидууму или ех vivo в образец, полученный из организма указанного индивидуума.

Предпочтительно варианты применения и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, включают введение комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в изобретении.

Кроме того, варианты применения и способы, предлагаемые в настоящем изобретении, включают введение нескольких комплексов, клеток или фармацевтических препаративных форм, предлагаемых в изобретении. Например, в вариантах применения и способах, предлагаемых в настоящем изобретении, применяют или вводят по меньшей мере два различных комплекса, при этом каждый комплекс содержит по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп, и указанный антиген или антигенный эпитоп или (если в указанном комплексе содержатся несколько антигенов или антигенных эпитопов) указанный поднабор антигенов или антигенных эпитопов различаются между двумя комплексами.

Например, различные комплексы (I), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться либо компонентом а), т.е. проникающими в клетку пептидами, либо компонентом б), т.е. антигенами или антигенными эпитопами, либо поднаборами из нескольких антигенов или антигенных эпитопов, либо компонентом в), т.е. пептидным агонистом TLR или поднабором из нескольких пептидных агонистов TLR; или различные комплексы (I), содержащиеся в композиции описанной выше, могут отличаться двумя из трех компонентов а), б) и в); или различные комплексы (I), содержащиеся в композиции описанной выше, могут отличаться всеми тремя компонентами а), б) и в) комплекса. Соответственно различные нуклеиновые кислоты (II), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они кодируют указанные различные комплексы; различные векторы (III), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные нуклеиновые кислоты; различные клетки-хозяева (IV), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они содержат указанные различные векторы; и различные клетки, загруженные комплексом (V), содержащиеся в описанной выше композиции, могут отличаться тем, что они загружены указанными различными комплексами.

Кроме того, в вариантах применения и способах, предлагаемых в настоящем изобретении, клетки, предлагаемые в настоящем изобретении, могут представлять собой антигенпрезентирующие клетки, в частности дендритные клетки, более предпочтительно дендритные клетки из индивидуума, подлежащего лечению.

Путь введения

Комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; нуклеиновую кислоту (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить любым описанным выше путем, в том числе, орально, парентерально, внутривенно, ректально или с помощью комбинации указанных путей введения. Парентеральное введение включает (но, не ограничиваясь только ими) внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное, подкожное, внутрикожное и внутримышечное введение. Предпочтительно комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом, предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину предпочтительно вводят энтеральным путем, таким как оральный, подъязычный и ректальный путь. Комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; нуклеиновую кислоту (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно применять также местным, внутриопухолевым, внутрикожным, подкожным, внутримышечным, интраназальным или внутринодальным путем. Комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; нуклеиновую кислоту (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно применять также в форме импланта, который обеспечивает медленное высвобождение композиций, а также с помощью медленной контролируемой i.v.-инфузии. Например, комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; нуклеиновую кислоту (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить подкожно или внутрикожно.

При введении комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в настоящем изобретении; нуклеиновой кислоты (предназначенной для применения), предлагаемой в настоящем изобретении; клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемым в настоящем изобретении; предлагаемой в изобретении композиции; предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины может требоваться несколько последовательных инъекций. Так, введение можно повторять по меньшей мере два раза, например один раз в качестве инъекций для первичной иммунизации, а затем в качестве бустерных инъекций/введений.

В частности, комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; нуклеиновую кислоту (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить многократно или постоянно. Комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; нуклеиновую кислоту (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить многократно или постоянно в течение периода времени, составляющего по меньшей мере 1, 2, 3 или 4 недели; 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10 или 12 месяцев; или 2, 3, 4 или 5 лет. Например, комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении, можно вводить дважды в день, один раз в день, каждые два дня, каждые три дня, один раз в неделю, каждые две недели, каждые три недели, один раз в месяц или каждые два месяца. Предпочтительно комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении, можно вводить многократно, например, один раз в неделю или (один раз) каждые две недели.

Кроме того, проникающий в клетку пептид, компоненты а), б) и в), т.е. по меньшей мере один антиген или антигенный эпитоп и по меньшей мере один пептидный агонист TLR, входящие в комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении, могут содержаться в различных композициях, которые смешивают перед введением или которые вводят одновременно индивидууму, нуждающемуся в этом.

Согласно одному из подходов комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; нуклеиновую кислоту (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить пациенту непосредственно, используя описанные выше пути введения, в частности, для фармацевтических композиций. Альтернативно этому, комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; нуклеиновую кислоту (предназначенную для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить пациенту с использованием подхода ex vivo, например, путем интродукции фармацевтической композиции, вакцины или предлагаемого в изобретении транспортера конъюгированной карго-молекулы, указанного выше, в клетки, предпочтительно аутологичные клетки, т.е. клетки, полученные из организма пациента, подлежащего лечению, и трансплантации этих клеток в подлежащую лечению область у пациента, необязательно, осуществляя сортировку и/или культивирование этих клеток до обработки.

Вводимая индивидууму доза в виде однократной дозы или нескольких доз должна значительно варьироваться в зависимости от различных факторов, включая фармакокинетические свойства, состояния и характеристики индивидуума (пол, возраст, вес тела, состояние здоровья, конституция), степени проявления симптомов, сопутствующей терапии, частоты обработок и требуемого действия.

Как правило, для лечения рака терапевтически эффективная доза комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в настоящем изобретении, составляет от примерно 0,01 до 5 мг на инъекцию, в частности от примерно 0,1 до 2 мг на инъекцию или от примерно 0,01 нмоля до 1 ммоля на инъекцию, в частности, от 1 нмоля до 1 ммоля на инъекцию, предпочтительно от 1 мкмоля до 1 ммоля на инъекцию.

Комбинированная терапия

Введение комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в настоящем изобретении; нуклеиновой кислоты (предназначенной для применения), предлагаемой в настоящем изобретении; клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемой в настоящем изобретении; предлагаемой в изобретении композиции; предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины согласно способам и вариантам применения, предлагаемым в изобретении, можно осуществлять индивидуально или в комбинации с соагентом, пригодным для лечения и/или стабилизации колоректального рака.

Например, в случае лечения, предупреждения или стабилизации колоректального рака, введение фармацевтических композиций согласно способам и вариантам применения, предлагаемым в изобретении, можно осуществлять в комбинации с субстанциями, применяемыми для общепринятой химиотерапии, которые направлены против солидных колоректальных опухолей, и для контроля возникновения метастазов, или любой другой молекулой, действие которой заключается в запуске запрограммированной гибели клеток, например, с соагентом, выбранным из представителей семейства факторов некроза опухоли, включая (но, не ограничиваясь только ими) Fas-лиганд и родственный фактору некроза опухоли (TNF) апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL). Согласно другому варианту осуществления изобретения введение комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в настоящем изобретении; нуклеиновой кислоты (предназначенной для применения), предлагаемой в настоящем изобретении; клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемой в настоящем изобретении; предлагаемой в изобретении композиции; предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины согласно способам и вариантам применения, предлагаемым в изобретении, можно осуществлять параллельно с лучевой терапией.

Под объем изобретения подпадает введение комплекса (предназначенного для применения), предлагаемого в настоящем изобретении; нуклеиновой кислоты (предназначенной для применения), предлагаемой в настоящем изобретении; клетки, такой как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемой в настоящем изобретении; предлагаемой в изобретении композиции; предлагаемой в изобретении фармацевтической композиции или предлагаемой в изобретении вакцины, где введение индивидууму осуществляют до, одновременно или последовательно с другими терапевтическими режимами или соагентами, пригодными для лечения и/или стабилизации колоректального рака и/или предупреждения рецидива колоректального рака (например, режимы с применением нескольких лекарственных средств), в терапевтически эффективном количестве. Указанный комплекс, указанную клетку, композицию, вакцину или фармацевтическую композицию, который/которую вводят одновременно с указанными соагентами, можно вводить в одной и той же или в различных композициях и с помощью одинакового(ых) или различного(ых) путей введения.

Указанные другие терапевтические режимы или соагенты можно выбирать из группы, состоящей из лучевой терапии, химиотерапии, хирургии, таргетной терапии (включающей применение малых молекул, пептидов и моноклональных антител) и антиангиогенной терапии. В контексте настоящего описания под антиангиогенной терапией подразумевается введение агента, который прямо или косвенно целенаправленно воздействует на ассоциированную с опухолью сосудистую сеть.

Таким образом, в настоящем изобретении предложена также комбинация (I) комплекса, указанного в настоящем описании; и

(II) химиотерапевтического агента, таргетного лекарственного средства и/или иммунотерапевтического агента, такого как модулятор иммунных контрольных точек.

Предпочтительно предназначенная для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака.

Традиционные химиотерапевтические агенты являются цитотоксическими, т.е. они действуют путем уничтожения клеток, которые быстро делятся, что является одним из основных свойств большинства раковых клеток. Предпочтительными химиотерапевтическими агентами для применения в комбинации с комплексом, указанным в настоящем описании, являются химиотерапевтические агенты, известные специалисту в данной области, предназначенные для лечения колоректального рака. Предпочтительные для применения в комбинации химиотерапевтические агенты включают 5-фторурацил (5-FU), капецитабин (Xeloda®), иринотекан (Camptosar®) и оксалиплатин (Eloxatin®). Предпочтительно также комплекс, указанный в настоящем описании, объединять с комбинированной химиотерапией, предпочтительно выбранной из (I) FOLFOX (5-FU, лейковорин и оксалиплатин); (II) СареОх (капецитабин и оксалиплатин); (III) 5-FU и лейковорин; (IV) FOLFOXIRI (лейковорин, 5-FU, оксалиплатин и иринотекан); и (V) FOLFIRI (5-FU, лейковорин и иринотекан). При нераспространившемся раке предпочтительной является комбинация с (I) FOLFOX (5-FU, лейковорин и оксалиплатин); (II) СареОх (капецитабин и оксалиплатин); или (III) 5-FU и лейковорин. В случае распространившегося рака предпочтительной является комбинация с (IV) FOLFOXIRI (лейковорин, 5-FU, оксалиплатин и иринотекан); (I) FOLFOX (5-FU, лейковорин и оксалиплатин); или (V) FOLFIRI (5-FU, лейковорин и иринотекан).

Таргентые лекарственные средства для применения в комбинации с комплексом, указанным в настоящем описании, для лечения колоректального рака включают лекарственные средства, мишенью которых является VEGF, и лекарственные средства, мишенью которых является EGFR. Предпочтительные примеры лекарственных средств, мишенью которых является VEGF, включают бевацизумаб (Avastin®), рамуцирумаб (Cyramza®) или зив-афлиберцепт (Zaltrap®). Предпочтительные примеры лекарственных средств, мишенью которых является EGFR, включают цетуксимаб (Erbitux®), панитумумаб (Vectibix®) или регорафениб (Stivarga®).

Иммунотерапевтические агенты для применения в комбинации с комплексом, указанным в настоящем описании, для лечения колоректального рака включают вакцины, химерные антигенные рецепторы (CAR), модуляторы контрольных точек и онколитические вирусные терапии.

Предпочтительные вакцины для применения в комбинации с комплексом, указанным в настоящем описании, для лечения колоректального рака включают TroVax, OncoVax, IMA910, ЕТВХ-011, MicOryx, ЕР-2101, MKC1106-РР, CDX-1307, V934/V935, MelCancerVac, импримPGG, FANG, тецемотид, AlloStim, DCVax, GI-6301, AVX701, OCV-C02.

Искусственные Т-клеточные рецепторы (известные также как химерные Т-клеточные рецепторы, химерные иммунорецепторы, химерные антигенные рецепторы (CAR)) представляют собой сконструированные рецепторы, которые придают произвольную специфичность иммунной эффекторной клетке. Искусственные Т-клеточные рецепторы (CAR) являются предпочтительными в контексте адаптивного переноса клеток. Для этой цели Т-клетки выделяют из организма пациента и модифицируют так, чтобы они экспрессировали рецепторы, специфические для колоректального рака. Т-клетки, которые в результате могут распознавать и уничтожать раковые клетки, повторно интродуцируют в организм пациента.

В контексте настоящего описания понятие «модулятор иммунных контрольных точек (который обозначают также как «модулятор контрольных точек) относится к молекуле или к соединению, которая/которое модулирует (например, полностью или частично снижает, ингибирует, взаимодействует с, активирует, стимулирует, повышает, усиливает или поддерживает) функцию одной или нескольких молекул контрольных точек. Таким образом, модулятор иммунных контрольных точек может представлять собой «ингибитор иммунных контрольных точек» (который обозначают также как «ингибитор контрольных точек» или «ингибитор») или «активатор иммунных контрольных точек» (который обозначают также как «активатор контрольных точек» или «активатор»). «Ингибитор иммунных контрольных точек» (который обозначают также как «ингибитор контрольных точек» или «ингибитор») полностью или частично снижает, ингибирует, взаимодействует с или негативно модулирует функцию одной или нескольких молекул контрольных точек. «Активатор иммунных контрольных точек» (который обозначают также как «активатор контрольных точек» или «активатор») полностью или частично активирует, стимулирует, повышает, усиливает, поддерживает или положительно модулирует функцию одной или нескольких молекул контрольных точек.

Модуляторы иммунных контрольных точек, как правило, обладают способностью модулировать (I) аутотолерантность (толерантность к «своему) и/или (II) амплитуду и/или продолжительность иммунного ответа. Предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек, применяемый согласно настоящему изобретению, модулирует функцию одной или нескольких человеческих молекул контрольных точек и, таким образом, является «модулятором человеческих контрольных точек».

Молекулы контрольных точек представляют собой молекулы, такие как белки, как правило, участвующие в путях иммунного ответа, и, например, регулируют активацию Т-клеток, пролиферацию Т-клеток и/или функцию Т-клеток. Таким образом, функция молекул контрольных точек, которая модулируется (например, полностью или частично снижается, ингибируется, подвергается взаимодействию с, активируется, стимулируется, повышается, усиливается или поддерживается) с помощью модуляторов контрольных точек, как правило, представляет собой (регуляцию) активацию Т-клеток, пролиферацию Т-клеток и/или функцию Т-клеток. Таким образом, молекулы иммунных контрольных точек регулируют и поддерживают аутотолерантность и продолжительность, и амплитуду физиологических иммунных ответов. Многие молекулы иммунных контрольных точек принадлежат к семейству B7:CD28 или к суперсемейству рецептора фактора некроза опухолей (TNFR) и путем связывания специфических лигандов активируют сигнальные молекулы, для которых характерен рекрутмент в цитоплазматический домен (см. Susumu Suzuki и др., Current status of immunotherapy. Japanese Journal of Clinical Oncology, 2016: doi: 10.1093/jjco/hyv201 [Epub ahead of print]; см., в частности, таблицу 1).

Предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек для применения в комбинации с комплексом, указанным в настоящем описании, для лечения колоректального рака, представляет собой активатор или ингибитор одной или нескольких молекул иммунных контрольных точек, выбранных из CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, ОХ40, GITR, ICOS, A2AR, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, TIM-3, VISTA, СЕАСАМ1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, GITR, TNFR и/или FasR/DcR3; или активатор или ингибитор одного или нескольких их лигандов.

Более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой активатор (ко)стимуляторной молекулы контрольной точки или ингибитор ингибирующей молекулы контрольной точки или их комбинацию. Таким образом, модулятор иммунных контрольных точек более предпочтительно представляет собой (I) активатор CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, ОХ40, GITR и/или ICOS или (II) ингибитор A2AR, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CD40, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR и/или FasR/DcR3.

Еще более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор ингибирующей молекулы контрольной точки (но предпочтительно не ингибитор стимуляторной молекулы контрольной точки). Таким образом, еще более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор A2AR, В7-Н3, В7-Н4, BTLA, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PDL-1, PD-L2, TIM-3, VISTA, CEACAM1, GARP, PS, CSF1R, CD94/NKG2A, TDO, TNFR и/или DcR3 их лиганда.

Предпочтительно также модулятор иммунных контрольных точек представляет собой активатор стимуляторной или костимуляторной молекулы контрольной точки (но предпочтительно не активатор ингибирующей молекулы контрольной точки). Таким образом, еще более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой активатор CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, ОХ40, GITR и/или ICOS или их лиганда.

Еще более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой модулятор пути CD40, пути IDO, пути CTLA-4 и/или пути PD-1. В частности, модулятор иммунных контрольных точек предпочтительно представляет собой модулятор CD40, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 и/или IDO, более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 и/или IDO или активатор CD40, еще более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-L1, PD-1 и/или IDO и наиболее предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4 и/или PD-1.

Еще более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой модулятор пути CD40, пути IDO, пути LAG3, пути CTLA-4 и/или пути PD-1. В частности, модулятор иммунных контрольных точек предпочтительно представляет собой модулятор CD40, LAG3, CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1 и/или IDO, более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-L1, PD-L2, PD-1, LAG3, и/или IDO или активатор CD40, еще более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4, PD-L1, PD-1, LAG3 и/или IDO, еще более предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор LAG3, CTLA-4 и/или PD-1 и наиболее предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор CTLA-4 и/или PD-1.

Таким образом, модулятор контрольных точек для применения в комбинации с комплексом, указанным в настоящем описании, для лечения колоректального рака, можно выбирать из известных модуляторов пути CD40, пути CTLA-4 или пути PD-1. Предпочтительно модулятор контрольных точек для применения в комбинации с комплексом, указанным в настоящем описании, для лечения колоректального рака можно выбирать из известных модуляторов пути CD40, пути LAG3, пути CTLA-4 или пути PD-1. Особенно предпочтительно модулятор контрольных иммунных точек представляет собой ингибитор PD-1. Предпочтительные ингибиторы пути CTLA-4 и пути PD-1 включают моноклональные антитела Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и тремелимумаб (фирма Pfizer/MedImmune), а также Opdivo^® (ниволумаб; фирма Bristol Myers Squibb), Keytruda^® (пембролизумаб; фирма Merck), дурвалумаб (фирма MedImmune/AstraZeneca), MEDI4736 (фирма AstraZeneca; см.. WO 2011/066389 A1), MPDL3280A (фирма Roche/Genentech; см. US 8217149 В2), пидилизумаб (СТ-011; фирма CureTech), MEDI0680 (АМР-514; фирма AstraZeneca), MSB-0010718C (фирма Merck), MIH1 (фирма Affymetrix) и ламбролизумаб (например, описанный как hPD109A и его гуманизированные производные h409A11, h409A16 и h409A17 в WO2008/156712; у Hamid и др., N. Engl. J. Med. 369, 2013, cc. 134-144). Более предпочтительные ингибиторы контрольных точек включают ингибиторы CTLA-4 Yervoy^® (ипилимумаб; фирма Bristol Myers Squibb) и тремелимумаб (фирма Pfizer/MedImmune), а также ингибиторы PD-1 Opdivo^® (ниволумаб; фирма Bristol Myers Squibb), Keytruda^® (пембролизумаб; фирма Merck), пидилизумаб (СТ-011; фирма CureTech), MEDI0680 (АМР-514; фирма AstraZeneca), АМР-224 и ламбролизумаб (например, описанный как hPD109A и его гуманизированные производные h409A11, h409A16 и h409A17 в WO 2008/156712; у Hamid и др., N. Engl. J. Med. 369, 2013, cc. 134-144). Как указано выше, предпочтительным примером ингибитора LAG3 является моноклональное антитело к LAG3 BMS-986016 (фирма Bristol-Myers Squibb). Другие предпочтительные примеры ингибитора LAG3 включают LAG525 (фирма Novartis), IMP321 (фирма Immutep) и LAG3-Ig, описанный в WO 2009/044273 А2 и у Brignon и др., Clin. Cancer Res. 15, 2009, cc. 6225-6231, а также мышиные или гуманизированные антитела, блокирующие человеческий LAG3 (например, IMP701, описанное в WO 2008/132601 А1), или полностью человеческие антитела, блокирующие человеческий LAG3 (например, описанные в ЕР 2320940 А2).

Предпочтительно модулятор иммунных контрольных точек не представляет собой модулятор CD40. В частности, предпочтительный модулятор иммунных контрольных точек не представляет собой лиганд CD40. Предпочтительно также модулятор иммунных контрольных точек не представляет собой антитело к CD40.

Предпочтительно также модулятор контрольных точек для применения в комбинации с комплексом, указанным в настоящем описании, для лечения колоректального рака, выбирают из группы, состоящей из пембролизумаба, ипилимумаба, ниволумаба, MPDL3280A, MEDI4736, тремелимумаба, авелумаба, PDR001, LAG525, INCB24360, варлимумаба, урелумаба, АМР-224 и СМ-24.

Онколитические вирусы создают для осуществления ими клеточного лизиса в результате их репликации в опухоли, инактивируя таким образом противораковый иммунный ответ. Терапию на основе онколитического вируса для применения в комбинации с комплексом, указанным в настоящем описании, для лечения колоректального рака, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из JX594 (дезактивирующий тимидинкиназу вирус оспы), ColoAd1 (аденовирус), NV1020 (полученный из HSV), ADXS11-001 (ослабленная вакцина на основе листерии), Reolysin® (специфическая форма человеческого реовируса), PANVAC (рекомбинантный вирус оспы CEA-MUC-1-TRICOM), Ad5-hGCC-PADRE (вакцина на основе рекомбинантного аденовируса) и vvDD-CDSR (вирус оспы).

В контексте настоящего описания понятие «примерно в одно и то же время» означает, в частности, одновременное введение или вариант, когда непосредственно после введения (I) химиотерапевтического агента, таргетного лекарственного средства и/или иммунотерапевтического агента, такого как модулятор иммунных контрольных точек, вводят (II) комплекс, или непосредственно после введения (I) комплекса вводят (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек. Специалисту в данной области должно быть очевидно, что понятие «непосредственно после» включает время, необходимее для подготовки второго введения - в частности, время, необходимое для экспозиции и дезинфекции места второго введения, а также при необходимости подготовки «устройства для введения» (например, шприца, насоса и т.д.). Одновременное введение включает также вариант, когда периоды введения (I) комплекса и (II) химиотерапевтического агента, таргетного лекарственного средства и/или иммунотерапевтического агента, такого как модулятор иммунных контрольных точек, перекрываются, или, например, вариант, когда один компонент вводят в течение более длительного периода времени, например, в течение 30 мин, 1 ч, 2 ч или более, например, путем инфузии, а другой компонент вводят в определенный момент времени в течение указанного длительного периода. Введение (I) комплекса и (II) химиотерапевтического агента, таргетного лекарственного средства и/или иммунотерапевтического агента, такого как модулятор иммунных контрольных точек, примерно в одно и то же время является особенно предпочтительным, если используют различные пути введения и/или введение в различные области.

Предпочтительно также (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, вводят последовательно. Это означает, что (I) комплекс вводят до или после (II) химиотерапевтического агента, таргетного лекарственного средства и/или иммунотерапевтического агента, такого как модулятор иммунных контрольных точек. При последовательном введении промежуток времени между введением первого компонента и введением второго компонента предпочтительно не превышает одну неделю, более предпочтительно не превышает 3 дня, еще более предпочтительно не превышает 2 дня и наиболее предпочтительно не превышает 24 ч. Наиболее предпочтительно (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, вводят в один и тот же день, при этом промежуток времени между введением первого компонента (модулятор контрольных точек или комплекс) и введением второго компонента (другой модулятор контрольных точек и комплекс) предпочтительно не превышает 6 ч, более предпочтительно не превышает 3 ч, еще более предпочтительно не превышает 2 ч и наиболее предпочтительно не превышает 1 ч.

Предпочтительно (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, вводят с помощью одного и того же пути введения. Предпочтительно также (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, вводят с помощью различных путей введения.

Кроме того, (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, предпочтительно находятся в различных композициях. Альтернативно этому, (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, предпочтительно находятся в одной и той же композиции.

Таким образом, в настоящем изобретении предложена фармацевтическая препаративная форма, содержащая комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в изобретении, или клетку (предназначенную для применения), предлагаемую в изобретении, прежде всего антигенпрезентирующую клетку (предназначенную для применения), предлагаемую в изобретении, в сочетании по меньшей мере с одним соагентом, которую можно применять для лечения и/или стабилизации рака, и/или предупреждения рецидива колоректального рака, и по меньшей мере один фармацевтически приемлемый носитель.

Кроме того, комплекс (предназначенный для применения), предлагаемый в настоящем изобретении; клетку, такую как антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом (предназначенным для применения), предлагаемую в настоящем изобретении; предлагаемую в изобретении композицию; предлагаемую в изобретении фармацевтическую композицию или предлагаемую в изобретении вакцину можно вводить после хирургического вмешательства, при котором удаляют солидные опухоли, в качестве профилактики рецидива и/или метастазов.

Кроме того, введение визуализирующей или диагностической композиции согласно способам и вариантам применения, предлагаемым в изобретении, можно осуществлять индивидуально или в комбинации с соагентом, пригодным для визуализации и/или диагностирования колоректального рака.

Индивидуумы

Настоящее изобретение можно применять для любого индивидуума, страдающего колоректальным раком или имеющего риск развития колоректального рака. В частности, терапевтический эффект указанного комплекса может проявляться в виде иммунного ответа, направленного против указанных антигенов или антигенных эпитопов, в частности, ответа, зависящего от CD4⁺-Т-клеток-хелперов и/или цитотоксических CD8⁺-T-клеток и/или рестриктированного по молекулам ГКГС класса I и/или молекулам ГКГС класса II.

Согласно настоящему изобретению индивидуумы предпочтительно подвергались хирургическому удалению опухоли.

Объем настоящего изобретения не ограничен конкретными вариантами осуществления изобретения, представленными в настоящем описании. Фактически специалистам в данной области после ознакомления с приведенным выше описанием и приведенными ниже чертежами должны стать очевидными различные модификации изобретения, которые можно осуществлять в дополнение к указанным в настоящем описании. Указанные модификации подпадают по объем прилагаемой формулы изобретения.

Все процитированные в настоящем описании ссылки включены в него в качестве ссылок.

Если не указано иное, то все технические и научные понятия, примененные в настоящем описании, имеют общепринятое значение, известное обычному специалисту в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя при воплощении изобретения на практике или тестировании настоящего изобретения можно применять методы и материалы, сходные или эквивалентные указанным в настоящем описании, ниже описаны приемлемые методы и материалы. Все публикации, заявки на патент, патенты и другие, упомянутые в настоящем описании ссылки полностью включены в него в качестве ссылки. В случае разногласия следует руководствоваться настоящим описанием, включая определения. Кроме того, материалы, методы и примеры представлены только с целью иллюстрации и не направлены на ограничение объема изобретения.

Краткое описание чертежей

Ниже представлено краткое описание прилагаемых чертежей. Чертежи предназначены для более подробной иллюстрации настоящего изобретения. Однако они никоим образом не предназначены для ограничения объема изобретения.

На чертежах показано:

на фиг. 1 - полученные в примере 1 данные об экспрессии маркера активации CD40 в полученных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали 300 нМ EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 или 25 нг/мл LPS в течение 48 ч. Осуществляли также окрашивание изотипа для каждого из условий (данные, полученные для изотипа не представлены на фиг. 1) (один эксперимент);

на фиг. 2 - полученные в примере 1 данные об экспрессии маркера активации CD86 в полученных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали 300 нМ EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 или нг/мл LPS в течение 48 ч. Осуществляли также окрашивание изотипа для каждого из условий (данные, полученные для изотипа не представлены на фиг. 2) (один эксперимент);

на фиг. 3 - полученные в примере 1 данные об экспрессии маркера активации HLADR в полученных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали 300 нМ EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 или нг/мл LPS в течение 48 ч. Осуществляли также окрашивание изотипа для каждого из условий (данные, полученные для изотипа не представлены на фиг. 3) (один эксперимент);

на фиг. 4 - полученные в примере 1 данные об экспрессии маркера активации CD83 в полученных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали 300 нМ EDAZ13Mad5, Z13Mad5, Mad5 или нг/мл LPS в течение 48 ч. Осуществляли также окрашивание изотипа для каждого из условий (данные, полученные для изотипа не представлены на фиг. 4) (один эксперимент);

на фиг. 5 - полученные в примере 2 данные о функциональной рестриктированной по ГКГС класса I кросс-презентации в мышиной системе in vitro с использованием полученных из костного мозга дендритных клеток (BMDC) и спленоцитов из различных трансгенных по TCR мышей. Для этой цели BMDC загружали в течение ночи 300 нМ EDAZ13Mad5, EDAMad5 или Mad5. Осуществляли мониторинг эффективности рестриктированной по ГКГС класса I презентации эпитопа OVACD8 и эпитопа gp 100 через 4 дня с помощью меченных CFSE OT1-клеток и P-Mel-клеток соответственно. Осуществляли мониторинг эффективности ограниченной по ГКГС класса II презентации эпитопа OVACD4 через 4 дня с помощью меченных CFSE ОТ2-клеток. В качестве контроля BMDC импульсно обрабатывали в течение 1 ч 5 мкМ пептидом (один эксперимент, репрезентативный для 2 отдельных экспериментов);

на фиг. 6 - полученные в примере 3 результаты для групп, обработанных соединениями в дозе 2 нмоля. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (Wk0 и Wk2), используя в дозе 2 нмоля EDAMad5 или EDAZ13Mad5. Группу, применяемую в качестве положительного контроля, вакцинировали Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA). У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашивание пентамером (3-4 мыши на группу, один эксперимент);

на фиг. 7 - полученные в примере 3 результаты для групп, обработанных соединениями в дозе 10 нмолей. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (Wk0 и Wk2) EDAMad5 или EDAZ13Mad5 в дозе 10 нмолей. Группу, применяемую в качестве положительного контроля, вакцинировали Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA). У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашивание пентамером (3-4 мыши на группу, один эксперимент);

на фиг. 8 - полученные в примере 3 данные о проценте позитивных по пентамеру CD8⁺-T-клеток во всех протестированных группах. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (Wk0 и Wk2), используя в дозе 10 нмолей EDAMad5 или EDAZ13Mad5. Группу, применяемую в качестве положительного контроля, вакцинировали Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA). У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашивание пентамером (3-4 мыши на группу, один эксперимент);

на фиг. 9 - полученные в примере 4 данные о росте опухолей у 7 мышей на группу (среднее ± СКО); *, р<0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (2-сторонний дисперсионный анализ). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d13) путем подкожной инъекции (s.c.) EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 или Mad5 и MPLA в дозе 10 нмолей (доза, эквимолярная EDA) в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля;

на фиг. 10 - полученные в примере 4 кривые роста индивидуальных опухолей (у каждой из 7 мышей на группу). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d13) путем подкожной (s.c.) инъекции в дозе 10 нмолей EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 или Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA) в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля;

на фиг. 11 - полученная в примере 4 (А) кривая выживаемости для 7 мышей на группу; *, р<0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (логранговый критерий) и (Б) кривая периода без прогрессирования опухоли для 7 мышей на группу; *, р<0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (логранговый критерий);

на фиг. 12 - полученные в примере 5 данные о количестве метастазов в каждой экспериментальной группе. Мышам линии C57BL/6 имплантировали i.v. 1×10⁵ опухолевых клеток меланомы линии B16-OVA и вакцинировали дважды (d0 и d9) путем подкожной (s.c.) инъекции в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, EDAMad5 или Z13Mad5 + MPLA (доза, эквимолярная EDA) или только MPLA в правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 13 и изымали легкие. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. **, р<0,01; ****, р<0,0001 (непарный t-критерий);

на фиг. 13 - полученные в примере 6 данные о количестве метастазов в каждой экспериментальной группе. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (d-21 и d-7) путем подкожной (s.c.) инъекции в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, EDAMad5 или Z13Mad5 + MPLA (доза, эквимолярная EDA) в правую боковую область. В день 0 мышам имплантировали i.v. 1×10⁵ опухолевых клеток меланомы линии B16-OVA. Мышей умерщвляли в день 14 и изымали легкие. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. *, р<0,05. ***, р<0,001 (непарный t-критерий);

на фиг. 14 - результаты, полученные в примере 8. Линии клеток HEK-hTLR2 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулировали 0,3 мкМ, 1 мкМ или 3 мкМ AnaxaZ13Mad5 или Z13Mad5Anaxa и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. Для получения положительного контроля использовали 500 нг/мл Pam3CSK4. (А) Добавляли 20 мкл супернатанта в среду для детекции QuantiBlue® и инкубировали при 37°С в течение 1 ч перед определением ОП (620 нм). (Б) Оценивали секрецию IL-8 (с помощью ELISA) в супернатанте;

на фиг. 15 - результаты, полученные в примере 9. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (Wk0 и Wk2), используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или AnaxaZ13Mad5. У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашивание пентамером (один эксперимент);

на фиг. 16 - результаты, полученные в примере 9. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (Wk0 и Wk2), используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или AnaxaZ13Mad5. У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашивание пентамером (один эксперимент с 4 мышами на группу). *, р<0,05;

на фиг. 17 - полученные в примере 10 данные о росте опухолей у 7 мышей на группу (среднее ± СКО). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d13) либо путем подкожной инъекции в дозе 10 нмолей AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, либо путем совместной s.c.-инъекции Z13Mad5 + Pam3CSK4 (доза, эквимолярная дозе Anaxa) в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. *, р<0,05; ***, р<0,001, ****, р<0,0001;

на фиг. 18 - полученные в примере 10 кривые роста индивидуальных опухолей (7 мышей на группу). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) либо путем подкожной инъекции в дозе 10 нмолей AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, либо путем совместной s.c.-инъекции Z13Mad5 + Pam3CSK4 (доза, эквимолярная Anaxa) в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля;

на фиг. 19 - полученные в примере 10 кривые выживаемости для 7 мышей на группу. Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d13) либо путем подкожной инъекции в дозе 10 нмолей AnaxZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, либо путем совместной s.c.-инъекции Z13Mad5 + Pam3CSK4 (доза, эквимолярная Anaxa) в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. *, р<0,05, **, р<0,01, ****, р<0,0001 (логранговый критерий);

на фиг. 20 - полученные в примере 11 кривые роста опухолей у 7 мышей на группу (среднее ± СКО). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d13) в дозе 2 нмоля путем подкожной инъекции Hp91Z13Mad5,

EDAZ13Mad5, Z13Mad5 Anaxa, Z13Mad5EDA или Z13Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA) в правую боковую область. *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; р<0,0001 (2-сторонний дисперсионный анализ в день 23);

на фиг. 21 - полученные в примере 11 кривые роста индивидуальных опухолей (7 мышей на группу). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) путем подкожной инъекции в дозе 2 нмоля Hp91Z13Mad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 Anaxa, Z13Mad5EDA или Z13Mad5 и MPLA (доза, эквимолярная EDA) в правую боковую область;

на фиг. 22 - полученные в примере 11 кривые выживаемости всех 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.). *, р<0,05; **, р<0,01 (логранговый критерий);

на фиг. 23 - полученные в примере 12 данные о росте опухолей у 7 мышей на группу (среднее значение ± СКО); ****, р<0,0001 (логранговый критерий). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d13) путем подкожной инъекции в правую боковую область Z13Mad5Anaxa в дозе либо 0,5 нмоля, либо 2 нмоля, либо 10 нмолей. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля;

на фиг. 24 - полученные в примере 13 данные о SIINFEKL-специфических CD8-Т-клеточных ответах, обнаруженных в крови мышей линии C57BL/6, вакцинированных три раза (один раз в Wk0, один раз в Wk2 и один раз в Wk4) s.c, i.d. или i.m. с использованием Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля (А) или 2 нмоля (Б). Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинации и осуществляли окрашиванием мультимером (один эксперимент с 4 мышами на группу). *, р<0,05;

на фиг. 25 - полученные в пример 13 данные об экспрессии KLRG1 (А) и экспрессии PD-1 (Б), для анализа которых использовали позитивные по мультимеру CD8-Т-клетки (один эксперимент с 4 мышами на группу). В целом, метод состоял в следующем: мышей линии C57BL/6 вакцинировали три раза (один раз в Wk0, один раз в Wk2 и один раз в Wk4) s.c, i.d. или i.m. с использованием Z13Mad5 Anaxa в дозе 2 нмоля. Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинации и осуществляли FACS-окрашивание;

на фиг. 26 - полученные в примере 14 данные о SIINFEKL-специфических CD8-T-клеточных ответах, обнаруженных у мышей линии C57BL/6, вакцинированных два раза (один раз в Wk0 и один раз в Wk2) внутринодально с использованием Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля. Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой вакцинации и осуществляли окрашиванием мультимером (3 мыши на группу);

на фиг. 27 - полученные в примере 15 данные о проценте позитивных по пентамеру клеток среди CD8-Т-клеток (А и Б; *, р<0,05) и средние геометрические значения для (экспрессии) KLRG1 у позитивных по пентамеру CD8-T-клеток (В и Г). В целом, метод состоял в следующем: мышей линии C57BL/6 вакцинировали 3 раза (А и В: Wk0, Wk2 и Wk4; Б и Г: Wk0, Wk2 и Wk8) s.c. с использованием Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля. У мышей брали кровь через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашиванием пентамером (один эксперимент, 4 мыши на группу);

на фиг. 28 - полученные в примере 15 данные о проценте позитивных по мультимеру клеток среди CD8-T-клеток (А и Г); средние геометрические значения для KLRG1 у позитивных по мультимеру CD8-T-клеток (Б и Д) и средние геометрические значения для PD1 у позитивных по мультимеру CD8-T-клеток (В и Е). А-В: мышей линии C57BL/6 вакцинировали 3 раза в день 0, день 3 и день 7 и кровь брали в день 7 и день 14. Г-Е, мышей линии C57BL/6 вакцинировали 3 раза в день 0, день 7 и день 14 и кровь брали в день 14 и день 21. Вакцинацию осуществляли s.c. с использованием Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля. Окрашивание мультмером осуществляли в образцах крови (один эксперимент, 4 мыши на группу);

на фиг. 29 - полученные в примере 16 данные о секреции IL-6, свидетельствующей об активации АРС после инкубации BMDC с различными конструкциями, которые указаны на чертеже. В целом, метод состоял в следующем: BMDC высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулировали 1 мкМ Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 или EDAMad5 и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Секрецию IL-6 количественно оценивали в супернатанте с помощью ELISA. Представлены средние значения ± СКО для 2-3 отдельных экспериментов;

на фиг. 30 - полученные в примере 16 данные о секреции TNF-α, свидетельствующей об активации АРС после инкубации клеток Raw 264.7 с различными конструкциями, указанными на чертеже. В целом, метод состоял в следующем: клетки Raw 264.7 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулировали 1 мкМ Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa или Z13Mad5 и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Секрецию TNF-α количественно оценивали в супернатанте с помощью ELISA. Представлены средние значения ± СКО для 2-3 отдельных экспериментов;

на фиг. 31 - полученные в примере 17 данные о секреции IL-8, свидетельствующей о связывании TLR4 после инкубации клеток HEK-hTLR4 с различными конструкциями, указанными на чертеже. В целом, метод состоял в следующем: клетки HEK-hTLR4 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулировали 1 мкМ Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa, Z13Mad5, EDAZ13Mad5 или EDAMad5 и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Секрецию IL-8 количественно оценивали в супернатанте с помощью ELISA. Представлены средние значения ± СКО для 2 отдельных экспериментов;

на фиг. 32 - полученные в примере 18 данные о количестве метастазов на модели метастазирования легкого с использованием полутерапевтического режима. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.v. 1 × 10⁵ опухолевых клеток меланомы линии B16-OVA и вакцинировали дважды (d0 и d9) путем подкожной инъекции в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (доза, эквимолярная EDA) или только MPLA в правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 13 и изымали легкие. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. **, р<0,01 (односторонний дисперсионный анализ с критерием Тьюки для множественных сравнений);

на фиг. 33 - полученные в примере 19 данные о количестве метастазов на модели метастазирования легкого с использованием полутерапевтического режима. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.v. 1×10⁵ опухолевых клеток меланомы линии B16-OVA и вакцинировали дважды (d0 и d9) путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa или Z13Mad5 + Pam3CSK4 (доза, эквимолярная Anaxa) в правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 21 и изымали легкие. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. *, р<0,05; **, р<0,01 (непарный t-критерий);

на фиг. 34 - полученные в примере 20 данные количественной оценки SIINFEKL-специфических CD8-Т-клеток на модели глиобластомы Quad-Gl261. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем s.с.-инъекции в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Anaxa. SIINFEKL-специфические CDS-T-клетки количественно определяли в крови и в BIL (инфильтрующие головной мозг лейкоциты) в d28 путем окрашивания мультимером (5-8 мышей на группу);

на фиг. 35 - полученные в примере 20 данные о секреции цитокинов. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем s.с.-инъекции в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Anaxa. Выделяли BIL и культивировали в течение 6 ч со зрелыми BMDC, загруженными или не загруженными пептидом SllNFEKL, в присутствии брефелдина А перед внутриклеточным окрашиванием цитокинов. Данные представлены в виде % CD8-T-клеток, секретирующих цитокин (5-8 мышей на группу);

на фиг. 36 - полученные в примере 21 данные о воздействии Z13Mad5Anaxa на выживаемость на модели глиобластомы Quad-Gl261. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали трижды (d7, d21 и d35) путем s.c.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля. Мышей ежедневно взвешивали и умерщвляли, когда потеря веса достигала более 15%;

на фиг. 37 - полученные в примере 22 данные о воздействии Z13Mad5Anaxa на рост опухолей и на выживаемость на подкожной модели опухоли EG7-OVA с использованием профилактического режима. В целом, метод состоял в следующем: мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (d-21 и d-7) путем s.с.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля в правую боковую область, а затем имплантировали в день 0 s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. (А) Рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее значение ± СКО); ****, р<0,0001 (2-сторонний дисперсионный анализ в день 30). (Б) Кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.). ***, р<0,001 (логранговый критерий);

на фиг. 38 - полученные в примере 23 данные о воздействии Z13Mad5Anaxa на рост опухолей и на выживаемость на подкожной модели опухоли B16-OVA с использованием терапевтического режима на развитых опухолях. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 1×10⁵ опухолевых клеток B16-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d14 и d21) путем s.c.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля в правую боковую область. (А) Рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее значение ± СКО); *, р<0,05 (2-сторонний дисперсионный анализ в день 32). (Б) Кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.); **, р<0,01; ***, р<0,001;

на фиг. 39 - полученные в примере 24 данные о воздействии СРР в составе конструкции Z13Mad5Anaxa на рост опухолей и на выживаемость на подкожной модели опухоли EG7-OVA. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали в день 0 s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область, а затем вакцинировали дважды (d5 и d13) путем s.c-инъекции Z13Mad5Anaxa или Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. (А) Рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее значение ± СКО); ****, р<0,0001. (Б) Кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.). **, р<0,01; ***, р<0,001;

на фиг. 40 - полученные в примере 25 данные о воздействии комплексов, содержащих различные СРР, на иммунный ответ. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали пять раз (Wk0, Wk2, Wk4, Wk6 и Wk8) s.c. с использованием в дозе либо 2 нмоля (А), либо 0,5 нмоля (Б) Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa или Z18Mad5Anaxa. У мышей брали кровь через 7 дней после 2-ой, 3-ей, 4-ой и 5-ой вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент, 4 мыши на группу). *, р<0,05 при сравнении вакцинированных и наивных мышей в каждый момент времени за исключением момента времени Vac2 для вакцинированных Z18Mad5Anaxa мышей;

на фиг. 41 - полученные в примере 26 данные о воздействии комплексов, содержащих различные СРР, на CD8-T-клетки в селезенке (А), дренирующих лимфатических узлах (Б) и костном мозге (В). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали пять раз (Wk0, Wk2, Wk4, Wk6 и Wk8) s.c, используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa. Через 9 дней после 5-ой вакцинации мышей умерщвляли, изымали органы и осуществляли окрашивание мультимером;

на фиг. 42 - полученные в примере 26 данные о воздействии комплексов, содержащих различные СРР, на Т-клетки в селезенке (CD8-T-клеточный ответ (А) и CD4-Т-клеточный ответ (Б)). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали пять раз (Wk0, Wk2, Wk4, Wk6 и Wk8) s.c, используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa. (А) Через 9 дней после 5-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом SIINFEKL OVACD8. (Б) Через 9 дней после 5-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом OVACD4;

на фиг. 43 - полученные в примере 26 данные о воздействии комплексов, содержащих различные СРР, на эффекторную функцию CDS-T-клеток. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали пять раз (Wk0, Wk2, Wk4, Wk6 и Wk8) s.c, используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa. Через 9 дней после 5-ой вакцинации осуществляли внутриклеточное окрашивание клеток селезенки, стимулированных пептидом SIINFEKL OVACD8;

на фиг. 44 - полученные в примере 27 данные о воздействии комплексов, содержащих различные СРР, на рост опухолей (А) и на уровни выживаемости (Б). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d13) с помощью s.с.-инъекции Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля в правую боковую область. (А) Рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее значение ± СКО); *, р<0,05; ****, р<0,0001 (2-сторонний дисперсионный анализ, тестирование в день 28). (Б) Кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.). *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001 (логранговый критерий);

на фиг. 45 - полученные в примере 28 данные о воздействии комплексов, содержащих различные СРР, на иммунный ответ. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали три раза (Wk0, Wk2 и Wk4) s.c, используя в дозе 2 нмоля (А) или 0,5 нмоля (Б) EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 или EDAZ18Mad5. У мышей брали кровь через 7 дней после 3-ей вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент, 4 мыши на группу). *, р<0,05;

на фиг. 46 - полученные в примере 29 данные о воздействии EDAZ14Mad5 на рост опухолей (А) и уровни выживаемости (Б). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d 13) с помощью s.c.-инъекции EDAZ14Mad5 в дозе 2 нмоля в правую боковую область. Левая панель: рост опухолей у 7 мышей на группу (среднее ± СКО); **, р<0,01 (2-сторонний дисперсионный анализ, тестирование в день 27). Правая панель: кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.);

на фиг. 47 - полученные в примере 30 результаты количественной оценки SIINFEKL-специфических CD8-Т-клеток на модели глиобластомы Quad-Gl261. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем s.с.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля или Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Anaxa в дозе 2 нмоля. SIINFEKL-специфические CD8-T-клетки количественно определяли в крови и в BIL в d28 путем окрашивания мультимером (7-16 мышей на группу);

на фиг. 48 - полученные в примере 30 данные о секреции цитокинов. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем s.с.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля или Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Апаха в дозе 2 нмоля. BIL выделяли и культивировали в течение 6 ч с созревшими BMDC, загруженными или не загруженными пептидом SllNFEKL, в присутствии брефелдина А перед внутриклеточным окрашиванием цитокинов. Данные представлены в виде % CDS-T-клеток, секретирующих цитокин (7-16 мышей на группу);

на фиг. 49 - полученные в примере 31 данные о воздействии Z13Mad8Anaxa на Т-клетки в селезенке (CD8-T-клеточный ответ (А) и CD4-Т-клеточный ответ (Б)). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали четыре раза (Wk0, Wk2, Wk4 и Wk6) s.c. с использованием Z13Mad8Anaxa в дозе 2 нмоля. (А) Через одну неделю после 4-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом gp70CD8. (Б) Через одну неделю после 4-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом gp70CD4;

на фиг. 50 - полученные в примере 32 данные о воздействии Z13Mad11Anaxa на количество метастазов на модели метастазов в легком В16 (А) и на Т-клеточный ответ в селезенке (Б). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали два раза (день 0, день 10) s.c. с использованием Z13Mad11Anaxa в дозе 1 нмоль;

на фиг. 51 - полученные в примере 33 данные о воздействии Z13Mad9Anaxa на Т-клетки в селезенке (CD8-T-клеточный ответ). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали четыре раза (Wk0, Wk2, Wk4 и Wk6) s.c. с использованием Z13Mad9Anaxa в дозе 2 нмоля. Через одну неделю после 4-ой вакцинации осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом adpgk;

на фиг. 52 - полученные в примере 34 данные о воздействии комплексов, содержащих различные СРР, на иммунный ответ. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали два раза (Wk0 и Wk2) s.c. с использованием в дозе 2 нмоля либо Z13Mad5Anaxa, либо TatFMad5Anaxa. У мышей брали кровь через 7 дней после 2-ой вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент, 8 мышей на группу):

на фиг. 53 - полученные в примере 35 результаты количественной оценки SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток у наивных мышей. В целом, метод состоял в следующем: мышей линии C57BL/6 вакцинировали однократно (день 0) путем s.с.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля (группа «Z13Mad5Anaxa»), либо Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Anaxa в дозе 2 нмоля (группа «Z13Mad5+Anaxa»). SIINFEKL-специфические CD8-Т-клетки количественно определяли в крови в d7 путем окрашивания мультимером (4-8 мышей на группу);

на фиг. 54 - полученные в примере 36 данные о воздействии Z13Mad12Anaxa на Т-клетки в крови (CD8-T-клеточный ответ). Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (Wk0 и Wk2) s.c. с использованием Z13Mad12Anaxa в дозе 2 нмоля. Через 1 неделю после 2-ой вакцинации осуществляли окрашивание мультимером в отношении неоантигена reps1 на клетках крови;

на фиг. 55 - полученные в примере 37 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 (слева направо) в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ Z13Mad5Anaxa (нижние панели) или Z13Mad5 (верхние панели) в течение 48 ч. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа.

на фиг. 56 - полученные в примере 38 данные о проценте позитивных по мультимеру клеток (% от CD8-Т-клеток) в процессе повторной вакцинации. В целом, метод состоял в следующем: мышей линии C57BL/6 вакцинировали подкожно 6-кратно (недели 0, 2, 4, 8, 12, 16), используя Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля. У мышей брали кровь через 7 дней после каждой вакцинации или перед вакцинацией и осуществляли окрашиванием пентамером (два эксперимента, 4 мыши на группу). Стрелками под осью времени обозначены моменты времени вакцинации;

на фиг. 57 - полученные в примере 39 данные об объемах опухолей (А) и уровнях выживаемости (Б) мышей, вакцинированных Z13Mad11Anaxa, и контрольных мышей на модели опухоли МС-38. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 2×10⁵ опухолевых клеток МС38 в левую боковую область и вакцинировали дважды (-d21 и -d7 до имплантации опухоли) путем s.c.-инъекции Z13Mad11Anaxa в дозе 2 нмоля в правую боковую область. (А) - данные о росте опухолей и (Б) - кривая выживаемости для 7 мышей на группу. На графике показаны медианы выживаемости (m.s.). *, р<0,05; **, р<0,01 (логранговый критерий);

на фиг. 58 - полученные в примере 40 данные о высвобождении выбранных цитокинов после введения комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении в целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 инъецировали i.v. Z13Mad5Anaxa в дозе 10 нмолей. Через 0,5, 1 и 3 ч после введения получали образцы крови для мониторинга IL-6, TNFα, IFNY, IL1-β и IL12 в сыворотке, используя мультиплекс фирмы Luminex (n=4);

на фиг. 59 - полученные в примере 41 данные о специфическом для неоантигена adpgk иммунном ответе в области опухоли (инфильтрующие опухоль клетки, TIL) у контрольных (колонка (А)) и вакцинированных Z13Mad12Anaxa мышей (колонка (Б)). Представлены полученные с помощью FACS точечные графики для TIL. На каждом точечном графике представлены данные о позитивных по мультимеру клетках (в % от CD8-Т-клеток);

на фиг. 60 - полученные в примере 41 данные о специфическом для неоантигена reps1 иммунном ответе в области опухоли (инфильтрующие опухоль клетки, TIL) у контрольных (колонка (А)) и вакцинированных Z13Mad12Anaxa мышей (колонка (Б)). Представлены полученные с помощью FACS точечные графики для клеток крови. На каждом точечном графике представлены данные о позитивных по мультимеру клетках (в % от CD8-T-клеток);

на фиг. 61 - полученные в примере 41 данные о специфическом для неоантигенов иммунном ответе в области опухоли (инфильтрующие опухоль клетки, TIL) у контрольных и вакцинированных Z13Mad12Anaxa мышей. Представлены данные о позитивных по мультимеру клетках (в % от CD8-T-клеток) для каждого эпитопа (adpgk (А) и reps1 (Б));

на фиг. 62 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР110 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа;

на фиг. 63 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР112 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа;

на фиг. 64 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР115 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание указанного изотипа;

на фиг. 65 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР117 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа;

на фиг. 66 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР118 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа;

на фиг. 67 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР119 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа;

на фиг. 68 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР120 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа;

на фиг. 69 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР122 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа;

на фиг. 70 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР123 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа;

на фиг. 71 - полученные в примере 42 данные об экспрессии маркеров активации HLA-DR, CD83, CD80 и CD86 в выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клетках (DC) из одной лейкоцитарной пленки. DC стимулировали с использованием в дозе 300 нМ АТР125 в течение ночи. Для каждого состояния осуществляли также окрашивание изотипа;

на фиг. 72 - полученные в примере 43 данные о росте опухолей (А) и уровнях выживаемости (Б) для 13-14 мышей на группу (среднее значение ± СКО). Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 2×10⁵ опухолевых клеток МС-38 в область спины. Мышей из групп «Z13Mad12Anaxa» и «Z13Mad 12Anaxa + анти-PD1» вакцинировали 3 раза (d3, d 10 и d 17) путем подкожной инъекции Z13Mad12Anaxa в дозе 2 нмоля в основание хвоста. 200 мкг антитела к PD1 вводили i.p.в каждый из дней 6, 10, 13, 17, 20, 24 и 27 мышам из групп «анти-PD1» и «Z13Mad12Anaxa + анти-PD1». Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. На каждой кривой роста опухоли указано количество не имеющих опухоли (свободных от опухоли) мышей в каждой группе. *, р<0,05; **, р<0,01; ***, р<0,001; ****, р<0,0001;

на фиг. 73 - полученные в примере 43 кривые роста индивидуальных опухолей для 13-14 мышей на группу. Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 2×10⁵ опухолевых клеток МС-38 в область спины. Мышей из групп «Z13Mad12Anaxa» и «Z13Mad12Anaxa + анти-PD1» вакцинировали 3 раза (d3, d10 и d17) путем подкожной инъекции Z13Mad12Anaxa в дозе 2 нмоля в основание хвоста. 200 мкг антитела к PD1 вводили i.p. в каждый из дней 6, 10, 13, 17, 20, 24 и 27 мышам из групп «анти-PD1» и «Z13Mad12Anaxa + анти-PD1». Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля;

на фиг. 74 - результаты, полученные в примере 44. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали однократно, используя АТР128 в дозе 4 нмоля. У мышей брали кровь через 7 дней и осуществляли Elispot-анализ с использованием клеток крови, стимулированных дендритными клетками, загруженными АТР128 (один эксперимент);

на фиг. 75 - полученные в примере 45 данные об индексе активации для выделенных из моноцитов человеческой крови дендритных клеток (DC) из десяти различных лейкоцитарных пленок. DC стимулировали 300 нМ АТР128 в течение ночи. Для получения отрицательного и положительного контролей клетки инкубировали с буфером и MPLA соответственно;

на фиг. 76 - полученные в примере 46 данные об областях АТР128, содержащих пептиды, которые, как установлено, презентируются ГКГС класса I (А) и класса II (Б) на поверхности человеческих дендритных клеток из двух различных доноров, донора 9 (сплошная линия) и донора 10 (пунктирная линия), после загрузки в течение ночи АТР128, и соответствующее количество пептидов, которые презентируются на ГКГС класса I и класса II (В). Подчеркнутые числа соответствуют пептидам, которые описаны ранее в литературе в качестве иммуногенных пептидов.

Примеры

Ниже представлены конкретные примеры, иллюстрирующие различные варианты осуществления и объекты изобретения. Однако объем настоящего изобретения не ограничен указанными в настоящем описании конкретными вариантами осуществления изобретения. Представленные ниже препараты и примеры даны с целью лучшего понимания изобретения специалистами в данной области и воплощения на практике настоящего изобретения. Однако объем настоящего изобретения не ограничен приведенными в качестве примера вариантами осуществления изобретения, которые представлены только с целью иллюстрации отдельных объектов изобретения, и под объем изобретения подпадают функционально эквивалентные методы. Так, различные модификации изобретения в дополнение к указанным в настоящем описании должны быть очевидны специалистам в данной области из представленного выше описания, прилагаемых чертежей и описанных ниже примеров. Указанные модификации подпадают под объем прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1: Созревание in vitro человеческих дендритных клеток

В основу настоящего исследования была положена задача изучить способность комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению, индуцировать созревание дендритных клеток. В настоящем исследовании комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, представлял собой слитый белок, содержащий проникающий в клетку пептид «Z13», белок «MAD5», состоящий из различных CD8⁺- и CD4⁺-эпитопов из различных антигенов, и пептидный агонист TLR4 «EDA». Таким образом, создавали слитый белок с EDA-пептидом в N-концевом положении и различными контрольными конъюгированными белками без Z13 или EDA, или без них обоих.

Так, создавали следующие конструкции, в которых аминокислотная последовательность проникающего в клетку пептида «Z13» подчеркнута, а пептидного агониста TLR «EDA» обозначена курсивом:

EDAZ13Mad5

Последовательность:

Молекулярная масса: 25057 Да.

Характеристики:

- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gp100CD8, ЕальфаCD4 и OVACD8.

- Содержит агонист TLR EDA (Lasarte J.J. и др., The extra domain A from fibronectin targets antigens to TLR4-expressing cells and induces cytotoxic T cell responses in vivo. J Immunol, 178(2), 2007, cc. 748-756).

- Буфер для хранения: 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ ДТТ, 1М L-аргинин, рН 8.

- Уровень эндотоксинов: <0,01 эндотоксиновых единиц (EU)/мкг.

Z13Mad5

Последовательность:

Молекулярная масса: 15196 Да

Характеристики:

- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gp100CD8, ЕальфаCD4 и OVACD8.

- Буфер для хранения: 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ ДТТ, 1М L-аргинин, рН 9.

- Уровень эндотоксинов:

- партия 1: 0,32 EU/мг

- партия 2: 0,44 EU/мг.

Mad5

Последовательность:

Молекулярная масса: 10154,6 Да

Характеристики:

- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gp100CD8, ЕальфаCD4 и OVACD8.

- Буфер для хранения: 50 мМ Трис-Cl, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.

- Уровень эндотоксинов: 0,069 EU/мг.

Исследовали белки EDAZ13Mad5, Z13Mad5 и Mad5 в отношении их способности индуцировать созревание человеческих дендритных клеток (DC). После инкубации в течение 48 ч с 300 нМ белком оценивали экспрессию маркеров активации (CD86, CD40, CD83 и HLA-DR) на человеческих DC с помощью FACS (фиг. 1-4). В качестве отрицательного контроля использовали специфические для каждого белка буферы.

Результаты для CD40 представлены на фиг. 1, для CD86 на фиг. 2, для HLADR на фиг. 3 и для CD83 на фиг. 4. В то время как конструкция EDAZ13Mad5 индуцировала созревание человеческих DC, о чем свидетельствует повышающая регуляция CD86, HLADR и CD83, белки Z13Mad5 и Mad5 не обладали способностью активировать человеческие DC. Эти результаты свидетельствуют о том, что EDA-компонент белка ответствен за повышающую регуляцию маркеров активации на человеческих DC.

Пример 2: Презентация эпитопов in vitro (ГКГС I)

В основу настоящего исследования была положена задача изучить функциональную рестриктированную по ГКГС класса I кросс-презентацию в мышиной системе in vitro с использованием полученных из костного мозга дендритных клеток (BMDC) и спленоцитов из различных трансгенных по TCR мышей. Для этой цели использовали конструкции EDAZ13Mad5 и Mad5 (описанные выше в примере 1) и конструкцию EDAMad5:

EDAMad5

Последовательность

Молекулярная масса: 20017 Да.

Характеристики:

- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gp100CD8, ЕальфаCD4 и OVACD8.

- Содержит агонист TLR EDA.

- Буфер для хранения: 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.

- Уровень эндотоксинов: 1,8 EU/мг.

BMDC загружали в течение ночи 300 нМ белками EDAMad5, EDAZ13Mad5 и Mad5, содержащими эпитопы OVACD8, OVACD4 и gp 100. Осуществляли мониторинг процессинга и презентации этих ограниченных ГКГС I эпитопов OVACD8 и gp 100, измеряя in vitro пролиферацию наивных OVA_257-264-специфических CD8⁺-Т-клеток из трансгенных по ОТ-1 Т-клеточному рецептору (TCR) мышей и gp100-специфических CD8⁺-Т-клеток из трансгенных по P-mel Т-клеточному TCR мышей соответственно. Таким образом, осуществляли мониторинг эффективности ограниченной ГКГС класса I презентации эпитопа OVACD8 и эпитопа gp 100 через 4 дня с использованием меченных CFSE ОТ1-клеток и P-Mel-клеток соответственно. Мониторинг процессинга и презентации рестриктированного по ГКГС II эпитопа OVACD4 осуществляли путем измерения in vitro пролиферации наивных OVA_323-339-специфических CD4⁺-T-клеток из трансгенных по ОТ-2 Т-клеточному рецептору (TCR) мышей. Таким образом, осуществляли мониторинг эффективности рестриктированной по ГКГС класса II презентации эпитопа OVACD4 через 4 дня с использованием меченных CFSE ОТ2-клеток. В качестве контроля BMDC подвергали в течение 1 ч обработке в импульсном режиме пептидом в дозе 5 мкМ (один эксперимент, репрезентативный для 2 отдельных экспериментов).

Результаты представлены на фиг. 5. Обнаружены сходные кросс-презентация и способность к процессингу всех изученных белков на основе Mad5.

Пример 3: CD8-Т-клеточный иммунный ответ

Для изучения эффективности конъюгированных с EDA белков в отношении индукции CD8⁺-T-клеточного ответа мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (Wk0 и Wk2) путем подкожной инъекции конструкций EDAZ13Mad5 или EDAMad5 (описанных в примерах 1 и 2) в дозе либо 2 нмоля, либо 10 нмолей. Применяемую в качестве положительного контроля группу вакцинировали Mad5 и агонистом TLR4 MPLA (в дозе, эквимолярной EDA). Изучали две дозы конструкций (2 нмоля) (фиг. 6) и (10 нмолей) (фиг. 7). В каждой группе использовали 3-4 мыши.

Через 7 дней после последней вакцинации у мышей брали кровь и осуществляли окрашивание пентамером для мониторинга OVA-специфического иммунного ответа в крови. На фиг. 8 представлен процент позитивных по пентамеру CD8⁺-T-клеток во всех группах и для обеих тестированных доз.

Эти данные свидетельствуют о том, что указанный иммунный ответ оказался ниже при дозе 10 нмолей, чем при дозе 2 нмоля. При использовании обеих доз, 2 нмоля и 10 нмолей, опосредуемый вакциной иммунный ответ оказался более стойким в группе, обработанной EDAZ13Mad5, чем в группе, обработанной EDAMad5. Кроме того, обнаружен повышенный иммунный ответ, когда агонист TLR4 конъюгировали с вакциной.

Пример 4: Эффективность вакцины в отношении роста опухоли на стандартной модели опухоли EG.7-OVA

Для оценки воздействия содержащих EDA конструкций белков на контроль роста опухоли, была выбрана s.c.-модель клеток тимомы EG.7-OVA. Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область. После имплантации опухолей мышей вакцинировали в дни 5 и 13, используя в дозе 10 нмолей одну из следующих конструкций (описание конструкций см. в примерах 1 и 2): EDAZ13Mad5, EDAMad5, Mad5 или Mad5 и MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) s.c. в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля.

На фиг. 9 представлены данные о росте опухолей у 7 мышей на группу (среднее значение ± СКО); *, р<0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (2-сторонний дисперсионный анализ). На фиг. 10 представлены кривые роста индивидуальных опухолей (для каждой из 7 мышей на группу). На фиг. 11А представлена кривая выживаемости 7 мышей на группу; *, р<0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (логранговый критерий). На фиг. 11Б представлена кривая периода без развития опухоли для 7 мышей на группу; *, р<0,05 EDAZ13Mad5 относительно контрольной группы (логранговый критерий).

Результаты продемонстрировали, что при использовании в терапевтическом режиме конструкция EDAZ13Mad5 представляла собой единственную белковую вакцину, которая значительно контролировала рост опухолей по сравнению с контрольной группой, что приводило к существенному улучшению кривых периода без прогрессирования опухоли и кривых выживаемости.

Таким образом, результаты позволяют предположить, что конструкция белка EDAZ13Mad5 представляет собой высокоэффективную вакцину для контроля роста опухолей при применении в терапевтическом режиме.

Пример 5: Эффективность вакцины в отношении роста опухолей на модели метастатической меланомы

Для оценки эффективности на модели метастазов в легкие с использованием опухолевых клеток B16-OVA в полутерапевтическом режиме применяли различные конструкции белков: EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (см. в примерах 1 и 2 описание конструкций) и индивидуально MPLA. Мышам линии C57BL/6 имплантировали i.v. 1×10⁵ опухолевых клеток меланомы B16-OVA и одновременно (d0) вводили путем подкожной инъекции в правую боковую область в дозе 2 нмоля вакцину (EDAMad5, EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA, MPLA индивидуально). Через 9 дней мышей вакцинировали второй раз такой же дозой. Дополнительно контрольные группы вакцинировали с использованием в дозе 2 нмоля Z13Mad5 и агониста TLR4 MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) или только MPLA. Мышей умерщвляли в день 13 и изымали легкие. В каждом легком подсчитывали количество метастатических очагов. Результаты представлены на фиг. 12.

Результаты продемонстрировали, что конъюгат EDAZ13Mad5 обладал такой же эффективностью, что и Z13Mad5 + MPLA в отношении ингибирования метастазов опухоли в легкое. Кроме того, установлено, что EDA-Mad5 обладал более низкой эффективностью, чем EDAZ13Mad5, что свидетельствует об имеющей решающее значение роли Z13 в эффективности вакцины.

Пример 6: Эффективность вакцины в отношении роста опухолей на модели метастатической меланомы - профилактический режим

Кроме того, эффективность различных конструкций белков EDAMad5, EDAZ13Mad5 и Z13Mad5 + MPLA (см. в примерах 1 и 2 описание конструкций) оценивали на модели метастазов в легкие в профилактическом режиме. Мышей линии C57BL/6 вакцинировали за 21 и 7 дней до имплантации опухолевых клеток (d-21 и d-7) путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, EDAMad5 или Z13Mad5 + MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) в правую боковую область. В день 0 мышам имплантировали i.v. 1×10⁵ опухолевых клеток меланомы B16-OVA. Мышей умерщвляли в день 14 и изымали легкие. Результаты представлены на фиг. 13.

Пример 7: Создание дополнительных конструкций, содержащих пептидный агонист TLR2

В этом случае комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, представлял собой слитый белок, который содержал проникающий в клетку пептид «Z13», белок «MAD5», состоящий из различных CD8⁺- и CD4⁺-эпитопов различных антигенов, и пептидный агонист TLR2 «Anaxa». Таким образом, создавали слитые белки с пептидом Anaxa в С-концевом или N-концевом положении.

Так, создавали следующие конструкции, в которых аминокислотная последовательность проникающего в клетку пептида «Z13» подчеркнута, а пептидного агониста TLR «Anaxa» обозначена курсивом:

AnaxaZ13Mad5

Последовательность:

Молекулярная масса: 18973 Да.

Характеристики:

- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gp100CD8, ЕальфаCD4 и OVACD8.

- Содержит 35-мерный пептид аннексина.

- Буфер для хранения: 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.

- Уровень эндотоксинов: 5,17 EU/мг.

Z13Mad5Anaxa

Последовательность:

Молекулярная масса: 18973 Да

Характеристики:

- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gp100CD8, ЕальфаCD4 и OVACD8.

- Содержит 35-мерный пептид аннексина.

- Буфер для хранения: 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.

- Уровень эндотоксинов: 3,1 EU/мг.

Пример 8: Оценка TLR2-связывания (клеточные линии HEK-hTLR2)

В основу настоящего исследования была положена задача оценить, могут ли конструкции белков Z13Mad5Anaxa и AnaxaZ13Mad5 (см. в примере 7 описание конструкций этих белков) связываться с TLR2 в качестве агониста. Клетки HEK-Blue ™ hTLR2 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 0,3, 1 или 3 мкМ AnaxaZ13Mad5 или Z13Mad5Anaxa, и инкубировали при 37°С в течение 24 ч. В качестве положительного контроля использовали Pam3CSK4, агонист TLR2, в концентрации 500 нг/мл.

Для мониторинга активации NF-κB/AP1 добавляли 20 мкл супернатанта в среду для детекции QuantiBlue® и инкубировали при 37°С за 1 ч до определения ОП (620 нм). Результаты представлены на фиг. 14А.

Секрецию IL-8 в супернатанте количественно оценивали с помощью ELISA. Результаты представлены на фиг. 14Б.

Результаты (фиг. 14А, Б) свидетельствуют о том, что Z13Mad5Anaxa и AnaxaZ13Mad5 обладали одинаковой способностью связываться с TLR2 в зависимости от дозы.

Пример 9: Индукция in vivo специфических CD8⁺-Т-клеток

Для изучения эффективности конъюгированных с Anaxa белков, описанных в примере 7, в отношении индукции CD8⁺-T-клеточных ответов мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (Wk0 и Wk2) путем подкожной инъекции AnaxaZ13Mad5 в дозе 2 нмоля или Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля. Через 7 дней после последней вакцинации у мышей брали кровь, и для мониторинга OVA-специфического иммунного ответа в крови осуществляли окрашивание пентамером (один эксперимент с 4 мышами на группу). Результаты представлены на фиг. 15 и 16.

Эти данные свидетельствуют о том, что и вакцина Z13Mad5Anaxa, и конструкция AnaxaZ13Mad5 вызывали сильный иммунный ответ.

Пример 10: Терапевтическое воздействие на рост опухолей

Для оценки воздействия конъюгированных с Anaxa конструкций белков, описанных в примере 7, на контроль роста опухолей применяли стандартную модель опухоли, а именно, созданную путем s.c.-имплантации клеток тимомы EG.7-OVA.

Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область. После имплантации опухолей каждую из трех групп по 7 мышей в каждой вакцинировали s.c. в правую боковую область в дни 5 и 13 путем подкожной инъекция в дозе 10 нмолей либо AnaxZ13Mad5 (группа 1), либо Z13Mad5Anaxa (группа 2), либо Z13Mad5 и Pam3CSK4 (в дозе, эквимолярной Anaxa; группа 3). Для сравнения воздействия белка, смешанного с другим адъювантом, контрольную группу вакцинировали Z13Mad5 и Pam3CSK4 (в дозе, эквимолярной Anaxa). Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. Результаты представлены на фиг. 17-19.

При применении в терапевтическом режиме белковые вакцины Z13Mad5Anaxa и AnaxaZ13Mad5 обладали более высокой эффективностью в отношении контроля роста опухолей по сравнению с контрольной группой, т.е. совместная инъекция Z13Mad5 и Pam3CSK обеспечивала существенно улучшенную кривую выживаемости. В частности, для Z13Mad5Anaxa и AnaxaZ13Mad5 была продемонстрирована существенно более высокая эффективность, чем для Z13Mad5 при введении отдельно от Pam3CSK4. Таким образом, результаты позволяют предположить, что конструкции белков Z13Mad5Anaxa и AnaxaZ13Mad5 являются многообещающими конъюгированными вакцинами для контроля роста опухолей при использовании в терапевтическом режиме.

Пример 11: Терапевтическое воздействие на рост опухолей - сравнение конструкций, содержащих различные агонисты TLR

Задачей настоящего исследования было сравнение эффективности различных конструкций белковых вакцин, конъюгированных с различными агонистами TLR, а именно: EDAZ13Mad5 и Z13Mad5Anaxa, которые описаны в примерах 1 и 7, в отношении контроля роста опухолей. Для этой цели мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ клеток тимомы EG.7-OVA в левую боковую область согласно методу, описанному в примере 10. Мышей (каждую из 7 мышей в группе) вакцинировали s.c. в правую боковую область в дни 5 и 13, используя в дозе 2 нмоля либо EDAZ13Mad5, Z13Mad5Anaxa, либо используя совместную инъекцию Z13Mad5+MPLA (в дозе, эквимолярной EDA).

Результаты представлены на фиг. 20, 21 и 22. В этой экспериментальной схеме Z13Mad5Anaxa, EDAZ13Mad5 и Z13Mad5+MPLA обладали сходной способностью обеспечивать существенный контроль роста опухолей. Кроме того, эти данные свидетельствуют о том, что Z13Mad5Anaxa является наиболее эффективной конструкцией в отношении уровня контроля роста опухолей, а эффективность EDAZ13Mad5 несколько превышала эффективность Z13Mad5+MPLA при изучении с использованием указанной экспериментальной схемы.

Пример 12: Зависимость эффекта от дозы Z13Mad5Anaxa в отношении контроля роста опухолей

Для определения оптимальной дозы содержащей конъюгат вакцины оценивали способность Z13Mad5Anaxa (см. пример 7) в трех различных дозах (0,5, 2 и 10 нмолей) контролировать рост опухолей. Дозовую зависимость конструкции Z13Mad5Anaxa оценивали на s.с.-модели, созданной с использованием клеток тимомы EG.7-OVA, согласно методу, описанному выше в примере 10. После имплантации опухолей мышей вакцинировали дважды (в день 5 и в день 13 после имплантации опухолей) в терапевтическом режиме с использованием Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5, 2 или 10 нмолей.

Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d5 и d13) путем подкожной инъекция в дозе либо 0,5, либо 2, либо 10 нмолей Z13Mad5Anaxa в правую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля.

Данные о росте опухолей в группе из 7 мышей представлены на фиг. 23. Эти данные свидетельствуют о том, что дозы 0,5 и 2 нмоля обладали по меньшей мере такой же эффективностью, что и доза 10 нмолей в отношении контроля роста опухолей.

Пример 13: Влияние различных путей введения Z13Mad5Anaxa

Это исследование базировалось на полученных в описанных выше примерах результатах, продемонстрировавших эффективность содержащей конъюгат вакцины Z13Mad5Anaxa (см. пример 7), которая обладала способностью вызывать специфические иммунные ответы и оказалась эффективной в отношении контроля роста опухолей на описанной выше подкожной модели опухоли EG7.

Для изучения воздействия подкожного, внутримышечного и внутрикожного путей введения сравнивали иммунные ответы, вызываемые подкожной, внутримышечной и внутрикожной инъекциями. Внутрикожные инъекции осуществляли, используя устройство PLEASE^® фирма Pantec Biosolutions.

Мышей вакцинировали три раза каждые две недели (Wk0, Wk2 и Wk4), используя Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 или 2 нмоля (см. пример 7). Для того, чтобы оказывать целенаправленное воздействие на несколько лимфатических узлов, 1-ую и 3-ую вакцинации осуществляли в правую боковую область, а 2-ую осуществляли в левую боковую область. Ответ SIINFEKL-специфических CD8⁺-Т-клеток анализировали через 1 неделю после 2-ой и 3-ей вакцинаций в крови. На фиг. 24 представлены данные об ответах SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток после каждой вакцинации, обнаруженные в крови мышей линии C57BL/6, вакцинированных три раза (Wk0, Wk2 и Wk4) s.c., i.d. или i.m. с использованием 0,5 нмоля (фиг. 24 А) или 2 нмоля (фиг. 24 Б) Z13Mad5Anaxa. Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинаций и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент с 4 мышами на группу).

Результаты продемонстрировали, что при использовании двух изученных доз (0,5 и 2 нмоля) (I) введение всеми изученными путями приводило к SIINFEKL-специфическому CD8-T-клеточному иммунному ответу и (II) подкожная вакцинация приводила к самому сильному SIINFEKL-специфическому CD8-T-клеточному иммунному ответу. При подкожном введении максимальный ответ достигался после 3-ей вакцинации и все еще поддерживался после 3-ей вакцинации. SIINFEKL-специфический CD8-T-клеточный иммунный ответ после 2-ой вакцинации, вызываемый при внутрикожной и внутримышечной вакцинациях, был ниже, чем при подкожной вакцинации, и не повышался после 3-ей вакцинации.

Далее оценивали эффекторную функцию и статус истощения SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток, анализируя KLRG 1 (представитель 1 лектинподобного рецептора клеток-киллеров подсемейства G 1) и PD-1 соответственно.

Для этой цели мышей линии C57BL/6 вакцинировали три раза (Wk0, Wk2 и Wk4) s.c., i.d. или i.m. Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля (см. пример 7). Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинаций и осуществляли FACS-окрашивание. Экспрессию KLRG1 и PD-1 анализировали по позитивным по мультимеру CD8-T-клеткам (один эксперимент с 4 мышами на группу). Результаты представлены на фиг. 25.

Указанные данные свидетельствуют о том, что экспрессия KLRG 1 сильно повышалась на SIINFEKL-специфических CD8-T-клетках после подкожной вакцинации. После i.d. - или i.m. - вакцинации обнаруженное действие оказалось более низким. Процент KLRG 1-позитивных клеток среди SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток также повышался после s.с.-вакцинации (данные не представлены).

В противоположность KLRG 1, экспрессия PD-1 снижалась с течением времени и с количеством вакцинаций при подкожном и внутримышечном путях вакцинации. Это позволяет предположить, что истощение SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток не происходило. Процент PD1-позитивных клеток среди SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток также снижался после s.c.- и i.m.-вакцинаций (данные не представлены). Важно отметить, что экспрессия PD-1 оказалась выше после 2-ой вакцинации, когда мышей вакцинировали подкожно, что отражает статус более ранней активации специфических Т-клеток (Keir M.E. и др., PD-1 and its ligands in tolerance and immunity. Annu Rev Immunol, 26, 2008, сс. 677-704).

Анализировали также маркер позднего истощения Tim-3. Во всех группах обнаружен очень низкий уровень его экспрессии.

В совокупности, результаты свидетельствуют о том, что подкожная вакцинация вызывает наиболее сильный специфический CD8-T-клеточный иммунный ответ по сравнению с внутримышечными или внутрикожными инъекциями.

Пример 14: Внутринодальный путь введения

С учетом результатов предыдущих экспериментов (пример 13) проводили дополнительное изучение внутринодального пути введения. Для этого исследовали иммунный ответ, вызываемый внутринодальной инъекцией Z13Mad5Anaxa (см. пример 7).

Для этой цели мышам сначала инъецировали подкожно голубой Эванса, позволяющий легко визуализировать лимфатические узлы, в которые осуществляли инъекции, и осуществлять внутринодальную инъекцию без инвазивной хирургии, например, согласно методу, описанному у Jewell C.M., S.C. Lopez и D.J. Irvine, In situ engineering of the lymph node microenvironment via intranodal injection adjuvant-releasing polymer particles. Proc Nati Acad Sci USA, 108(38), 2011, сс. 15745-15750.

Мышей линии C57BL/6 вакцинировали два раза каждые две недели (Wk0 и Wk2) внутринодально, используя в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Anaxa (см. пример 7). Первую вакцинацию осуществляли в правый паховый лимфатический узел, а вторую вакцинацию осуществляли в левый паховый лимфатический узел. Кровь брали у мышей через 7 дней после 2-ой вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (3 мыши на группу.). Другими словами анализировали SIINFEKL-специфический ответ CD8⁺-Т-клеток в крови через 1 неделю после 2-ой вакцинации. На фиг. 26 показаны SIINFEKL-специфические ответы CD8-T-клеток. Указанные данные свидетельствуют о том, что внутринодальная инъекция также может вызывать ответ SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток.

Пример 15: Схема вакцинации

Работу по изучению схемы вакцинации начинали с выявления влияния третьей вакцинации при применении описанной выше конструкции Z13Mad5Anaxa (см. пример 7). С учетом предыдущих результатов был выбран подкожный путь введения.

В этом эксперименте первые две вакцинации осуществляли в wk0 и wk2, a 3-ю вакцинацию осуществляли либо в wk4 (фиг. 27 А), либо в wk8 (фиг. 27Б). Таким образом, мышей линии C57BL/6 вакцинировали три раза (фиг. 27 А и В: Wk0, Wk2 и Wk4 и фиг. 27 Б и Г: Wk0, Wk2 и Wk8) s.c., используя Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля. Брали кровь у мышей через 7 дней после последней вакцинации и осуществляли окрашиванием пентамером (один эксперимент с 4 мышам на группу). Соответственно анализировали SIINFEKL-специфический CD8⁺-Т-клеточный ответ через 1 неделю после 2-ой и 3-ей вакцинаций (фиг. 27 А и Б). Дополнительно оценивали эффекторную функцию SIINFEKL-специфических Т-клеток, анализируя экспрессию KLRG 1 на специфических CD8-Т-клетках (фиг. 27 В и Г).

Данные свидетельствуют о том, что по сравнению с контролем процент SIINFEKL-специфических CD8-Т-клеток существенно повышался во все изученные моменты времени (Vac2 и Vac3), а также при использовании обеих схем вакцинации (фиг. 27 А и Б).

Важно отметить, что третья вакцинация в Wk4 обеспечивала наиболее значительное повышение процента SIINFEKL-специфических CD8-Т-клеток (фиг. 27 А). Для этих же клеток продемонстрировано повышение эффекторной функции благодаря более высокому уровню экспрессии KLRG 1 (фиг. 27 В). В противоположность этому, при осуществлении третьей вакцинации в Wk8 не обнаружено улучшения после третьей вакцинации относительно второй вакцинации касательно SIINFEKL-специфического иммунного ответа и экспрессии KLRG 1.

В совокупности, эти результаты свидетельствуют о том, что CD8-T-клеточный иммунный ответ можно повышать путем укорачивания промежутка времени между второй и третьей вакцинацией.

С учетом того, что более ранняя третья вакцинация, вероятно, усиливала иммунный ответ, в следующем опыте исследовали две короткие схемы вакцинации:

I) три вакцинации в день 0, день 3 и день 7 и

II) три вакцинации в день 0, день 7 и день 14.

И в этом случае также использовали мышей линии C57BL/6 и вакцинацию осуществляли s.c. с применением Z13Mad5Anaxa в дозе 0,5 нмоля (см. пример 7). Осуществляли окрашивание мультимером образцов крови, полученных через 1 неделю после 2-ой и 3-ей вакцинаций (один эксперимент с 4 мышами на группу).

Таким образом, анализировали SIINFEKL-специфический CD8⁺-Т-клеточный ответ через 1 неделю после 2-ой и 3-ей вакцинаций (фиг. 28 А и Г). Кроме того, оценивали эффекторную функцию SIINFEKL-специфических Т-клеток, анализируя экспрессию KLRG 1 на специфических CD8-T-клетках (фиг. 28Б и 28Д), и статус истощения путем анализа экспрессии PD-1 специфическими Т-клетками (фиг. 28В и 28Е).

Данные свидетельствуют о том, что - аналогично результатам, полученным в первом опыте, вне зависимости от описанной выше схемы вакцинации - по сравнению с контролем процент SIINFEKL-специфических CD8-Т-клеток увеличивался во все изученные моменты времени (Vac2 и Vac3), а также в обеих схемах вакцинации (фиг. 28 А и Б).

Однако по сравнению со схемой wk0-wk2-wk4 схема с вакцинациями в день 0, день 3 и день 7 не вызывала столь же сильный SIINFEKL-специфический CD8-Т-клеточный иммунный ответ. Касательно схемы с вакцинациями в день 0, день 7 и день 14, вызываемый SIINFEKL-специфический CD8-Т-клеточный иммунный ответ оказался более сильным по сравнению с описанной ранее схемой (d0-d3-d7), но он не поддерживался после 3-ей вакцинации.

В совокупности, результаты, полученные при применении указанных схем вакцинации, свидетельствуют о том, что схема вакцинации Wk0-Wk2-Wk4 представляет собой самую лучшую схему вакцинации для вызывания эффективного OVA-специфического CD8-T-клеточного иммунного ответа с высокой эффекторной функцией.

Пример 16: Способность конъюгированных конструкций агонист TLR-CPP активировать мышиные антигенпрезентирующие клетки (АРС)

Для изучения воздействия как компонента, представляющего собой СРР, так и компонента, представляющего собой агонист TLR, в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, вновь применяли описанные выше слитые белки (см. примеры 1, 2 и 7).

Кроме того, создавали дополнительный «контрольный пептид», который также представлял собой слитый белок и который содержал белок «MAD5», состоящий из различных CD8⁺ - и CD4⁺ -эпитопов из различных антигенов, и пептидный агонист TLR2 «Anaxa» (т.е. без проникающего в клетку пептида). Таким образом, дополнительно создавали следующие контрольные конструкции:

Mad5Anaxa

Последовательность:

Молекулярная масса: 13933 Да.

Характеристики:

- Карго-молекула Mad5 содержит эпитопы OVACD4, gp100CD8, ЕальфаCD4 и OVACD8.

- Содержит 35-мерный пептид аннексина в С-концевом положении.

- Буфер для хранения: 50 мМ Трис-HCl, 150 мМ NaCl, 10% глицерина, 2 мМ ДТТ, 0,5М L-аргинин, рН 8.

- Уровень эндотоксинов: партия 1-12, 15 EU/мг.

В основу этого исследования была положена задача оценить способность двух взятых в качестве примера комплексов, предлагаемых в настоящем изобретении, а именно: EDAZ13Mad5 (см. пример 1) и Z13Mad5Anaxa (см. пример 7), повышать активацию антигенпрезентирующих клеток по сравнению с референс-комплексами, в которых отсутствовал либо компонент, представляющий собой проникающий в клетку пептид Z13 (Mad5Anaxa, см. выше; EDAMad5, см. пример 2), либо агонист TLR (Z13Mad5, см. пример 1).

Для этой цели оценивали способность указанных выше конструкций повышать активацию антигенпрезентирующих клеток (АРС) на дендритных клетках из костного мозга (BMDC), которые экспрессируют все TLR за исключением TLR7.

BMDC высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 1 мкМ либо Z13Mad5Anaxa (см. пример 7), либо Mad5Anaxa (см. выше), либо Z13Mad5 (см. пример 1), EDAZ13Mad5 (см. пример 1), либо EDAMad5 (см. пример 2), и инкубировали в течение 24 ч при 37°С.

Активацию АРС изучали, осуществляя мониторинг секреции IL-6 в супернатант культуры BMDC. Секрецию IL-6 количественно оценивали в супернатанте с помощью ELISA.

Результаты представлены на фиг. 29. Эти данные четко демонстрируют, что конструкция Z13Mad5Anaxa обладала способностью активировать BMDC, однако не обнаружено никакой активации, когда клетки культивировали в присутствии Z13Mad5 или Mad5Anaxa. Это позволяет предположить, что не только агонист TLR (Anaxa или EDA) имеет решающее значение для активации макрофагов и дендритных клеток, но необходим также и СРР. Кроме того, установлено, что присутствие СРР без агониста TLR не достаточно, таким образом, фактически оба, и СРР, и агонист TLR имеют решающее значение для активации макрофагов и дендритных клеток.

Указанные результаты подтверждали с использованием другой клеточной линии, такой как клеточная линия мышиных макрофагов Raw 264.7, которая экспрессирует все TLR за исключением TLR5 (Applequist S.E., R.P. Wallin и H.G. Ljunggren, Variable expression of Toll-like receptor in murine innate and adaptive immune cell lines. Int Immunol, 14(9), 2002, cc. 1065-1074).

Клетки линии Raw 264.7 высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 1 мкМ либо Z13Mad5Anaxa (см. пример 7), Mad5Anaxa (см. выше), либо Z13Mad5 (см. пример 1), и инкубировали в течение 24 ч при 37°С.

Активацию АРС в клетках линии Raw 264.7 изучали, осуществляя мониторинг секреции TNF-α в супернатанте культуры Raw 264.7. Секрецию TNF-α количественно оценивали с помощью ELISA в супернатанте. Результаты представлены на фиг. 30.

Считается, что СРР может облегчать проникновение молекулы в клетки, что обеспечивает улучшенный таргетинг внутриклеточного TLR.

В совокупности, данные подтвердили решающее значение как СРР, так и агониста TLR в конъюгированных конструкциях в отношении активации АРС. Это действие может быть результатом облегчения проникновения конструкции в клетку, что приводит к оптимальному таргетингу внутриклеточного TLR.

Пример 17: Способность конъюгированных конструкций связываться с человеческим TLR4

В настоящее время установлено, что пептид Anaxa обладает адъювантной активностью благодаря передаче сигналов через TLR2 (WO 2012/048190 А1), в то время как пептид EDA является встречающимся в естественных условиях лигандом для TLR4 (Okamura Y. и др., The extra domain A of fibronectin activates Toll-like receptor 4. J Biol Chem, 276(13), 2001, cc. 10229-10233).

Кроме того, как продемонстрировано выше в примере 8 и на фиг. 14, комплекс, предлагаемый для применения согласно настоящему изобретению, который содержит пептид Anaxa в качестве агониста TLR, например Z13Mad5Anaxa, обладает способностью связываться с человеческим TLR2 и усиливать секрецию IL-8 клетками линии HEK-hTLR2 (см. пример 8, фиг. 14).

При создании настоящего изобретения оценивали способность комплексов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые содержали либо пептид Anaxa, в качестве агониста TLR, либо пептид EDA в качестве агониста TLR, связываться с человеческим TLR4. Для этой цели HEK-клетки, трансфектированные человеческим TLR4 (HEK-hTLR4), высевали в плоскодонный 96-луночный планшет в культуральную среду, стимулированную 1 мкМ либо Z13Mad5Anaxa (см. пример 7), Mad5Anaxa (см выше), Z13Mad5 (см. пример 1), EDAZ13Mad5 (см. пример 1), либо EDAMad5 (см. пример 2), и инкубировали в течение 24 ч при 37°С. Секрецию IL-8 в супернатанте количественно оценивали с помощью ELISA.

Результаты представлены на фиг. 31. Как и ожидалось, инкубация HEK-hTLR4 с EDAZ13Mad5 приводила к выраженной секреции IL-8, что свидетельствует о связывании EDAZ13Mad5 с TLR4. В соответствии с результатами, полученными в примере 16, секреция IL-8 при использовании EDAMad5 (без СРР) оказалась существенно ниже по сравнению с EDAZ13Mad5, что демонстрирует эффект присутствия СРР. Установлено, что конструкция Z13Mad5, в которой отсутствует агонист TLR, не вызвала секрецию IL-8, свидетельствуя - как и ожидалось - об отсутствии связывания с TLR4.

Важно отметить, что инкубация HEK-hTLR4 с конструкцией Z13Mad5Anaxa приводила к наиболее выраженной секреции IL-8, свидетельствующей о связывании Z13Mad5Anaxa с TLR4. Это является неожиданным, поскольку согласно существовавшей ранее гипотезе Anaxa является агонистом TLR2. И в этом случае аналогичная конструкция, но без СРР (Mad5Anaxa) приводила к существенно более низкой секреции IL-8, что подтверждает результаты, полученные в примере 16.

В совокупности, эти данные (I) подтверждают результаты, полученные в пример 16, (II) подтверждают, что EDA действительно является агонистом TLR4, и (III) и свидетельствуют, что является неожиданным, о том, что пептид Anaxa также является агонистом TLR4 (в дополнение к тому, что он является агонистом TLR2, см. пример 8 и фиг. 14).

Пример 18: Эффективность вакцины в отношении роста опухоли на модели метастазов легких - полутерапевтический режим: в качестве агониста TLR EDA

Это исследование базировалось на результатах, полученных в примере 6, демонстрирующих эффективность комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению, такого как EDAZ13Mad5, при изучении на модели метастазов меланомы в легкие в профилактическом режиме (см. фиг. 13).

В настоящем исследовании использовали такую же модель метастазов в легкое, а также конструкции белков EDAZ13Mad5 и Z13Mad5 + MPLA (см. в примерах 1 и 2 описание конструкций). Однако при использовании полутерапевтического режима мышей линии C57BL/6 вакцинировали одновременно с имплантацией опухолевых клеток (d0) и второй раз через 9 дней после имплантации (d9). Вакцинацию осуществляли путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) или MPLA в правую боковую область. В день 0 мышам имплантировали i.v. 1×10⁵ опухолевых клеток меланомы B16-OVA и вакцинировали дважды (d0 и d9) путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 2 нмоля EDAZ13Mad5, Z13Mad5 + MPLA (в дозе, эквимолярной EDA) или MPLA индивидуально в правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 13 и легкие изымали. Результаты представлены на фиг. 32.

Результаты продемонстрировали, что конструкция EDAZ13Mad5 оказалась несколько более эффективной, чем Z13Mad5 + MPLA в отношении ингибирования роста метастазов меланомы. Кроме того, никакого адъювантного действия не выявлено при инъекции мышам только MPLA.

Как EDAZ13Mad5, так и Z13Mad5 + MPLA существенно ингибировали метастазы меланомы в легкие при их применении и в профилактическом, и в полутерапевтическом режимах.

Пример 19: Эффективность вакцины в отношении роста опухолей на модели метастазов в легкие - полутерапевтический режим: в качестве агониста TLR Anaxa

Это исследование базировалось на результатах, полученных в примере 18, в нем использовали такую же модель (в полутерапевтическом режиме) и схему эксперимента. Однако изучали воздействие комплексов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые содержали пептид «Anaxa» в качестве агониста TLR - вместо агониста TLR EDA, который применяли в примере 18.

Для этой цели мышам линии C57BL/6 имплантировали i.v. 1×10⁵ опухолевых клеток меланомы B16-OVA и вакцинировали дважды (d0 и d9) путем подкожной инъекции (s.c.) в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Anaxa, Mad5Anaxa или Z13Mad5 + Pam3CSK4 (в дозе, эквимолярной Anaxa) в правую боковую область. Мышей умерщвляли в день 21 и легкие изымали. Количество метастатических очагов подсчитывали в каждом легком. Результаты представлены на фиг. 33.

Результаты продемонстрировали, что конструкция Z13Mad5Anaxa оказалась значительно более эффективной, чем Z13Mad5 + Pam3CSK4 в отношении ингибирования роста метастазов меланомы. В противоположность этому, Mad5Anaxa не обладала способностью контролировать рост метастазов в легкие, что вновь подтверждает важность СРР.

В целом, эксперимент, проведенный на модели метастазов B16-OVA в легкие, продемонстрировал, что конструкция Z13Mad5Anaxa обладала высокой эффективностью в отношении ингибирования роста метастазов меланомы в легкие.

Пример 20: Эффективность вакцины на модели глиобластомы

В этом исследовании использовали другую модель рака, а именно: модель глиобластомы. Глиома представляет собой наиболее часто встречающуюся форму первичной опухоли головного мозга у взрослых, при этом мультиформная глиобластома (GBM) является наиболее летальной. Эта опухоль является печально известной с позиции ее высокой инвазивности и агрессивного поведения. В настоящее время наилучшим путем лечения GBM является режим, включающий комбинацию хирургии, химиотерапии и лучевой терапии, который обеспечивает медианный период выживаемости, составляющий только 14,6 месяца. Существует неотложная неудовлетворенная к настоящему времени потребность в новых путях лечения, улучшающих прогноз для страдающих глиомой пациентов. Опосредуемая Т-клетками иммунотерапия умозрительно представляет собой привлекательный вариант лечения при применении в сочетании с существующими путями лечения глиомы, в частности, высоко инвазивной GBM.

Глиома Gl261 представляет собой индуцируемую карциногеном модель мышиной глиомы. Эта модель представляет собой одну из очень небольшого количества моделей опухолей головного мозга, созданную на животных с нарушенным иммунитетом, которая имеет характеристики роста, сходные с человеческой GBM (Newcomb Е. и D. Zagzag, The murine GL261 glioma experimental model to assess novel brain tumor treatments, в: CNS Cancer Models, Markers, Prognostic, Factors, Targets, and Therapeutic Approaches под ред. E.G. Van Meir, изд-во Humana Press: Atlanta, 2009, cc. 227-241; Jacobs V.L. и др., Current review of in vivo GBM rodent models: emphasis on the CNS-1 tumour model. ASN Neuro, 3(3): 2011, е00063). Небольшие количества трансплантированных внутрь черепа клеток G1261 образуют внутричерепные опухоли у мышей линии C57BL/6 (Zhu X. и др., Poly-/CLC promotes the infiltration of effector Т cells into intracranial gliomas via induction of CXCL10 in IFN-alpha and IFN-gamma dependent manners, Cancer Immunol Immunother, 59(9), 2010, cc. 1401-1409; Zhu X. и др., Toll like receptor-3 ligand poly-/CLC promotes the efficacy of peripheral vaccinations with tumor antigen-derived peptide epitopes in murine CNS tumor models. J Transl Med, 5, 2007, с. 10). Клетки обладают умеренной иммуногенностью: они обладают способностью вызывать опухольспецифический иммунный ответ в области опухоли. Однако опухольспецифические иммунные клетки не обеспечивают полный клиренс опухоли.

В настоящее время М. Ollin создал новую модель Gl261 (Ohlfest J.R., и др., Vaccine injection site matters: qualitative and quantitative defects in CDB Т cells primed as a function of proximity to the tumor in a murine glioma model. J Immunol, 190(2), 2013, cc. 613-620) путем трансфекции клеток линии Gl261 «Quad кассетой» («четверной кассетой»), экспрессирующей четыре пептида, презентируемых молекулами Н-2b класса I или II: человеческий gp100_25-33, куриный OVA_257-264, куриный OVA_323-339 и мышиный I-Еα_52-68. Клеточная линия Quad-Gl261 также стабильно экспрессирует люциферазу, что позволяет отслеживать рост опухоли с помощью биолюминесценции.

Целью настоящего исследования была оценка эффективности комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению, на модели глиобластомы Quad-Gl261.

Воздействие комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению, а именно: Z13Mad5Anaxa (см. пример 7) оценивали с использованием описанной выше модели глиобластомы. При этом анализировали Т-клеточный хоминг в области опухоли у мышей, несущих опухоль Gl261-Quad, которых вакцинировали дважды (Wk1 и Wk3) вакциной Z13Mad5Anaxa. Группу, вакцинированную Z13Mad5 и Anaxa (в дозе, эквимолярной Z13Mad5Anaxa), которые вводили индивидуально, применяли в качестве контроля. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. (внутрь черепа) 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали дважды (в d7 и d21 после имплантации) путем s.с.-инъекции в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa (группа 1) или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Anaxa (группа 2). В Wk4 анализировали кровь и инфильтрующие головной мозг лейкоциты (BIL), при этом количественно оценивали SIINFEKL-специфические CD8-T-клетки в крови и в BIL в d28 путем окрашивания мультимером (5-8 мышей на группу). Результаты представлены на фиг. 34.

В целом, в крови обнаружена низкая частота встречаемости SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток. Однако более высокий процент SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток обнаружен в крови вакцинированных Z13Mad5Anaxa мышей. Во всех группах обнаружена существенно более сильная аккумуляция SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток в BIL.

После двух вакцинаций Z13Mad5Anaxa частота встречаемости SIINFEKL-специфических CD8⁺-Т-клеток в BIL оказалась в 2 раза выше (24%), чем при применении Z13Mad5 + Anaxa (12%).

Затем оценивали секрецию цитокинов. Для этого мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем s.с.-инъекции, используя в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Anaxa. BIL выделяли и культивировали в течение 6 ч со зрелыми BMDC, загруженными или не загруженными пептидом SllNFEKL, в присутствии брефелдина А перед внутриклеточным окрашиванием цитокинов. Результаты представлены на фиг. 35.

Несмотря на гетерогенность, обнаружен высокий уровень секреции цитокинов для инфильтрующих головной мозг CD8-T-клеток из мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa. Эти результаты продемонстрировали, что вакцина Z13Mad5Anaxa обладала способностью вызывать более сильный SIINFEKL-специфический CD8-T-клеточный иммунный ответ в головном мозге несущих опухоли мышей с выраженной эффекторной функцией.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что Z13Mad5Anaxa обладает эффективностью в отношении вызывания иммунного ответа инфильтрующих головной мозг SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток.

Пример 21: Эффективность вакцины в отношении выживаемости на модели глиобластомы Gl261-Quad

В независимом эксперименте осуществляли мониторинг выживаемости мышей, вакцинированных контролем и Z13Mad5Anaxa. Терапевтический режим включал три последовательные вакцинации с использованием в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa в дни 7, 21 и 35 после i.e.-имплантации опухоли.

Мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали три раза (d7, d21 и d35) путем s.с.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля. Мышей ежедневно взвешивали и умерщвляли, когда потеря веса достигала более чем 15%. Результаты представлены на фиг. 36.

Результаты продемонстрировали, что терапевтическая вакцинация Z13Mad5Anaxa является более эффективной, чем в контрольной группе, удлиняя медиану выживаемости на 10 дней.

Пример 22: Эффективность вакцины на подкожной модели опухоли - профилактический режим

Этот опыт базировался на результатах, полученных в примере 10, которые представлены на фиг. 17-19.

Для оценки воздействия конъюгированных с Anaxa конструкций белков, описанных в примере 7, на контроль роста опухолей использовали стандартную модель опухоли, а именно: s.с.-имплантацию клеток тимомы EG.7-OVA. В противоположность примеру 10, в котором вакцинацию осуществляли в дни 5 и 13, в настоящем исследовании использовали профилактический режим, при котором мышей вакцинировали за 21 и 7 дней до имплантации опухоли.

Мышей линии C57BL/6 вакцинировали дважды (d-21 и d-7) путем s.c.-инъекции, используя в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Anaxa, в правую боковую область, а затем имплантировали в день 0 s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля.

Результаты, представленные на фиг. 37, касаются объема опухолей (фиг. 37А) и уровня выживаемости (фиг. 37Б). Данные демонстрируют, что профилактическая вакцинация с использованием Z13Mad5Anaxa обладала высокой эффективностью в отношении контроля роста опухолей и уровня выживаемости. Объем опухолей существенно снижался у мышей, обработанных Z13Mad5Anaxa, по сравнению с контрольными мышами. Уровень выживаемости существенно повышался у мышей, обработанных Z13Mad5Anaxa, по сравнению с контрольными мышами.

Пример 23: Эффективность вакцины на подкожной модели опухоли - терапевтический режим на развитых опухолях

Этот опыт базировался на результатах, полученных в примере 10, которые представлены на фиг. 17-19, и на результатах, полученных в примере 22, которые представлены на фиг. 37. Целью настоящего исследования была оценка воздействия Z13Mad5Anaxa (см. пример 7) на развитую опухоль.

Для этой цели применяли s.с.-модель, полученную с использованием клеток меланомы B16-OVA. В этой модели опухолевые клетки размножались медленно, что позволяло создавать большее окно продолжительности вакцинации.

Первую вакцинацию с использованием Z13Mad5Anaxa в низкой дозе 0,5 нмоля осуществляли при наличии развитой и видимой невооруженным глазом опухоли, т.е. в день 14 после имплантации опухолевых клеток. Вторую вакцинацию осуществляли в день 21.

Таким образом, мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 1×10⁵ опухолевых клеток B16-OVA в левую боковую область и вакцинировали дважды (d14 и d21) путем s.c.-инъекции в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Anaxa в правую боковую область. Осуществляли мониторинг роста опухолей и строили кривые выживаемости. Результаты представлены на фиг. 38.

Результаты продемонстрировали, что Z13Mad5Anaxa эффективно контролировала рост развитых и видимых невооруженных глазом опухолей. Кроме того, несмотря на присутствие развитых и видимых невооруженных глазом опухолей уровни выживаемости повышались у мышей, обработанных Z13Mad5Anaxa, по сравнению с контролями.

Пример 24: Эффективность вакцины на подкожной модели опухоли - терапевтический режим: роль СРР

Протокол этого исследования соответствовал протоколу опыта, описанного в примере 10, только с тем различием, что оценивали дополнительную группу «Mad5Anaxa» (см. пример 16).

В целом, метод состоял в следующем: использовали стандартную модель опухоли, а именно: полученную в результате s.c.-имплантации клеток тимомы EG.7-OVA. Мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область. После имплантации опухолей группы по 7 мышей в каждой вакцинировали s.c. в правую боковую область в день 5 и 13 путем подкожной инъекции, используя в дозе 0,5 нмоля либо Z13Mad5Anaxa (группа 1), либо Mad5Anaxa (группа 2), и сравнивали с контрольной группой. Размер опухоли определяли с помощью кронциркуля. Результаты представлены на фиг. 39.

Результаты продемонстрировали, что у мышей, обработанных Z13Mad5Anaxa, обнаружено существенное снижение объема опухолей и существенно повышение уровня выживаемости по сравнению, как с контрольными мышами, так и с мышами, обработанными Mad5Anaxa, т.е. конструкцией без СРР. Эти результаты свидетельствуют о том, что присутствие СРР приводит к существенному уменьшению объема опухолей и существенному повышению уровня выживаемости, т.е. повышенной эффективности вакцинация. Таким образом, результаты продемонстрировали - в совокупности с результатами, полученными в примере 10, - что присутствие СРР и агониста TLR приводит к синергетическому действию в отношении роста опухолей и уровня выживаемости.

Пример 25: Сравнение кинетики иммунных ответов при применении комплексов, содержащих различные проникающие в клетку пептиды

Для изучения воздействия различных СРР в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, применяли описанный выше слитый белок Z13Mad5Anaxa (см. пример 7).

Дополнительно конструировали слитые белки, содержащие СРР, отличные от Z13, а именно: Z14 (SEQ ID NO: 7) или Z18 (SEQ ID NO: 11). Указанные слитые белки содержали также белок «MAD5», который состоит из различных CD8⁺ - и CD4⁺ -эпитопов из различных антигенов, и пептидный агонист TLR2 «Anaxa». Таким образом, создавали следующие дополнительные конструкции:

Z14Mad5Anaxa

Последовательность:

Z18Mad5Anaxa

Последовательность:

Мышей линии C57BL/6 разделяли на 8 различных групп (по 4 мыши на группу): три группы, обрабатываемые либо Z13Mad5Anaxa, либо Z14Mad5Anaxa, либо Z18Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля, и соответствующий им контроль, и три группы, обрабатываемые Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa или Z18Mad5Anaxa в дозе 0,05 нмоля, и соответствующий им контроль. Мышей вакцинировали пять раз (Week0, Week2, Week4, Week6 и Week8) s.c. У мышей брали кровь через 7 дней после 2-ой, 3-ей, 4-ой и 5-ой вакцинаций и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент, 4 мыши на группу).

Результаты представлены на фиг. 40. Во всех группах, вакцинированных Z13Mad5Anaxa, Z14Mad5Anaxa или Z18Mad5Anaxa, обнаружен повышенный процент позитивных по мультимеру клеток по сравнению с контрольной группой (за исключением второй вакцинации Z18Mad5Anaxa). Эти результаты свидетельствуют о том, что комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, которые содержат различные проникающие в клетку пептиды, обладают способностью вызывать иммунный ответ при их применении в различных дозах.

Пример 26: Сравнение Т-клеточных иммунных ответов при применении комплексов, содержащих различные проникающие в клетку пептиды

Для более детального изучения CD8-Т-клеточных иммунных ответов мышей линии C57BL/6 разделяли на три различные группы (по 3-4 мыши на группу): наивные Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa.

Мышей линии C57BL/6 из Z13Mad5Anaxa-группы и Z14Mad5Anaxa-группы вакцинировали 5 раз (Week0, Week2, Week4, Week6 и Week8) s.c., используя в дозе 2 нмоля либо Z13Mad5Anaxa (см. пример 7), либо Z14Mad5Anaxa (см. пример 25). Через 9 дней после 5-ой вакцинации мышей умерщвляли, органы изымали и осуществляли окрашивание мультимером для определения процента SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток в селезенке, костном мозге и дренирующих лимфатических узлах (паховых и подмышечных).

Результаты представлены на фиг. 41. У мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa, обнаружено сходное увеличение позитивных по мультимеру клеток, в частности, в селезенке и костном мозге, а также небольшое увеличение дренирующих лимфатических узлов.

Для дополнительного изучения эффекторной функции CD8-T-клеток после вакцинации комплексами с различными СРР, в те же группах мышей, которые описаны выше, осуществляли Elispot-анализ клеток селезенки, стимулированных пептидом SIINFEKL-OVACD8 (SEQ ID NO: 35), через 9 дней после 5-ой вакцинации для количественного определения продуцирующих IFN-γ клеток.

Результаты представлены на фиг. 42А. У мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa, обнаружено существенное увеличение продуцирующих IFN-γ клеток по сравнению с наивными мышами. У мышей, вакцинированных Z14Mad5Anaxa, также обнаружено увеличение продуцирующих IFN-γ клеток по сравнению с наивными мышами, однако увеличение оказалось не значимым, что может являться следствием небольшого количества мышей (3 мыши в обработанной Z14Mad5Anaxa группе).

Для изучения CD4-Т-клеточных ответов после вакцинации комплексами, содержащими разные СРР, в тех же группах мышей, которые описаны выше, осуществляли Elispot-анализ клеток селезенки, стимулированных пептидом SIINFEKL-OVACD4 (SEQ ID NO: 36), через 9 дней после 5-ой вакцинации для количественного определения продуцирующих IFN-γ клеток.

Результаты представлены на фиг. 42Б. У мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa, обнаружено очень существенно повышение количества продуцирующих INF-γ клеток по сравнению с наивными мышами. У мышей, вакцинированных Z14Mad5Anaxa, также обнаружено увеличение продуцирующих INF-γ клеток по сравнению с наивными мышами, однако увеличение оказалось не значимым, что может являться следствием небольшого количества мышей (3 мыши в обработанной Z14Mad5Anaxa группе).

Кроме того, у описанных выше групп мышей осуществляли внутриклеточное окрашивание клеток селезенки, стимулированных пептидом SIINFEKL OVACD8 (SEQ ID NO: 35), для идентификации CD107a⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺-клеток. Результаты представлены на фиг. 43. У мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa, обнаружено сходное увеличение CD107a⁺IFN-γ⁺TNF-α⁺-клеток.

Пример 27: Сравнение действия комплексов, содержащих различные проникающие в клетку пептиды, на рост опухолей и выживаемость на s.c.-модели EG.7-OVA

Для изучения воздействий комплексов, содержащих различные проникающие в клетку пептиды, на рост опухолей и выживаемость использовали s.с.-модель, созданную с использованием клеток EG.7-OVA. В d0 мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и разделяли на три различные группы (наивные, Z13Mad5Anaxa и Z14Mad5Anaxa). Мышей вакцинировали дважды в d5 и d13 после имплантации опухолей путем s.c.-инъекции, используя в дозе 0,5 нмоля Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa, в правую боковую область.

Результаты представлены на фиг. 44. Вакцинация Z13Mad5Anaxa или Z14Mad5Anaxa приводила к существенному снижению объемов опухолей по сравнению с контрольными мышами (фиг. 44А), а также к существенному повышению уровней выживаемости по сравнению с контрольными мышами (фиг. 44Б). Эти результаты продемонстрировали, что оба комплекса, и Z13Mad5Anaxa и Z14Mad5Anaxa, обладали способностью существенно снижать рост опухолей и существенно пролонгировать выживаемость.

Пример 28: Сравнение иммунных ответов после вакцинации комплексами, содержащими различные проникающие в клетку пептиды

В этом эксперименте изучали воздействие различных СРР в комплексе, предлагаемом для применения согласно настоящему изобретению, с использованием комплекса с агонистом TLR «EDA». Для этого применяли описанный выше слитый белок EDAZ13Mad5 (см. пример 1).

Кроме того, дополнительно создавали слитые белки, которые содержали СРР, отличные от Z13, а именно: Z14 (SEQ ID NO: 7) или Z18 (SEQ ID NO: 11). Указанные слитые белки содержали также белок «MAD5», состоящий из различных CD8⁺- и CD4⁺ -эпитопов из различных антигенов, и пептидный агонист TLR4 «EDA». Таким образом, дополнительно создавали следующие конструкции:

EDAZ14Mad5

Последовательность:

EDAZ18Mad5

Последовательность:

Мышей линии C57BL/6 разделяли на 8 различных группы (по 4 мыши на группу): три группы, которые обрабатывали либо EDAZ13Mad5, либо EDAZ14Mad5, либо EDAZ18Mad5 в дозе 2 нмоля, и соответствующий им контроль, и три группы, которые обрабатывали либо EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5, либо EDAZ18Mad5 в дозе 5 нмолей, и соответствующая им контрольная группа. Мышей вакцинировали три раза (неделя 0, неделя 2 и неделя 4) s.c. У мышей брали кровь через 7 дней после 2-ой и 3-ей вакцинаций и осуществляли окрашивание мультимером (один эксперимент с 4 мышами на группу).

Результаты представлены на фиг. 45. Во всех группах, вакцинированных EDAZ13Mad5, EDAZ14Mad5 или EDAZ18Mad5, обнаружен повышенный процент позитивных по мультимеру клеток по сравнению с контрольной группой. Эти результаты продемонстрировали, что комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, которые содержали различные проникающие в клетку пептиды, обладали способностью вызывать иммунный ответ в различных дозах.

Пример 29: Воздействие EDAZ14Mad5 на рост опухолей и выживаемость на s.с.-модели EG.7-OVA

Для изучения воздействия EDAZ14Mad5 на рост опухоли и выживаемость использовали s.с.-модель EG.7-OVA (см. в примере 4 и на фиг. 9-11 результаты исследования EDAZ13Mad5 на такой же модели).

В d0 мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 3×10⁵ опухолевых клеток EG7-OVA в левую боковую область и разделяли на 2 группы (наивные и EDAZ14Mad5). Мышей вакцинировали дважды в d5 и d13 после имплантации опухолей путем s.c.-инъекции EDAZ14Mad5 в дозе 0,5 нмоля в правую боковую область.

Результаты представлены на фиг. 46. Аналогично EDAZ13Mad5 (см. пример 4, фиг. 9-11) вакцинация EDAZ14Mad5 приводила к существенному снижению объемов опухолей по сравнению с контрольными мышами (фиг. 46 А), а также к существенному повышению уровней выживаемости (фиг. 46 Б). Указанные результаты продемонстрировали, что конструкция EDAZ14Mad5 обладала способностью существенно снижать рост опухолей и существенно пролонгировать выживаемость аналогично EDAZ13Mad5 (см. пример 4, фиг. 9-11).

Пример 30: Повышенная эффективность слитой конструкции Z13Mad5Anaxa по сравнению с Z13Mad5 и Anaxa на модели глиобластомы

Для изучения эффективности комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, была выбрана модель глиобластомы (см. пример 20). Так, Z13Mad5Anaxa (см. пример 7; SEQ ID NO: 28) вводили одной группе мышей, а Z13Mad5 (SEQ ID NO: 29) и Anaxa (SEQ ID NO: 15) вводили (вместе) другой группе мышей.

Т-клеточный хоминг в области опухоли анализировали у несущих опухоль линии Gl261-Quad мышей (7-16 мышей на группу), которых вакцинировали дважды, а именно: день 7 и день 21 после имплантации опухолей (день 0), используя вакцину Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля. Группу, вакцинированную и Z13Mad5, и Anaxa (в дозе, эквимолярной Z13Mad5Anaxa), применяли в качестве контроля. В целом, метод состоял в следующем: мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. (внутрь черепа) 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали дважды (в d7 и d21 после имплантации) путем s.c.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля (группа 1) или Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Anaxa в дозе 2 нмоля (группа 2). В день 28 анализировали кровь и инфильтрующие головной мозг лейкоциты (BIL), при этом количественно оценивали SIINFEKL-специфические CD8-T-клетки в крови и BIL в d28 путем окрашивания мультимером (7-16 мышей на группу).

Результаты представлены на фиг. 47. Обнаружен существенно более высокий процент SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток в крови вакцинированных Z13Mad5Anaxa мышей по сравнению с мышами, вакцинированными и Z13Mad5, и Anaxa (фиг. 47А). Аналогично этому, обнаружено более сильное накопление SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток в BIL у вакцинированных Z13Mad5Anaxa мышей по сравнению с мышами, вакцинированными по отдельности Z13Mad5 и Anaxa (фиг. 47Б, р=0,0539).

Далее оценивали секрецию цитокинов. Для этого мышам линии C57BL/6 имплантировали i.e. 5×10⁵ опухолевых клеток Gl261-Quad и вакцинировали дважды (d7 и 21) путем s.с.-инъекции Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля или Z13Mad5 в дозе 2 нмоля и Anaxa в дозе 2 нмоля. BIL выделяли и культивировали в течение 6 ч со зрелыми BMDC, загруженными или не загруженными пептидом SllNFEKL (SEQ ID NO: 35), в присутствии брефелдина А перед внутриклеточным окрашиванием цитокинов.

Результаты представлены на фиг. 48. В целом, более высокий уровень секреции цитокинов обнаружен для инфильтрующих головной мозг CD8-T-клеток из мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa. В частности, существенно более высокий уровень секреции общего IFN-γ и IFN-γ и TNF-α вместе обнаружен для инфильтрующих головной мозг CD8-T-клеток из мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa, по сравнению с мышами, вакцинированными по отдельности Z13Mad5 и Anaxa.

В совокупности эти результаты продемонстрировали, что вакцина Z13Mad5Anaxa (по сравнению с введением по отдельности Z13Mad5 и Anaxa) обладала способностью вызывать более сильный SIINFEKL-специфический CD8-T клеточный иммунный ответ в головном мозге несущих опухоли мышей с выраженной эффекторной функцией.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что Z13Mad5Anaxa является эффективной в отношении вызывания высокого иммунного ответа инфильтрующих головной мозг SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток. Z13Mad5Anaxa также обладает способностью усиливать секрецию цитокинов антигенспецифическими CD8-T-клетками в головном мозге.

Пример 31: Воздействие других антигенных карго-молекул в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении

Для изучения воздействия различных антигенных карго-молекул («Mad8») создавали другой комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, различные антигены и пептидный агонист TLR («Z13Mad8Anaxa»). Z13Mad8Anaxa отличался от Z13Mad5Anaxa (описанного в примере 7) антигенными карго-молекулами. В частности, «Z13Mad8Anaxa» представляет собой слитый белок, содержащий проникающий в клетку пептид «Z13», антигенную карго-молекулу «MAD8», которая содержит CD8- и CD4-эпитопы гликопротеина 70, и пептидный агонист TLR «Anaxa». Ниже представлена аминокислотная последовательность Z13Mad8Anaxa, в которой проникающий в клетку пептид «Z13» подчеркнут, а пептидный агонист TLR «Anaxa» обозначен курсивом:

Наивных мышей линии Balb/c (4 мыши на группу) вакцинировали 4 раза s.c. (неделя 0, неделя 2, неделя 4 и неделя 6) Z13Mad8Anaxa в дозе 2 нмоля.

Для изучения CD4-Т-клеточных ответов после вакцинации через 1 неделю после 4-ой вакцинации мышей умерщвляли; изымали органы и осуществляли ех vivo Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидом gp70CD4 (SEQ ID NO: 64) или пептидом gp70CD8 (SEQ ID NO: 65), для количественной оценки продуцирующих IFN-γ эпитопспецифических CD4- и CD8-T-клеток.

Результаты представлены на фиг. 49. У мышей, вакцинированных Z13Mad8Anaxa, обнаружено существенное увеличение продуцирующих IFN-γ клеток по сравнению с наивными мышами. Эти данные демонстрируют, что вакцина Z13Mad8Anaxa обладала способностью вызывать эффективный иммунный ответ эпитопспецифических CD8- и CD4-T-клеток, и поэтому комплекс, предлагаемый в настоящем изобретении, может вызывать иммунный ответ на аутоантиген.

Пример 32: Воздействие других антигенных карго-молекул в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении

Для изучения воздействия дополнительных других антигенных карго-молекул («Mad 11») создавали другой комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, другие антигены и пептидный агонист TLR («Z13Mad11Anaxa»). Z13Mad11Anaxa отличался от Z13Mad5Anaxa (описанного в примере 7) антигенными карго-молекулами. В частности, «Z13Mad11Anaxa» представляет собой слитый белок, содержащий проникающий в клетку пептид «Z13», антигенную карго-молекулу «MAD11», содержащую два CD8-эпитопа сурвивина, подробно описанных у Derouazi M., Wang Y., Marlu R. и др. Optimal epitope composition after antigen screening using a live bacterial delivery vector: Application to TRP-2. Bioengineered Bugs. 1(1), 2010, сс. 51-60, doi:10.4161/bbug.1.1.9482, и пептидный агонист TLR «Anaxa». Ниже представлена аминокислотная последовательность Z13Mad11Anaxa, в которой проникающий в клетку пептид «Z13» подчеркнут, а пептидный агонист TLR «Anaxa» обозначен курсивом:

Наивным мышам линии C57BL/6 (5 мышей на группу) имплантировали i.v. 1×10⁵ опухолевых клеток меланомы В16 и вакцинировали дважды (d0 и d10) путем подкожной инъекции Z13Mad11Anaxa в дозе 1 нмоль. В день 18 мышей умерщвляли, органы изымали и осуществляли ex vivo Elispot-анализ на клетках селезенки, стимулированных пептидами сурвивина сурвивин 20-28 (SEQ ID NO: 67) и сурвивин 97-104: (SEQ ID NO: 68) для количественной оценки продуцирующих IFN-γ сурвивинспецифических Т-клеток.

Результаты представлены на фиг. 50. У мышей, вакцинированных Z13Mad11Anaxa, обнаружено меньшее количество метастазов по сравнению с наивными мышами (фиг. 50А). Кроме того, в селезенке мышей, вакцинированных Z13Mad11Anaxa, существенно увеличено количество продуцирующих IFN-γ сурвивинспецифических Т-клеток (фиг. 49Б).

Полученные результаты продемонстрировали, что Z13Mad11Anaxa обладает эффективностью в отношении уменьшения количества метастазов, и Z13Mad11Anaxa может усиливать секрецию цитокинов антигенспецифическими CD8-T-клетками в селезенке.

Пример 33: Воздействие других антигенных карго-молекул в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении

Для изучения воздействия дополнительных других антигенных карго-молекул («Mad9») создавали другой комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, другой антиген и пептидный агонист TLR («Z13Mad9Anaxa»). Z13Mad9Anaxa отличался от Z13Mad5Anaxa (описанного в примере 7) антигенной карго-молекулой. В частности, «Z13Mad9Anaxa» представляет собой слитый белок, содержащий проникающий в клетку пептид «Z13», антигенную карго-молекулу «Mad9», содержащую неоантиген, описанный у Yadav и др. Nature. 515(7528), 27 ноября 2014 г., cc. 572-576, из линии опухолевых клеток МС-38, и пептидный агонист TLR «Anaxa». Ниже представлена аминокислотная последовательность Z13Mad9Anaxa, в которой проникающий в клетку пептид «Z13» подчеркнут, а пептидный агонист TLR «Anaxa» обозначен курсивом:

Наивных мышей линии C57BL/6 (4 мыши на группу) вакцинировали 4 раза s.c. (неделя 0, неделя 2, неделя 4 и неделя 6), используя Z13Mad9Anaxa в дозе 2 нмоля. Для изучения CD8-T-клеточных ответов после вакцинации через 1 неделю после 4-ой вакцинации мышей умерщвляли, органы изымали и осуществляли Elispot-анализ на клетках селезенки после рестимуляции in vitro на 7 день с использованием стимуляции пептидом adpgk (SEQ ID NO: 66) для количественной оценки продуцирующих IFN-γ эпитопспецифических CD8-T-клеток.

Результаты представлены на фиг. 51. У мышей, вакцинированных Z13Mad9Anaxa, обнаружено существенное увеличение эффекторных неоантигенспецифических CD8-T-клеток по сравнению с наивными мышами

Пример 34: Сравнение иммунных ответов после вакцинации комплексами, имеющими различные проникающие в клетку пептиды

В этом эксперименте изучали воздействие дополнительного другого СРР в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении, используя комплекс, содержащий агонист TLR «Anaxa». Для этого использовали слитый белок Z13Mad5Anaxa, описанный выше (см. пример 7, SEQ ID NO: 28).

Кроме того, создавали дополнительный слитый белок, который содержал ТАТ-СРР, объединенный с линкерами фурина, описанный у Lu и др., Multiepitope trojan antigen peptide vaccines for the induction of antitumor CTL and Th immune responses J. Immunol., 172, 2004, cc. 4575-4582. Указанный слитый белок содержал также белок «MAD5», состоящий из различных CD8⁺- и CD4⁺- эпитопов из различных антигенов, и пептидный агонист TLR4 «Anaxa». Таким образом, дополнительно создавали следующую конструкцию:

TatFMad5Anaxa

Последовательность:

Мышей линии C57BL/6 разделяли на три различные группы (8 мышей на группу): одна группа, которую обрабатывали Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля, одна группа, которую обрабатывали TatFMad5Anaxa в дозе 2 нмоля, и соответствующий контроль. Мышей вакцинировали два раза (неделя 0 и неделя 2) s.c., используя либо Z13Mad5Anaxa в дозе 2 нмоля, либо TatFMad5Anaxa в дозе 2 нмоля. У мышей брали кровь через 7 дней после 2-ой вакцинации и осуществляли окрашивание мультимером (8 мышей на группу).

Результаты представлены на фиг. 52. У мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa или TatFMad5Anaxa, обнаружен повышенный процент позитивных по мультимеру клеток по сравнению с контрольной группой. Эти результаты свидетельствуют о том, что комплексы, предлагаемые в настоящем изобретении, которые имеют различные проникающие в клетку пептиды, могут вызывать иммунный ответ в различных дозах. Однако СРР, полученный из ZEBRA (Z13), оказался лучше, чем ТАТ-СРР.

Пример 35: Повышенная эффективность слитой конструкции Z13Mad5Anaxa по сравнению с Z13Mad5 и Anaxa на наивных мышах

Далее эффективность комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, изучали на наивных мышах. Для этого Z13Mad5Anaxa (см. пример 7; SEQ ID NO: 28) вводили одной группе мышей, а Z13Mad5 (SEQ ID NO: 29) и Anaxa (SEQ ID NO: 15) вводили (совместно) другой группе мышей.

Мышей линии C57BL/6 из Z13Mad5Anaxa-группы и Z13Mad5 + Anaxa-группы вакцинировали однократно (неделя 0) путем s.с.-инъекции в дозе 2 нмоля Z13Mad5Anaxa (группа 1) или 2 нмоля Z13Mad5 и 2 нмоля Anaxa (группа 2). В день 14 анализировали кровь, оценивая количественно SIINFEKL-специфические CD8-T-клетки в крови путем окрашивания мультимером (4-8 мышей на группу).

Результаты представлены на фиг. 53. Обнаружен существенно более высокий процент SIINFEKL-специфических CD8-T-клеток в крови мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa, по сравнению с мышами, вакцинированными Z13Mad5 и Anaxa по отдельности (фиг. 53).

В совокупности эти результаты продемонстрировали, что вакцина Z13Mad5Anaxa (по сравнению с введением Z13Mad5 и Anaxa по отдельности) обладала способностью вызывать более сильный SIINFEKL-специфический CD8-T-клеточный периферический иммунный ответ.

Пример 36: Воздействие другой антигенной карго-молекулы в комплексе, предлагаемом в настоящем изобретении

Для изучения воздействия дополнительной другой антигенной карго-молекулы («Mad12») создавали другой комплекс, содержащий проникающий в клетку пептид, другой антиген и пептидный агонист TLR («Z13Mad12Anaxa»). Z13Mad12Anaxa отличался от Z13Mad5Anaxa (описанного в примере 7) антигенной карго-молекулой. В частности, «Z13Mad12Anaxa» представляет собой слитый белок содержащий проникающий в клетку пептид «Z13», антигенную карго-молекулу «MAD12», которая содержит три неоантигена, описанные у Yadav и др. Nature. 515(7528), 27 ноября 2014 г., cc. 572-576, из линии опухолевых клеток МС-38, и пептидный агонист TLR «Anaxa». Ниже представлена аминокислотная последовательность Z13Mad12Anaxa:

Наивных мышей линии C57BL/6 (4 мыши на группу) вакцинировали дважды s.c. (неделя 0, неделя 2), используя Z13Mad12Anaxa в дозе 2 нмоля. Для изучения CD8-T-клеточных ответов после вакцинации через 1 неделю после 2-ой вакцинации анализировали кровь, при этом количественно оценивали специфические в отношении неоантигена reps1 CD8-T-клетки в крови путем окрашивания мультимером (4 мыши на группу).

Результаты представлены на фиг. 54. У мышей, вакцинированных Z13Mad12Anaxa, обнаружено существенное увеличение эффекторных неоантигенспецифических CD8-T-клеток по сравнению с наивными мышами.

Пример 37: Созревание in vitro человеческих дендритных клеток

В основу этого исследования была положена задача изучить способность комплекса, предлагаемого для применения согласно настоящему изобретению («Z13Mad5Anaxa», SEQ ID NO: 28, см. пример 7), индуцировать созревание дендритных клеток в сравнении с комплексом, в котором отсутствует пептидный агонист TLR («Z13Mad5», SEQ ID NO: 29, см. пример 1).

Полипептид Z13Mad5Anaxa и полипептид Z13Mad5 исследовали в отношении их способности индуцировать созревание человеческих дендритных клеток (DC). После инкубации в течение ночи с использованием 300 нМ белка оценивали экспрессию маркеров активации (CD86, CD80, CD83 и HLA-DR) на человеческих DC с помощью FACS (фиг. 55). В качестве отрицательного контроля для каждого белка применяли в таких же объемах буфер.

Результаты представлены на фиг. 55. В то время как комплекс Z13Mad5Anaxa индуцировал созревание человеческих DC, о чем свидетельствует повышающая регуляция CD86, HLADR и CD83, Z13Mad5 не обладал способностью активировать человеческие DC. Эти результаты свидетельствуют о том, что компонент белка, представляющий собой Anaxa, ответствен за повышающую регуляцию маркеров активации на человеческих DC.

Пример 38: CD8-Т-клеточный иммунный ответ в процессе повторной вакцинации

Для решения вопроса о том, может ли пул эффекторных Т-клеток поддерживаться в течение нескольких месяцев, осуществляли повторную вакцинацию. Для этой цели мышей линии C57BL/6 вакцинировали подкожно шесть раз (недели 0, 2, 4, 8, 12, 16), используя конструкцию Z13Mad5Anaxa (SEQ ID NO: 28) в дозе 2 нмоля. Через семь дней после каждой вакцинация (и перед некоторыми вакцинациями) у мышей брали кровь и осуществляли окрашивание пентамером для мониторинга OVA-специфического иммунного ответа в крови (два эксперимента с 4 мышами на группу). На фиг. 56 представлен процент позитивных по пентамеру CD8⁺-Т-клеток у мышей, вакцинированных Z13Mad5Anaxa, и контрольных мышей.

Указанные данные демонстрируют, что пул эффекторных Т-клеток может поддерживаться в течение 4 месяцев (17 недель) при использовании 6 вакцинаций.

Пример 39: Оценка комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, на модели мышиного колоректального рака МС38

Для оценки воздействий комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, на модели мышиного колоректального рака была выбрана модель мышиного колоректального рака МС38. МС38 представляет собой клеточную линию карциномы ободочной кишки.

Наивным мышам линии C57BL/6 имплантировали s.c. 2×10⁵ опухолевых клеток МС38 в левую боковую область и вакцинировали дважды (в день -21 и день -7 до имплантации опухоли) путем подкожной инъекции конструкции Z13Mad11Anaxa в дозе 2 нмоля (см. пример 32, SEQ ID NO: 40) в правую боковую область. Антигенная карго-молекула «Mad11» содержит два эпитопа сурвивина, экспрессия которых имела место на мышиной модели колоректального рака МС38.

Результаты представлены на фиг. 57. У мышей, вакцинированных Z13Mad11Anaxa, обнаружен существенно меньший объем опухолей по сравнению с наивными мышами (фиг. 57А). Кроме того, для мышей, вакцинированных Z13Mad11Anaxa, был выявлен существенно более высокий уровень выживаемости (фиг. 57Б).

Полученные результаты демонстрируют, что Z13Mad11Anaxa может существенно снижать и замедлять рост опухолей по сравнению с контролем. Кроме того, у мышей, вакцинированных Z13Mad11Anaxa, повышался уровень выживаемости.

Пример 40: Предварительный опыт по оценке токсичности на мышах

Для оценки токсичности комплекса, предлагаемого в настоящем изобретении, на мышах Z13Mad5Anaxa (SEQ ID NO: 28) инъецировали в дозе 2 нмоля s.c. и i.v. наивным мышам линии C57BL/6. Отбор образцов крови осуществляли через 0,5, 1,5 и 3 ч после введения. Применяли поступающий в продажу набор для мультиплексного определения (фирма Luminex) для обнаружения и количественной оценки цитокинов в крови, и в каждый момент времени получали образцы крови 4 мышей. При этом, не удалось обнаружить никакой экспрессии провоспалительных цитокинов. Следует отметить, что при сравнении данных, полученных с помощью набора для мультиплексного определения, с данными, полученными с помощью классического ELISA, результаты оказались сходными (данные не представлены).

Далее дозу Z13Mad5Anaxa (SEQ ID NO: 28) повышали до 10 нмолей. Однако и в этом случае никакие цитокины не обнаружены после s.c.-введения. В отличие от s.c.-введения, через 1,5 ч после i.v.-введения было обнаружено кратковременное увеличение IL-6 и TNFα. Однако указанное небольшое увеличение исчезало через 3 ч (фиг. 58). Подкожная инъекция мышам Z13Mad5Anaxa в дозе 10 нмолей не индуцировала никакого высвобождения цитокинов вплоть до 6 ч после обработки (данные не представлены).

Пример 41: Воздействия комплекса, содержащего проникающий в клетку пептид, различные антигены и пептидный агонист TLR на хоминг Т-клеток в область МС-38-опухоли

Для оценки воздействий комплекса, содержащего проникающий в клетку пептид, различные антигены и пептидный агонист TLR на хоминг Т-клеток в область опухоли, мышей вакцинировали проникающим в клетку пептидом, различными антигенами и пептидым агонистом TLR, используя модель опухоли МС-38. В день 27 мышей умерщвляли и осуществляли FACS-окрашивание для мониторинга специфического для неоантигена иммунного ответа у TIL (инфильтрующие опухоль лимфоциты).

Мышам линии C57BL/6 (4 мыши на группу, самки, возрастом 7 недель) имплантировали s.c. 2×10⁵ опухолевых клеток линии МС-38 в левую боковую область (день 0). После имплантации опухолей мышей группы «Z13Mad12Anaxa» вакцинировали в дни 3, 10 и 17 подкожно в дозе 2 нмоля Z13Mad12Anaxa (см. пример 36; SEQ ID NO: 69) в основание хвоста.

Как продемонстрировано на фиг. 59, 60 и 61, неоантиген-специфические Т-клетки накапливались в области опухоли у вакцинированных мышей. Процент позитивных по мультимеру клеток существенно увеличивался у мышей, вакцинированных Z13Mad12Anaxa. У контрольных мышей обнаружен более низкий процент позитивных по мультимеру клеток.

Пример 42: Активация человеческих дендритных клеток содержащими человеческие антигены конструкциями

Целью настоящего исследования было изучение различных комплексов, предлагаемых в настоящем изобретении, которые содержат в качестве карго-молекул различные человеческие антигены, индуцировать созревание человеческих дендритных клеток. Для этой цели тестировали каждую из конструкций АТР110 (SEQ ID NO: 72), АТР112 (SEQ ID NO: 74), ATP115 (SEQ ID NO: 77), ATP117 (SEQ ID NO: 79), ATP118 (SEQ ID NO: 80), ATP119 (SEQ ID NO: 81), ATP120 (SEQ ID NO: 82), ATP122 (SEQ ID NO: 84), ATP123 (SEQ ID NO: 85) и АТР125 (SEQ ID NO: 87). Биологическим показателем, применяемым для оценки активации DC, являлся индекс активации, который свидетельствует о проценте активации на основе интенсивности экспрессии четырех мембранных антигенов: HLA-DR, CD80, CD83 и CD86.

После инкубации в течение ночи с использованием в дозе 300 нМ или 600 нМ каждой из вышеуказанных конструкций (АТР110 (SEQ ID NO: 72), АТР 112 (SEQ ID NO: 74), АТР 115 (SEQ ID NO: 77), ATP 117 (SEQ ID NO: 79), ATP118 (SEQ ID NO: 80), ATP119 (SEQ ID NO: 81), ATP120 (SEQ ID NO: 82), ATP122 (SEQ ID NO: 84), ATP123 (SEQ ID NO: 85) и АТР125 (SEQ ID NO: 87)), оценивали экспрессию маркеров активации (CD86, CD80, CD83 и HLA-DR) на человеческих дендритных клетках с помощью FACS (фиг. 62-71). В качестве отрицательных контролей для каждой конструкции применяли такие же объемы буфера.

Результаты, представленные на фиг. 62-71, демонстрируют, что при использовании всех протестированных конструкций происходило созревание дендритных клеток, о чем свидетельствует повышающая регуляция CD86, HLADR и CD83.

Пример 43: Воздействия комбинации ингибитора PD1 и комплекса, содержащего проникающий в клетку пептид, различные антигены и пептидный агонист TLR. на рост опухолей и уровень выживаемости на модели карциномы ободочной кишки

Для оценки эффективности комбинации ингибитора PD1 и комплекса, содержащего проникающий в клетку пептид, различные антигены и пептидный агонист TLR, при лечении колоректального рака использовали модель опухоли МС-38. МС-38 представляет собой клеточную линию карциномы ободочной кишки.

Для этой цели мышам линии C57BL/6 (13-14 мышей на группу, самки возрастом 7 недель) имплантировали s.c. 2×10⁵ опухолевых клеток МС-38 в левую боковую область (день 0). После имплантации опухолей мышей из групп «Z13Mad12Anaxa» и «Z13Mad12Anaxa + анти-PD1» вакцинировали в день 3, день 10 и 17 путем подкожного введения в основание хвоста Z13Mad12Anaxa (см. пример 36; SEQ ID NO: 69) в дозе 2 нмоля. 200 мкг антитела к PD1 RMP1-14 (фирма BioXcell, Вест Лебанон, шт. Нью-Гемпшир, США) вводили i.p. в каждый из дней 6, 10, 13, 17, 20, 24 и 27 мышам из групп «анти-PD1» и «Z13Mad12Anaxa + анти-PD1». В дни 10 и 17, когда осуществляли совместное введение и Z13Mad12Anaxa, и антитела к PD1 группе «Z13Mad12Anaxa + анти-PD1», антитело вводили i.p. непосредственно после s.c.-обработки Z13Mad12Anaxa. Размер опухолей определяли с помощью кронциркуля.

Как продемонстрировано на фиг. 72 и 73, обработка только ингибитором PD1 или только Z13Mad12Anaxa приводила к существенному снижению объемов опухолей (фиг. 72А) и повышенной выживаемости (фиг. 72Б) по сравнению с контрольной группой. Однако комбинация их обоих, т.е. ингибитора PD1 и Z13Mad12Anaxa, приводила к наиболее выраженному улучшению, а именно, к сильному уменьшению объемов опухолей и сильному повышению уровней выживаемости. Следует отметить, что в группе «Z13Mad12Anaxa + aPD1» только у трех мышей развились опухоли (в то время как у 10 остальных мышей опухоли отсутствовали (свободные от опухолей мыши)), в то время как в группе «aPD1» и в группе «Z13Mad12Anaxa» у 8 и 10 мышей соответственно развились опухоли. В контрольной группе у всех мышей развились опухоли. Эти данные свидетельствуют о том, что комбинация терапии с использованием антитела к PD1 и вакцинации с использованием Z13Mad12Anaxa обладала более высокой эффективностью, чем терапия на основе только антитела к PD1 или вакцинация с использованием только Z13Mad12Anaxa.

Как продемонстрировано на фиг. 73, количество свободных от опухолей мышей в группе «Z13Mad12Anaxa + aPD1» (10 мышей из 13 мышей) оказалось больше суммы количеств свободных от опухолей мышей в группе «aPD1» (6 мышей из 14 мышей) и в группе «Z13Mad12Anaxa» (3 мыши из 13 мышей). Эти результаты свидетельствуют о синергетическом действии терапии на основе антитела к PD1 и вакцинации Z13Mad12Anaxa.

Пример 44: Иммунный ответ, вызываемый у мышей после вакцинации АТР128

Создавали другую содержащую компоненты человеческого происхождения конструкцию, АТР128 (SEQ ID NO: 89), включающую проникающий в клетку пептид, эпитопы трех антигенов (сурвивин, СЕА и ASCL2) и пептидный агонист TLR. В частности, «АТР128» (SEQ ID NO: 89) представляет собой слитый белок, который содержит проникающий в клетку пептид «Z13» (SEQ ID NO: 6), эпитопы трех антигенов сурвивина, СЕА и ASCL2 и последовательность варианта пептидного агониста TLR «Anaxa» (а именно, пептидный агонист TLR, имеющий SEQ ID NO: 71). Ниже представлена аминокислотная последовательность АТР128:

Наивных мышей линии C57BL/6 (5 мышей на группу, самки, возрастом 7 недель) вакцинировали путем подкожной инъекции АТР128 (SEQ ID NO: 89) в дозе 4 нмоля. Контрольных мышей обрабатывали наполнителем (буфер для вакцины). Через 7 дней после обработки у мышей брали кровь и осуществляли ex vivo Elispot-анализ на клетках крови, стимулированных мышиными дендритными клетками, загруженными АТР128, определяя количество специфических для вакцины Т-клеток, продуцирующих IFN-γ.

Результаты представлены на фиг. 74. У мышей, вакцинированных АТР128, обнаружен более высокий АТР128-специфический иммунный ответ по сравнению с наивными мышами.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что АТР128 обладает эффективностью в отношении вызывания иммунного ответа у мышей.

Пример 45: Активация человеческих дендритных клеток конструкцией АТР128

Целью настоящего исследования было изучение способности конструкции АТР128 (SEQ ID NO: 89), содержащей в качестве карго-молекулы человеческий антиген, индуцировать созревание человеческих дендритных клеток (человеческие DC). Для этой цели тестировали АТР128 (SEQ ID NO: 89). Биологическим показателем, применяемым для оценки активации DC, являлся индекс активации (фиг. 75), который свидетельствует о проценте активации на основе интенсивности экспрессии четырех мембранных антигенов: HLA-DR, CD80, CD83 и CD86.

После инкубации в течение ночи с использованием АТР128 (SEQ ID NO: 89) в дозе 300 нМ оценивали экспрессию маркеров активации (CD86, CD80, CD83 и HLA-DR) на человеческих дендритных клетках с помощью FACS (фиг. 75). В качестве отрицательного контроля применяли такой же объем буфера, в качестве положительного контроля применяли MPLA.

Результаты представлены на фиг. 75. Результаты демонстрируют, что АТР128 может эффективно активировать человеческие DC.

Пример 46: Активация человеческих дендритных клеток конструкцией АТР128

Для подтверждения того, что человеческие клетки могут процессировать и презентировать эпитопные пептиды, включенные в АТР128 (SEQ ID NO: 89), человеческие дендритные клетки (человеческие DC) из двух различных доноров (а именно, донора «9» и «10») загружали в течение ночи АТР128 и обрабатывали для очистки презентируемых молекулами ГКГС класс I и класса II пептидов, элюции пептидов и характеризации с помощью масс-спектроскопии. В целом, метод состоял в следующем: пулы пептидов из подвергнутых шоковой заморозке образцов человеческих DC получали с помощью иммунной преципитации с использованием HLA-специфических антител, обработки кислотой и ультрафильтрации. Пулы HLA-пептидов разделяли на основе их гидрофобности с помощью хроматографии с обращенной фазой и элюированные пептиды анализировали с использованием масс-спектрометра (фирма Thermo Fisher Scientific). Затем получали данные и автоматически обрабатывали путем анализа сигналов, соответствующих массам нефрагментированных пептидов, а также информации о спектрах фрагментов, содержащих пептидную последовательность. Частоту ложных обнаружений (FDR) определяли с помощью алгоритма Percolator ( L., Canterbury J.D., Weston J., Noble W.S., MacCoss M.J. Semi-supervised learning for peptide identification from shotgun proteomics datasets. Nat Methods 4(11), 2007, cc. 923-925)) на основе обработки «decoy»-базы данных (базы данных-«приманки»), состоящей из перетасованной целевой базы данных. Для молекул ГКГС класса I длина пептидов ограничена длиной 8-12 аминокислот. Для молекул ГКГС класса II длина пептидов ограничена длиной 12-25 аминокислот. Аннотирование ГКСГ осуществляли с использованием SYFPEITHI (www.syfpeithi.de).

Данные продемонстрировали, что человеческие DC, загруженные АТР128, могли процессировать и презентировать эпитопные пептиды как класса I, так и класса II, полученные из полиантигенного домена (фиг. 76). В пуле класса I идентифицировали пептиды, полученные из всех антигенов. Во всех антигенных участках вакцины идентифицировали большее количество связанных с классом II пептидов.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> АМАЛЬ ТЕРАПЬЮТИКС СА

<120> СЛИТАЯ КОНСТРУКЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОНИКАЮЩИЙ В КЛЕТКУ ПЕПТИД,

ПОЛИЭПИТОП И ПЕПТИДНЫЙ АГОНИСТ TLR, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ

ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

<130> AM05P013WO

<150> PCT/EP2016/072475

<151> 2016-09-21

<160> 98

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP: Penetratin

<400> 1

Arg Gln Ile Lys Ile Tyr Phe Gln Asn Arg Arg Met Lys Trp Lys Lys

1 5 10 15

<210> 2

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP: TAT minimal domain

<400> 2

Tyr Gly Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 245

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ZEBRA amino acid sequence (natural sequence from Epstein -

Barr

virus (EBV)) (YP_401673)

<400> 3

Met Met Asp Pro Asn Ser Thr Ser Glu Asp Val Lys Phe Thr Pro Asp

1 5 10 15

Pro Tyr Gln Val Pro Phe Val Gln Ala Phe Asp Gln Ala Thr Arg Val

20 25 30

Tyr Gln Asp Leu Gly Gly Pro Ser Gln Ala Pro Leu Pro Cys Val Leu

35 40 45

Trp Pro Val Leu Pro Glu Pro Leu Pro Gln Gly Gln Leu Thr Ala Tyr

50 55 60

His Val Ser Thr Ala Pro Thr Gly Ser Trp Phe Ser Ala Pro Gln Pro

65 70 75 80

Ala Pro Glu Asn Ala Tyr Gln Ala Tyr Ala Ala Pro Gln Leu Phe Pro

85 90 95

Val Ser Asp Ile Thr Gln Asn Gln Gln Thr Asn Gln Ala Gly Gly Glu

100 105 110

Ala Pro Gln Pro Gly Asp Asn Ser Thr Val Gln Thr Ala Ala Ala Val

115 120 125

Val Phe Ala Cys Pro Gly Ala Asn Gln Gly Gln Gln Leu Ala Asp Ile

130 135 140

Gly Val Pro Gln Pro Ala Pro Val Ala Ala Pro Ala Arg Arg Thr Arg

145 150 155 160

Lys Pro Gln Gln Pro Glu Ser Leu Glu Glu Cys Asp Ser Glu Leu Glu

165 170 175

Ile Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys

180 185 190

Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser

195 200 205

Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys Pro Ser

210 215 220

Leu Asp Val Asp Ser Ile Ile Pro Arg Thr Pro Asp Val Leu His Glu

225 230 235 240

Asp Leu Leu Asn Phe

245

<210> 4

<211> 45

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP1 (Z11)

<400> 4

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Gln Met Cys

35 40 45

<210> 5

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP2 (Z12)

<400> 5

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Cys Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys

35 40

<210> 6

<211> 42

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP3 (Z13)

<400> 6

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys

35 40

<210> 7

<211> 30

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP4 (Z14)

<400> 7

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys

20 25 30

<210> 8

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP5 (Z15)

<400> 8

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys

<210> 9

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP6 (Z16)

<400> 9

Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp

1 5 10 15

<210> 10

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP7 (Z17)

<400> 10

Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP8 (Z18)

<400> 11

Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu

1 5 10 15

Leu Leu Lys

<210> 12

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP9 (Z19)

<400> 12

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala

1 5

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CPP10 (Z20)

<400> 13

Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys

1 5 10

<210> 14

<211> 85

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MAD5 cargo

<400> 14

Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile

1 5 10 15

Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val Pro

20 25 30

Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser

35 40 45

Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn

50 55 60

Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr

65 70 75 80

Glu Trp Thr Gly Ser

<210> 15

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TLR2 peptide agonist Anaxa

<400> 15

Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His

1 5 10 15

Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe

20 25 30

Asp Ala Glu

<210> 16

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> enterokinase target site

<400> 16

Asp Asp Asp Lys

<210> 17

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> factor Xa target site

<400> 17

Ile Glu Asp Gly Arg

1 5

<210> 18

<211> 6

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> thrombin target site

<400> 18

Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> protease TEV target site

<400> 19

Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PreScission protease target site

<400> 20

Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Pro

1 5

<210> 21

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> furin target site

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> X may be any amino acid

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (3)..(3)

<223> X is R or K

<400> 21

Arg Xaa Xaa Arg

<210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptidic linker

<400> 22

Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 23

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptidic linker

<400> 23

Gly Gly Gly Gly

<210> 24

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptidic linker

<400> 24

Glu Gln Leu Glu

<210> 25

<211> 4

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> peptidic linker

<400> 25

Thr Glu Trp Thr

<210> 26

<211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EDAZ13Mad5

<400> 26

Met His His His His His His Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala

1 5 10 15

Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro

20 25 30

Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp

35 40 45

Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala

50 55 60

Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val

65 70 75 80

Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser

85 90 95

Thr Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys

100 105 110

Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser

115 120 125

Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Lys Ile

130 135 140

Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg

145 150 155 160

Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp

165 170 175

Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly

180 185 190

Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln

195 200 205

Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser

210 215 220

<210> 27

<211> 169

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> AnaxaZ13Mad5

<400> 27

Met His His His His His His Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys

1 5 10 15

Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser

20 25 30

Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu Lys Arg Tyr Lys Asn Arg

35 40 45

Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His

50 55 60

Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg

65 70 75 80

Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala

85 90 95

His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala

100 105 110

Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala

115 120 125

Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val

130 135 140

Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe

145 150 155 160

Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser

165

<210> 28

<211> 169

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Z13Mad5Anaxa

<400> 28

Met His His His His His His Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser

1 5 10 15

Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu

20 25 30

Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu

50 55 60

Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val

65 70 75 80

Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala

85 90 95

Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala

100 105 110

Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

115 120 125

Thr Glu Trp Thr Gly Ser Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu

130 135 140

Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val

145 150 155 160

Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

165

<210> 29

<211> 134

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Z13Mad5

<400> 29

Met His His His His His His Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser

1 5 10 15

Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu

20 25 30

Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu

35 40 45

Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu

50 55 60

Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val

65 70 75 80

Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala

85 90 95

Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala

100 105 110

Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

115 120 125

Thr Glu Trp Thr Gly Ser

130

<210> 30

<211> 92

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mad5

<400> 30

Met His His His His His His Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val

1 5 10 15

His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly

20 25 30

Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro

35 40 45

Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn

50 55 60

Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile

65 70 75 80

Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser

85 90

<210> 31

<211> 182

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EdaMad5

<400> 31

Met His His His His His His Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala

1 5 10 15

Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro

20 25 30

Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp

35 40 45

Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala

50 55 60

Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val

65 70 75 80

Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser

85 90 95

Thr Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu

100 105 110

Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val

115 120 125

Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala

130 135 140

Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala

145 150 155 160

Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

165 170 175

Thr Glu Trp Thr Gly Ser

180

<210> 32

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mad5Anaxa

<400> 32

Met His His His His His His Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val

1 5 10 15

His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly

20 25 30

Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro

35 40 45

Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn

50 55 60

Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile

65 70 75 80

Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser Ser Thr Val His

85 90 95

Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro

100 105 110

Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

115 120 125

<210> 33

<211> 157

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Z14Mad5Anaxa

<400> 33

Met His His His His His His Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser

1 5 10 15

Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu

20 25 30

Val Ala Ala Ala Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala

35 40 45

Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly

50 55 60

Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe

65 70 75 80

Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala

85 90 95

Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn

100 105 110

Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser Ser Thr Val His Glu Ile

115 120 125

Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala

130 135 140

Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

145 150 155

<210> 34

<211> 146

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Z18Mad5Anaxa

<400> 34

Met His His His His His His Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

1 5 10 15

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser

20 25 30

Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu

35 40 45

Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu

50 55 60

Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala

65 70 75 80

Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu

85 90 95

Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser Ser

100 105 110

Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser

115 120 125

Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp

130 135 140

Ala Glu

145

<210> 35

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> SIINFEKL OVACD8

<400> 35

Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu

1 5

<210> 36

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> OVACD4 peptide

<400> 36

Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly

1 5 10 15

Arg

<210> 37

<211> 212

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EDAZ14Mad5

<400> 37

Met His His His His His His Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala

1 5 10 15

Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro

20 25 30

Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp

35 40 45

Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala

50 55 60

Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val

65 70 75 80

Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser

85 90 95

Thr Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys

100 105 110

Phe Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Glu

115 120 125

Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn

130 135 140

Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala Leu Lys Val Pro Arg

145 150 155 160

Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala Lys Phe Ala Ser Phe

165 170 175

Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala Asn Leu

180 185 190

Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Thr Glu

195 200 205

Trp Thr Gly Ser

210

<210> 38

<211> 201

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EDAZ18Mad5

<400> 38

Met His His His His His His Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala

1 5 10 15

Phe Thr Asp Val Asp Val Asp Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro

20 25 30

Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp

35 40 45

Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala

50 55 60

Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val

65 70 75 80

Ala Leu His Asp Asp Met Glu Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser

85 90 95

Thr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser Glu Asn Asp Arg Leu Arg

100 105 110

Leu Leu Leu Lys Glu Ser Leu Lys Ile Ser Gln Ala Val His Ala Ala

115 120 125

His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Val Gly Ala

130 135 140

Leu Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Gly Val Pro Arg Phe Ala

145 150 155 160

Lys Phe Ala Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val

165 170 175

Asp Lys Ala Asn Leu Asp Val Glu Gln Leu Glu Ser Ile Ile Asn Phe

180 185 190

Glu Lys Leu Thr Glu Trp Thr Gly Ser

195 200

<210> 39

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Z13Mad8Anaxa

<400> 39

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Val Thr Tyr His Ser Pro

35 40 45

Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe Glu Arg Arg Ala Ile Leu Asn Arg Leu

50 55 60

Val Gln Phe Ile Lys Asp Arg Ile Ser Val Val Gln Ala Leu Val Leu

65 70 75 80

Thr Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp

85 90 95

His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn

100 105 110

Phe Asp Ala Glu

115

<210> 40

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Z13Mad11Anaxa

<400> 40

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Tyr Arg Ile Ala Thr

35 40 45

Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Asp Cys Ala Met Glu Glu Leu Thr

50 55 60

Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Gln Arg Ser Thr Val His Glu

65 70 75 80

Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser

85 90 95

Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

100 105 110

<210> 41

<211> 94

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Z13Mad9Anaxa

<400> 41

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys His Leu Glu Leu Ala Ser

35 40 45

Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser Ile Val Ser Thr Val His Glu

50 55 60

Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

85 90

<210> 42

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mad9

<400> 42

His Leu Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser Ile

1 5 10 15

Val

<210> 43

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mad8

<400> 43

Val Thr Tyr His Ser Pro Ser Tyr Ala Tyr His Gln Phe Glu Arg Arg

1 5 10 15

Ala Ile Leu Asn

<210> 44

<211> 33

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mad11

<400> 44

Asn Tyr Arg Ile Ala Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Asp Cys

1 5 10 15

Ala Met Glu Glu Leu Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Gln

20 25 30

Arg

<210> 45

<211> 90

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EDA

<400> 45

Asn Ile Asp Arg Pro Lys Gly Leu Ala Phe Thr Asp Val Asp Val Asp

1 5 10 15

Ser Ile Lys Ile Ala Trp Glu Ser Pro Gln Gly Gln Val Ser Arg Tyr

20 25 30

Arg Val Thr Tyr Ser Ser Pro Glu Asp Gly Ile Arg Glu Leu Phe Pro

35 40 45

Ala Pro Asp Gly Glu Asp Asp Thr Ala Glu Leu Gln Gly Leu Arg Pro

50 55 60

Gly Ser Glu Tyr Thr Val Ser Val Val Ala Leu His Asp Asp Met Glu

65 70 75 80

Ser Gln Pro Leu Ile Gly Ile Gln Ser Thr

85 90

<210> 46

<211> 115

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TatFMad5Anaxa

<400> 46

Arg Lys Lys Arg Arg Gln Arg Arg Arg Arg Val Lys Arg Ile Ser Gln

1 5 10 15

Ala Val His Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala Gly Arg Arg Val

20 25 30

Lys Arg Lys Val Pro Arg Asn Gln Asp Trp Leu Arg Val Lys Arg Ala

35 40 45

Ser Phe Glu Ala Gln Gly Ala Leu Ala Asn Ile Ala Val Asp Lys Ala

50 55 60

Arg Val Lys Arg Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu Arg Val Lys Arg

65 70 75 80

Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His

85 90 95

Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe

100 105 110

Asp Ala Glu

115

<210> 47

<211> 314

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EpCAM

<400> 47

Met Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala

1 5 10 15

Thr Ala Thr Phe Ala Ala Ala Gln Glu Glu Cys Val Cys Glu Asn Tyr

20 25 30

Lys Leu Ala Val Asn Cys Phe Val Asn Asn Asn Arg Gln Cys Gln Cys

35 40 45

Thr Ser Val Gly Ala Gln Asn Thr Val Ile Cys Ser Lys Leu Ala Ala

50 55 60

Lys Cys Leu Val Met Lys Ala Glu Met Asn Gly Ser Lys Leu Gly Arg

65 70 75 80

Arg Ala Lys Pro Glu Gly Ala Leu Gln Asn Asn Asp Gly Leu Tyr Asp

85 90 95

Pro Asp Cys Asp Glu Ser Gly Leu Phe Lys Ala Lys Gln Cys Asn Gly

100 105 110

Thr Ser Met Cys Trp Cys Val Asn Thr Ala Gly Val Arg Arg Thr Asp

115 120 125

Lys Asp Thr Glu Ile Thr Cys Ser Glu Arg Val Arg Thr Tyr Trp Ile

130 135 140

Ile Ile Glu Leu Lys His Lys Ala Arg Glu Lys Pro Tyr Asp Ser Lys

145 150 155 160

Ser Leu Arg Thr Ala Leu Gln Lys Glu Ile Thr Thr Arg Tyr Gln Leu

165 170 175

Asp Pro Lys Phe Ile Thr Ser Ile Leu Tyr Glu Asn Asn Val Ile Thr

180 185 190

Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Ser Gln Lys Thr Gln Asn Asp Val Asp

195 200 205

Ile Ala Asp Val Ala Tyr Tyr Phe Glu Lys Asp Val Lys Gly Glu Ser

210 215 220

Leu Phe His Ser Lys Lys Met Asp Leu Thr Val Asn Gly Glu Gln Leu

225 230 235 240

Asp Leu Asp Pro Gly Gln Thr Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala

245 250 255

Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile

260 265 270

Val Val Val Val Ile Ala Val Val Ala Gly Ile Val Val Leu Val Ile

275 280 285

Ser Arg Lys Lys Arg Met Ala Lys Tyr Glu Lys Ala Glu Ile Lys Glu

290 295 300

Met Gly Glu Met His Arg Glu Leu Asn Ala

305 310

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> EpCAM epitope

<400> 48

Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val

1 5

<210> 49

<211> 1255

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MUC-1

<400> 49

Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr

1 5 10 15

Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly

20 25 30

Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser

35 40 45

Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His

50 55 60

Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu

65 70 75 80

Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln

85 90 95

Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr

100 105 110

Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro

115 120 125

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

130 135 140

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

145 150 155 160

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

165 170 175

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

180 185 190

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

195 200 205

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

210 215 220

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

225 230 235 240

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

245 250 255

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

260 265 270

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

275 280 285

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

290 295 300

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

305 310 315 320

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

325 330 335

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

340 345 350

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

355 360 365

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

370 375 380

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

385 390 395 400

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

405 410 415

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

420 425 430

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

435 440 445

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

450 455 460

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

465 470 475 480

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

485 490 495

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

500 505 510

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

515 520 525

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

530 535 540

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

545 550 555 560

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

565 570 575

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

580 585 590

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

595 600 605

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

610 615 620

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

625 630 635 640

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

645 650 655

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

660 665 670

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

675 680 685

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

690 695 700

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

705 710 715 720

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

725 730 735

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

740 745 750

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

755 760 765

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

770 775 780

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

785 790 795 800

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

805 810 815

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

820 825 830

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

835 840 845

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr

850 855 860

Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

865 870 875 880

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

885 890 895

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

900 905 910

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro

915 920 925

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn

930 935 940

Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser

945 950 955 960

Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly

965 970 975

Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe

980 985 990

Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His

995 1000 1005

Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Ser Val Pro

1010 1015 1020

Pro Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr

1025 1030 1035

Gly Val Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln

1040 1045 1050

Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu

1055 1060 1065

Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln

1070 1075 1080

Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser

1085 1090 1095

Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn

1100 1105 1110

Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala

1115 1120 1125

Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser Asp

1130 1135 1140

Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro Gly

1145 1150 1155

Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu

1160 1165 1170

Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg

1175 1180 1185

Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr

1190 1195 1200

His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr

1205 1210 1215

Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser

1220 1225 1230

Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val

1235 1240 1245

Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu

1250 1255

<210> 50

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MUC-1 epitope

<400> 50

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn

1 5

<210> 51

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MUC-1 epitope

<400> 51

Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

1 5 10

<210> 52

<211> 142

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> survivin

<400> 52

Met Gly Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

1 5 10 15

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Cys Ala

20 25 30

Cys Thr Pro Glu Arg Met Ala Glu Ala Gly Phe Ile His Cys Pro Thr

35 40 45

Glu Asn Glu Pro Asp Leu Ala Gln Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu

50 55 60

Glu Gly Trp Glu Pro Asp Asp Asp Pro Ile Glu Glu His Lys Lys His

65 70 75 80

Ser Ser Gly Cys Ala Phe Leu Ser Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu

85 90 95

Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys

100 105 110

Ile Ala Lys Glu Thr Asn Asn Lys Lys Lys Glu Phe Glu Glu Thr Ala

115 120 125

Lys Lys Val Arg Arg Ala Ile Glu Gln Leu Ala Ala Met Asp

130 135 140

<210> 53

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> survivin epitope

<400> 53

Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe

1 5 10

<210> 54

<211> 701

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEA

<400> 54

Met Glu Ser Pro Ser Ala Pro Pro His Arg Trp Cys Ile Pro Trp Gln

1 5 10 15

Arg Leu Leu Leu Thr Ala Ser Leu Leu Thr Phe Trp Asn Pro Pro Thr

20 25 30

Thr Ala Lys Leu Thr Ile Glu Ser Thr Pro Phe Asn Val Ala Glu Gly

35 40 45

Lys Glu Val Leu Leu Leu Val His Asn Leu Pro Gln His Leu Phe Gly

50 55 60

Tyr Ser Trp Tyr Lys Gly Glu Arg Val Asp Gly Asn Arg Gln Ile Ile

65 70 75 80

Gly Tyr Val Ile Gly Thr Gln Gln Ala Thr Pro Gly Pro Ala Tyr Ser

85 90 95

Gly Arg Glu Ile Ile Tyr Pro Asn Ala Ser Leu Leu Ile Gln Asn Ile

100 105 110

Ile Gln Asn Asp Thr Gly Phe Tyr Thr Leu His Val Ile Lys Ser Asp

115 120 125

Leu Val Asn Glu Glu Ala Thr Gly Gln Phe Arg Val Tyr Pro Glu Leu

130 135 140

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys

145 150 155 160

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr

165 170 175

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

180 185 190

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn

195 200 205

Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg

210 215 220

Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp Ala Pro

225 230 235 240

Thr Ile Ser Pro Leu Asn Thr Ser Tyr Arg Ser Gly Glu Asn Leu Asn

245 250 255

Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser Trp Phe

260 265 270

Val Asn Gly Thr Phe Gln Gln Ser Thr Gln Glu Leu Phe Ile Pro Asn

275 280 285

Ile Thr Val Asn Asn Ser Gly Ser Tyr Thr Cys Gln Ala His Asn Ser

290 295 300

Asp Thr Gly Leu Asn Arg Thr Thr Val Thr Thr Ile Thr Val Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Pro Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu

325 330 335

Asp Glu Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr

340 345 350

Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg

355 360 365

Leu Gln Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr

370 375 380

Arg Asn Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser

385 390 395 400

Val Asp His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn Val Leu Tyr Gly Pro Asp

405 410 415

Asp Pro Thr Ile Ser Pro Ser Tyr Thr Tyr Tyr Arg Pro Gly Val Asn

420 425 430

Leu Ser Leu Ser Cys His Ala Ala Ser Asn Pro Pro Ala Gln Tyr Ser

435 440 445

Trp Leu Ile Asp Gly Asn Ile Gln Gln His Thr Gln Glu Leu Phe Ile

450 455 460

Ser Asn Ile Thr Glu Lys Asn Ser Gly Leu Tyr Thr Cys Gln Ala Asn

465 470 475 480

Asn Ser Ala Ser Gly His Ser Arg Thr Thr Val Lys Thr Ile Thr Val

485 490 495

Ser Ala Glu Leu Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro

500 505 510

Val Glu Asp Lys Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Ala Gln

515 520 525

Asn Thr Thr Tyr Leu Trp Trp Val Asn Gly Gln Ser Leu Pro Val Ser

530 535 540

Pro Arg Leu Gln Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn

545 550 555 560

Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Cys Gly Ile Gln Asn Ser

565 570 575

Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu Tyr Gly

580 585 590

Pro Asp Thr Pro Ile Ile Ser Pro Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly

595 600 605

Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Asn Pro Ser Pro Gln

610 615 620

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

625 630 635 640

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

645 650 655

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

660 665 670

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr

675 680 685

Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu

690 695 700

<210> 55

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEA epitope

<400> 55

Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser

1 5 10

<210> 56

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEA epitope

<400> 56

Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

1 5 10

<210> 57

<211> 189

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Kirsten Ras

<400> 57

Met Thr Glu Tyr Lys Leu Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly Lys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Thr Ile Gln Leu Ile Gln Asn His Phe Val Asp Glu Tyr

20 25 30

Asp Pro Thr Ile Glu Asp Ser Tyr Arg Lys Gln Val Val Ile Asp Gly

35 40 45

Glu Thr Cys Leu Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ala Gly Gln Glu Glu Tyr

50 55 60

Ser Ala Met Arg Asp Gln Tyr Met Arg Thr Gly Glu Gly Phe Leu Cys

65 70 75 80

Val Phe Ala Ile Asn Asn Thr Lys Ser Phe Glu Asp Ile His His Tyr

85 90 95

Arg Glu Gln Ile Lys Arg Val Lys Asp Ser Glu Asp Val Pro Met Val

100 105 110

Leu Val Gly Asn Lys Cys Asp Leu Pro Ser Arg Thr Val Asp Thr Lys

115 120 125

Gln Ala Gln Asp Leu Ala Arg Ser Tyr Gly Ile Pro Phe Ile Glu Thr

130 135 140

Ser Ala Lys Thr Arg Gln Arg Val Glu Asp Ala Phe Tyr Thr Leu Val

145 150 155 160

Arg Glu Ile Arg Gln Tyr Arg Leu Lys Lys Ile Ser Lys Glu Glu Lys

165 170 175

Thr Pro Gly Cys Val Lys Ile Lys Lys Cys Ile Ile Met

180 185

<210> 58

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Kirsten Ras epitope

<400> 58

Val Val Val Gly Ala Gly Gly Val Gly

1 5

<210> 59

<211> 314

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MAGE-A3

<400> 59

Met Pro Leu Glu Gln Arg Ser Gln His Cys Lys Pro Glu Glu Gly Leu

1 5 10 15

Glu Ala Arg Gly Glu Ala Leu Gly Leu Val Gly Ala Gln Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Glu Glu Gln Glu Ala Ala Ser Ser Ser Ser Thr Leu Val Glu Val

35 40 45

Thr Leu Gly Glu Val Pro Ala Ala Glu Ser Pro Asp Pro Pro Gln Ser

50 55 60

Pro Gln Gly Ala Ser Ser Leu Pro Thr Thr Met Asn Tyr Pro Leu Trp

65 70 75 80

Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Ser Ser Asn Gln Glu Glu Glu Gly Pro Ser

85 90 95

Thr Phe Pro Asp Leu Glu Ser Glu Phe Gln Ala Ala Leu Ser Arg Lys

100 105 110

Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu

115 120 125

Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Gly Asn Trp Gln

130 135 140

Tyr Phe Phe Pro Val Ile Phe Ser Lys Ala Phe Ser Ser Leu Gln Leu

145 150 155 160

Val Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Val Asp Pro Ile Gly His Leu Tyr

165 170 175

Ile Phe Ala Thr Cys Leu Gly Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp

180 185 190

Asn Gln Ile Met Pro Lys Ala Gly Leu Leu Ile Ile Val Leu Ala Ile

195 200 205

Ile Ala Arg Glu Gly Asp Cys Ala Pro Glu Glu Lys Ile Trp Glu Glu

210 215 220

Leu Ser Val Leu Glu Val Phe Glu Gly Arg Glu Asp Ser Ile Leu Gly

225 230 235 240

Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu

245 250 255

Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Cys Tyr Glu Phe Leu

260 265 270

Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu His

275 280 285

His Met Val Lys Ile Ser Gly Gly Pro His Ile Ser Tyr Pro Pro Leu

290 295 300

His Glu Trp Val Leu Arg Glu Gly Glu Glu

305 310

<210> 60

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MAGE-A3 epitope

<400> 60

Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu

1 5

<210> 61

<211> 380

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL13Ralpha2

<400> 61

Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile

1 5 10 15

Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val

20 25 30

Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr

35 40 45

Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu

50 55 60

Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr

65 70 75 80

Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp

85 90 95

Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln

100 105 110

Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr

115 120 125

Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp

130 135 140

Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly

145 150 155 160

Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu

165 170 175

Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly

180 185 190

Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys

195 200 205

Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg

210 215 220

Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro

225 230 235 240

Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu

245 250 255

Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr

260 265 270

Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val

275 280 285

Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu

290 295 300

Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly

305 310 315 320

Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu

325 330 335

Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu

340 345 350

Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr

355 360 365

Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr

370 375 380

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> IL13Ralpha2 epitope

<400> 62

Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu

1 5

<210> 63

<211> 50

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Mad12

<400> 63

Leu Phe Arg Ala Ala Gln Leu Ala Asn Asp Val Val Leu Gln Ile Met

1 5 10 15

Glu His Leu Glu Leu Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser

20 25 30

Ile Val Val Ile Ser Ala Ser Ile Ile Val Phe Asn Leu Leu Glu Leu

35 40 45

Glu Gly

<210> 64

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gp70CD4 peptide

<400> 64

Leu Val Gln Phe Ile Lys Asp Arg Ile Ser Val Val Gln Ala

1 5 10

<210> 65

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> gp70CD8 peptide

<400> 65

Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe

1 5

<210> 66

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> adpgk peptide

<400> 66

Ala Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met

1 5

<210> 67

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> survivin20-28

<400> 67

Ala Thr Lys Asn Trp Pro Phe Leu

1 5

<210> 68

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> survivin97-104

<400> 68

Thr Val Ser Glu Phe Leu Lys Leu

1 5

<210> 69

<211> 127

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Z13Mad12Anaxa

<400> 69

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Leu Phe Arg Ala Ala Gln

35 40 45

Leu Ala Asn Asp Val Val Leu Gln Ile Met Glu His Leu Glu Leu Ala

50 55 60

Ser Met Thr Asn Met Glu Leu Met Ser Ser Ile Val Val Ile Ser Ala

65 70 75 80

Ser Ile Ile Val Phe Asn Leu Leu Glu Leu Glu Gly Ser Thr Val His

85 90 95

Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro

100 105 110

Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

115 120 125

<210> 70

<211> 1255

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Her2/neu

<400> 70

Met Glu Leu Ala Ala Leu Cys Arg Trp Gly Leu Leu Leu Ala Leu Leu

1 5 10 15

Pro Pro Gly Ala Ala Ser Thr Gln Val Cys Thr Gly Thr Asp Met Lys

20 25 30

Leu Arg Leu Pro Ala Ser Pro Glu Thr His Leu Asp Met Leu Arg His

35 40 45

Leu Tyr Gln Gly Cys Gln Val Val Gln Gly Asn Leu Glu Leu Thr Tyr

50 55 60

Leu Pro Thr Asn Ala Ser Leu Ser Phe Leu Gln Asp Ile Gln Glu Val

65 70 75 80

Gln Gly Tyr Val Leu Ile Ala His Asn Gln Val Arg Gln Val Pro Leu

85 90 95

Gln Arg Leu Arg Ile Val Arg Gly Thr Gln Leu Phe Glu Asp Asn Tyr

100 105 110

Ala Leu Ala Val Leu Asp Asn Gly Asp Pro Leu Asn Asn Thr Thr Pro

115 120 125

Val Thr Gly Ala Ser Pro Gly Gly Leu Arg Glu Leu Gln Leu Arg Ser

130 135 140

Leu Thr Glu Ile Leu Lys Gly Gly Val Leu Ile Gln Arg Asn Pro Gln

145 150 155 160

Leu Cys Tyr Gln Asp Thr Ile Leu Trp Lys Asp Ile Phe His Lys Asn

165 170 175

Asn Gln Leu Ala Leu Thr Leu Ile Asp Thr Asn Arg Ser Arg Ala Cys

180 185 190

His Pro Cys Ser Pro Met Cys Lys Gly Ser Arg Cys Trp Gly Glu Ser

195 200 205

Ser Glu Asp Cys Gln Ser Leu Thr Arg Thr Val Cys Ala Gly Gly Cys

210 215 220

Ala Arg Cys Lys Gly Pro Leu Pro Thr Asp Cys Cys His Glu Gln Cys

225 230 235 240

Ala Ala Gly Cys Thr Gly Pro Lys His Ser Asp Cys Leu Ala Cys Leu

245 250 255

His Phe Asn His Ser Gly Ile Cys Glu Leu His Cys Pro Ala Leu Val

260 265 270

Thr Tyr Asn Thr Asp Thr Phe Glu Ser Met Pro Asn Pro Glu Gly Arg

275 280 285

Tyr Thr Phe Gly Ala Ser Cys Val Thr Ala Cys Pro Tyr Asn Tyr Leu

290 295 300

Ser Thr Asp Val Gly Ser Cys Thr Leu Val Cys Pro Leu His Asn Gln

305 310 315 320

Glu Val Thr Ala Glu Asp Gly Thr Gln Arg Cys Glu Lys Cys Ser Lys

325 330 335

Pro Cys Ala Arg Val Cys Tyr Gly Leu Gly Met Glu His Leu Arg Glu

340 345 350

Val Arg Ala Val Thr Ser Ala Asn Ile Gln Glu Phe Ala Gly Cys Lys

355 360 365

Lys Ile Phe Gly Ser Leu Ala Phe Leu Pro Glu Ser Phe Asp Gly Asp

370 375 380

Pro Ala Ser Asn Thr Ala Pro Leu Gln Pro Glu Gln Leu Gln Val Phe

385 390 395 400

Glu Thr Leu Glu Glu Ile Thr Gly Tyr Leu Tyr Ile Ser Ala Trp Pro

405 410 415

Asp Ser Leu Pro Asp Leu Ser Val Phe Gln Asn Leu Gln Val Ile Arg

420 425 430

Gly Arg Ile Leu His Asn Gly Ala Tyr Ser Leu Thr Leu Gln Gly Leu

435 440 445

Gly Ile Ser Trp Leu Gly Leu Arg Ser Leu Arg Glu Leu Gly Ser Gly

450 455 460

Leu Ala Leu Ile His His Asn Thr His Leu Cys Phe Val His Thr Val

465 470 475 480

Pro Trp Asp Gln Leu Phe Arg Asn Pro His Gln Ala Leu Leu His Thr

485 490 495

Ala Asn Arg Pro Glu Asp Glu Cys Val Gly Glu Gly Leu Ala Cys His

500 505 510

Gln Leu Cys Ala Arg Gly His Cys Trp Gly Pro Gly Pro Thr Gln Cys

515 520 525

Val Asn Cys Ser Gln Phe Leu Arg Gly Gln Glu Cys Val Glu Glu Cys

530 535 540

Arg Val Leu Gln Gly Leu Pro Arg Glu Tyr Val Asn Ala Arg His Cys

545 550 555 560

Leu Pro Cys His Pro Glu Cys Gln Pro Gln Asn Gly Ser Val Thr Cys

565 570 575

Phe Gly Pro Glu Ala Asp Gln Cys Val Ala Cys Ala His Tyr Lys Asp

580 585 590

Pro Pro Phe Cys Val Ala Arg Cys Pro Ser Gly Val Lys Pro Asp Leu

595 600 605

Ser Tyr Met Pro Ile Trp Lys Phe Pro Asp Glu Glu Gly Ala Cys Gln

610 615 620

Pro Cys Pro Ile Asn Cys Thr His Ser Cys Val Asp Leu Asp Asp Lys

625 630 635 640

Gly Cys Pro Ala Glu Gln Arg Ala Ser Pro Leu Thr Ser Ile Ile Ser

645 650 655

Ala Val Val Gly Ile Leu Leu Val Val Val Leu Gly Val Val Phe Gly

660 665 670

Ile Leu Ile Lys Arg Arg Gln Gln Lys Ile Arg Lys Tyr Thr Met Arg

675 680 685

Arg Leu Leu Gln Glu Thr Glu Leu Val Glu Pro Leu Thr Pro Ser Gly

690 695 700

Ala Met Pro Asn Gln Ala Gln Met Arg Ile Leu Lys Glu Thr Glu Leu

705 710 715 720

Arg Lys Val Lys Val Leu Gly Ser Gly Ala Phe Gly Thr Val Tyr Lys

725 730 735

Gly Ile Trp Ile Pro Asp Gly Glu Asn Val Lys Ile Pro Val Ala Ile

740 745 750

Lys Val Leu Arg Glu Asn Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile Leu

755 760 765

Asp Glu Ala Tyr Val Met Ala Gly Val Gly Ser Pro Tyr Val Ser Arg

770 775 780

Leu Leu Gly Ile Cys Leu Thr Ser Thr Val Gln Leu Val Thr Gln Leu

785 790 795 800

Met Pro Tyr Gly Cys Leu Leu Asp His Val Arg Glu Asn Arg Gly Arg

805 810 815

Leu Gly Ser Gln Asp Leu Leu Asn Trp Cys Met Gln Ile Ala Lys Gly

820 825 830

Met Ser Tyr Leu Glu Asp Val Arg Leu Val His Arg Asp Leu Ala Ala

835 840 845

Arg Asn Val Leu Val Lys Ser Pro Asn His Val Lys Ile Thr Asp Phe

850 855 860

Gly Leu Ala Arg Leu Leu Asp Ile Asp Glu Thr Glu Tyr His Ala Asp

865 870 875 880

Gly Gly Lys Val Pro Ile Lys Trp Met Ala Leu Glu Ser Ile Leu Arg

885 890 895

Arg Arg Phe Thr His Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Val Thr Val

900 905 910

Trp Glu Leu Met Thr Phe Gly Ala Lys Pro Tyr Asp Gly Ile Pro Ala

915 920 925

Arg Glu Ile Pro Asp Leu Leu Glu Lys Gly Glu Arg Leu Pro Gln Pro

930 935 940

Pro Ile Cys Thr Ile Asp Val Tyr Met Ile Met Val Lys Cys Trp Met

945 950 955 960

Ile Asp Ser Glu Cys Arg Pro Arg Phe Arg Glu Leu Val Ser Glu Phe

965 970 975

Ser Arg Met Ala Arg Asp Pro Gln Arg Phe Val Val Ile Gln Asn Glu

980 985 990

Asp Leu Gly Pro Ala Ser Pro Leu Asp Ser Thr Phe Tyr Arg Ser Leu

995 1000 1005

Leu Glu Asp Asp Asp Met Gly Asp Leu Val Asp Ala Glu Glu Tyr

1010 1015 1020

Leu Val Pro Gln Gln Gly Phe Phe Cys Pro Asp Pro Ala Pro Gly

1025 1030 1035

Ala Gly Gly Met Val His His Arg His Arg Ser Ser Ser Thr Arg

1040 1045 1050

Ser Gly Gly Gly Asp Leu Thr Leu Gly Leu Glu Pro Ser Glu Glu

1055 1060 1065

Glu Ala Pro Arg Ser Pro Leu Ala Pro Ser Glu Gly Ala Gly Ser

1070 1075 1080

Asp Val Phe Asp Gly Asp Leu Gly Met Gly Ala Ala Lys Gly Leu

1085 1090 1095

Gln Ser Leu Pro Thr His Asp Pro Ser Pro Leu Gln Arg Tyr Ser

1100 1105 1110

Glu Asp Pro Thr Val Pro Leu Pro Ser Glu Thr Asp Gly Tyr Val

1115 1120 1125

Ala Pro Leu Thr Cys Ser Pro Gln Pro Glu Tyr Val Asn Gln Pro

1130 1135 1140

Asp Val Arg Pro Gln Pro Pro Ser Pro Arg Glu Gly Pro Leu Pro

1145 1150 1155

Ala Ala Arg Pro Ala Gly Ala Thr Leu Glu Arg Pro Lys Thr Leu

1160 1165 1170

Ser Pro Gly Lys Asn Gly Val Val Lys Asp Val Phe Ala Phe Gly

1175 1180 1185

Gly Ala Val Glu Asn Pro Glu Tyr Leu Thr Pro Gln Gly Gly Ala

1190 1195 1200

Ala Pro Gln Pro His Pro Pro Pro Ala Phe Ser Pro Ala Phe Asp

1205 1210 1215

Asn Leu Tyr Tyr Trp Asp Gln Asp Pro Pro Glu Arg Gly Ala Pro

1220 1225 1230

Pro Ser Thr Phe Lys Gly Thr Pro Thr Ala Glu Asn Pro Glu Tyr

1235 1240 1245

Leu Gly Leu Asp Val Pro Val

1250 1255

<210> 71

<211> 35

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> TLR peptide agonist "Anaxa" sequence variant

<400> 71

Ser Thr Val His Glu Ile Leu Ser Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His

1 5 10 15

Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe

20 25 30

Asp Ala Glu

<210> 72

<211> 118

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP110

<400> 72

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Ala Pro Pro Gln Val Leu

35 40 45

Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Tyr Val Asp Glu Lys

50 55 60

Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val

65 70 75 80

Ile Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu

85 90 95

Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr

100 105 110

Thr Asn Phe Asp Ala Glu

115

<210> 73

<211> 331

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP111

<400> 73

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Arg Thr Leu Thr Leu Phe

35 40 45

Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn

50 55 60

Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Pro Asp Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His Ser Ala Ser Pro Gln

85 90 95

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

100 105 110

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

115 120 125

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

130 135 140

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Gly Ala Thr

145 150 155 160

Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val Ala Leu Ile Leu Gly

165 170 175

Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu

180 185 190

Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Ser Tyr Glu Phe Leu

195 200 205

Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Ala Leu

210 215 220

Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg

225 230 235 240

Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Ala

245 250 255

Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala

260 265 270

Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala

275 280 285

Gly Val Ile Ala Val Ile Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys

290 295 300

Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly

305 310 315 320

Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

325 330

<210> 74

<211> 313

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP112

<400> 74

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Arg Thr Leu Thr Leu Phe

35 40 45

Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn

50 55 60

Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Pro Asp Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His Ser Ala Ser Pro Gln

85 90 95

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

100 105 110

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

115 120 125

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

130 135 140

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Leu Gly Asp Pro

145 150 155 160

Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr

165 170 175

Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Ser Tyr Glu Phe Leu Trp Gly

180 185 190

Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Ala Leu Ser Arg

195 200 205

Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg

210 215 220

Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Ala Pro Pro

225 230 235 240

Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Tyr Val

245 250 255

Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val

260 265 270

Ile Ala Val Ile Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu

275 280 285

Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val

290 295 300

Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

305 310

<210> 75

<211> 366

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP113

<400> 75

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Arg Thr Leu Thr Leu Phe

35 40 45

Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn

50 55 60

Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Pro Asp Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His Ser Ala Ser Pro Gln

85 90 95

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

100 105 110

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

115 120 125

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

130 135 140

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Leu Gly Asp Pro

145 150 155 160

Lys Lys Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr

165 170 175

Arg Gln Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Ser Tyr Glu Phe Leu Trp Gly

180 185 190

Pro Arg Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Ala Leu Ser Arg

195 200 205

Lys Val Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg

210 215 220

Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Ala Pro Pro

225 230 235 240

Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Tyr Val

245 250 255

Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val

260 265 270

Ile Ala Val Ile Val Val Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

275 280 285

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala

290 295 300

Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Arg Pro Ala Leu Gly

305 310 315 320

Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ser Thr Val His Glu

325 330 335

Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser

340 345 350

Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

355 360 365

<210> 76

<211> 335

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP114

<400> 76

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Arg Thr Leu Thr Leu Phe

35 40 45

Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn

50 55 60

Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Pro Asp Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His Ser Ala Ser Pro Gln

85 90 95

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

100 105 110

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

115 120 125

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

130 135 140

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Pro Thr Leu

145 150 155 160

Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe

165 170 175

Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala Val Lys Lys Gln Phe Glu

180 185 190

Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Pro

195 200 205

Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Tyr

210 215 220

Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Val Ile Ala Val Ile Val Val Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala

245 250 255

His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr

260 265 270

Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Arg Pro Ala Leu

275 280 285

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ser Thr Val His

290 295 300

Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro

305 310 315 320

Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

325 330 335

<210> 77

<211> 303

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP115

<400> 77

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Arg Thr Leu Thr Leu Phe

35 40 45

Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn

50 55 60

Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Pro Asp Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His Ser Ala Ser Pro Gln

85 90 95

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

100 105 110

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

115 120 125

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

130 135 140

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Glu Tyr Lys Leu

145 150 155 160

Val Val Val Gly Ala Val Gly Val Gly Lys Ser Ala Leu Thr Ala Pro

165 170 175

Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Tyr

180 185 190

Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly

195 200 205

Val Ile Ala Val Ile Val Val Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala

210 215 220

His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr

225 230 235 240

Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Arg Pro Ala Leu

245 250 255

Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ser Thr Val His

260 265 270

Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro

275 280 285

Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

290 295 300

<210> 78

<211> 363

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP116

<400> 78

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Arg Thr Leu Thr Leu Phe

35 40 45

Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn

50 55 60

Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Pro Asp Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His Ser Ala Ser Pro Gln

85 90 95

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

100 105 110

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

115 120 125

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

130 135 140

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Pro Thr Leu

145 150 155 160

Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe

165 170 175

Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala Val Lys Lys Gln Phe Glu

180 185 190

Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Pro

195 200 205

Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Tyr

210 215 220

Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly

225 230 235 240

Val Ile Ala Val Ile Val Val Leu Gly Asp Pro Lys Lys Leu Leu Thr

245 250 255

Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Gly

260 265 270

Ser Asp Pro Ala Ser Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Val

275 280 285

Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Ala Leu Ser Arg Lys Val Ala Glu Leu

290 295 300

Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys

305 310 315 320

Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys

325 330 335

Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly

340 345 350

Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

355 360

<210> 79

<211> 285

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP117

<400> 79

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Arg Thr Leu Thr Leu Phe

35 40 45

Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn

50 55 60

Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Pro Asp Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His Ser Ala Ser Pro Gln

85 90 95

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

100 105 110

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

115 120 125

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

130 135 140

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Pro Pro Gln

145 150 155 160

Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Tyr Val Asp

165 170 175

Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile

180 185 190

Ala Val Ile Val Val Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly

195 200 205

Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro

210 215 220

Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Arg Pro Ala Leu Gly Ser

225 230 235 240

Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ser Thr Val His Glu Ile

245 250 255

Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala

260 265 270

Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

275 280 285

<210> 80

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP118

<400> 80

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Arg Thr Leu Thr Leu Phe

35 40 45

Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn

50 55 60

Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Pro Asp Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His Ser Ala Ser Pro Gln

85 90 95

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

100 105 110

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

115 120 125

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

130 135 140

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Pro Pro Gln

145 150 155 160

Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Tyr Val Asp

165 170 175

Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile

180 185 190

Ala Val Ile Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser

195 200 205

Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys

210 215 220

Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

225 230

<210> 81

<211> 261

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP119

<400> 81

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Leu Gly Asp Pro Lys Lys

35 40 45

Leu Leu Thr Gln His Phe Val Gln Glu Asn Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln

50 55 60

Val Pro Gly Ser Asp Pro Ala Ser Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg

65 70 75 80

Ala Leu Val Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Ala Leu Ser Arg Lys Val

85 90 95

Ala Glu Leu Val His Phe Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro

100 105 110

Val Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Val Val Ala Pro Thr Leu Pro

115 120 125

Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys

130 135 140

Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu

145 150 155 160

Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Pro Gly

165 170 175

Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg

180 185 190

Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala

195 200 205

Pro Asp Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val

210 215 220

Thr Ser Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly

225 230 235 240

Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr

245 250 255

Asn Phe Asp Ala Glu

260

<210> 82

<211> 191

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP120

<400> 82

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Arg Thr Leu Thr Leu Phe

35 40 45

Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn

50 55 60

Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Pro Asp Ser Ser Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His Ser Ala Ser Pro Gln

85 90 95

Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu

100 105 110

Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe

115 120 125

Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile

130 135 140

Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ser Thr Val His

145 150 155 160

Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro

165 170 175

Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

180 185 190

<210> 83

<211> 311

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP121

<400> 83

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His

85 90 95

Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

100 105 110

His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

130 135 140

Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ala Gly Ala Thr Val Gly Ile Met Ile Gly Val Leu Val Gly Val

165 170 175

Ala Leu Ile Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr

180 185 190

Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala

195 200 205

His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala

210 215 220

Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe

225 230 235 240

Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu

245 250 255

Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala

260 265 270

Val Ile Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu

275 280 285

Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro

290 295 300

Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

305 310

<210> 84

<211> 294

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP122

<400> 84

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Ser His

85 90 95

Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

100 105 110

His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

130 135 140

Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

165 170 175

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

180 185 190

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro

195 200 205

Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly

210 215 220

Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys

225 230 235 240

Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val

245 250 255

Ile Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu

260 265 270

Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr

275 280 285

Thr Asn Phe Asp Ala Glu

290

<210> 85

<211> 294

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP123

<400> 85

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His

85 90 95

Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

100 105 110

His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

130 135 140

Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser

165 170 175

Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His

180 185 190

Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro

195 200 205

Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly

210 215 220

Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys

225 230 235 240

Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val

245 250 255

Ile Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser Leu Glu

260 265 270

Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr

275 280 285

Thr Asn Phe Asp Ala Glu

290

<210> 86

<211> 344

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP124

<400> 86

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His

85 90 95

Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

100 105 110

His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

130 135 140

Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

165 170 175

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala

180 185 190

Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

195 200 205

Asp Arg Glu Arg Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

210 215 220

Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro

225 230 235 240

Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr

245 250 255

Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala

260 265 270

Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Leu Ile Tyr Tyr Val Asp

275 280 285

Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile

290 295 300

Ala Val Ile Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Cys Lys Leu Ser

305 310 315 320

Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys

325 330 335

Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

340

<210> 87

<211> 344

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP125

<400> 87

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His

85 90 95

Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

100 105 110

His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

130 135 140

Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

165 170 175

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala

180 185 190

Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

195 200 205

Asp Arg Glu Arg Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val

210 215 220

Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro

225 230 235 240

Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr

245 250 255

Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala

260 265 270

Phe Gly Leu Leu Leu Ala Ala Ala Thr Ala Leu Ile Tyr Tyr Val Asp

275 280 285

Glu Lys Ala Pro Glu Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile

290 295 300

Ala Val Ile Val Val Ser Thr Val His Glu Ile Leu Ser Lys Leu Ser

305 310 315 320

Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys

325 330 335

Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

340

<210> 88

<211> 397

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP127

<400> 88

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His

85 90 95

Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

100 105 110

His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

130 135 140

Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

165 170 175

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala

180 185 190

Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

195 200 205

Asp Arg Glu Arg Ala Pro Pro Gln Val Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu

210 215 220

Ala Ala Ala Thr Ala Leu Ile Tyr Tyr Val Asp Glu Lys Ala Pro Glu

225 230 235 240

Phe Ser Met Gln Gly Leu Lys Ala Gly Val Ile Ala Val Ile Val Val

245 250 255

Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu

260 265 270

Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly

275 280 285

Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu

290 295 300

Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg

305 310 315 320

Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala

325 330 335

Pro Arg Gly Pro Ser Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu

340 345 350

Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr Ser Thr Val His Glu Ile

355 360 365

Leu Ser Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala

370 375 380

Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

385 390 395

<210> 89

<211> 353

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP128

<400> 89

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His

85 90 95

Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

100 105 110

His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

130 135 140

Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

165 170 175

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala

180 185 190

Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

195 200 205

Asp Arg Glu Arg Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn

210 215 220

Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val

225 230 235 240

Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg

245 250 255

Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His

260 265 270

Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val

275 280 285

Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Ser Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala

290 295 300

Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr Ser Thr

305 310 315 320

Val His Glu Ile Leu Ser Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr

325 330 335

Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala

340 345 350

Glu

<210> 90

<211> 358

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP129

<400> 90

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His

85 90 95

Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

100 105 110

His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

130 135 140

Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

165 170 175

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala

180 185 190

Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

195 200 205

Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn

210 215 220

Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala

225 230 235 240

Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys

245 250 255

Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg

260 265 270

Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu

275 280 285

Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Ser Glu Gly

290 295 300

Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu

305 310 315 320

Gly Gly Tyr Ser Thr Val His Glu Ile Leu Ser Lys Leu Ser Leu Glu

325 330 335

Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr Gly Ser Val Lys Pro Tyr

340 345 350

Thr Asn Phe Asp Ala Glu

355

<210> 91

<211> 396

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ATP130

<400> 91

Lys Arg Tyr Lys Asn Arg Val Ala Ser Arg Lys Ser Arg Ala Lys Phe

1 5 10 15

Lys Gln Leu Leu Gln His Tyr Arg Glu Val Ala Ala Ala Lys Ser Ser

20 25 30

Glu Asn Asp Arg Leu Arg Leu Leu Leu Lys Asn Arg Thr Leu Thr Leu

35 40 45

Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala Tyr Val Ser Gly Ile Gln

50 55 60

Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro Val Thr Leu Asp Val Leu

65 70 75 80

Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn Leu Asn Leu Ser Cys His

85 90 95

Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile Asn Gly Ile Pro Gln Gln

100 105 110

His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile Thr Pro Asn Asn Asn Gly

115 120 125

Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala Thr Gly Arg Asn Asn Ser

130 135 140

Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser Gly Thr Ser Pro Gly Leu

145 150 155 160

Ser Ala Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp

165 170 175

His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala

180 185 190

Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu

195 200 205

Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys Ile Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn

210 215 220

Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala

225 230 235 240

Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys

245 250 255

Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg

260 265 270

Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu

275 280 285

Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr

290 295 300

Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg

305 310 315 320

Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp

325 330 335

Asp Ser Gly Ser Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu

340 345 350

Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr Ser Thr Val His Glu Ile Leu

355 360 365

Ser Lys Leu Ser Leu Glu Gly Asp His Ser Thr Pro Pro Ser Ala Tyr

370 375 380

Gly Ser Val Lys Pro Tyr Thr Asn Phe Asp Ala Glu

385 390 395

<210> 92

<211> 193

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASCL2

<400> 92

Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val

1 5 10 15

Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu

20 25 30

Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly

35 40 45

Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys

50 55 60

Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly

65 70 75 80

Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val

85 90 95

Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val

100 105 110

Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser

130 135 140

Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser

145 150 155 160

Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu

165 170 175

Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly

180 185 190

Tyr

<210> 93

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASCL2 epitope

<400> 93

Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln

1 5 10

<210> 94

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASCL2 epitope

<400> 94

Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp

1 5 10

<210> 95

<211> 50

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Survivin fragment

<400> 95

Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg

1 5 10 15

Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu Glu Gly Ser Ala Val Lys

20 25 30

Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg

35 40 45

Glu Arg

<210> 96

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CEA fragment

<400> 96

Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala

1 5 10 15

Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro

20 25 30

Val Thr Leu Asp Val Leu Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn

35 40 45

Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile

50 55 60

Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala

85 90 95

Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser

100 105 110

Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala

115 120

<210> 97

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> ASCL2 fragment

<400> 97

Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu

1 5 10 15

Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly

20 25 30

Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu

35 40 45

Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg

50 55 60

Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala

65 70 75 80

Pro Arg Gly Pro Ser Glu Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu

85 90 95

Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr

100 105

<210> 98

<211> 276

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> antigenic cargo of ATP128

<400> 98

Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn Asp Ala Arg Ala

1 5 10 15

Tyr Val Ser Gly Ile Gln Asn Ser Val Ser Ala Asn Arg Ser Asp Pro

20 25 30

Val Thr Leu Asp Val Leu Pro Asp Ser Ser Tyr Leu Ser Gly Ala Asn

35 40 45

Leu Asn Leu Ser Cys His Ser Ala Ser Pro Gln Tyr Ser Trp Arg Ile

50 55 60

Asn Gly Ile Pro Gln Gln His Thr Gln Val Leu Phe Ile Ala Lys Ile

65 70 75 80

Thr Pro Asn Asn Asn Gly Thr Tyr Ala Cys Phe Val Ser Asn Leu Ala

85 90 95

Thr Gly Arg Asn Asn Ser Ile Val Lys Ser Ile Thr Val Ser Ala Ser

100 105 110

Gly Thr Ser Pro Gly Leu Ser Ala Ala Pro Thr Leu Pro Pro Ala Trp

115 120 125

Gln Pro Phe Leu Lys Asp His Arg Ile Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro

130 135 140

Phe Leu Glu Gly Ser Ala Val Lys Lys Gln Phe Glu Glu Leu Thr Leu

145 150 155 160

Gly Glu Phe Leu Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Ala Val Ala Arg Arg

165 170 175

Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln

180 185 190

Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser

195 200 205

Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln

210 215 220

Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly

225 230 235 240

Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser Ala Pro Arg Gly Pro Ser Glu

245 250 255

Gly Ala Leu Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp

260 265 270

Leu Gly Gly Tyr

275

<---

Иллюстрации к изобретению RU 2 807 135 C2

Реферат патента 2023 года СЛИТАЯ КОНСТРУКЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОНИКАЮЩИЙ В КЛЕТКУ ПЕПТИД, ПОЛИЭПИТОП И ПЕПТИДНЫЙ АГОНИСТ TLR, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

Изобретение относится к иммунологии и медицине, в частности к комплексу, предназначенному для применения для предупреждения и/или лечения рака, где комплекс содержит а) проникающий в клетку пептид, б) по меньшей мере три антигенных эпитопа и в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR, в котором компоненты а)-в) ковалентно связаны. В частности, описаны композиции, предназначенные для применения для предупреждения и/или лечения колоректального рака, такие как фармацевтические композиции и вакцины. Предлагаемое изобретение позволяет получить новый комплекс для применения в иммунотерапии колоректального рака, представляющий собой более эффективную вакцину, прежде всего противораковую вакцину, которая обладает улучшенной противоопухолевой активностью, предназначенную для предупреждения и/или лечения колоректального рака. 9 н. и 38 з.п. ф-лы, 76 ил., 46 пр.

Формула изобретения RU 2 807 135 C2

1. Комплекс для лечения колоректального рака, содержащий:

а) проникающий в клетку пептид;

б) по меньшей мере три антигенных эпитопа; и

в) по меньшей мере один пептидный агонист TLR,

в котором компоненты а)-в) ковалентно связаны и в котором по меньшей мере три антигенных эпитопа содержат (I) один или несколько эпитопов сурвивина или функциональный(ые) вариант(ы) его последовательности(ей), (II) один или несколько эпитопов карциноэмбрионального антигена (СЕА) или функциональный(ые) вариант(ы) его последовательности(ей) и (III) один или несколько эпитопов гомолога 2 комплекса Achaete-scute (ASCL2) или функциональный(ые) вариант(ы) его последовательности(ей).

2. Комплекс по п. 1, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент длиной по меньшей мере 10 аминокислот, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

3. Комплекс по п. 2, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 53.

4. Комплекс по п. 2, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

5. Комплекс по п. 1, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент длиной по меньшей мере 10 аминокислот, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

6. Комплекс по п. 5, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 55, и/или пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 56.

7. Комплекс по п. 5, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 96, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

8. Комплекс по п. 1, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее фрагмент длиной по меньшей мере 10 аминокислот, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

9. Комплекс по п. 8, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 93, и/или пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 94.

10. Комплекс по п. 8, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 97, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

11. Комплекс по п. 1, где комплекс содержит в направлении от N-конца к С-концу:

(I) один или несколько эпитопов СЕА или функциональные варианты его последовательности;

(II) один или несколько эпитопов сурвивина или функциональные варианты его последовательности; и

(III) один или несколько эпитопов ASCL2 или функциональные варианты его последовательности.

12. Комплекс по п. 11, где комплекс содержит в направлении от N-конца к С-концу:

(I) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент длиной по меньшей мере 10 аминокислот, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности;

(II) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент длиной по меньшей мере 10 аминокислот, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности; и

(III) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее фрагмент длиной по меньшей мере 10 аминокислот, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

13. Комплекс по п. 12, в котором С-конец (I) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 54, или ее фрагмент, или вариант, непосредственно связан с N-концом (II) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент, или вариант; и С-конец (II) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 52, или ее фрагмент, или вариант, непосредственно связан с N-концом (III) пептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 92, или ее фрагмент, или вариант.

14. Комплекс по п. 1, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 96, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности; пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности; и пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 97, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

15. Комплекс по п. 1 или 14, где комплекс содержит пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 98, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

16. Комплекс по п. 1, где комплекс представляет собой рекомбинантный полипептид или рекомбинантный белок.

17. Комплекс по п. 1, где проникающий в клетку пептид:

(i) имеет длину аминокислотной последовательности указанного пептида всего от 5 до 50 аминокислот, предпочтительно всего от 10 до 45 аминокислот, более предпочтительно всего от 15 до 45 аминокислот; и/или

(ii) имеет аминокислотную последовательность, содержащую фрагмент минимального домена ZEBRA, указанный минимальный домен расположен от остатка 170 до остатка 220 аминокислотной последовательности ZEBRA, соответствующий SEQ ID NO: 3, где необязательно 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот были заменены, удалены и/или добавлены без нарушения проникающей способности указанного пептида или его варианта.

18. Комплекс по п. 17, где пептид, проникающий в клетку, имеет аминокислотную последовательность, содержащую Ser (S) в положении, эквивалентном 189, аминокислотной последовательности ZEBRA согласно SEQ ID NO: 3.

19. Комплекс по п. 17 или 18, где пептид, проникающий в клетку, имеет аминокислотную последовательность, содержащую:

(i) последовательность согласно следующей общей формуле (I):

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁SX₁₃X₁₄X₁₅X₁₆X₁₇

_{с 0, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислотами, которые заменены, удалены и/или добавлены без нарушения проникающей способности указанного пептида в клетку, где}

X₁ представляет собой K, R или Н, предпочтительно X₁ представляет собой K или R;

Х₂ представляет собой R, K или Н, предпочтительно Х₂ представляет собой R или K;

Х₃ представляет собой Y, W или F, предпочтительно Х₃ представляет собой Y, W или F;

Х₄ представляет собой K, R или Н, предпочтительно Х₄ представляет собой K или R;

Х₅ представляет собой N или Q;

X₆ представляет собой R, K или Н, предпочтительно X₆ представляет собой R или K;

Х₇ представляет собой V, I, М, L, F или А, предпочтительно Х₇ представляет собой V, I, М или L;

Х₈ представляет собой А, V, L, I или G, предпочтительно Х₈ представляет собой А или G;

Х₉ представляет собой S или Т;

Х₁₀ представляет собой R, K или Н, предпочтительно Х₁₀ представляет собой R или K;

Х₁₁ представляет собой K, R или Н, предпочтительно Х₁₁ представляет собой K или R;

Х₁₃ представляет собой R, K или Н, предпочтительно Х₁₃ представляет собой R или K;

Х₁₄ представляет собой А, V, L, I или G, предпочтительно Х₁₄ представляет собой А или G;

Х₁₅ представляет собой K, R или Н, предпочтительно Х₁₅ представляет собой K или R;

Х₁₆ представляет собой F, L, V, I, Y, W или М, предпочтительно Х₁₆ представляет собой F, Y или W; и

Х₁₇ представляет собой K, R или Н, предпочтительно Х₁₇ представляет собой K или R.

20. Комплекс по п. 17 или 18, где пептид, проникающий в клетку, имеет аминокислотную последовательность, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из аминокислотных последовательностей, соответствующих SEQ ID NO: 4-13, или вариант этой последовательности без нарушения проникающей способности указанного пептида в клетку, в частности его вариантов последовательностей, по меньшей мере на 70% идентичных последовательности, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичных последовательности и более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичных последовательности, без нарушения способности указанного пептида проникать в клетки.

21. Комплекс по п. 20, где пептид, проникающий в клетку, имеет аминокислотную последовательность, содержащую или состоящую из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 6 (СРР3/Z13), SEQ ID NO: 7 (CPP4/Z14), SEQ ID NO: 8 (CPP5/Z15) или SEQ ID NO: 11 (CPP8/Z18), или вариант этой последовательности без нарушения проникающей способности указанного пептида в клетки, в частности его вариантов последовательностей, по меньшей мере на 70% идентичных последовательности, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичных последовательности и более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичных последовательности, без нарушения способности указанного пептида проникать в клетки.

22. Комплекс по п. 21, где пептид, проникающий в клетку, включает или состоит из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности.

23. Комплекс по п. 1, где по меньшей мере один пептидный агонист TLR является TLR2, TLR4 и/или TLR5, предпочтительно TLR2 пептидным агонистом и/или TLR4 пептидным агонистом.

24. Комплекс по п. 23, где по меньшей мере один пептидный агонист TLR содержит или состоит из аминокислотной последовательности, соответствующей SEQ ID NO: 15 или 71; или вариант этой последовательности, в частности вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичный последовательности и более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичный последовательности, без нарушения способности указанного пептида быть агонистом TLR.

25. Комплекс по п. 24, где по меньшей мере один пептидный агонист TLR включает или состоит из пептида, имеющего аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 71; или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности, предпочтительно по меньшей мере на 80% идентичный последовательности и более предпочтительно по меньшей мере на 90% идентичный последовательности, без нарушения способности указанного пептида быть агонистом TLR.

26. Комплекс по п. 1, содержащий предпочтительно в направлении от N-конца к С-концу следующие компоненты:

(I) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 6, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности;

(II) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 96, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности;

(III) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 95, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности;

(IV) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 97, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности; и

(V) пептид, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 71, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 70% идентичный последовательности,

где компоненты (I)-(V) необязательно сцеплены друг с другом с помощью линкера или спейсера.

27. Комплекс по п. 1 или 26, где указанный комплекс содержит или состоит из полипептида, который имеет аминокислотную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 89, или функциональный вариант этой последовательности, по меньшей мере на 90% идентичный последовательности.

28. Способ получения комплекса по любому из пп. 1-27, предусматривающий культивирование в культуральной среде клетки-хозяина, трансформированной вектором экспрессии, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую указанный комплекс, с последующим выделением комплекса из клетки или культуральной среды и его очисткой, где комплекс представляет собой полипептид или белок.

29. Антигенпрезентирующая клетка, загруженная комплексом по любому из пп. 1-27.

30. Клетка по п. 29, где указанная клетка представляет собой дендритную клетку.

31. Композиция для приготовления фармацевтической композиции или вакцины для лечения колоректального рака, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного из комплекса, как он определен в любом из пп. 1-27.

32. Вакцина для лечения колоректального рака, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного из комплекса, как он определен в любом из пп. 1-27, и вспомогательное вещество для повышения его иммуногенности.

33. Фармацевтическая композиция для лечения колоректального рака, содержащая эффективное количество по меньшей мере одного комплекса, как он определен в любом из пп. 1-27, и фармацевтически приемлемый носитель.

34. Фармацевтическая композиция по п. 33, где указанная композиция содержит эффективное количество по меньшей мере двух различных комплексов.

35. Комбинация для лечения колоректального рака, содержащая эффективное количество:

(i) комплекса по любому из пп. 1-27; и

(ii) химиотерапевтического средства, таргетного лекарственного средства и/или иммунотерапевтического агента, такого как модулятор иммунных контрольных точек.

36. Комбинация по п. 35, в которой (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, вводят примерно в одно и то же время.

37. Комбинация по любому из пп. 35, 36, в которой (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, вводят последовательно.

38. Комбинация по любому из пп. 35-37, в которой (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, вводят с использованием одного и того же пути введения.

39. Комбинация по любому из пп. 35-37, в которой (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, вводят с использованием различных путей введения.

40. Комбинация по любому из пп. 35-39, в которой (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, находятся в различных композициях.

41. Комбинация по любому из пп. 35-38, в которой (I) комплекс и (II) химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек, находятся в одной и той же композиции.

42. Комбинация по любому из пп. 35-41, в которой химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент представляет собой модулятор иммунных контрольных точек.

43. Комбинация по п. 42, в которой модулятор иммунных контрольных точек представляет собой ингибитор PD-1.

44. Набор для лечения колоректального рака, содержащий (1) комплекс, как он определен в любом из пп. 1-27, и (2) инструкцию по применению.

45. Набор по п. 44, где набор дополнительно содержит листовку-вкладыш в упаковке или листок с инструкциями по применению для лечения колоректального рака с использованием комплекса, как он определен в любом из пп. 1-27.

46. Набор по п. 44 или 45, где набор дополнительно содержит химиотерапевтический агент, таргетное лекарственное средство и/или иммунотерапевтический агент, такой как модулятор иммунных контрольных точек.

47. Способ лечения колоректального рака у индивидуума, который нуждается в этом, включающий введение индивидууму комплекса, как он определен в любом из пп. 1-27.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2807135C2

US 20120231030, 13.09.2012
DEROUAZI M
et al., Novel Cell-Penetrating Peptide-Based Vaccine Induces Robust CD4+ and CD8+ T Cell-Mediated Antitumor Immunity, Cancer research, 2015, vol
Фальцовая черепица	0	Белавенец М.И.	SU75A1
Прибор для нагревания перетягиваемых бандажей подвижного состава	1917	Колоницкий Е.А.	SU15A1
Способ и устройство для поворачивания поднимаемого килем вверх затонувшего судна	1925	Видерт Л.К.	SU3020A1
ZHAO M
et al., Intracellular cargo delivery using tat peptide and derivatives, Medicinal research reviews, 2004, vol
Пишущая машина для тюркско-арабского шрифта	1922	Мадьярова А. Туганов Т.	SU24A1
Печь для непрерывного получения сернистого натрия	1921	Настюков А.М. Настюков К.И.	SU1A1

RU 2 807 135 C2

Авторы

Деруази Мадиха

Бельну Элоди

Даты

2023-11-09—Публикация

2017-09-21—Подача

название	год	авторы	номер документа
ПЕПТИДНЫЕ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНТЕРЛЕЙКИНА-31	2019	Баммерт Гэри Фрэнсис Данэм Стивен Алан	RU2786441C2
ПРЕПАРАТ, СОДЕРЖАЩИЙ ФАКТОР VIII И ПЕПТИДЫ ФАКТОРА ФОН ВИЛЛЕБРАНДА	2015	Каннихт Кристоф Солецка Барбара Кола Гвидо Винге Стефан	RU2714154C2
УЛУЧШЕНИЕ ИММУНОГЕННОСТИ ПЕПТИДА L2 ВПЧ	2017	Больчи, Анджело Мюллер, Мартин Оттонелло, Симоне Пуйянфард, Сомайе Спаньоли, Глория	RU2743016C2
КОНСТРУКТЫ Т-КЛЕТОЧНОГО РЕЦЕПТОРА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ	2019	Джунеджа, Викрам Чой, Дзаевон	RU2785954C2
АНТИГЕНЫ И АНТИГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ	2013	Сориани Марко Скарселли Мария Нораис Натали Гомес Мориэль Данило Росси Паккани Силвия	RU2727476C2
ЭКСПРЕССИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ НИТРОГЕНАЗЫ В РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТКАХ	2018	Вуд, Крейг Кристофер Аллен, Роберт Сайлэс Окада, Соко Уорден, Эндрю Чарльз Тилбрук, Кимберли Телма Тейлор, Мэттью Крейг	RU2809244C2
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ПРОТИВОРАКОВАЯ НЕОЭПИТОПНАЯ ВАКЦИНА	2017	Гранум Стайн Стубсруд Элизабет Фредриксен Агнете Брунсвик	RU2782422C2
ТАУ-ПЕПТИДНЫЕ ИММУНОГЕННЫЕ КОНСТРУКЦИИ	2018	Ван, Чан И	RU2798972C2
МОЛЕКУЛЫ, СВЯЗЫВАЮЩИЕ ADAM9, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ	2017	Лу, Дерик, Т. Скрайбнер, Джунипер, А. Барат, Бхасвати Дидрич, Гундо Джонсон, Лесли, С. Бонвини, Эзио	RU2783619C2
ПЕПТИД, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ (ВАРИАНТЫ) И ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО НА ЕГО ОСНОВЕ, СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ДИАБЕТА ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СОПУТСТВУЮЩИХ ОЖИРЕНИЮ, СПОСОБ УМЕНЬШЕНИЯ АППЕТИТА, УМЕНЬШЕНИЯ ПОТРЕБЛЕНИЯ ПИЩИ, УМЕНЬШЕНИЯ ПОТРЕБЛЕНИЯ КАЛОРИЙ, УМЕНЬШЕНИЯ МАССЫ ТЕЛА И УВЕЛИЧЕНИЯ РАСХОДА ЭНЕРГИИ	2007	Блум Стивен Роберт	RU2492183C2

Описание патента на изобретение RU2807135C2

Похожие патенты RU2807135C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 807 135 C2

Реферат патента 2023 года СЛИТАЯ КОНСТРУКЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОНИКАЮЩИЙ В КЛЕТКУ ПЕПТИД, ПОЛИЭПИТОП И ПЕПТИДНЫЙ АГОНИСТ TLR, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА

Формула изобретения RU 2 807 135 C2

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2807135C2

RU 2 807 135 C2