СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ РАЗМНОЖЕНИЯ И ЦИТОТОКСИЧНОСТИ КЛЕТОК, ЯВЛЯЮЩИХСЯ НАТУРАЛЬНЫМИ КИЛЛЕРАМИ Российский патент 2025 года по МПК A61K35/17 A61K38/20 C07K14/54 C12N5/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

[0001] Данная заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №62/881311, поданной 31 июля 2019 г., и предварительной заявке на патент США №62/932342, поданной 7 ноября 2019 г., полное содержание каждой из которых включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0002] Некоторые варианты осуществления способов и композиций, раскрытых в данном документе, относятся к усилению размножения и/или усилению цитотоксичности сконструированных иммунных клеток, таких как клетки, являющиеся натуральными киллерами (NK), и/или Т-клетки.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0003] Применение сконструированных клеток для клеточной иммунотерапии обеспечивает возможность лечения типов рака или других заболеваний с помощью привлечения различных составляющих иммунной системы для нацеливания и уничтожения пораженных заболеванием или поврежденных клеток. Для таких видов терапии требуются сконструированные клетки в количествах, достаточных для терапевтически релевантных доз.

ВКЛЮЧЕНИЕ МАТЕРИАЛА ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ В ВИДЕ ТЕКСТОВОГО ФАЙЛА В ФОРМАТЕ ASCII

[0004] В настоящую заявку посредством ссылки включен перечень последовательностей, содержащийся в нижеследующем текстовом файле в формате ASCII, который подается одновременно с ней. Имя файла: NKT034WO_ST25.txt; создан 20 июля 2020 г., размер 123 Кбайт.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0005] В нескольких вариантах осуществления представлены различные способы усиления размножения иммунных клеток для применения в клеточной иммунотерапии. Например, в нескольких вариантах осуществления представлен способ, в котором иммунные клетки совместно культивируют с линией фидерных клеток в среде, обогащенной одним или более растворимыми цитокинами, при этом цитокины добавляют в среду по меньшей мере один раз в ходе совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления иммунные клетки представляют собой NK-клетки. В нескольких вариантах осуществления размноженные NK-клетки неожиданно становятся поддающимися клеточной инженерии, такой как конструирование клеток для экспрессии химерного рецептора (например, для применения в иммунотерапии рака). В нескольких вариантах осуществления NK-клетки (или другие иммунные клетки), совместно культивируемые со средой, обогащенной растворимым интерлейкином, экспрессируют такие химерные рецепторы надежнее, чем NK-клетки, не подвергнутые совместному культивированию в среде, обогащенной растворимым интерлейкином. Кроме того, в нескольких вариантах осуществления сконструированные NK-клетки проявляют неожиданно усиленную цитотоксичность.

[0006] В нескольких вариантах осуществления представлен способ усиления размножения клеток, являющихся натуральными киллерами, для применения в иммунотерапии, включающий совместное культивирование в культуральной среде популяции клеток, являющихся натуральными киллерами (NK), с популяцией фидерных клеток, обогащение культуральной среды интерлейкином-2 (IL2) и обогащение культуральной среды по меньшей мере одним растворимым стимулирующим средством, выбранным из интерлейкина-12 (IL12), интерлейкина-18 (IL18), интерлейкина-21 (IL21) или их комбинации. В нескольких вариантах осуществления популяция фидерных клеток содержит клетки, сконструированные для экспрессии 4-1BBL и мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15);

[0007] В нескольких вариантах осуществления представлены способы усиления цитотоксичности клеток, являющихся натуральными киллерами (NK), включающие приведение NK-клеток в контакт с нуклеиновой кислотой, кодирующей химерный антигенный рецептор (CAR), чтобы обеспечить экспрессию CAR в NK-клетках, совместное культивирование в культуральной среде популяции NK-клеток с популяцией фидерных клеток, обогащение культуральной среды интерлейкином-2, обогащение культуральной среды по меньшей мере одним растворимым стимулирующим средством, где растворимое стимулирующее средство выбрано из интерлейкина-12, интерлейкина-18, интерлейкина-21 и их комбинаций, где обогащение среды по меньшей мере одним растворимым стимулирующим средством приводит к усилению цитотоксичности у CAR-экспрессирующих NK-клеток по сравнению с NK-клетками, совместно культивируемыми с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства.

[0008] В нескольких вариантах осуществления обогащение среды по меньшей мере одним растворимым стимулирующем средством приводит к усилению размножения NK-клеток по сравнению с совместным культивированием NK-клеток с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства.

[0009] В нескольких вариантах осуществления обогащение среды по меньшей мере одним растворимым стимулирующим средством приводит к усилению размножения NK-клеток по сравнению с совместным культивированием NK-клеток с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства. В нескольких вариантах осуществления усилена одна или более дополнительных характеристик NK-клеток, таких как, например, активность (например, цитотоксичность против клетки или клеток-мишеней), продолжительность жизни (либо в культуре, либо в условиях in vivo), активность (например, усилена активность или продолжительность активности) и т.д. Например, в нескольких вариантах осуществления способы культивирования приводят к усилению одного или более из персистенции и/или цитотоксичности NK-клеток по сравнению с полученными персистенцией и/или цитотоксичностью NK-клеток, совместно культивируемых с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства. В нескольких вариантах осуществления полученные NK-клетки проявляют схожий с клетками памяти фенотип, характеризующийся (i) повышенной экспрессией NKG2C в NK-клетках и/или (ii) сниженной или эквивалентной экспрессией лиганда CD62 в NK-клетках, при этом экспрессия в обоих (i) и (ii) по сравнению с NK-клетками, культивируемыми в тех же условиях, но без одной или более растворимых стимулирующих молекул. Предпочтительно, в нескольких вариантах осуществления после введения субъекту полученные NK-клетки проявляют сниженные признаки цитокиновой отмены по сравнению с NK-клетками, культивируемыми в среде, содержащей по меньшей мере одно растворимое стимулирующее средство, но не содержащей фидерные клетки. В этом состоит отличие от других способов размножения NK-клеток, которые приводят к NK-клеткам, проявляющим зависимость от высоких концентраций применяемых цитокинов. В таких способах NK-клетки проявляют сниженную жизнеспособность при удалении из условий культивирования, как, например, при введении пациенту, что может ограничивать применимость и/или эффективность таких клеток в уничтожении опухолевых клеток.

[0010] В нескольких вариантах осуществления растворимое стимулирующее средство, применяемое для обогащения среды, является комбинацией IL12 и IL18. В нескольких вариантах осуществления, если IL12 и IL18 применяются в комбинации, IL21 не применяется. В нескольких вариантах осуществления IL21 не применяется. В нескольких вариантах осуществления концентрация по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства составляет от 0,01 нг/мл до 50 нг/мл в момент времени в пределах I, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20 или 24 часов от начала совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления концентрация по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства составляет от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл в момент времени в пределах 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20 или 24 часов от начала совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления концентрация по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства составляет от 0,01 нг/мл до 50 нг/мл в момент времени в пределах 120 часов от начала совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает растворимый IL12 в концентрации, составляющей менее чем 10 нг/мл в момент времени в пределах 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20 или 24 часов от начала совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает растворимый IL18 в концентрации, составляющей менее чем 50 нг/мл в момент времени в пределах 24 часов от начала совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления концентрация по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства составляет от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл в момент времени в пределах 120 часов от начала совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает растворимый IL12 в концентрации, составляющей менее чем 10 нг/мл в момент времени в пределах 120 часов от начала совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает растворимый IL18 в концентрации, составляющей менее чем 50 нг/мл в момент времени в пределах 120 часов от начала совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает (i) растворимый IL12 в концентрации от 0,01 нг/мл до 8 нг/мл и (ii) растворимый IL18 в концентрации от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл, и где культуральную среду во второй раз обогащают интерлейкином-2 в концентрации, которая превышает таковую при первом обогащении культуральной среды IL2, где указанные концентрации присутствуют в момент времени в пределах 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 18, 20 или 24 часов от начала совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает (i) растворимый IL12 в концентрации от 0,01 нг/мл до 8 нг/мл и (ii) растворимый IL18 в концентрации от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл, и где культуральную среду во второй раз обогащают IL2 в концентрации, которая превышает концентрацию IL2 в культуральной среде, обогащенной в первый раз, где указанные концентрации присутствуют в момент времени в пределах 120 часов от начала совместного культивирования.

[0011] В нескольких вариантах осуществления популяция фидерных клеток содержит клетки K562. В нескольких вариантах осуществления популяция фидерных клеток не является линией клеток 721.221. В нескольких вариантах осуществления фидерные клетки (например, клетки K562) облучают перед совместным культивированием. В нескольких вариантах осуществления фидерные клетки (например, клетки K562) экспрессируют как 4-1BBL, так и mbIL15. В нескольких вариантах осуществления фидерные клетки (например, клетки K562) экспрессируют как 4-1BBL, так и mbIL15, и их облучают перед началом совместного культивирования.

[0012] Согласно нескольким вариантам осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает (i) растворимый IL12 в концентрации от 0,01 нг/мл до 8 нг/мл и (ii) растворимый IL18 в концентрации от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл. В нескольких вариантах осуществления, в которых применяется IL12, IL12 добавляют в культуральную среду клеток в концентрации, составляющей менее чем 7 нг/мл. В нескольких вариантах осуществления, в которых применяется IL18, IL18 добавляют в культуральную среду клеток в концентрации, составляющей менее чем 40 нг/мл. В нескольких вариантах осуществления при применении нескольких стимулирующих цитокинов концентрация IL12 составляет менее чем 7 нг/мл, концентрация IL18 составляет менее чем 40 нг/мл. В некоторых таких вариантах осуществления IL2 присутствует в начальной концентрации, и позже добавляют дополнительный IL2. В некоторых таких вариантах осуществления начальная концентрация IL2 составляет от 50 МЕ/мл до 500 МЕ/мл. В нескольких вариантах осуществления среду в первый раз обогащают IL2 до концентрации менее чем 500 МЕ/мл. В дополнительных вариантах осуществления среду в первый раз обогащают IL2 до концентрация менее чем 50 МЕ/мл. В нескольких вариантах осуществления начальная концентрация IL2 составляет менее чем 50 МЕ/мл. В нескольких вариантах осуществления позже среду обогащают дополнительным IL2 до концентрации, составляющей менее чем 500 МЕ/мл.

[0013] В нескольких вариантах осуществления концентрация по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства составляет от 0,01 нг/мл до 50 нг/мл в момент времени в пределах 120 часов указанного совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления популяция фидерных клеток содержит клетки, сконструированные для экспрессии 4-1BBL и мембраносвязанного IL-15 (mbIL15). В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно растворимое стимулирующее средство предусматривает комбинацию указанного интерлейкина-12 и указанного интерлейкина-18. В нескольких вариантах осуществления концентрация по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства составляет от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл в момент времени в пределах 120 часов совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает растворимый IL12 в концентрации, составляющей менее чем 10 нг/мл в момент времени в пределах 120 часов совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает растворимый IL18 в концентрации, составляющей менее чем 50 нг/мл в момент времени в пределах 120 часов совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает (i) растворимый IL12 в концентрации от 0,01 нг/мл до 8 нг/мл и (ii) растворимый IL18 в концентрации от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл, и где культуральную среду во второй раз обогащают интерлейкином-2 в концентрации, которая превышает концентрацию IL2 в культуральной среде, обогащенной в первый раз, где каждая концентрация присутствует в момент времени в пределах 120 часов совместного культивирования. В нескольких вариантах осуществления способы, описанные в данном документе, дополнительно включают обогащение среды дополнительным количеством по меньшей мере одного из растворимых стимулирующих средств. В нескольких вариантах осуществления обогащение среды во второй раз выполняют в промежутке от 12 часов до 120 часов от обогащения в первый раз. В дополнительных вариантах осуществления дополнительное обогащение среды выполняют в более поздние моменты времени. В нескольких вариантах осуществления концентрации растворимых средств, например IL12 и/или IL18, являются одинаковыми в первый момент времени, как в соответствующий второй момент времени. В некоторых вариантах осуществления их последующие концентрации отличаются (например, являются большими).

[0014] В нескольких вариантах осуществления представлена популяция сконструированных клеток, являющихся натуральными киллерами, содержащих сконструированный химерный рецептор, выполненный с возможностью связывания маркера на раковой клетке-мишени и, после связывания, индуцирования развития у NK-клетки цитотоксического эффекта против раковой клетки-мишени, где NK-клетка была размножена в культуре в присутствии по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства, где растворимое стимулирующее средство выбрано из интерлейкина-12, интерлейкина-18, интерлейкина-21 и их комбинаций, и где популяция сконструированных NK-клеток по меньшей мере частично обладает схожим с клетками памяти фенотипом, характеризующимся (i) повышенной экспрессией NKG2C в NK-клетках и/или (ii) сниженной или эквивалентной экспрессией лиганда CD62 в NK-клетках, при этом экспрессия в обоих (i) и (ii) по сравнению с NK-клетками, культивируемыми в тех же условиях, но без растворимого стимулирующего средства.

[0015] В нескольких вариантах осуществления сконструированный химерный рецептор кодируется последовательностью, которая на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 86%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности под SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 или 27. В нескольких вариантах осуществления сконструированный химерный рецептор имеет аминокислотную последовательность, которая на по меньшей мере 85%, 90%, 95%, 86%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности под SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 или 28.

[0016] В нескольких вариантах осуществления способы дополнительно включают приведение NK-клеток в контакт с вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR). В некоторых вариантах осуществления CAR выполнен с возможностью нацеливания на один или более из CD19, CD 123, CD70, ВСМА или лиганд рецептора натуральных киллеров группы D (NKG2D). В нескольких вариантах осуществления CAR не включает субдомен DAP 10 или DAP12.

[0017] В нескольких вариантах осуществления NK-клетки, полученные с помощью способов, раскрытых в данном документе, применяют в получении лекарственного препарата для лечения рака. В нескольких вариантах осуществления NK-клетки, полученные с помощью способов, раскрытых в данном документе, предназначены для лечения рака. Также представлены способы лечения рака у субъекта, нуждающегося в этом, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества сконструированных NK-клеток, размноженных с применением любого из способов, раскрытых в данном документе.

[0018] В нескольких вариантах осуществления также представлена культуральная среда для размножения клеток, при этом культуральная среда содержит IL2, обеспеченный в концентрации, составляющей менее чем 500 МЕ/мл; IL12, обеспеченный в концентрации, составляющей менее чем 10 нг/мл; и IL18, обеспеченный в концентрации, составляющей 30 нг/мл.

[0019] В нескольких вариантах осуществления также представлена комбинированная культуральная среда для размножения клеток, при этом комбинация содержит IL2, обеспеченный в концентрации, составляющей менее чем 500 МЕ/мл, IL12, обеспеченный в концентрации, составляющей менее чем 10 нг/мл, IL18, обеспеченный в концентрации, составляющей 30 нг/мл, и IL15, который связан с поверхностью клеточной мембраны (mbIL15). В нескольких вариантах осуществления mbIL15 связан с поверхностью клеточной мембраны фидерной клетки. В нескольких вариантах осуществления культуральная среда и/или комбинированная культуральная среда дополнительно содержат по меньшей мере одну аминокислоту, по меньшей мере одну неорганическую соль и по меньшей мере один витамин.

[0020] В нескольких вариантах осуществления представлен способ усиления размножения клеток, являющихся натуральными киллерами, для применения в иммунотерапии, включающий совместное культивирование в культуральной среде популяции клеток, являющихся натуральными киллерами (NK), с популяцией фидерных клеток, обогащение культуральной среды в первый момент времени по меньшей мере одним растворимым стимулирующим средством, где растворимое стимулирующее средство выбрано из интерлейкина-12, интерлейкина-18, интерлейкина-21 и их комбинаций, и обогащение культуральной среды во второй момент времени дополнительным количеством по меньшей мере одного из растворимых стимулирующих средств. В нескольких вариантах осуществления NK совместно культивируют с фидерными клетками в течение второго периода времени. В нескольких вариантах осуществления обогащение среды по меньшей мере одним растворимым стимулирующим средством приводит к усилению размножения NK-клеток по сравнению с совместным культивированием NK-клеток с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства.

[0021] В нескольких вариантах осуществления концентрация по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства составляет от 0,01 нг/мл до 100 нг/мл. В нескольких вариантах осуществления популяция фидерных клеток содержит клетки, сконструированные для экспрессии одного или более из 4-1BBL и мембраносвязанного IL-15. В нескольких вариантах осуществления способ также подразумевает обогащение культуральной среды интерлейкином-2. В нескольких вариантах осуществления первый и второй момент времени разнесены на от более чем 12 часов до менее чем 120 часов. В нескольких вариантах осуществления концентрации, представленные в данном документе, являются конечными концентрациями рассматриваемых молекулы или средства в культуральной среде. В нескольких вариантах осуществления концентрации, представленные в данном документе, являются концентрациями молекулы или средства при разведении (если допустимо) перед добавлением к заданному объему среды. В некоторых вариантах осуществления концентрация присутствует в момент времени в пределах 12, 24, 72 или 120 часов. В некоторых вариантах осуществления, когда применяют более одного средства, концентрация каждого средства составляет от 0,01 нг/мл до 100 нг/мл или от 1 МЕ/мл до 1000 МЕ/мл (и, например, присутствует в момент времени в пределах 12, 24, 72 или 120 часов). В других вариантах осуществления, когда применяют более одного средства, концентрация всех средств составляет от 0,01 нг/мл до 100 нг/мл или от 1 МЕ/мл до 1000 МЕ/мл (и, например, присутствует в момент времени в пределах 12, 24, 72 или 120 часов).

[0022] В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно растворимое стимулирующее средство предусматривает комбинацию IL12 и IL18. В нескольких вариантах осуществления первый момент времени находится в начале совместного культивирования NK-клеток с фидерной клеткой, или где второй момент времени находится в начале второго периода времени. В нескольких вариантах осуществления первый момент времени и второй момент времени разнесены на от 24 до 120 часов, и концентрация стимулирующего средства составляет от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл

[0023] В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает (i) растворимый IL12 в концентрации от 10 нг/мл до 30 нг/мл и (ii) растворимый IL18 в концентрации от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл. В нескольких вариантах осуществления по меньшей мере одно стимулирующее средство предусматривает (i) растворимый IL12 в концентрации от 0,01 нг/мл до 10 нг/мл и (ii) растворимый IL18 в концентрации от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл. В нескольких вариантах осуществления концентрация каждого из растворимого IL12 и растворимого IL18 является одинаковой в первый момент времени, как и в соответствующий второй момент времени. В нескольких вариантах осуществления концентрация каждого из растворимого IL12 и растворимого IL18 отличается в первый момент времени, как и в соответствующий второй момент времени. В нескольких вариантах осуществления концентрации растворимого IL12 и растворимого IL18 являются эквивалентными друг другу.

[0024] В нескольких вариантах осуществления способ также включает осуществление трансдукции размноженных NK-клеток с помощью конструкции на основе нуклеиновой кислоты, кодирующей химерный рецептор, где экспрессия химерного рецептора усилена по сравнению с экспрессией химерного рецептора на NK-клетках, совместно культивируемых с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства. В нескольких вариантах осуществления цитотоксическая активность химерного рецептора неожиданно усилена по сравнению с цитотоксической активностью химерного рецептора на NK-клетках, совместно культивируемых с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства.

[0025] В данном документе также представлено применение NK-клеток, размноженных с помощью способа, раскрытого в данном документе, для лечения рака и/или для получения лекарственного препарата для лечения рака.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0026] Описания фигур ниже относятся к экспериментам и результатам, которые представляют неограничивающие варианты осуществления настоящего изобретения, раскрытого в данном документе.

[0027] На фиг. 1А и 1В изображен неограничивающий пример протокола размножения, применяемого для усиления размножения NK-клеток согласно вариантам осуществления, раскрытым в данном документе.

[0028] На фиг. 2 изображены данные, сравнивающие кратное размножение NK-клеток с использованием различных методов размножения, включая неограничивающие варианты осуществления методов, раскрытых в данном документе.

[0029] На фиг. 3А-3В изображены данные, относящиеся к размножению NK-клеток, полученных от четырех разных доноров, в различных условиях. На фиг. 3А показаны данные проточной цитометрии, измеряющие экспрессию NKG2D на поверхности NK-клеток при размножении с фидерными клетками отдельно (верхний ряд) или с использованием обогащения цитокином (нижний ряд). На фиг. 3В показано измерение средней интенсивности флуоресценции (представляющей трансдукцию с помощью конструкции химерного рецептора (NKX101), несущей NKG2D) в различных условиях.

[0030] На фиг. 4 показаны данные, относящиеся к цитотоксичности NK-клеток в различные моменты времени после начала размножения в условиях с использованием фидерных клеток отдельно или с обогащением цитокином.

[0031] На фиг. 5А-5В изображены данные, относящиеся к экспрессии определенных маркеров, свойственных фенотипу клеток памяти, у NK-клеток.

[0032] На фиг. 6 показаны полученные в условиях in vivo данные, относящиеся к противоопухолевой активности NK-клеток, размноженных при указанной стимуляции цитокином в ходе размножения или без нее.

[0033] Фиг. 7А-7В относятся к размножению NK-клеток в различных условиях. На фиг. 7А показаны различные концентрации, определенные как сверхнасыщающие, насыщающие или субнасыщающие для IL12/18. На фиг. 7В показаны данные пролиферации NK-клеток в различных условиях культивирования.

[0034] На фиг. 8 показаны данные, относящиеся к высвобождению интерферона-гамма из NK-клеток, культивируемых с варьирующими концентрациями IL12 и/или IL18 в культуральной среде.

[0035] Фиг. 9А-9Н относятся к оценке размножения NK-клеток после семи дней культивирования в указанных условиях. На фиг. 9А показаны обобщенные данные для каждой из групп культивирования. На фиг. 9В представлены статистические сравнения групп. На фиг. 9С показаны данные кратного размножения (в день 7) для набора данных по определенной титрации, включающего различные концентрации IL12 с IL18 из расчета 4 нг/мл. На фиг. 9D показаны аналогичные данные с IL18 из расчета 20 нг/мл. На фиг. 9Е показана жизнеспособность сконструированных NK-клеток в день 7 культивирования с 20 нг/мл IL18, 40 МЕ/мл IL-2 и указанными концентрациями IL12. На фиг. 9F показана жизнеспособность сконструированных NK-клеток в день 8 культивирования с 20 нг/мл IL18, 400 МЕ/мл IL-2 и указанными концентрациями IL12. На фиг. 9G показана жизнеспособность сконструированных NK-клеток в день 7 культивирования с 4 нг/мл IL18, 40 МЕ/мл IL-2 и указанными концентрациями IL12. На фиг. 9Н показана жизнеспособность сконструированных NK-клеток в день 8 культивирования с 4 нг/мл IL18, 400 МЕ/мл IL-2 и указанными концентрациями IL12.

[0036] Фиг. 10А-10В относятся к оценке цитотоксичности NK-клеток. На фиг. 10А показаны обобщенные данные по цитотоксичности NK-клеток в каждой из групп культивирования после 8 дней культивирования. На фиг. 10В представлены статистические сравнения цитотоксичности.

[0037] Фиг. 11А-11В относятся к оценке цитотоксичности NK-клеток. На фиг. 11А показаны обобщенные данные по цитотоксичности NK-клеток в каждой из групп культивирования после 15 дней культивирования. На фиг. 11В представлены статистические сравнения цитотоксичности.

[0038] На фиг. 12 показаны данные экспрессии для NK-клеток, полученных от двух доноров, которые трансдуцировали с помощью конструкции химерного рецептора и культивировали в различных условиях.

[0039] На фиг. 13 показаны данные экспрессии для NK-клеток, полученных от двух дополнительных доноров, которые трансдуцировали с помощью конструкции химерного рецептора и культивировали в различных условиях.

[0040] На фиг. 14А-14В показаны данные цитотоксичности. На фиг. 14А показаны обобщенные данные, относящиеся к цитотоксичности NK-клеток, трансдуцированных с помощью химерного рецептора, нацеливающегося на лиганды NKG2D, и культивируемых в указанных условиях. На фиг. 14В показаны статистические сравнения групп.

[0041] Фиг. 15A-15D относятся к цитотоксическим эффектам NK-клеток, трансдуцированных с помощью химерного рецептора, нацеливающегося на NKG2D, после культивирования в указанных условиях. На фиг. 15А и 15В показаны данные, касающиеся цитотоксичности NK-клеток, полученных от двух разных доноров, через 13 дней после трансдукции с помощью либо вектора, кодирующего GFP, либо вектора, кодирующего химерный рецептор, нацеливающийся на лиганды NKG2D. На фиг. 15С и 15D показаны соответствующие данные цитотоксичности для клеток от тех же двух доноров в день 21 после трансдукции.

[0042] На фиг. 16А-16В показаны данные, относящиеся к фенотипу NK-клеток. На фиг. 16А показаны данные, относящиеся к экспрессии маркеров, ассоциированных со схожим с клетками памяти фенотипом, у NK-клеток с течением времени в указанных условиях культивирования. На фиг. 16В показаны данные проточной цитометрии, показывающие прогрессирование экспрессии маркеров с течением времени в культуре.

[0043] На фиг. 17A-17D показаны обобщенные данные экспрессии, относящиеся к выбранными маркерами у NK-клеток в различных условиях культивирования. На фиг. 17А показаны данные экспрессии, относящиеся к лиганду CD62, на фиг. 17В показана экспрессия NKG2C, на фиг. 17С показана экспрессия CD57 и на фиг. 17D показана экспрессия как CD62L, так и NKG2C.

[0044] На фиг. 18 показаны данные цитотоксичности для NK-клеток, экспрессирующих одно из GFP и/или химерного рецептора, направленного на лиганд NKG2D, в день 21 после трансдукции.

[0045] На фиг. 19 показаны данные жизнеспособности и размножения клеток для NK-клеток, выращенных при варьирующих условиях культивирования.

[0046] На фиг. 20 показаны данные экспрессии (на основании метки Flag) для NK-клеток, трансдуцированных с помощью CD19-связывающего CAR и культивируемых с использованием указанных условий. Эти данные собирали на день 15 размножения.

[0047] На фиг. 21 показаны данные экспрессии (на основании метки Flag) для NK-клеток, трансдуцированных с помощью СВ19-связывающего CAR и культивируемых с использованием указанных условий. Эти данные собирали на день 22 размножения.

[0048] На фиг. 22А-22С показаны данные, относящиеся к цитотоксичности NK-клеток, экспрессирующих СВ19-связывающий CAR. NK-клетки размножали с использованием указанных условий и подвергали испытаниям с клетками Nalm6 с использованием соотношений Е:Т, указанных на фиг. 22А (среднее для 3 доноров). На фиг. 22В показаны обобщенные данные цитотоксичности. На фиг. 22С показаны данные цитотоксичности в зависимости от соотношения эффектора и мишени.

[0049] На фиг. 23 показана схема экспериментальных условий для оценки цитотоксичности NK-клеток, экспрессирующих химерный рецептор, нацеливающийся на лиганды NKG2D, на модели с ксенотрансплантатом гепатоцеллюлярной карциномы.

[0050] На фиг. 24 показаны обобщенные данные по опухолевой нагрузки у мышей при указанных обработках с течением времени.

[0051] На фиг. 25 показана схема экспериментальных условий для оценки влияния условий культивирования при размножении на цитотоксичность NK-клеток в условиях in vivo.

[0052] На фиг. 26A-26F показана цитотоксичность, данные выживания, данные, относящиеся к персистенции NK-клеток, и данные, относящиеся к экспрессии CAR, у свежих или подвергнутых криоконсервации NK-клеток. На фиг. 26А показаны данные, относящиеся к цитотоксичности NK-клеток, размноженных в указанных условиях, против клеток Nalm6 в модели с ксенотрансплантатом. На фиг. 26В показана кривая выживания для мышей, получающих указанные виды обработки. На фиг. 26С показаны данные, относящиеся к обнаружению NK-клеток человека в мышиной крови через 18 дней после инъекции, разделенные на основании условий культивирования при размножении. На фиг. 26D показаны данные, относящиеся к обнаружению CAR-положительных NK-клеток в мышиной крови через 18 дней после инъекции, разделенные на основании условий культивирования при размножении. На фиг. 26Е показаны данные экспрессии, относящиеся к процентной доле NK-клеток (либо свежих, либо подвергнутых криоконсервации), экспрессирующих неограничивающий вариант осуществления CD19-связывающего CAR, в день 15 размножения и в присутствии или в отсутствие дополнительных стимулирующих молекул. На фиг. 26F показаны данные экспрессии, относящиеся к процентной доле NK-клеток (либо свежих, либо подвергнутых криоконсервации), экспрессирующих неограничивающий вариант осуществления CD19-связывающего CAR, в день 22 размножения и в присутствии или в отсутствие дополнительных стимулирующих молекул.

[0053] Фиг. 27А-27С относятся к эффективности различных CD19-направленных CAR согласно вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, в условиях in vivo. На фиг. 27А показано схематическое изображение экспериментального протокола для оценки эффективности гуманизированных NK-клеток, экспрессирующих различные конструкции CD19-направленных CAR, в условиях in vivo. Указаны различные протестированные экспериментальные группы. В случае клеток с обозначением «IL12/ IL18», клетки размножали в присутствии растворимого IL12 и/или IL18 согласно вариантам осуществления, раскрытым в данном документе. На фиг. 27В и 27С показаны данные биолюминесценции от животных, которым вводили дозу опухолевых клеток Nalm6 и обрабатывали указанной конструкцией.

[0054] На фиг. 28A-28J показаны графические изображения данных биолюминесценции, представленных на фигурах 27В-27С. На фиг. 28А показана биолюминесценция (в виде потока фотонов в секунду) от животных, получавших нетрансдуцированные NK-клетки. На фиг. 28В показан поток, измеренный у животных, получавших PBS в качестве среды-носителя. На фиг. 28С показан поток, измеренный у животных, получавших предварительно замороженные NK-клетки, экспрессирующие NK19 NF2 CAR (в качестве неограничивающего примера CAR). На фиг. 28D показан поток, измеренный у животных, получавших предварительно замороженные NK-клетки, экспрессирующие NK19 NF2 CAR (в качестве неограничивающего примера CAR), размноженные с применением IL12 и/или IL18. На фиг. 28Е и на фиг. 28F показан поток, измеренный у животных, получавших свежие NK-клетки, экспрессирующие NK19 NF2 CAR (в качестве неограничивающего примера CAR). На фиг. 28G и на фиг. 28Н показан поток, измеренный у животных, получавших свежие NK-клетки, экспрессирующие NK19 NF2 CAR (в качестве неограничивающего примера CAR), размноженные с применением IL12 и/или IL18. На фиг. 28I показан линейный график, изображающий биолюминесценцию, измеренную у различных групп на протяжении первых 30 дней после инокуляции опухоли. На фиг. 28J показан линейный график, изображающий биолюминесценцию, измеренную у различных групп на протяжении первых 56 дней после инокуляции опухоли.

[0055] На фиг. 29 показаны данные, относящиеся к массе тела мышей с течением времени при получении указанной терапии.

[0056] На фиг. 30А-30С показаны данные, относящиеся к данным, характеризующим NK-клетки, сконструированные для экспрессии CAR (раскрытых в данном документе) и размноженные в присутствии или в отсутствие одного или более стимулирующих цитокинов. На фиг. 30А показаны данные, относящиеся к процентной доле NK-клеток, экспрессирующих CAR, в крови животных с течением времени. На фиг. 30В показаны данные, относящиеся к процентной доле NK-клеток, экспрессирующих CAR, в крови животных на протяжении периода, составляющего 50 дней. На фиг. 30С показаны данные, относящиеся к процентной доле NK-клеток, экспрессирующих CAR, с течением времени и на основании количества протестированных живых клеток.

[0057] На фиг. 31А-31С показаны данные, полученные для трех различных мышей (31А, 31В и 31С соответственно), относящиеся к экспрессии CD19-связывающего CAR и определению того, какие клетки экспрессируют CAR.

[0058] На фиг. 32А-32С показаны данные, полученные для трех различных мышей (32А, 32В и 32С соответственно), относящиеся к экспрессии CD19-связывающего CAR и определению того, какие клетки экспрессируют CAR.

[0059]На фиг. 33А-33С показаны обобщенные данные экспрессии, полученные для образцов крови, собранных через 4 дня после введения в условиях in vivo (протокол на фиг. 27А). На фиг. 33А показана процентная доля CD3-CD56⁺ NK-клеток, полученных из образцов цельной крови, для указанных экспериментальных групп. На фи. 33В показана процентная доля NK-клеток, экспрессирующих специфический CD19-связывающий CAR, для каждой экспериментальной группы. На фиг. 33С показаны данные, относящиеся к количеству обнаруженных GFP-положительных раковых клеток для каждой экспериментальной группы.

[0060] На фиг. 34А-34С показаны обобщенные данные экспрессии, полученные для образцов крови, собранных через 12 дней после введения в условиях in vivo (протокол на фиг. 27А). На фиг. 34А показана процентная доля CD3-CD56⁺ NK-клеток, полученных из образцов цельной крови, для указанных экспериментальных групп.На фиг. 34В показана процентная доля NK-клеток, экспрессирующих специфический CD19-связывающий CAR, для каждой экспериментальной группы. На фиг. 34С показаны данные, относящиеся к количеству обнаруженных GFP-положительных раковых клеток для каждой экспериментальной группы.

[0061] На фиг. 35А-35Е показаны обобщенные данные экспрессии, полученные для образцов крови, собранных через 18 дней после введения в условиях in vivo (протокол на фиг. 27А). На фиг. 35А показана процентная доля CD3-CD56⁺ NK-клеток, полученных из образцов цельной крови, для указанных экспериментальных групп. На фиг. 35В показана процентная доля CD19-положительных опухолевых клеток для каждой экспериментальной группы, как измерено с использованием антитела, конъюгированного с фикоэритрином (РЕ). На фиг. 35С показаны данные, относящиеся к количеству обнаруженных GFP-положительных раковых клеток для каждой экспериментальной группы. На фиг. 35D показана процентная доля NK-клеток, экспрессирующих специфический CD19-связывающий CAR, для каждой экспериментальной группы, как измерено с использованием антитела к CD19-FC. На фиг. 35Е показана процентная доля NK-клеток, экспрессирующих CD19-связывающий CAR, в каждой группе обработки.

[0062] На фиг. 36 показаны данные, собранные на протяжении 4 недель, относящиеся к периоду полужизни NK-клеток, экспрессирующих CD19-связывающий CAR, для каждой из двух доз NK-клеток, как измерено по числу NK-клеток на 10000 лейкоцитов. Две дозы представляли собой (i) 2 миллиона NK-клеток, экспрессирующих СВ19-связывающий CAR, и (ii) 5 миллионов NK-клеток, экспрессирующих CD19-связывающий CAR. Эти данные собирали после введения третей дозы NK-клеток.

[0063] На фиг. 37 показаны данные, собранные для определения периода полужизни подвергнутых криоконсервации NK-клеток, сконструированных для экспрессии CAR, нацеливающегося на лиганды NKG2D, и размноженных без применения дополнительного стимулирующего цитокина.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[0064] В то время как иммунотерапия рака или клеточная терапия других заболеваний весьма продвинулась с точки зрения возможности конструирования клеток для экспрессии представляющих интерес структур, все еще существует потребность в клинически релевантном количестве таких клеток для введения пациенту. Это особенно важно, когда подразумеваемая нативная иммунная клетка, подлежащая конструированию и последующему введению, является менее распространенной, чем другие типы иммунных клеток. Для этого требуется либо начинать с большим количеством исходного материала, что может быть непрактичным, либо разрабатывать более эффективные способы и композиции для размножения (в некоторых случаях предпочтительного) представляющей интерес иммунной клетки, такой как NK-клетка. Следовательно, в нескольких вариантах осуществления в данном документе представлены способы и композиции, которые преимущественно обеспечивают возможность усиления размножения NK-клеток (или других иммунных клеток), но также обеспечивают возможность усиления цитотоксичности таких клеток.

[0065] В нескольких вариантах осуществления представлены популяции размноженных и активированных NK-клеток, полученных за счет совместного культивирования модифицированной «фидерной» клетки, раскрытой в данном документе, с исходной популяцией иммунных клеток и обогащения совместной культуры различными цитокинами в определенные моменты времени в ходе размножения.

Клетки для применения в размножении иммунных клеток

[0066] В нескольких вариантах осуществления в совместной культуре с популяцией иммунных клеток, которые подлежат размножению, применяют линии клеток. Такие линии клеток обозначены в данном документе как «стимулирующие клетки», которые также могут быть обозначены как «фидерные клетки». В нескольких вариантах осуществления подлежит размножению вся популяция иммунных клеток, в то время как в нескольких вариантах осуществления подлежит размножению выбранная субпопуляция иммунных клеток. Например, в нескольких вариантах осуществления размножают NK-клетки относительно других субпопуляций иммунных клеток (таких как Т-клетки). В других варианты осуществления размножают как NK-клетки, так и Т-клетки. В нескольких вариантах осуществления фидерные клетки сами по себе являются генетически модифицированными. В некоторых вариантах осуществления фидерные клетки не экспрессируют молекулы МНС I, которые оказывают ингибиторный эффект на NK-клетки. В некоторых вариантах осуществления у фидерных клеток не обязательно полностью отсутствует экспрессия молекулы МНС I, при этом они могут экспрессировать молекулы МНС I на более низком уровне, чем клетка дикого типа. Например, в нескольких вариантах осуществления, если клетка дикого типа экспрессирует молекулу МНС на уровне X, применяемые линии клеток могут экспрессировать молекулу МНС на уровне менее чем 95% от X, менее чем 90% от X, менее чем 85% от X, менее чем 80% от X, менее чем 70% от X, менее чем 50% от X, менее чем 25% от X и на любом уровне экспрессии между (и включая) вышеперечисленные. В нескольких вариантах осуществления стимулирующие клетки являются иммортализованными, например, линией раковых клеток. Однако в нескольких вариантах осуществления стимулирующие клетки являются первичными клетками.

[0067] В зависимости от варианта осуществления в качестве фидерных клеток могут применяться различные типы клеток. Они включают без ограничения клетки K562, определенные линии клеток опухоли Вильмса (например, линию клеток опухоли Вильмса HFWT), клетки опухоли эндометрия (например, HHUA), клетки меланомы (например, HMV-II), клетки гепатобластомы (например, HuH-6), клетки мелкоклеточной карциномы легкого (например, Lu-130 и Lu-134-A), клетки нейробластомы (например, NB19 и NB69), клетки эмбриональной карциномы яичка (например, NEC14), клетки карциномы шейки матки (ТСО-2), клетки нейробластомы (например, TNB1), линию В-клеток, трансформированных EBV, 721.221, среди прочего.

[0068] В дополнительных вариантах осуществления фидерным клеткам также свойственна сниженная (или отсутствующая) экспрессия молекул МНС II, а также сниженная (или отсутствующая) экспрессия молекул МНС I. В некоторых вариантах осуществления могут применяться другие линии клеток, которые изначально могут экспрессировать молекулы МНС класса I, в сочетании с генетической модификацией таких клеток для снижения или нокаута экспрессии молекул МНС I. Генетическая модификация может быть выполнена с помощью применения методик редактирования генов (например, системы crispr/cas; редактирования РНК с помощью аденозиндезаминаз, действующих на РНК (ADAR), с помощью доменов «цинковые пальцы», TALEN и т.д.), ингибиторной РНК (например, siRNA) или других молекулярных способов для нарушения и/или снижения экспрессии молекул МНС I на поверхности клеток.

[0069] Как более подробно рассматривается ниже, в нескольких вариантах осуществления фидерные клетки сконструированы для экспрессии определенных стимулирующих молекул (например, интерлейкинов, CD3, 4-1BBL и т.д.) для содействия размножению и активации иммунных клеток. Сконструированные фидерные клетки раскрыты, например, в международной заявке на патент PCT/SG 2018/050138, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте. В нескольких вариантах осуществления стимулирующие молекулы, такие как интерлейкин-12, 18 и/или 21, добавляют в среду для совместного культивирования по отдельности, например, в определенные моменты времени и в конкретных количествах, для осуществления усиления размножения требуемой(-ых) субпопуляции(-ий) иммунных клеток.

Стимулирующие молекулы

[0070] Как кратко рассматривалось выше, определенные молекулы содействуют размножению иммунных клеток, таких как NK-клетки или Т-клетки, включая сконструированные NK- или Т-клетки. В зависимости от варианта осуществления стимулирующая молекула или молекулы могут быть экспрессированы на поверхности фидерных клеток, применяемых для размножения популяции иммунных клеток. Например, в нескольких вариантах осуществления популяция фидерных клеток K562 сконструирована для экспрессии 4-1BBL и/или мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15). Дополнительные варианты осуществления относятся к дополнительным мембраносвязанным интерлейкинам или стимулирующим средствам. Примеры таких дополнительных мембраносвязанных стимулирующих молекул можно найти в международной заявке на патент PCT/SG 2018/050138, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0071] В нескольких вариантах осуществления способы, раскрытые в данном документе, относятся к добавлению одной или более стимулирующих молекул в культуральную среду, в которой совместно культивируют сконструированные фидерные клетки и сконструированные NK-клетки. В нескольких вариантах осуществления добавляют один или более интерлейкинов. Например, в нескольких вариантах осуществления в среду добавляют IL2. В нескольких вариантах осуществления в среду добавляют IL12. В нескольких вариантах осуществления в среду добавляют IL18. В нескольких вариантах осуществления в среду добавляют IL21. В нескольких вариантах осуществления в среду добавляют комбинации двух или более из IL2, IL12, IL18 и/или IL21. В некоторых вариантах осуществления вместо применения фидерной клетки с mbIL15 в среду добавляют растворимый IL15 (отдельно или в комбинации с любым из IL2, IL12, IL18 и IL21).

[0072] В нескольких вариантах осуществления среда содержит один или более витаминов, неорганических солей и/или аминокислот. В нескольких вариантах осуществления среда содержит 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или все из глицина, L-аргинина, L-аспарагина, L-аспарагиновой кислоты, L-цистеина (например, L-цистеина 2HCl), L-глутаминовой кислоты, L-глутамина, L-гистидина, L-гидроксипролина, L-изолейцина, L-лейцина, гидрохлорида L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-пролина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина (например, дигидрата динатриевой соли L-тирозина) и L-валина. В нескольких вариантах осуществления среда содержит 1, 2, 3, 4 или более из биотина, хлорида холина, D-патонтената кальция, фолиевой кислоты, i-инозитола, ниацинамида, парааминобензойной кислоты, гидрохлорида пиридоксина, рибофлавина, гидрохлорида тиамина и витамина В12. В нескольких вариантах осуществления среда содержит 1, 2, 3, 4 или более из нитрата кальция (Ca(NO₃)₂ 4H₂O), сульфата магния (MgSO₄) (например, сульфата магния (MgSO₄) (безвод.)), хлорида калия (KCl), бикарбоната натрия (NaHCO₃), хлорида натрия (NaCl) и двухосновного фосфата натрия (Na₂HPO₄) (например, двухосновного фосфата натрия (Na₂HPO₄) безводного).

[0073] В нескольких вариантах осуществления среда дополнительно содержит D-глюкозу и/или глутатион (необязательно восстановленный глутатион). В нескольких вариантах осуществления среда дополнительно содержит сыворотку крови (например, фетальную бычью сыворотку) в количестве, находящемся в диапазоне от приблизительно 1% до приблизительно 20%. В нескольких вариантах осуществления сыворотка является термоинактивированной. В нескольких вариантах осуществления среда не содержит сыворотку крови. В нескольких вариантах осуществления среда не содержит чужеродных элементов.

[0074] В зависимости от варианта осуществления IL2 применяют для обогащения культуральной среды и усиления размножения или других характеристик NK-клеток. В нескольких вариантах осуществления концентрация применяемого IL2 находится в диапазоне от приблизительно 1 МЕ/мл до приблизительно 1000 МЕ/мл, включая, например, от приблизительно 1 МЕ/мл до приблизительно 5 МЕ/мл (например, 1, 2, 3, 4 и 5), от приблизительно 5 МЕ/мл до приблизительно 10 МЕ/мл (например, 5, 6, 7, 8, 9 и 10), от приблизительно 10 МЕ/мл до приблизительно 20 МЕ/мл (например, приблизительно 10, 12, 14, 16, 18 и 20), от приблизительно 20 МЕ/мл до приблизительно 30 МЕ/мл (например, приблизительно 20, 22, 24, 26, 28 и 30), от приблизительно 30 МЕ/мл до приблизительно 40 МЕ/мл (например, 30, 32, 34, 36, 38 и 40), от приблизительно 40 до приблизительно 50 МЕ/мл (например, 40, 42, 44, 46, 48, 50), от приблизительно 50 МЕ/мл до приблизительно 75 МЕ/мл (например, 50, 55, 60, 65, 70 и 75), от приблизительно 75 МЕ/мл до приблизительно 100 МЕ/мл (например, 75, 80, 85, 90, 95 и 100), от приблизительно 100 МЕ/мл до приблизительно 200 МЕ/мл (например, 100, 125, 150, 175 и 200), от приблизительно 200 МЕ/мл до приблизительно 300 МЕ/мл (например, 200, 225, 250, 275 и 300), от приблизительно 300 МЕ/мл до приблизительно 400 МЕ/мл (например, 300, 325, 350, 375 и 400), от приблизительно 400 МЕ/мл до приблизительно 500 МЕ/мл (например, 400, 425, 450, 475 и 500), от приблизительно 500 МЕ/мл до приблизительно 750 МЕ/мл (например, 500, 550, 600, 650, 700 и 750) или от приблизительно 750 МЕ/мл до приблизительно 1000 МЕ/мл (например, 750, 800, 850, 900, 950 и 1000) и любые концентрации между ними, включая граничные точки. В нескольких вариантах осуществления IL2 может быть добавлен в несколько моментов времени в ходе культивирования. В некоторых таких варианты осуществления концентрация применяемого IL2 в выбранные моменты времени отличается.

[0075] В зависимости от варианта осуществления IL12A и/или IL12B применяют для обогащения культуральной среды и усиления размножения или других характеристик NK-клеток. В нескольких вариантах осуществления концентрация применяемого IL12 (либо IL12A, либо IL12B) находится в диапазоне от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, включая, например, от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 0,05 нг/мл (например, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 и 0,05), от приблизительно 0,05 нг/мл до приблизительно 0,1 нг/мл (например, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 и 0,1), от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 0,5 нг/мл (например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5), от приблизительно 0,5 нг/мл до приблизительно 1,0 нг/мл (например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 и 1,0), от приблизительно 1,0 нг/мл до приблизительно 2,0 нг/мл (например, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 и 2,0), от приблизительно 2,0 нг/мл до приблизительно 5,0 нг/мл (например, 2,0, 3,0, 4,0 и 5,0), от приблизительно 5,0 нг/мл до приблизительно 10,0 нг/мл (например, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 и 10,0), от приблизительно 10,0 нг/мл до приблизительно 15,0 нг/мл (например, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0 и 15,0), от приблизительно 15,0 нг/мл до приблизительно 20,0 нг/мл (например, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0 и 20,0), от приблизительно 20,0 нг/мл до приблизительно 25,0 нг/мл (например, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0 и 25,0), от приблизительно 25,0 нг/мл до приблизительно 30,0 нг/мл (например, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0 и 30,0), от приблизительно 30,0 нг/мл до приблизительно 50,0 нг/мл (например, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0 и 50,0), от приблизительно 50,0 нг/мл до приблизительно 75,0 нг/мл (например, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0 и 75,0), от приблизительно 75,0 нг/мл до приблизительно 100,0 нг/мл (например, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 и 100,0) и любые концентрации между ними, включая граничные точки. В нескольких вариантах осуществления концентрация IL12 составляет от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 8 нг/мл, включая любые концентрации между ними, включая граничные точки.

[0076] В некоторых вариантах осуществления применяют смесь IL12A и IL12B. В нескольких вариантах осуществления применяют конкретное соотношение IL12A:IL12B, например, 1:10, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250:, 1:500, 1:1000, 1:10000, 10000:1, 1000:1, 500:1, 250:1, 150:1, 100:1, 10:1 и любое соотношение между ними, включая граничные точки.

[0077] В некоторых вариантах осуществления интерлейкин-18 (IL18) применяют для усиления размножения или других характеристик NK-клеток. В нескольких вариантах осуществления концентрация применяемого IL18 находится в диапазоне от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, включая, например, от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 0,05 нг/мл (например, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 и 0,05), от приблизительно 0,05 нг/мл до приблизительно 0,1 нг/мл (например, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 и 0,1), от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 0,5 нг/мл (например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5), от приблизительно 0,5 нг/мл до приблизительно 1,0 нг/мл (например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 и 1,0), от приблизительно 1,0 нг/мл до приблизительно 2,0 нг/мл (например, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 и 2,0), от приблизительно 2,0 нг/мл до приблизительно 5,0 нг/мл (например, 2,0, 3,0, 4,0 и 5,0), от приблизительно 5,0 нг/мл до приблизительно 10,0 нг/мл (например, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 и 10,0), от приблизительно 10,0 нг/мл до приблизительно 15,0 нг/мл (например, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0 и 15,0), от приблизительно 15,0 нг/мл до приблизительно 20,0 нг/мл (например, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0 и 20,0), от приблизительно 20,0 нг/мл до приблизительно 25,0 нг/мл (например, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0 и 25,0), от приблизительно 25,0 нг/мл до приблизительно 30,0 нг/мл (например, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0 и 30,0), от приблизительно 30,0 нг/мл до приблизительно 50,0 нг/мл (например, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0 и 50,0), от приблизительно 50,0 нг/мл до приблизительно 75,0 нг/мл (например, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0 и 75,0), от приблизительно 75,0 нг/мл до приблизительно 100,0 нг/мл (например, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 и 100,0) и любые концентрации между ними, включая граничные точки.

[0078] В некоторых вариантах осуществления интерлейкин-21 (IL21) применяют для усиления размножения или других характеристик NK-клеток. В нескольких вариантах осуществления концентрация применяемого IL21 находится в диапазоне от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, включая, например, от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 0,05 нг/мл (например, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 и 0,05), от приблизительно 0,05 нг/мл до приблизительно 0,1 нг/мл (например, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 и 0,1), от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 0,5 нг/мл (например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5), от приблизительно 0,5 нг/мл до приблизительно 1,0 нг/мл (например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 и 1,0), от приблизительно 1,0 нг/мл до приблизительно 2,0 нг/мл (например, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 и 2,0), от приблизительно 2,0 нг/мл до приблизительно 5,0 нг/мл (например, 2,0, 3,0, 4,0 и 5,0), от приблизительно 5,0 нг/мл до приблизительно 10,0 нг/мл (например, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 и 10,0), от приблизительно 10,0 нг/мл до приблизительно 15,0 нг/мл (например, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0 и 15,0), от приблизительно 15,0 нг/мл до приблизительно 20,0 нг/мл (например, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0 и 20,0), от приблизительно 20,0 нг/мл до приблизительно 25,0 нг/мл (например, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0 и 25,0), от приблизительно 25,0 нг/мл до приблизительно 30,0 нг/мл (например, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0 и 30,0), от приблизительно 30,0 нг/мл до приблизительно 50,0 нг/мл (например, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0 и 50,0), от приблизительно 50,0 нг/мл до приблизительно 75,0 нг/мл (например, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0 и 75,0), от приблизительно 75,0 нг/мл до приблизительно 100,0 нг/мл (например, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 и 100,0) и любые концентрации между ними, включая граничные точки.

[0079] В некоторых вариантах осуществления интерлейкин-15 (IL15) применяют в растворимом формате (либо вместо, либо в дополнение к mbIL15 на фидерных клетками) для усиления размножения или других характеристик NK-клеток. В нескольких вариантах осуществления концентрация применяемого IL15 находится в диапазоне от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, включая, например, от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 0,05 нг/мл (например, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 и 0,05), от приблизительно 0,05 нг/мл до приблизительно 0,1 нг/мл (например, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 и 0,1), от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 0,5 нг/мл (например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5), от приблизительно 0,5 нг/мл до приблизительно 1,0 нг/мл (например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 и 1,0), от приблизительно 1,0 нг/мл до приблизительно 2,0 нг/мл (например, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 и 2,0), от приблизительно 2,0 нг/мл до приблизительно 5,0 нг/мл (например, 2,0, 3,0, 4,0 и 5,0), от приблизительно 5,0 нг/мл до приблизительно 10,0 нг/мл (например, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 и 10,0), от приблизительно 10,0 нг/мл до приблизительно 15,0 нг/мл (например, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0 и 15,0), от приблизительно 15,0 нг/мл до приблизительно 20,0 нг/мл (например, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0 и 20,0), от приблизительно 20,0 нг/мл до приблизительно 25,0 нг/мл (например, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0 и 25,0), от приблизительно 25,0 нг/мл до приблизительно 30,0 нг/мл (например, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0 и 30,0), от приблизительно 30,0 нг/мл до приблизительно 50,0 нг/мл (например, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0 и 50,0), от приблизительно 50,0 нг/мл до приблизительно 75,0 нг/мл (например, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0 и 75,0), от приблизительно 75,0 нг/мл до приблизительно 100,0 нг/мл (например, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 и 100,0) и любые концентрации между ними, включая граничные точки.

[0080] В некоторых вариантах осуществления интерлейкин-22 (IL22) применяют для облегчения размножения NK-клеток. В нескольких вариантах осуществления концентрация применяемого IL22 находится в диапазоне от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 100 нг/мл, включая, например, от приблизительно 0,01 нг/мл до приблизительно 0,05 нг/мл (например, 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 и 0,05), от приблизительно 0,05 нг/мл до приблизительно 0,1 нг/мл (например, 0,05, 0,06, 0,07, 0,08, 0,09 и 0,1), от приблизительно 0,1 нг/мл до приблизительно 0,5 нг/мл (например, 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 и 0,5), от приблизительно 0,5 нг/мл до приблизительно 1,0 нг/мл (например, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 и 1,0), от приблизительно 1,0 нг/мл до приблизительно 2,0 нг/мл (например, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9 и 2,0), от приблизительно 2,0 нг/мл до приблизительно 5,0 нг/мл (например, 2,0, 3,0, 4,0 и 5,0), от приблизительно 5,0 нг/мл до приблизительно 10,0 нг/мл (например, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 и 10,0), от приблизительно 10,0 нг/мл до приблизительно 15,0 нг/мл (например, 10,0, 11,0, 12,0, 13,0, 14,0 и 15,0), от приблизительно 15,0 нг/мл до приблизительно 20,0 нг/мл (например, 15,0, 16,0, 17,0, 18,0, 19,0 и 20,0), от приблизительно 20,0 нг/мл до приблизительно 25,0 нг/мл (например, 20,0, 21,0, 22,0, 23,0, 24,0 и 25,0), от приблизительно 25,0 нг/мл до приблизительно 30,0 нг/мл (например, 25,0, 26,0, 27,0, 28,0, 29,0 и 30,0), от приблизительно 30,0 нг/мл до приблизительно 50,0 нг/мл (например, 30,0, 35,0, 40,0, 45,0 и 50,0), от приблизительно 50,0 нг/мл до приблизительно 75,0 нг/мл (например, 50,0, 55,0, 60,0, 65,0, 70,0 и 75,0), от приблизительно 75,0 нг/мл до приблизительно 100,0 нг/мл (например, 75,0, 80,0, 85,0, 90,0, 95,0 и 100,0) и любые концентрации между ними, включая граничные точки.

[0081] Если применяют два стимулирующих средства, относительное соотношение между двумя средствами может находиться в диапазоне, включающем соотношения 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:150, 1:200, 1:250, 1:500, 1:750, 1:1000, 1:10000, 1:50000, 1:100000, 100000:1, 50000:1, 10000:1, 1000:1, 750:1, 500:1, 250:1, 200:1, 150:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1 любое соотношение между перечисленными, включая граничные точки. Аналогично, если применяют три или более средств, в качестве соотношения между такими дополнительными средствами и другими средствами может использоваться любое из вышеуказанных соотношений.

[0082] Как более подробно рассматривается ниже, в зависимости от варианта осуществления стимулирующие молекулы можно добавлять в определенный момент (или моменты) в ходе процесса размножения или можно добавлять таким образом, что они присутствуют в качестве компонента культуральной среды на протяжении процесса совместного культивирования.

Способы совместного культивирования и размножения иммунных клеток

[0083] В некоторых вариантах осуществления NK-клетки, выделенные из образца периферической крови донора, совместно культивируют с клетками K562, модифицированными для экспрессии 4-1BBL и mbIL15. В то время как другие подходы предусматривают экспрессию других мембраносвязанных цитокинов, получение фидерной клетки с нескольким стимулирующими молекулами может быть тяжелым в осуществлении (например, обеспечение требуемых уровней экспрессии различных стимулирующих молекул, экспрессия в нужный момент времени в ходе размножения и т.д.). В связи с этим, несколько вариантов осуществления, раскрытых в данном документе, относятся к обогащению культуральной среды конкретными концентрациями различных стимулирующих средств в конкретные моменты времени. В нескольких вариантах осуществления фидерные клетки высевают в сосуды для культивирования и оставляют до достижения практически конфлюэнтного слоя. Затем к культуре можно добавлять иммунные клетки в требуемой концентрации, которая, в нескольких вариантах осуществления, находится в диапазоне от приблизительно 0,5×10⁶ клеток/см² до приблизительно 5×10⁶ клеток/см², включая любую плотность между вышеперечисленными, включая граничные точки.

[0084] В нескольких вариантах осуществления иммунные клетки выделяют из образца периферической крови. После этого в нескольких вариантах осуществления иммунные клетки могут быть размножены все вместе или применяют выделенную субпопуляцию клеток, таких как NK-клетки.

[0085] После этого NK-клетки высевают с фидерными клетками, необязательно одним или более цитокинами (либо присутствующими в культуральной среде, либо вносимыми в качестве внешней добавки), и культивируют в течение первого периода времени, например, приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 2 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 14 дней или в течение любого периода времени между вышеперечисленными, включая граничные точки.

[0086] В нескольких вариантах осуществления после первого периода размножения размноженные клетки (например, NK-клетки) трансдуцируют с помощью сконструированной конструкции, такой как химерный антигенный рецептор. Любой из множества химерных антигенных рецепторов может экспрессироваться в сконструированных клетках, таких как NK-клетки, включая описанные в международной заявке, поданной согласно РСТ, PCT/US 2018/024650, РСТ/IB 2019/000141, PCT/IB 2019/000181 и/или PCT/US 2020/020824, PCT/US 2020, 035752, предварительной заявке на патент США №62/924967, 62/960285 и/или 623/038645, каждая из которых включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте.

[0087] После вирусной трансдукции сконструированные клетки культивируют в течение второго периода времени, например, приблизительно 6 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 24 часов, приблизительно 2 дней, приблизительно 3 дней, приблизительно 4 дней, приблизительно 5 дней, приблизительно 6 дней, приблизительно 7 дней, приблизительно 8 дней, приблизительно 9 дней, приблизительно 10 дней, приблизительно 11 дней, приблизительно 12 дней, приблизительно 13 дней, приблизительно 14 дней или в течение любого периода времени между вышеперечисленными, включая граничные точки. Следует отметить, что определенные данные, представленные в данном документе, относятся к вирусной экспрессии комплекса химерного рецептора, экспрессирующего домен, связывающий лиганд NKG2D (например, NKX101) или CD19 (например, NK19-1 или NKX101). Однако можно применять любой подходящий химерный рецептор или химерный антигенный рецептор.

[0088] Обогащение среды одним или более стимулирующими средствами, такими как IL12 и/или IL18, может происходить в любой момент времени в ходе процесса культивирования. Например, одно или более стимулирующих средств можно добавлять в начале культивирования, например, в нулевой момент времени (например, в начале культивирования). Средство или средства можно добавлять во второй, третий, четвертый, пятый или более раз. Последующие добавления могут быть, а могут не быть, в той же концентрации, что и в предыдущее добавление. Интервал между несколькими добавлениями может варьироваться, например, временной интервал составляет приблизительно 12 часов, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов, приблизительно 48 часов, приблизительно 72 часа или больше и любой период времени между вышеперечисленными, включая граничные точки.

[0089] Если применяют несколько добавлений стимулирующего средства, концентрация при первом обогащающем добавлении может быть такой же, как и при втором (и/или любом обогащающем добавлении), или отличающейся концентрацией. Например, в нескольких вариантах осуществления при добавлении стимулирующего средства на протяжении нескольких моментов времени его концентрация может возрастать, понижаться, оставаться постоянной или варьироваться между несколькими неэквивалентными концентрациями.

[0090] В нескольких вариантах осуществления применяют определенные соотношения фидерных клеток и клеток, подлежащих размножению. Например, в нескольких вариантах осуществления применяют соотношение фидерные клетки: клетки-«мишени», составляющее приблизительно 5:1. В нескольких вариантах осуществления применяют соотношения 1:1, в то время как в дополнительных вариантах осуществления оно может находиться в диапазоне, включающем приблизительно: 1:10, 1:20, 1:50, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:50000, 1:100000, 100000:1, 50000:1, 10000:1, 1000:1, 100:1, 50:1, 20:1, 10:1 и любое другое соотношение между вышеперечисленными, включая граничные точки.

ПРИМЕРЫ

[0091] Материалы и способы, раскрытые в примерах, являются неограничивающими примерами материалов и способов (включая реагенты и условия), применимых к различным вариантам осуществления, представленным в настоящей заявке.

Пример 1. - Начальная оценка условий размножения

[0092] На фиг. 1А показан неограничивающий пример процесса размножения. В этом примере стимулирующие цитокины добавляют в день 0 и такую же дозу добавляют снова в день 4, что применялось в определенных вариантах осуществления, рассматриваемых в данном документе. На фиг. 1В представлен неограничивающий вариант осуществления процесса с использованием одной дозы, что применялось в определенных вариантах осуществления, рассматриваемых в данном документе.

[0093] На фиг. 2 показаны данные, относящиеся к кратному размножению NK-клеток с использованием различных способов. На левом крайнем наборе данных показано размножение NK-клеток с использованием фидерных клеток K562 (экспрессирующих mbIL15 и 4-1BBL) отдельно, в то же время в каждом из трех наборов данных правее показано повышение кратного размножения при обогащении среды IL12 и IL18 в различных концентрациях. Присутствие обогащающих IL12 и IL18 в любом количестве приводило к значимому повышению размножения NK-клеток, таким образом демонстрируя, что дополнительные стимулирующие средства могут усиливать размножение NK-клеток.

[0094] На фиг. 3А показаны данные проточной цитометрии, относящиеся к экспрессии NKG2D в NK-клетках, полученных от четырех разных доноров, которые размножали либо с клетками K562 отдельно (верхний ряд), либо с обогащением IL12/18. Как можно увидеть на основании увеличенной высоты сдвинутой вправо кривой (которая относится к клеткам, трансдуцированным с помощью NKX101), экспрессия NKG2D повышалась. Обозначение NKX101 относится к сконструированной NK-клетке, которая экспрессирует усеченный внеклеточный домен NKG2D, способный связывать лиганды рецептора NKG2D. В нескольких вариантах осуществления усеченный домен NKG2D соединен с шарниром CD8-альфа и ТМ-доменом CD8-альфа. В нескольких вариантах осуществления усеченный домен NKG2D соединен с костимулирующим доменом ОХ40 и сигнальным доменом CD3-дзета. В нескольких вариантах осуществления конструкция дополнительно содержит мембраносвязанный IL15. В нескольких вариантах осуществления NKX101 имеет нуклеотидную последовательность под SEQ ID NO: 1 или аминокислотную последовательность, изложенную в SEQ ID NO: 2. Дополнительно подтверждает усиление экспрессии NKG2D фиг. 3А, на которой с помощью более высокого среднего значения интенсивности флуоресценции (MFI) при применении обогащающего растворимого IL12/18 демонстрируется большее присутствие NKG2D на данной клетке. Таким образом, обогащение фидерной клетки растворимым IL12/18 не только усиливает размножение NK-клеток, но оно также усиливает экспрессию химерных рецепторов в таких NK-клетках. Это является неожиданным преимуществом, поскольку большее число NK-клеток теперь экспрессируют большее количество рецептора, который будет нацеливаться на нежелательную клетку, такую как клетка опухоли.

[0095] Для нацеливания NK-клеток на опухоли могут применяться другие рецепторы. Например, в нескольких вариантах осуществления рецептором является химерный антигенный рецептор, нацеливающийся на CD19 на опухолевых клетках. В нескольких вариантах осуществления CD19-связывающий CAR содержит scFv, который связывается с CD19 (например, FMC63 scFv или его вариант), соединенный с костимулирующим доменом ОХ40 и сигнальным доменом CD3-дзета. В нескольких вариантах осуществления последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая CAR, дополнительно кодирует IL15. В нескольких вариантах осуществления IL15 выполнен с возможностью экспрессироваться в клетке-хозяине (например, NK-клетке или Т клеткой) в мембраносвязанной форме. В нескольких вариантах осуществления CAR кодируется нуклеотидной последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 95%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности с последовательностью под SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25 или 27. В нескольких вариантах осуществления CAR имеет аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 95%, 97%, 98%, 99% или большей идентичностью последовательности с последовательностью под SEQ ID NO: 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 или 28. В нескольких вариантах осуществления в CAR используется гуманизированная молекула, связывающая CD19.

[0096] На фиг. 4 изображены данные, согласно которым применение обогащающего растворимого IL12/18 при размножении NK-клеток действительно приводит к усилению цитотоксичности у таких размноженных NK-клеток. На фиг. 4 показаны данные для двух разных доноров в два момента времени, через 14 дней и 21 день после вирусной трансдукции. Условия культивирования, применяемые для размножения NK-клеток, предусматривали либо применение растворимого IL12/18 (пунктирные линии), либо K562 (экспрессирующих 4-1BBL и mbIL15) отдельно (непрерывные линии). Клетки, трансдуцированные с помощью GFP, применяли в качестве контроля - кривые для NKX101 указаны стрелками на фиг. 4. Как указывают данные, относящиеся к размножению на клетках K562 отдельно, применение IL12/18 усиливает цитотоксичность NK-клеток через 21 день после трансдукции (нижние панели). Хотя в этом конкретном эксперименте эффект через 14 дней был ограниченным, в нескольких вариантах осуществления, возможно в зависимости от донора и/или конкретных концентраций IL, в нескольких вариантах осуществления усиление цитотоксичности достигалось в более ранние моменты времени, такие как 14, 15, 16, 17, 18, 19 20, 21, 22 или 23 день после вирусной трансдукции. Независимо от времени, неожиданно оказалось, что применение растворимых интерлейкинов в ходе процесса размножения может значительно усиливать цитотоксичность размноженных клеток.

[0097] В нескольких вариантах осуществления повышенная цитотоксичность сконструированных NK-клеток по меньшей мере частично обусловлена клетками, развивающимися в направлении специфического фенотипа. На фиг. 5А и 5В изображены данные, относящиеся к развитию определенных маркеров, связанных с NK-клеткам памяти, с течением времени. На фиг. 5А показана экспрессия CD57, NKG2C и CD62L в NK-клетках, размноженных на фидерных клетках отдельно, в то время как на фиг. 5В показано применение фидерных клеток вместе с растворимым IL12/18. Экспрессия NKG2C возрастала на день 21 в NK-клетках, размноженных с IL12/18. NKG2C является маркером индуцированных цитокином NK-клеток памяти. Повышенный уровень CD67L также наблюдали в более поздние моменты времени у NK-клеток, размноженных с использованием растворимого IL12/18. CD67L ассоциирован с повышенным выходом лимфоцитов из сосудов (доказательство повышенной клеточной активности). Взятые вместе, эти данные свидетельствуют о том, что применение растворимых интерлейкинов в ходе размножения NK-клеток способно запускать в действие разные сигнальные пути, которые ассоциированы с NK-клетками памяти в отношении антигенов и усиленной цитотоксичностью против клеток, несущих такие антигены.

[0098] На фиг. 6 изображены данные, относящиеся к противоопухолевому эффекту NK-клеток, экспрессирующих NKX101, в условиях in vivo, когда исходные NK-клетки размножали с использованием клеток K562 отдельно в сравнении с обогащением среды для размножения растворимым IL12/18. Животная модель предусматривает введение мышам дозы 4 х 10⁶ клеток гепатоцеллюлярной карциномы SNU499 (внутрибрюшинно) в день 0, а затем 3 х 10⁶ NK-клеток, экспрессирующих NKX101, которые были размноженные при обогащении среды для размножения IL12/18 или без него (или контроля). Как показано на левых панелях, контрольные мыши имеют значительную опухолевую нагрузку уже на день 7, при этом опухолевый сигнал присутствует и незначительно повышается у некоторых мышей в дни 14 и 21. Биолюминесцентная визуализация в условиях in vivo (BLI) показана под фотографиями. На правой панели показан эксперимент, выполненный с NK-клетками, экспрессирующими NKX101. Как показано на фотографиях, опухолевая нагрузка присутствовала в день 7, но большей частью не обнаруживалась в день 14 и сохранялась в таком состоянии ко дню 21. На центральной панели показаны фотографии для эксперимента с NK-клетками, экспрессирующими NKX101, при этом NK-клетки были размножены с использованием растворимого IL12/18. Воздействие на опухолевую нагрузку было по меньшей мере таким же эффективным, как и в случае клеток NKX101 («стандартное» размножение), хотя значительная степень эффективности NKX101 может затруднять обнаружение улучшения эффекта при применении IL12/18. Несмотря на это, согласно нескольким вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, применение растворимого IL12/18 для обогащения среды для размножение NK-клеток приводит не только к усилению размножения, но также усилению экспрессии химерного рецептора и усилению цитотоксичности.

Пример 2. - Дополнительные оценки размножения и эффективности

[0099] Как рассматривается выше, в нескольких вариантах осуществления, раскрытых в данном документе, один или более растворимых стимулирующих факторов применяют для усиления размножения и/или цитотоксичности сконструированных иммунных клеток, таких как NK-клетки, Т-клетки или их комбинации. Эксперименты, проводимые в рамках настоящего примера, выполняли, чтобы оценить эффективность различных концентраций выбранных стимулирующих молекул по сравнению с общепринятой системой размножения. Хотя в зависимости от варианта осуществления могут применяться другие стимулирующие средства, в этом примере использовали растворимый интерлейкин-12 и растворимый интерлейкин-18. Эти цитокины добавляли (в различных концентрациях, описанных ниже) и полученные размноженные клетки сравнивали с клетками, размноженными с использованием клеток K562, модифицированных для экспрессии мембраносвязанного интерлейкина-15 и 4-1BBL (более подробно описаны в патенте США №7435596 и 8026097, полное содержание каждого из которых включено в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Размноженные клетки оценивали с точки зрения пролиферации, секреции цитокинов, цитотоксичности и фенотипа.

[00100] Эксперименты подготавливали с использованием NK-клеток, полученных от нескольких доноров, при этом их размножали с использованием различных условий. Одну группу NK-клеток размножали на mbIL15-экспрессирующих фидерных клетках (K562/4-1BBL/mbIL15). Другую группу NK-клеток размножали на mbIL15-экспрессирующих клетках, которые дополнительно модифицировали для экспрессии IL12 и IL18 на поверхности клеток. Для всех других групп применяли различные условия культивирования и выполняли анализы пролиферации для определения эффектов различных концентраций стимулирующих цитокинов. Например, на одну группу клеток воздействовали фиксированной концентрацией IL12 (5 нг/мл) и варьирующими концентрациями IL18. На дополнительную группу воздействовали другой фиксированной концентрацией IL12 (2,5 нг/мл) и варьирующими концентрациями IL18. Следует отметить, что на те культуры, на которые воздействовали IL12 и IL18 в растворимой форме, воздействовали дозой IL12/18 в нулевой день культивирования (и снова в день 4). Как рассматривается выше, добавление растворимых цитокинов в день 0 и день 4 применяли в экспериментах, обеспечивающих данные, показанные на фигурах 2-18 и фигурах 23-24. В других экспериментах использовали воздействие растворимых цитокинов только в день 0.

[00101] На фиг. 7А представлена схематическая таблица различных условий культивирования, применяемых для размножения NK-клеток. На фиг. 7В показаны данные, относящиеся к числу клеток после 72 часов воздействия различных условий. Как видно по нижней кривой, добавление IL18 отдельно при любой концентрации оказывало ограниченное влияние на пролиферацию NK-клеток. В отличие от этого, добавление IL12 отдельно повышало пролиферацию NK-клеток дозозависимым образом. Комбинация IL12 (из расчета либо 2,5 нг/мл, либо 5 нг/мл) с варьирующими концентрациями дополнительно усиливала пролиферацию NK-клеток, что свидетельствует от синергическом взаимодействии между этими двумя интерлейкинами. Данные для IL12 из расчета как 2,5 нг/мл, так и 5 нг/мл демонстрируют надежное размножение NK-клеток, при этом почти максимальные уровни достигались, когда IL18 присутствовал в концентрации от приблизительно 0,1 до приблизительно 1 нг/мл. Добавление IL18 при более высоких концентрациях все еще могло положительно влиять на усиление размножения NK-клеток, при этом самая высокая концентрация IL18 из расчета 50 нг/мл в комбинации с IL12 из расчета 5 нг/мл приводила к небольшому усилению размножения по сравнению с IL12 из расчета 2,5 нг/мл. Данные для размножения со сверхнасыщающими концентрациями IL12 или IL18 вышли за пределы масштаба и не показаны.

[00102] На фиг. 8 показаны данные, относящиеся к концентрациями IFNg после 72 часов культивирования с варьирующими концентрациями либо IL12, либо IL18. На графике представлена концентрация IFNg (измеренная по поглощению в ходе анализа ELISA) относительно возрастающих концентраций выбранного интерлейкина. Аналогично данным пролиферации добавление IL12 привело к большей выработке IFNg по сравнению с добавлением IL18. Тем не менее добавление возрастающих концентраций IL18 все же приводило к повышенной выработке IFNg. С другой стороны IL12 приводил к большей выработке IFNg в NK-клетках при почти каждой протестированной концентрации. Как и в случае пролиферации комбинация одной из концентраций IL12 с концентрациями IL18, составляющими приблизительно 1 нг/мл (или больше), обеспечивала усиление выработки IFNg. Комбинация IL12 (в одной из концентраций) с IL18 в концентрациях ниже приблизительно 0,5 нг/мл приводила в выработке IFNg, аналогичной таковой, достигаемой с помощью IL12 отдельно. С другой стороны включение IL18 из расчета приблизительно 1 нг/мл или больше вело к значительному усилению выработки IFNg, что снова указывает на синергическую стимуляцию NK-клеток.

[00103] На фиг. 9А-9В показаны данные, относящиеся к размножению NK-клеток (нетрансдуцированных), после 7 дней размножения в указанных условиях культивирования. Первую группу размножали с использованием насыщающих концентраций как IL12 (20 нг/мл), так и IL18 (25 нг/мл). Вторую группу размножали с использованием насыщающих концентраций IL12 (20 нг/мл) и субнасыщающих концентраций IL18 (0,05 нг/мл). Третью группу размножали с использованием фидерных клеток, сконструированных для экспрессии мембраносвязанных форм каждого из IL15, IL12 и IL18 (дополнительные подробности относительно этой линии фидерных клеток можно найти в международной заявке на патент PCT/SG 2018/0501387, которая включена в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). Четвертую группу, выступающую в качестве контроля, размножали на устойчивой линии фидерных клеток (клетки K562, экспрессирующие mbIL15 и 4-1BBL). На фиг. 9А показаны рассчитанные данные размножения, а на фиг. 9В показан статистический анализ. На фиг. 9С и 9D отображены данные по кривым определенной титрации и размножению NK-клеток. На фиг. 9С показаны данные для различных концентраций IL12, при этом IL18 удерживается на постоянном уровне 4 нг/мл. На фиг. 9D показаны аналогичные данные с варьирующимся IL12 и постоянным IL18 из расчета 20 нг/мл. Взятые вместе, эти данные указывают на то, что добавление IL12 и IL18, независимо от того, находятся ли они в растворимом формате или являются мембраносвязанными на фидерных клетках (таких как клетки K562, экспрессирующие mbIL15), обеспечивает значимое усиление размножения NK-клеток. Что интересно, IL12, по-видимому, является первичным стимулом размножения, при этом его активность усиливается при включении IL18 даже в низких концентрациях (см., например, аналогичные количества размноженных клеток при насыщающих и субнасыщающих концентрациях IL18). Эти данные указывают на то, что комбинации IL12 и IL18 надежно усиливают размножение NK-клеток.

[00104] На фиг. 10А-10В показаны данные цитотоксичности для нетрансдуцированных NK-клеток после 8 дней размножения в указанных условиях (и обогащении среды IL-2 из расчета 40 МЕ/мл). Клетками-мишенями были клетки острого лимфоцитарного лейкоза Reh (отличные от Т-клеток; отличные от В-клеток) при соотношении эффектор:мишень 1:1. Независимо от условий культивирования всех клетки проявляли цитотоксичность на уровне от приблизительно 40% до приблизительно 65%. Клетки, размноженные на mbIL15-экспрессирующих фидерных клетках без любого из IL12 или IL18, проявляли наиболее высокую степень цитотоксичности, значительно большую, чем любая из групп, культивируемых с растворимым IL12/IL18. При применении фидерных клеток с мембраносвязанным IL12 и IL18 проявлялись более высокие степени цитотоксичности, чем при применении растворимых цитокинов.

[00105] На фиг. 11А-11В показаны данные цитотоксичности для нетрансдуцированных NK-клеток против клеток Reh в соотношении эффектор : мишень 1:1 в день 15 культивирования (концентрация IL2 составляла 400 МЕ/мл). Эти данные демонстрируют не только более высокие степени цитотоксичности для всех протестированных групп, но и ограниченные отличия между группами. Другими словами, все группы показали повышенную степень цитотоксичности, что означает отсутствие значимой разницы между условиями культивирования. Согласно некоторым вариантам осуществления применение IL12 и IL18 индуцирует сигнальный путь или каскад, который влияет на размножение на ранних этапах культивирования. В нескольких вариантах осуществления такой путь или каскад (или пути/каскады) оказывал отсроченное влияние на усиление цитотоксичности. В нескольких вариантах осуществления применение определенных стимулирующих факторов индуцировало фенотипическое изменение в NK-клетках, такое как схожий с клетками памяти фенотип, которое подготавливает NK-клетки к индуцированию цитотоксических эффектов против клетки-мишени. В нескольких вариантах осуществления индукция такого фенотипического изменения может занять 1-2, 3-4, 5-6, 7-8 или больше дней до его распознавания, в зависимости от характеристики NK-клетки, подлежащей оценке.

[00106] Хотя вышеперечисленные эксперименты выполняли с нетрансдуцированными NK-клетками, они демонстрируют, что включение IL12 и IL18 в различных концентрациях может усиливать размножение и цитотоксичность NK-клеток. Дополнительные эксперименты предпринимали с NK-клетками, трансдуцированными с помощью химерного рецептора (в сравнении с GFP-трансдуцированными клетками или нетрансдуцированными (NT) NK-клетками). В качестве неограничивающего примера используемый химерный рецептор содержит усеченный домен NKG2D, связанный с шарниром CDS-альфа и ТМ-доменом CDS-альфа, костимулирующий домен ОХ40, сигнальный домен CD3-дзета и мембраносвязанный IL15. На фиг. 12 показаны данные проточной цитометрии, оценивающей экспрессию химерного рецептора (указан как 45_4) на NK-клетках, полученных от различных доноров, которые культивировали в различных условиях. В левой колонке на фиг. 12, показаны данные для NK-клеток, культивируемых на фидерных клетках, экспрессирующих mbIL15, для двух доноров (227 вверху, 732 внизу). Кривая, указанная как «45_4», показывает более высокую экспрессию NKG2D (как и ожидалось для клеток, которые были трансдуцированы NKG2D-содержащим химерным рецептором). В правой колонке показаны результаты экспрессии для NK-клеток, культивируемых на mBIL15-экспрессирующих фидерных клетках с растворимым IL12 и растворимым IL18, добавленными в среду в день 0 из расчета 20 нг/мл и 25 нг/мл соответственно. На фиг. 13 показаны соответствующие данные для двух дополнительных доноров. Как можно увидеть из данных MFI как на фиг. 12, так и на фиг. 13, применение IL12 и IL18 привело к усилению экспрессии NKG2D, что дополнительно подтверждает предыдущие данные о том, что определенные стимулирующие факторы могут надежно управлять размножением NK-клеток. Эти данные также подкрепляют то, что применения стимулирующих молекул, таких как IL12 и IL18, является подходящим для трансдуцированных NK-клеток.

[00107] После подтверждения того, что стимулирующие цитокины усиливают размножение трансдуцированных NK-клеток, оценивали цитотоксичность. На фиг. 14А и 14В показаны данные, относящиеся к цитотоксичности NK-клеток, трансдуцированных с помощью указанных конструкций и размноженных с использованием указанных условий культивирования. Группы были следующими: GFP-трансдуцированные NK-клетки, выращенные на mbIL-15-экспрессирующих фидерных клетках; GFP-трансдуцированные NK-клетки, выращенные на mbIL-15-экспрессирующих фидерных клетках и подвергнутые воздействию IL12 и IL18, NKX101-трансдуцированные NK-клетки, выращенные на mbIL-15-экспрессирующих фидерных клетках, и NKX101-трансдуцированные NK-клетки, выращенные на mbIL-15-экспрессирующих фидерных клетках и подвергнутые воздействию IL12 и IL18. Клетками мишенями были клетки Reh при соотношении Е:Т 1:1. Цитотоксичность оценивали в день 13 после начала размножения с использованием клеток, полученных от четырех разных доноров. Как показано, как GFP-трансдуцированные, так и NKX101-трансдуцированные NK-клетки проявляли цитотоксичность, при этом NKX101-экспрессирующие клетки показали наиболее высокие эффекты против клеток-мишеней. Не обнаружили никаких значимых отличий по признаку применяемых условий культивирования при размножении (см. фиг. 14В).

[00108] На фиг. 15А-15В показаны дополнительные данные цитотоксичности для клеток, полученных от двух доноров, где тестировали разные соотношения Е:Т. Эти данные показывают закономерность, соответствующую показанной на фиг. 14. На фиг. 15А показаны данные для четырех условий культивирования для первого донора, а на фиг. 15В показаны соответствующие данные для второго донора. Следует отметить, что донор 543 (фиг. 15А) был отрицательным по цитомегаловирусу, а донор 224 (фиг. 15В) был положительным по CMV. Положительные по CMV индивидуумы имеют субпопуляцию NK-клеток, которые обладают схожим с клетками памяти фенотипом, это означает, что для них характерен более быстрый ответ на клетки-мишени. Данные на фиг. 15А-15В собирали в день 13 после начала размножения. Эти кривые аналогичны вышеописанным данным, и в этот относительно ранний момент времени присутствие или отсутствие IL12/IL18 оказывает ограниченный эффект на цитотоксичность, индуцируемую NK-клетками. На фиг. 15С и 15D показаны данные с теми же донорами/условиями, но в 21 день после начала размножения. Примечательно, что применение IL12/IL18 приводит к усилению цитотоксичности против клеток-мишеней при большинстве протестированных соотношений Е:Т. Эти данные соответствуют описанным выше для нетрансдуцированных NK-клеток, в том смысле, что существует задержка в индукции усиления цитотоксичности, но его можно обнаружить в более поздние моменты времени. Как рассматривается выше, этот эффект может быть обусловлен временем, требуемым для индукции фенотипического изменения в NK-клетках.

[00109] Фиг. 16А-16В относятся к оценке фенотипа NK-клеток, культивируемых в разных условиях, с течением времени. На фиг. 16А показаны уровни экспрессии NKG2C и CD62L (L-селектин) на протяжении 5 недель культивирования в указанных условиях. Уровни экспрессии ни CD62L, ни NKG2C не варьировали значительным образом на протяжении 5 недель культивирования при применении mbIL 15-экспрессирующих фидерных клеток. Однако, в отличие от этого, применение таких фидерных клеток и обогащение среды IL12 и IL18 в день 0 оказывало значительное влияние на экспрессию как NKG2C, так и CD62L. CD62L изначально присутствовал на приблизительно 50% NK-клеток после 1 недели культивирования. Хотя его присутствие повышалось через неделю, после этого произошел значительный спад в экспрессии CD62L, при этом обнаружение на ограниченном уровне было возможно после 4 недель культивирования. В отличие от этого, экспрессия NKG2C немного повысилась после недели культивирования, причем экспрессия NKG2C повысилась на NK-клетках, при этом у более чем 40% клеток NKG2C экспрессировался после 5 недель. Таким образом, через 5 недель культуру можно было охарактеризовать как имеющую повышенные уровни NKG2C по сравнению с NK-клетками, выращенными без стимулирующего цитокина, и имеющую сниженную или эквивалентную экспрессию CD62L по сравнению с NK-клетками, выращенными без стимулирующего цитокина. На фиг. 16В показаны дополнительные данные, подтверждающие формирование измененного, схожего с клетками памяти фенотипа у NK-клеток. На фиг. 16В показаны данные экспрессии, полученные с помощью анализа FACS донорных NK-клеток в день 14 (верхний ряд) и в день 21 (нижний ряд), которые культивировали с mbIL15-экспрессирующими клетками (левая колонка) или mbIL15-экспрессирующими клетками вместе с добавлением IL12 и IL18 в день 0 (правая колонка). Также показана экспрессия CD57, при этом относительно низкая процентная доля клеток, положительных по экспрессии, подтверждает тенденцию к потере экспрессии данного маркера при культивировании NK-клеток (свежие NK-клетки имели бы более высокий уровень экспрессии CD57). Как можно увидеть в колонке mbIL15, экспрессия NKG2C (ось X) значительным образом не изменяется. В отличие от этого, процентная доля клеток, экспрессирующих NKG2C, после дополнительной недели культивирования повысилась на 40% (как указано стрелочкой) после начального воздействия растворимым IL12 и растворимым IL18.

[00110] На фиг. 17A-17D показаны обобщенные данные, относящиеся к экспрессии маркеров на NK-клетках после 14 дней культивирования в указанных условиях. Как показано на фиг. 17А, в этот момент времени экспрессия CD62L усиливалась за счет применения IL12 и IL18, независимо от того, находились ли они в растворимом или мембраносвязанном форматах. Как рассматривается выше, эта экспрессия снижается на протяжении дополнительного времени культивирования. На фиг. 17В показано усиление экспрессии NKG2D при введении IL12 и IL18 в среду в день 1. Как и в случае других данных, следует отметить, что эффекты в отношении фенотипа NK-клеток (как, например, размножения и цитотоксичности) приблизительно эквивалентны при варьирующих концентрациях IL18 (например, эффекты отмечены при насыщающих или субнасыщающих концентрациях IL18). Уровни экспрессии CD57 были относительно низкими при всех условиях, что характерно для культивируемых (а не для свежевыделенных) клеток, как показано на фиг. 17D. На фиг. 17D показана двойная положительная экспрессия маркеров CD62L и NKG2C, при этом снова уровни экспрессии увеличивались при присутствии IL12 и IL18 в культуре. Эти данные отражают смещение фенотипа NK-клеток, культивируемых с IL12 и IL18 (независимо растворимых или мембраносвязанных), в направлении более сильного схожего с клетками памяти фенотипа. В нескольких вариантах осуществления этот фенотип обеспечивает NK-клетки, в частности сконструированные для экспрессии химерного рецептора, усиленной способностью к размножению и/или усиленной цитотоксичностью, что делает их более сильнодействующим продуктом для иммунотерапии рака.

[00111] На фиг. 18 показано то, что применение IL12 и IL18 усиливает цитотоксичность сконструированных NK-клеток даже в более поздние моменты времени (показана цитотоксичность в 21 день после размножения). Примечательно, что две центральные точки на фигуре представляют NKX101-трансдуцированные NK-клетки, которые проявляют наибольший цитотоксический эффект в сравнении с любыми другими группами. Важно, что NKX101-трансдуцированные NK-клетки, культивируемые с растворимым IL12 и 18 на mbIL15-экспрессирующих фидерных клетках, показывают наибольшую степень цитотоксичности по отношению к клеткам мишеням (в качестве неограничивающего примера мишенью в данном случае были клетки лейкоза Reh). Таким образом, согласно нескольким вариантам осуществления применение растворимых стимулирующих факторов, таких как IL12, IL18, IL21 и т.д., при культивировании NK-клеток, обеспечивает неожиданное усиление размножения клеток (что является весьма важным для получения клинически значимых количеств клеток), а также неожиданное усиление цитотоксичности против клеток-мишеней.

Пример 3 - Оценка размножения, криоконсервации и цитотоксичности

[00112] Как раскрыто в данном документе, в нескольких вариантах осуществления сконструированные NK-клетки, которые размножали, предназначены для применения в аутологичной ситуации. В нескольких вариантах осуществления применяли аллогенный подход. В нескольких вариантах осуществления NK-клетки разрабатываются как «имеющиеся в наличии», что означает уже имеющуюся популяцию NK-клеток, которые были размножены и сконструированы, а затем сохранены для введения пациенту дозы в более поздний момент времени. В нескольких вариантах осуществления сохранение происходит путем криоконсервации. Как в случае любого цикла заморозки-оттаивания, жизнеспособность и активность клеток может быть проблемой. На фиг. 19 показаны данные, относящиеся к характеристиками NK-клеток, полученных от трех разных доноров, которые культивировали с mbIL15-экспрессирующими фидерными клетками или mbIL15-экспрессирующими фидерными клетками, обогащенными растворимым IL12/18 в начале культивирования. Три нижних ряда таблицы являются доказательством положительного влияния растворимого IL12 и 18 на NK-клетки при культивировании. Через 6 дней после начала размножения жизнеспособность NK-клеток в среде, обогащенной IL12/18, была немного выше, в то время как общее количество клеток и, как следствие, кратное размножение были значительно выше при применении IL12/18.

[00113] Основываясь на этих данных, клетки трансдуцировали CD19-связывающим химерным антигенным рецептором и культивировали в присутствии растворимых IL12 и 18 (с использованием mbIL15-экспрессирующих фидерных клеток) или без них. Часть клеток подвергали криоконсервации и затем сравнивали с соответствующими свежими клетками. NK-клетки оценивали в отношении экспрессии FLAG (метка в пределах конструкции NK19-1, хотя следует понимать, что в данном документе представлены соответствующие конструкции, не содержащие метку) с помощью FACS. Как показано на фиг. 20, как свежие, так и подвергнутые криоконсервации NK-клетки, полученные от 3 доноров, сохраняли экспрессию CD19-связывающего CAR. По-видимому, присутствие IL12/18 оказывает ограниченное влияние на экспрессию CAR. На фиг. 21 показаны клетки от тех же доноров в день 22 размножения. Что интересно, процентная доля клеток, экспрессирующих CD19-связывающий CAR, снизилась в день 14 по сравнению с днем 21. Экспрессия конструкций в день 21 была приблизительно такой же, как у свежих NK-клеток (например незамороженных) (сравните ряды 3-4 с рядами 7-8). Эти данные указывают на то, что NK-клетки, культивируемые согласно способам, раскрытым в данном документе, являются надежной популяцией клеток и могут пережить криоконсервацию и все еще сохранять жизнеспособность и поддерживать значительные уровни экспрессии конструкций, индуцирующих цитотоксичность.

[00114] Предпринимали дополнительный анализ эффектов криоконсервации на NK-клетки. В качестве клетки-мишени применяли линию клеток Nalm6 с ядерным красным, и на них нацеливались с помощью линии NK-клеток, экспрессирующих СВ19-связывающий CAR. В качестве неограничивающего примера в этом эксперименте использовали CAR, который кодируется SEQ ID NO: 1. Результаты анализа представлены на фиг. 22А-22В. На фиг. 22А показаны кривые числа клеток (среднее значение для трех доноров) на протяжении времени анализа. Как показано, в случае нетрансдуцированных NK-клеток и клеток Nalm6 отдельно продемонстрированы аналогичные степени повышения числа клеток-мишеней Nalm6. Нетрансдуцированные NK-клетки, выращенные с растворимыми IL12/18, показали небольшой цитотоксический эффект (смещение вниз кривой, показывающей число клеток на лунку). Примечательно, что подвергнутые криоконсервации клетки в день 14 культивирования показали значительный цитотоксический эффект в отношении клеток Nalm6, ограничивая их рост до последних часов эксперимента. Важно отметить, что в день 14 подвергнутые криоконсервации клетки, выращенные в культуре с растворимым IL12/18, полностью ограничили рост клеток Nalm6. В нескольких вариантах осуществления клетки, размноженные на протяжении больших периодов времени (либо свежие, либо подвергнутые криоконсервации), также были способны значительно снижать рост опухоли. Обобщенные данные за 14 дней показаны на фиг. 22В. Касательно нетрансдуцированных NK-клеток, размножение NK-клеток с растворимыми IL12/18, добавленными в день О культивирования, значительно повышало цитотоксичность NK-клеток против опухолевых клеток-мишеней. Аналогичные данные показаны для NK-клетки, экспрессирующей CAR. Даже в присутствии CAR, приводящего к почти 80% цитотоксичности против клеток-мишеней, культивирование CAR-экспрессирующих NK-клеток с растворимыми IL12/18 значительно усиливало цитотоксичность. На фиг. 22С показаны дополнительные данные цитотоксичности для NK-клеток, культивируемых в присутствии IL12/18 или их отсутствии в культуральной среде в ходе размножения, при различных соотношениях Е:Т. Как показано, клетки, сконструированные для экспрессии неограничивающий варианта осуществления CD19-связывающего CAR, проявляют усиление цитотоксичности при почти всех соотношениях Е:Т. По мере повышения количества клеток-мишеней цитотоксичность NK-клеток, размноженных с использованием IL12 и IL18, раскрытых в данном документе, проявляет возрастающие цитотоксические эффекты по сравнению с клетками, размноженными на фидерных клетках отдельно. В совокупности эти данные предоставляют доказательство того, что применение IL12/18 в культуральной среде приводит к усиленной пролиферации NK-клеток, а также усилению цитотоксичности. Кроме того, эти данные предоставляют важное дополнительное доказательство того, что активность клеток сохраняется даже после криоконсервации клеток. Эти данные указывают на то, что согласно некоторым вариантам осуществления был получен продукт на основе «размороженных» сконструированных NK-клеток с надежными противоопухолевыми эффектами.

[00115] На фиг. 23 показана схема эксперимента в условиях in vivo, где клетки гепатоцеллюлярной карциномы инъецируют донорным мышам и им вводят NK-клетки, выращенные с использованием различных условий культивирования. После этого отслеживали опухолевую нагрузку с использованием биолюминесценции. Вводимые клетки представляют собой одно из нетрансдуцированных NK-клеток, выращенных в среде, обогащенной растворимыми IL12/IL18 в день I, NK-клеток, экспрессирующих NKX101, выращенных с IL2, или NK-клеток, экспрессирующих NKX101, выращенных в среде, обогащенной растворимыми IL12/IL18 в день 1. Все клетки выращивали на mbIL15-экспрессирующих фидерных клетках. На фиг. 24 показаны результаты анализа опухолевой нагрузки с течением времени. У контрольных животных, а также животных, получавших нетрансдуцированные NK-клетки, показан умеренный рост опухоли с течением времени. В отличие от этого, у животных, получавших NK-клетки, экспрессирующие NKX101 и выращенные с IL12/18 или IL2, показаны значительно большие противоопухолевые эффекты. Опухолевая нагрузка уменьшалась у обеих групп, при этом происходило лишь небольшое повышение в дни 14-21 в группе IL2. Эти данные дополнительно подтверждают применение стимулирующих цитокинов, таких как IL12, IL18 или IL21, в культуральной среде при размножении, чтобы усиливать цитотоксичность культивируемых NK-клеток.

[00116] На фиг. 25 показаны аналогичные экспериментальные условия, на этот раз с ксенотрансплантатом из клеток Nalm6 и обработкой NK-клетками, экспрессирующими CD19-связывающий CAR. На фиг. 26А показаны полученные данные по биолюминесценции. Как и в случае предыдущего эксперимента, у контрольных животных и животных, получавших нетрансдуцированные NK-клетки, показано быстрое повышение опухолевой нагрузки, хотя оно снижалось в более поздние моменты времени. У животных, получавших NK-клетки, экспрессирующие NK19-1 (CD19-связывающий CAR), показана эффективная задержка роста опухоли, ограничивающая значительное разрастание в более поздние моменты времени. Клетки, экспрессирующие NK19-1 и выращенные с IL12/18, показали заметный контроль роста опухоли, ограничивающий ее разрастание вплоть до поздних стадий эксперимента и даже позже, при заметно более низкой общей опухолевой нагрузке по сравнению с другими группами. На фиг. 26В показаны дополнительные данные, относящиеся к выживанию. У мышей, получавших РВ (контрольные) или NT NK-клетки, показано быстрое падение выживаемости через примерно 30 дней. Животные, получавшие NK19-1, выживали дольше, чем такие группы, а животные в группе NK19-1 IL12/18 все еще характеризовались жизнеспособностью 80%, когда во всех остальных группах выжившие отсутствовали. На фиг. 26С и 26D показаны данные, относящиеся к персистенции NK-клеток в условиях in vivo, когда их культивировали в среде, обогащенной IL12/18. На фиг. 26С показано измерение процентной доли CD56+клеток человека (маркер NK-клеток) из общей периферической мышиной крови. Как показано, размножение NK-клеток с использованием растворимых IL12/18 приводит к значительно более высокой процентной доле NK-клеток человека в мышиной крови даже через 18 дней после введения. Это доказывает усиление персистенции, обеспечиваемое у NK-клеток благодаря применению стимулирующих цитокинов в ходе размножения. Аналогичным образом, не только NK-клетки в целом, которые являются персистирующими в условиях in vivo, но и клетки, экспрессирующие CAR, получают выгоду в виде усиленной персистенции благодаря применению растворимых IL12/18 (или других стимулирующих молекул). На фиг. 26D показана процентная доля NK-клеток, положительных по CD19-связывающему CAR (из общего числа клеток мышиной периферической крови), через 18 дней после инъекции реципиентным мышам с ксенотрансплантатом. Как и в случае предыдущей фигуры, эти данные показывают, что сконструированные иммунные клетки, такие как NK-клетки, экспрессирующие химерный антигенный рецептор, проявляют усиленную персистенцию в условиях in vivo при размножении с использованием по меньшей мере одного стимулирующего цитокина. Дополнительный эксперимент проводили для оценки эффектов цитокинов, применяемых в культуре при размножении и криоконсервации (или их отсутствия), в отношении экспрессии CAR в NK-клетках. На фиг. 26Е показано, что в день 15 культивирования экспрессия неограничивающего варианта осуществления CD19-связывающего CAR не изменялась, если цитокины применяли в культуре при размножении. То есть, усиленные эффекты, продемонстрированные в данном документе на основе культивирования при размножении с использованием одной или более дополнительных стимулирующих молекул, не уравновешиваются сниженной экспрессией CAR. Более того, криоконсервация NK-клеток не оказывала негативного влияния на экспрессию CAR в сконструированных NK-клетках. Фиг. 26F подтверждает, что экспрессия CAR не ухудшалась после дополнительного времени культивирования. Эти данные снова подтверждают усиление цитотоксичности, персистенции и стабильной экспрессии CAR в NK-клетках, выращенных под влиянием стимулирующих цитокинов, таких как, среди прочего, IL12 и IL18. Аналогичным образом, криоконсервация сконструированных NK-клеток не оказывала значительного негативного влияния на эти полезные характеристики.

Пример 4. - Дополнительные эксперименты для оценки эффектов криоконсервации и размножения на цитотоксичность, характеристики NK-клеток и выживаемость NK-клеток

[00117] Проводили дополнительные эксперименты, чтобы определить, окажет ли процесс криоконсервации с последующим оттаиванием негативное влияние на сконструированные NK-клетки, например, за счет снижения их жизнеспособности, персистенции или цитотоксичности. На фиг. 27А показана схема используемого экспериментального протокола, а также экспериментальные группы и другие применяемые условия. Как описано выше, в случае групп обработки с обозначением «IL12/IL18», клетки размножали в присутствии растворимого IL12 и/или IL18 в соответствии с вариантами осуществления, описанными в данном документе. Группы обработки включали свежие нетрансдуцированные NK-клетки (G1) и PBS (G2) в качестве контрольных групп.Экспериментальные группы включали подвергнутые криоконсервации и оттаиванию NK-клетки, сконструированные для экспрессии неограничивающего варианта осуществления CD19-связывающего CAR и размноженные без (G3) и в присутствии дополнительных стимулирующих цитокинов (G4), а также свежие NK-клетки, сконструированные для экспрессии неограничивающего варианта осуществления CD19-связывающего CAR и размноженные без (G5, G6) и в присутствии дополнительных стимулирующих цитокинов (G7, G8). Забор крови и визуализацию проводили в моменты времени, указанные на фиг. 27А.

[00118] На фиг. 27В и 27С показана визуализация биолюминесценции в условиях in vivo для указанных экспериментальных групп.На фиг. 28А-28Н показаны линейные графики, отражающие интенсивность биолюминесценции с течением времени. Эти данные обобщены на фиг. 281, на которой показаны данные первых 30 дней после обработки, и на фиг. 28J, на которой показаны данные на протяжении 56 дней. Хотя на фиг. 281 показано явное отличие между NK-клетками, экспрессирующими CD19-связывающие CAR, и двумя контрольными группами, для каждой из экспериментальных групп показано ограниченное вплоть до необнаруживаемого повышения показателя BLI, измеряемого на протяжении первых 30 дней эксперимента (повышение показателя BLI указывает на повышенный рост опухоли), что указывает на контроль роста опухоли. На фиг. 28J показаны данные на протяжении 56 дней, и здесь наблюдается большее разделение экспериментальных групп, экспрессирующих различные конструкции CAR и подвергнутых обработке в указанных условиях, в подавлении роста опухолевых клеток. Для контрольных групп (G1 и G2) показан значительно повышенный рост опухоли, что привело к завершению эксперимента для таких групп через 30 дней. Для группы, получавшей свежие NK-клетки, экспрессирующие CD19-связывающий CAR и размноженные без применения растворимых интерлейкинов (G5), показано резкое повышение показателя BLI между днями 30 и 56. Для другой экспериментальной повторности этой группы (G6) показана более выраженная способность к подавлению роста опухоли. Для группы, получавшей замороженные NK-клетки, экспрессирующих CD19-связывающий CAR и размноженные без применения растворимых интерлейкинов (G3), также показано повышение показателя BLI между днями 30 и 56, но не в той же степени, какую обнаруживали в случае свежих клеток. Экспериментальные группы, получавшие NK-клетки, экспрессирующие CD19-связывающий CAR, независимо свежие или замороженные, которые размножали с использованием дополнительных стимулирующих факторов в ходе размножения (согласно вариантам осуществления, раскрытым в данном документе), проявляли наиболее надежное предотвращение роста опухоли. Что примечательно, для групп 4 и 8, обе из которых представляли собой подвергнутые криоконсервации NK-клетки, показано наибольшее подавление роста опухоли. В комбинации с данными, собранными при введении свежих сконструированных NK-клеток, эти данные указывают на то, что согласно нескольким вариантам осуществления сконструированные NK-клетки, экспрессирующие CD19-связывающие CAR, являются эффективными не только при получении и введении в свежем состоянии, но также при получении, замораживании, затем оттаивании и введении (например, как в определенных вариантах осуществления аллогенного введения).

[00119] На фиг. 29 показан линейный график массы тела мышей, обработанных указанными конструкциями, на протяжении 56 дней эксперимента. Снижение массы тела коррелирует с повышенным ростом опухоли, например прогрессирование опухоли приводит к ухудшению здоровья мышей и соответствующей потере массы тела (например, истощению). Как показано, для контрольных групп показана значительная потеря массы тела в течение 30 дней, в то время как во всех экспериментальных группах кроме одной масса тела увеличивается на протяжении большей части эксперимента. Как и в случае данных биолюминесценции, обсуждаемых выше, наблюдается заметная тенденция, согласно которой многие из сравниваемых свежих и замороженных препаратов проявляют практически аналогичные эффекты в отношении массы тела. Согласно нескольким вариантам осуществления сконструированные NK-клетки, экспрессирующие CD19-связывающий CAR, эффективны не только при получении и введении в свежем состоянии. Дополнительно, согласно нескольким вариантам осуществления сконструированные NK-клетки, экспрессирующие CD19-связывающие CAR, эффективны не только при получении, замораживании, затем оттаивании и введении (например, как в случае аллогенного введения).

[00120] Собирали дополнительные данные, чтобы охарактеризовать признаки NK-клеток, размноженных с применением одного или более дополнительных стимулирующих факторов или без них. На фиг. 30А показаны данные, относящиеся к длительности жизни (например, персистенции) NK-клеток при культивировании. Эти данные показывают процентную долю NK-клеток (на основании положительности по CD56), которые были сконструированы (на основании положительности по активирующему химерному рецептору (ACR)). Эти данные показывают, что NK-клетки, размноженные в присутствии дополнительных стимулирующих факторов, таких как IL12 и/или IL18, или без них в ходе размножения, проявляют аналогичные профили персистенции в условиях in vivo, при этом такие сконструированные NK-клетки присутствуют на относительно постоянном уровне в крови (приблизительно 5-10%) на протяжении приблизительно 7 дней. И снова, измерение основано на обнаружении экспрессии сконструированного CAR и положительности по CD56, при этом процентную долю NK-клеток, присутствующих в крови животных, измеряли на протяжении ~50 дней, и данные таких измерений показаны на фиг. 30В. В отличие от аналогичных профилей на протяжении 7-дневного периода количество NK-клеток, размноженных без применения одного или более дополнительных стимулирующих факторов, начало снижаться после приблизительно 25-30 дней. Количество этих клеток продолжало медленно снижаться до приблизительно 48 дней, когда количество клеток стало приближаться к нулю. В тот же момент времени, составляющий приблизительно 25-30 дней, сконструированные NK-клетки, размноженные с дополнительными стимулирующими факторами (например, IL12 и/или IL18 согласно нескольким вариантам осуществления), продолжали присутствовать в крови на уровне приблизительно 10% на протяжении 45 дней. Только в последние три дня наблюдалось небольшое снижение (до приблизительно 5-7%). Эти данные определенно указывают на то, что применение одной или более дополнительных стимулирующих молекул, таких как IL12, IL18 и/или IL21, придает сконструированным NK-клеткам усиленную персистенцию в условиях in vivo по сравнению с NK-клетками, размноженными при культивировании без применения таких стимулирующих молекул. На фиг. 30С иным образом представлены данные персистенции, основанные на подсчете количества сконструированных CAR-экспрессирующих NK-клеток на 10000 живых подсчитанных клеток. Эти данные отражают общую тенденцию, показанную на фиг. 30В, то есть клетки, размноженные с применением одной или более стимулирующих молекул (например, растворимого IL12 и/или растворимого IL18), остаются в крови в больших количествах на протяжении более длительного периода по сравнению со сконструированными NK-клетками, размноженными без таких стимулирующих молекул. В нескольких вариантах осуществления способы, раскрытые в данном документе, являются особенно предпочтительными, потому что они не допускают цитокиновой зависимости, которая является обычной среди определенных способов размножения на основе цитокинов. В некоторых способах применение высоких концентраций растворимых цитокинов содействует росту клеток, но клетки растут, привыкая к таким концентрациям, и проявляют симптомы отмены (например, апоптоз, сниженную жизнеспособность или снижение других функций) при воздействии среды без таких искусственных условий, как, например, после введения пациенту. Отсутствие потребности в продолжающихся высоких концентрациях цитокинов, проявляемое сконструированными NK-клетками, размноженными согласно способам, раскрытым в данном документе, вносит по меньшей мере частичный вклад в более длительную продолжительность жизни (и продолжительность активной жизни) клеток в условиях in vivo.

[00121] На фиг. 31А-31С показаны дополнительные данные, характеризующие сконструированные NK-клетки, полученные согласно вариантам осуществления, раскрытым в данном документе. Эти данные собраны на основании исследования крови трех мышей (день 51 после введения), которым вводили свежие (не подвергнутые криоконсервации) сконструированные NK-клетки, экспрессирующие CD19-связывающий CAR и размноженные с использованием растворимого IL12 и растворимого IL18 согласно нескольким вариантам осуществления, раскрытым в данном документе. Данные изображают долю клеток в образце цельной крови, которые являются С056-положительными (указывает на NK-клетки) и CD19-Fc положительными (указывает на клетки, экспрессирующие сконструированный CD19-связывающий CAR). Как показано на каждой из фиг. 31А, 31В и 31С, доля двойных-положительных клеток (область в рамке в сверху справа) находится в диапазоне от приблизительно 4,75% до приблизительно 6,7%. На фиг. 32А-32С показан анализ цельной крови для тех же мышей, что и на фиг. 31, но идентифицированы клетки, которые являются CD19-Fc положительными (указывает на клетки, экспрессирующие сконструированный CD19-связывающий CAR) и CD3-положительными (указывает на Т-клетки). Эти данные демонстрируют, что подавляющее большинство клеток, экспрессирующих CD19-связывающий CAR, являются отрицательными по CD3, это означает, что они не являются Т-клетками. Согласно нескольким вариантам осуществления определенные способы получения NK-клеток действительно включают стадии удаления Т-клеток из первоначального образца цельной крови донора, однако ничтожное количество Т-клеток может оставаться. Однако в нескольких вариантах осуществления в соответствии с данными, показанными на фиг. 31А-32С, большинство сконструированных клеток, экспрессирующих CD19-связывающий CAR, проявляют признаки NK-клеток (CD56-положительные) и отсутствие признаков Т-клетки (CD3-отрицательные).

[00122] Фиг. 33, 34 и 35 относятся к данным, дополнительно характеризующим клетки из цельной крови животных в различные моменты времени после инокуляции опухоли. Фиг. 33 относится к данным в день 4 после введения, фиг. 34 относится к данным в день 12 после инокуляции опухоли, и фиг. 35 относится к данным в день 18 после инокуляции опухоли. Эти данные относятся к клеткам из цельной крови животных, обработанных как контрольные животные и получавших либо нетрансдуцированные NK-клетки (NT NK-клетки), либо PBS, или одной из других групп, которые получали сконструированные NK-клетки, размноженные с IL2 в культуре или IL12/18 в культуре, с группами обработки свежими и замороженными клетками для каждого условия. На фиг. 33А показана процентная доля NK-клеток (CD56-пол./CD3-отр.) из цельной крови животных в день 4. Каждая из групп обработки была относительно аналогична в этом отношении, при этом приблизительно 3-5% клеток в цельной крови являются сконструированными NK-клетками. На фиг. 33В показаны данные, относящиеся к процентной доле клеток, которые специфически экспрессируют неограничивающий вариант осуществления CD19-связывающего CAR. Прямо как на фиг. 33А, процентная доля клеток, экспрессирующих CD19-связывающий CAR, в каждой из групп обработки находится в диапазоне приблизительно 3-5%. На фиг. 33С показаны данные, относящиеся к процентной доле GFP-положительных опухолевых клеток, присутствующих в крови в день 4 после введения. В соответствии с BLI-визуализацией, показанной на предыдущих фигурах, наблюдалось небольшое обнаруживаемое присутствие опухолевых клеток в любой группе обработки. Может так случиться, что обнаруженный на низком уровне сигнал отражает миграцию GFP+опухолевых клеток из кровотока в различные ткани (что делает их потенциально обнаруживаемыми с помощью BLI-визуализации, но не в образце крови как таковом). На фиг. 34А-34С показаны соответствующие данные через 12 дней после инокуляции опухоли. Как это было в более раннем моменте времени, для каждой из групп обработки отмечалось, что приблизительно 3%-5% клеток крови в образце являлись NK-клетками (фиг. 34А). На фиг. 34В показана процентная доля клеток, положительных по конструкции CD19-связывающего CAR. Хотя уровни экспрессии были аналогичными для всех групп обработки в этот момент времени, каждая экспериментальная группа присутствовала на уровнях, заметно превышающих таковые у контрольных групп.Также через 12 дней процент клеток, экспрессирующих CD19-связывающий CAR (например, NK-клеток), был немного выше (приблизительно 7-9% от клеток крови), что свидетельствует о повышенной персистенции сконструированных клеток в кровотоке. На фиг. 34С показано количество опухолевых клеток в цельной крови. Что интересно, для всех групп показана небольшая экспрессия GFP, несмотря на то, что BLI-визуализация показала повышение люминесценции, особенно у контрольных групп. Опять же, эти данные могут отражать физиологическую «резидентность», которую проявляют определенные опухолевые клетки в суспензионном состоянии.

[00123] На фиг. 35А показана процентная доля NK-клеток (на основании положительности по CD56) через 18 дней после инокуляции опухоли. Для всех экспериментальных групп показаны заметно более высокие процентные доли по сравнению с контрольными группами, при этом значения для групп находились в диапазоне от приблизительно 15% до приблизительно 25% клеток в цельной крови. Это повышение процентной доли соответствовало временному интервалу повышения количества NK-клеток, как показано на фиг. 30В и 30С. Хотя в этом конкретном эксперименте эти данные не продемонстрировали статистическое отличие, они показали, что NK-клетки, размноженные в среде, содержащей IL12/IL18, и подвергнутые криоконсервации, характеризовались наибольшей пролиферацией у экспериментальных групп. Согласно нескольким вариантам осуществления фидерная клетка вместе с размножением на основе цитокина, в сочетании с криоконсервацией обеспечивают наиболее надежную NK-клетку, которая может выживать при более нормальных условиях обеспечения цитокинами (например, без добавления цитокинов) и может сохраняться в течение более длительных периодов времени в здоровом состоянии. На фиг. 35В и 35С показаны два измерения опухолевой нагрузки в день 18. На фиг. 35В показана процентная доля клеток в крови, которые являются положительными по CD19 (мишень для сконструированного CAR в этом неограничивающем варианте осуществления), как измерено с использованием антитела к CD19, связанного с РЕ. Эти данные показывают тенденцию в сторону повышения роста опухолевой нагрузки у контрольных групп, и, в отличие от этого, способность сконструированных NK-клеток из групп обработки ограничивать рост опухоли. На фиг. 35С показаны аналогичные данные, но полученные благодаря обнаружению сигнала GFP (например, с помощью BLI). Эти данные, хотя и отличаются от данных на фиг. 35 В вследствие разной чувствительности обнаружения с помощью РЕ в сравнении с GFP, показывают аналогичную тенденцию. Экспериментальные NK-клетки демонстрируют усиленную способность предотвращать размножение опухолевых клеток по сравнению с контрольными. Фиг. 35D относится к данным, касающимся количества NK-клеток, которые экспрессируют сконструированную CD19-связывающую молекулу (например, положительных по обоим CD56 и CD19-Fc). Аналогично данным, представленным на фиг. 35А, эти данные демонстрируют, что повышенная процентная доля NK-клеток в образце крови является NK-клетками, экспрессирующими сконструированный CD19-связывающий CAR, что отражает усиление их персистенции. На фиг. 35Е показаны данные, подтверждающие, что почти вся популяция NK-клеток из каждой экспериментальной группы, которые являются положительными по CAR, представляет собой NK-клетки, которые были сконструированы для экспрессии CD19-связывающего CAR, раскрытого в данном документе.

[00124] Для дополнительного исследования персистенции сконструированных NK-клеток, размноженных согласно вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, две дозы сконструированных NK-клеток, размноженных с использованием растворимых цитокинов, как раскрыто в данном документе, вводили мышам и количество клеток отслеживали на протяжении четырех дополнительных недель (протокол введения на основании фиг. 27А). На фиг. 36 показана диаграмма размаха для этих данных. Вкратце, по оси X диаграммы размаха представлено время в двух форматах: либо i) время после третьего введения, либо ii) общее время с момента инокуляции опухоли (показано в скобках). По оси Y представлено число NK-клеток, экспрессирующих CD19-связывающий CAR (на 10000 лейкоцитов). Диаграммы размаха для дозы с 2 миллионами NK-клеток представляют собой нижний ряд прямоугольников (показаны штриховкой), в то же время для дозы с 5 миллионами клеток представляют собой верхний ряд (показаны сплошной заливкой). Эти данные указывают, что период полужизни сконструированных NK-клеток, размноженных в условиях применений одной или более стимулирующих молекул (таких как IL12 и/или IL18) (в сочетании с фидерными клетками, как описано в нескольких вариантах осуществления в данном документе), увеличен по сравнению со сконструированными NK-клетками, размноженными в условиях присутствия только фидерных клеток. Период полужизни для дозы с 2 миллионами сконструированных NK-клеток составляет -15 дней. На основании дисперсии в одном или более из клиренса и/или объема распределения период полужизни для дозы с 5 миллионами сконструированных NK-клеток составляет -18 дней. Это отличает их от данных для дозы других сконструированных NK-клеток, размноженных без применения одной или более дополнительных стимулирующих молекул, которые показаны на фиг. 37 и указывают на период полужизни, составляющий -5 дней для дозы с 5 миллионами клеток. Таким образом, согласно нескольким вариантам осуществления, раскрытым в данном документе, размножение сконструированных NK-клеток с использованием одного или более дополнительных цитокинов в сочетании с системой фидерных клеток, обеспечивает повышенное размножение NK-клеток и придает таким клеткам усиленную персистенцию и/или цитотоксичность.

[00125] Предполагается, что можно выполнять различные комбинации или подкомбинации специфических признаков и аспектов вариантов осуществления, раскрытых выше, и при этом оставаться в рамках одного или более вариантов осуществления настоящего изобретения. Кроме того, раскрытие в данном документе любого конкретного признака, аспекта, способа, свойства, характеристики, качества, атрибута, элемента и т.п.в связи с вариантом осуществления может применяться во всех других вариантах осуществления, изложенных в данном документе. Соответственно, следует понимать, что различные признаки и аспекты раскрытых вариантов осуществления можно комбинировать или заменять друг другом с целью получения различных форм вариантов осуществления раскрытого изобретения. Таким образом, предполагается, что объем настоящего изобретения, раскрытого в данном документе, не должен ограничиваться конкретными раскрытыми вариантами осуществления, описанными выше. Более того, несмотря на то, что настоящее изобретение допускает различные модификации и альтернативные формы, его конкретные примеры были показаны с помощью графических материалов и подробно описаны в данном документе. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не должно ограничиваться конкретными раскрытыми формами или способами, но наоборот, настоящее изобретение должно охватывать все модификации, эквиваленты и альтернативные варианты, попадающие в рамки сущности и объема различных описанных вариантов осуществления и приложенных пунктов формулы изобретения. Любые раскрытые в данном документе способы не требуют выполнения в указанном порядке. Раскрытые в данном документе способы включают определенные действия, предпринимаемые практикующим специалистом; однако, они также могут включать любые сторонние инструкции по данным действиям, упомянутые либо напрямую, либо косвенным образом. Например, действия, такие как «введение популяции размноженных NK-клеток», включают «инструктаж по введению популяции размноженных NK-клеток». В дополнение, если признаки или аспекты настоящего изобретения описаны в терминах групп Маркуша, то специалисты в данной области техники будут понимать, что в настоящем изобретении, тем самым, описан любой отдельный представитель или подгруппа представителей группы Маркуша.

[00126] Раскрытые в данном документе диапазоны также охватывают любые возможные перекрытия, поддиапазоны и их комбинации. Такие выражения, как «до», «по меньшей мере», «более чем», «менее чем», «между» и т.п., включают в себя указанное число. Числа, которым предшествует такой термин, как «приблизительно» или «примерно», включают указанные числа. Например, «90%» включает «90%». В некоторых вариантах осуществления под последовательностью, характеризующейся по меньшей мере 95% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, подразумевают последовательности, которые на 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичны эталонной последовательности Кроме того, когда последовательность описана как «содержащая» нуклеотидную или аминокислотную последовательность, такое упоминание также должно включать, если не указано иное, что последовательность «содержит», «состоит из» или «состоит по сути из» указанной последовательности.

[00127] Термины в единственном числе могут означать «один или более чем один», если не указано противоположное или иное не очевидно из контекста. Фразу «и/или», применяемую в данном документе в описании и в пунктах формулы изобретения, следует понимать как означающую «один из или оба» из элементов, соединенных таким образом. Несколько элементов, перечисленных с помощью «и/или», следует толковать таким же образом, т.е. «один или более» из элементов, соединенных таким образом. Могут необязательно присутствовать другие элементы, отличные от элементов, специфически определенных с помощью условия «и/или». Применяемое в данном документе в описании и в пунктах формулы изобретения «или» следует понимать как имеющее такое же значение, как «и/или», определенное выше. Например, при применении в списке элементов «или» или «и/или» следует интерпретировать как включающее, т.е. включение по меньшей мере одного, но необязательно более чем одного из списка элементов и необязательно дополнительных неперечисленных элементов. Только термины, для которых четко указано противоположное, такие как «только один из» или «точно один из», будут относиться к включению точно одного элемента из ряда или списка элементов. Таким образом пункты формулы изобретения, которые включают «или» между одним или более представителями группы, считаются выполненными, если один, более чем один или все из представителей группы присутствуют, используются или иным образом относятся к данному продукту или процессу, если не указано противоположное. Представлены варианты осуществления, в которых точно один представитель группы присутствует, используется или иным образом относится к данному продукту или процессу. Представлены варианты осуществления, в которых более чем один или все из представителей группы присутствуют, используются или иным образом относятся к данному продукту или процессу. Любой один или более пунктов формулы изобретения могут быть откорректированы для явного исключения любого варианта осуществления, аспекта, признака, элемента или характеристики, или любой их комбинации. Любой один или более пунктов формулы изобретения могут быть откорректированы для исключения любого средства, композиции, количества, дозы, пути введения, типа клеток, мишени, клеточного маркера, антигена, нацеливающегося фрагмента или их комбинации.

[00128] В нескольких вариантах осуществления представлены аминокислотные последовательности, которые соответствуют любой из нуклеиновых кислот, раскрытых в данном документе, с учетом вырожденности генетического кода. Более того, предполагается, что те последовательности (будь то последовательность нуклеиновой кислоты или аминокислотная последовательность), которые отличаются от явным образом раскрытых в данном документе, но обладают функциональным сходством или эквивалентностью, также входят в объем настоящего изобретения. Вышеизложенное включает мутантные формы, усечения, замены или другие типы модификаций.

[00129] Любые заголовки или подзаголовки, применяемые в данном документе, предназначены для организационных целей и не должны применяться для ограничения объема вариантов осуществления, раскрытых в данном документе.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Нкарта, Инк.

<120> СПОСОБЫ И КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ УСИЛЕНИЯ РАЗМНОЖЕНИЯ И ЦИТОТОКСИЧНОСТИ

КЛЕТОК, ЯВЛЯЮЩИХСЯ НАТУРАЛЬНЫМИ КИЛЛЕРАМИ

<130> NKT.034WO

<150> 62/881311

<151> 2019-07-31

<150> 62/932342

<151> 2019-11-07

<160> 28

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 1797

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK45-1

<400> 1

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgttattca accaagaagt tcaaattccc ttgaccgaaa gttactgtgg cccatgtcct 120

aaaaactgga tatgttacaa aaataactgc taccaatttt ttgatgagag taaaaactgg 180

tatgagagcc aggcttcttg tatgtctcaa aatgccagcc ttctgaaagt atacagcaaa 240

gaggaccagg atttacttaa actggtgaag tcatatcatt ggatgggact agtacacatt 300

ccaacaaatg gatcttggca gtgggaagat ggctccattc tctcacccaa cctactaaca 360

ataattgaaa tgcagaaggg agactgtgca ctctatgcct cgagctttaa aggctatata 420

gaaaactgtt caactccaaa tacgtacatc tgcatgcaaa ggactgtgac cacgacgcca 480

gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc atcgcgtcgc agcccctgtc cctgcgccca 540

gaggcgtgcc ggccagcggc ggggggcgca gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt 600

gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt 660

atcacccttt actgccggag ggaccagagg ctgccccccg atgcccacaa gccccctggg 720

ggaggcagtt tccggacccc catccaagag gagcaggccg acgcccactc caccctggcc 780

aagatcagag tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtaccagca gggccagaac 840

cagctctata acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga 900

cgtggccggg accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg 960

tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc 1020

gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag 1080

gacacctacg acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gcggctctgg cgagggaagg 1140

ggttccctgc ttacttgcgg cgacgtcgaa gagaatcccg gtccgatggc cctcccagta 1200

actgccctcc ttttgcccct cgcactcctt cttcatgccg ctcgccccaa ctgggtcaac 1260

gtgattagcg atttgaagaa aatcgaggac cttatacagt ctatgcatat tgacgctaca 1320

ctgtatactg agagtgatgt acacccgtcc tgtaaggtaa cggccatgaa atgctttctt 1380

ctggagctcc aggtcatcag cttggagtct ggggacgcaa gcatccacga tacggttgaa 1440

aacctcatca tccttgcgaa caactctctc tcatctaatg gaaacgttac agagagtggg 1500

tgtaaggagt gcgaagagtt ggaagaaaaa aacatcaaag aatttcttca atccttcgtt 1560

cacatagtgc aaatgttcat taacacgtcc actaccacac ccgccccgag gccacctacg 1620

ccggcaccga ctatcgccag tcaacccctc tctctgcgcc ccgaggcttg ccggcctgcg 1680

gctggtgggg cggtccacac ccggggcctg gattttgcgt gcgatatata catctgggca 1740

cctcttgccg gcacctgcgg agtgctgctt ctctcactcg ttattacgct gtactgc 1797

<210> 2

<211> 599

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK45-5

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Leu Phe Asn Gln Glu Val Gln Ile Pro Leu Thr

20 25 30

Glu Ser Tyr Cys Gly Pro Cys Pro Lys Asn Trp Ile Cys Tyr Lys Asn

35 40 45

Asn Cys Tyr Gln Phe Phe Asp Glu Ser Lys Asn Trp Tyr Glu Ser Gln

50 55 60

Ala Ser Cys Met Ser Gln Asn Ala Ser Leu Leu Lys Val Tyr Ser Lys

65 70 75 80

Glu Asp Gln Asp Leu Leu Lys Leu Val Lys Ser Tyr His Trp Met Gly

85 90 95

Leu Val His Ile Pro Thr Asn Gly Ser Trp Gln Trp Glu Asp Gly Ser

100 105 110

Ile Leu Ser Pro Asn Leu Leu Thr Ile Ile Glu Met Gln Lys Gly Asp

115 120 125

Cys Ala Leu Tyr Ala Ser Ser Phe Lys Gly Tyr Ile Glu Asn Cys Ser

130 135 140

Thr Pro Asn Thr Tyr Ile Cys Met Gln Arg Thr Val Thr Thr Thr Pro

145 150 155 160

Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu

165 170 175

Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His

180 185 190

Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu

195 200 205

Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr

210 215 220

Cys Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly

225 230 235 240

Gly Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His

245 250 255

Ser Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala

260 265 270

Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu

275 280 285

Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp

290 295 300

Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu

305 310 315 320

Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile

325 330 335

Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr

340 345 350

Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met

355 360 365

Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu

370 375 380

Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val

385 390 395 400

Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro

405 410 415

Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile

420 425 430

Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His

435 440 445

Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln

450 455 460

Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu

465 470 475 480

Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val

485 490 495

Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile

500 505 510

Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn

515 520 525

Thr Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr

530 535 540

Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala

545 550 555 560

Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile

565 570 575

Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser

580 585 590

Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

595

<210> 3

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-1

<400> 3

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga tattcagatg acccagagcc cgagcagcct gagcgcgagc 120

gtgggcgatc gcgtgaccat tacctgccgc gcgagccagg atattagcaa atatctgaac 180

tggtatcagc agaaaccggg cggcaccgtg aaactgctga tttatcatac cagccgcctg 240

catagcggcg tgccgagccg ctttagcggc agcggcagcg gcaccgattt taccctgacc 300

attagcagcc tgcagccgga agatattgcg acctattatt gccagcaggg caacaccctg 360

ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg aaagcggccc gggcctggtg 480

aaaccgagcc agaccctgag cctgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gccggattat 540

ggcgtgagct ggattcgcca gccgccgggc aaaggcctgg aatggattgg cgtgatttgg 600

ggcagcgaaa ccacctatta taacagcgcg ctgaaaagcc gcctgaccat tagcaaagat 660

aacagcaaaa accaggtgag cctgaaactg agcagcgtga ccgcggcgga taccgcggtg 720

tattattgcg cgaaacatta ttattatggc ggcagctatg cgatggatta ttggggccag 780

ggcaccagcg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 4

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательсноть NK19H-без Flag-1

<400> 4

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 5

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-2

<400> 5

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga tattcagatg acccagagcc cgagcagcct gagcgcgagc 120

gtgggcgatc gcgtgaccat tacctgccgc gcgagccagg atattagcaa atatctgaac 180

tggtatcagc agaaaccggg cggcaccgtg aaactgctga tttatcatac cagccgcctg 240

catagcggcg tgccgagccg ctttagcggc agcggcagcg gcaccgattt taccctgacc 300

attagcagcc tgcagccgga agatattgcg acctattttt gccagcaggg caacaccctg 360

ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg aaagcggccc gggcctggtg 480

aaaccgagcc agaccctgag cctgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gccggattat 540

ggcgtgagct ggattcgcca gccgccgggc aaaggcctgg aatggattgg cgtgatttgg 600

ggcagcgaaa ccacctatta taacagcgcg ctgaaaagcc gcctgaccat tagcaaagat 660

aacagcaaaa accaggtgag cctgaaactg agcagcgtga ccgcggcgga taccgcggtg 720

tattattgcg cgaaacatta ttattatggc ggcagctatg cgatggatta ttggggccag 780

ggcaccagcg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 6

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-2

<400> 6

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 7

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-3

<400> 7

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga tattcagatg acccagagcc cgagcagcct gagcgcgagc 120

gtgggcgatc gcgtgaccat tacctgccgc gcgagccagg atattagcaa atatctgaac 180

tggtatcagc agaaaccgga tggcaccgtg aaactgctga tttatcatac cagccgcctg 240

catagcggcg tgccgagccg ctttagcggc agcggcagcg gcaccgatta taccctgacc 300

attagcagcc tgcagccgga agatattgcg acctattttt gccagcaggg caacaccctg 360

ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg aaagcggccc gggcctggtg 480

aaaccgagcc agaccctgag cctgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gccggattat 540

ggcgtgagct ggattcgcca gccgccgggc aaaggcctgg aatggattgg cgtgatttgg 600

ggcagcgaaa ccacctatta taacagcgcg ctgaaaagcc gcctgaccat tagcaaagat 660

aacagcaaaa accaggtgag cctgaaactg agcagcgtga ccgcggcgga taccgcggtg 720

tattattgcg cgaaacatta ttattatggc ggcagctatg cgatggatta ttggggccag 780

ggcaccagcg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 8

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-3

<400> 8

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 9

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-4

<400> 9

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga tattcagatg acccagagcc cgagcagcct gagcgcgagc 120

gtgggcgatc gcgtgaccat tacctgccgc gcgagccagg atattagcaa atatctgaac 180

tggtatcagc agaaaccggg cggcaccgtg aaactgctga tttatcatac cagccgcctg 240

catagcggcg tgccgagccg ctttagcggc agcggcagcg gcaccgattt taccctgacc 300

attagcagcc tgcagccgga agatattgcg acctattatt gccagcaggg caacaccctg 360

ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg aaagcggccc gggcctggtg 480

aaaccgagcc agaccctgag cctgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gccggattat 540

ggcgtgagct ggattcgcca gccgccgggc aaaggcctgg aatggctggg cgtgatttgg 600

ggcagcgaaa ccacctatta taacagcgcg ctgaaaagcc gcctgaccat tagcaaagat 660

aacagcaaaa gccaggtgag cctgaaactg agcagcgtga ccgcggcgga taccgcggtg 720

tattattgcg cgaaacatta ttattatggc ggcagctatg cgatggatta ttggggccag 780

ggcaccagcg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 10

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-4

<400> 10

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 11

<211> 2153

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-5

<400> 11

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga tattcagatg acccagagcc cgagcagcct gagcgcgagc 120

gtgggcgatc gcgtgaccat tacctgccgc gcgagccagg atattagcaa atatctgaac 180

tggtatcagc agaaaccggg cggcaccgtg aaactgctga tttatcatac cagccgcctg 240

catagcggcg tgccgagccg ctttagcggc agcggcagcg gcaccgattt taccctgacc 300

attagcagcc tgcagccgga agatattgcg acctattttt gccagcaggg caacaccctg 360

ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg agtcaggacc tggcctggtg 480

aaaccctcac agactctgtc cctgacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat 540

ggtgtaagct ggattcgcca gcctccaggt aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg 600

ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat ctccaaggac 660

aactccaaga gccaagtttc cttaaaatta agtagtgtta ctgctgctga cacagccgtc 720

tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggccaa 780

ggaacctcag tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcaga 1140

tctagcgcag acgcccccgc gtaccagcag ggccagaacc agctctataa cgagctcaat 1200

ctaggacgaa gagaggagta cgatgttttg gacaagagac gtggccggga ccctgagatg 1260

gggggaaagc cgagaaggaa gaaccctcag gaaggcctgt acaatgaact gcagaaagat 1320

aagatggcgg aggcctacag tgagattggg atgaaaggcg agcgccggag gggcaagggg 1380

cacgatggcc tttaccaggg tctcagtaca gccaccaagg acacctacga cgcccttcac 1440

atgcaggccc tgccccctcg cggctctggc gagggaaggg gttccctgct tacttgcggc 1500

gacgtcgaag agaatcccgg tccgatggcc ctcccagtaa ctgccctcct tttgcccctc 1560

gcactccttc ttcatgccgc tcgccccaac tgggtcaacg tgattagcga tttgaagaaa 1620

atcgaggacc ttatacagtc tatgcatatt gacgctacac tgtatactga gagtgatgta 1680

cacccgtcct gtaaggtaac ggccatgaaa tgctttcttc tggagctcca ggtcatcagc 1740

ttggagtctg gggacgcaag catccacgat acggttgaaa acctcatcat ccttgcgaac 1800

aactctctct catctaatgg aaacgttaca gagagtgggt gtaaggagtg cgaagagttg 1860

gaagaaaaaa acatcaaaga atttcttcaa tccttcgttc acatagtgca aatgttcatt 1920

aacacgtcca ctaccacacc cgccccgagg ccacctacgc cggcaccgac tatcgccagt 1980

caacccctct ctctgcgccc cgaggcttgc cggcctgcgg ctggtggggc ggtccacacc 2040

cggggcctgg attttgcgtg cgatatatac atctgggcac ctcttgccgg cacctgcgga 2100

gtgctgcttc tctcactcgt tattacgctg tactgctaag cggccgcgtc gac 2153

<210> 12

<211> 707

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-5

<400> 12

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

370 375 380

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

385 390 395 400

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

405 410 415

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

420 425 430

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

435 440 445

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

450 455 460

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

465 470 475 480

Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

485 490 495

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu

500 505 510

Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn

515 520 525

Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His

530 535 540

Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys

545 550 555 560

Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu

565 570 575

Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile

580 585 590

Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly

595 600 605

Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu

610 615 620

Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr

625 630 635 640

Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln

645 650 655

Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala

660 665 670

Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala

675 680 685

Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr

690 695 700

Leu Tyr Cys

705

<210> 13

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-6

<400> 13

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga catccagatg acacagagcc cgtcctccct gtctgcctct 120

gtgggagaca gagtcaccat cacctgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 180

tggtatcagc agaaaccaga cggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 240

cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta caccctcacc 300

attagcagcc tgcaaccgga agatattgcc acttacttct gccaacaggg taatacgctt 360

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagatcacag gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg agtcaggacc tggcctggtg 480

aaaccctcac agactctgtc cctgacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat 540

ggtgtaagct ggattcgcca gcctccaggt aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg 600

ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat ctccaaggac 660

aactccaaga gccaagtttc cttaaaatta agtagtgtta ctgctgctga cacagccgtc 720

tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggccaa 780

ggaacctcag tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 14

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-6

<400> 14

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 15

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-7

<400> 15

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga catccagatg acacagagcc cgtcctccct gtctgcctct 120

gtgggagaca gagtcaccat cacctgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 180

tggtatcagc agaaaccagg tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 240

cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagattt caccctcacc 300

attagcagcc tgcaaccgga agatattgcc acttactact gccaacaggg taatacgctt 360

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagatcacag gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg agtcaggacc tggcctggtg 480

aaaccctcac agactctgtc cgtgacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat 540

ggtgtaagct ggattcgcca gcctccaggt aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg 600

ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat ctccaaggac 660

aactccaaga gccaagtttc cttaaaatta agtagtgtta ctgctgctga cacagccgtc 720

tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggccaa 780

ggaacctcag tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 16

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-7

<400> 16

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 17

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-8

<400> 17

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga catccagatg acacagagcc cgtcctccct gtctgcctct 120

gtgggagaca gagtcaccat cacctgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 180

tggtatcagc agaaaccagg tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 240

cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagattt caccctcacc 300

attagcagcc tgcaaccgga agatattgcc acttacttct gccaacaggg taatacgctt 360

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagatcacag gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg agtcaggacc tggcctggtg 480

aaaccctcac agactctgtc cgtgacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat 540

ggtgtaagct ggattcgcca gcctccaggt aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg 600

ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat ctccaaggac 660

aactccaaga gccaagtttc cttaaaatta agtagtgtta ctgctgctga cacagccgtc 720

tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggccaa 780

ggaacctcag tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 18

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-8

<400> 18

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 19

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-9

<400> 19

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga catccagatg acacagagcc cgtcctccct gtctgcctct 120

gtgggagaca gagtcaccat cacctgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 180

tggtatcagc agaaaccaga cggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 240

cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta caccctcacc 300

attagcagcc tgcaaccgga agatattgcc acttacttct gccaacaggg taatacgctt 360

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagatcacag gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg agtcaggacc tggcctggtg 480

aaaccctcac agactctgtc cgtgacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat 540

ggtgtaagct ggattcgcca gcctccaggt aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg 600

ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat ctccaaggac 660

aactccaaga gccaagtttc cttaaaatta agtagtgtta ctgctgctga cacagccgtc 720

tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggccaa 780

ggaacctcag tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 20

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-9

<400> 20

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 21

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-10

<400> 21

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga tattcagatg acccagagcc cgagcagcct gagcgcgagc 120

gtgggcgatc gcgtgaccat tacctgccgc gcgagccagg atattagcaa atatctgaac 180

tggtatcagc agaaaccggg cggcaccgtg aaactgctga tttatcatac cagccgcctg 240

catagcggcg tgccgagccg ctttagcggc agcggcagcg gcaccgattt taccctgacc 300

attagcagcc tgcagccgga agatattgcg acctattatt gccagcaggg caacaccctg 360

ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg aaagcggccc gggcctggtg 480

aaaccgagcc agaccctgag cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gccggattat 540

ggcgtgagct ggattcgcca gccgccgcgc aaaggcctgg aatggctggg cgtgatttgg 600

ggcagcgaaa ccacctatta taacagcgcg ctgaaaagcc gcctgaccat tagcaaagat 660

aacagcaaaa gccaggtgag cctgaaaatg agcagcgtga ccgcggcgga taccgcgatt 720

tattattgcg cgaaacatta ttattatggc ggcagctatg cgatggatta ttggggccag 780

ggcaccagcg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 22

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-10

<400> 22

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 23

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-11

<400> 23

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga tattcagatg acccagagcc cgagcagcct gagcgcgagc 120

gtgggcgatc gcgtgaccat tacctgccgc gcgagccagg atattagcaa atatctgaac 180

tggtatcagc agaaaccggg cggcaccgtg aaactgctga tttatcatac cagccgcctg 240

catagcggcg tgccgagccg ctttagcggc agcggcagcg gcaccgattt taccctgacc 300

attagcagcc tgcagccgga agatattgcg acctattttt gccagcaggg caacaccctg 360

ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg aaagcggccc gggcctggtg 480

aaaccgagcc agaccctgag cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gccggattat 540

ggcgtgagct ggattcgcca gccgccgcgc aaaggcctgg aatggctggg cgtgatttgg 600

ggcagcgaaa ccacctatta taacagcgcg ctgaaaagcc gcctgaccat tagcaaagat 660

aacagcaaaa gccaggtgag cctgaaaatg agcagcgtga ccgcggcgga taccgcgatt 720

tattattgcg cgaaacatta ttattatggc ggcagctatg cgatggatta ttggggccag 780

ggcaccagcg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 24

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-11

<400> 24

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 25

<211> 2150

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19H-без Flag-12

<400> 25

gaattcgccg ccaccatggc cttaccagtg accgccttgc tcctgccgct ggccttgctg 60

ctccacgccg ccaggccgga tattcagatg acccagagcc cgagcagcct gagcgcgagc 120

gtgggcgatc gcgtgaccat tacctgccgc gcgagccagg atattagcaa atatctgaac 180

tggtatcagc agaaaccgga tggcaccgtg aaactgctga tttatcatac cagccgcctg 240

catagcggcg tgccgagccg ctttagcggc agcggcagcg gcaccgatta taccctgacc 300

attagcagcc tgcagccgga agatattgcg acctattttt gccagcaggg caacaccctg 360

ccgtatacct ttggcggcgg caccaaactg gaaattaccg gtggcggtgg ctcgggcggt 420

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctcaggtg cagctgcagg aaagcggccc gggcctggtg 480

aaaccgagcc agaccctgag cgtgacctgc accgtgagcg gcgtgagcct gccggattat 540

ggcgtgagct ggattcgcca gccgccgcgc aaaggcctgg aatggctggg cgtgatttgg 600

ggcagcgaaa ccacctatta taacagcgcg ctgaaaagcc gcctgaccat tagcaaagat 660

aacagcaaaa gccaggtgag cctgaaaatg agcagcgtga ccgcggcgga taccgcgatt 720

tattattgcg cgaaacatta ttattatggc ggcagctatg cgatggatta ttggggccag 780

ggcaccagcg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1020

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1080

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1140

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1200

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1260

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1320

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1380

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1440

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1500

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1560

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1620

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1680

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1740

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1800

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1860

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1920

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 1980

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2040

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2100

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2150

<210> 26

<211> 706

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19H-без Flag-12

<400> 26

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

50 55 60

Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

100 105 110

Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln

130 135 140

Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Thr

145 150 155 160

Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly

165 170 175

Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly

180 185 190

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

195 200 205

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Ser Leu Lys

210 215 220

Met Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys

225 230 235 240

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro

260 265 270

Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu

275 280 285

Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp

290 295 300

Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly

305 310 315 320

Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg Asp Gln

325 330 335

Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser Phe Arg

340 345 350

Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu Ala Lys

355 360 365

Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln

370 375 380

Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu

385 390 395 400

Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly

405 410 415

Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln

420 425 430

Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu

435 440 445

Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr

450 455 460

Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro

465 470 475 480

Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val

485 490 495

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu

500 505 510

Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val Asn Val

515 520 525

Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile

530 535 540

Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val

545 550 555 560

Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu

565 570 575

Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu

580 585 590

Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys

595 600 605

Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln

610 615 620

Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr Thr Thr

625 630 635 640

Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro

645 650 655

Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val

660 665 670

His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro

675 680 685

Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu

690 695 700

Tyr Cys

705

<210> 27

<211> 2210

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> ДНК NK19-1

<400> 27

ggatccgaat tcgccgccac catggcctta ccagtgaccg ccttgctcct gccgctggcc 60

ttgctgctcc acgccgccag gccggactac aaagacgatg acgataaagg cggtggtggc 120

tctggtggtg gcggcagcga catccagatg acacagacta catcctccct gtctgcctct 180

ctgggagaca gagtcaccat cagttgcagg gcaagtcagg acattagtaa atatttaaat 240

tggtatcagc agaaaccaga tggaactgtt aaactcctga tctaccatac atcaagatta 300

cactcaggag tcccatcaag gttcagtggc agtgggtctg gaacagatta ttctctcacc 360

attagcaacc tggagcaaga agatattgcc acttactttt gccaacaggg taatacgctt 420

ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gagatcacag gtggcggtgg ctcgggcggt 480

ggtgggtcgg gtggcggcgg atctgaggtg aaactgcagg agtcaggacc tggcctggtg 540

gcgccctcac agagcctgtc cgtcacatgc actgtctcag gggtctcatt acccgactat 600

ggtgtaagct ggattcgcca gcctccacga aagggtctgg agtggctggg agtaatatgg 660

ggtagtgaaa ccacatacta taattcagct ctcaaatcca gactgaccat catcaaggac 720

aactccaaga gccaagtttt cttaaaaatg aacagtctgc aaactgatga cacagccatt 780

tactactgtg ccaaacatta ttactacggt ggtagctatg ctatggacta ctggggccaa 840

ggaacctcag tcaccgtctc ctcaaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 900

cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 960

ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 1020

gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg ccggagggac 1080

cagaggctgc cccccgatgc ccacaagccc cctgggggag gcagtttccg gacccccatc 1140

caagaggagc aggccgacgc ccactccacc ctggccaaga tcagagtgaa gttcagcagg 1200

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500

caggccctgc cccctcgcgg ctctggcgag ggaaggggtt ccctgcttac ttgcggcgac 1560

gtcgaagaga atcccggtcc gatggccctc ccagtaactg ccctcctttt gcccctcgca 1620

ctccttcttc atgccgctcg ccccaactgg gtcaacgtga ttagcgattt gaagaaaatc 1680

gaggacctta tacagtctat gcatattgac gctacactgt atactgagag tgatgtacac 1740

ccgtcctgta aggtaacggc catgaaatgc tttcttctgg agctccaggt catcagcttg 1800

gagtctgggg acgcaagcat ccacgatacg gttgaaaacc tcatcatcct tgcgaacaac 1860

tctctctcat ctaatggaaa cgttacagag agtgggtgta aggagtgcga agagttggaa 1920

gaaaaaaaca tcaaagaatt tcttcaatcc ttcgttcaca tagtgcaaat gttcattaac 1980

acgtccacta ccacacccgc cccgaggcca cctacgccgg caccgactat cgccagtcaa 2040

cccctctctc tgcgccccga ggcttgccgg cctgcggctg gtggggcggt ccacacccgg 2100

ggcctggatt ttgcgtgcga tatatacatc tgggcacctc ttgccggcac ctgcggagtg 2160

ctgcttctct cactcgttat tacgctgtac tgctaagcgg ccgcgtcgac 2210

<210> 28

<211> 724

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<220>

<221> иной_признак

<223> АК-последовательность NK19-1

<400> 28

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

35 40 45

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

50 55 60

Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

65 70 75 80

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

85 90 95

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

100 105 110

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

115 120 125

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

130 135 140

Ile Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser

165 170 175

Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp

180 185 190

Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp

195 200 205

Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu

210 215 220

Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe

225 230 235 240

Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys

245 250 255

Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

260 265 270

Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg

275 280 285

Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg

290 295 300

Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly

305 310 315 320

Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr

325 330 335

Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Arg

340 345 350

Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly Gly Ser

355 360 365

Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser Thr Leu

370 375 380

Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr

385 390 395 400

Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg

405 410 415

Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met

420 425 430

Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu

435 440 445

Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys

450 455 460

Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu

465 470 475 480

Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu

485 490 495

Pro Pro Arg Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly

500 505 510

Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His Ala Ala Arg Pro Asn Trp Val

530 535 540

Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met

545 550 555 560

His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys

565 570 575

Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser

580 585 590

Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile

595 600 605

Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser

610 615 620

Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe

625 630 635 640

Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser Thr

645 650 655

Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser

660 665 670

Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly

675 680 685

Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp

690 695 700

Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile

705 710 715 720

Thr Leu Tyr Cys

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способам усиления размножения клеток, являющихся натуральными киллерами (NK) (варианты). В одном из вариантов указанный способ включает (a) совместное культивирование в культуральной среде популяции NK-клеток с популяцией фидерных клеток, содержащей клетки, сконструированные для экспрессии 4-1BBL и мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15); (b) обогащение культуральной среды интерлейкином-2 (IL2) и (c) обогащение культуральной среды по меньшей мере одним растворимым стимулирующим средством, представляющим собой комбинацию (i) растворимого интерлейкина-12 и растворимого интерлейкина-18 (IL18). Настоящее изобретение обеспечивает усиление размножения натуральных киллеров и их цитотоксичности против клеток-мишеней. 3 н. и 21 з.п. ф-лы, 37 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Способ усиления размножения клеток, являющихся натуральными киллерами (NK), включающий:

(a) совместное культивирование в культуральной среде популяции NK-клеток с популяцией фидерных клеток,

где популяция фидерных клеток содержит клетки, сконструированные для экспрессии 4-1BBL и мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15);

(b) обогащение культуральной среды интерлейкином-2 (IL2) и

(c) обогащение культуральной среды по меньшей мере одним растворимым стимулирующим средством, где по меньшей мере одно растворимое стимулирующее средство предусматривает комбинацию (i) растворимого интерлейкина-12 (IL12) в концентрации от 0,01 нг/мл до 8 нг/мл и (ii) растворимого интерлейкина-18 (IL18) в концентрации от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл.

2. Способ по п. 1, где среду в первый раз обогащают IL2 в концентрации менее чем 500 МЕ/мл.

3. Способ по п. 1 или 2, где среду в первый раз обогащают IL2 в концентрации менее чем 50 МЕ/мл.

4. Способ по любому из пп. 1–3, где культуральную среду во второй раз обогащают IL2 в концентрации, которая превышает концентрацию IL2 в культуральной среде, обогащенной в первый раз.

5. Способ по п. 4, где обогащение культуральной среды во второй раз выполняют в промежутке от 12 часов до 120 часов от обогащения культуральной среды в первый раз.

6. Способ по любому из пп. 1–5, где популяция фидерных клеток содержит клетки K562.

7. Способ по п. 6, где клетки K562 облучают перед совместным культивированием с популяцией NK-клеток.

8. Способ по любому из пп. 1–7, дополнительно включающий приведение популяции NK-клеток в контакт с вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR).

9. Способ по п. 8, где CAR выполнен с возможностью нацеливания на один или более из CD19, CD123, CD70, BCMA или лиганда рецептора натуральных киллеров группы D (NKG2D).

10. Способ по любому из пп. 1–9, где способ обеспечивает усиление персистенции NK-клеток по сравнению с персистенцией NK-клеток, совместно культивируемых с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства.

11. Способ по любому из пп. 1–10, где способ обеспечивает усиление цитотоксичности NK-клеток по сравнению с цитотоксичностью NK-клеток, совместно культивируемых с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства.

12. Способ по любому из пп. 4–11, где среду во второй раз обогащают IL2 до концентрации, составляющей менее чем 500 МЕ/мл.

13. Способ усиления размножения клеток, являющихся натуральными киллерами (NK), включающий:

(a) совместное культивирование в культуральной среде популяции NK-клеток с популяцией фидерных клеток, где популяция фидерных клеток содержит клетки, сконструированные для экспрессии 4-1BBL и мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15);

(b) обогащение культуральной среды интерлейкином-2 (IL2), растворимым интерлейкином-12 (IL12) и растворимым интерлейкином-18,

где культуральную среду обогащают (i) растворимым IL12 в концентрации от 0,01 нг/мл до 8 нг/мл и (ii) растворимым IL18 в концентрации от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл, и

(c) приведение популяции NK-клеток в контакт с вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR).

14. Способ по п. 13, где культуральную среду обогащают IL2 в концентрации менее чем 500 МЕ/мл.

15. Способ по п. 12 или 14, где культуральную среду обогащают IL2 в концентрации менее чем 50 МЕ/мл.

16. Способ усиления размножения клеток, являющихся натуральными киллерами (NK), включающий:

(a) совместное культивирование в культуральной среде популяции NK-клеток с популяцией фидерных клеток, при этом популяция фидерных клеток содержит клетки, сконструированные для экспрессии 4-1BBL и мембраносвязанного интерлейкина-15 (mbIL15);

(b) обогащение культуральной среды интерлейкином-2 (IL2);

(c) обогащение культуральной среды в первый момент времени по меньшей мере одним растворимым стимулирующим средством, где, в пределах 120 часов указанного совместного культивирования, по меньшей мере одно растворимое стимулирующее средство предусматривает комбинацию (i) интерлейкина-12 (IL12) в концентрации от 0,01 нг/мл до 8 нг/мл и (ii) интерлейкина-18 (IL18) в концентрации от 0,01 нг/мл до 30 нг/мл;

(d) обогащение культуральной среды во второй момент времени дополнительным количеством по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства;

где первый и второй момент времени разнесены на от более чем 12 часов до менее чем 120 часов, и

(e) совместное культивирование популяции NK-клеток с фидерными клетками в течение второго периода времени,

где способ приводит к усилению размножения NK-клеток по сравнению с совместным культивированием NK-клеток с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства.

17. Способ по п. 16, где популяция фидерных клеток содержит клетки K562.

18. Способ по п. 16 или 17, дополнительно включающий приведение популяции NK-клеток в контакт с вектором, кодирующим химерный антигенный рецептор (CAR).

19. Способ по п. 17, где клетки K562 облучают перед совместным культивированием с популяцией NK-клеток.

20. Способ по п. 18, где CAR выполнен с возможностью нацеливания на один или более из CD19, CD123, CD70, BCMA или лиганда рецептора натуральных киллеров группы D (NKG2D).

21. Способ по любому из пп. 16–20, где способ обеспечивает усиление персистенции NK-клеток по сравнению с персистенцией NK-клеток, совместно культивируемых с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства.

22. Способ по любому из пп. 16–20, где способ обеспечивает усиление цитотоксичности NK-клеток по сравнению с цитотоксичностью NK-клеток, совместно культивируемых с фидерными клетками в отсутствие по меньшей мере одного растворимого стимулирующего средства.

23. Способ по любому из пп. 16–22, где среду в первый раз обогащают IL2 до концентрации, составляющей менее чем 500 МЕ/мл.

24. Способ по любому из пп. 16–23, где культуральную среду во второй раз обогащают IL2 в концентрации, которая превышает концентрацию IL2 в культуральной среде, обогащенной в первый раз.