СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ Российский патент 1995 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и может быть использовано для выявления больных с аутоиммунной тромбоцитопенической пурпурой среди больных с заболеваниями крови, сопровождающимися тромбоцитопенией.

Наиболее близким к заявленному решению по совокупности признаков является способ диагностики аутоиммунной тромбоцитопении с использованием реакции Cimo P. L. и Lerber S. A. заключающийся в исследовании лизиса донорских тромбоцитов, меченных радиоактивным веществом. Согласно способу-прототипу сыворотку крови больного прогревают для инактивации комплемента при температуре 56^оС в течение 30 мин и смешивают с тромбоцитами донора, меченными ⁵¹Сr и обработанными 2%-ным раствором 2-аминоэтилизотиуро- ниумбромида. Параллельно с опытом ставят 6 контрольных проб, где вместо сыворотки больного вносят сыворотку 6 здоровых лиц. В опытную и контрольные пробы вносят плазму здоровых лиц в качестве источника комплемента. Инкубируют опытную и контрольную пробы в термостате при 37^оС в течение 2 ч, затем пробы центрифугируют, определяют радиоактивность осадка и надосадочной жидкости и вычисляют процент лизиса тромбоцитов в каждой пробе. Доказательством наличия антитромбоцитарных антител считается такой результат, где процент лизиса в опытной пробе превышает средний результат, полученный в контрольных пробах более, чем на 3 стандартных отклонения σ Использование способа-прототипа позволяет обеспечить точность диагностики 40%
Способ-прототип не позволяет обеспечить возможность использования специфического маркера наличия антимтромбоци- тарных антител с усиленной способностью комплементзависимого лизиса. Это обусловлено следующим. В указанном способе в качестве маркера наличия антитромбоцитарных антител служат нормальные тромбоциты донора. Известно, что при аутоиммунной тромбоцитопении титр антитромбоцитарных антител в сыворотке крови больного относительно низкий [1] При нормальной концентрации комплемента в сыворотке крови, как это предусмотрено методикой способа-прототипа, и при малом содержании антител не происходит (по мнению авторов заявленного решения) активации системы комплемента в степени, достаточной для того, чтобы вызвать лизис тромбоцитов. Это приводит к относительно высокой частоте ложноотрицательных реакций, что снижает точность диагностики. Кроме того, вследствие функционально-структурных нарушений тромбоцитов больных с аутоиммунной тромбоцитопенией к ним вырабатываются специфические антитела, которые могут не связываться с чужеродными (донорскими) нормальными тромбоцитами и не лизировать их. Это также приводит к возможности получения ложноотрицательных результатов. Методика способа-прототипа позволяет выявлять антитромбо- цитарные антитела к нормальным тромбоцитам, которые образуются как у больных с аутоиммунной тромбоцитопенией, так в ряде случаев у больных с заболеваниями крови, которым с лечебной или заместительной целью переливались препараты крови, содержащие тромбоциты. Это приводит к возможности получения ложноположительных результатов и обусловливает относительно низкую специфичность способа-прототипа. Невозможность использования в прототипе специфического маркера наличия антитромбоцитарных антител с усиленной способностью комплементзависимого лизиса приводит также к относительно большой длительности анализа, необходимости работы с радиоактивными веществами, требует взятия крови у доноров, что усложняет исследование, а иногда (при отсутствии донора) делает его невозможным.

Задачей изобретения является создание способа диагностики аутоиммунной тромбоцитопении, обеспечивающего возможность использования специфического маркера наличия антитромбоцитарных антител с усиленной способностью комплементзависимого лизиса.

Решение поставленной задачи достигается тем, что в способе диагностики аутоиммунной тромбоцитопении путем внесения комплемента в исследуемую кровь больного in vitro и определения лизиса тромбоцитов, согласно изобретению исследуемую цельную кровь больного делят на две части. В опытную пробу крови вносят в качестве источника комплемента нормальную кроличью сыворотку в соотношении 1:1, в контрольную пробу вносят растворитель, инкубируют обе пробы в термостате в течение 30 мин, затем определяют количество тромбоцитов в каждой пробе. При снижении их количества в опытной пробе на 30% и более по сравнению с контрольной диагностируют аутоиммунную тромбоцитопению.

Выбор оптимального соотношения кроличьей сыворотки, добавляемой к опытной пробе крови, при использовании заявляемого способа проводили путем исследования влияния различных соотношений кроличьей сыворотки и исследуемой крови больных и здоровых детей на точность диагностики. Были исследованы три группы детей:
1 группа больные с клинически подтвержденной аутоиммунной тромбоцитопенией 42 человека.

2 группа больные с ятрогенной тромбоцитопенией (больные лейкозом, леченные цитостатиками) 19 человек.

3 группа здоровые дети 32 человека.

Диагноз аутоиммунной тромбоцитопении подтверждали на основании комплекса клинико-морфологических данных [1] отсутствие признаков болезни в раннем детстве; отсутствие морфологических и лабораторных признаков, характерных для наследственных форм тромбоцитопений, в том числе и при морфологическом изучении биоптата костного мозга, анализов крови, функциональных свойств тромбоцитов; отсутствие клинических и лабораторных признаков болезни у кровных родственников; эффект кортикостероидной терапии, назначенной в достаточной дозе (с нередкими рецидивами в период отмены); обнаружение, если это возможно, антитромбоцитарных антител.

Зависимость точности диагностики аутоиммунной тромбоцитопении от соотношения объема исследуемой крови и кроличьей сыворотки показана в табл.1.

Из данных табл.1 видно, что именно соотношение объема исследуемой крови и кроличьей сыворотки 1: 1 обеспечивает наибольшую точность диагностики в группе больных с аутоиммунной тромбоцитопенией (1 группа) при отсутствии ложноположительных результатов в контрольных группах (2 и 3 группы).

Для выбора оптимального времени инкубации пробы крови в термостате исследовали различия процента лизиса тромбоцитов под влиянием комплемента у 2 групп лиц:
1 больные с аутоиммунной тромбоцитопенией (42 чел.);
2 здоровые дети (32 чел.).

Аутоиммунную тромбоцитопению диагностировали на основании комплекса клинико-морфологических данных [1]
Зависимость лизиса тромбоцитов от времени инкубации проб в термостате показана в табл.2.

Из данных табл.2 видно, что оптимальным временем инкубации проб крови в термостате является 30 мин, так как увеличение этого времени не приводит к повышению точности диагностики, а снижение времени инкубации меньше 30 мин приводит к снижению точности диагностики.

Для выявления интервала прогностически значимых различий количества тромбоцитов в опытной и контрольной пробах, обеспечивающих наибольшую точность диагностики, с использованием заявленного способа были обследованы три группы лиц:
1 группа больные с клинически подтвержденной аутоиммунной тромбоцитопенией 42 чел.

2 группа больные с ятрогенной тромбоцитопенией (больные лейкозом, леченные цитостатиками) 19 чел.

3 группа здоровые дети 32 чел.

Аутоиммунную тромбоцитопению диагностировали на основании комплекса клинико-морфологических данных [1]
Результаты исследований диагностической значимости различий количества тромбоцитов в опытной и контрольной пробах при использовании заявленного способа даны в табл.3.

Из данных табл.3 следует, что диагностически значимым является различие количества тромбоцитов в контрольной и опытной пробах, равное 30% и более, т. к. при этих значениях достигается максимальное количество подтвержденных клиническими наблюдениями положительных результатов при отсутствии ложноположительных результатов в контрольных группах.

Для доказательства специфичности заявленного способа и его большей точности по сравнению с прототипом были обследованы следующие группы лиц:
1 больные с клинически подтвержденной аутоиммунной тромбоцитопенией (42 чел.);
2 больные с тромбоцитопатиями (12 чел.);
3 больные с ятрогенной тромбоцитопенией (больные лейкозом, леченные цитостатиками) 19 чел.

4 больные с гипопластической анемией 9 чел.

5 здоровые дети 32 чел.

Диагноз тромбоцитопатий и аутоиммунной тромбоцитопении устанавливали на основании комплекса клинико-морфологических данных, а диагноз лейкоза и гипопластической анемии на основании изучения биоптатов костного мозга и клинических методов. В исследуемых группах выявляли истинные, ложноположительные и ложноотрицательные результаты. При этом под истинной реакцией понимали диагнос- тируемую с помощью заявленного способа аутоиммунную тромбоцитопению, подтвержденную комплексом клинико-морфологических данных. Под ложноположительной понимали диагностируемую заявленным способом аутоиммунную тромбоцитопению, не подтвержденную комплексом клинико-морфологических данных. Под ложноотрицательной понимали аутоиммунную тромбоцитопению, установленную с помощью комплекса клинико-морфологических данных, в случае, когда заявленный способ дал отрицательный результат. Результаты представлены в табл.4.

Из приведенных данных табл.4 видно, что заявляемый способ является высокоспецифичным, так как не дает ложноположительных результатов при очень низкой частоте ложноотрицательных результатов.

Достижение обеспечиваемого изобретением технического результата обусловлено следующим. Авторами заявленного решения впервые выявлено, что тромбоциты больных с аутоиммунной тромбоцитопенией обладают повышенной способностью к лизису в избытке комплемента, в качестве которого используется кроличья сыворотка, содержание комплемента в которой намного выше, чем в человеческой. Это подтверждается данными табл.1. В условиях, когда объем крови превышает объем кроличьей сыворотки, концентрация комплемента видимо недостаточна для взаимодействия со всеми антителами, сорбированными на тромбоцитах, что приводит к возможности получения ложноотрицательных результатов. По мнению авторов заявленного решения, при соотношении крови и кроличьей сыворотки 1:1 создается избыток комплемента, оптимальный для реализации литического потенциала антитромбоцитарных антител. При избытке кроличьей сыворотки с превышением оптимального соотношения иммуноглобулины, содержащиеся в ней, вероятно оказывают протективное действие в отношении тромбоцитов и препятствуют их лизису, несмотря на избыток комплемента, поскольку известно защитное действие иммуноглобулинов в отношении тромбоцитов, что используется для лечения больных с аутоиммунной тромбоцитопенией. При этом также возрастает возможность получения ложноотрицательных результатов. Усиление способности антителозависимого лизиса у тромбоцитов больных аутоиммунной тромбоцитопенией в избытке комплемента, по-видимому, может быть обусловлено наличием у этих тромбоцитов специфических функционально-структурных изменений, не присущих нормальным тромбоцитам донора. Проведение анализа цельной крови, где большинство антител сорбировано на тромбоцитах, в условиях избытка комплемента, когда проявляется повышенная способность измененных тромбоцитов к антителозависимому лизису, обеспечивает возможность выявления антитромбоцитарных антител даже при их низком титре в сыворотке крови, что приводит к сокращению количества ложноотрицательных результатов и повышению точности диагностики. Предложенный способ позволяет выявлять специфические антитела, которые вырабатываются, по мнению авторов заявленного решения, только у больных с аутоиммунной тромбоцитопенией и связываются с измененными тромбоцитами этих больных, которые используются в качестве специфического маркера, что также снижает возможность получения ложноотрицательных результатов и практически исключает возможность получения ложноположительных результатов, способствуя тем самым повышению точности и специфичности диагностики. Проведение исследования в условиях оптимального избытка комплемента, способствующих ускоренному лизису тромбоцитов, позволяет сократить время диагностической процедуры.

Таким образом, именно заявленная совокупность выполнения действий в ходе диагностической процедуры (в частности, проведение реакции в оптимальном избытке комплемента) позволяет использовать тромбоциты больных аутоиммунной тромбоцитопенией в качестве специфического маркера наличия антитромбоцитарных антител, а также создать условия для проявления ими свойства (повышенной способности к лизису), обеспечивающего повышение точности и специфичности диагностики.

Способ осуществляют следующим образом.

У больного утром натощак берут 0,1 мл крови из пальца в пробирку, содержащую 0,01 мл 5% -ного раствора этилендиаминтетраацетата (ЭДТА). Пробирку встряхивают для смешивания крови с антикоагулянтом и отбирают 0,04 мл крови в контрольную пробирку и 0,04 мл в опытную. В контрольную пробирку добавляют 0,04 мл физраствора, в опытную 0,04 мл кроличьей сыворотки (соотношение крови и кроличьей сыворотки 1:1). Обе пробирки помещают в термостат при температуре 37^оС на 30 мин. По окончании срока инкубации пробирки вынимают из термостата и добавляют в обе пробирки по 4 мл 1%-ного раствора оксалата аммония. С помощью камеры Горяева подсчитывают под микроскопом число тромбоцитов в 1 мм³ в контрольной и опытной пробах и определяют на сколько процентов количество тромбоцитов в опытной пробе меньше, чем в контрольной по формуле:
100% где Т_контр. количество тромбоцитов в 1 мм³ в контрольной пробе;
Т_опытн. количество тромбоцитов в 1 мм³ в опытной пробе. При снижении числа тромбоцитов в опытной пробе на 30% и более по сравнению с контрольной диагностируют аутоиммунную тромбоцитопению.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами:
П р и м е р 1.

Больной Сергей К. 8 лет, ИБ N 1863, поступил в больницу N 1 г. Л-да с диагнозом "носовое кровотечение". Из анамнеза болезни известно, что носовое кровотечение началось вечером предыдущего дня без каких-либо провоцирующих факторов и продолжалось ночь и утро последующего дня. Попытки остановить кровотечение тампонами с перекисью водорода и передней тампонадой носа были безуспешными, в связи с чем ребенок направлен в больницу. В течение 2 последних лет мать замечала образование большого количества синяков на теле ребенка без видимых причин. При поступлении количество тромбоцитов в анализе крови составляло 10х10⁹/л. Заподозрена аутоиммунная тромбоцитопения. Антитромбоцитарные антитела попытались выявить с помощью методики, изложенной в способе-прототипе [1] У больного утром натощак взяли 1 мл крови из вены. Кровь оставили на 2 ч при температуре 37^оС, затем отцентрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 мин, отделили сыворотку и прогрели ее при 56^оС в течение 30 мин. Затем в опытной пробирке смешивали 0,05 мл этой сыворотки с 0,02 мл взвеси тромбоцитов донора, меченных ⁵¹Сr и обработанных 2%-ным раствором 2-аминоэтилизотиурониумбромида (концентрация тромбоцитов 100000 в мм³) и 0,1 мл свежей бестромбоцитарной плазмы донора, используемой в качестве источника комплемента и 0,025 мл 0,01 М хлорида магния. В 6 контрольные пробирки вместо сыворотки больного вносили по 0,05 мл сыворотки 6 разных здоровых лиц, прогретой при 56^оС в течение 30 мин. Опытную и контрольные пробирки инкубировали 2 ч при 37^оС. После этого все пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 25 мин и определяли радиоактивность надосадочной жидкости и осадка тромбоцитов в каждой пробирке и вычисляли процент лизиса тромбоцитов, который составил,
в контрольных пробирках N 1-3
N 2-2
N 3-5
N 4-5
N 5-4
N 6-3
Средний результат (М)=3,67%
Стандартное отклонение от среднего результата в контрольных пробирках (σ ) 1,19.

М+3 σ3,67+1,19х3=7,24%
в опытной пробирке 6.

При сравнении результата опыта и контроля получили:
6%<7,24% Таким образом, результаты теста были отрицательны, т.к. процент лизиса в опытной пробирке не превышал средний результат, полученный в контрольных пробирках, более чем на 3 стандартных отклонения. В данном случае методика способа-прототипа не позволила выявить антитромбоцитарные антитела.

Для выявления антитромбоцитарных антител был также использован заявленный способ. У больного утром натощак взяли 0,1 мл крови из пальца в пробирку, содержащую 0,01 мл 5%-ного раствора ЭДТА. Пробирку встряхнули для смешивания крови с антикоагулянтом и отобрали 0,04 мл крови в контрольную пробирку и 0,04 мл в опытную. В контрольную пробирку добавили 0,04 мл физраствора, в опытную 0,04 мл кроличьей сыворотки. Обе пробирки поместили в термостат при 37^оС на 30 мин. По окончании срока инкубации пробирки вынули из термостата и добавили в обе пробирки по 4 мл 1%-ного раствора оксалата аммония. С помощью камеры Горяева подсчитали число тромбоцитов в обеих пробах, которое составило в контрольной пробе 10,5х10⁹/л, а в опытной 3,4х10⁹/л, т.е. в опытной пробе тромбоцитов было на 67% меньше, чем в контрольной:
100%67% Таким образом, с помощью заявленного способа была диагностирована аутоиммунная тромбоцитопения.

Для подтверждения диагноза аутоиммунной тромбоцитопении было проведено контрольное комплексное обследование по клинико-морфологическим критериям, изложенным в литературе, с последующим наблюдением за ребенком в течение 2 лет. При этом было установлено следующее.

В раннем детстве у ребенка признаки заболевания отсутствовали; при обследовании ребенка, его анализов крови, миелограммы, функциональных свойств тромбоцитов не выявлено морфологических и лабораторных признаков, характерных для наследственных форм тромбоцитопений; при обследовании матери, отца и старшего брата, а также при сборе семейного анамнеза не выявлено клинических и лабораторных признаков сходных болезней; ремиссию у данного больного удалось достичь при назначении преднизолона в дозе 3 мг/кг/сутки с последующим переводом на поддерживающую дозу 7,5 мг/сутки. При попытке дальнейшего снижения дозы отмечено падение числа тромбоцитов и появление синяков на теле. Результаты контрольного обследования свидетельствовали о наличии аутоиммунной тромбоцитопении. Таким образом, диагноз аутоиммунной тромбоцитопении, поставленный с помощью заявленного способа, был подтвержден контрольным комплексным обследованием, в то время как способ-прототип дал отрицательный результат.

П р и м е р 2.

При скриннинговом обследовании с использованием заявленного способа (аналогично примеру 1) 87 детей из зоны Чернобыльской аварии у мальчика Антона С. 13 лет был выявлен положительный результат анализа: в контрольной пробе тромбоцитов 180х10⁹/л, в опытной 126х10⁹/л, т.е. на 30% меньше, чем в контрольной. У ребенка заподозрена аутоиммуння тромбоцитопеническая пурпура. При сборе анамнеза оказалось, что в течение последнего года у мальчика отмечено обилие синяков, а 6 месяцев назад отмечалось длительное (в течение 4 суток) кровотечение из лунки зуба, которое лечили амбулаторно. При обследовании мальчика с помощью способа-прототипа аналогично примеру 1 получен положительный результат в опытной пробе лизис тромбоцитов равнялся 16% в контрольных (М + 3 σ) 7,3% при клиническом наблюдении за ребенком в течение года подтвержден диагноз аутоиммунной тромбоцитопении. Через 3 месяца после обследования появилась обильная петехиальная сыпь на теле, синяки, в анализе крови снижение тромбоцитов до 20х10⁹/л. Ремиссия с подъемом количества тромбоцитов до нормы достигнута при назначении преднизолона. Биоптат костного мозга без патологии. Таким образом, диагноз аутоиммунной тромбоцитопении подтвержден с помощью заявленного способа, а также с помощью способа-прототипа и контрольного комплексного клинико-морфологического обследования.

П р и м е р 3.

Больная Марина Ц. 14 лет, ИБ N 12814 поступила в больницу с диагнозом "тромбоцитопеническая пурпура" с жалобами на носовое кровотечение, боли в горле. Заболела 2 недели назад, появились боли в горле, температура повысилась до 38^оС. Лечилась эритромицином. Накануне поступления в больницу вечером возникло носовое кровотечение, которое удалось остановить через 4 ч с помощью передней тампонады носа. В анализе крови тромбоциты 24х10⁹/л. С помощью методики прототипа [1] проверили аналогично примеру 1 аутоиммунный генез тромбоцитопении. Тест оказался положительным в опытной пробирке лизис тромбоцитов составил 29% в контрольных (М+3 σ) 7,8% т.е. процент лизиса в опытной пробирке превысил средний результат контроля более, чем на 3 стандартных отклонения. С помощью заявленного способа проведен анализ аналогично примеру 1, аутоиммунный характер тромбоцитопении подтвердить не удалось: в контрольной пробе количество тромбоцитов составило 22х10⁹/л, в опытной 20х10⁹/л, таким образом в опытной пробе тромбоцитов было всего на 9% меньше, чем в контрольной, т.е. тест был отрицательным. Диагноз аутоиммунной тромбоцитопении не подтвержден и клинически: при биопсии костного мозга выявлена резкая гипоплазия всех 3 ростков кроветворения и поставлен диагноз гипопластической анемии. Клиническое улучшение с подъемом количества тромбоцитов до нормы удалось достичь с помощью антилимфоцитарного глобулина. Таким образом, способ, изложенный в прототипе, дал ложноположительный результат, а отрицательный результат заявленного способа совпал с данными клинического и лабораторного обследования этой больной.

С использованием заявленного способа было проведено скриннинговое обследование 126 детей с заболеваниями системы крови. Все дети на второй день после поступления были обследованы с помощью заявленного способа и способа-прототипа [1] Для подтверждения диагноза аутоиммунной тромбоцитопении проводили контрольное комплексное обследование по клинико-морфологическим критериям в динамике. Диагноз острого лейкоза и гипопластической анемии ставили на основе результатов исследования морфологии биоптатов костного мозга. Контрольное комплексное обследование позволило выявить в рассматриваемой группе 68 детей с аутоиммунной тромбоцитопенией, 21 ребенка с тромбоцитопатиями, 18 с острым лейкозом, и 19 детей с гипопластической анемией. Кроме того, проводили хронометрирование диагностической процедуры при использовании заявленного способа и способа-прототипа. Результаты сравнения эффективности заявленного способа и способа-прототипа представлены в табл.5.

Из данных табл.5 видно, что использование заявленного способа позволяет обеспечить повышение точности диагностики аутоиммунной тромбоцитопении в 2,5 раза (97% против 40%). Кроме того, заявленный способ не дает ложноположительных результатов при тромбоцитопениях иного генеза, тогда как при обследовании по методике способа-прототипа были получены ложноположительные результаты у 10 детей (5 детей с тромбоцитопатиями, 3 с острым лейкозом, 2 с гипопластической анемией), что составило 17% от количества обследованных детей с заболеваниями крови неаутоиммунного генеза. Это свидетельствует о большей специфичности заявленного способа по сравнению с прототипом. Кроме того, из табл. 5 следует, что при осуществлении заявленного способа затраты времени на проведение анализа сокращаются в 18 раз.

Таким образом, заявленный способ при его реализации обеспечивает возможность использования специфического маркера наличия антитромбоцитарных антител с усиленной способностью комплементза- висимого лизиса. Это приводит к повышению точности (в 2,5 раза) и специфичности диагностики по сравнению со способом-прототипом, а также позволяет в 18 раз сократить время на проведение анализа. Заявленный способ не требует применения дорогостоящих радиоактивных реактивов и аппаратуры для измерения радиоактивности, не предполагает взятия крови у доноров, что делает его общедоступным и применимым в любой лаборатории.

Использование: в медицине, а именно в гематологии для выявления больных с аутоиммунной тромбоцитопенической пурпурой среди больных с заболеваниями крови, сопровождающимися тромбоцитопениями. Сущность изобретения: исследуемую кровь больного in vitro делят на две равные части. В опытную пробу крови вносят в качестве источника комплемента нормальную кроличью сыворотку в соотношении 1 : 1, в контрольную пробу вносят растворитель, например физраствор, инкубируют обе пробы в термостате в течение 30 мин, затем определяют количество тромбоцитов в каждой пробе. При снижении их количества в опытной пробе на 30% и более по сравнению с контролем диагностируют аутоиммунную тромбоцитопению. Способ позволяет повысить точность диагностики в 2,5 раза и ее специфичность, а также сократить время исследования. 5 табл.

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННОЙ ТРОМБОЦИТОПЕНИИ путем внесения комплемента в исследуемую кровь больного in vitro и определения лизиса тромбоцитов, отличающийся тем, что исследуемую цельную кровь больного делят на две части, в опытную пробу вносят в качестве источника комплемента нормальную кроличью сыворотку в соотношении 1:1, в контрольную пробу вносят растворитель, инкубируют обе пробы в термостате в течение 30 мин, затем определяют количество тромбоцитов в каждой пробе и при снижении их количества в опытной пробе на 30% и более по сравнению с контрольной диагностируют аутоиммунную тромбоцитопению.