ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Данное изобретение относится к применению антисмысловых олигомеров для лечения, предотвращения или ослабления эффектов пигментного ретинита.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Пигментный ретинит (ПР) представляет собой дегенеративное заболевание глаз, которое вызывает серьезное ухудшение зрения из-за прогрессирующей дегенерации палочковидных фоторецепторных клеток в сетчатке; большинство случаев ПР передаются по наследству. Эта форма дистрофии сетчатки проявляет начальные симптомы независимо от возраста; таким образом, диагноз ПР встречается повсеместно, от раннего детства до пожилого возраста. ПР представляет собой редкое заболевание, которым страдает около один из 4000 индивидуумов (более 1,5 миллиона человек во всем мире). 30%-40% семейных случаев ПР демонстрируют аутосомно-доминантное генетическое наследование (Hartong et al. 2006). В настоящее время не существует лечения ПР.
[0003] ПР вызывается мутациями более чем в 50 генах. Гетерозиготные мутации в гене PRPF31 вызывают аутосомно-доминантный пигментный ретинит (адПР). В некоторых случаях такие мутации демонстрируют неполную пенетрантность, когда у одних носителей развивается дегенерация сетчатки, а у других симптомы полностью отсутствуют. Бессимптомные носители защищены от заболевания выше средней экспрессией не мутировавшего аллеля PRPF31.
[0004] Экспрессия гена PRPF31 контролируется комплексом деаденилазы Ccr4-Not. Ccr4-Not представляет собой белковый комплекс из девяти субъединиц, который является главным регулятором трансляции и стабильности мРНК в эукариотических клетках. Основной CCR4-Not комплекс состоит из Ccr4p, Caf1p, пяти Not белков (CNot1-CNot5), Caf40p и Caf130p в дрожжах.
[0005] В настоящее время опосредованная AAV замена гена и редактирование гена CRISPR/Cas9 изучаются как способы лечения заболеваний сетчатки. Хотя кодирующая последовательность PRPF31 находится в пределах емкости векторов AAV, последствия нерегулируемой экспрессии или сверхэкспрессии PRPF31 неизвестны. Кроме того, неизвестно, можно ли повторно назначать вирус-опосредованную генную терапию для глазных заболеваний, поскольку сообщалось о сероконверсии как следствие внутриглазной инъекции вирусного вектора. Кроме того, для коррекции гена CRISPR/Cas9 потребуется отдельный продукт для мутации PRPF31 в каждой семье. Кроме того, эти подходы, такие как замещение генов, и редактирование генов требуют субретинальной инъекции вирусных векторов для достижения адекватной трансфекции.
[0006] Существует необходимость в разработке новых способов лечения или профилактики пигментного ретинита; или по меньшей мере в предложении способов, дополняющих ранее известные способы лечения.
[0007] Данное изобретение направлено на обеспечение улучшенного или альтернативного способа лечения, предотвращения или ослабления эффектов пигментного ретинита
[0008] Предыдущее обсуждение уровня техники предназначено только для облегчения понимания данного изобретения. Данное обсуждение не является подтверждением или признанием того, что какой-либо из упомянутых материалов является или являлся частью общеизвестных знаний на дату приоритета заявки.
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0009] В целом, согласно одному аспекту данного изобретения предлагается выделенный или очищенный антисмысловой олигомер для модификации сплайсинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3 или его части. Предпочтительно предлагается выделенный или очищенный антисмысловой олигомер для индукции непродуктивного сплайсинга в транскрипте гена CNOT3 или его части.
[0010] Например, в одном аспекте данного изобретения предлагается антисмысловой олигомер из 10-50 нуклеотидов, содержащий нацеливающую последовательность, комплементарную области рядом или внутри интрона транскрипта гена CNOT3 или его части. В другом аспекте данного изобретения предлагается антисмысловой олигомер из 10-50 нуклеотидов, содержащий нацеливающую последовательность, комплементарную области рядом или внутри экзона транскрипта гена CNOT3 или его части.
[0011] Предпочтительно антисмысловой олигомер представляет собой фосфородиамидатный морфолиноолигомер. Предпочтительно антисмысловой олигомер имеет модифицированный остов.
[0012] Предпочтительно антисмысловой олигомер выбран из группы, включающей последовательности, представленные в Таблице 1.
[0013] Предпочтительно антисмысловой олигомер выбран из списка, включающего: SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67 еще более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64.
[0014] Антисмысловой олигомер предпочтительно действует, вызывая пропуск одного или более экзонов транскрипта гена CNOT3 или его части. Например, антисмысловой олигомер может вызывать пропуск экзонов 3, 8, 9, 12 и/или 17.
[0015] Антисмысловой олигомер по данному изобретению может быть выбран как антисмысловой олигомер, способный связываться с выбранным целевым сайтом CNOT3, причем целевой сайт представляет собой сайт сплайсинга мРНК, выбранный из донорного сайта сплайсинга, акцепторных сайтов сплайсинга или экзонных элементов сплайсинга. Целевой сайт может также включать некоторые фланкирующие интронные последовательности, когда олигомер нацелен на донорные или акцепторные сайты сплайсинга.
[0016] Более конкретно, антисмысловой олигомер может быть выбран из группы, состоящей из любой одной или более из SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, еще более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64, и/или последовательностей, представленных в Таблице 1, и их комбинаций или коктейлей. В группу входят последовательности, которые могут гибридизоваться с такими последовательностями в строгих условиях гибридизации, последовательности, комплементарные им, последовательности, содержащие модифицированные основания, модифицированные остовы и их функциональные усечения или удлинения, которые обладают или модулируют активность процессинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые олигомеры могут быть на 100% комплементарны целевой последовательности или могут включать ошибки спаривания, например, для размещения вариантов, при условии, что гетеродуплекс, образованный между олигонуклеотидом и целевой последовательностью, достаточно стабилен, чтобы противостоять действию клеточных нуклеаз и другим сценариям деградации, происходящей in vivo. Следовательно, определенные олигонуклеотиды могут иметь около или по меньшей мере около 70% комплементарности последовательностей, например, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарности последовательности между олигонуклеотидом и целевой последовательностью.
[0017] Данное изобретение распространяется также на комбинацию двух или более антисмысловых олигомеров, способных связываться с выбранной мишенью для индукции исключения экзона в транскрипте гена CNOT3, включая конструкцию, содержащую два или более таких антисмысловых олигомера. Конструкцию можно использовать для терапии на основе антисмысловых олигомеров.
[0018] Изобретение распространяется, согласно еще одному его аспекту, на кДНК или клонированные копии антисмысловых олигомерных последовательностей по изобретению, а также на векторы, содержащие антисмысловые олигомерные последовательности по изобретению Данное изобретение также распространяется на клетки, содержащие такие последовательности и/или векторы.
[0019] Также предлагается способ управления сплайсингом в транскрипте гена CNOT3, включающий этап:
a) предоставления одного или более антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе, и обеспечения связывания олигомера(ов) с сайтом целевой нуклеиновой кислоты.
[0020] Также предложена фармацевтическая, профилактическая или терапевтическая композиция для лечения, предотвращения или ослабления эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3, у пациента, причем композиция содержит:
a) один или более антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе, и
b) один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей.
[0021] Данная композиция может содержать от около 1 нМ до 1000 нМ каждого из желаемых антисмысловых олигомеров по данному изобретению. Предпочтительно данная композиция может содержать от около 10 нМ до 500 нМ, наиболее предпочтительно от 1 нМ до 10 нМ каждого из антисмысловых олигомеров по данному изобретению.
[0022] Также предлагается способ лечения, предотвращения или ослабления эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3, включающий этап:
a) введение пациенту эффективного количества одного или более антисмысловых олигомеров или фармацевтической композиции, содержащей один или более антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе.
[0023] Также предлагается применение очищенных и выделенных антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе, для производства лекарственного средства для лечения, предотвращения или ослабления эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3.
[0024] Также предлагается набор для лечения, предотвращения или ослабления эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3 у пациента, который включает, по меньшей мере антисмысловой олигомер, как описано в данном документе, и его комбинации или коктейли, упакованные в подходящий контейнер вместе с инструкцией по его применению.
[0025] Предпочтительное заболевание, связанное с экспрессией CNOT3 у пациента, представляет собой пигментный ретинит. Субъектом с заболеванием, связанным с экспрессией CNOT3, может быть млекопитающее, включая человека.
[0026] Далее будут описаны дополнительные аспекты данного изобретения со ссылкой на прилагаемые неограничивающие примеры и графические материалы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ
[0027] Дополнительные признаки данного изобретения более полно описаны в нижеследующем описании нескольких неограничивающих вариантов его реализации. Данное описание включено исключительно в целях иллюстрации данного изобретения. Его не следует понимать как ограничение общего содержания, раскрытия или описания данного изобретения, изложенного выше. Описание будет сделано со ссылкой на прилагаемые графические материалы, на которых:
На Фиг. 1 представлена схема рамки считывания CNOT3. CNOT3 состоит из 18 экзонов и кодирует белок с 753 аминокислотами. На Фиг. 1(а) экзоны внутри рамки считывания изображены прямоугольниками, тогда как экзоны с соединениями, которые прерывают кодоны, показаны с уголками (синий, красный). На Фиг. 1(b) представлен белок CNOT3, на котором показаны функциональные домены и положения аминокислот, соответствующие указанным выше экзонам. NAR: НЕ закрепленный регион. CS: связывающая последовательность NOT бокс: Негативный на TATA бокс. Исключение экзонов 2, 3, 8, 9, 11, 12, 13, 14, 15 и 16 нарушит открытую рамку считывания.
На Фиг. 2 представлено изображение геля, демонстрирующее продукты транскрипта CNOT3 из фибробластов пациента ПР11 через 48 часов после трансфекции 2’O-метилфосфоротиоат АО (50, 25 и 12,5 нМ). Контрольные АО, нацеленные на неизвестную последовательность (-ve контрольный АО), были включены для сравнения.
На Фиг. 3 представлено изображение геля, демонстрирующее продукты транскрипции CNOT3 из фибробластов через 48 часов после трансфекции 2’O-метилфосфоротиоат АО, разработанными для индукции удерживания концевого интрона, в концентрациях 50 и 25 нМ.
Фиг. 4A и 4B: на Фиг. 4A представлена родословная 0255: 11 членов с мутацией PRPF31 (c.267delA). На Фиг. 4B представлена родословная 0080: 13 членов, страдающих расстройством (около 1205 G>A). Стрелка = донорские дермальные фибробласты, черный = пациенты, которые в настоящее время участвуют в исследовании естественного развития заболевания CRE.
На Фиг. 5A-H показаны фибробласты кожи пациента с мутацией CLN3, перепрограммированной на плюрипотентность. iPSC пациента (CLN3-/-) демонстрирует типичную морфологию iPSC и выраженные маркеры плюрипотентности, включая присутствие OCT4, NANOG, SOX2 и SSEA4 (A). Сравнение экспрессии плюрипотентного гена в 6 линиях iPSC с помощью количественной ОТ-ПЦР продемонстрировало сходные паттерны экспрессии для всех линий (B). iPSC пациента продемонстрировали потенциал трехлинейной дифференциации. iPSC пациентов (CLN3-iPS-EB), генно-скорректированные контрольные iPSC (CLN3HDR-iPS-EB) и контрольные iPSC человека (ДТ-iPS-EB, ThermoFisher) были дифференцированы как эмбриоидные тельца в течение 2 недель, а затем подверглись скринингу на экспрессию маркеров эктодермы (PAX6, OTX1), мезодермы (SOX17, GATA4, FOX2A) и эндодермы (BRACHYURY, FDGFR), а также генов плюрипотентности (OCT4, NANOG, SOX2) с помощью количественной ОТ-ПЦР (C). D-H: Дифференциация iPSC в сетчатке. Органоиды сетчатки имели морфологию, подобную зрительному бокалу, окруженному прозрачными ламинированными тканями сетчатки (D), которые содержали организованный апикальный слой фоторецепторов, экспрессирующих рековерин (E) , а также базально расположенные Smi32, экспрессирующие ганглиозные клетки сетчатки (F). Электронная микроскопия внешних сегментов фоторецепторов органоидов сетчатки (G) на 170-е сутки продемонстрировала сходную морфологию с внешними сегментами в развивающейся (E120) сетчатке человека (H).
На Фиг. 6 показан скрининг AO-индуцированного пропуска экзона CNOT3 с использованием соединения 2’-O-метил на остове PS. АО предназначены для нацеливания на мотивы энхансеров сплайсинга экзонов CNOT3, чтобы опосредовать исключение целевого экзона во время сплайсинга пре-мРНК, чтобы опосредовать нокдаун CNOT3 или нарушить функцию белка. Кожные фибробласты трансфицировали в течение 48 часов с помощью CNOT3 AO (2’OMe-PS химия), нацеленных на экзоны (как указано). Продукты ОТ-ПЦР разделяли на 2% агарозных гелях.
На Фиг. 7 показан скрининг AO-индуцированного пропуска экзона CNOT3 с использованием соединения 2’-O-метил на остове PS. АО предназначены для нацеливания на мотивы энхансеров сплайсинга экзонов CNOT3, чтобы опосредовать исключение целевого экзона во время сплайсинга пре-мРНК, чтобы опосредовать нокдаун CNOT3 или нарушить функцию белка. Кожные фибробласты трансфицировали в течение 48 часов с помощью CNOT3 AO (2’OMe-PS химия), нацеленных на экзоны (как указано). Продукты ОТ-ПЦР разделяли на 2% агарозных гелях.
На Фиг. 8 показана отрицательная корреляция между экспрессией мРНК CNOT3 и PRPF31. На Фиг. 8(a) продемонстрирован анализ РВ-кПЦР экспрессии мРНК PRPF31 и CNOT3, нормализованной к экспрессии TATA-связывающего белка (TBP) в пигментном эпителии сетчатки, полученном из iPSC из ПР11, у бессимптомных и здоровых (ДТ) индивидуумов. ПР11 и бессимптомный субъект происходят от одной родословной, оба гетерозиготны по мутации PRPF31 c.1205C>A (Ser402*). Здоровый субъект из неродственной семьи. Экспрессия мРНК CNOT3 и PRPF31 в здоровом контроле была установлена на 1 (n ≥ 2). На Фиг. 8(b) кожные фибробласты пациента с ПР11 трансфицировали в течение 48 часов АО CNOT3 (2’OMe-PS), нацеленными на экзон 4, 6, 7 или 10. Уровень транскрипта PRPF31 анализировали с помощью РВ-кПЦР и нормализовали относительно экспрессии TBP. Экспрессия PRPF31 в клетках, обработанных контрольным АО в концентрации 25 нМ, была установлена на 1 (n=1). На Фиг. 8(c): кожные фибробласты пациента с ПР11 трансфицировали в течение 48 часов АО CNOT3 (2’OMe-PS химия), нацеленными на экзон 3, 8, 9, 16 или 17. Уровень транскрипта PRPF31 анализировали с помощью РВ-кПЦР и нормализовали относительно экспрессии TBP, и он показан относительно экспрессии PRPF31 в клетках, обработанных АО контролем плацебо при 25 нМ (контрольная экспрессия PRPF31 установлена на 1 (n=1).
На Фиг. 9 показан эффект ASO6 (SEQ ID NO: 64, CNOT3_H17A(+83+107), нацеленный на экзон 17 CNOT3 ), синтезированного в виде фосфородиамидатморфолиноолигомера (PMO) и трансфицированного в RPE, полученный из ПР11 iPSC. (A) Пропуск экзона 17 CNOT3 в клетках, обработанных одним PMO или проникающим в клетки PMO, меченным пептидом (PPMO), в концентрации 5 мкМ. (B) Повышающая регуляция PRPF31 как следствие нокдауна CNOT3, определенная с помощью РВ-кПЦР и нормализованная по экспрессии TATA-связывающего белка (TBP). Экспрессия PRPF31 в необработанном контроле была установлена на 1.
На Фиг. 10 показано (А) иммуноокрашивание ресничек (красный) и базального тельца (зеленый) в RPE дикого типа и ПР11 с или без обработки антисмысловым олигомером с ASO6 (SEQ ID NO: 64, CNOT3_H17A(+83+107), нацеленным на экзон 17 CNOT3 ). (B) Процент клеток RPE, экспрессирующих реснички, рассчитанный от ≥1000 клеток. (C) Измерение длины ресничек с помощью программного обеспечения NIS-Elements Imaging. Гистограмма представляет собой среднее значение ± СОС для ~ 300 реснитчатых клеток. Масштаб = 10 мкм. Тест Стьюдента. *** р <0,001.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ДАННОГО ИЗОБРЕТЕНИЯ
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Антисмысловые олигонуклеотиды
[0028] Существует повышенная уязвимость фоторецепторов к снижению активности сплайсинга. В то время как мутации в факторах сплайсинга могут вызывать дефицит сплайсинга в различных тканях, фоторецепторные клетки будут сильно затронуты из-за их высокой потребности в продукции мРНК (например, мРНК, кодирующей родопсин и другие белки фототрансдукции). Эта модель предполагает, что количество мРНК, продуцируемой сетчаткой, значительно превышает уровни мРНК, продуцируемой другими тканями.
[0029] PRPF31 (также известный как hPRP31) кодирует важный фактор сплайсинга пре-мРНК, необходимый для сборки и рециклинга комплекса РНК U4/U6. Несколько исследований продемонстрировали снижение количества общей мРНК PRPF31 у пациентов с ПР11, а также замедленную скорость сборки сплайсосом и процессинга пре-мРНК. Это указывает на то, что заболевание возникает по механизму гаплонедостаточности. По сравнению с другими тканями сетчатка экспрессирует в семь раз больше основных сплайсосомных малых ядерных РНК (snРНК).
[0030] Субъединица 3 CCR4-Not-транскрипционного комплекса (CNOT3, один из пяти Not-белков комплекса деаденилазы Ccr4-Not) была идентифицирована как главный ген-модификатор, определяющий пенетрантность мутаций PRPF31 через механизм репрессии транскрипции; модулирование транскрипции PRPF31 путем прямого связывания с его промотором. Уровень экспрессии аллеля PRPF31 дикого типа определяет, являются ли носители мутированного аллеля PRPF31 симптоматическими. У бессимптомных носителей CNOT3 экспрессируется на низких уровнях, что позволяет продуцировать большее количество транскриптов PRPF31 дикого типа и предотвращает проявление дегенерации сетчатки.
[0031] CNOT3 человека представляет собой ген из 18 экзонов, который кодирует белок с 753 аминокислотами. Исключение экзона 2 удаляет кодон инициации трансляции из транскрипта. Удаление экзона 4, 5, 6, 7, 10 или 17 может нарушить функциональные домены CNOT3. Исключение любого из экзонов 3, 8, 9 и 11-16 нарушает открытую рамку считывания.
[0032] Нокаут гена CNOT3 является эмбрионально летальным, поскольку он жизненно важен для прогрессии клеточного цикла посредством регуляции оборота мРНК и регуляции распада мРНК в различных физиологических процессах. Однако, если уровни CNOT3 могут быть снижены или устранены локально в глазах субъектов, подверженных риску или страдающих от ПР, то прогрессирование заболевания будет затронуто, поскольку может производиться повышенное количество белка PRPF31, имитируя модель неполной пенетрантности, при этом бессимптомные носители защищены от заболевания экспрессией PRPF31 выше среднего уровня немодифицированного гена.
[0033] Таким образом, в данном изобретении предлагаются антисмысловые олигонуклеотиды для индукции непродуктивного сплайсинга или функционально нарушенного белка CNOT3 (негативного регулятора PRPF31) для снижения (но предпочтительно не устранения) уровней CNOT3 и, следовательно, увеличения транскрипции и трансляции нормального аллеля PRPF31.
[0034] В отличие от других терапий на основе антисмысловых олигомеров, данное изобретение не вызывает повышенного разложения РНК за счет привлечения РНКазы H, при этом РНКаза H предпочтительно связывается, а разложенная РНК связывается дуплексом с ДНК гена CNOT3. Данное изобретение также не основано на гибридизации антисмыслового олигомера с геномной ДНК CNOT3 или связывание антисмысловых олигомеров с мРНК для модуляции количества белка CNOT3, продуцируемого путем вмешательства в нормальные функции, такие как репликация, транскрипция, транслокация и трансляция.
[0035] Скорее, антисмысловые олигомеры используются для модификации сплайсинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3 или его части, и для индукции «пропуска» экзона и/или удержания концевого интрона. Данная стратегия предпочтительно снижает общую экспрессию белка или приводит к образованию белков, в которых отсутствуют функциональные домены, что приводит к снижению функции белка.
[0036] Согласно первому аспекту данного изобретения предложены антисмысловые олигомеры, способные связываться с выбранной мишенью на транскрипте гена CNOT3 для модификации сплайсинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3 или его части. В широком смысле предлагается выделенный или очищенный антисмысловой олигомер для индукции направленного исключения экзона и/или удержания терминального интрона в транскрипте гена CNOT3 или его части.
[0037] В общей популяции экспрессия PRPF31 сильно варьируется, с непрерывным распределением уровней. Уровни экспрессии варьируются от 0,53 до 2,48 условных единиц, что составляет 5-кратную вариацию между низшим и высшим экспрессорами. Тридцать процентов носителей мутации PRPF31 не имеют симптомов, и у этих индивидуумов есть аллели дикого типа, экспрессия которых почти в 2 раза выше, чем у носителей с симптоматическими мутациями PRPF31. Следовательно, предпочтительно модуляция экспрессии CNOT3 приводит к по меньшей мере в два раза более высокой экспрессии PRPF31, чем в случае с симптоматическими мутациями PRPF31. Предпочтительно экспрессия PRPF31 из-за АО по данному изобретению, снижающих экспрессию CNOT3, в 1,5-5 раз выше, чем экспрессия с симптоматическими мутациями PRPF31. Например, экспрессия PRPF31 может быть в 2-4 раза выше.
[0038] Под «выделенным» подразумевается материал, который по существу или практически не содержит компонентов, которые обычно сопровождают его, находясь в нативном состоянии. Например, «выделенный полинуклеотид» или «выделенный олигонуклеотид», в контексте данного документа, может относиться к полинуклеотиду, который был очищен или удален из последовательностей, фланкирующих его в естественном состоянии, например, фрагмент ДНК, который был удален из последовательностей, которые примыкают к фрагменту в геноме. Термин «выделение» применительно к клеткам относится к очистке клеток (например, фибробластов, лимфобластов) от субъекта-источника (например, субъекта с заболеванием полинуклеотидных повторов). В контексте мРНК или белка термин «выделение» относится к выделению мРНК или белка из источника, например, клеток.
[0039] Можно сказать, что антисмысловой олигомер «направлен на» или «нацелен против» целевой последовательности, с которой он гибридизируется. В некоторых вариантах реализации, целевая последовательность содержит область, включающую 3’ или 5’ сайт сплайсинга предварительно обработанной мРНК, точку ветвления или другие последовательности, участвующие в регуляции сплайсинга. Целевая последовательность может находиться внутри экзона или внутри интрона или охватывать соединение интрон/экзон.
[0040] В некоторых вариантах реализации, антисмысловой олигомер обладает достаточной комплементарностью последовательности к целевой РНК (т.е. РНК, для которой модулируется выбор сайта сплайсинга), чтобы эффективно блокировать область целевой РНК (например, пре-мРНК). В иллюстративных вариантах реализации такое блокирование пре-мРНК CNOT3 служит для модуляции сплайсинга либо путем маскирования сайта связывания для нативного белка, который в противном случае модулировал бы сплайсинг, и/или путем изменения структуры целевой РНК. В некоторых вариантах реализации, целевая РНК представляет собой целевую пре-мРНК (например, пре-мРНК гена CNOT3).
[0041] Антисмысловой олигомер, имеющий достаточную комплементарность последовательности к последовательности целевой РНК для модуляции сплайсинга целевой РНК, означает, что антисмысловой олигомер имеет последовательность, достаточную для запуска маскирования сайта связывания для нативного белка, который в противном случае мог бы модулировать сплайсинг и/или изменять трехмерную структуру целевой РНК.
[0042] Выбранные антисмысловые олигомеры могут быть короче, например, на около 12 оснований, или длиннее, например, на около 50 оснований, и включать небольшое количество ошибок спаривания, при условии, что последовательность достаточно комплементарна, чтобы влиять на модуляцию сплайсинга при гибридизации с целевой последовательностью, и необязательно образует с РНК гетеродуплекс, имеющий Tпл. 45 °C или выше.
[0043] Предпочтительно антисмысловой олигомер выбран из группы, включающей последовательности, представленные в Таблице 1. Предпочтительно антисмысловой олигомер выбран из группы, включающей последовательности из SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, еще более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64.
[0044] В некоторых вариантах реализации степень комплементарности между целевой последовательностью и антисмысловым олигомером достаточна для образования стабильного дуплекса. Область комплементарности антисмысловых олигомеров с последовательностью целевой РНК может составлять всего 8-11 оснований, но может составлять 12-15 оснований или более, например 10-50 оснований, 10-40 оснований, 12-30 оснований, 12-25 оснований, 15-25 оснований, 12-20 оснований или 15-20 оснований, включая все целые числа между этими диапазонами. Антисмысловой олигомер из около 16-17 оснований обычно достаточно длинный, чтобы иметь уникальную комплементарную последовательность. В некоторых вариантах реализации может потребоваться минимальная длина дополнительных оснований для достижения требуемой Tпл. связывания, как обсуждается в данном документе.
[0045] В некоторых вариантах реализации могут подходить олигонуклеотиды длиной до 50 оснований, где по меньшей мере минимальное количество оснований, например, 10-12 оснований, комплементарно целевой последовательности. В целом, однако, облегченное или активное поглощение клетками оптимизируется при олигонуклеотидной длине менее около 30 оснований. Для антисмысловых олигомеров фосфородиамидат-морфолиноолигомера (PMO) оптимальный баланс стабильности связывания и захвата обычно достигается при длине 18-25 оснований. Включены антисмысловые олигомеры (например, CPPMO, PPMO, PMO, PMO-X, PNA, LNA, 2'-OMe), которые состоят из около 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 или 50 оснований.
[0046] В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигомеры могут быть на 100% комплементарны целевой последовательности или могут включать несовпадения, например, для размещения вариантов, при условии, что гетеродуплекс, образованный между олигонуклеотидом и целевой последовательностью, является достаточно стабильным, чтобы противостоять действию клеточных нуклеаз и другим сценариям деградации, происходящей in vivo. Следовательно, определенные олигонуклеотиды могут иметь около или по меньшей мере около 70% комплементарности последовательностей, например, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% комплементарности последовательности между олигонуклеотидом и целевой последовательностью.
[0047] Ошибки спаривания, если они присутствуют, обычно имеют менее дестабилизирующее влияние по отношению к концевым областям гибридного дуплекса, чем к его середине. Число допустимых ошибок спаривания будет зависеть от длины олигонуклеотида, процентного содержания пар оснований G:C в дуплексе и положения ошибок спаривания в дуплексе в соответствии с хорошо понятными принципами стабильности дуплекса. Хотя такой антисмысловой олигомер не обязательно на 100% комплементарен целевой последовательности, он является эффективным для стабильного и специфического связывания с целевой последовательностью, так что сплайсинг целевой пре-РНК модулируется.
[0048] Стабильность дуплекса, образованного между антисмысловым олигомером и целевой последовательностью, является функцией Tпл. связывания и восприимчивости дуплекса к клеточному ферментативному расщеплению. Tпл. олигонуклеотида по отношению к РНК с комплементарной последовательностью может быть измерена обычными методами, такими как описанные Hames et al., Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, 1985, pp. 107-108, или как описано в Miyada C. G. and Wallace R. B., 1987, Oligonucleotide Hybridization Techniques, Methods Enzymol. Vol. 154 pp. 94-107. В некоторых вариантах реализации, антисмысловые олигомеры могут иметь Tпл. связывания по отношению к РНК с комплементарной последовательностью выше температуры тела и предпочтительно выше около 45 °C или 50 °C. Также включены Tпл. в диапазоне 60-80 °C или выше.
[0049] Дополнительные примеры вариантов включают антисмысловые олигомеры, имеющие около или по меньшей мере около 70% идентичности или гомологии последовательностей, например, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79 %, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичности или гомологии последовательностей по всей длине любой из SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, еще более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64, или последовательностей, указанных в Таблице 1.
[0050] Более конкретно, предложен антисмысловой олигомер, способный связываться с выбранным целевым сайтом для модификации сплайсинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3 или его части. Антисмысловой олигомер предпочтительно выбран из антисмысловых олигомеров, представленных в Таблице 1 или SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, еще более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64.
[0051] Модификация сплайсинга пре-мРНК предпочтительно вызывает «пропуск» или удаление одного или более экзонов или интронов мРНК и/или удержания терминального интрона. Результирующий белок может иметь более короткую длину по сравнению с исходным полноразмерным белком CNOT3 из-за внутреннего усечения или преждевременной терминации или может быть длиннее из-за удерживания концевого интрона. Эти белки CNOT3 могут быть названы изоформами немодифицированного белка CNOT3.
[0052] Остальные экзоны полученной мРНК могут находиться в рамке считывания и вырабатывать более короткий белок с последовательностью, аналогичной последовательности родительского полноразмерного белка, за исключением того, что он имеет внутреннее усечение в области между исходными 3’ и 5’ концами. В другой возможности пропуск экзона может вызвать сдвиг рамки считывания, что приводит к белку, в котором первая часть белка по существу идентична родительскому полноразмерному белку, но где вторая часть белка имеет другую последовательность (например, бессмысленный последовательность) из-за сдвига кадра. Альтернативно, пропуск экзона может вызвать выработку белка с преждевременной терминацией из-за нарушения рамки считывания и наличия преждевременного прекращения трансляции. Кроме того, антисмысловой олигомер может вырабатывать искусственно удлиненный белок из-за удерживания терминального интрона в рамке считывания.
[0053] Функциональные домены CNOT3 включают суперспираль, линкер, NAR (Not якорную область), CS (соединительную последовательность) и бокс NOT. Исключение экзона 4 удаляет часть домена суперспирали, потеря экзона 9 нарушит открытую рамку считывания, что приведет к деградации мРНК, и любой кодируемый белок будет усечен, тогда как пропуск экзона 17 изменяет бокс NOT и, как ожидается, повлияет на комплексообразование и, следовательно, функцию CNOT3.
[0054] Удаление одного или более экзонов может дополнительно привести к неправильной упаковке белка CNOT3 и снижению способности белка успешно переноситься через мембрану.
[0055] Предпочтительно присутствие усеченных изнутри белков (т.е. белков, в которых отсутствуют аминокислоты, кодируемые одним или более экзонами). Если белок CNOT3 нокаутирован, могут возникнуть проблемы с повышением транскрипции CNOT3, поскольку организм пытается компенсировать снижение общего количества белка CNOT3. Напротив, присутствие усеченного изнутри белка (предпочтительно лишенного одной или более признаков полного белка CNOT3) должно быть достаточным для предотвращения повышенной транскрипции, но все же обеспечивать терапевтическое преимущество из-за снижения общего количества функционального белка CNOT3.
[0056] Антисмысловой олигомер, индуцирующий пропуск экзона по данному изобретению, не обязательно должен полностью или даже существенно нарушать функцию белка CNOT3. Предпочтительно, способ пропуска экзона приводит к снижению или нарушению функциональности белка CNOT3.
[0057] Способ пропуска по данному изобретению с использованием антисмысловых олигомеров может пропускать отдельный экзон или может приводить к пропуску двух или более экзонов одновременно.
[0058] Антисмысловые олигомеры по данному изобретению могут представлять собой комбинацию двух или более антисмысловых олигомеров, способных связываться с выбранной мишенью, чтобы индуцировать исключение экзона в транскрипте гена CNOT3. Комбинация может представлять собой смесь двух или более антисмысловых олигомеров и/или конструкцию, содержащую два или более антисмысловых олигомера, соединенных вместе.
Таблица 1. Список антисмысловых олигонуклеотидных последовательностей, использованных в данном исследовании, и оценка эффективности для АО-индуцированного пропуска экзона CNOT3. +1:> 50% пропуск экзонов, 0: <50% пропуск экзонов, -1:Отсутствие пропуска экзонов
[0059] Также предлагается способ управления сплайсингом в транскрипте гена CNOT3, включающий этап:
a) предоставления одного или более антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе, и обеспечения связывания олигомера(ов) с сайтом целевой нуклеиновой кислоты.
[0060] Согласно еще одному аспекту данного изобретения предлагается последовательность целевой нуклеиновой кислоты для управления сплайсингом для CNOT3, содержащей ДНК-эквиваленты последовательностей нуклеиновой кислоты, выбранных из Таблицы 1 или группы, состоящей из SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, еще более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64, и комплементарных им последовательностей.
[0061] Конструирование антисмысловых олигомеров для полной маскировки консенсусных сайтов сплайсинга необязательно может приводить к изменению сплайсинга целевого экзона. Кроме того, авторы данного изобретения обнаружили, что размер или длина самого антисмыслового олигомера не всегда является основным фактором при разработке антисмысловых олигомеров. С некоторыми мишенями, такими как экзон 3 IGTA4, антисмысловые олигомеры длиной всего 20 оснований способны вызывать некоторый пропуск экзонов, в некоторых случаях более эффективно, чем другие более длинные (например, 25 оснований) олигомеры, направленные на тот же экзон.
[0062] Авторы данного изобретения также обнаружили, что не существует какого-либо стандартного мотива, который может быть заблокирован или замаскирован антисмысловыми олигомерами для перенаправления сплайсинга. Было обнаружено, что необходимо разработать антисмысловые олигомеры и эмпирически оценить их индивидуальную эффективность.
[0063] Более конкретно, антисмысловой олигомер может быть выбран из антисмысловых олигомеров, представленных в Таблице 1. Последовательности предпочтительно выбраны из группы, состоящей из любой одной или более из любой одной или более SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, еще более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64, и их комбинаций или коктейлей. В нее входят последовательности, которые могут гибридизоваться с такими последовательностями в строгих условиях гибридизации, последовательности, комплементарные им, последовательности, содержащие модифицированные основания, модифицированные остовы и их функциональные усечения или удлинения, которые обладают или модулируют активность процессинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3.
[0064] Олигомер и ДНК, кДНК или РНК комплементарны друг другу, когда достаточное количество соответствующих положений в каждой молекуле занято нуклеотидами, которые могут связываться друг с другом посредством водородной связи. Таким образом, «специфически гибридизируемый» и «комплементарный» являются терминами, которые используются для обозначения достаточной степени комплементарности или спаривания, так что между олигомером и ДНК, кДНК или целевой РНК происходит стабильное и специфическое связывание. В данной области техники понятно, что последовательность антисмыслового олигомера не обязательно должна быть на 100% комплементарной последовательности его целевой последовательности для специфической гибридизации. Антисмысловой олигомер специфически гибридизуется, когда связывание соединения с целевой ДНК или молекулой РНК мешает нормальной функции целевой ДНК или продукта РНК, и существует достаточная степень комплементарности, чтобы избежать неспецифического связывания антисмыслового олигомера с нецелевой последовательностью в условиях, при которых желательно специфическое связывание, то есть в физиологических условиях в случае анализов in vivo или терапевтического лечения, и в случае анализов in vitro, в условиях, в которых проводятся анализы.
[0065] Селективная гибридизация может происходить в условия с низкой, средней или высокой степенью жесткости, но предпочтительно в условиях с высокой степенью жесткости. Специалисты в данной области техники поймут, что на жесткость гибридизации будут влиять такие условия, как концентрация соли, температура или органические растворители, в дополнение к основной композиции, длина комплементарных цепей и количество ошибок спаривания нуклеотидных оснований между гибридизирующими нуклеиновыми кислотами. Жесткие температурные условия обычно включают температуры, превышающие 30 °C, обычно превышающие 37 °C и предпочтительно превышающие 45 °C, предпочтительно по меньшей мере 50°C и обычно 60°C-80°C или выше. Жесткий солевой режим обычно будет менее 1000 мМ, обычно менее 500 мМ и предпочтительно менее 200 мМ. Однако сочетание параметров гораздо важнее, чем измерение любого отдельного параметра. Пример жестких условий гибридизации представляет собой 65 ºC и 0,1 x SSC (1 x SSC = 0,15 M NaCl, 0,015 M цитрат натрия, pH 7,0). Таким образом, антисмысловые олигомеры по данному изобретению могут включать олигомеры, которые селективно гибридизуются с последовательностями, представленными в Таблице 1, или SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, еще более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64.
[0066] Следует понимать, что расположение кодонов на конце экзонов в структурных белках не всегда может разрушаться на конце кодона, следовательно, может возникнуть необходимость в удалении более одного экзона из пре-мРНК для обеспечения считывания в рамке считывания мРНК. В таких обстоятельствах может потребоваться отобрать множество антисмысловых олигомеров с помощью способа по данному изобретению, каждый из которых направлен в разные области, ответственные за индукцию включения желаемого экзона и/или интрона. При данном значении ионной силы и pH, Tпл. представляет собой температуру, при которой 50% целевой последовательности гибридизируется с комплементарным полинуклеотидом. Такая гибридизация может происходить с «почти» или «по существу» комплементарной последовательностью антисмыслового олигомера к целевой последовательности, а также с точно соответствующей комплементарной последовательностью.
[0067] Обычно селективная гибридизация происходит, когда существует идентичность по меньшей мере на около 55% на участке, состоящем из по меньшей мере около 14 нуклеотидов, предпочтительно по меньшей мере на около 65%, более предпочтительно по меньшей мере на около 75% и наиболее предпочтительно по меньшей мере на около 90%, 95% 98% или 99% идентичности с нуклеотидами антисмыслового олигомера. Длина сравнения гомологии, как описано, может охватывать более длинные участки и в некоторых вариантах реализации часто будет охватывать участок, состоящий по меньшей мере из около девяти нуклеотидов, обычно по меньшей мере из около 12 нуклеотидов, чаще по меньшей мере из около 20, часто по меньшей мере из около 21, 22, 23 или 24 нуклеотида, по меньшей мере из около 25, 26, 27 или 28 нуклеотидов, по меньшей мере из около 29, 30, 31 или 32 нуклеотида, по меньшей мере из около 36 или более нуклеотидов.
[0068] Таким образом, последовательности антисмысловых олигомеров по данному изобретению предпочтительно имеют по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 86, 87, 88, 89 или 90% гомологии с последовательностями, показанными в перечнях последовательностей в данном документе. Более предпочтительно гомология составляет по меньшей мере 91, 92, 93, 94 или 95%, более предпочтительно по меньшей мере 96, 97, 98 или 99%. Как правило, чем короче длина антисмыслового олигомера, тем больше гомология, необходимая для получения селективной гибридизации. Следовательно, если антисмысловой олигомер по данному изобретению состоит из менее чем около 30 нуклеотидов, предпочтительно, чтобы процент идентичности составлял более 75%, предпочтительно более 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95%, 96, 97, 98% или 99% по сравнению с антисмысловыми олигомерами, указанными в перечнях последовательностей в данном документе. Сравнения гомологии нуклеотидов можно проводить с помощью программ сравнения последовательностей, таких как программа GCG Wisconsin Bestfit или GAP (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395). Таким образом, последовательности, имеющие длину, аналогичную или существенно отличающуюся от тех, что цитируются в данном документе, могут быть сравнены путем вставки гэпов в выравнивание, при этом такие гэпы могут быть определены, например, с помощью алгоритма сравнения, используемого GAP.
[0069] Антисмысловой олигомер по данному изобретению может иметь области пониженной гомологии и области точной гомологии с целевой последовательностью. Для олигомера не обязательно иметь точную гомологию по всей его длине. Например, олигомер может иметь непрерывные участки по меньшей мере из 4 или 5 оснований, которые идентичны целевой последовательности, предпочтительно непрерывные участки по меньшей мере из 6 или 7 оснований, которые идентичны целевой последовательности, более предпочтительно непрерывные участки по меньшей мере из 8 или 9 оснований, идентичных целевой последовательности. Олигомер может иметь участки по меньшей мере из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или 26 оснований, которые идентичны целевой последовательности. Остальные участки олигомерной последовательности могут периодически совпадать с целевой последовательностью; например, оставшаяся последовательность может иметь идентичное основание, за которым следует неидентичное основание, за которым следует идентичное основание. Альтернативно (или также) последовательность олигомера может иметь несколько участков идентичной последовательности (например, 3, 4, 5 или 6 оснований), перемежающихся участками с менее чем идеальной гомологией. Такие несовпадения последовательностей предпочтительно не будут иметь или будут иметь очень небольшую потерю активности переключения сплайсинга.
[0070] Термин «модулировать» или «модулирует» включает «увеличивать» или «уменьшать» один или более поддающихся количественной оценке параметров, необязательно на определенную и/или статистически значимую величину. Термины «увеличивать» или «увеличивающий», «усиливать» или «усиливающий», или «стимулировать», или «стимулирующий» обычно относятся к способности одного или антисмысловых олигомеров или композиций производить или вызывать больший физиологический ответ (т.е. последующие эффекты) в клетке или субъекте относительно ответа, вызванного отсутствием антисмыслового олигомера или контрольным соединением. Термины «уменьшающий» или «уменьшение» обычно относятся к способности одного или антисмысловых олигомеров или композиций продуцировать или вызывать сниженный физиологический ответ (т.е. последующие эффекты) в клетке или субъекте по сравнению с ответом, вызванным отсутствием антисмыслового олигомера или контрольным соединением.
[0071] Соответствующие физиологические или клеточные ответы (in vivo или in vitro) будут очевидны специалистам в данной области техники и могут включать увеличение исключения специфических экзонов в пре-мРНК, кодирующей CNOT3, уменьшение количества пре-мРНК, кодирующей CNOT3 или снижение экспрессии функционального белка CNOT3 в клетке, ткани или субъекте, нуждающемся в этом. «Уменьшенное» или «сниженное» количество обычно является статистически значимой величиной и может включать уменьшение на 1,1, 1,2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 или более раз (например, 500, 1000 раз) (включая все целые числа и десятичные числа между и более 1, например, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8) менее чем количество, полученное при отсутствии антисмыслового олигомера ( отсутствие агента) или контрольного соединения.
[0072] Термин «уменьшать» или «ингибировать» может в целом относиться к способности одного или более антисмысловых олигомеров или композиций «уменьшать» релевантный физиологический или клеточный ответ, такой как симптом заболевания или состояния, описанного в данном документе, при измерении в соответствии с рутинными способами диагностики. Соответствующие физиологические или клеточные ответы (in vivo или in vitro) будут очевидны специалистам в данной области техники и могут включать уменьшение симптомов или патологии заболевания, такого как пигментный ретинит.
[0073] «Снижение» ответа может быть статистически значимым по сравнению с ответом, вызванным отсутствием антисмыслового олигомера или контрольной композицией, и может включать 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% уменьшение, включая все целые числа между ними.
[0074] Длина антисмыслового олигомера может варьироваться до тех пор, пока он способен избирательно связываться с намеченным местом в молекуле пре-мРНК. Длина таких последовательностей может быть определена в соответствии с методиками отбора, описанными в данном документе. Обычно антисмысловой олигомер будет иметь длину от около 10 нуклеотидов до около 50 нуклеотидов в длину. Однако будет понятно, что в способе можно использовать любую длину нуклеотидов в этом диапазоне. Предпочтительно длина антисмыслового олигомера составляет от 10 до 40, от 10 до 35, от 15 до 30 нуклеотидов в длину или от 20 до 30 нуклеотидов в длину, наиболее предпочтительно от около 25 до 30 нуклеотидов в длину. Например, олигомер может иметь длину 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов.
[0075] Используемый в данном документе термин «антисмысловой олигомер» относится к линейной последовательности нуклеотидов или аналогов нуклеотидов, которая позволяет нуклеотидному основанию гибридизоваться с целевой последовательностью в РНК посредством спаривания оснований Уотсона-Крика с образованием гетеродуплекса олигонуклеотид:РНК в пределах целевой последовательности. Термины «антисмысловой олигомер», «антисмысловой олигонуклеотид», «олигомер» и «антисмысловое соединение» могут использоваться взаимозаменяемо для обозначения олигонуклеотида. Циклические субъединицы могут быть основаны на рибозе или другом пентозном сахаре или, в некоторых вариантах реализации, морфолиновой группе (см. описание морфолиноолигонуклеотидов ниже). Также рассматриваются пептидные нуклеиновые кислоты (PNA), заблокированные нуклеиновые кислоты (LNA) и 2’-O-метилолигонуклеотиды среди других антисмысловых агентов, известных в данной области техники.
[0076] Включены не встречающиеся в природе антисмысловые олигомеры или «аналоги олигонуклеотидов», включая антисмысловые олигомеры или олигонуклеотиды, имеющие (i) модифицированную структуру основной цепи, например, основную цепь, отличную от стандартной фосфодиэфирной связи, обнаруживаемой в встречающихся в природе олиго- и полинуклеотидах, и/или (ii) модифицированные сахарные фрагменты, например, морфолиновые фрагменты, а не рибозные или дезоксирибозные фрагменты. Олигонуклеотидные аналоги содержат основания, способные к образованию водородных связей путем спаривания оснований по Уотсону-Крику со стандартными полинуклеотидными основаниями, причем остов аналогов представляет основания таким образом, чтобы обеспечивать такое образование водородных связей специфическим по последовательностям способом между молекулой олигонуклеотидного аналога и основаниями в стандартном полинуклеотиде (например, одноцепочечной РНК или одноцепочечной ДНК). Предпочтительными аналогами являются те, которые содержат по существу незаряженный, содержащий фосфор остов.
[0077] Одним из способов получения антисмысловых олигомеров является метилирование положения 2’ гидроксирибозы, и включение фосфоротиоатного остова дает молекулы, которые внешне напоминают РНК, но гораздо более устойчивы к расщеплению нуклеазами, хотя специалисты в данной области техники будут знать другие формы подходящих остовов, которые могут быть использованы в целях данного изобретения.
[0078] Чтобы избежать деградации пре-мРНК во время образования дуплекса с антисмысловыми олигомерами, антисмысловые олигомеры, используемые в данном способе, могут быть адаптированы для минимизации или предотвращения расщепления эндогенной РНКазой Н. Это свойство очень предпочтительно, поскольку обработка РНК неметилированными олигомерами, внутриклеточные или в неочищенных экстрактах, которые содержат РНКазу Н, приводят к деградации дуплексов пре-мРНК:антисмысловые олигомеры. В данном способе можно использовать любую форму модифицированных антисмысловых олигомеров, которая способна обходить или не вызывать такую деградацию. Устойчивость к нуклеазам может быть достигнута путем модификации антисмысловых олигомеров по данному изобретению так, чтобы они включали частично ненасыщенную алифатическую углеводородную цепь и одну или более полярных или заряженных групп, включая карбоксильные группы, сложноэфирные группы и спиртовые группы.
[0079] Антисмысловые олигомеры, которые не активируют РНКазу H, можно получить в соответствии с известными способами (см., например, патент США № 5149797). Такие антисмысловые олигомеры, которые могут быть дезоксирибонуклеотидными или рибонуклеотидными последовательностями, просто содержат любую структурную модификацию, которая пространственно препятствует или предотвращает связывание РНКазы H с дуплексной молекулой, содержащей олигомер в качестве одного из ее членов, причем структурная модификация существенно не препятствует или не нарушает образование дуплекса. Поскольку части олигомера, участвующие в образовании дуплекса, существенно отличаются от частей, участвующих в связывании с ним РНКазы Н, доступны многочисленные антисмысловые олигомеры, которые не активируют РНКазу Н. Например, такие антисмысловые олигомеры могут быть олигомерами, в которых по меньшей мере один или все мостиковые фосфатные остатки между нуклеотидами представляют собой модифицированные фосфаты, такие как метилфосфонаты, метилфосфотиоаты, фосфороморфолидаты, фосфоропиперазидаты, боранофосфаты, амидные связи и фосфорамидаты. Например, любой другой из межнуклеотидных мостиковых фосфатных остатков может быть модифицирован, как описано. В другом неограничивающем примере такие антисмысловые олигомеры представляют собой молекулы, в которых по меньшей мере один или все нуклеотиды содержат 2'-низшую алкильную группу (такую как, например, C1-C4, линейный или разветвленный, насыщенный или ненасыщенный алкил, такой как метил, этил, этенил, пропил, 1-пропенил, 2-пропенил и изопропил). Например, любой другой из нуклеотидов может быть модифицирован, как описано.
[0080] Примером антисмысловых олигомеров, которые при дуплексе с РНК не расщепляются клеточной РНКазой Н, является 2'-O-метилпроизводным. Такие 2'-O-метил-олигорибонуклеотиды стабильны в клеточной среде и в тканях животных, и их дуплексы с РНК имеют более высокие значения Tm, чем их рибо- или дезоксирибо-аналоги. Альтернативно, антисмысловые олигомеры, устойчивые к нуклеазам, по данному изобретению могут иметь фторированный по меньшей мере один из последних 3'-концевых нуклеотидов. Еще альтернативно, антисмысловые олигомеры, устойчивые к нуклеазам, по данному изобретению имеют фосфоротиоатные связи, связывающие по меньшей мере два из последних 3-концевых нуклеотидных оснований, предпочтительно содержащие фосфортиоатные связи между последними четырьмя 3'-концевыми нуклеотидными основаниями.
[0081] Повышенное переключение сплайсинга также может быть достигнуто с помощью альтернативной химии олигонуклеотидов. Например, антисмысловой олигомер может быть выбран из списка, включающего: фосфорамидат или фосфородиамидат морфолиноолигомер (PMO); PMO-X; PPMO; пептидную нуклеиновую кислоту (PNA); заблокированную нуклеиновую кислоту (LNA) и производные, включая альфа-L-LNA, 2’-амино LNA, 4’-метил LNA и 4’-O-метил LNA; этиленовые мостиковые нуклеиновые кислоты (ENA) и их производные; фосфоротиоатный олигомер; олигомер трицикло-ДНК (tcДНК); олигомер трициклофосфоротиоат; 2’O-метил-модифицированный олигомер (2’-OMe); 2’-O-метоксиэтил (2’-MOE); 2’-фтор, 2’-фторарабино (FANA); разблокированную нуклеиновую кислоту (UNA); гекситолнуклеиновую кислоту (HNA); циклогексенильную нуклеиновую кислоту (CeNA); 2’-амино (2’-NH2); 2’-O-этиленамин или любую комбинацию вышеперечисленного в виде миксмеров или гэпмеров. Для дальнейшего повышения эффективности доставки вышеупомянутые модифицированные нуклеотиды часто конъюгированы с жирными кислотами/липидами/холестерином/аминокислотами/углеводами/полисахаридами/наночастицами и т.д. с сахаром или фрагментами азотистых оснований. Данные конъюгированные производные нуклеотидов также могут быть использованы для конструирования антисмысловых олигомеров с пропуском экзона. Для модификации сплайсинга транскриптов гена CNOT3 человека, индуцированной антисмысловым олигомером, обычно используются олигорибонуклеотиды, PNA, 2OMe или MOE-модифицированные основания на фосфоротиоатном остове. Хотя 2OMeAO используются для конструирования олиго, из-за их эффективного поглощения in vitro при доставке в виде катионных липоплексов, эти соединения чувствительны к расщеплению нуклеазами и не считаются идеальными для in vivo или клинических применений. Когда для создания антисмысловых олигомеров по данному изобретению используются альтернативные химические методы, урацил (U) последовательностей, представленных в данном документе, может быть заменен тимином (T).
[0082] Хотя антисмысловые олигомеры, описанные выше, являются предпочтительной формой антисмысловых олигомеров по данному изобретению, данное изобретение включает другие олигомерные антисмысловые молекулы, включая, но не ограничиваясь ими, олигомерные миметики, такие как описанные ниже.
[0083] Конкретные примеры предпочтительных антисмысловых олигомеров, применимых в данном изобретении, включают олигомеры, содержащие модифицированные остовы или неприродные межнуклеозидные связи. Как определено в этом описании, олигомеры, имеющие модифицированные остовы, включают те, которые содержат атом фосфора в остове, и те, которые не содержат атом фосфора в остове. Для целей данного описания и, как иногда упоминается в данной области, модифицированные олигомеры, которые не имеют атома фосфора в их межнуклеозидном остове, также могут рассматриваться как антисмысловые олигомеры.
[0084] В других предпочтительных олигомерных миметиках и сахар, и межнуклеозидная связь, т.е. остов нуклеотидных единиц, заменены новыми группами. Основные единицы сохраняются для гибридизации с подходящим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно такое олигомерное соединение, миметик олигомера, который, как было показано, обладает превосходными гибридизационными свойствами, называется пептидной нуклеиновой кислотой (ПКН). В соединениях ПКН сахарный остов олигомера замещен амид-содержащим остовом, в частности, аминоэтилглициновым остовом. Нуклеооснования удерживаются и связаны прямо или непрямо с аза-атомами азота амидной части остова.
[0085] Другой предпочтительный химический состав представляет собой олигомерные соединения фосфородиамидат-морфолиноолигомера (PMO), которые не разлагаются какой-либо известной нуклеазой или протеазой. Эти соединения не заряжены, не активируют активность РНКазы Н при связывании с цепью РНК и, как было показано, проявляют устойчивую модуляцию сплайсинга после введения in vivo (Summerton and Weller, Antisense Nucleic Acid Drug Development, 7, 187-197).
[0086] Модифицированные олигомеры также могут содержать один или более замещенных сахарных фрагментов. Олигомеры также могут содержать модификации или замены азотистых оснований (часто называемых в данной области техники просто «основанием»). Некоторые азотистые основания особенно полезны для увеличения сродства связывания олигомерных соединений по данному изобретению. К ним относятся 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и O-6 замещенные пурины, включая 2-аминопропиладенин, 5-пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. Было показано, что замещения 5-метилцитозина увеличивают стабильность дуплекса нуклеиновой кислоты на 0,6-1,2 °C, особенно в сочетании с модификациями 2'-O-метоксиэтилсахара.
[0087] Другая модификация олигомеров по данному изобретению включает химическое связывание с олигомером одного или более фрагментов или конъюгатов, которые усиливают активность, клеточное распределение или клеточное поглощение олигомера. Такие фрагменты включают, но не ограничиваются ими, липидные фрагменты, такие как холестериновый фрагмент, холевую кислоту, тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол, тиохолестерин, алифатическую цепь, например, остатки додекандиола или ундецила, фосфолипид, например, ди-гексадецил-рац-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-рац-глицеро-3-Н-фосфонат, полиаминовую или полиэтиленгликолевую цепь, или адамантануксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, миристил или октадециламиновый или гексиламинокарбонилоксихолестериновый фрагмент.
[0088] Проникающие в клетки пептиды были добавлены к олигомерам фосфородиамидата морфолино для усиления клеточного поглощения и ядерной локализации. Было показано, что различные пептидные метки влияют на эффективность захвата и целевую тканевую специфичность, как показано в Jearawiriyapaisarn et al. (2008), Mol. Ther. 16 9, 1624-1629.
[0089] Необязательно, чтобы все положения в данном соединении были однородно модифицированы, и на самом деле более чем одна из вышеупомянутых модификаций может быть включена в одно соединение или даже в один нуклеозид в олигомере. Данное изобретение также включает антисмысловые олигомеры, которые являются химерными соединениями. «Химерные» антисмысловые олигомеры или «химеры» в контексте данного изобретения представляют собой антисмысловые олигомеры, в частности олигомеры, которые содержат две или более химически различных областей, каждая из которых состоит по меньшей мере из одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигомерного соединения. Эти олигомеры обычно содержат по меньшей мере одну область, в которой олигомер модифицирован таким образом, чтобы придать олигомеру или антисмысловому олигомеру повышенную устойчивость к расщеплению нуклеазой, повышенное клеточное поглощение и дополнительную область для повышения аффинности связывания с целевой нуклеиновой кислотой.
[0090] Активность антисмысловых олигомеров и их вариантов можно анализировать с помощью обычных способов в данной области техники. Например, формы сплайсинга и уровни экспрессии исследуемых РНК и белков могут быть оценены любым из множества хорошо известных способов обнаружения форм сплайсинга и/или экспрессии транскрибируемой нуклеиновой кислоты или белка. Неограничивающие примеры таких способов включают ОТ-ПЦР сплайсированных форм РНК с последующим разделением по размеру продуктов ПЦР, методы гибридизации нуклеиновых кислот, например, нозерн-блоттинг и/или использование массивов нуклеиновых кислот; методы амплификации нуклеиновых кислот; иммунологические методы обнаружения белков; методы очистки белков; и анализы функции или активности белков.
[0091] Уровни экспрессии РНК можно оценить путем получения мРНК/кДНК (т.е. транскрибируемого полинуклеотида) из клетки, ткани или организма и путем гибридизации мРНК/кДНК с эталонным полинуклеотидом, который является комплементом исследуемой нуклеиновой кислоты или его фрагментом. кДНК необязательно может быть амплифицирована с использованием любого из множества методов полимеразной цепной реакции или способов транскрипции in vitro перед гибридизацией с комплементарным полинуклеотидом; желательно без усиления. Экспрессию одного или более транскриптов также можно обнаружить с помощью количественной ПЦР для оценки уровня экспрессии транскрипта (ов).
[0092] В данном изобретении предлагается индуцированное антисмысловым олигомером переключение сплайсинга транскрипта гена CNOT3, клинически значимый химический состав олигомера и система доставки для управления манипуляциями сплайсинга CNOT3 до терапевтических уровней. Существенное уменьшение количества полноразмерной мРНК CNOT3 и, следовательно, белка CNOT3 от транскрипции гена CNOT3 достигается за счет:
1) уточнение олигомера in vitro с использованием клеточных линий фибробластов посредством экспериментальной оценки (i) целевых мотивов интронных энхансеров, (ii) длины антисмыслового олигомера и разработки коктейлей олигомеров, (iii) выбора химии и (iv) добавления пептидов, проникающих в клетки (CPP), для усиления доставки олигомеров; и
2) детальной оценка нового подхода к генерации транскриптов CNOT3 с одним или более отсутствующими экзонами.
[0093] Таким образом, в данном документе показано, что процессингом пре-мРНК CNOT3 можно манипулировать с помощью специфических антисмысловых олигомеров. Таким образом можно получить функционально значимое снижение количества белка CNOT3, тем самым уменьшая тяжелую патологию, связанную с пигментным ретинитом.
[0094] Антисмысловые олигомеры, используемые в соответствии с данным изобретением, могут быть удобно получены с помощью хорошо известной методики твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза продается несколькими поставщиками, включая, например, Applied Biosystems (Фостер-Сити, Калифорния). Один метод синтеза олигомеров на модифицированном твердом носителе описан в патенте США № 4458066.
[0095] Любые другие средства для такого синтеза, известные в данной области техники, могут быть использованы дополнительно или альтернативно. Хорошо известно использование подобных методов для получения олигомеров, таких как фосфоротиоаты и алкилированные производные. В одном таком автоматизированном варианте реализации диэтилфосфорамидиты используются в качестве исходных материалов и могут быть синтезированы, как описано Beaucage, et al., (1981) Tetrahedron Letters, 22:1859-1862.
[0096] Антисмысловые олигомеры по данному изобретению синтезируются in vitro и не включают антисмысловые композиции биологического происхождения или генетические векторные конструкции, разработанные для управления синтезом антисмысловых олигомеров in vivo. Молекулы по данному изобретению также могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими молекулами, структурами молекул или смесями соединений, как, например, липосомы, молекулы, нацеленные на рецепторы и т. д.
[0097] Антисмысловые олигомеры могут быть составлены для пероральной, местной, парентеральной или другой доставки, в частности, в виде составов для местной доставки в глаза и инъекции в глаза. Композиции могут быть составлены для помощи в захвате, распределении и/или абсорбции в месте доставки или активности. Предпочтительно антисмысловые олигомеры по данному изобретению составлены для местной доставки в глаз или посредством внутриглазной инъекции, или внутриглазного имплантата, так что эффекты на выработку CNOT3 ограничены пространственно и не являются системными.
Способ лечения
[0098] Согласно еще одному аспекту изобретения предложен один или более антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе, для применения в терапии на основе антисмысловых олигомеров. Предпочтительно терапия предназначена для состояния, связанного с экспрессией CNOT3. Более предпочтительно лечение состояния, связанного с экспрессией CNOT3, представляет собой терапию пигментного ретинита.
[0099] Более конкретно, антисмысловой олигомер может быть выбран из Таблицы 1 или группы, состоящей из любой одной или более SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, даже более предпочтительно, SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64 и их комбинаций или коктейлей. Сюда входят последовательности, которые могут гибридизоваться с такими последовательностями в строгих условиях гибридизации, последовательности, комплементарные им, последовательности, содержащие модифицированные основания, модифицированные остовы и их функциональные усечения или удлинения, которые обладают или модулируют активность процессинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3.
[00100] Изобретение распространяется также на комбинацию двух или более антисмысловых олигомеров, способных связываться с выбранной мишенью, чтобы индуцировать исключение экзона в транскрипте гена CNOT3. Комбинация может представлять собой коктейль из двух или более антисмысловых олигомеров, конструкцию, содержащую два или более или два или более антисмысловых олигомера, объединенных вместе для использования в терапии на основе антисмысловых олигомеров.
[00101] Таким образом, предлагается способ лечения, предотвращения или ослабления эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3, включающий этап:
a) введение пациенту эффективного количества одного или более антисмысловых олигомеров или фармацевтической композиции, содержащей один или более антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе.
[00102] Предпочтительное заболевание, связанное с экспрессией CNOT3 у пациента, представляет собой пигментный ретинит.
[00103] Таким образом, изобретение предлагает способ лечения, предотвращения или ослабления эффектов пигментного ретинита, включающий этап:
a) введение пациенту эффективного количества одного или более антисмысловых олигомеров или фармацевтической композиции, содержащей один или более антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе.
[00104] Предпочтительно терапию используют для снижения уровней функционального белка CNOT4 с помощью стратегии пропуска экзонов. Снижение уровней CNOT3 предпочтительно достигается за счет снижения уровня транскриптов путем модификации сплайсинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3 или его части.
[00105] Снижение уровней CNOT3 предпочтительно приведет к уменьшению количества, продолжительности или тяжести симптомов состояния или патологии, связанных с CNOT3, таких как пигментный ретинит.
[00106] Используемый в данном документе термин «лечение» субъекта (например, млекопитающего, такого как человек) или клетки представляет собой вмешательство любого типа, используемое в попытке изменить естественное течение заболевания или состояния у индивидуума или клетки. Лечение включает, но не ограничивается этим, введение фармацевтической композиции и может проводиться либо профилактически, либо после начала патологического события или контакта с этиологическим агентом. Также включены «профилактические» лечения, которые могут быть направлены на снижение скорости прогрессирования заболевания или состояния, подлежащего лечению, задержку начала этого заболевания или состояния или уменьшение тяжести его начала. «Лечение» или «профилактика» не обязательно указывает на полное устранение, излечение или предотвращение заболевания или состояния или связанных с ними симптомов.
[00107] Субъектом с заболеванием, связанным с экспрессией CNOT3, может быть млекопитающее, включая человека.
[00108] Антисмысловые олигомеры по данному изобретению также можно использовать в сочетании с альтернативными способами лечения, такими как лекарственная терапия.
[00109] Таким образом, данное изобретение предлагает способ лечения, предотвращения или ослабления эффектов заболевания или состояния, связанного с экспрессией CNOT3, при котором антисмысловые олигомеры по данному изобретению вводятся последовательно или одновременно с другой альтернативной терапией, связанной с лечением, предотвращением или улучшением состояния заболевания или состояния, связанного с экспрессией CNOT3. Предпочтительно заболевание или состояние представляет собой пигментный ретинит.
Доставка
[00110] Антисмысловые олигомеры по данному изобретению также можно использовать в качестве профилактических или терапевтических средств, которые можно использовать для лечения заболевания. Соответственно, в одном варианте реализации данное изобретение предлагает антисмысловые олигомеры, которые связываются с выбранной мишенью в пре-мРНК CNOT3 для индукции эффективного и последовательного пропуска экзонов, как описано в данном документе, в терапевтически эффективном количестве, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителем или вспомогательным веществом.
[00111] Также предложена фармацевтическая, профилактическая или терапевтическая композиция для лечения, предотвращения или ослабления эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3 у пациента, причем композиция содержит:
a) один или более антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе; и
b) один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей.
[00112] Предпочтительно, чтобы антисмысловой олигомер по данному изобретению доставлялся локализованным окулярным путем, чтобы избежать системного эффекта. Пути введения включают, но не ограничиваются ими, интравитреальное, внутрикамерное, субконъюнктивальное, субтенонное, ретробульбарное, заднее юкстасклеральное или местное (капли, жидкости для промывания глаз, кремы и т. д.). Способы доставки включают, например, инъекцию с помощью шприца и устройства для доставки лекарственного средства, такого как имплантированное устройство для доставки в стекловидное тело (например, VITRASERT®).
[00113] В одном варианте реализации антисмысловой олигомер вводят внутривенно в дозе 20 мг/кг. Например, антисмысловой олигомер можно вводить мыши внутривенно в дозе 20 мг/кг.
[00114] Предпочтительно, антисмысловой олигомер вводят посредством интравитреальной инъекции в дозе 0,01-1,5 мг/кг массы тела, 0,1-0,1 мг/кг массы тела, 0,2-0,8 мг/кг массы тела, 0,4-0,7 мг/кг массы тела, или более предпочтительно 0,4-0,6 мг/кг массы тела. Антисмысловой олигомер можно вводить посредством интравитреальной инъекции, например, в дозе около 0,05 мг/кг массы тела, 0,1 мг/кг массы тела, 0,2 мг/кг массы тела, 0,3 мг/кг массы тела, 0,4 мг/кг массы тела, 0,5 мг/кг массы тела, 0,6 мг/кг массы тела, 0,7 мг/кг массы тела, 0,8 мг/кг массы тела, 0,9 мг/кг массы тела, 1,0 мг/кг массы тела, 1,1 мг/кг массы тела, 1,2 мг/кг массы тела, 1,3 мг/кг массы тела, 1,4 мг/кг массы тела, 1,5 мг/кг массы тела. Предпочтительно антисмысловой олигомер вводят посредством интравитреальной инъекции в дозе около 0,5 мг/кг массы тела. Например, антисмысловой олигомер можно вводить мыши посредством интравитреальной инъекции в дозе около 0,5 мг/кг массы тела.
[00115] Более предпочтительно, антисмысловой олигомер вводят посредством интравитреальной инъекции в дозах 0,5-50 мг на глаз, 0,5-40 мг на глаз, 0,5-30 мг на глаз, 2-30 мг на глаз, 2-20 мг на глаз, 0,5- 20 мг на глаз или более предпочтительно от 5 до 20 мг на глаз. Антисмысловой олигомер можно вводить посредством интравитреальной инъекции, например, в дозе около 0,5 мг на глаз, 1,0 мг на глаз, 2,0 мг на глаз, 3,0 мг на глаз, 4,0 мг на глаз, 5,0 мг на глаз, 6,0 мг на глаз, 7,0 мг на глаз, 8,0 мг на глаз, 9,0 мг на глаз, 10,0 мг на глаз, 11,0 мг на глаз, 12,0 мг на глаз, 13,0 мг на глаз, 14,0 мг на глаз, 15,0 мг на глаз, 16,0 мг на глаз, 17,0 мг на глаз, 18,0 мг на глаз, 19,0 мг на глаз, 20,0 мг на глаз, 21 мг на глаз, 22 мг на глаз, 23 мг на глаз, 24 мг на глаз, 25 мг на глаз, 30 мг на глаз, 35 мг на глаз, 40 мг на глаз, 45 мг на глаз или 50 мг на глаз. Предпочтительно антисмысловой олигомер вводят посредством интравитреальной инъекции в дозе около 5-20 мг на глаз.
[00116] Антисмысловой олигомер можно вводить с регулярными интервалами в течение короткого периода времени, например, ежедневно в течение двух недель или меньше. Однако во многих случаях олигомер вводят с перерывами в течение более длительного периода времени. Введение может сопровождаться или одновременно происходить с введением антибиотика или другого терапевтического лечения. Схема лечения может быть скорректирована (доза, частота, путь и т. д.), как указано, на основе результатов иммуноанализов, других биохимических тестов и физиологического обследования субъекта, подвергаемого лечению.
[00117] Дозирование может зависеть от тяжести и чувствительности болезненного состояния, подлежащего лечению, с курсом лечения, продолжающимся от нескольких дней до нескольких месяцев, или до тех пор, пока не произойдет излечение или не будет достигнуто уменьшение болезненного состояния. В качестве альтернативы дозировку можно подбирать в зависимости от скорости прогрессирования заболевания. Сначала устанавливают исходный уровень прогрессирования. Затем отслеживают скорость прогрессирования после однократной начальной дозы, чтобы убедиться в его снижении. Предпочтительно, чтобы после введения не наблюдалось прогрессирования. Предпочтительно повторное введение необходимо только в том случае, если скорость прогрессирования не изменилась. Успешное лечение предпочтительно приводит к прекращению дальнейшего прогрессирования заболевания или даже к некоторому восстановлению зрения. Оптимальные схемы введения могут быть рассчитаны на основе измерений накопления лекарственного средства в организме пациента. Специалисты в области техники могут легко определить оптимальные дозировки, методики дозирования и частоту повторения.
[00118] Оптимальные дозировки могут варьироваться в зависимости от относительной активности отдельных олигомеров и, как правило, могут быть оценены на основе EC50, которые оказались эффективными на животных моделях in vitro и in vivo.
[00119] Как правило, доза составляет от 0,01 до 1,5 мг/кг массы тела или введение посредством интравитреальной инъекции в пределах 0,5-50 мг на глаз и может вводиться один или более раз в день, неделю, месяц или год, или даже один раз каждые 2-20 лет. Частота повторения дозирования зависит от скорости прогрессирования заболевания. Специалисты в данной области техники могут легко оценить частоту повторения дозирования на основании измеренного времени пребывания и концентрации лекарственного средства в жидкостях или тканях организма. После успешного лечения может быть желательно, чтобы пациент прошел поддерживающую терапию для предотвращения рецидива болезненного состояния, при этом олигомер вводят в поддерживающих дозах, доза может составлять 0,01-1,5 мг/кг массы тела или вводиться посредством интравитреальной инъекции в дозе 0,5-50 мг на глаз один или более раз в день, неделю, месяц или год или даже один раз в 2-20 лет.
[00120] Эффективная схема лечения in vivo с использованием антисмысловых олигомеров по данному изобретению может варьироваться в зависимости от продолжительности, дозы, частоты и пути введения, а также от состояния субъекта, подвергаемого лечению (т.е. профилактическое введение по сравнению с введением в ответ на локализованную или системную инфекцию). Соответственно, такая терапия in vivo часто требует наблюдения с помощью тестов, подходящих для конкретного типа заболевания, подвергаемого лечению, и соответствующих корректировок в дозе или схеме лечения для достижения оптимального терапевтического результата.
[00121] За лечением можно наблюдать, например, по общим показателям заболевания, известным в данной области техники. Эффективность вводимых in vivo антисмысловых олигомеров по данному изобретению может быть определена из биологических образцов (ткани, крови, мочи и т.д.), взятых у субъекта до, во время и после введения антисмыслового олигомера. Анализы таких образцов включают (1) наблюдение за наличием или отсутствием образования гетеродуплекса с целевыми последовательностями и нецелевыми последовательностями с использованием процедур, известных специалистам в данной области техники, например, анализ электрофоретической подвижности в геле; (2) наблюдение за количеством мутантной мРНК по отношению к эталонной нормальной мРНК или белку, как определено стандартными методами, такими как ОТ-ПЦР, Нозерн-блоттинг, ИФА или Вестерн-блоттинг.
[00122] Внутриядерная доставка олигомера является серьезной проблемой для антисмысловых олигомеров. Различные проникающие в клетки пептиды (CPP) локализуют PMO в различной степени в разных условиях и в разных клеточных линиях, и изобретатели оценили новые CPP на предмет их способности доставлять PMO к целевым клеткам. Термины CPP или «пептидный фрагмент, который усиливает клеточное поглощение» используются взаимозаменяемо и относятся к катионным пептидам, проникающим в клетку, также называемым «транспортными пептидами», «пептидами-носителями» или «доменами пептидной трансдукции». Пептиды, как показано в данном документе, обладают способностью индуцировать проникновение в клетки около или, по меньшей мере около в 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или 100% клеток данной культуральной популяции и приводят к макромолекулярной транслокации в нескольких тканях in vivo при системном введении. CPP хорошо известны в данной области техники и раскрыты, например, в заявке на патент США № 2010/0016215, которая полностью включена в данный документ посредством ссылки.
[00123] Таким образом, данное изобретение предлагает антисмысловые олигомеры по данному изобретению, которые выигрывают в комбинации с проникающими в клетки пептидами для производства терапевтических фармацевтических композиций.
Вспомогательные вещества
[00124] Антисмысловые олигомеры настоящего изобретения предпочтительно доставляются в фармацевтически приемлемой композиции. Композиция может содержать от около 1 нМ до 1000 нМ каждого из желаемых антисмысловых олигомеров по данному изобретению. Предпочтительно композиция может содержать от около 1 до 500 нМ, от 10 до 500 нМ, от 50 до 750 нМ, от 10 до 500 нМ, от 1 до 100 нМ, от 1 до 50 нМ, от 1 до 40 нМ, 1 от нМ до 30 нМ, от 1 до 20 нМ, наиболее предпочтительно от 1 до 10 нМ каждого антисмыслового олигомера(ов) по данному изобретению.
[00125] Композиция может содержать около 1 нм, 2 нм, 3 нм, 4 нм, 5 нм, 6 нм, 7 нм, 8 нм, 9 нм, 10 нм, 20 нм, 50 нм, 75 нм, 100 нм, 150 нм, 200 нм, 250 нм, 300 нм, 350 нм, 400 нм, 450 нм, 500 нм, 550 нм, 600 нм, 650 нм, 700 нм, 750 нм, 800 нм, 850 нм, 900 нм, 950 нм или 1000 нм каждого желаемого антисмыслового олигомера(ов) по данному изобретению.
[00126] Настоящее изобретение дополнительно предлагает один или более антисмысловых олигомеров, адаптированных для помощи в профилактическом или терапевтическом лечении, предотвращении или облегчении симптомов заболевания, такого как заболевание или патология, связанная с экспрессией CNOT3, в форме, подходящей для доставки пациенту.
[00127] Фраза «фармацевтически приемлемый» относится к молекулярным соединениям и композициям, которые физиологически переносимы и обычно не вызывают аллергической или аналогичной нежелательной реакции, такой как расстройство желудка и т.п., при введении пациенту. Термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту, вспомогательному веществу или носителю, с которым вводят соединение. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. В качестве носителей предпочтительно использовать воду или физиологические растворы и водные растворы декстрозы и глицерина, особенно для растворов для инъекций. Подходящие фармацевтические носители описаны в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press, PA (2013).
[00128] В более конкретной форме изобретения представлены фармацевтические композиции, содержащие терапевтически эффективные количества одного или более антисмысловых олигомеров по данному изобретению вместе с фармацевтически приемлемыми разбавителями, консервантами, солюбилизаторами, эмульгаторами, адъювантами и/или носителями. Такие композиции включают разбавители с различным содержанием буфера (например, трис-HCl, ацетат, фосфат), pH и ионной силой, а также добавки, такие как детергенты и солюбилизирующие вещества (например, твин 80, полисорбат 80), антиоксиданты (например, аскорбиновая кислота, натрий метабисульфит), консерванты (например, тимерсол, бензиловый спирт) и наполнители (например, лактоза, маннит). Материал может быть включен в состав полимерных соединений в виде частиц, таких как полимолочная кислота, полигликолевая кислота и т.д., или в липосомы. Также можно использовать гилауроновую кислоту. Такие композиции могут влиять на физическое состояние, стабильность, скорость высвобождения in vivo и скорость клиренса in vivo настоящих белков и производных. См., например, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Ed., Pharmaceutical Press, PA (2013). Композиции могут быть приготовлены в жидкой форме или могут находиться в виде сухого порошка, например, в лиофилизированной форме.
[00129] Следует понимать, что фармацевтические композиции, предлагаемые в соответствии с данным изобретением, можно вводить любыми способами, известными в данной области техники. Фармацевтические композиции для введения вводят путем инъекции, перорально, местно или легочным или назальным путем. Например, антисмысловые олигомеры можно доставлять внутривенным, внутриартериальным, внутрибрюшинным, внутримышечным или подкожным путями введения. Подходящий путь может быть определен специалистом в данной области техники в зависимости от состояния пациента, подвергаемого лечению. Предпочтительно антисмысловые олигомеры доставляются в глаз местно, путем внутриглазной инъекции или внутриглазного имплантата, так что эффекты на выработку CNOT3 ограничены в пространстве и не являются системными.
[00130] Составы для местного введения включают те, в которых олигомеры по данному изобретению находятся в смеси с агентом для местной доставки, таким как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Липиды и липосомы могут быть нейтральными (например, диолеоилфосфатидил DOPE, этаноламин, димиристоилфосфатидилхолин, DMPC, дистеаролифосфатидилхолин) отрицательными (например, димиристоилфосфатидилглицерин, DMPG) и катионными (например, диолеоилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеоилфосфатидилэтаноламин DOTMA). Для местного или другого введения олигомеры по данному документе могут быть инкапсулированы в липосомы или могут образовывать с ними комплексы, в частности с катионными липосомами. Альтернативно олигомеры могут образовывать комплексы с липидами, в частности с катионными липидами. Жирные кислоты и сложные эфиры, их фармацевтически приемлемые соли и их применение дополнительно описаны в патенте США № 6287860 и/или заявке на патент США № 09/315298 поданной 20 мая 1999 г.
[00131] В некоторых вариантах реализации антисмысловые олигомеры по данному документу могут быть доставлены местными или трансдермальными способами (например, путем включения антисмысловых олигомеров, например, в эмульсии, с такими антисмысловыми олигомерами, необязательно упакованными в липосомы), включая доставку к глазным поверхностям. Такие местные или трансдермальные и опосредованные эмульсией/липосомами способы доставки описаны для доставки антисмысловых олигомеров в данной области техники, например, в патенте США № 6965025. Предпочтительно местная доставка осуществляется в глаз.
[00132] Описанные в данном документе антисмысловые олигомеры также могут быть доставлены через имплантируемое устройство. Создание такого устройства - это признанный в данной области способ, например, дизайн синтетического имплантата, описанного, например, в патенте США № 6969400. Предпочтительно имплантат может быть имплантирован в глаз для длительной доставки антисмысловых олигомеров.
[00133] Композиции и составы для глазного введения, включая глазную инъекцию, местную глазную доставку и глазной имплантат, могут включать стерильные водные растворы, которые также могут содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, такие как, помимо прочего, усилители проникновения, соединения-носители и другие фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества.
[00134] Доставка терапевтически полезного количества антисмысловых олигомеров может быть достигнута с помощью ранее опубликованных методов. Например, доставка антисмыслового олигомера может осуществляться посредством композиции, содержащей смесь антисмыслового олигомера и эффективного количества блок-сополимера. Пример этого метода описан в заявке на патент США 20040248833. Другие способы доставки антисмысловых олигомеров в ядро описаны у Mann CJ et al. (2001) Proc, Natl. Acad. Science, 98(1) 42-47, и у Gebski et al. (2003) Human Molecular Genetics, 12(15): 1801-1811. Способ введения молекулы нуклеиновой кислоты в клетку посредством вектора экспрессии либо в виде голой ДНК, либо в комплексе с липидными носителями, описан в US 6806084.
[00135] Антисмысловые олигомеры могут быть введены в клетки с использованием методов, признанных в данной области техники (например, трансфекция, электропорация, слияние, липосомы, коллоидные полимерные частицы и вирусные и невирусные векторы, а также другие способы, известные в данной области техники). Выбранный способ доставки будет зависеть, по меньшей мере от обрабатываемых клеток и местоположения клеток и будет очевиден специалисту в данной области техники. Например, локализация может быть достигнута с помощью липосом со специфическими маркерами на поверхности для направления липосомы, прямой инъекцией в ткань, содержащую целевые клетки, специфическим рецептор-опосредованным захватом и т.п.
[00136] Может быть желательно доставить антисмысловой олигомер в коллоидной дисперсионной системе. Коллоидные дисперсионные системы включают комплексы макромолекул, нанокапсулы, микросферы, гранулы и системы на основе липидов, включая эмульсии масло-в-воде, мицеллы, смешанные мицеллы и липосомы или липосомальные композиции. Эти коллоидные дисперсионные системы можно использовать при производстве терапевтических фармацевтических композиций.
[00137] Липосомы представляют собой искусственные мембранные везикулы, которые можно использовать в качестве средств доставки in vitro и in vivo . Эти составы могут иметь характеристики чистого катионного, анионного или нейтрального характера и полезные характеристики для способов доставки in vitro, in vivo и ex vivo. Было показано, что большие однослойные везикулы могут инкапсулировать значительный процент водного буфера, содержащего большие макромолекулы. РНК и ДНК могут быть инкапсулированы внутри водной полости и доставляться в клетки в биологически активной форме (Fraley, et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981).
[00138] Для того чтобы липосомы были эффективным носителем для переноса генов, должны присутствовать следующие характеристики: (1) инкапсуляция представляющего интерес антисмыслового олигомера с высокой эффективностью, не ставя под угрозу его биологическую активность; (2) предпочтительное и существенное связывание с целевой клеткой по сравнению с клетками, не являющимися целевыми; (3) доставка водного содержимого везикулы к цитоплазме целевой клетки с высокой эффективностью; и (4) точная и эффективная экспрессия генетической информации (Mannino, et al., Biotechniques, 6: 682, 1988). Композиция липосом обычно представляет собой комбинацию фосфолипидов, особенно фосфолипидов с высокой температурой фазового перехода, обычно в комбинации со стероидами, особенно холестерином. Также можно использовать другие фосфолипиды или другие липиды. Физические характеристики липосом зависят от pH, ионной силы и присутствия двухвалентных катионов. Катионные липосомы - это положительно заряженные липосомы, которые, как полагают, взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. Считается, что липосомы, чувствительные к pH или отрицательно заряженные липосом, захватывают ДНК, а не образуют с ней комплексы. Как катионные, так и некатионные липосомы используют для доставки ДНК в клетки.
[00139] Липосомы также включают «стерически стабилизированные» липосомы, термин, который в контексте данного документа относится к липосомам, содержащим один или более специализированных липидов, которые при включении в липосомы приводят к увеличению продолжительности циркуляции по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примерами стерически стабилизированных липосом являются те, в которых часть липидной части липосомы, образующей пузырьки, включает один или более гликолипидов или дериватизирована одним или более гидрофильными полимерами, такими как фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ). Липосомы и их использование дополнительно описаны в US6287860.
[00140] Как известно в данной области техники, антисмысловые олигомеры могут быть доставлены с использованием, например, способов, включающих опосредованное липосомами поглощение, липидные конъюгаты, опосредованное полилизином поглощение, опосредованное наночастицами поглощение и опосредованный рецепторами эндоцитоз, а также с использованием дополнительных неэндоцитарных способов доставки, таких как микроинъекция, повышение проницаемости (например, повышение проницаемости стрептолизином-O, повышение проницаемости анионным пептидом), электропорация и различные неинвазивные неэндоцитарные методы доставки, которые известны в данной области техники (см. Dokka and Rojanasakul, Advanced Drug Delivery Reviews 44, 35-49, полностью включена посредством ссылки).
[00141] Антисмысловой олигомер также можно комбинировать с другими фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями для получения фармацевтической композиции. Подходящие носители и разбавители включают изотонические физиологические растворы, например, физиологический раствор с фосфатным буфером. Композиция может быть составлена для парентерального, внутримышечного, внутривенного, подкожного, внутриглазного, перорального или трансдермального введения.
[00142] Описанные пути введения предназначены только в качестве руководства, поскольку специалист в данной области техники сможет легко определить оптимальный способ введения и любую дозировку для любого конкретного животного и состояния.
[00143] Были предприняты многочисленные попытки введения функционального нового генетического материала в клетки как in vitro, так и in vivo (Friedmann (1989) Science, 244: 1275-1280). Эти подходы включают интеграцию гена, который должен быть экспрессирован, в модифицированные ретровирусы (Friedmann (1989) supra; Rosenberg (1991) Cancer Research 51(18), suppl.: 5074S-5079S); интеграцию в неретровирусные векторы (Rosenfeld, et al. (1992) Cell, 68:143-155; Rosenfeld, et al. (1991) Science, 252:431-434); или доставку трансгена, связанного с гетерологичным элементом промотора-энхансера, с помощью липосом (Friedmann (1989), supra; Brigham, et al. (1989) Am. J. Med. Sci., 298:278-281 ; Nabel, et al. (1990) Science, 249:1285-1288; Hazinski, et al. (1991) Am. J. Resp. Cell Molec. Biol., 4:206-209; и Wang and Huang (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 84:7851-7855); в сочетании с лиганд-специфическими транспортными системами на основе катионов (Wu and Wu (1988) J. Biol. Chem., 263:14621-14624) или с использованием голой ДНК, экспрессионных векторов (Nabel et al. (1990), supra); Wolff et al. (1990) Science, 247:1465-1468). Прямая инъекция трансгенов в ткань вызывает только локализованную экспрессию (Rosenfeld (1992) supra); Rosenfeld et al. (1991) supra; Brigham et al. (1989) supra; Nabel (1990) supra; и Hazinski et al. (1991) supra). Группа Brigham et al. (Am. J. Med. Sci. (1989) 298:278-281 and Clinical Research (1991) 39 (abstract)) сообщила о трансфекции in vivo только легких мышей после внутривенного или интратрахеального введения липосомного комплекса ДНК. . Примером обзорной статьи о процедурах генной терапии человека является: Anderson, Science (1992) 256:808-813; Barteau et al. (2008), Curr Gene Ther; 8(5):313-23; Mueller et al. (2008). Clin Rev Allergy Immunol; 35(3):164-78; Li et al. (2006) Gene Ther., 13(18):1313-9; Simoes et al. (2005) Expert Opin Drug Deliv; 2(2):237-54.
[00144] Антисмысловые олигомеры по данному изобретению включают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров или любое другое соединение, которое при введении животному, включая человека, способно поставлять (прямо или косвенно) биологически активный метаболит или остаток. Соответственно, в качестве примера раскрытие также относится к пролекарствам и фармацевтически приемлемым солям соединений по данному изобретению, фармацевтически приемлемым солям таких пролекарств и другим биоэквивалентам.
[00145] Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений по данному изобретению: то есть солям, которые сохраняют желаемую биологическую активность исходного соединения и не оказывают на него нежелательных токсикологических эффектов. Для олигомеров предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей включают, но не ограничиваются ими (а) соли, образованные с катионами, такими как натрий, калий, аммоний, магний, кальций, полиамины, такие как спермин и спермидин, и т.д .; (b) кислотно-аддитивные соли, образованные с неорганическими кислотами, например, хлористоводородной кислотой, бромистоводородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и т.п .; (c) соли, образованные с органическими кислотами, такими как, например, уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, глюконовая кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, пальмитиновая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфоновая кислота, метансульфоновая кислота, п-толуолсульфоновая кислота, нафталиндисульфоновая кислота, полигалактуроновая кислота и тому подобное; и (d) соли, образованные с элементарными анионами, таких как хлор, бром и йод. Фармацевтические композиции по данному изобретению можно вводить несколькими способами в зависимости от того, желательно ли местное или системное лечение, и от области, подлежащей лечению. Введение может осуществляться местным (включая офтальмологические и слизистые оболочки, а также ректальная доставка), легочным (например, путем ингаляции или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе с помощью небулайзера, интратрахеальным, интраназальным, эпидермальным и трансдермальным путем), пероральным или парентеральным путями. Парентеральное введение включает внутривенную, внутриартериальную, подкожную, внутрибрюшинную, внутриглазную или внутримышечную инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или внутрижелудочковое введение. Считается, что олигомеры по меньшей мере с одной 2'-O-метоксиэтильной модификацией особенно полезны для внутриглазного введения. Предпочтительно антисмысловой олигомер доставляется внутриглазным путем.
[00146] Фармацевтические составы по данному изобретению, которые могут быть удобно представлены в стандартной лекарственной форме, могут быть приготовлены в соответствии с обычными методами, хорошо известными в фармацевтической промышленности. Такие методы включают этап объединения активных ингредиентов с фармацевтическим носителем(ями) или вспомогательным веществом(ами). Обычно составы готовят путем однородного и тщательного объединения активных ингредиентов с жидкими носителями или тонко измельченными твердыми носителями или с обоими, а затем, если необходимо, придания продукту формы.
Варианты реализации в швейцарском стиле
[00147] Согласно другому аспекту в данном изобретении предлагается применение одного или более антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе, при производстве лекарственного средства для модуляции или контроля заболевания, связанного с экспрессией CNOT3.
[00148] В данном изобретении также предлагается применение очищенных и выделенных антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе, для производства лекарственного средства для лечения заболевания, связанного с экспрессией CNOT3.
[00149] Также предлагается применение очищенных и выделенных антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе, для производства лекарственного средства для лечения, предотвращения или ослабления эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3.
[00150] Предпочтительно, патология или заболевание, связанное с CNOT3, представляет собой пигментный ретинит.
[00151] Изобретение распространяется, согласно еще одному его аспекту, на кДНК или клонированные копии антисмысловых олигомерных последовательностей по изобретению, а также на векторы, содержащие антисмысловые олигомерные последовательности по изобретению. Изобретение также распространяется на клетки, содержащие такие последовательности и/или векторы.
Наборы
[00152] Также предлагается набор для лечения, предотвращения или ослабления эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3 у пациента, который включает, по меньшей мере антисмысловой олигомер, как описано в данном документе, и его комбинации или коктейли, упакованные в подходящий контейнер вместе с инструкцией по его применению.
[00153] В предпочтительном варианте реализации наборы будут содержать по меньшей мере один антисмысловой олигомер, как описано в данном документе или как показано в Таблице 1, или SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, еще более предпочтительно, SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64 или смесь антисмысловых олигомеров, как описано в данном документе. Наборы также могут содержать периферические реагенты, такие как буферы, стабилизаторы и т. д.
[00154] Поэтому предлагается набор для лечения, предотвращения или облегчения заболевания или состояния, связанного с экспрессией CNOT3 у пациента, который включает, по меньшей мере антисмысловой олигомер, описанный в данном документе или как показано в Таблице 1, и его комбинации или коктейли, упакованные в подходящий контейнер, вместе с инструкциями по его применению.
[00155] Также предложен набор для лечения, предотвращения или облегчения заболевания или состояния, связанного с экспрессией CNOT3 у пациента, который содержит по меньшей мере антисмысловой олигомер, выбранный из группы, состоящей из любой одной или более из SEQ ID NO: 1-74, более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 14, 16-18, 27, 30, 34, 35, 64 и 67, еще более предпочтительно SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64 , а также его комбинации или коктейли, упакованные в подходящий контейнер, вместе с инструкциями по его применению.
[00156] Предпочтительно заболевание или состояние представляет собой пигментный ретинит.
[00157] Содержимое набора можно лиофилизировать, и набор может дополнительно содержать подходящий растворитель для восстановления лиофилизированных компонентов. Отдельные компоненты набора будут упакованы в отдельные контейнеры и, связанные с такими контейнерами, могут быть уведомления в форме, предписанной государственным органом, регулирующим производство, применение или продажу фармацевтических или биологических продуктов, причем уведомление отражает одобрение агентства производства, применения или продажи для введения человеку.
[00158] Когда компоненты набора представлены в одном или более жидких растворах, жидкий раствор может быть водным раствором, например, стерильным водным раствором. Для применения in vivo экспрессионная конструкция может быть составлена в виде фармацевтически приемлемой композиции для введения с помощью шприца. В этом случае контейнер может представлять собой ингалятор, шприц, пипетку, глазную капельницу или другое подобное устройство, из которого состав может быть нанесен на пораженный участок животного, такой как легкие, введенный животному, или даже наносится и смешивается с другими компонентами набора.
[00159] В одном варианте реализации набор по данному изобретению содержит композицию, содержащую терапевтически эффективное количество антисмыслового олигомера, способного связываться с выбранной мишенью на транскрипте гена CNOT3 для модификации сплайсинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3 или его части. В альтернативном варианте реализации композиция находится в предварительно отмеренной, предварительно смешанной и/или предварительно упакованной форме. Желательно, чтобы внутриглазный раствор был стерильным.
[00160] Набор по данному изобретению может также включать инструкции, разработанные для облегчения соблюдения схемы введения пользователем. Используемые в данном документе инструкции относятся к любой этикетке, вкладышу и т.д. и могут быть размещены на одной или более поверхностях упаковочного материала, или инструкции могут быть предоставлены на отдельном листе или любой их комбинации. Например, в одном варианте реализации набор по данному изобретению содержит инструкции по введению составов по данному изобретению. В одном варианте реализации инструкции указывают, на то, что состав по данному изобретению подходит для лечения пигментного ретинита. Такие инструкции могут также включать инструкции по дозировке, а также инструкции по применению путем местной доставки в глаз или посредством внутриглазной инъекции.
[00161] Антисмысловые олигомеры и подходящие вспомогательные вещества могут быть упакованы индивидуально, чтобы позволить практикующему врачу или пользователю при необходимости формулировать компоненты в фармацевтически приемлемую композицию. Альтернативно, антисмысловые олигомеры и подходящие вспомогательные вещества могут быть упакованы вместе, что требует минимальной стадии составления от практикующего врача или пользователя. В любом случае упаковка должна сохранять химическую, физическую и эстетическую целостность активных ингредиентов.
Общие пункты
[00162] Специалисты в данной области техники поймут, что описанное в данном документе изобретение допускает изменения и модификации, отличные от конкретно описанных. Изобретение включает в себя все такие вариации и модификации. Изобретение также включает все этапы, особенности, составы и соединения, упомянутые или указанные в описании, по отдельности или вместе, и любые и все комбинации или любые две или более этапов или признаков.
[00163] Каждый документ, ссылка, заявка на патент или патент, цитируемые в данном тексте, прямо включены в него во всей своей полноте посредством ссылки, что означает, что они должны быть прочитаны и рассмотрены читателем как часть данного текста. То, что документ, ссылка, заявка на патент или патент, цитируемые в этом тексте, не повторяются в этом тексте, сделано для краткости.
[00164] Любые инструкции производителя, описания, спецификации продуктов и листы продуктов для любых продуктов, упомянутых в данном документе или в любом документе, включенном в данный документ посредством ссылки, тем самым включены в данный документ посредством ссылки и могут быть использованы при практике изобретения.
[00165] Объем данного изобретения не ограничивается каким-либо из конкретных вариантов реализации, описанных в данном документе. Эти варианты реализации предназначены только для иллюстрации. Функционально эквивалентные продукты, составы и способы явно входят в объем изобретения, как описано в данном документе.
[00166] Описанное в данном документе изобретение может включать в себя один или более диапазонов значений (например, размер, смещение, напряженность поля и т. д.). Под диапазоном значений будут пониматься все значения в пределах диапазона, включая значения, определяющие диапазон, и значения, примыкающие к диапазону, которые приводят к тому же или по существу к тому же результату, что и значения, непосредственно примыкающие к тому значению, которое определяет границу диапазона. Соответственно, если не указано иное, числовые параметры, изложенные в описании и формуле изобретения, являются приблизительными, и могут варьироваться в зависимости от желаемых свойств, которые стремятся получить с помощью данного изобретения. Следовательно, «около 80%» означает «около 80%», а также «80%». По меньшей мере, каждый числовой параметр следует рассматривать в свете количества значащих цифр и обычных подходов к округлению.
[00167] В данном описании, если контекст не требует иного, слово «содержать» или варианты, такие как «содержит» или «содержащий», будет пониматься как подразумевающее включение указанного целого числа или группы целых чисел, но не исключение любого другого целого числа или группы целых чисел. Также следует отметить, что в этом документе и, в частности, в формуле изобретения и/или параграфах такие термины, как «содержит», «содержащий», «содержать» и т.п., могут иметь значение, приписываемое им в Патентном законодательстве США; например, они могут означать «включает», «включенный», «включающий» и тому подобное; и что такие термины, как «состоящий по существу из» и «состоит по существу из», имеют значение, приписываемое им в Патентном законодательстве США, например, они допускают элементы, не перечисленные явно, но исключают элементы, которые встречаются в предшествующем уровне техники или которые влияют на основную или новую характеристики изобретения.
[00168] Другие определения выбранных терминов, используемых в данном документе, можно найти в подробном описании изобретения и применять по всем документу. Если не указано иное, все другие используемые в данном документе научные и технические термины имеют то же значение, которое обычно понимается специалистом в данной области техники, к которой принадлежит изобретение. Термин «активный агент» может означать один активный агент или может включать два или более активных агента.
[00169] Идентификационные номера последовательностей («SEQ ID NO:»), содержащие информацию о нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, включенную в это описание, собраны в конце описания и были получены с использованием программы Patentln Version 3.0. Каждая нуклеотидная или аминокислотная последовательность идентифицируется в списке последовательностей числовым индикатором <210>, за которым следует идентификатор последовательности (например, <210> 1, <210> 2 и т. д.). Длина, тип последовательности и исходный организм для каждой нуклеотидной или аминокислотной последовательности указаны с помощью информации, представленной в полях числовых индикаторов <211>, <212> и <213>, соответственно. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности, указанные в описании, определяются информацией, представленной в поле числового индикатора <400>, за которым следует идентификатор последовательности (например, <400> 1, <400> 2 и т. д.).
[00170] Система номенклатуры антисмысловых олигомеров была предложена и опубликована для различения различных антисмысловых олигомеров (см. Mann et al., (2002) J Gen Med 4, 644-654). Эта номенклатура стала особенно актуальной при тестировании нескольких немного разных антисмысловых олигомеров, направленных на одну и ту же целевую область, как показано ниже:
H # A/D (x:y)
первая буква обозначает вид (например, H: человек, M: мышь)
«#» обозначает номер целевого экзона
«A/D» указывает акцепторный или донорный сайт сплайсинга в начале и конце экзона, соответственно.
(xy) представляет координаты отжига, где «-» или «+» обозначают интронные или экзонные последовательности соответственно. Например, A (-6+18) будет указывать на последние 6 оснований интрона, предшествующего целевому экзону, и первые 18 оснований целевого экзона. Ближайший сайт сплайсинга будет акцептором, поэтому этим координатам будет предшествовать буква «A». Координаты отжига в донорском сайте сплайсинга могут быть описаны как D (+2-18), где последние 2 экзонных основания и первые 18 интронных оснований соответствуют сайту отжига антисмыслового олигомера. Координаты полностью экзонного отжига, которые будут представлены как A (+65+85), то есть место между 65-м и 85-м нуклеотидом включительно от начала этого экзона.
[00171] Следующие ниже примеры служат для более полного описания способа использования описанного выше изобретения, а также для изложения наилучших способов, предполагаемых для выполнения различных аспектов изобретения. Понятно, что эти способы никоим образом не служат для ограничения истинного объема этого изобретения, а скорее представлены в качестве иллюстрации.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
АО-опосредованный пропуск экзона, вызывающий сдвиг рамки считывания в CNOT3
[00172] Структура экзона CNOT3 показана на Фиг. 1. AO с переключением сплайсинга были разработаны для нацеливания на сайты энхансеров в экзонах со сдвигом рамки считывания в пре-мРНК CNOT3 (Фиг. 1), чтобы вызвать пропуск экзона и, как следствие, потерю открытой рамки считывания и нокдаун CNOT3.
[00173] Нормальные фибробласты человека и фибробласты пациента с ПР11 (PRPF31 c.1205 C>A Ser402*) были получены из биопсий кожи и культивированы в среде DMEM с добавлением 10% FBS. Антисмысловые последовательности (Таблица 1), синтезированные на месте в виде олигомеров 2'O-метилфосфоротиоата, трансфицировали в фибробласты в 24-луночных планшетах в виде липоплексов с использованием Lipofectamine 3000 (Life Technologies) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательности, которые были эффективны в изменении отбора целевых экзонов, затем были синтезированы как фосфородиамидат-морфолиноолигомеры (PMO) и трансфицированы в фибробласты как i) не образующие комплекс ii) отожженые до смысловой привязки ODN и доставленные с Lipofectamine 3000 (как указано выше), или iii) нуклеофекция с использованием набор P2 первичных клеток 4-D Nucleofector X S (Lonza) в соответствии с инструкциями производителя.
[00174] Общую РНК экстрагировали из трансфицированных и контрольных клеток с применением системы экстракции РНК MagMax (Life Technologies). Представляющие интерес транскрипты оценивали сначала с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР, а затем с помощью РВ-кПЦР. кДНК (РНК 300 нг) синтезировали в соответствии с инструкциями производителя с использованием набора обратной транскриптазы SuperScript IV (Life Technologies). ОТ-ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы LA Taq с буфером I для GC (TAKARA) в соответствии с инструкциями производителя.
[00175] Три различных набора праймеров были использованы для оценки транскриптов CNOT3 после того, как клетки были трансфицированы АО, пропускающими экзон CNOT3:
1. Для АО, нацеленных на экзон 3, прямой отжиг праймера к экзону 2 был спарен с обратным праймером в экзоне 6.
2. Для АО, нацеленных на экзоны 8 и 9, прямой праймер в экзоне 7 был спарен с обратным праймером в экзоне 11.
3. Для АО, нацеленных на экзоны 16 и 17, прямой праймер в экзоне 15 был спарен с обратным праймером в экзоне 18.
[00176] РВ-кПЦР использовали для количественного определения уровней транскрипта PRPF31 после трансфекции с помощью АО, пропускающего экзон CNOT3. Прямой праймер через соединение экзонов 2 и 3 PRPF31 был спарен с обратным праймером через соединение экзонов 3 и 4 (Таблица 2). Результаты для всех клеток, обработанных AO CNOT3, нормализовали к экспрессии двух конститутивных генов, TBP и GAPDH, и сравнивали с клетками, обработанными Anti ISS-N1 и плацебо AO, для расчета крайностей в изменении уровней транскриптов PRPF31.
Таблица 2: Праймеры для ОТ-ПЦР и РВ-кПЦР для CNOT3, PRPF31 и конститутивных генов, TBP и GAPDH.
[00177] Секвенирование индуцированных (меньших) продуктов транскрипта CNOT3, которые, как предполагается, являются результатом индуцированного пропуска экзона, показало, что АО 3697 и 3698 опосредовали пропуск экзона 3, АО 3702 индуцировал как частичный, так и полный пропуск экзона 8 и АО 3703 опосредовал дозозависимый пропуск экзона 8 (данные не показаны). Затем АО, которые опосредовали эффективный пропуск экзонов 3, 8 или 9 CNOT3, трансфицировали в фибробласты пациентов с ПР на 48 часов, и транскрипты CNOT3 анализировали с помощью ОТ-ПЦР (Фиг. 2). Пропуск экзона CNOT3 был очевиден через 48 часов после трансфекции с некоторым снижением уровней продукта полноразмерного транскрипта. Экзон 3 был пропущен AO 3697, экзон 8 был пропущен AO 3702 и 3703, и экзон 9 был пропущен AO 3706.
[00178] Ранее мы показали, что фосфородиамидатморфолино (PMO) химия более эффективно опосредует модификацию сплайсинга, чем те же последовательности, синтезированные с помощью 2'O-метил PS химии. Следовательно, наиболее многообещающие последовательности АО для нокдауна транскрипта CNOT3 будут синтезированы как PMO и трансфицированы в нормальные фибробласты, не образовывая комплексы, с помощью поводка/липоплекса или посредством нуклеофекции (Nucleofector, Lonza). Оценка и оптимизация последовательности АО, нацеленной на CNOT3, продолжаются.
[00179] Клетки SH-SY5Y часто используются в качестве моделей нейрональной функции и дифференцировки in vitro. Они являются адренергическими по фенотипу, но также экспрессируют дофаминергические маркеры. АО, которые модифицируют транскрипты CNOT3 в фибробластах, будут оцениваться в дифференцированных клетках SH-SY5Y на способность подавлять CNOT3 и увеличивать экспрессию PRPF31 (транскрипт и белок).
Пример 2
АО-опосредованное удержание терминального интрона для подавления CNOT3
[00180] Антисмысловые последовательности были разработаны для нацеливания на концевой экзон CNOT3, чтобы вызвать удержание концевого интрона и нокдаун CNOT3.
[00181] 2'O-метил АО, нацеленные на концевой экзон CNOT3, трансфицировали в фибробласты пациента adRP11 в течение 48 часов. ОТ-ПЦР анализ показал, что транскрипты CNOT3 AOS 3887, 3888 и 3889 (Таблица 1), индуцировали удержание терминального интрона и дозозависимое снижение уровня полноразмерного транскрипта продукта (Фиг. 3).
Пример 3
Набор и проверка семей с ПР
[00182] Мы исследовали 3 поколения 2 семей в Западной Австралии (1 европеоидная и 1 аборигенная) с мутациями PRPF31 (Фиг. 4). Мы получили дермальные фибробласты от 7 пациентов и начали мониторинг прогрессирования заболевания у 10 из 24 больных в этих семьях.
Таблица 3: Выявленные мутации, вызывающие ПР11, и соответствующее количество пациентов с каждой подтвержденной мутацией (информация из Австралийского реестра наследственных заболеваний сетчатки по состоянию на 2018 год).
Пример 4
Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток от пациента с ПР11 и контрольных фибробластов и оценка экспрессии генов, как следствие нокдауна CNOT3
[00183] Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки будут получать из фибробластов пациента и контрольных фибробластов. Фибробласты пациента будут трансфицировать перепрограммируемыми эписомами (ThermoFisher®) с использованием системы электропорации NEON®. В типичном эксперименте по перепрограммированию 12-15 iPSC-подобных колоний отбирают через 3-4 недели после трансфекции и пересеивают для оценки экспрессии плюрипотентного гена с помощью иммуноокрашивания и анализа ОТ-ПЦР (Фиг. 5A-C). Затем будут выбраны три клона для дополнительного тестирования, включая профилирование экспрессии генов с помощью TaqMan Arrays (Human Stem Cell Pluripotency Arrays, ThermoFisher) и виртуальное кариотипирование с помощью анализа хромосомных G-полос с анализом QuantiSNP (AGRF).
[00184] Чтобы продемонстрировать потенциал дифференциации трех линий, iPSC культивируют в виде эмбриоидных телец в течение 2-4 недель и исследуют на экспрессию маркеров дифференцииации эктодермы, мезодермы и энтодермы, а также на подавление маркеров плюрипотентности с помощью ОТ-ПЦР (Фиг. 5C). iPSC будут дифференцироваться в органоиды сетчатки с использованием опубликованного протокола CIF (Mellough et al., Efficient stage-specific differentiation of human pluripotent stem cells toward retinal photoreceptor cells. Stem Cells, 2012. 30(4): p. 673-86.), (Фиг. 5D-H).
[00185] Дифференцированные клетки будут трансфицированы ведущим АО, нацеленным на CNOT3, синтезированным в виде морфолиносоединений, в трипликатах для каждого анализа.
[00186] Будут проанализированы CNOT3, PRPF31 и другие транскрипты факторов сплайсинга. CNOT3, PRPF31 и выбранные белки парапекл и факторы сплайсинга будут оцениваться с помощью вестерн-блоттинга и иммунофлуоресценции, чтобы отразить целостность механизма и путей сплайсинга.
Пример 5
Дозозависимое тестирование АО
[00187] Последовательности АО были разработаны для пропуска выбранных экзонов из матричной РНК CNOT3 и трансфицированы в виде АО 2'O-метилфосфоротиоатов в фибробласты после образования комплекса с катионными липосомами для эффективной трансфекции. Пропуск целевого экзона приводит к получению укороченного продукта ОТ-ПЦР матричной РНК, идентифицированного путем разделения и окрашивания продуктов на 2% агарозном геле (Фиг. 6 и 7).
[00188] Предпочтительные последовательности демонстрируют дозозависимый пропуск целевого экзона. Затем ведущие последовательности были синтезированы в виде олигомеров фосфородиамидат-морфолино (PPMO) для тестирования путем трансфекции в фибробласты пациента.
[00189] У пациентов с ПР11 уровни PRPF31 равны около 50% от уровня таковых для здорового населения. Уровни информационных РНК для CNOT3 и PRPF31 количественно определяли с помощью обратной транскрипции и количественной ПЦР (ОТ-кПЦР) у членов семей ПР 11 и в здоровом контроле. Фиг. 8a показывает, что более высокая экспрессия CNOT3 коррелирует со снижением уровня PRPF31 и клиническим исходом у гетерозиготных носителей мутации PRPF31. Пропуск целевых экзонов CNOT3 оценивали с помощью РВ-кПЦР (Фиг. 8b, 8c), и экспрессия PRPF31 после обработки АО показана в сравнении с таковой в клетках, обработанных контрольной последовательностью АО (контрольное значение трансфекции 25 нМ АО установлено на 1), которая не нацелены на какую-либо область генома здорового человека (эффект не ожидается - отрицательный контроль). Данные для необработанных клеток включены для сравнения.
[00190] У пациентов с ПР11 уровни PRPF31 равны около 50% от таковых для здоровой популяции, тогда как у бессимптомных носителей мутации уровень PRPF31 составляет не менее чем 70% от такового у здоровой популяции или выше. Ожидается, что увеличение в 1,5 раза экспрессии PRPF31 (например, пропуск экзона 3 или 10 CNOT3, Фиг. 8b и пропуск экзонов 9, 16 или 17 CNOT3, Фиг. 8C), восстановит функцию сплайсинга в пигментном эпителии сетчатки ПР11.
Пример 6
Пропуск экзона CNOT3, опосредованный антисмысловыми олигомерами, усиливает экспрессию PRPF31 в iPSC пигментном эпителии сетчатки (RPE), полученном от ПР11 пациента, и восстанавливает длину и количество первичных ресничек.
[00191] ASO6 (SEQ ID NO: 64, CNOT3_H17A(+83+107), нацеленный на экзон 17 CNOT3 ) был синтезирован как фосфородиамидат-морфолиноолигомер (PMO) и трансфицирован в RPE, полученный из ПР11 iPSC, путем прямой трансфекции с использованием 5 мкМ ASO в культуральной среде.
[00192] Иммуноцитохимию использовали для иммуноокрашивания ресничек и базального тельца в RPE дикого типа и ПР11 с обработкой антисмысловым олигомером или без нее.
Протокол иммуноокрашивания ресничек
[00193] Клетки RPE на предметном стекле камеры фиксировали, используя ледяной ацетон-метанол (1:1) в течение 4 минут, затем сушили на воздухе. Клетки блокировали в течение 30 минут в 10% фильтрованной козьей сыворотке в ФСБ. Для окрашивания базального тельца клетки инкубировали с мышиным антителом к перицентрину (1:100) в течение 1 часа при комнатной температуре. Первичные антитела детектировали с использованием антимышиных AlexaFluoro488 (1: 400). Для окрашивания ресничек клетки инкубировали с кроличьими антителами к ARL13B (1: 500) и инкубировали в течение ночи при 4 °C. Второе первичное антитело детектировали с использованием антикроличьего AlexaFluoro568 (1:400) в течение 1 часа при комнатной температуре и контрастировали с помощью Hoechst для обнаружения ядер (разведение 1:125). Покровное стекло помещали на предметное стекло, используя антибликовое средство Prolong Gold.
Конфокальный анализ и количественная оценка
[00194] Первичные реснички RPE оценивали для оценки функции PRPF31 с помощью конфокальной микроскопии. Около 300 клеток RPE/образец измеряли на длину ресничек с помощью программного обеспечения NIS-Elements Imaging.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| МОДУЛЯТОРЫ И МОДУЛЯЦИЯ РНК РЕЦЕПТОРА КОНЕЧНЫХ ПРОДУКТОВ ГЛУБОКОГО ГЛИКИРОВАНИЯ | 2020 |
|
RU2820247C2 |
| Система направленного изменения сплайсинга в гене MARK2 | 2023 |
|
RU2810907C1 |
| ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С НЕЙТРОФИЧЕСКИМ ФАКТОРОМ ГОЛОВНОГО МОЗГА (BDNF), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА BDNF | 2013 |
|
RU2661104C2 |
| АНТИСМЫСЛОВЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ | 2015 |
|
RU2702424C2 |
| ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ИНТЕРФЕРОН- СВЯЗАННЫМ РЕГУЛЯТОРОМ РАЗВИТИЯ 1 (IFRD1), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К IFRD1 | 2011 |
|
RU2611195C2 |
| ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ГЕНОМ АЛЬФА-L-ИДУРОНИДАЗЫ (IDUA), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА ГЕНА IDUA | 2011 |
|
RU2597972C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ МОДУЛЯЦИИ SMN2 СПЛАЙСИНГА У СУБЪЕКТА | 2010 |
|
RU2683772C2 |
| АНТИСМЫСЛОВЫЕ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ | 2015 |
|
RU2730681C2 |
| ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ГЕНОМ DLG, ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА ГЕНА DLG | 2011 |
|
RU2611190C2 |
| ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С АЛЬФА-СУБЪЕДИНИЦЕЙ ПОТЕНЦИАЛЗАВИСИМОГО НАТРИЕВОГО КАНАЛА (SCNA), ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА ГЕНА SCNA | 2011 |
|
RU2588654C2 |
Группа изобретений относится к биотехнологии. Представлены: выделенный или очищенный антисмысловой олигомер для модификации сплайсинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3, фармацевтическая композиция для лечения эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3, у пациента, способ лечения заболевания, связанного с экспрессией CNOT3 и набор для лечения эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3, у пациента. Причем набор содержит антисмысловой олигомер и комбинации или коктейли, упакованные в подходящий контейнер вместе с инструкцией по их применению. Изобретение направлено на получение антисмыслового олигомера для модификации сплайсинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3 или его части. 4 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл., 19 ил., 6 пр.
1. Выделенный или очищенный антисмысловой олигомер для модификации сплайсинга пре-мРНК в транскрипте гена CNOT3 или его части, выбранный из списка, состоящего из SEQ ID NO: 1-61 или 63-74.
2. Антисмысловой олигомер по п. 1, выбранный из списка, состоящего из: SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11, 15, 16-18, 27, 30, 34, 35 и 64.
3. Антисмысловой олигомер по п. 1 или 2, выбранный из списка, состоящего из SEQ ID NO: 4, 7, 27, 30, 34 и 64.
4. Антисмысловой олигомер по любому из пп. 1-3, причем:
(а) антисмысловой олигомер содержит одно или более положений нуклеотидов, подверженных альтернативной химической обработке или модификации, выбранной из списка, включающего: (i) модификацию структуры основной цепи; (ii) модификацию сахарных фрагментов; (iii) придание устойчивости к РНКазе H; (iv) использование химического подхода создания олигомеров-миметиков; и/или
(b) когда в нуклеотидной последовательности присутствует любой урацил (U), урацил (U) заменяется тимином (T).
5. Антисмысловой олигомер по любому из пп. 1-4, причем антисмысловой олигомер представляет собой фосфородиамидатный морфолиноолигомер.
6. Антисмысловой олигомер по любому из пп. 1-5, в котором:
(i) антисмысловой олигомер представляет собой фосфородиамидатный морфолиноолигомер;
(ii) последовательность антисмыслового олигомера соответствует SEQ ID NO: 64; и
(iii) любой урацил (U), присутствующий в нуклеотидной последовательности, заменяется тимином (T).
7. Фармацевтическая композиция для лечения эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3, у пациента, причем композиция содержит:
a) один или более антисмысловых олигомеров по любому из пп. 1-6, и
b) один или более фармацевтически приемлемых носителей и/или разбавителей.
8. Способ лечения заболевания, связанного с экспрессией CNOT3, включающий этап:
a) введения пациенту эффективного количества антисмыслового олигомера по любому из пп. 1-6 или фармацевтической композиции по п. 7.
9. Набор для лечения эффектов заболевания, связанного с экспрессией CNOT3, у пациента, причем набор содержит по меньшей мере антисмысловой олигомер по любому из пп. 1-6 и их комбинации или коктейли, упакованные в подходящий контейнер вместе с инструкцией по их применению.
10. Фармацевтическая композиция по п. 7, способ по п. 8 или набор по п. 9, причем заболевание, связанное с экспрессией CNOT3, представляет собой пигментный ретинит.
11. Фармацевтическая композиция по п. 7 или 10, способ по п. 8 или 10 или набор по п. 9 или 10, причем субъектом, страдающим заболеванием, связанным с экспрессией CNOT3, является человек.
12. Антисмысловой олигомер по любому из пп. 1-6, композиция по любому из пп. 7, 10 или 11, способ по любому из пп. 8, 10 или 11 или набор по любому из пп. 9-11, приводящие к уровню экспрессии белка PRPF31 в 1,5-5 раз выше, чем уровень экспрессии белка PRPF31 у субъектов с симптоматическими мутациями PRPF31.
| PITOUT L., Modulation of modifiers of Pre-mRNA splicing: A therapeutic strategy for amenable inherited diseases, PhD Thesis Abstract, Murdoch University, 2018 | |||
| VENTURINI G et al., CNOT3 is a modifier of PRPF31 mutations in retinitis pigmentosa with incomplete penetrance, PLoS Genetics | |||
| Изложница с суживающимся книзу сечением и с вертикально перемещающимся днищем | 1924 |
|
SU2012A1 |
| Топка с несколькими решетками для твердого топлива | 1918 |
|
SU8A1 |
| Походная разборная печь для варки пищи и печения хлеба | 1920 |
|
SU11A1 |
| DIAKATOU M et al., Genome editing as a | |||
