Способ получения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида Российский патент 2024 года по МПК C07D213/81 A61K31/4425 A61P31/12 

Из уровня техники известно вещество - энисамия йодид, которое является производным изоникотиновой кислоты.

Энисамия йодид является индуктором эндогенного интерферона. Вещество связывает гемагглютинины вируса гриппа А, в результате чего вирионы становятся неспособными к присоединению с клетками-мишенями с целью репликации.

Энисамия йодид стабилизирует лизосомальные и клеточные мембраны, тормозит дегрануляцию базофилов, нормализует уровень простагландинов, оказывает антиоксидантное действие, ослабляет сосудистые реакции в очагах воспаления.

Энисамия йодид входит в состав нескольких зарегистрированных в России и мире препаратов с МНН «энисамия йодид».

Помимо этого, указанное вещество включено в рекомендации для врачей как препарат с прямым противовирусным действием (см. "Лекарственная терапия острых респираторных вирусных инфекций (ОРВИ) в амбулаторной практике в период эпидемии COVID-19", версия 2 (16.04.2020), далее - [1].

Из уровня техники известны сведения о способе получения энисамии йодида.

Указанный способ включает несколько стадий, сырьем для получения энисамия йодида служит изоникотиновая кислота (см. RU 2689775, 29.05.2019, далее - [2]).

При этом в ближайших аналогах к предложенной группе изобретений [1] и [2] не раскрыты сведения о новом веществе 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида, его активности в отношении заболеваний человека разной этиологии.

Кроме того, способ по патентному документу [2], направлен на получение энисамия йодида, а не нового вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Поэтому техническая задача заявленной группы изобретений заключается в разработке тонкого органического синтеза вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида, в проведении его последующей идентификации и в исследовании биологической активности вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Техническим результатом заявленной группы изобретений является:

- Получение нового вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида;

- Создание способа получения вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида;

- Подтверждение структуры и состава вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида;

- Биологическая активность вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в отношении вирусных и невирусных инфекций у пациентов;

- Биологическая активность вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в отношении нейроинфекций у пациентов;

- Проникновение вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида через гематоэнцефалический барьер пациента;

- Наличие высокой тканевой доступности вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида у пациентов;

- Поступление вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодид в системный кровоток пациента;

- Способность у вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида распределяться в органы и ткани пациентов.

Заявленное решение реализуется в способе получения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Предложен способ получения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида, при котором в качестве исходного сырья для его получения используют этиловый эфир 3-гидроксиизоникотиновой кислоты, с последующим его нагревом до 120°С.

Согласно второму зависимому пункту формулы нагрев этилового эфира проводят в течение 6 часов.

Сущность изобретения поясняется графическими материалами.

Таблица 1. Ряд метаболитов энисамия йодида.

Таблица 2. Прогноз проницаемости метаболитов энисамия йодида через гематоэнцефалический барьер.

Таблица 3. Результаты экспериментов по получению 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метил пиридин-1-ия йодида.

Таблица 4. Содержание 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге крыс после однократного внутрижелудочного введения тестируемого объекта в дозе 100 мг/кг.

Таблица 5. Основные показатели проникновения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головной мозг крыс после однократного внутрижелудочного введения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в дозе 100 мг/кг.

Таблица 6. Содержание 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге крыс после многократного внутрижелудочного введения, тестируемого 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в дозе 100 мг/кг, мкг/мл.

Таблица 7. Основные показатели проникновения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге крыс после многократного внутрижелудочного введения, тестируемого 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в дозе 100 мг/кг.

Таблица 8. Влияние 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида на репродукцию бактерии S. pneumoniae серотипа 19А, вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, вирусы герпеса, арбовирусы, парамиксовирусы, энтеровирусы ECHO и Коксаки.

Таблица 9. Влияние энисамия йодида на инфекционную активность бактерии S pneumoniae серотипа 19А, вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, вирусы герпеса, арбовирусы, парамиксовирусы, энтеровирусы ECHO и Коксаки.

Рисунок 1. Кривая «концентрация-время» 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге крыс после однократного внутрижелудочного введения тестируемого объекта 4-(бензилкарбамоил) -3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в дозе 100 мг/кг в линейных координатах (n=5, ).

Рисунок 2. Кривая «концентрация-время» 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге крыс после однократного внутрижелудочного введения тестируемого 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в дозе 100 мг/кг в полулогарифмических координатах (n=5, ).

Рисунок 3. Кривая «концентрация-время» 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге крыс после однократного и многократного внутрижелудочного введения тестируемого 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в дозе 100 мг/кг в линейных координатах (n=5, ).

Рисунок 4. Кривая «концентрация-время» 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге крыс после однократного и многократного внутрижелудочного введения тестируемого 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в дозе 100 мг/кг в полулогарифмических координатах (n=5, ).

Рисунок 5. Тканевая доступность (ft) 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в ткани и органы крыс после однократного и многократного внутрижелудочного введения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в дозе 100 мг/кг.

Рисунок 6. Хроматограммы образцов 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида и йодида натрия.

Рисунок 7. ¹Н ЯМР спектр этилового эфира 3-гидроксиизоникотиновой кислоты.

Рисунок 8. Масс-спектр 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Рисунок 9. ¹H ЯМР спектр соединения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Рисунок 10. Хроматограмма соединения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Рисунок 11. Влияние 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида на репродукцию вируса S. pneumoniae серотипа 19А.

Рисунок 12. Снижение инфекционной активности бактерии S pneumoniae серотипа 19А, вирусного менингита (вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, вирусы герпеса, арбовирусы, парамиксовирусы, энтеровирусы ECHO и Коксаки) в присутствии 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Сущность заявленной группы решений.

Для прогноза профилей биологической активности энисамия йодида, его аналогов, метаболитов и производных была использована компьютерная программа PASS (Prediction of Activity Spectra for Substances).

Разработка компьютерной программы PASS, прогнозирующей спектры биологической активности органических молекул, была начата более 30 лет назад в рамках Государственной системы регистрации новых химических соединений, синтезированных в СССР.

Данная программа по структурной формуле лекарственно-подобного органического соединения предсказывает профиль его биологической активности.

Профиль биологической активности включает несколько тысяч видов биологических активностей, на основе анализа взаимосвязей «структура-активность», содержащей свыше 1 млн биологически активных органических соединений.

В программе PASS под спектром биологической активности органического соединения понимается множество различных видов биологической активности, которые отражают результат его взаимодействия с различными биологическими объектами.

Спектр биологической активности отражает "внутренние", присущие данному соединению свойства, зависящие только от строения его молекул.

Это качественное характеристическое свойство вещества, зависящие только от структуры его молекул, что обеспечивает возможность объединения в единой обучающей выборке больших массивов данных из различных информационных источников.

Компьютерная оценка профилей биологической активности энисамия йодида, его аналогов, производных и метаболитов с использованием программы PASS выполнялась впервые.

Здесь необходимо отметить, что структурная формула энисамия йодида включает заряженный четырехвалентный азот с заместителями, отличными от водорода.

Заряд молекулы энисамия не может быть нейтрализован и его солям не соответствует ни одна основная форма.

Следовательно, энисамий йодид и его аналоги не удовлетворяют общепринятым критериям при подготовке обучающих выборок для построения зависимостей «структура-свойство». Поэтому для получения результатов по энисамию йодиду в программе прогноза спектров биологической активности был модифицирован алгоритм работы программы с целью обработки соединений, главная компонента структурной формулы которых имеет суммарный заряд, отличный от нуля (для случаев наличия в ней четырехвалентного азота). В результате проведенного исследования были выявлен ряд метаболитов энисамия йодида. Перечень метаболитов приведен в Таблице 1.

Кроме того, заявителем был выполнен прогноз проницаемости через гематоэнцефалический барьер энисамия йодида и его метаболитов с использованием программы GUSAR.

В результате этой работы было выявлено, что все они обладают способностью прохождения через гематоэнцефалический барьер. Результаты приведены в Таблице 2. Согласно приведенным в Таблице 1 данным, среди метаболитов энисамия йодида, наиболее перспективными с точки зрения биологической активности являются Метаболит 5 (4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридиния йодид),

Метаболит 6 (N-(циклогекса-1,3-диен-1-илметил)изоникотинамид) и метаболит 9 (N-бензил-2-оксо-1,2-дигидропиридин-4-карбоксамид).

Эти соединения, согласно расчетам, обладают активностью такой же или большей, чем сам энисамия йодид.

Метаболит 5 при этом превосходит по прогнозируемой активности энисамия йодид более чем в 50 раз и Метаболиты 6 и 9 более чем в 40 раз.

Кроме того, и с точки зрения поиска подходов к практическому получению Метаболит 5, который имеет в своем составе доступные химические блоки, сильно превосходит Метаболиты 6 и 9, синтез которых осуществить из простых доступных прекурсоров невозможно.

Таким образом, именно, Метаболит 5 (4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридиния йодид) был выбран как наиболее перспективный для синтеза, исследования биологической активности in vitro, in vivo и дальнейшего изучения в качестве потенциального лекарственного препарата.

Структурная формула Метаболита 5 - 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида представлена ниже.

Брутто формула 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида: C14H15IN2O2.

Вещество 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодид ранее не было синтезировано.

Из ближайшего аналога [2] к предложенному способу получения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида известно, что в качестве сырья для его получения используется изоникотиновая кислота.

За основу получения соединения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида была использована следующая схема синтеза:

Из уровня техники известно, что ацилирование бензиламина 2 можно проводить, используя как непосредственно карбоновую кислоту, так и ее производные - сложные эфиры, галогенангидриды и т.п.

Причем ацилирующая способность различных производных отличается, и чем она выше, тем лучше образуется целевой амид.

Так, известно, что сложные эфиры обладают большей ацилирующей способностью по сравнению с карбоновыми кислотами, а хлорангидриды еще большей. На этом же принципе основано и использование различного рода сшивающих реагентов - образуется соединение, обладающее более высокой ацилирующей способностью.

Заявителем был проведен ряд опытов по получению амида 3 с использованием различных ацилирующих агентов. Однако не все из них оказались удачными.

Результаты экспериментов приведены в Таблице 3.

Сначала были воспроизведены условия, аналогичные используемым для получения энисамия йодида в патентном документе [2] (см. в [2] Таблица 1, опыт 1).

Однако, даже после дополнительного времени нагревания реакционной массы отгонка воды и образование продукта не происходили.

Для облегчения процесса отделения воды из довольно вязкой реакционной смеси, были добавлены растворители.

Целью добавления растворителей являлось обеспечение возможности азеотропной отгонки воды (см. Таблица 3, опыты 2 и 3).

Однако даже в этом случае не был получен итоговый продукт.

Не достигнув результата, было решено для получения амида использовать различные сшивающие агенты (см. Таблица 3, опыты 4-7).

Основной целью применения сшивающих агентов являлось использование их способности образовывать интермедиаты с карбоновой кислотой, обладающие большей ацилирующей способностью.

Были использованы такие типы сшивающих реагентов, как:

- Карбодиимиды;

- Карбонилдиимидазол;

- Урониевая соль - TBTU, являющаяся аналогом HBTU и HATU.

Под каждый вид сшивающего агента были подобраны соответствующие температурные и временные условия.

Однако использование в синтезе сшивающих реагентов также не привело к положительному результату - получению итогового продукта.

Вероятно, это было связано с наличием гидроксильной группы в исходной кислоте. Образующиеся интермедиаты со сшивающими агентами (по карбоксильной группе) достаточно активны, чтобы вступать во внутри- и межмолекулярные реакции по гидроксильной группе вместо образования целевого амида.

Причем в реакционных массах по данным спектроскопии 1H ЯМР и ТСХ в небольших количествах наблюдалось вещество, похожее на целевой амид 3.

Однако образующиеся смеси были слишком сложными, а содержание амида слишком малым, для того чтобы выделить его в чистом виде.

В дальнейшем было принято решение отказаться от использования в качестве исходного реагента кислоты 1.

В качестве ацилирующего агента был опробован хлорангидрид исходной кислоты.

В результате был получен искомый амид 3 (см. Таблица 3, опыт 8).

Однако выход его составил только 22%, что является весьма низким показателем.

Затем в качестве исходного вещества был использован этиловый сложный эфир кислоты 1.

По итогам проведенного синтеза был получен этиловый эфир с выходом 87%.

Структурная формула этилового эфира 3-гидроксиизоникотиновой кислоты.

В опыте 9 этиловый эфир нагревали до 90°С в течение 3 часов.

Однако выход полученного амида продукта был низкий 8% (см. Таблица 3, опыт 9),

После чего в процесс был добавлен растворитель, для снижения чрезмерной вязкости реакционной смеси (см. Таблица 3, опыт 10).

Но добавление растворителя не привело к увеличению выхода.

Затем было принято решение увеличить время и температуру проведения реакции, до 120°С и 6 часов.

Такое решение позволило получить целевой амид с выходом 55%, который можно назвать удовлетворительным, (см. Таблица 3, опыт 11).

После получения вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида. Для идентификации вещества были использованы следующие спектральные приборы.

Спектры ЯМР были зарегистрированы на спектрометре Varian MercuryPlus 400 (рабочая частота 400,45 МГц для ядра ¹H и 100,70 МГц для ядра ¹³С) при температуре 323 K.

В качестве внутреннего стандарта использовался сигнал остаточных протонов растворителя (7,26 м.д. для CDCl₃ и 2,48 м.д. для d6-DMSO).

Химические сдвиги приведены в м.д. по шкале δ относительно ТМС.

Масс-спектральный анализ проводился на приборах:

1) Surveyor MSQ (Thermo Fisher Scientific). Масс-спектральный датчик: метод ионизации APCI, регистрация положительных и отрицательных ионов. Объем вводимой пробы 2 мкл. Время анализа 4,5 мин.

2) Shimadzu, состоящий из двух насосов LC-30AD, автосемплера SIL-30AC, термостата колонок CTO10-AS, диодно-матричного детектора SPD-M20A, коммуникационного модуля СВМ-20А, масс-спектрометрического детектора LCMS-8040. Масс-спектральный датчик: метод ионизации - ESI, регистрация положительных и отрицательных ионов. Объем вводимой пробы 20 мкл. Время анализа 60 мин.

Определение чистоты полученного соединения

Чистота полученного соединения по данным спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии была выше 95%.

Однако мы столкнулись с образованием дополнительного пика при использовании метода ВЭЖХ-МС.

Данный пик наблюдался при использовании комбинации растворителей ацетонитрил - вода, но при этом "пропадал" при замене воды на 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты.

После анализа литературных данных, мы пришли к выводу, что данный пик образуется вследствие наличия в молекуле йодид-аниона.

Мы проверили данную гипотезу, сравнив хроматограммы полученного нами продукта и йодида натрия (см. рис 6).

Наше предположение также подтвердилось тем, что в отрицательных ионах основным пиком являлся анион йода с массой m/z=127.

Таким образом, разработка тонкого синтеза 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида была завершена, вещество было получено.

Рассмотрим подробно стадии получения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

1. Получение N'-бензил-3-гидроксиизоникотинамида

Для ацилирования бензиламина используют как карбоновую кислоту, так и ее производные - сложные эфиры, галогенангидриды и т.п.

Однако ацилирующая способность вышеуказанных производных будет различна.

При этом, чем выше ацилирующая способность вещества, тем лучше образование целевого амида.

Общеизвестно, что сложные эфиры и хлорангидриды обладают большей ацилирующей способностью по сравнению с карбоновыми кислотами.

В процессе разработки синтеза 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида были проведены серии опытов с использованием различных ацилирующих и сшивающих агентов.

Так, были использованы несколько типов сшивающих агентов: Карбодиимиды (DCC, EDC), Карбонилдиимидазол (CDI); Урониевая соль (TBTU), являющаяся аналогом HBTU и HATU.

В качестве исходного вещества был использован этиловый сложный эфир кислоты.

В итоге в процессе синтеза был получен этиловый эфир 3-гидроксиизоникотиновой кислоты с выходом 87% со следующей структурной формулой:

Этиловый эфир 3-гидроксиизоникотиновой кислоты

Результаты экспериментов приведены в Таблице 3.

Получение этилового эфира 3-гидроксиизоникотиновой кислоты

Схема получения этилового эфира 3-гидроксизоникотиновой кислоты

В двугорлую круглодонную колбу на 500 мл, снабженную магнитной мешалкой, нагревательной баней, термометром и обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, помещают 6,00 г (43,1 ммоль) 3-гидроксишоникотиновой кислоты 1, 240 мл этанола и 6 мл конц. серной кислоты.

Полученную смесь нагревают до кипения (Тбани=90°С, ТРМ=78°С) и до полного растворения кислоты. Кипятят РМ при перемешивании в течение 48 часов.

По завершении реакции РМ смесь охлаждают до комнатной температуры, растворитель упаривают досуха на РПИ.

Полученный остаток растворяют в 60 мл воды.

К образовавшемуся раствору при перемешивании порциями добавляют NaHCO₃ до прекращения выделения газа (потребность соды составила 10,75 г).

Целевой эфир экстрагируют ДХМ (3×60 мл).

Объединенные органические экстракты сушат над Na₂SO₄, фильтруют.

Растворитель упаривают досуха с помощью РПИ.

После упаривания получают 6,29 г (37,6 ммоль, 87%) продукта в виде подвижного масла, которое при кристаллизации образует бежево-коричневые кристаллы.

На Рисунке 7 приведен ¹Н ЯМР спектр этилового эфира 3-гидроксиизоникотиновой кислоты.

ЯМР ¹H-NMR (CDCl₃, 400 MHz): 10,27 (s, 1Н), 8,48 (s, 1Н), 8,20 (d, J=5,1 Hz, 1H), 7,59 (d, J=5,1 Hz, 1H), 4,45 (q, J=7,1 Hz, 2H), 1,42 (t, J=7,2 Hz, 3H).

Получение N'-бензил-3-гидроксиизоникотинамида

Схема получения N'-бензил-3-гидроксиизоникотинамида

В круглодонную колбу на 100 мл, снабженную нагревающей баней, магнитной мешалкой и обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой, помещают 4,19 г (25,1 ммоль) этилового эфира 3-гидроксиизоникотиновой кислоты 1а и 16,12 г (6 экв., 150,4 ммоль, 16,43 мл) бензиламина 2.

После чего происходит набухание и светление этилового эфира.

Далее полученную смесь при перемешивании нагревают до Тбани=130°С, в результате чего происходит ее РМ гомогенизирование.

Затем смесь нагревают в течение 6 часов.

По завершении реакции РМ проводят ее упаривание.

В результате синтеза получают ее вязкий остаток, который при его охлаждении затвердевает в виде твердой стеклообразной субстанции.

Продукт отделяют с помощью колоночной хроматографии (Vсилик.=200 мл, 1=14,7 см, d=4,0 см), элюент: ДХМ - метанол 4:1.

В результате получают 3,15 г (13,7 ммоль, 55%) N'-бензил-3-гидроксиизоникотинамида 3.

На Рисунке 8 приведен масс-спектр N'-бензил-3-гидроксиизоникотинамида 3 в положительных ионах метил-1H-индол-3-ил)пиримидин-2-ил]бензол-1,2,4-триамина.

ЯМР ¹Н (CDCl₃, 400 MHz): 10,39 (br.s, 1,6¹ H), 8.40 (s, 1H), 8,07 (d, J=5,2 Hz, 1H), 7,43-7,16 (m, 6H), 4,63 (d, J=5,6 Hz, 2H).

2. Получение соединения со структурной формулой

В результате проведения реакции алкилирования получают целевое соединение с выходом 55%.

Чистота полученного соединения по данным спектроскопии ЯМР и масс-спектрометрии составляет выше 95%.

Однако при использовании метода ВЭЖХ-МС на хроматограмме было выявлено образование дополнительного пика (см. Рисунок 6).

Данный пик наблюдался только при использовании комбинации растворителей ацетонитрил - вода.

При замене воды на 0,1%-ный раствор муравьиной кислоты пик отсутствовал. Причиной образования дополнительного пика является наличия в молекуле йодид-аниона. При сравнении хромато грамм 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида и йодида натрия, очевидно, что в отрицательных ионах основным пиком являлся анион йода с массой m/z=127.

Получение соединения со структурной формулой 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида

Схема получения соединения со структурной формулой 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида

2,40 г (10,5 ммоль) N'-бензил-3-гидроксиизоникотинамида 3 и 14,2 мл ацетона помещают в двугорлую круглодонную колбу, снабженную нагревательной баней, магнитной мешалкой, термометром и обратным холодильником с хлоркальциевой трубкой. Полученную смесь нагревают до ТРМ=50°С и перемешивают до полного растворения амида.

По завершении растворения в РМ вносят 2,24 г (15,8 ммоль, 982 мкл) йодистого метила 4.

Перемешивают смесь в течение 5 часов. Наблюдают образование осадка.

По завершении реакции охлаждают при перемешивании реакционную смесь до 10°С.

Отфильтровывают и промывают холодным ацетоном (5 мл) образовавшийся осадок.

Сушат осадок в токе воздуха в течение 1 часа, а затем на РПИ при 30°С в течение еще 3 часов.

Получают целевой продукт в виде бежево-желтоватого порошка, в количестве 3,28 г (8,85 ммоль, 84%) с чистотой 97,9% по данным ВЭЖХ.

На Рисунке 9 приведен ¹Н ЯМР спектр соединения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

ЯМР ¹Н (DMSO-d₆, 400 MHz): 9,64 (s, 1H), 8,48 (s, 1H), 8,43 (d, J=6,2 Hz, 1H), 8,18 (d, J=6,1 Hz, 1H), 7,39-7,32 (m, 4H), 7,30-7,24 (m, 1H), 4,55 (d, J=5,9 Hz, 2H), 4,30 (s, 3H).

На Рисунке 10 приведена хроматограмма соединения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Характеристики полупродуктов и целевого продукта 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида устанавливались с помощью методов физико-химического анализа: ¹Н ЯМР, ВЭЖХ-МС и т.д.

3. Исследование активности 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида in vivo, in vitro.

Пример 1. Исследования in vivo биологической активности соединения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Для выполнения доклинического исследования in vivo были использованы половозрелые самцы крыс линии Wistar.

Данные животные являются стандартным видом животных, используемых для фармакокинетических исследований при необходимости оценки распределения в ткани и органы.

Из переданных для исследования крыс было сформировано две группы по 50 животных. Каждая группа включала по десять подгрупп (по числу временных точек) по 5 животных в каждой подгруппе.

В экспериментальные группы были отобраны крысы без признаков отклонений внешнего вида, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения по всем животным более чем на 20%.

Распределение крыс по подгруппам выполнено методом модифицированной блочной рандомизации.

Для этого всех животных, переданных на исследование, случайным образом помещали в ячейки блока рандомизации (число ячеек блока рандомизации кратно числу подгрупп в эксперименте).

Далее, пользуясь генератором случайных чисел, получали перечень данных, содержащий номера ячеек с крысами и соответствующие им номера подгрупп, куда в дальнейшем были размещены животные.

Каждому отобранному в исследование животному был присвоен индивидуальный номер. Перед первым (группа 1) и последним (группа 2) введением исследуемого объекта крысы были лишены корма на 16 ч.

Животным давали воду, очищенную и нормированную по органолептическим свойствам, по показателям рН, сухого остатка, восстанавливающих веществ, диоксида углерода, нитратов и нитритов, аммиака, хлоридов, сульфатов, кальция и тяжелых металлов.

Исследуемый объект вводили экспериментальным животным однократно и многократно (5 дней) внутрижелудочно, поскольку исходный препарат предназначен для перорального применения у человека.

Для исследования фармакокинетики 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида была использована доза 16,7 мг/кг для человека (по аналогии с неизменным действующим веществом энисамия йодида).

Согласно инструкции по медицинскому применению, препарат Нобазит®, таблетки, покрытые пленочной оболочкой, 250 мг, (владелец РУ ОАО «Авексима», Россия) принимают внутрь, после еды, по 0,5 г 3 раза в сутки.

Максимальная разовая доза - 1 г, суточная - 2 г. Рекомендованный курс лечения от 5 до 7 дней.

Следовательно, максимальная разовая доза (МРД) энисамия йодида составит: 1000 мг/60 кг (средняя масса тела человека) = 16,7 мг/кг.

При пересчете доз с учетом межвидовых коэффициентов, эквивалентная доза для крыс составит: 16,7×6,2 (коэффициент пересчета) = 103,54 мг/кг ≈ 100 мг/кг.

Таким образом, в исследовании фармакокинетики 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодид был введен крысам внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг (максимальная разовая доза, МРД).

В данном исследовании фармакокинетики тестируемый 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодид был введен животным внутрижелудочно в дозе 100 мг/кг (1 МРД) однократно и многократно (в течение 5 дней, 1 раз в день) в виде раствора в инертном носителе.

Выбранная доза позволила оценить основные параметры фармакокинетики (Cmax, Tmax, AUC, MRT, Т1/2) 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида при однократном и многократном внутрижелудочном введении и распределение тестируемого объекта во внутренние органы.

На основании результатов проведенного фармакокинетического исследования энисамия йодида, для вещества 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодид были выбраны следующие временные точки отбора проб: 0 (до введения исследуемого объекта), через 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 24 часа после введения.

При многократном введении забор крови и органов осуществлен непосредственно перед последним введением (точка 0) и через 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 и 24 часа после последнего введения тестируемого объекта.

При выборе органов и тканей для оценки распределения во внутренние органы были выбраны ткани, отличающиеся по степени васкуляризации (сильно, средне и слабо васкуляризированные), органы-мишени и органы, отвечающие за элиминацию.

Для выполнения исследования 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида были выбраны следующие органы и ткани: печень, почки - сильно васкуляризированные органы, отвечающие за элиминацию; легкие, сердце, головной мозг. Тестируемый объект - вещество 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодид вводили крысам в виде раствора в инертном носителе (вода очищенная), выбранном на основании результатов тестовой пробоподготовки, внутрижелудочно с помощью зонда. Вещество вводили однократно (группа 1) и многократно (группа 2).

Препарат вводили последовательно животным разных подгрупп с минимально возможным интервалом между введениями отдельным животным внутри подгруппы.

Введение препарата крысам одной подгруппы занимало не более 1-2 минут.

Результаты исследований, подтверждающие наличие активности у 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодид, при однократном и многократном введении крысам, приведены на Рисунках 1-5.

Пример 2. Изучение фармакокинетики 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида при однократном внутрижелудочном введении крысам.

Данные по изменению концентрации 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодид в головном мозге крыс после однократного введения тестируемого объекта представлены в Таблице 4, усредненные фармакокинетические кривые в линейных и полулогарифмических координатах - на Рисунках 1 и 2.

При этом хроматографирование каждой полученной биологической пробы было выполнено в двух повторностях.

Затем на основании полученных данных был выполнен расчет содержания аналита в каждой пробе.

Для расчета фармакокинетических параметров использованы средние значения содержания аналита, представленные в Таблице 4.

Анализируемое вещество в исследованных образцах головного мозга определялось в течение 6-8 ч часов.

Максимальную концентрацию 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида наблюдали через 0,5-2 ч после введения тестируемого объекта.

Далее наблюдали постепенное снижение концентрации исследуемого вещества в тканях головного мозга крыс (Рисунки 1 и 2).

Среднее содержание 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге через 6 ч после его введения, тестируемого составило около 4,2% от его максимальной концентрации.

Через 8 ч после введения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в тканях головного мозга, аналит был обнаружен только у одного животного.

Далее через 10 ч и далее после введения тестируемого объекта во всех пробах концентрация 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида составила менее НПКО использованной биоаналитической методики.

Основные параметры, характеризующие степень проникновения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головной мозг приведены в Таблице 5. Величина тканевой доступности 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида для головного мозга составила 0,12 (см. Рис 5).

Таким образом, после однократного введения тестируемого объекта отмечено интенсивное поступление и длительное нахождение 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в тканях печени, почек, сердца, легких, а также проникновение через гематоэнцефалический барьер.

Пример 3. Изучение фармакокинетики 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида при многократном внутрижелудочном введении крысам.

Данные по изменению концентрации 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге крыс после многократного введения тестируемого объекта представлены в Таблице 6, усредненные фармакокинетические кривые в линейных и полулогарифмических координатах - на Рисунках 3 и 4.

Анализируемое вещество в исследованных образцах головного мозга определялось в течение 4-6 ч часов.

Максимальную концентрацию 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси- 1-метилпиридин- 1-ия йодида наблюдали через 0,5-2 ч после введения тестируемого объекта. Далее наблюдали постепенное снижение концентрации 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге крыс (Рисунки 3 и 4).

Среднее содержание 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головном мозге через 6 ч после его введения составило около 3% от его максимальной концентрации.

Через 8 ч после введения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в тканях головного мозга аналит был обнаружен только у одного животного, через 10 ч и далее после введения тестируемого объекта во всех пробах концентрация 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида составила менее НПКО использованной биоаналитической методики.

Основные параметры, характеризующие степень проникновения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в головной мозг приведены в Таблице 7. Величина тканевой доступности 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида (ft) для головного мозга составила 0,11.

Полученные данные позволили предположить отсутствие накопления действующего вещества в головном мозге при многократном внутрижелудочном введении тестируемого объекта крысам.

Суммарные данные по тканевой доступности 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в ткани и органы крыс после однократного и многократного внутрижелудочного введения тестируемого объекта представлены на Рисунке 5.

Отмечено интенсивное поступление и длительное нахождение исследуемого вещества в тканях печени, почек, сердца и легких, а также его проникновение через гематоэнцефалический барьер.

Для тканей печени, почек и сердца тканевая доступность 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида после многократного введения оказалась выше, чем после однократного введения, что подтверждает предположение о более интенсивном проникновении исследуемого вещества в органы и ткани после его многократного введения.

Пример 4. Исследование антимикробной активности 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в экспериментах in vitro.

Общеизвестно, что пневмококковый менингит связан с самой высокой смертностью среди бактериальных менингитов. Кроме того, пневмококковый менингит зачастую приводит к неврологическим осложнениям, несмотря на использование антибиотикотерапии.

В настоящее время повсеместной проблемой является возрастающая устойчивость Streptococcus pneumoniae к антибиотикам.

Основными причинами постоянно возрастающей устойчивости пневмококков являются неоправданное применение мощных антибиотиков в амбулаторной практике, назначение препаратов без учета спектра антимикробной активности и биологических свойств возбудителя, ошибки в выборе дозировки и продолжительности курса лечения, использование антибиотиков широкого спектра действия для профилактики осложнений при вирусных инфекциях.

Поэтому на текущий момент большинство штаммов Streptococcus pneumoniae устойчивы к таким антибактериальным препаратам как макролиды, тетрациклин, хлорамфеникол, сульфаниламидам, однако сохраняют высокую чувствительность к цефалоспоринам 3-го поколения.

При этом согласно рекомендациям по диагностике и лечению бактериальных гнойных менингитов у детей препаратами выбора при пневмококковом менингите являются цефалоспорины 3-го поколения.

Целью исследования являлось уточнение антимикробной активности 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в отношении штамма Streptococcus pneumoniae у человека.

В качестве препарата сравнения использовали цефатаксим/цефтриаксон. Исследования выполняли в соответствии со следующими документами «Правила лабораторной практики в Российской Федерации» (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации №708 от 23.08.2010 г.) и «Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств» Часть первая // под ред. А.Н. Миронова (2012).

Исследования осуществляли согласно техническому заданию, утвержденному в договоре. Дизайн и организация исследования были направлены на решение поставленной цели и базировались на общих принципах проведения исследований по оценке антимикробнойактивности лекарственных препаратов.

В работе использованы бактерии S. pneumoniae серотипа 19А с типичными морфологическими и культуральными свойствами, тестированные моноспецифическими К-сыворотками полного набора.

Штаммы культивировали в бульоне с добавлением крови крупного рогатого скота в течение 22-24 ч, затем на сердечно-мозговом агаре.

Далее штаммы пересевали на сердечно-мозговую или полусинтетическую (с добавлением аминопептида) среды.

Идентификацию бактерии S. pneumoniae проводили на основании оценки культуральных свойств, результатах микроскопии при окраске по Граму, чувствительности к оптохину и желчи, наличии латексагглютинации (Slidex pneumo-Kit).

Культуры бактерий, идентифицированные как S. pneumoniae, подвергали ПЦР-типированию.

По результатам исследования были получены данные о том, что 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодид проявляет активность сравнимую с препаратом сравнения.

Пример 5. Изучение репродукции бактерии S. pneumoniae серотипа 19А в условиях применения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида. Из представленных данных в Таблице 8 и Рисунке 11 следует, что вещество 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида проявляет активность в клетках бактерий S. pneumoniae серотипа 19А.

Пример 6. Изучение влияния 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида на инфекционную активность вирусных возбудителей менингита: вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, вирусы герпеса, арбовирусы, парамиксовирусы, энтеровирусы ECHO и Коксаки.

Вирусный менингит представляет собой воспаление оболочек головного мозга (менингит), вызванное проникновением в них вирусов. Вирусный менингит является инфекционным заболеванием. Его возбудителями могут выступать различные вирусы, которые попадают в мозговые оболочки гематогенным, лимфогенным или периневральным путем. В зависимости от типа вируса вирусный менингит может возникнуть при контактном или воздушно-капельном заражении. Попадая в организм, вирусы проникают в подпаутинное пространство и инфицируют паутинную и мягкую мозговые оболочки.

Выделение вируса является весьма сложной задачей, поскольку в цереброспинальной жидкости он содержится в небольшом количестве, а в других источниках (кровь, моча, кал, мазок из носоглотки) может находиться при носительстве или после перенесенной инфекции без развития вирусного менингита. Таким образом, диагностика вирусного менингита весьма затруднена, а специфическая и неспецифическая противовирусная терапия вирусного менингита необходима, особенно у пациентов с ослабленным состоянием иммунной системы и у грудных детей.

Целью исследования являлось уточнение противовирусной активности 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в отношении вирусных возбудителей менингита: вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, вирусы герпеса, арбовирусы, парамиксовирусы, энтеровирусы ECHO и Коксаки. В качестве препарата сравнения использовали иммуноглобулин.

Исследования осуществляли согласно техническому заданию, утвержденному в договоре. Дизайн и организация исследования были направлены на решение поставленной цели и базировались на общих принципах проведения исследований по оценке антимикробной активности лекарственных препаратов.

В работе использованы вирусы из коллекции вирусных штаммов ФБУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»: вирус гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm09, вирус парагриппа человека 3-го типа, аденовирус человека 6-го типа, вирус простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), вирус клещевого энцефалита, Nipah henipavirus, ЕСНО-вирус, вирус Коксаки В3.

Вирусы накапливали в клетках пермиссивных линий: MDCK, Vero, MA-104, А549, L-41 и НЕр-2.

Клетки пермиссивных линий сеяли на 24-луночные планшеты и инкубировали в течение 16-24 ч до формирования монослоя4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида вносили в диапазоне концентраций в лунки планшетов с монослоем клеток в объеме 0,5 мл. Планшеты с клетками инкубировали в атмосфере 5% CO₂ при 36°С в течение 1 ч. После этого в лунки вносили по 0,5 мл соответствующего вируса (m.o.i. 0,01) в среде альфа-МЕМ и инкубировали в течение 1 ч. После этого жидкость из лунок отбирали, клетки промывали и вносили в лунки по 1 мл свежей среды с 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида в соответствующих концентрациях. Планшеты инкубировали в атмосфере 5% CO₂ при 36°С в течение 48-120 ч в зависимости от вируса (табл. 1). Далее в культуральной жидкости определяли инфекционный титр вируса. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча и выражали в логарифмах числа 50% инфекционных доз.

Как видно из представленных в Таблице 9 и Рисунке 12 данных, снижение активности изученного вируса в тесте на прямое снижение ЦПД отмечалось при относительно высоких концентрациях 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида.

Изобретение относится к способу получения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида, при котором в качестве исходного сырья для его получения используют этиловый эфир 3-гидроксиизоникотиновой кислоты, с последующим его нагревом до 120°С, отличающийся тем, что нагрев этилового эфира проводят в течение 6 часов. Технический результат: разработан способ получения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида, который может быть использован для лечения нейроинфекций. 1 з.п. ф-лы, 6 пр., 12 ил.

1. Способ получения 4-(бензилкарбамоил)-3-гидрокси-1-метилпиридин-1-ия йодида, при котором в качестве исходного сырья для его получения используют этиловый эфир 3-гидроксиизоникотиновой кислоты, с последующим его нагревом до 120°С.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что нагрев этилового эфира проводят в течение 6 часов.