Способ оценки дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в трёхмерных скаффолдах Российский патент 2024 года по МПК C12N5/775 

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам оценки направления дифференцировки клеток в трехмерных скаффолдах.

Одним из наиболее динамично развивающихся направлений в современной регенеративной медицине является разработка тканеинженерных конструктов (ТИК) или биомедицинских клеточных продуктов (БМКП), состоящих из трехмерного скаффолда и клеток. Разработка и производство ТИК/БМКП основаны на культивировании клеток в трёхмерных скаффолдах-носителях с целью пространственного формирования будущего органа или его фрагмента для трансплантата. Одним из самых востребованных видов клеток для этой цели стали мезенхимальные стволовые клетки (МСК). МСК широко используются благодаря их способности к самообновлению и многолинейному дифференцировочному потенциалу, ключевыми направлениями которого являются адипогенное и остеогенное (Saidova, A.A. and Vorobjev, I.A. (2020) ‘Lineage Commitment, Signaling Pathways, and the Cytoskeleton Systems in Mesenchymal Stem Cells’, Tissue Engineering - Part B: Reviews, 26(1), pp. 13-25. doi:10.1089/ten.teb.2019.0250). Однако отслеживание и контроль специфичной для линии дифференцировки в трехмерных носителях остаются одной из проблем, ограничивающих применение клеток с многолинейным потенциалом дифференцировки. В зависимости от задач и вида формируемого ТИК/БМКП клетки должны находиться в определенном состоянии - либо не в дифференцированном, либо в дифференцированном в определенном направлении, например, в остеогенном. Перед трансплантацией качество клеточного продукта (ТИК/БМКП) должно быть подтверждено и в том числе охарактеризовано состояние клеток. Следует отметить, что оценка дифференцировочного потенциала культуры МСК, культивируемой в двухмерных условиях (монослой на культуральном пластике), не вызывает проблем. Существуют классические методики и коммерческие наборы, позволяющие провести определение наличия или отсутствия клеток в дифференциированном состоянии (Bertolo, A., Guerrero, J. and Stoyanov, J. (2020) ‘Autofluorescence-based sorting removes senescent cells from mesenchymal stromal cell cultures’, Научные отчеты, 10(1). doi:10.1038/S41598-020-76202-2.; Luo, X. et al. (2020) ‘The self-organized differentiation from MSCs into SMCs with manipulated micro/Nano two-scale arrays on TiO2 surfaces for biomimetic construction of vascular endothelial substratum’, Materials Science and Engineering: C, 116, p. 111179. doi:10.1016/J.MSEC.2020.111179.; Sugimoto, Y. et al. (2021) ‘Differentiation and proliferation potencies of human bone tissue-derived mesenchymal stromal cells (hBT-MSCs) after long-term cryopreservation - Comparison among cells stored for 1, 5, 10, 15, and 20 years’, Regenerative Therapy, 18, pp. 363-371. doi:10.1016/J.RETH.2020.01.006.; Waqas, K. et al. (2022) ‘Methylglyoxal - an advanced glycation end products (AGEs) precursor - Inhibits differentiation of human MSC-derived osteoblasts in vitro independently of receptor for AGEs (RAGE)’, Bone, 164, p. 116526. doi:10.1016/J.BONE.2022.116526). Однако для оценки дифференцировки клеток, культивируемых в трехмерных скаффолдах, стандартных подходов не разработано, встречаются лишь единичные исследования, как правило, включающие очень затратные по времени и трудоемкости методы (Tamaddon, M. et al. (2017) ‘Monomeric, porous type II collagen scaffolds promote chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro’, Scientific Reports, 7(1), pp. 1-10. doi:10.1038/srep43519.; Jamalpoor, Z. et al. (2019) ‘In vitro interaction of human Wharton’s jelly mesenchymal stem cells with biomimetic 3D scaffold’, Journal of Biomedical Materials Research - Part A, 107(6), pp. 1166-1175. doi:10.1002/jbm.a.36608). В тоже время способ оценки дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в трехмерных скаффолдах (ТИК/БМКП) должен быть прост в применении и реализуем в течение краткосрочного периода. Таким образом, задача по оценке дифференцировки клеток в трехмерных скаффолдах, является актуальной и востребованной.

В качестве прототипа выбран способ, применяемый для оценки дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток на основе анализа цитоскелета (Treiser, M.D. et al. (2010) ‘Cytoskeleton-based forecasting of stem cell lineage fates’, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 107(2), pp. 610-615. doi:10.1073/pnas.0909597107), включающий предварительную фиксацию образцов с анализируемыми клетками, окрашивание их флуорохромом специфичным для F-актина (например, Alexa Fluor™ 488 Phalloidin), визуализацию клеток с использованием флуоресцентной микроскопии с последующим анализом изображений с оценкой показателей морфологии клетки, структурных и организационных особенностей цитоскелета, которые описывают пространственное распределение актиновых филаментов и их расположение в клетке, на основе кластерного анализа и построения математической модели по оцениваемым параметрам делается вывод о наличии дифференцировки клеток.

Способ, выбранный в качестве прототипа, включает предварительную фиксацию клеток, что может повлечь изменения в морфологии клеток при их трёхмерном расположении, и применение конфокального микроскопа (например, Leica TCS SP2 (Leica Microsystems Inc.)), дорогостоящего, труднодоступного и сложного в обслуживании оборудования, что требует дополнительной подготовки анализируемого образца, зачастую приводящей к его деформации. Визуализация клеток проводится с использованием иммерсионного объектива 63Х (NA=1.3), не входящего в стандартную комплектацию к лабораторным микроскопам, что ограничивает распространение способа и требует дополнительных затрат на приобретение дорогостоящего объектива. В ходе реализации способа - прототипа получают изображения, которые представляют собой мозаику из 60 отдельных изображений, в связи с чем процесс съёмки требует значительных временных затрат. Последующий анализ включает длительную и трудоёмкую обработку изображений с использованием дорогостоящего программного обеспечения (например, Image Pro Plus версии 5.1 (Media Cybernetics)). Таким образом, существенными недостатками способа, представленного в прототипе, являются длительность, трудоемкость, дороговизна. Способ включает применение кластерного анализа и получение математической модели, что влечет за собой высокий риск ошибки, так как представляет собой непрямой метод анализа.

Задача предлагаемого изобретения - расширение арсенала технических средств оценки дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в трёхмерных скаффолдах.

Технический результат - прижизненная (без предварительной фиксации) оценка дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в трёхмерных скаффолдах со снижением трудоемкости и временных затрат.

Технический результат достигается тем, что в способе, включающем окрашивание образцов с анализируемыми клетками флуорохромом специфичным для F-актина, визуализацию клеток с использованием флуоресцентной микроскопии с последующим анализом изображений, оценкой показателей морфологии клетки и структурных особенностей цитоскелета, проводят прижизненное окрашивание, без предварительной фиксации клеток, визуализируют клетки с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии, проводят фотофиксацию объектов с характерным флуоресцентным свечением с использованием объективов с 10-ти или 20-кратным увеличением и функции наложения по двум каналам, оценивают выявленные объекты по следующим критериям: форма клетки, количество отростков, степень их ветвления; при визуализации клеток со следующей совокупностью признаков: округлая форма клеток, от 0 до 2 отростков клеток, ветвление отростков до первого порядка включительно делают вывод об адипогенной дифференцировке; при визуализации клеток со следующей совокупностью признаков: древовидная или округлая форма клеток, от 5 до 11 отростков клеток, ветвление отростков до четвёртого порядка включительно делают вывод об остеогенной дифференцировке.

Способ поясняется графическими материалами, где на фиг. 1 представлено схематичное изображение округлых клеток; на фиг. 2 представлено схематичное изображение древовидной клетки.

Способ оценки дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в трёхмерных скаффолдах осуществляют следующим образом:

Берут образец для анализа и без предварительной фиксации, проводят окрашивание клеток анализируемого образца трехмерного скаффолда, содержащего мезенхимальные стволовые клетки, флуоресцентно меченым фаллоидином, обладающим специфическим сродством к F-актину (например, CF^®594 Phalloidin) для визуализации цитоскелета, а также окрашивание флуорохромом, высокоспецифичным к двухцепочечной молекуле ДНК (например, Hoechst 33342), для визуализации ядер клеток. Для этого анализируемый образец помещают в лунку 24-х луночного планшета; образец трижды промывают фосфатным буферным раствором. По окончанию промывки жидкость из лунки отбирают полностью; готовят рабочий раствор красителя, содержащего флуоресцентно меченый фаллоидин согласно инструкции производителя (например, 10 мкл раствора CF^®594 Phalloidin с концентрацией 200 Ед/мл разбавляют 200 мкл фосфатного буфера), и добавляют его к образцу таким образом, чтобы раствор полностью покрывал образец (например, 400 мкл рабочего раствора на лунку); Планшет с образцом инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 20 минут; затем трижды промывают образец фосфатным буферным раствором, по окончанию промывки к образцу добавляют 1 мл полной культуральной среды (например, Mesencult с добавлением supplement); к образцу в культуральной среде добавляют специфичный к двухцепочечной молекуле ДНК прижизненный краситель согласно инструкции производителя (например, 0,5 мкл раствора Hoechst 33342 в концентрации 10 мкг/мл); планшет с образцом инкубируют в термостате при 37°С в течение 30 минут; после инкубации образец трижды промывают фосфатным буферным раствором, по окончанию отмывки в лунку с образцом добавляют 1 мл полной культуральной среды для предотвращения пересыхания образца и гибели клеток.

Проводят визуализацию окрашенных клеток в образце. Для этого планшет с образцом переносят на оборудование, позволяющее проводить широкопольную флуоресцентную микроскопию (например, имиджер Cytation™5). В 10 полях зрения проводят фотофиксацию объектов с характерным флуоресцентным свечением с использованием объективов с 10-ти или 20-кратным увеличением и функцией наложения по двум каналам. Для регистрации используют каналы, соответствующие рекомендациям сертификации красителей (например, Texas Red для регистрации «красного» сигнала и DAPI для регистрации «синего» сигнала).

Проводят анализ полученных снимков. Оценивают выявленные объекты по следующим критериям: форма клетки, количество отростков, степень их ветвления. Под округлой понимают форму клетки, центральная часть которой, расположенная вокруг ядра, может быть описана как форма похожая на круг (см. Фиг. 1). Под древовидной формой клетки понимают форму клетки, не соответствующую округлой форме клетки, при этом иерархическую структурную организацию клетки можно описать как древовидную (см. Фиг.2).

Наличие отростков и степень ветвления отростков определяют согласно схеме, представленной на фиг. 1 и фиг. 2, где 1 - ядро клетки, 2 - отростки клетки первого порядка, 3 - отростки второго порядка, 4 - отростки третьего порядка, 5 - отростки четвертого порядка, при этом при подсчете общего числа отростков считают все отростки без учета порядка.

При наличии в анализируемых полях зрения объектов со следующей совокупностью признаков: округлая форма клеток; общее количество отростков от 0 до 2; ветвление отростков до первого порядка включительно делают вывод об адипогенной дифференцировке.

При наличии в анализируемых полях зрения объектов со следующей совокупностью признаков: древовидная или округлая форма клеток, общее количество отростков от 5 до 11, ветвление отростков до четвёртого порядка включительно делают вывод об остеогенной дифференцировке.

Полученные данные позволяют провести прижизненную оценку дифференцировки клеток, без предварительной фиксации клеток, находящихся в трёхмерной структуре скаффолда, и определить направление дифференцировки клеток без разрушения скаффолда.

Пример 1.

Для оценки дифференцировки клеток в трёхмерных скаффолдах был взят образец скаффолда, содержащего мезенхимальные стволовые клетки. До проведения исследования образец культивировали 12 дней в адипогенной дифференцировочной среде (Stem Cell) в СО₂-инкубаторе (37°С, 5% СО₂). Проведена оценка дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток по предложенному способу. (использованы: красители CF®594 Phalloidin и Hoechst 33342, имиджер Cytation™5, 20-кратное увеличение и функции наложения по двум каналам - Texas Red для регистрации «красного» сигнала и DAPI для регистрации «синего» сигнала).

На фиг.3 представлен микрофотоснимок клетки с 20-кратным увеличением. Форма округлая, не имеет отростков. Сделан вывод об адипогенной дифференцировке.

Дополнительно проведена оценка других клеток.

На фиг.4а представлен микрофотоснимок клетки с 20-кратным увеличением, на фиг. 4б визуализированные отростки выделены разными цветами. Форма клетки округлая, имеет 2 отростка первого порядка ветвления. Сделан вывод об адипогенной дифференцировке.

На фиг.5а представлен микрофотоснимок клетки с 20-кратным увеличением, на фиг. 5б визуализированные отростки выделены разными цветами. Форма клетки округлая, имеет 1 отросток первого порядка ветвления. Сделан вывод об адипогенной дифференцировке.

С целью подтверждения корректности вывода, сделанного по предложенному способу о наличии направленной адипогенной дифференцировки, в этой же среде параллельно в течение 12 дней в тех же условиях культивировали контрольную культуру мезенхимальных стволовых клеток на пластике. Спустя 12 дней наличие адипогенной дифференцировки в культуре определяли общепринятым способом применимым для культур клеток на пластике - окрашиванием специфическим красителем Red Oil. В культуре клеток жировые вакуоли приобретали специфическое окрашивание (оранжевое) и хорошо визуализировались, что свидетельствовало о наличии адипогенной дифференцировки.

На фиг. 6 представлен снимок контрольной культуры мезенхимальных стволовых клеток, специфически окрашенные жировые вакуоли свидетельствуют о наличии адипогенной дифференцировки клеток.

Пример 2.

Для оценки дифференцировки клеток в трёхмерных скаффолдах был взят образец скаффолда содержащего мезенхимальные стволовые клетки до проведения исследования культивируемый в остеогенной дифференцировочной среде (Stem cell) в СО₂-инкубаторе (37°С, 5% СО₂) в течении 14 суток. Проведена оценка дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток по предложенному способу (использованы: красители CF®594 Phalloidin и Hoechst 33342, имиджер Cytation™5, 10-ти и 20-кратное увеличение и функции наложения по двум каналам - Texas Red для регистрации «красного» сигнала и DAPI для регистрации «синего» сигнала).

На фиг. 7а представлен микрофотоснимок клетки с 20-кратным увеличением, на фиг. 7б визуализированные отростки выделены разными цветами. Форма клетки древовидная, имеет 5 отростков, отростки первого и второго порядка ветвления. Сделан вывод об остеогенной дифференцировке.

Дополнительно проведена оценка других клеток.

На фиг. 8а представлен микрофотоснимок клетки с 20-кратным увеличением, на фиг. 8б визуализированные отростки выделены разными цветами. Форма клетки древовидная, имеет 11 отростков, отростки первого, второго, третьего и четвёртого порядка ветвления. Сделан вывод об остеогенной дифференцировке.

На фиг. 9а представлен микрофотоснимок клетки с 10-кратным увеличением, на фиг. 9б визуализированные отростки выделены разными цветами. Форма клетки округлая, имеет 8 отростков, отростки первого и второго порядка ветвления. Сделан вывод об остеогенной дифференцировке.

В этой же среде параллельно в течение 14 дней в тех же условиях культивировали контрольную культуру мезенхимальных стволовых клеток на пластике. Спустя 14 дней наличие остеогенной дифференцировки в культуре определяли общепринятым способом применимым для культур клеток на пластике - окрашиванием специфическим красителем ализариновым красным. В культуре клеток группы клеток, дифференцированные в остеогенном направлении приобретали специфическое окрашивание (ярко красное) и хорошо визуализировались, что свидетельствовало о наличии остеогенной дифференцировки.

На Фиг. 10 представлен снимок контрольной культуры мезенхимальных стволовых клеток, специфически окрашенные красным группы клеток свидетельствуют о наличии остеогенной дифференцировки.

Пример 3.

Для оценки дифференцировки клеток в трёхмерных скаффолдах был взят образец скаффолда содержащего мезенхимальные стволовые клетки до проведения исследования культивируемый в культуральной среде (Mesencult с добавлением supplement) в СО₂-инкубаторе (37°С, 5% СО₂) в течение 8 суток. Проведена оценка дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток по предложенному способу (использованы: красители CF®594 Phalloidin и Hoechst 33342, имиджер Cytation™5, 10-ти и 20-кратное увеличение и функции наложения по двум каналам - Texas Red для регистрации «красного» сигнала и DAPI для регистрации «синего» сигнала).

На Фиг. 11а представлен микрофотоснимок клетки с 20-кратным увеличением, на фиг. 11б визуализированные отростки выделены разными цветами. Форма клетки древовидная, имеет 4 отростка, отростки первого и второго порядка ветвления.

На Фиг. 12а представлен микрофотоснимок клетки с 20-кратным увеличением, на фиг. 12б визуализированные отростки выделены разными цветами. Форма клетки не округлая и не древовидная, имеет 2 отростка, отростки первого порядка ветвления.

На Фиг. 13а представлен микрофотоснимок клетки с 20-кратным увеличением, на фиг. 13б визуализированные отростки выделены разными цветами. Форма клетки древовидная, имеет 3 отростка, отростки первого и второго порядка ветвления.

В связи с тем, что не было выявлено ни одной клетки советующей параметрам: округлая форма клеток, от 0 до 2 отростков клеток, ветвление отростков до первого порядка включительно, а также не одной клетки советующей параметрам: древовидная или округлая форма клеток, от 5 до 11 отростков клеток, ветвление отростков до четвёртого порядка включительно, то сделан вывод об отсутствии адипогенной или остеогенной дифференцировки.

В этой же среде параллельно в течение 8 дней в тех же условиях культивировали контрольную культуру мезенхимальных стволовых клеток на пластике. Спустя 8 дней один образец культуры клеток окрашивали специфическим красителем Red Oil - общепринятым методом для определения наличия адипогенной дифференцировки в культуре клеток на пластике, второй образец культуры клеток окрашивали специфическим красителем ализариновым красным - общепринятым методом для определения наличия остеогенной дифференцировки в культуре клеток на пластике.

На Фиг. 14а контрольная культура клеток окрашена Red Oil видно, что в культуре клеток не наблюдается жировых вакуолей приобретающих специфического окрашивания. На Фиг. 14б контрольная культура клеток окрашена ализариновым красным видно, что в культуре клеток не наблюдается кластеров клеток, приобретающих специфическое окрашивание. Таким образом, можно заключить, что в контрольной культуре клеток не наблюдалось адипогенной или остеогенной дифференцировки.

Таким образом, предложенный способ позволяет провести прижизненную (без предварительной фиксации) оценку дифференцировки клеток, находящихся в трёхмерных скаффолдах, и определить направление дифференцировки клеток без разрушения скаффолда.

Изобретение относится к медицине, биотехнологии, регенеративной медицине, в частности к способам оценки направления дифференцировки клеток в трехмерных скаффолдах. Для реализации способа проводят прижизненное окрашивание образцов двумя флуорохромами, один из которых специфичен для F-актина, а второй для двухцепочечной молекулы ДНК. Визуализируют клетки с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии, проводят фотофиксацию объектов с характерным флуоресцентным свечением с использованием объективов с 10- или 20-кратным увеличением и функцией наложения по двум каналам. Дают морфологическую характеристику выявленным объектам по следующим критериям: форма клетки, количество отростков, степень их ветвления. Вывод о наличии дифференцировки и её направлении делают при наличии в анализируемых полях зрения клеток с определенной совокупностью признаков. Способ позволяет охарактеризовать дифференцировку клеток, находящихся в структуре трёхмерного скаффолда. 14 ил., 3 пр.

Способ оценки дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток в трёхмерных скаффолдах, включающий окрашивание образцов с анализируемыми клетками флуорохромом, специфичным для F-актина, визуализацию клеток с использованием флуоресцентной микроскопии с последующим анализом изображений, оценкой показателей морфологии клетки и структурных особенностей цитоскелета, отличающийся тем, что проводят прижизненное окрашивание, без предварительной фиксации клеток, визуализируют клетки с помощью широкопольной флуоресцентной микроскопии, проводят фотофиксацию объектов с характерным флуоресцентным свечением с использованием объективов с 10- или 20-кратным увеличением и функции наложения по двум каналам, оценивают выявленные объекты по следующим критериям: форма клетки, количество отростков, степень их ветвления; при визуализации клеток со следующей совокупностью признаков: округлая форма клеток, от 0 до 2 отростков клеток, ветвление отростков до первого порядка включительно - делают вывод об адипогенной дифференцировке; при визуализации клеток со следующей совокупностью признаков: древовидная или округлая форма клеток, от 5 до 11 отростков клеток, ветвление отростков до четвёртого порядка включительно - делают вывод об остеогенной дифференцировке.