Изобретение относится к биотехнологии, иммунологии и микробиологии. Предложенное средство может применяться для специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров.
По данным Федеральной службы государственной статистики на конец 2022 г. поголовье крупного рогатого скота в хозяйствах всех категорий составло17489,0 тыс. голов. Численность КРС в начале 2021 г. оценивалась на уровне 17649,6 тыс. голов, что на 0,16 тыс. голов меньше, чем в 2022-м г. За последние 10 лет поголовье КРС сократилось на 11,1% [1].
Рост поголовья крупного рогатого скота в России сдерживают затраты на корма, а также увеличение тарифов на топливо и электроэнергию.Ограничение применения антибиотиков в животноводстве, перебои ввоза ряда кормовых добавок, подорожание кормов и низкое их качество провоцируют развитие в стадах ряда инфекций, в том числе обладающих иммуносупрессивным эффектом. Вакцинопрофилактика является первым бастионом защиты здоровья животных. Но следует отметить, что иммунный ответ животного также зависит от сбалансированного рациона.
Значительный удар по экономической составляющей наносят инфекционные болезни. Инфекционный мастит занимает существенное место среди всех выявляемых заболеваний. Мастит является одним из самых распространенных заболеваний дойных коров во всем мире, который при разовом обследовании стада может быть выявлен у 5-36% животных. Заболеваемость стада в течение года может достигать 68%, при условии, что некоторые животные могут переболевать два и более раз [2].
Мастит наносит огромный экономический ущерб, складывающийся из убытков, связанных с сокращением удоев и качеством молока (66 %), выбраковкой продукции из-за снижения пищевых и технологических свойств (6 %), преждевременным выводом из стада высокопродуктивных коров из-за нарушения функции четвертей вымени (22 %), повышением расходов на медикаменты для лечения животных (5 %), а также с увеличением затрат на оплату труда ветеринарных специалистов (1 %). Косвенный, но существенный ущерб наносит выпойка молозива телятам от больных маститом коров, что как правило, приводит к массовым желудочно-кишечным заболеваниям и является одной из причин их гибели в раннем постнатальном периоде. Во всем мире, мастит является одним из наиболее экономически значимых заболеваний молочной промышленности, так, к примеру, ущерб наносимый маститом коров в России составляет около 1 млрд руб., в Англии убытки доходят до 50 млн фунтов стерлингов в год, а в США предполагаемые потери варьируют от 185,00 до 265,00 долларов на корову в год [3,4].
На развитие данной болезни большое влияние оказывают предрасполагающие и сопутствующие факторы, к которым относят резистентность и иммунный статус животного, не соблюдение зоотехнических, профилактических и лечебных мероприятий, не выполнение преддоильной и постдоильной гигиены вымени, отсутствие контроля за исправностью доильных аппаратов, а также неудовлетворительная дезинфекция систем доения.
Изучение этиопатогенеза показывают, что мастит коров является полиэтиологическим заболеванием, наиболее частыми возбудителями которого являются: Streptococcuisspp. (S. agalactiae, S. dysgalactiae, S. uberis и др.), Staphylococcus spp. (S. aureus, S. hyicus, S. xylosus, S. epidermidis и др.), Escherichia coli, Candida spp. (C. citettii, C. glabrata, C. rugosa), Mycoplasma spp. (M.bovis, M.dispar и др.), Trueperellapyogenes.
Несмотря на большое количество используемых в настоящее время препаратов, вследствие широкого распространения антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов их эффективность постоянно снижается. Перспективы дальнейшего использования антибиотиков в качестве лекарственных средств многие исследователи и международные организации ставят под сомнение из-за быстро развивающейся к ним резистентности у многих возбудителей. Способствует увеличению популяций резистентных бактерий – нерациональное применение ПМП, не правильный выбор лекарственных средств, не соблюдение рекомендаций, указанных в инструкции, а именно, доза, кратность, продолжительность лечения. Рост устойчивости к антибактериальным препаратам вызвал серьезные опасения во всем мире как с точки зрения общественного здравоохранения, так и с точки зрения безопасности пищевых продуктов, в связи с чем их использование в животноводстве на протяжении многих лет находится под постоянным контролем.
Возникновение мастита зачастую не заканчивается бесследно, даже если препараты для лечения подобраны правильно. В литературе, имеются данные об эффективности профилактической вакцинации коров, больных маститами. Вакцинация животных является признанным способом сокращения затрат на ветеринарный сервис. Благодаря разработке вакцин для лечения и профилактики маститов возможно успешно бороться с одним из самых распространенных в хозяйстве заболеваний (их эффективность, составляет 70–98%) [5, 6, 7].
Вакцинопрофилактика занимает значительное место в борьбе с инфекционными болезнями. Применение вакцин позволит не только снизить количество маститов у коров, но и значительно улучшить качество получаемой молочной продукции.
В настоящее время на фармацевтическом мировом рынке представлено несколько импортных вакцин против мастита коров, производства Испания; Франция, США [8, 9].Сложившаяся политическая ситуация в мире, ввод расширенных санкций и ограничение препаратов, не соответствующих стандартам GMP, делают данный перечень биопрепаратов труднодоступными для российских скотоводов. Скудность выбора иммунобиологических препаратов, ввиду их нехватки, либо же полного отсутствия, усугубляется тем, что на отечественном рынке присутствуют средства специфической профилактики маститов коров[10, 11, 12].
По данным патентной и научно-технической литературы не обнаружена аналогичная совокупность признаков, в части компонентов, что позволяет судить об изобретательском уровне заявленного технического решения.
Таким образом, в области техники существует потребность в разработке фармацевтического средства, которое является безопасным и способно индуцировать иммунный ответ против возбудителей мастита крупного рогатого скота.
Для решения этой проблемы было создано настоящее изобретение, в которое входила разработка средства специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров, и обеспечивающее эффективную защиту восприимчивых животных против возбудителей мастита. Предлагаемое средство является уникальным, т.к. на настоящий момент в мире не существует аналогов по компонентному составу, полностью прошедших все стадии контроля безопасности для целевых животных и эффективности против клинических и субклинических маститов коров.
Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцин, как эффективного инструмента контроля и профилактики инфекционного маститакрупного рогатого скота.
Указанный технический результат достигнут созданием средства специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров, охарактеризованный следующей совокупностью признаков, отраженных ниже.
Разработанное средство (вакцина) в 3,0 см3 препарата содержит следующие компоненты: активное вещество в виде смеси инактивированной суспензии бактериальных клеток штаммов: Streptococcus agalactiae «SA-21», Streptococcus dysgalactiae «SD-21», Streptococcus uberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichia coli «EC-21», Escherichia coli «EC-21-25»; и вспомогательные вещества: формалин (массовая доля формальдегида 37-40%), фосфатно-буферный раствор (ФБР), адъювант – Montanide ISA 206. В дозе вакцины содержится не менее 7,5×108 инактивированных клеток штамма Streptococcus agalactiae «SA-21»; 7,5×108 инактивированных клеток штамма Streptococcus dysgalactiae «SD-21»; 7,5×108 инактивированных клеток штамма Streptococcusuberis «SU-21»; 7,5×108 инактивированных клеток штамма Staphylococcus aureus «SAU-21Л»; 7,5×108 инактивированных клеток штамма Staphylococcus aureus «SAU-21М»;7,5×108 инактивированных клеток штамма Staphylococcus hyicus «SH-21»;7,5×108 инактивированных клеток Escherichia coli «EC-21»; 7,5×108 инактивированных клеток штамма Escherichia coli «EC-21-25».
Формалин был использован в качестве инактиванта бактериальной суспензии в количестве 0,2% от инактивируемого объема, в вакцине его остаточное количество не превышает 15 мг/см3. Фосфатно-буферный раствор используется для разведения высококонцентрированных антигенов и тем самым для доведения объема смеси антигена до 50%. Масляный адъювант Montanide ISA 206выполняет роль иммуномодулятора и составляет 50% (в соответствии с наставлением по его использованию фирмы-производителя).
Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые спрашивается правовая охрана:
1. Средство специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров.
2. Активное вещество в виде смеси из инактивированной суспензии бактериальных клеток штаммов: Streptococcusagalactiae «SA-21», Streptococcusdysgalactiae «SD-21», Streptococcusuberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichiacoli «EC-21», Escherichiacoli «EC-21-25».
3. Целевые добавки.
Существенным отличительным признаком предлагаемой вакцины заключается в том, что в качестве активного вещества она содержит смесь из инактивированных антигенных материалов из 3 штаммов стрептококка
«SA-21», «SD-21», «SU-21»; 3 штаммов стафилококков « SAU-21Л», «SAU-21М» и «SH-21», 2 колибактериозных штамма«EC-21» и «EC-21-25», в эффективном количестве.
Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования:
1. Инактивированный антигенный материал из штамма Streptococcusagalactiae «SA-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади, в эффективном количестве.
2. Инактивированный антигенный материал из штамма Streptococcusagalactiae «SA-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток 7,5х108, в количестве 12,5.
3. Инактивированный антигенный материал изштамма Streptococcusdysgalactiae«SD-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади, в эффективном количестве.
4. Инактивированный антигенный материал из штамма Streptococcusdysgalactiae«SD-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток 7,5х108, в количестве 12,5.
5. Инактивированный антигенный материал из штамма Streptococcusuberis «SU-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади, в эффективном количестве.
6. Инактивированный антигенный материал из штамма Streptococcusuberis «SU-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток 7,5х108, в количестве 12,5.
7. Инактивированный антигенный материализ штамма Staphylococcus aureus «SAU-21Л», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, в эффективном количестве.
8. Инактивированный антигенный материал из штамма Staphylococcus aureus «SAU-21Л», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток 7,5х108, в количестве 12,5.
9. Инактивированный антигенный материал из штамма Staphylococcus aureus «SAU-21М», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, в эффективном количестве.
10. Инактивированный антигенный материал из штамма Staphylococcus aureus «SAU-21М», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток 7,5х108, в количестве 12,5.
11. Инактивированный антигенный материал штамма Staphylococcus hyicus«SH-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, в эффективном количестве.
12. Инактивированный антигенный материал из штамма Staphylococcus hyicus«SH-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток 7,5х108, в количестве 12,5.
13. Инактивированный антигенный материал из штамма Escherichiacoli «EC-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, в эффективном количестве.
14. Инактивированный антигенный материал из штамма Escherichiacoli «EC-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток 7,5х108, в количестве 12,5.
15. Инактивированный антигенный материал из штамма Escherichiacoli «EC-21-25», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, в эффективном количестве.
16. Инактивированный антигенный материал из штамма Escherichiacoli «EC-21-25», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток 7,5х108, в количестве 12,5.
17. Из целевых добавок вакцина содержит масляный адъювант MontanideISA 206 VG - в количестве 50% в 1 см3 готового препарата.
Адъювант в составе вакцины усиливает воздействие фармацевтической субстанции (антигенов) на иммунную систему прививаемых животных, инициируя каскад иммунных реакций, и обеспечивая выработку напряжённого иммунитета.
В результате проведенных исследований авторы определили важнейшие технологические показатели, позволившие создать препарат, в котором отсутствует конкуренция между антигенами, входящими в состав предлагаемой вакцины. Высокий иммунологический эффект в отношении специфических антигенов, входящих в состав вакцины, был достигнут путем получения бактериальных компонентов в составе вакцины, обладающих безвредностью, иммуногенностью и антигенной активностью, а также вариант оптимального их соотношения в составе вакцины, обеспечивающих выработку защитного уровня антител, т.е. создание иммунитета к заболеванию маститом крупного рогатого скота.
Предлагаемое средство (вакцина) обеспечивает надежную защиту животных против возбудителей клинических и субклинических маститов коров, циркулирующих на территории Российской Федерации.
Дополнительный технический результат предлагаемого изобретения достигается за счет того, что в состав вакцины против возбудителей клинических и субклинических маститов коров входят новые производственные штаммы: 3 штамма стрептококка «SA-21», «SD-21», «SU-21»; 3 штамма стафилококков «SAU-21Л», «SAU-21М» и «SH-21» и 2 колибактериозных штамма «EC-21» и «EC-21-25».
По внешнему виду препарат представляет собой однородную эмульсию белого цвета. При хранении вакцины возможно незначительное образование рыхлого осадка. При тщательном взбалтывании флакона с вакциной однородность эмульсии восстанавливается. По лекарственной форме изобретение является эмульсией для инъекции.
В качестве исходного материала для изготовления главного посевного материала (Masterseed) и дальнейшего проведения процедуры депонирования был использован изолят возбудителя мастита коров – Streptococcusagalactiae, который был выделен из проббиологического материала (молоко), отобранных от крупного рогатого скота в ООО «Молочник» Большесолдатского района Курской области РФ в 2021 г. После всестороннего изучения изолята и подтверждения его принадлежности к виду Streptococcusagalactiae, была проведена процедура депонирования во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» присвоено наименование - штамм бактерии Streptococcusagalactiae«SA-21». Штамм относится к классу семейству Streptococcaceae, роду Streptococcus, виду Streptococcusagalactiae.
Штамм Streptococcusagalactiae«SA-21» адаптирован к культивированию на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм депонирован под регистрационным номером: 386 – деп / 22-20 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
В качестве исходного материала для изготовления главного посевного материала (Masterseed) и дальнейшего проведения процедуры депонирования был использован изолят возбудителя мастита коров – Streptococcus dysgalactiae, который был выделен из проб биологического материала (молоко), отобранных от крупного рогатого скота в СПК «Гавриловское» Суздальского района Владимирской области РФ в 2021 г. После всестороннего изучения изолята и подтверждения его принадлежности к виду Streptococcus dysgalactiae, была проведена процедура депонирования во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ»и присвоено наименование – штамм бактерии Streptococcusdys galactiae«SD-21». Штамм относится к семейству Streptococcaceae, роду Streptococcus, виду Streptococcus dysgalactiae.
Штамм Streptococcusdys galactiae «SD-21» адаптирован к культивированию на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм депонирован под регистрационным номером: 389 – деп / 22-23 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
В качестве исходного материала для изготовления главного посевного материала (Masterseed) и дальнейшего проведения процедуры депонирования был использован изолят возбудителя мастита коров – Streptococcusuberis, который был выделен из проббиологического материала (молоко), отобранных от крупного рогатого скота в ОАО «Племзавод «Порецкое» Суздальского района Владимирской области РФ в 2021 г. После всестороннего изучения изолята и подтверждения его принадлежности к виду Streptococcusuberis, была проведена процедура депонирования во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» и присвоено наименование - штамм бактерии Streptococcusuberis«SU-21». Штамм относится ксемейству Streptococcaceae, роду Streptococcus, виду Streptococcusuberis.
Штамм Streptococcusuberis«SU-21» адаптирован к культивированию на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм депонирован под регистрационным номером: 385 – деп / 22-19 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
В качестве исходного материала для изготовления главного посевного материала (Masterseed) и дальнейшего проведения процедуры депонирования был использован изолят возбудителя мастита коров – Staphylococcusaureus, который был выделен из проббиологического материала (молоко), отобранных от крупного рогатого скота в ЗАО «им. Ленина» Веселовского района Ростовской области РФ в 2021 г. После всестороннего изучения изолята и подтверждения его принадлежности к виду Staphylococcus aureus, была проведена процедура депонирования во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» и присвоено наименование - штамм бактерии Staphylococcus aureus«SAU-21Л». Штамм относится к семейству Staphylococcaceae, роду Staphylococcus, виду Staphylococcus aureus.
Штамм Staphylococcus aureus «SAU-21Л» адаптирован к культивированию на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм депонирован под регистрационным номером: 383 – деп / 22-17 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
В качестве исходного материала для изготовления главного посевного материала (Masterseed) и дальнейшего проведения процедуры депонирования был использован изолят возбудителя мастита коров – Staphylococcusaureus, который был выделен из проббиологического материала (молоко), отобранных от крупного рогатого скота в ООО «Молочник» Большесолдатского района Курской области РФ в 2021 г. После всестороннего изучения изолята и подтверждения его принадлежности к виду Staphylococcus aureus, была проведена процедура депонирования во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» и присвоено наименование - штамм бактерии Staphylococcus aureus«SAU-21M». Штамм относится к семейству Staphylococcaceae, роду Staphylococcus, виду Staphylococcus aureus.
Штамм Staphylococcus aureus «SAU-21M» адаптирован к культивированию на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм депонирован под регистрационным номером: 382 – деп / 22-16 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
В качестве исходного материала для изготовления главного посевного материала (Masterseed) и дальнейшего проведения процедуры депонирования был использован изолят возбудителя мастита коров – Staphylococcushyicus, который был выделен из проббиологического материала (молоко), отобранных от крупного рогатого скота в ООО «Вперед» Новокузнецкого района Кемеровской области РФ в 2021 г. После всестороннего изучения изолята и подтверждения его принадлежности к виду Staphylococcushyicus, была проведена процедура депонированияво Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» и присвоено наименование - штамм бактерии Staphylococcushyicus«SH-21». Штамм относится к семейству Staphylococcaceae, роду Staphylococcus, виду Staphylococcus hyicus.
Штамм «StaphylococcushyicusSH-21» адаптирован к культивированию на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм депонирован под регистрационным номером: 387 – деп / 22-21 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
В качестве исходного материала для изготовления главного посевного материала (Masterseed) и дальнейшего проведения процедуры депонирования был использован изолят возбудителя мастита коров – Escherichiacoli, который был выделен из проббиологического материала (молоко), отобранных от крупного рогатого скота в ЗАО «им. Ленина» Пристенского района Курской области РФ в 2021 г. После всестороннего изучения изолята и подтверждения его принадлежности к виду Escherichia coli, была проведена процедура депонирования во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» и присвоено наименование - штамм бактерии Escherichia coli «EС-21». Штамм относится к семейству Enterobacteriaceae, роду Escherichia, виду Escherichia coli.
Штамм Escherichia coli «EС-21» адаптирован к культивированию на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм депонирован под регистрационным номером: 380 – деп / 22-14 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
В качестве исходного материала для изготовления главного посевного материала (Masterseed) и дальнейшего проведения процедуры депонирования был использован изолят возбудителя мастита коров – Escherichia coli, который был выделен из проб биологического материала (молоко), отобранных от крупного рогатого скота в ООО Агрохолдинг «Скопинский» Скопинского района Рязанской области РФ в 2021 г. После всестороннего изучения изолята и подтверждения его принадлежности к виду Escherichia coli, была проведена процедура депонирования и присвоено наименование - штамм бактерии Escherichia coli «EС-21-25». Штамм относится к семейству Enterobacteriaceae, роду Escherichia, виду Escherichia coli.
Штамм Escherichia coli «EС-21-25» адаптирован к культивированию на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона в условиях ФГБУ «ВНИИЗЖ». Штамм депонирован под регистрационным номером: 381 – деп / 22-15 – ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Для проведения процедуры глубинного культивирования используют культуры штаммов третьей генерации, для получения которой проходят поочередно все этапы наработки от первой генерации к третьей, которая непосредственно является «матровой расплодкой».
Наработку культур первой генерации проводят во флаконах с питательной средой на основе сердечно-мозгового бульона (СМБ). Размороженный рабочий посевной материал штаммов S. agalactiae«SA-21», S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21», S. aureus«SAU-21Л», S.aureus«SAU-21М», S. hyicus«SH-21», E. coli«EC-21», E. coli«EC-21-25» инокулируют в питательную среду в объеме 0,2 см3, для культивирования используют по 2 флакона на каждый штамм (объем питательной среды во флаконе составляет 50,0 см3). При культивировании штаммов S. agalactiae«SA-21»,S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21»к питательной среде дополнительно добавляют10% сыворотки крови лошади или КРС. Для исключения контаминации посторонней микрофлорой, выращиваемых культур, делают контрольные высевы из каждого флакона в объеме 0,2-0,3 см3 в 2 пробирки с мясо-пептонным бульоном (МПБ), мясо-пептонным агаром (МПА) и 2 пробирки с мясо-пептонным печеночным бульоном (МППБ) под вазелиновом маслом. Посевы помещают для инкубирования в термостат на 12-18 ч при температуре (37,0±0,5)°С. По истечении срока выращивания культуры проверяют на чистоту микроскопией мазков, окрашенных по Граму.
Бульонные культуры штаммов S. agalactiae«SA-21»,S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21», S. aureus«SAU-21Л»,S.aureus«SAU-21М», S. hyicus«SH-21»,E. coli«EC-21», E. coli«EC-21-25»первой генерации пересевают по 10,0 см3 во флаконы вместимостью 500,0 см3, содержащих ½ объема аналогичных питательных сред. При культивировании штаммов S. agalactiae«SA-21»,S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21»к питательной среде дополнительно добавляют10% сыворотки крови лошади или КРС. Для создания эффекта перемешивания флаконы ставят в шейкер-инкубатор при заданном вращении 180 об/мин и температурой (37,0±0,5) °С. Одновременно проводят контрольные высевы на исключение контаминации, как описано выше.
Проверенные на чистоту и типичность роста культуры штаммов
S. agalactiae«SA-21»,S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21», S. aureus«SAU-21Л»,S.aureus«SAU-21М», S. hyicus«SH-21»,E. coli«EC-21», E. coli«EC-21-25»второй генерации пересевают по 250,0 см3 в матрасы с объёмом аналогичной питательной среды 500,0 см3. При культивировании штаммов S. agalactiae«SA-21»,S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21»к питательной среде дополнительно добавляют10% сыворотки крови лошади или КРС. Посевы помещают в термостат на 4-5 ч (короткий пассаж) при температуре (37,0±0,5) °С и за это время проводят периодическое перемешивание. После окончания срока выращивания культуры третьей генерации проверяют на чистоту и специфичность роста (контрольные высевы).
Проверенные на чистоту и типичность роста культуры третьей генерации из матрасов под давлением 0,02-0,03 МПа через сифоны перекачивают в биореакторы для проведения процедуры производственного глубинного культивирования.
Глубинное культивирование штаммов S. agalactiae «SA-21», S.dysgalactiae «SD-21», S. uberis «SU-21», S. aureus «SAU-21Л» ,S.aureus «SAU-21М», S. hyicus«SH-21», E. coli «EC-21», E. coli «EC-21-25» проводят в системе для получения бакматериала в асептических условиях объемом 50 л.
В стерильные реакторы с соблюдением правил асептики вносят питательную среду на основе СМБ. Исходная питательная среда должна отвечать следующим физико-химическим показателям: Т = (37,0±0,5)0С, pH = 7,7±0,1ед, Eh = +95±(+5)мВ, pO2 =100%. Перед внесением матровыхрасплодок проводят аэрацию и перемешивание питательной среды. Время экспозиции среды при заданном режиме 30 мин. После экспозиции показатель рН питательной среды не должен превышать - 7,8 ед. Для контроля чистоты получаемой бактериальной суспензии проводят периодическую микроскопию культур (каждые 3 часа), а также высевы в пробирки с МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и в чашки Петри с МПА.
Инактивацию бульонных суспензий штаммов S. agalactiae«SA-21», S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21», S. aureus«SAU-21Л», S.aureus«SAU-21М»,S. hyicus «SH-21»,E. coli«EC-21», E. coli«EC-21-25»проводят с использованием 0,2% формалина (с содержанием 37-40% формальдегида) по объему и инкубируют 24 ч в условиях перемешивания при 50-60 об/мин и температуре (37,0±0,5) °С. По истечении времени экспозиции с формалином перемешивание прекращают, а инактивированные культуры оставляют при комнатной температуре в стационарных условиях на 18-24 ч.
Контроль полноты инактивации штаммов S. agalactiae«SA-21», S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21», S. aureus«SAU-21Л», S.aureus«SAU-21М», S. hyicus«SH-21», E. coli«EC-21», E. coli «EC-21-25» осуществляют путем высева содержимого реакторов в питательную среду на основе сердечно-мозгового бульона и идентичный агар с инкубированием посевов при (37,0±0,5) °С в течение 48 ч. Роста специфической бактериальной микрофлоры на питательных средах быть не должно.
Каждую, из инактивированных, суспензий штаммов S. agalactiae«SA-21»,S. dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21», S. aureus«SAU-21Л», S. aureus«SAU-21М», S. hyicus«SH-21», E. coli«EC-21», E. coli«EC-21-25»индивидуальноподают по трубопроводу с соблюдением условий стерильности из производственных реакторов в подготовленную проточную центрифугу (скорость вращения не менее 10000 g). Центрифугу включают и через 15 мин после набора рабочей частоты вращения ротора (14000 об/мин) в нее начинают подавать бактериальную суспензию (скорость подачи пропускают 15-20 л/час). Центрифугу останавливают через 10 мин по окончании подачи культуры из реакторов. После остановки центрифуги отверстия в роторе под факелом закрывают пробками, ротор помещают в стерильный двухслойный «рукав» из бязи и переносят в стерильный бокс.
Бактериальную массу снимают с внутренних стенок ротора центрифуги стерильным металлическим шпателем в стерильный стеклянный стакан. Предварительно в стакан вносят стерильный фосфатно-буферный раствор. После снятия всей бактериальной массы стакан плотно закрывают крышкой, переносят в бокс класса А для гомогенизации. Суспензии гомогенизируют в лабораторном гомогенизаторе при комнатной температуре в течение 15 мин при частоте вращения мешалки 2500 об/мин.
Полученные бактериальные суспензии фильтруют через стерильные многослойные марлевые фильтры в стерильные бутыли и определяют концентрацию клеток каждого из полученных антигенов. При постоянном перемешивании бактериальные суспензии разбавляют стерильным фосфатно-буферным раствором до концентрации 1010м.к./см3 по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей. Готовые суспензии клеточных антигенов
S. agalactiae«SA-21»,S. dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21», S. aureus«SAU-21Л», S. aureus«SAU-21М»,S. hyicus«SH-21», E. coli«EC-21», E. coli«EC-21-25»хранят в стеклянных или пластиковых бутылях под резиновой пробкой в комнате-рефрижераторе при температуре 4-8°С не более 6 месяцев. Перед использованием клеточных антигенов ихпроверяют на стерильность согласно ГОСТ 28085.
Готовые суспензии клеточных антигенов S. agalactiae«SA-21»,
S. dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21», S. aureus«SAU-21Л», S. aureus«SAU-21М»,S. hyicus«SH-21», E. coli«EC-21», E. coli«EC-21-25»перекачивают под давлением сжатого воздуха в емкость для объединения (сифон), где доводят при использовании ФБР до требуемой пропорции (соотношение антиген/масло – 50/50). Далее полученную смесь антигенов перекачивают в емкость для смешивания и эмульгирования при помощи сжатого воздуха через стерильный воздушный фильтр.
Эмульгирование вакцины против клинических и субклинических маститов коров инактивированной проводят при комнатной температуре.
Приготовление вакцины против клинических и субклинических маститов коров эмульсионной инактивированной основано на диспергировании суспензии антигенов в масляном адъюванте MontanideISA 206 VG (тип эмульсии «вода/масло/вода»). При эмульгировании строго соблюдают соотношение водной и масляной фаз 50:50 по массе и температуру обеих фаз (31,0±1,0) °С. В масляный адъювант при перемешивании со скоростью 100 об/мин медленно добавляют антиген. Затем скорость перемешивания увеличивают до 250-300 об/мин и продолжают эмульгирование в течение 15-20 минут до получения гомогенной эмульсии типа «вода-масло-вода».
Для получения стабильной эмульсии данного типа необходимо после эмульгирования довести температуру эмульсии до (10,0±1,0) °С, после чего проводят повторное перемешивание в течение 15-20 минут.
Таким образом, в результате проведенной работы разработано эффективное и безопасное для целевых животных средство специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров: эмульсионная инактивированнаявакцина, содержащая в своем составе в качестве активного вещества суспензию бактериальных клеток из штаммов: Streptococcusagalactiae «SA-21», Streptococcusdysgalactiae «SD-21», Streptococcusuberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichiacoli «EC-21», Escherichiacoli «EC-21-25»; в качестве вспомогательных веществ: формалин (массовая доля формальдегида 37-40%), фосфатно-буферный раствор и в качестве целевой добавки - адъювант MontanideISA 206 VG.
Кроме того, определены условия хранения разработанного средства ветеринарного применения и разработан способ применения средства для выработки специфического иммунитета против клинических и субклинических маститов коров.
Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.
Пример 1. Приготовление предлагаемой вакцины
Для приготовления средства для специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров использовали штаммы бактерий: Streptococcusagalactiae «SA-21», Streptococcusdysgalactiae «SD-21», Streptococcusuberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichiacoli «EC-21», Escherichiacoli «EC-21-25».
Технологический процесс состоит из следующих технологических этапов:
- получение бактериальных суспензий из штаммов Streptococcus agalactiae «SA-21», Streptococcus dysgalactiae «SD-21», Streptococcus uberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichia coli «EC-21», Escherichia coli «EC-21-25» отдельно;
- инактивация бактериальных суспензий из штаммов Streptococcus agalactiae «SA-21», Streptococcus dysgalactiae «SD-21», Streptococcus uberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichia coli «EC-21», Escherichia coli «EC-21-25», посредством внесения формалина 37 -40%, отдельно;
- разведение бактериальной массы из инактивированных бактериальных суспензий из штаммов Streptococcus agalactiae «SA-21», Streptococcus dysgalactiae «SD-21», Streptococcus uberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichia coli «EC-21», Escherichia coli «EC-21-25» фосфатно-буферным раствором до концентрации микробных клеток 6,0х109, отдельно;
- объединение полученных инактивированных суспензий бактерий;
- добавление ФБР до требуемой пропорции (соотношение антиген/масло – 50/50);
- добавления адъюванта к смеси инактивированных бактерий;
- расфасовка готового продукта во флаконы объемом 48 см3–16 доз.
Посевной материал, используемый для изготовления вакцины, получали на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади.
Для изготовления средства специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров: эмульсионной инактивированной вакцины, использовали суспензию бактериальных клеток из штаммов: Streptococcusagalactiae «SA-21», Streptococcusdysgalactiae «SD-21», Streptococcusuberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichiacoli «EC-21», Escherichiacoli «EC-21-25», выращенные отдельно на питательных средах с добавлением ростовых компонентов.
Предлагаемая средство специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров имеет оптимальный компонентный состав:
1. Инактивированный антигенный материал из штамма Streptococcusagalactiae «SA-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток не менее 7,5х108, в количестве 12,5.
2. Инактивированный антигенный материал из штамма Streptococcusdysgalactiae«SD-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток не менее 7,5х108, в количестве 12,5.
3. Инактивированный антигенный материал из штамма Streptococcusuberis «SU-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток не менее 7,5х108, в количестве 12,5.
4. Инактивированный антигенный материал из штамма Staphylococcus aureus «SAU-21Л», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток не мене 7,5х108, в количестве 12,5.
5. Инактивированный антигенный материал из штамма Staphylococcus aureus «SAU-21М», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток не менее 7,5х108, в количестве 12,5.
6. Инактивированный антигенный материал из штамма Staphylococcus hyicus«SH-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток не менее 7,5х108, в количестве 12,5.
7. Инактивированный антигенный материал из штамма Escherichiacoli «EC-21», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток не менее 7,5х108, в количестве 12,5.
8. Инактивированный антигенный материал из штамма Escherichiacoli «EC-21-25», полученный на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона, представляющий собой бактериальную суспензию с концентрацией микробных клеток не менее 7,5х108, в количестве 12,5.
9. Масляный адъювант Montanide ISA 206 VG в количестве 50% (по массе).
Содержимое антигенных материалов в предлагаемомсредстве специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров в указанных выше концентрациях является их эффективным количеством в препарате, обеспечивающим достижение технического результата от использования изобретения.
Глубинное культивирование штаммов бактерий S. agalactiae «SA-21»,S.dysgalactiae «SD-21», S. uberis«SU-21»,проводили в системе для получения бакматериала в асептических условиях на питательной среде на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки лошади. Глубинное культивирование штаммов бактерий S. aureus «SAU-21Л», S.aureus«SAU-21М», S. hyicus«SH-21»,E. coli «EC-21», E. coli «EC-21-25»проводили в системе для получения бакматериала в асептических условиях на питательной среде на основе сердечно-мозгового бульона без добавления сыворотки лошади.
После окончания глубинного культивирования, в бульонные суспензии штаммов бактерий S. agalactiae«SA-21»,S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21»,S. aureus«SAU-21Л»,S.aureus«SAU-21М»,S. hyicus«SH-21»,E. coli«EC-21»,E. coli«EC-21-25»добавляли 0,2% формалина (с содержанием 37-40% формальдегида) по объему и инкубировали 24 ч в условиях перемешивания при 50-60 об/мин и температуре (37,5±0,5) °С. По истечении времени экспозиции с формалином перемешивание прекращали, а инактивированные культуры оставляли при комнатной температуре в стационарных условиях на 18-24 ч.
Каждую, из инактивированных, суспензию штаммов бактерий S. agalactiae«SA-21», S.dysgalactiae«SD-21», S. uberis«SU-21»,S. aureus«SAU-21Л»,S.aureus«SAU-21М»,S. hyicus«SH-21», E. coli«EC-21»,E. coli«EC-21-25» центрифугировали индивидуально, извлекая микробный осадок. Густой осадок гомогенизировали при постоянном перемешивании разбавляя стерильным фосфатно-буферным раствором до концентрации 1000 ед. (1011м.к./см3по стандартному образцу мутности бактерийных взвесей).
Готовые суспензии клеточных антигенов S. agalactiae «SA-21», S.dysgalactiae «SD-21», S. uberis«SU-21»,S. aureus«SAU-21Л», S.aureus«SAU-21М», S. hyicus«SH-21», E. coli«EC-21»,E. coli«EC-21-25»объединяли для последующего эмульгирования. Приготовление вакцины против клинических и субклинических маститов коров эмульсионной инактивированной основано на диспергировании суспензии антигенов в масляном адъюванте MontanideISA 206 VG (тип эмульсии «вода/масло/вода»). Эмульгирование серии вакцины против клинических и субклинических маститов коров эмульсионной инактивированной проводили при комнатной температуре. При эмульгировании строго соблюдали соотношение водной и масляной фаз 50:50 по весу и температуру обеих фаз (31±1) °С. В масляный адъювант при перемешивании со скоростью 100 об/мин медленно добавляли антиген. Затем скорость перемешивания увеличивали до 250 об/мин и продолжали эмульгирование в течение 15-20 минут до получения гомогенной эмульсии типа «вода-масло-вода». Для получения стабильной эмульсии данного типа необходимо после эмульгирования достичь температуры эмульсии (10±1) °С. Затем проводили повторное перемешивание в течение 15-20 минут.
Полученное средство/вакцина представляет собой эмульсию белого цвета.
Пример 2. Определение токсичности средства специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров.
Изучение острой токсичности препарата при внутрижелудочном однократном поступлении проводили методом фиксированной дозы.
В опыте использовали 10 лабораторных крыс, из которых были сформированы следующие группы: №1 (5 самок) и №2 (5 самок).
Средство (вакцинный препарат) и стандартный объект (воду) вводили однократно внутрижелудочно при помощи зонда:
группа №1 – вводили препарат в дозе 2000 мг/кг;
группа №2 – вводили воду очищенную в дозе 1 см3.
Испытание предельной дозы проводили в 2 этапа. На первом этапе исследуемое веществов дозе 2000 мг/кгвводилиодному животному опытной группы. Поскольку признаков токсичности препарата отмечено не было, через сутки после первого этапа проводили исследование с дозой 2000 мг/кг на остальных 4-х животных в опытной в группе.
Подробный клинический осмотр животных выполнялся перед введением веществ, в течение первых суток, через 1 сут., 1 нед. и 2 нед. после введения препарата.
По окончании срока наблюдения животных подвергли диагностическому убою с последующим патологоанатомическим вскрытием, обращая внимание на возможные изменения в органах и тканях.
Изучение острой токсичности препарата при однократном внутрижелудочном введении испытуемого средства специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров в дозе 2000 мг/кг не вызывало признаков токсического поражения и гибели биологических тест-систем (лабораторных крыс).
Данное средство не оказывало существенного влияния на массу тела, динамику массы тела и массу внутренних органов животных. Изменения массы тела животных приведены в табл. 1. У всех лабораторных животных была положительная динамика массы тела. Препарат не вызывал патологии внутренних органов крыс, которая выражалась бы в изменении их строения, размера, расположения.
Пример 3. Обоснование иммунизирующей дозы средства и места введения.
Определение иммунизирующей дозы проводили на крупном рогатом скоте в количестве 14 голов массой 250-300 кг и белых нелинейных мышах в количестве 320 голов массой 14-18 гр.
Ввиду того, что мастит коров является факторным и невоспроизводимым заболеванием, оценка иммуногенной активности на целевых животных невозможна. Нами был подобран альтернативный метод оценки invivo на лабораторных животных, позволяющий оценить напряженность иммунитета на биологической модели, предрасположенной к инфицированию штаммами, входящими в состав вакцины.
Для исследования использовали 3 образца средства/вакцины, которые были изготовлены из смеси антигена с разной концентрацией микробных клеток. В первом образце общее количество микробных клеток составило по 4х109 в дозе, что соответствует 5х108м.к. каждого штамма, во втором 6х109, что соответствует 7,5х108м.к. каждого штамма (предлагаемое изобретение), в третьем 8х109, что соответствует 1х109м.к. каждого штамма.
Исследования были проведены следующим образом:
Иммунизация целевых животных: 14 голов КРС были разделены на 4 группы:
- №1 – введение образца вакцины с концентрацией м.к. 4х109, группа из 4 голов;
- №2- введение образца вакцины с концентрацией м.к. 6х109 группа из 4 голов;
- №3- введение образца вакцины с концентрацией м.к. 8х109 группа из 4 голов;
- №4 – группа контрольная из 2 голов.
Опытные группы с номерами 1, 2, 3 разделены на подгруппы (для идентификации подгрупп каждой присвоен порядковый номер в виде степени, к примеру: 11, 12, 21, 22 и т.д.) для оценки местной реакции и выбора рекомендуемого способа введения. Животным подгруппы со степенью 1 вводили препарат внутримышечно в область средней трети шеи в объеме 3,0 см3. Животным подгруппы со степенью 2 вводили препарат внутримышечно в область бедра в объеме 3,0 см3.
В течение всего срока исследования за животными всех групп вели клиническое наблюдение.
Через 14 суток после иммунизации у животных отбирали кровь из которой получали сыворотку, а также проводили послеубойную оценку места введения.
Пассивная иммунизация мышей с последующим заражением: 320 голов мышей были разделены на 4 группы:
1 – введение сыворотки от КРС полученной после иммунизации образцом вакцины с концентрацией м.к. 4х109, группа из 80 голов;
2- введение сыворотки от КРС полученной после иммунизации образцом вакцины с концентрацией м.к. 6х109 группа из 80 голов;
3- введение сыворотки от КРС полученной после иммунизации образцом вакцины с концентрацией м.к. 8х109 группа из 80 голов;
4 – введение сыворотки от КРС полученной от не иммунизированных животных, группа из 80 голов.
Все группы лабораторных животных разделены на 8 подгрупп по 10 голов в каждой для последующего заражения культурами штаммов (для идентификации подгрупп каждой присвоен порядковый номер в виде степени, к примеру: 11, 12, 13-8, 21, 22, 23-8 и т.д.). Специфическую сыворотку вводили мышам в общем объеме 1,0 см3 внутривенно в боковую вену хвоста. Для исключения анафилактических реакций инъекция проводилась пятикратно по 0,2 см3 с интервалом в 1 сут. Временной промежуток от крайнего введения сыворотки до заражения составил 5 сут, выдержка необходима для стабилизации иммунного фона у лабораторных животных. Спустя 5 сут лабораторных животных заражали бульонной культурой возбудителей.
Животным вводили 18-20 часовую бульонную культуру штамма, внутрибрюшинно в дозе 0,5 см3. Наблюдение за подопытными животными подгруппы со степенью 1-6 вели в течение 5 сут. Наблюдение за подопытными животными подгруппы со степенью 7-8 (для эшерихий) вели в течение 3 сут.
Для подтверждения специфической гибели мышей при заражении культурами штаммов выполняли посев на сывороточный сердечно-мозговой агар и сердечно-мозговой агар без добавления ростостимулирующих компонентов (для эшерихий) образцов спинного мозга, крови сердца, печени и селезенки.
Результаты исследований показали, что реактогенность образцов вакцин с концентрацией 4х109 и 6х109м.к./доза при инъекции в среднюю треть шеи и внешнюю поверхность бедра не сопровождались серьезными поражениями в месте введения. Клиническое состояние животных после введения образцов вакцины оставалось в пределах нормы. При введении вакцины во внешнюю поверхность бедра пальпировалось незначительное уплотнение глубоко расположенных тканей поперечнополосатой мускулатуры. При пальпации места инъекции в области шеи уплотнений и припухлостей не обнаружено.
Инъекция образца вакцины с концентрацией м.к. в дозе – 8х109 в оба испытуемых места введения сопровождалось образованием припухлости с болевой реакцией при надавливании. У животных зафиксировано повышение температуры тела на 1,0-1,5°С, гиперемия места инъекции. Нормализация физиологического состояния наступила на 3 сутки.
Руководствуясь результатами исследований и учитывая возможные отклонения при практическом использовании препарата, было выбрано место введения – средняя треть шеи.
Результаты исследования иммуногенности на лабораторных животных всех исследуемых проб экспериментальных образцов представлены в таблице 2.
Результаты исследований по подбору иммунизирующей дозы методом пассивной иммунизации/заражения показали, что группа лабораторных животных, пассивно иммунизированных сывороткой крови от первой группы КРС (вакцинация образцом вакцины с концентраций м.к. 4х109/доза) оказались частично защищенными от возбудителей. В большинстве случаев (заражение возбудителями S. agalactiae «SA-21», S. dysgalactiae «SD-21», S. uberis «SU-21», S. aureus «SAU-21М», E. coli «EC-21-25») зафиксированный падеж животных за время исследования оставался в пределах нормы. В 3 подгруппах из 8 (заражение возбудителями S. aureus «SAU-21Л», S. hyicus «SH-21», E. coli «EC-21») зафиксирован падеж, превышающий установленные границы. В результате проведенного исследования можно заключить, что образец сыворотки крови от первой группы КРС не защищает пассивно иммунизированных животных от заражения. Специфичность гибели мышей была подтверждена бактериологическим методом путем высева образцов спинного мозга, крови сердца, печени и селезенки на питательные среды. По окончанию инкубирования посевов были обнаружены колонии возбудителей, которые в последствии были идентифицированы, как соответствующие патогены группе зараженных ими животных.
Заражение группы лабораторных животных, пассивно иммунизированных сывороткой крови от второй группы КРС (вакцинация образцом вакцины с концентраций м.к. 6х109/доза) показало результаты в пределах допустимой нормы, что характеризует сыворотку активной и обладающей протективными свойствами при пассивной иммунизации. В двух случаях из восьми (заражение возбудителями S. agalactiae «SA-21», E. coli «EC-21») зафиксирована гибель по одному животному из подгрупп. Для подтверждения специфичности гибели мышей был произведен высев образцов спинного мозга, крови сердца, печени и селезенки на питательные среды. По окончанию инкубирования посевов на поверхности питательных сред роста микроорганизмов не обнаружено, что доказывает неспецифичность гибели. В следствии чего, полностью доказана активность исследуемой сыворотки против штаммов, входящих в состав вакцины.
Заражение группы лабораторных животных, пассивно иммунизированных сывороткой крови от третьей группы КРС (вакцинация образцом вакцины с концентраций м.к. 8х109/доза) показало результаты в пределах нормы, что характеризует сыворотку активной и обладающей протективными свойствами при пассивной иммунизации. В одном случае из восьми (заражение возбудителем S. aureus «SAU-21Л») зафиксирована гибель одного животного из подгруппы. Для подтверждения специфичности гибели животного был произведен высев образцов спинного мозга, крови сердца, печени и селезенки на питательные среды. По окончанию инкубирования посевов на поверхности питательных сред роста микроорганизмов не обнаружено, что доказывает не специфичность гибели. В следствии чего, полностью доказана активность исследуемой сыворотки против штаммов, входящих в состав вакцины.
Заражение группы лабораторных животных, пассивно иммунизированных сывороткой крови от четвертой группы КРС (животные без вакцинации) показали, что во всех подгруппах мышей зафиксирован 100 % падеж на 2 сутки опыта. Специфичность гибели мышей была подтверждена бактериологическим методом путем высева образцов спинного мозга, крови сердца, печени и селезенки на питательные среды. По окончанию инкубирования посевов были обнаружены колонии возбудителей, которые в последствии были идентифицированы, как соответствующие патогены группе зараженных ими животных.
Таким образом, анализируя полученные результаты, можно заключить что для практического, безопасного и эффективного применения препарата подходит инъекция вакцины в среднюю треть шеи с содержанием м.к. 6х109 в дозе, что соответствует 7,5х108м.к. каждого штамма.
Пример 4. Изучение продолжительности иммунитета.
Продолжительность иммунитета проверяли с использованием 600 голов КРС (коровы), которые были разделены на 3 группы (две опытные (1А и 1Б) и контрольная (2)) по 200 голов в каждой. Опытные группы разделены на две (1А, 1Б) - для оценки экономической эффективности вакцины при однократном (1А) и двукратном (1Б) применении.
Группе коров 1А вакцина вводилась однократно за 3-4 недели до отела, группе коров 1Б вакцина вводилась двукратно за 3-4 недели до отела с интервалом в 14 сут. Прививная доза препарата составила 3,0 см3, инъекция проводилась в область средней трети шеи. Контрольная группа (2) оставалась интактной до конца опыта.
Оценка продолжительности иммунитета, такого заболевания как мастит, возможна только на основании экономических показателей, путем сравнения контрольных и вакцинированных групп целевых животных.
Эффективность применения вакцины была оценена в сравнительном аспекте иммунизированных и контрольных групп по выявлению субклинических форм маститов у лактирующих коров при помощи экспресс-теста для определения количества соматических клеток в пробах молока; по количеству случаев клинического проявления болезни; по количеству полученного молока за время исследования в группах, вакцинированных и невакцинированных коров.
Контролируемые показатели оценивались с момента окончания периода молозива и в течение 8 мес. Все результаты фиксировались по группам в течение конкретного периода времени (ежемесячно) по каждой голове отдельно, т.к. животные на момент начала эксперимента имели не одинаковый срок стельности.
Анализируя аналогичные периоды за последние три года – средний суточный надой одной головы коровы составляет 15,4 л, погрешность - 0,1 л. За среднемесячный надой считаем 15,4 л х 30 (дней), что составило 462 л ежемесячно на 1 голову.
Разницу среднесуточного надоя в момент опыта вычисляли следующим образом:
R= ((M х 30) х N(без кл.пр.) / N(кол-во ж-ых в группе)) – 462,
где:R – разница среднесуточного надоя;
М – среднесуточный надой на одну голову;
N – количество здоровых животных не имеющих клинического проявления мастита, а также у которых не превышен показатель количества соматических клеток;
N – общее количество животных в группе.
Показатели полученные в процессе исследования отражены в таблице 3.
Для аккумулирования полученной информации и более предметного сравнения была использована формула коэффициента эффективности (КЭ), которая позволила в сравнительном аспекте оценить результативность вакцинации в 3 группах животных.
%,
где:а – заболеваемость животных (учитываются животные с повышенным уровнем соматических клеток в молоке и животные с клинической формой заболевания), привитых вакциной;
б – заболеваемость животных (учитываются те же показатели) в интактной группе (2).
Коэффициент эффективности группы однократно иммунизированных животных (1А) составил 30,35%, в группе двукратно иммунизированных животных (1Б) – 82,14%.
При анализе полученной информации, собранной на протяжении 8 мес. сделан вывод, что однократная иммунизация формирует нестабильный и непродолжительный иммунитет, в группе животных начиная с 2-го месяца эксперимента были отмечены случаи превышения допустимого уровня соматических клеток в молоке, начиная с 3-го мес. зафиксированы случаи клинического проявления мастита. Клинический мастит у поголовья встречался как в начальных стадиях проявления (серозный и катаральный), так и в более серьезных (гнойный и геморрагический). С двухсот голов животных данной группы за время исследования было недополучено (сравнивая со среднемесячным надоем, приходящимся на 1 голову) – 97,02 л молока.
Проведенное исследование доказывает преимущество двукратной иммунизации, основанное на снижении случаев превышения допустимого уровня соматических клеток в группе животных (за время опыта данный показатель был отклонен от нормы у 6 голов), снижении встречаемости клинических маститов (зафиксирована начальная стадия мастита (серозный) у 4 голов, без перехода в более тяжёлую), разница среднемесячного надоя, приходящегося на 1 голову коровы составила 23,10 л. Стоит отметить, что начиная с 7 мес. исследования зафиксировано увеличение субклинических и клинических форм маститов. Данное обстоятельство позволяет предположить, что уровень защитных антител к этому времени значительно снижается и животное оказывается не защищено от патогенов, вызывающих мастит.
Таким образом, в результате проведенных исследований было доказано, что средство специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров способствует созданию напряженного иммунитета при двукратном применении, сохраняющимся на протяжении не менее 6 мес.
Пример 4. Изучение стабильности средства (предлагаемое изобретение) при длительном хранении.
Флаконы с разработанным препаратом хранили при температуре от 2 до 8°С в течение 12 месяцев. Контроль показателей качества вакцины осуществляли у только что изготовленного образца вакцины, хранившегося в течение 6 мес. и хранившегося в течение 12 мес.
Контроль внешнего вида препарата осуществлялся с помощью визуального осмотра.
При закладке на хранение средство по внешнему виду представляло собой эмульсию белого цвета. При хранении вакцины возможно незначительное образование рыхлого осадка. При тщательном взбалтывании флакона с вакциной однородность эмульсии восстанавливается.
Контроль стабильности экспериментальных образцов определяли методом центрифугирования при 4000 об/мин (не менее 2147 g) в течение 10 минут. Кинематическую вязкость определяли с помощью капиллярного вискозиметра ВНЖ по ГФ ХIV, том I, стр. 595-601 (ОФС.1.2.1.0015.15) [13].
Кинематическая вязкость данного препарата не превышала 150 мм2/с.
Контроль стерильности препарата проводили путем высева на питательные среды согласно требованиям ГФ XIV том I, с. 1201-1222 (ОФС.1.2.4.0003.15). [14]. Во всех посевах не наблюдалось роста микроорганизмов на питательных средах. Рост микроорганизмов отсутствовал - средство было стерильно.
Контроль безвредности препарата проводили на 30 белых мышах массой 14-18 гр, которые были разделены на 3 группы по 10 голов в каждой, что соответствует исследуемым периодам времени (только что изготовленный образец вакцины, хранившийся в течение 6 мес., хранившийся в течение 12 мес.). Объем вводимой вакцины соответствовал 1,0 см3. Препарат вводили подкожно в область спины в объеме 1,0 см3.
В течение 10 суток после введения все животные оставались клинически здоровыми, без каких-либо патологических изменений. У животных не наблюдалось какой-либо местной реакции на введение препарата. Средство было безвредно.
Контроль антигенных свойств препарата проводили путем иммунизации 15 голов (кролики), с последующим получением от иммунизированных животных проб сыворотки крови.
Иммунизацию животных проводили путем внутримышечного введения разработанного препарата в дозе 1 см3. Отбор проб сыворотки крови осуществляли до иммунизации и спустя 21 сутки после введения препарата. Полученные пробы сывороток крови исследовали в ИФА «Набором для выявления антител к возбудителям мастита крупного рогатого скота в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа».
Результаты проведенных исследований показали, что предлагаемое изобретение сохранило свои антигенные свойства в течение всего срока хранения.
Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что при температуре от 2 до 8°С разработанное средство специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коровстабильно в течение не менее 12 месяцев (табл. 4).
Пример 5. Изучение стабильности средства при вскрытии флакона.
Контроль показателей качества вакцины осуществляли сразу после вскрытия, а также каждые 2 часа в течение 8 часов хранения. Стабильность эмульсии, кинематическую вязкость, безвредность и антигенную активность определяли через каждые 4 часа.
Контроль внешнего вида препарата осуществлялся с помощью визуального осмотра.
При закладке на хранение, через 2, 4, 6 и 8, часов хранения средство специфической профилактики по внешнему виду представляло собой эмульсию белого цвета, с небольшим количеством рыхлого осадка, при взбалтывании однородность эмульсии восстанавливается.
Контроль стерильности препарата проводили путем высева на питательные среды в соответствии с ГФ XIV том I, с. 1201-1222 (ОФС.1.2.4.0003.15). В посевах из только что вскрытого флакона, через 2 и 4 часа не наблюдалось роста микроорганизмов на питательных средах - средство было стерильно. В посевах через 6 и 8 часов наблюдался рост микроорганизмов на питательных средах - средство было нестерильно.
Контроль стабильности экспериментальных образцов определяли методом центрифугирования при 4000 об/мин (не менее 2147 g) в течение 10 минут. Кинематическую вязкость определяли с помощью капиллярного вискозиметра ВНЖ по ГФ ХIV, том I, стр. 595-601 (ОФС.1.2.1.0015.15). Эмульсия считается стабильной, если после центрифугирования на дне пробирки не отделяется водная фракция. Допускается образование осадка антигена серого цвета на дне пробирки. Кинематическая вязкость испытуемых образцов не превышала 150 мм2/с.
Контроль безвредности препарата оценивали на 30 белых мышах массой 14-18 гр. Препарат вводили подкожно в область спины в объеме 1,0 см3.
В течение 10 суток после введения все животные оставались клинически здоровыми, без каких-либо патологических изменений. У животных не наблюдалось какой-либо местной реакции на введение препарата. Средство было безвредно.
Контроль антигенных свойств препарата проводили путем иммунизации 15 кроликов массой 2,0-2,5 кг. До иммунизации и спустя 21 сутки у животных отбирали кровь с дальнейшим получением сыворотки. Которую исследовали в ИФА «Набором для выявления антител к возбудителям мастита крупного рогатого скота в сыворотках крови лабораторных животных в непрямом варианте иммуноферментного анализа». Иммунизацию животных проводили путем внутримышечного введения препарата во внешнюю поверхность бедра в дозе 1,0 см3.
Вакцина индуцировала у привитых животных выработку специфических антител к штаммам: «S. agalactiae SA-21», «S. dysgalactiaeSD-21», «S. uberisSU-21», «S. aureus SAU-21Л», «S. aureus SAU-21М», «S. hyicus SH-21», «E. coli EC-21», «E. coli EC-21-25» в титре не ниже 1:200.
Результаты проведенных исследований показали, отобранные образцы препарата по показателям: внешний вид, наличие посторонних примесей, стабильность эмульсии, кинематическая вязкость, безвредность, антигенная активность соответствовали норме в течение всего срока исследования. По показателю стерильность - образцы вакцины оставались стерильными в течение 4 часов после вскрытия флакона (табл. 5).
Полученные результаты позволили сделать вывод, что вакцина против клинических и субклинических маститов коров эмульсионная инактивированная, сохраняет свои свойства в течение 4 часов после вскрытия флакона.
Таким образом, поставленная техническая задача, а именно, создание средства специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров, обеспечивающее эффективную индукцию иммунного ответа, достигнута, что подтверждается приведенными примерами.
Все приведенные примеры подтверждают эффективность фармацевтического средства и его промышленную применимость.
Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Средство специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров»:
1. https://rosstat.gov.ru/
2. Белкин, Б.Л. О бактерицидной активности лактоматетраметилендиэтилентетрамина в отношении патогена мастита коров / Белкин Б.Л., Черепахина Л.А., Баркова В.Н., Андреев С.В. // Вестник Орловского государственного аграрного университета. – 2012. - № 1 (34) - С. 101 - 102.
3. Argaw, Amare. Review on Epidemiology of Clinical and Subclinical Mastitis on Dairy Cows // Food Science and Quality Management - 2016 - Vol 52. - P. 56-65.
4. Некрасов, Г. Д. Акушерство, гинекология и биотехника воспроизводства животных / Г. Д. Некрасов, И. А. Суманова. - Барнаул: АГАУ, 2007. - 204 с.
5. Амануллин, Р. А. Эффективность ассоциированной инактивированной вакцины "ВАКОЛИН" при маститах коров / Р. А. Амануллин // Прикладная микробиология. – 2015. – Т. 2. - № 1 (4). – С. 40 - 44.
6. Опыт применения вакцины Стартвак в ООО "Некрасово-1" Свердловской области / Л. А. Климова, М. В. Ряпосова, И. А. Шкуратова [и др.] // Ветеринария. – 2014. – № 9. – С. 34-37.
7. Скосырских, Л. Н. Перспективы применения вакцин против мастита коров / Л. Н. Скосырских // Вестник Государственного аграрного университета Северного Зауралья. – 2013. – № 4 (23). – С. 57 - 60.
8. Ценовик. Вакцины для крупного рогатого скота. В.Лавренова, маркетолог издательства «Сельскохозяйственные технологии».
9. www. vetlek.ru
10. Амануллин, Р.А. Эффективность применения вакцины Ваколин против маститов коров / Р.А. Амануллин, Т.Н. Грязнева // Ветеринария, зоотехния и биотехнология. – 2016. – № 4. – С. 44-47.
11. Исакова, М.Н. Изменения показателей иммунного статуса коров на фоне применения противомаститной вакцины / М.Н. Исакова, М.В. Ряпосова, О.Ю. Опарина // Ветеринарный фармакологический вестник. – 2019.– № 1 (6). –С. 91-95.
12. Кононенко, К.Н. Новый препарат для профилактики субклинического мастита у коров в сухостойный период / К.Н.Кононенко // Островские чтения. – 2020.– № 1. – С. 96 – 98.
13. ГФ ХIV, том I, с. 595-601 Вязкость (ОФС. 1.2.1.0015.15).
14. ГФ XIV том I, с. 1201-1222 ОФС.1.2.4.0003.15 «Стерильность»
Таблица 1
Показатели массы тела животных опытной и контрольной групп
п/введения
2000 мг/кг
вода 1,0 см3
Таблица 2
Результаты заражения лабораторных животных пассивно иммунизированных сывороткой крови КРС
«SU-21»
«SAU-21Л»
«SAU-21М»
«SH-21»
«EC-21»
«EC-21-25»
Таблица 3
Результаты исследования продолжительности иммунитета на целевых животных
/
24 гол
/
6 гол
/
38 гол
/
15 гол
/
4 гол
/
18 гол
Примечание: ежемесячно фиксировались только новые случаи,
(+n) – количество выздоровевших животных,
н/о – не обнаружено,
отсутств. – разница отсутствует.
Таблица 4
Определение стабильности препарата при хранении в течение 12 мес
показателя
«SA-21» - 1:400,
«SD-21» - 1:400,
«S SU-21» - 1:400,
«SAU-21Л» - 1:400,
«SAU-21М» - 1:400,
«SH-21» - 1:400,
«EC-21» - 1:400,
«EC-21-25» - 1:400
«SA-21» - 1:400,
«SD-21» - 1:400,
«S SU-21» - 1:400,
«SAU-21Л» - 1:400,
«SAU-21М» - 1:400,
«SH-21» - 1:400,
«EC-21» - 1:400,
«EC-21-25» - 1:400
«SA-21» - 1:400,
«SD-21» - 1:400,
«S SU-21» - 1:400,
«SAU-21Л» - 1:400,
«SAU-21М» - 1:400,
«SH-21» - 1:400,
«EC-21» - 1:400,
«EC-21-25» - 1:400
Примечание: «+» соответствует норме
Таблица 5
Определение стабильности препарата после вскрытия флакона в течение 8 часов.
показателя
«SA-21» - 1:400,
«SD-21» - 1:400,
«SU-21» - 1:400,
«SAU-21Л» - 1:400,
«SAU-21М» - 1:400,
«S SH-21» - 1:400,
«EC-21» - 1:400,
«EC-21-25» - 1:400
«SA-21» - 1:400,
«SD-21» - 1:400,
«SU-21» - 1:400,
«SAU-21Л» - 1:400,
«SAU-21М» - 1:400,
«S SH-21» - 1:400,
«EC-21» - 1:400,
«EC-21-25» - 1:400
«SA-21» - 1:400,
«SD-21» - 1:400,
«SU-21» - 1:400,
«SAU-21Л» - 1:800,
«SAU-21М» - 1:400,
«SH-21» - 1:400,
«EC-21» - 1:400,
«EC-21-25» - 1:800
Примечание: «+» соответствует норме, н/и –исследование не проводилось
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Штамм "SAU-21Л" бактерий Staphylococcus aureus для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров | 2023 |
|
RU2820305C1 |
| Штамм "SA-21" бактерии рода Streptococcus вида Streptococcus agalactiae для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров | 2022 |
|
RU2799603C1 |
| Штамм бактерий Streptococcus dysgalactiae для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики мастита коров | 2023 |
|
RU2818361C1 |
| Штамм бактерии Pasteurella multocida "РМ - В" для изготовления биопрепаратов для специфической профилактики пастереллеза (геморрагической септицемии) крупного рогатого скота, вызванного пастереллой серогруппы В | 2023 |
|
RU2818959C1 |
| ВАКЦИНА АССОЦИИРОВАННАЯ ПРОТИВ ЭШЕРИХИОЗА, СТРЕПТОКОККОЗА И СТАФИЛОКОККОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2013 |
|
RU2553556C1 |
| Ассоциированная вакцина против миксоматоза, пастереллёза и вирусной геморрагической болезни кроликов 1 и 2 типов | 2020 |
|
RU2741643C1 |
| КОМБИНАЦИИ ЛИЗОБАКТИНА И АМИНОГЛИКОЗИДОВ ПРОТИВ ЗАБОЛЕВАНИЙ, ВЫЗВАННЫХ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫМИ И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫМИ БАКТЕРИЯМИ У ЖИВОТНЫХ, НЕ ОТНОСЯЩИХСЯ К ЧЕЛОВЕКУ | 2018 |
|
RU2760008C2 |
| СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ, АССОЦИИРОВАННОЙ ПРОТИВ ЭШЕРИХИОЗА, СТРЕПТОКОККОЗА И СТАФИЛОКОККОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА | 2013 |
|
RU2538158C1 |
| Штамм "О N 2222/Тайвань/1/2012" вируса ящура Aphtae epizooticae для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики ящура | 2023 |
|
RU2817031C1 |
| ИММУНОГЕННЫЕ БЕЛКИ STREPTOCOCCUS | 2008 |
|
RU2518315C2 |
Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и биотехнологии, а именно к разработке вакцины инактивированной эмульсионной для крупного рогатого скота от клинических и субклинических маститов коров. Вакцина произведена из инактивированной формальдегидом суспензии бактериальных клеток штаммов: Streptococcusagalactiae «SA-21», Streptococcusdysgalactiae «SD-21», Streptococcusuberis «SU-21», Staphylococcus aureus «SA-21Л», Staphylococcus aureus «SA-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichiacoli «EC-21», Escherichiacoli «EC-21-25» – (50%) с добавлением адъюванта – Montanide ISA 206VG (50%). Препарат обладает высокой иммуногенностью и способен обеспечить эффективную защиту от клинических и субклинических маститов коров. 2 з.п. ф-лы, 5 табл., 5 пр.
1. Средство специфической профилактики против клинических и субклинических маститов коров эмульсионное инактивированное, содержащее активное вещество и целевую добавку, отличающееся тем, что в качестве активного вещества оно содержит смесь из инактивированных суспензий бактериальных клеток штаммов:
- Streptococcus agalactiae «SA-21», семейства Streptococcaceae, рода Streptococcus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: № 386 – деп / 22-20 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
- Streptococcus dysgalactiae «SD-21», семейства Streptococcaceae, рода Streptococcus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: № 389 – деп / 22-23 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
- Streptococcus uberis «SU-21», семейства Streptococcaceae, рода Streptococcus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: № 385 – деп / 22-19 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
- Staphylococcus aureus «SAU-21Л», семейства Staphylococcaceae, рода Staphylococcus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: № 383 – деп / 22-17 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
- Staphylococcus aureus «SAU-21М», семейства Staphylococcaceae, рода Staphylococcus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: № 382 – деп / 22-16 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
- Staphylococcus hyicus «SH-21», семейства Staphylococcaceae, рода Staphylococcus, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: № 387 – деп / 22-21 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
- Escherichia coli «EC-21», семейства Enterobacteriaceae, рода Escherichia, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: № 380 – деп / 22-14 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»;
- Escherichia coli «EC-21-25», семейства Enterobacteriaceae, рода Escherichia, депонированного в коллекции ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером: № 381 – деп / 22-15 - ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ»; и в качестве целевой добавки: адъювант Montanide ISA 206 VG, взятых в соотношении 12,5 : 12,5 : 12,5 : 12,5 : 12,5 : 12,5 : 12,5 : 12,5 ÷ 50,0 соответственно.
2. Средство по п. 1, отличающееся тем, что при наработке бактериальной массы в качестве инактиванта использован формалин (массовая доля формальдегида 37-40%) в количестве 0,2% от инактивируемого объема.
3. Средство по п. 1, где содержит смесь из инактивированных антигенных материалов из штаммов Streptococcus agalactiae «SA-21», Streptococcus dysgalactiae «SD-21», Streptococcus uberis «SU-21», полученных на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона с добавлением сыворотки крови лошади; из штаммов Staphylococcus aureus «SAU-21Л», Staphylococcus aureus «SAU-21М», Staphylococcus hyicus «SH-21», Escherichia coli «EC-21», Escherichia coli «EC-21-25», полученных на жидких и плотных питательных средах на основе сердечно-мозгового бульона; каждый с концентрацией микробных клеток не менее 7,5×108.
| Приспособление для отвода осветленной воды из секционной ловушки для улавливания волокон из отходных вод бумагоделательной машины | 1932 |
|
SU32914A1 |
| ПРЕПАРАТ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ КОРОВ С СУБКЛИНИЧЕСКИМ МАСТИТОМ И СПОСОБ ЕГО ПРИМЕНЕНИЯ | 2013 |
|
RU2532407C1 |
| СРЕДСТВО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ МАСТИТА У КОРОВ | 2010 |
|
RU2430722C1 |
| Капсюльный затвор для бутылок | 1930 |
|
SU22487A1 |
